Когато яйцата на хелминтите се открият върху различни обекти на околната среда (почва, вода, зеленчуци и др.), Винаги е необходимо да се определи тяхната жизнеспособност по външен вид, оцветяване с витални багрила, култивиране при оптимални условия и създаване на биологична проба, т.е.

Хранене на лабораторни животни.

Определяне на жизнеспособността на външния вид на яйца или ларви на хелминти. Яйцата на хелминтите се микроскопират първо при ниско увеличение, след това при голямо увеличение. При деформирани и мъртви яйца на хелминти черупката е разкъсана или огъната навътре, плазмата е мътна, разхлабена. Сегментираните яйца имат топчета за разцепване (бластомери) с различен размер, неправилна форма, често са изместени към един полюс. Понякога има анормални яйца, които, имайки външни деформации, се развиват нормално. В живите ларви на ascarids фина грануларност присъства само в средната част на тялото, тъй като те умират, грануларността се разпространява по цялото тяло, появяват се големи лъскави хиалинови вакуоли - така наречените низове от перли.

За да се определи жизнеспособността на зрелите яйца на ascarids, whipworms, pinworms, активните движения на ларвите трябва да бъдат предизвикани чрез леко нагряване на препарата (до температура не по-висока от 37 ° C). По-удобно е да се наблюдава жизнеспособността на ларвите на ascaris и камшичен червей, след като са изолирани от черупката на яйцето чрез натискане върху покривното стъкло на препарата с дисекционна игла или пинсети.

При инвазивните ларви на аскаридите често се вижда капачка, която се е отлепила в края на главата, а при ларвите на камшичести червеи, които са завършили развитието си в яйцето, при голямо увеличение на това място се открива стилет. В мъртвите ларви на хелминти, независимо от тяхното местоположение (в яйцето или извън него), се забелязва разпадане на тялото. В този случай вътрешната структура на ларвата става бучка или гранулирана, а тялото става мътна и непрозрачна. В тялото се намират вакуоли, а на кутикулата се откриват счупвания.

Жизнеспособността на тениидните онкосфери (говежда, свинска тения и др.) се определя от движението на ембрионите, когато са изложени на храносмилателни ензими. Яйцата се поставят върху часовниково стъкло с кучешки стомашен сок или изкуствен дуоденален сок. Съставът на последния: панкреатин 0,5 g, натриев бикарбонат 0,09 g, дестилирана вода 5 ml. Часовниците с яйца се поставят в термостат при 36-38 ° C за 4 часа.В този случай живите ембриони се освобождават от черупките. Обвивките на живите онкосфери също се разтварят в подкислен пепсин и в алкален разтвор на трипсин след 6-8 часа в термостат при 38 ° C.

Ако тениидните яйца се поставят в 1% разтвор на натриев сулфид, или 20% разтвор на натриев хипохлорид, или в 1% разтвор на хлорна вода при 36-38 ° C, зрелите и живи ембриони се освобождават от мембраните и правят без промяна за 1 ден. Незрелите и мъртви онкосфери се свиват или набъбват и се увеличават рязко, след което се "разтварят" в рамките на 10 минути - 2 часа.Живите ембриони на тениидите също активно се движат в смес от 1% разтвор на натриев хлорид, 0,5% разтвор на натриев бикарбонат и жлъчка при 36- 38 °C.

Жизнеспособността на сколекс ехинококите се определя при слабо нагряване. За да направите това, сколекси или капсули за разплод, измити с вода, се поставят в капка вода върху предметно стъкло с дупка, покриват се с покривно стъкло и се изследват под микроскоп с нагревателен етап при температура 38-39 ° C. Ако няма нагревателна маса, препаратът се нагрява с произволен източник на топлина. В същото време жизнеспособните сколекси активно се движат, намалявайки или отпускайки смукателите, удължавайки и скъсявайки хоботчето. Ако сколексите се поставят в 0,5-1% воден разтвор на филицилен при стайна температура, тогава всички жизнеспособни сколекси бързо ще се окажат и ще умрат. Нежизнеспособни сколекси не се оказват.

Жизнеспособността на Fasciola adolescaria, събрана от растения и други обекти във водни обекти, се проверява чрез изследването им върху предметно стъкло във физиологичен разтвор под микроскоп с нагряващ етап. При нагряване ларвите на трематодите в кистата започват да се движат.

Жизнеспособността на яйцата на тенията джудже се определя от разположението на куките върху зародиша.

В живите яйца на малката тения се наблюдават бавни махалообразни движения на протоплазмата и почти незабележимо удължаване и изместване на заострените краища на страничната двойка куки встрани от средната двойка.

Контракциите на протоплазмата на ембриона и зародишните кукички помагат на ембриона да се освободи първо от черупките на онкосферата, а след това и от външната обвивка на яйцето.

В живо яйце средната двойка и страничните двойки куки са разположени успоредно; в някои яйца остриетата на страничните двойки са събрани и разположени под ъгъл по-малък от 45 ° спрямо средната двойка куки.

Умиращият ембрион конвулсивно се свива и бавно раздалечава куките. В мъртвия ембрион движението на куките спира и те са подредени в безпорядък, понякога куките странично на съседната двойка се раздалечават под прав, тъп или остър ъгъл.

Понякога се наблюдава набръчкване на ембриона, образуване на грануларност. По-точен метод се основава на появата на движения на онкосферата при рязка промяна на температурата: от 5-10 до 38-40 ° C.

Определянето на жизнеспособността на незрелите нематоди трябва да се изследва във влажна камера (блюда на Петри), като яйцата на Ascaris се поставят в 3% разтвор на формалин, приготвен в изотоничен разтвор на натриев хлорид при температура 24-30 ° C, яйцата на камшичен червей в 3% разтвор на солна киселина при температура 30-35 °C, яйца на острици в изотоничен разтвор на натриев хлорид при температура 37 °C. Петриевите панички трябва да се отварят 1-3 пъти седмично за по-добра аерация и повторно навлажняване на филтърната хартия чиста вода.

Развитието на яйцата на хелминтите се следи поне 2 пъти седмично. Липсата на признаци на развитие в рамките на 2-3 месеца показва тяхната нежизнеспособност. Признаци за развитието на хелминтни яйца са първо етапите на раздробяване, разделянето на съдържанието на яйцето на отделни бластомери. През първото денонощие се развиват до 16 бластомера, които преминават във втори стадий – морула и т.н.

Яйцата на анкилостомите се култивират в стъклен цилиндър (висок 50 cm и диаметър 7 cm), затворен със запушалка. Смес от равни обеми стерилен пясък, въглен и изпражнения с яйца от анкилостоми, разредени с вода до полутечна консистенция, внимателно се изсипват на дъното на цилиндъра с помощта на стъклена тръба. По време на 1-2 дни утаяване на тъмно при температура 25-30 ° C, рабдитоидните ларви се излюпват от яйцата и след 5-7 дни те вече стават филариформени: ларвите пълзят нагоре по стените на цилиндъра, където се се виждат дори с просто око. Яйцата на трематоди, естествено развиващи се във вода, като описторхис, дифилоботриид, фасциол и др., се поставят върху часовниково стъкло, петриево блюдо или в друг съд, изсипва се малък слой чиста вода. При култивиране на яйца на фасциола трябва да се има предвид, че те се развиват по-бързо на тъмно, докато мирацидият се образува в живи яйца при температура 22-24 ° C за 9-12 дни. При микроскопия развиващи се яйца trematodes miracidium движения са ясно видими. Fasciola miracidium излиза от черупките на яйцата само на светлина. При култивиране водата се сменя след 2-3 дни.

Ларвите на анкилостомата и стронгилоида се култивират върху агар в петриево блюдо с животински въглен. След като са били в термостат при температура 26-30 ° C в продължение на 5-6 дни, ларвите се разпространяват върху агара, оставяйки след себе си пътека от бактерии (метод на Fülleborn).

Метод на Харада и Мори (1955). 7 ml дестилирана вода се добавят към епруветките, поставени в стойка. Вземете 0,5 g изпражнения с дървена пръчица и направете петно ​​върху филтърна хартия (15X150 mm) на 5 cm от левия ръб (тази операция се извършва върху лист хартия, за да се предпази повърхността на лабораторната маса). След това лентата с намазката се вкарва в епруветката така, че левият край, свободен от намазката, да достигне дъното на епруветката. Горният край се покрива с парче целофан и се увива плътно с ластик. На епруветката напишете номера и фамилията на обекта. В това състояние епруветките се съхраняват 8-10 дни при температура 28 °C. За да изследвате културата, отстранете и отстранете целофановото покритие и отстранете лента от филтърна хартия с пинсети. В този случай трябва да се внимава, тъй като малък брой инфекциозни ларви могат да се придвижат до горния край на филтърната хартия или до стената на епруветката и да проникнат под повърхността на целофана.

Епруветките се поставят в горещо водна баняпри температура 50 °C за 15 минути, след което съдържанието се разклаща и бързо се излива в 15-милилитрова епруветка за утаяване на ларвите. След центрофугиране, супернатантата се отстранява и утайката се прехвърля върху предметно стъкло, покрива се с покривно стъкло и се микроскопира при слабо увеличение.

За диференциална диагноза на филариформени ларви е необходимо да се използват данните, представени в табл. 13.

Методи за оцветяване на яйца и ларви на хелминти. Мъртвите тъкани в повечето случаи възприемат цветовете по-бързо от живите. Тези характеристики се използват в хелминтологията за определяне на жизнеспособността на яйцата и ларвите на хелминтите. В някои случаи обаче някои бои се възприемат по-добре от живите тъкани, отколкото от мъртвите.

Таблица 13. Диференциална диагноза на нишковидни ларви на A.duodenale, N.americanus, Strongyloides stercoralis, Trichostrongylus spp.

За диференциално разпознаване на живи и мъртви яйца и ларви се използват следните бои и методи.

Метилен синьо левкобаза се използва за оцветяване на живи и мъртви тъкани. Жива клетка или тъкан редуцира метиленово синьо до безцветна левкобаза; мъртвата тъкан няма тази способност и следователно придобива цвят.

За оцветяване на яйца на Ascaris можете да използвате метиленово синьо в разтвор на млечна киселина с алкален каустик (метиленово синьо 0,05 g, сода каустик 0,5 g, млечна киселина 15 ml). Живите яйца не възприемат цвят, ембрионите на мъртвите яйца се оцветяват Син цвят.

Методът на оцветяване не е приложим за незрели яйца на аскариди и червеи; пигментираната черупка се оцветява и следователно не се вижда дали зародишната клетка вътре в яйцето е оцветена.

Ларвите на Ascaris се оцветяват с основен разтвор на брилянтно-крезил синя боя в концентрация 1:10 000, както следва: капка течност с яйца на ascaris и капка основен разтвор на боята се нанасят върху предметно стъкло. Препаратът се покрива с покривно стъкло, което се притиска плътно към обекта с леко почукване с дисекционна игла. Под микроскоп се наблюдава броят на излюпените ларви и степента на тяхното оцветяване, след което същият препарат се преглежда отново след 2-3 часа.За живи се считат само недеформираните ларви, които не са оцветени 2 часа.Мъртвите ларви се оцветяват, когато черупката се счупва (частично или напълно).

Посочена е възможността за оцветяване на препарати с йоден разтвор при определяне на жизнеспособността на яйцата на птиците Ascaridia. В този случай като багрило се използва 5% алкохолен разтвор на йод. При нанасяне върху препарата ембрионите на мъртвите яйца на Ascarid се оцветяват за 1–3 s. оранжев цвят. Мъртви яйца на описторхис и онкосфери бича тенияоцветени с разтвор на толуидиново синьо (1:1000), а мъртвите онкосфери от говежда тения - с разтвор на брилянтно-крезилово синьо (1:10 000). В същото време ембрионите и черупките на мъртвите и живите яйца придобиват цвят. Затова след оцветяването яйцата и онкосферите се измиват с чиста вода и допълнително се оцветяват със сафранин (разреден 1:10 000 с 10% алкохолен разтвор). Алкохолът премахва боята от черупките, а сафранинът им придава червен цвят. В резултат на това живите яйца се оцветяват в червено, ембрионът на мъртвите яйца е син, а черупката остава червена. Мъртвите ембриони на онкосфери от говежди тения бързо, в рамките на няколко минути, стават яркочервени или розов цвятсафранин или синьо брилянтно-крезилово синьо в разреждане 1:4000 или индигокармин в разреждане 1:1000-1:2000.

Живите ембриони не се променят под въздействието на тези цветове дори след 2-7 часа.

За да се определи жизнеспособността на яйцата на малката тения, се препоръчва използването на следните бои: 1) брилянтно крезилово синьо (1: 8000) - след 1 час онкосферата на мъртвите яйца е особено ярко оцветена, което се откроява рязко на фона на бледо или безцветен фон на останалата част от яйцето; 2) сафранин: в разреждане 1: 8000 при експозиция за 2 часа и 1: 5000 за 3-5 часа; 3) 50% разтвор на пирогалова киселина при разреждане 1: 2 - при излагане на 1 час при температура 29-30 ° C (колкото по-ниска е температурата, толкова по-дълъг е процесът на оцветяване).

Живите плероцеркоиди на широката тения се оцветяват много добре с воден разтвор (1: 1000) на неутрална уста за 5-20 минути. За да се получи устойчив розов цвят, който не изчезва в рамките на 5 дни и не засяга мобилността на плероцеркоидите, обикновено са достатъчни 10 минути. Степента на оцветяване се контролира чрез гледане на ларвите в чист вид изотоничен разтворнатриев хлорид, за който плероцеркоидите периодично се отстраняват от боята. Препоръчително е да използвате метиленово синьо за оцветяване на мъртви плероцеркоиди.

Р. Е. Чобанов и др.. (1986) предложиха метод за определяне на жизнеспособността на яйцата и ларвите на хелминтите, използвайки пигмента рубрин, получен по време на култивирането като багрило. мухъл гъбички Penicilium rubrum. За да направите това, използвайте 3% воден разтвор на багрило.

Процесът на оцветяване на яйца и ларви завършва след 1,5 часа.Нежизнеспособните яйца на острици, говежди и джуджета тении, анкилостомиди, трихостронгилиди придобиват интензивен розов цвят, ларвите на анкилостомиди и трихостронгилиди стават червени. По-малко ярък цвят се наблюдава при яйцата на ascaris и камшичен червей, тъй като, отделяйки се от червата, те вече имат тъмно кафяв цвят: Жизнеспособните яйца и ларви не се оцветяват.

Физико-химични методи за стимулиране на освобождаването на миракдии от яйца на трематоди. Методите са разработени от S.M. German и S.A. Beer (1984) за определяне на жизнеспособността на яйцата на opisthorchia и dicrocelium чрез излагане на яйцата на реакционната среда. Ако са живи, излиза мирацидиум. Методите се основават на физикохимично активиране на жлезата за излюпване на мирацидиум и стимулиране на двигателната активност на ларвата. Стимулирането се постига чрез излагане на яйцата на трематодите на специална реакционна среда в комбинация с последователни методи - създаване на температурна разлика, изсушаване на суспензията от яйца, излагане на слаб поток от течност в тестовата капка, които допринасят за масовото освобождаване на мирацидии от яйцата.

Определяне на жизнеспособността на яйцата на описторхи по метода на Herman, Beer. Суспензия от яйца във вода (чешмяна, утаена) предварително се охлажда до 10-12 ° C. Всички последващи операции се извършват при стайна температура (18-22 °C). Една капка (около 0,05 ml) от суспензия, съдържаща 100-400 яйца, се добавя към центрофужна епруветка. Епруветките се поставят в решетка за 5-10 минути, за да се утаят яйцата. След това с тясна лента филтърна хартия внимателно се изсмуква излишната вода до пълното й отстраняване. 2 капки от средата се добавят към епруветката, разклаща се, съдържанието се прехвърля с пипета върху предметно стъкло и се оставя за 5-10 минути, като леко се разклаща (или се поставя под сешоар), за да се създадат слаби течни течения в падане на окачването в процес на проучване. Тази операция, която имитира чревната перисталтика на мекотело, ви позволява да активирате освобождаването на мирацидия. След това към суспензията се добавят още 2 капки от средата и след това препаратът се изследва под микроскоп с помощта на конвенционален светлинен микроскоп (Х200). През това време яйцата с жизнеспособни мирацидии трябва да отворят капака, докато ларвата активно излиза в околната среда. Поради наличието на етанол в него, мирацидият се имобилизира за 3-5 минути и след това се оцветява с багрило в средата. В резултат на това мирацидиите лесно се откриват и преброяват.

Приготвяне на реакционната среда. Средата се приготвя в 0.05 М Tris-HCi буфер при оптимални условия на рН от 8.0-9.5. Към буфера се добавя етанол до 10-13% и багрило (сафранин, метиленово синьо и други, работещи в диапазона на pH), докато течността леко се оцвети (например за сафранин крайната му концентрация ще бъде 1:50 000). Можете да използвате друг буфер, който работи в алкалния диапазон на рН, като например 0,05 М фосфат (рН 8,5). Следователно средата съдържа 96% етанол - 12 части; багрило ( матерна луга) - 1-10 части; 0,05 М трис-НС! буфер (pH 8,5-9,5) - до 100 части. Пример за среда: 12 части 96% етанол, 1 част наситен разтвор на сафранин, останалите до 100 части - 0,05 М Tris-HCl буфер, pH 9,5.

Определяне на жизнеспособността на яйца от дикроцелиум по метода на Herman, Beer, Stratan. Капка суспензия, съдържаща 100-150 яйца на трематоди, се поставя в центрофужна епруветка за 1-2 минути, за да се утаят яйцата. След това течността внимателно се изсушава с лента от филтърна хартия. Добавете 1-2 капки от реакционната среда с пипета на Пастьор и инкубирайте във водна баня при 28-30 °C за 2-3 минути. Състав на средата: 6 части бутанол, 94 части 0,4% разтвор на натриев хлорид или 0,3% разтвор на калиев хлорид в дестилирана вода. Яйцата в средата се прехвърлят с пипета върху предметно стъкло и се оставят за 1,5-2 часа при стайна температура (18-22 ° C), докато на всеки 25-30 минути (докато изсъхне) се добавят 1-2 капки (0,05 ml) разтвор на бутанол в дестилирана вода. След това препаратът се микроскопира при 100-200-кратно увеличение. Жизнеспособността се определя от броя на отворените яйца с освободени мирацидии. Бутанолът прониква през порите на яйчната черупка, достига до мирацидиите и ги активира. Инкубацията при определена температура засилва този процес. Бутанолът в концентрация 3-7% е вреден за мирацидия, който се е появил от яйцето. Прехвърлянето на суспензия от яйца от епруветка в предметно стъкло позволява, докато мирацидият излезе (след 30-40 минути), да се намали концентрацията на бутанол поради изпаряване до безопасно ниво (1,5-0,5%). Наличието на натриев хлорид в средата в концентрация 0,1-0,5% (или калиев хлорид в концентрация 0,05-0,4%) определя активността на освободения мирацидий. За разлика от малките прозрачни яйца на описторх, яйцата на дикроцелия имат тъмно оцветена черупка, имат ясно видим капак, който е отворен след освобождаването на мирацидия. Следователно, жизнеспособността на яйцата от дикроцелиум се оценява по-удобно чрез преброяване на яйца, които са се отворили, вместо чрез оцветяване и преброяване на мирацидиите.

Луминесцентен метод за изследване на яйца и ларви на хелминти.

За първи път в хелминтологичната практика методите на луминесцентна микроскопия са приложени през 1955 г. Съобщава се, че луминесцентната микроскопия позволява да се разграничат живи и мъртви обекти, без да се уврежда яйцето. За флуоресценция не са използвани UV лъчи, а синьо-виолетовата част на видимата светлина, с конвенционален микроскоп и предметни стъкла; за осветителя OI-18 е използван специален набор от цветни филтри.

Установено е, че живите и мъртвите яйца на кръгли червеи, острици, малки тении, говежди тении, широки тении и други хелминти светят по различен начин. Това явление се наблюдава както по време на първична луминесценция без използване на багрила, така и при оцветяване с флуорохроми (акридин оранжево, корифосфин, примулин, ауролин, берлерин сулфат, трипафлавин, риванол, хинакрин и др.).

Небоядисаните живи несегментирани яйца на кръгли червеи светят ярко зелено с жълтеникав оттенък; в мъртвите яйца черупката излъчва зелена светлина много по-ярка от тъмнозелената ембрионална; при яйцата на кръгли червеи с ларва се появява само черупката, докато при мъртвите и черупката, и ларвата са ярко жълти.

Непигментирани и несегментирани живи яйца на острици и малки тении излъчват зеленикаво-жълта светлина; в мъртвите яйца черупката интензивно свети на фона на тъмнозелена ембрионална маса. С вторична луминесценция (когато се оцветява с акридиново оранжево при разреждане 1:10 OOO и 1:50 OOO от 30 минути до 2 часа), черупката на живи и мъртви нематоди, трематоди и цестоди луминесцира по различен начин.

Обвивката на живи и мъртви Ascaris lumbricoides, Toxocara leonina, Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. diminuta, T.saginatus, D.latum става оранжево-червена. Ембриони на живи Asc. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum и онкосферите на говеждата тения луминесцират в матов тъмнозелен или сиво-зелен цвят. Мъртвите ембриони на тези яйца на хелминти излъчват "горяща" оранжево-червена светлина. Живите ларви на острици и токсокари (яйчени черупки) излъчват матова сиво-зелена светлина и когато умрат, цветът се променя от края на главата до „горящо“ светлозелено, след това жълто, оранжево и накрая ярко оранжево.

При оцветяване с флуорохроми - корифосфилум, примулин - в мъртви яйца на аскариди и червеи се наблюдава блясък от лилаво-жълто до медно-червено. Жизнеспособните яйца не луминесцират, а стават тъмнозелени. Живите яйца на трематодите Paragonimus westermani и Clonorchis sinensis не луминесцират след оцветяване с акридиново оранжево, докато мъртвите яйца излъчват жълтеникаво-зелена светлина.

Методът на луминесценция може да се използва и за определяне на жизнеспособността на ларвите на хелминтите. И така, флуорохромирани с разтвор на акридин оранжев (1: 2000) ларви на стронгилат, рабдита светят: живи - зелени (с нюанс), мъртви - ярко оранжева светлина. Живите ларви на Trichinella не светят или дават слаб блясък, когато се третират в продължение на 10 минути с разтвори на флуоресцеин изотиоцианат, аурамин и др. Флуорохромираните мъртви ларви (в концентрация 1: 5000) дават ярка светлина.

Живите мирацидии, които са излезли от черупката, излъчват слаба синкава светлина с едва забележимо светло жълто венче от реснички, но 10-15 минути след смъртта те се появяват като ярка „горяща“ светлозелена, а след това оранжево-червена светлина.

Директни методи: откриване на самите хелминти, техните фрагменти, яйца, ларви в изпражнения, урина, дуоденален секрет, храчки, назална и вагинална слуз, съдържанието на поднокътните пространства, биопсирани парчета тъкан.

При диагностицирането е невъзможно да се идентифицират по един метод яйцата или ларвите на всички видове хелминти, живеещи в храносмилателната системачовек. По този начин, когато се използва методът на флотация, яйцата на трематодите и в някои случаи неоплодените яйца на кръглите червеи не изплуват в повърхностния филм (поради високото специфично тегло). В изпражненията е много рядко да се намерят яйца от острици, тениидни онкосфери, които се откриват чрез специални изследователски методи: изстъргване от перианални гънки за острици и тенииди, методи на утаяване за трематоди (яйца на описторх и др.). Следователно, за целенасочен преглед на пациент за хелминтиаза, лекарят в препратката трябва да посочи на кои хелминти трябва да се обърне основно внимание (диагноза), което ще позволи на лаборанта да избере подходящата техника за идентифициране на този тип хелминти. Изпражнения взети от различни местаизпражненията в количество най-малко 50 грама (чаена лъжичка) в чиста стъклена чиния трябва да бъдат изпратени в лабораторията не по-късно от един ден след дефекацията и изследвани в деня на приемане.

Ако е необходимо изпражненията да се запазят до следващия ден, те се поставят на студено място (0-4 ° C) или се напълват с някой от консервантите.

Преди изследването изпражненията се смесват с пръчка, така че яйцата на хелминтите да се разпределят равномерно в общата маса.

Ако в препарата се открият яйца от хелминти, огледът не се спира, т.к. може да бъде двойна или тройна инвазия.

Мониторингът на ефективността на лечението на хелминтиаза се извършва чрез изследване на изпражненията за хелминтни яйца 2-3 седмици или 2-3 месеца след лечението, в зависимост от открития хелминт.

Макроскопските методи се използват за откриване на цели полово зрели хелминти или техни фрагменти в изпражненията с просто око или с ръчна лупа.

Често на повърхността на изпражненията след дефекация можете да видите активно пълзящи острици; отделя се с изпражнения кръгъл червей; понякога хората сами забелязват отделянето на хелминти. При пациенти с дифилоботриоза могат да се откроят фрагменти от стробила на тения (под формата на "юфка"), а при заразени с тенииди (свинска или говежда тения) сегменти от хелминти (под формата на "бели разфасовки" ) често напускат изпражненията (под формата на "бели разрези") или активно изпълзяват от ануса.

Макроскопският метод е основен за диференциална диагнозатениидоза и тениаринхоза (в комбинация с изследване).

От специалните макроскопски методи се използва методът на последователно измиване на изпражненията.

Изпражненията се смесват във вода до получаване на еднородна суспензия, след което при добро осветление внимателно се изследват на отделни малки порции в черни фотографски кювети или на тъмен фон в петриеви панички. Всички подозрителни бели частици, големи образувания, съмнителни за фрагменти от хелминти, се отстраняват с пинсети или дисекционна игла и се изследват под лупа между две предметни стъкла. Малки хелминти или глави на цестоди се изследват под лупа в капка глицерин или под микроскоп.

При използване на този метод за диагностика на сегменти от свинска, говежда тения, широка тения, измитите сегменти се поставят между две стъкла и при осветяване под лупа или малко увеличение на микроскопа се определя видът структурата на матката (в зрял сегмент на свинска тения, 8-12 странични клона, а в бича тения 18-32, по-често 28-32, в широка тения, сегментите са по-широки и матката е в центърът под формата на "розетка"). Ако матката е слабо видима, тогава тя може първо да се задържи известно време в 50% разтвор на глицерин, след което дори изоставените маточни стволове са ясно видими.

При определяне на тези цестоди по структурата на отделените глави, те се поставят внимателно с гърлото в капка глицерол между предметни стъкла (или се покриват с покривно стъкло) и без да се притискат, се изследват под микроскоп при слабо увеличение.

Микроскопски методиразделени на прости, сложни и специални.

Простите методи са нативна цитонамазка, нативна цитонамазка с разтвор на Лугол, методи на дебела цитонамазка под целофан по Като, усукване (по Шулман) и перианално изстъргване.

Комплексните методи са по-ефективни и се основават на концентрацията на яйца в препаратите. Те включват предварителна обработка на изпражненията с течни реактиви, в резултат на което яйцата на хелминтите се утаяват или изплуват на повърхността на течността.

Комплексните методи включват методи за обогатяване:

а) флотация (когато специфичното тегло на яйцата е по-малко от специфичното тегло на солевия разтвор и яйцата плуват в повърхностния филм);

б) утаяване (когато специфичното тегло на яйцата е по-голямо от специфичното тегло на солните разтвори и яйцата се утаяват в утайка).

Специални методи за откриване на яйца и ларви на хелминти, кисти и вегетативни форми на протозои са методите на остъргване, флотация, утаяване, ларвоскопия, протозооскопия, изследване на жлъчката и методите за оцветяване на петна от изпражнения, храчки и др.

Прости методи за изследване на изпражненията

нативна цитонамазка. С дървена пръчица се взема малка частица екскремент от различни части на предадената порция, втрива се добре върху предметно стъкло в капка 50% разтвор на глицерин и се прави тънък намазка върху 2-3 предметни стъкла. Най-малко 3 препарата се изследват под микроскоп. Недостатък на метода: разглежда се малко количество материал, поради което не се използва като независим метод.

Метод на усукване(Шулман). 2,0-3,0 g изпражнения се поставят в чаша, разбъркват се старателно със стъклена пръчка с 5-кратен обем физиологичен разтвор или дестилирана вода, като се правят бързи движения в продължение на 2-3 минути и бързо се отстранява клечката от сместа. Капка от сместа в края на пръчката се прехвърля върху предметно стъкло и се микроскопира. Принципът на центробежната сила причинява натрупването на яйца и ларви върху пръчка.

Като метод на дебело намазване с целофан. Химически реактиви: 100% глицерол, 6% разтвор на фенол (100 ml вода + 6 g фенол), 3% разтвор на малахитово зелено (2,5 ml дестилирана вода + 75 ml малахитово зелено).

Приготвяне на работен разтвор: 100 ml 6% разтвор на фенол + 100 ml чист глицерин + 1,2 ml 3% разтвор на малахитово зелено.

Приготвяне на целофанови ленти: изрязват се целофанови ленти, чийто размер съответства на предметното стъкло. Целофанът трябва да е хидрофилен (целофанът, който гори, е подходящ, ако се топи, тогава не е подходящ). В работния разтвор могат да се обработват до 5 хиляди ленти. Времето за излагане на целофановите ленти до готовност за използване в работния разтвор е минимум 24 часа.

Напредък на изследванията. 50 mg изпражнения (колкото грахово зърно) се нанасят върху предметно стъкло, разтриват се с индивидуална пръчица (стъклена, дървена), покриват се с целофанова лента и се разтриват отгоре с гумена запушалка, докато се получи равномерно плътно намазка . Лекарството се изсушава при стайна температура за един час или в термостат при 40 ° C за 20-30 минути и микроскопично (времето на експозиция може да се увеличи при стайна температура до 5-6 часа или повече).

По ефективност този метод се доближава до метода на флотация, но разкрива интензивна и средна интензивност на инвазия.

Използва се като независим диагностичен метод и се препоръчва за масово изследване на населението.

В клиничните диагностични лаборатории се използва като унифициран метод за диагностициране на хелминти при липса на специфични диагнози в указанията на лекарите.

Методите за перианално изстъргване и нативна намазка с разтвор на Лугол са описани в раздела за специални методи.

Усъвършенствани методи за обогатяване на фекалии

Методите за обогатяване се основават на разликата в специфичното тегло на яйцата на хелминтите и използвания солен разтвор.

При прилагане на метода на флотация могат да се използват следните солни разтвори:

1. Разтвор на оловен нитрат PbNO3 (оловен нитрат) с плътност 1,5. Приготвя се в размер на 650 g от веществото на 1 литър вода. Солта се разтваря на части в гореща вода в емайлиран съд, загрява се на котлона и се разбърква непрекъснато, докато се разтвори напълно. Не е необходимо да филтрирате разтвора. Разтворът се приготвя в деня на изследването, тъй като с течение на времето той се утаява и плътността му започва да пада след 24 часа.Ако разтворът се приготвя в в големи количества, след което в следващите дни преди изследването се загрява, като се разбърква утайката. Приготвянето на разтвора се извършва в аспиратор, тъй като оловният нитрат е сол на тежък метал.

2. Разтвор на амониев нитрат NH4NO3 (гранулиран или обикновен амониев нитрат) с плътност 1,3 се приготвя по същия начин като предишния, но в размер на 1500 g от веществото на 1 литър топла вода.

3. Приготвя се разтвор на натриев нитрат NaNO3 или натриев нитрат с плътност 1,38-1,4 в размер на 1000 g от веществото на 1 литър гореща вода.

4. Разтвор на натриев тиосулфат Na2S2O3×5H2O (натриев хипосулфит) с плътност 1,4 се приготвя в размер на 1750 g от веществото на 1 литър гореща вода.

5. Приготвя се разтвор на натриев сулфат Na2SO4 (епсомова сол) с плътност 1,26-1,28 в размер на 920 g от веществото на 1 литър гореща вода.

6. Приготвя се разтвор на цинков хлорид ZnCl2 (цинков хлорид) с плътност 1,82 в размер на 2000 g от веществото на 1 литър гореща вода. Охладеният разтвор не кристализира.

7. Наситен разтвор на натриев хлорид NaCl (готварска сол) с плътност 1,18-1,2. На! л вода, добавете 400-420 г сол на порции в емайлирана кофа с вряща вода, като разбърквате непрекъснато, докато се разтвори напълно. Докато разтворът се охлажда, се утаяват кристали от натриев хлорид.

Специфичното тегло на флотационните разтвори се измерва с аерометър само след като разтворът е напълно охладен до стайна температура.

Флотационните методи са най-ефективни за откриване на яйца от малка тения, камшичен червей, анкилостома, аскарис и широка тения.

Повърхностният филм може да се отстрани с телена примка или предметно стъкло.

В наситен разтвор на натриев хлорид филмът може да се изследва след 30-40 минути, в разтвор на амониев нитрат - след 10-20-30 минути след утаяване.

При отстраняване на филма с телена примка се изследват най-малко 8 капки.

Слайдовете се отстраняват от филма повече яйцаотколкото телени бримки. Стъклото трябва да е в контакт с течността от флотационен разтвор, която се добавя към чашата с пипета. След утаяване стъклото се отстранява, поставя се намокрената повърхност върху стъклото по-голям размери се изследват под микроскоп. Предметните стъкла трябва да бъдат обезмаслени преди употреба.

За изследване трябва да имате: предметни стъкла, химически чаши, телени примки, кювети, петриеви панички, пипети, круши, стъклени или дървени пръчици.

Напредък на изследванията. 5 g изпражнения се заливат с 10-кратно количество флотационен разтвор (за предпочитане с плътност 1,38-1,40), разбъркват се старателно, отгоре се отстраняват неразтворимите едри частици и суспензията се оставя за 10-15 минути. След това филмът се отстранява или с примка върху предметно стъкло, или с предметно стъкло. За разреждане на изпражненията е по-добре да вземете чаши с вместимост 30-50 ml, да излеете разтвора наравно с ръбовете (или да напълните 2-3 mm) и да покриете сместа с предметно стъкло и след това да добавите флотационния разтвор с пипетирайте, докато влезе в контакт с предметното стъкло. След 10-20 минути стъклото бързо се отстранява и останалия върху него филм се сканира под микроскоп без покривно стъкло.

Утаително-седиментационни методи

Седиментационните методи се използват за откриване на яйца от геохелминти, биохелминти в изпражненията и като специални методи за изследване на описторхоза.

Метод Горячев-Золотухин(опростен метод на Горячев). Около 1,5 g изпражнения се разбъркват в химическа чаша в 3-4 ml вода. Получената суспензия се филтрира през два слоя марля в центрофужна епруветка, като внимателно се наслагва върху съдържащите се в нея 4-5 ml наситен разтвор на натриев хлорид. Епруветките се поставят в стелаж за 15-20 ч. През това време тежките яйца на трематоди се утаяват. Получете два ясно разграничени слоя. Утайката е микроскопична.

Етер-формалинов метод.Използва се за диагностика на всички чревни инвазии и като специален метод за яйца на протозои и описторхи.

Оборудване: центрофуга на 3000 об/мин; центрофужни градуирани тръби, фунии; метална цедка (чай) или двуслойна превръзка; предметни стъкла и покривни стъкла; дървени (или стъклени) пръчици; памук, бинт

Химически реактиви: 10% разтвор на формалин (1 част разтвор на фармацевтичен формалин и 4 части дестилирана вода); етилов етер (медицински).

В центрофужни епруветки се наливат 7 ml 10% разтвор на формалин и се поставят 1 g изпражнения (такова количество изпражнения, че разтворът в епруветката да достигне 8 ml). Изпражненията се смесват с формалин, докато се образува хомогенна смес, след което се изсипват през метална цедка (или двуслойна марля, бинт) в друга центрофужна епруветка (ако изпражненията останат върху цедката, тогава цедката трябва да се изплакне с формалин). Добавете 2 ml етер към тази центрофужна епруветка, запушете и разклатете енергично в продължение на 30 секунди.

Сместа се центрофугира при 3000 rpm за една минута (възможно за две минути при 1500 rpm). Поради реакцията на етер-формалин, коагулацията на протеините се извършва под формата на тапа в горната част на епруветката и яйцата на хелминтите се утаяват. Коагулантният слой се отстранява, супернатантата се отцежда, утайката се нанася върху предметно стъкло директно от епруветката или с пастьорска пипета, покрива се с покривно стъкло и се гледа под микроскоп.

Метод на етерно-оцетно утаяване. Принципът на етерно-оцетно утаяване на яйца от хелминти е последователно третиране на фекални проби с 10% воден разтвор оцетна киселинаи етер. Оцетната киселина е по-добра от другите химически съединенияемулгира фекална проба. Прониква в несмлени частици, състоящи се предимно от фибри, които, когато страхотно съдържаниепречат на изследването чрез утаяване след центрофугиране. Последващото добавяне на етер към епруветката и разбъркване води до извличане на оцетна киселина от съдържанието на епруветката заедно с фекални частици, импрегнирани с нея. Тъй като специфичното тегло на сместа от етер и оцетна киселина е по-малко от специфичното тегло на водата, пробите от изпражненията, третирани с тези вещества, изплуват нагоре и яйцата на хелминтите, които имат голямо специфично тегло, се утаяват.

Количеството на утайката, получена след утаяване с етер-оцетна киселина, е 3-4 пъти по-малко, отколкото след утаяване с етер-формалин. Това значително улеснява откриването на яйца от хелминти в него и ви позволява да изследвате утайката като цяло с проба от 0,5-1 г. Токсичността на етерно-оцетния метод е 5 пъти по-ниска.

Напредък на изследванията. 7 ml 10% разтвор на оцетна киселина се излива в градуирана центрофужна епруветка и се добавя 1 g проба от изпражнения (т.е. такова количество изпражнения, при което разтворът на оцетна киселина нараства до 8 ml). Разбъркайте добре със стъклена или дървена клечка. Прецедете през фуния с два слоя марля в друга центрофужна епруветка. Към емулсата се добавят 2 ml етилов етер (т.е. до 10 ml). Епруветките се затварят с гумена запушалка (възможно е от флакон с пеницилин) и се разклащат за 15 секунди. След отстраняване на запушалката, епруветките се центрофугират за една минута при 3000 rpm за 2 минути. Супернатантата се изхвърля от епруветката. В някои случаи образуваната фекална тапа пречи на изхвърлянето на супернатанта. В този случай тапата се отделя от стените на епруветката със стъклена или дървена пръчка. Цялата утайка се пипетира върху предметно стъкло и се микроскопира под покривно стъкло при ниско увеличение. Утайката обикновено е малка и безцветна. Яйцата на хелминтите, особено яйцата на малкия метил, се откриват добре.

Метод на химическо утаяване. Принципът на изследването се основава на утаяването на яйца от фекална проба във физиологичен разтвор със специфично тегло 1,15. Същността на метода се състои в директното центрофугиране на епруветка, в която тапа от изпражнения, емулгирана в 1% разтвор на оцетна киселина, се наслоява върху разтвор на натриев нитрат (sp. тегло 1,16). Високото специфично тегло на физиологичния разтвор и отделените от химическата реакция мехурчета, проникващи в слоя хомогенизирани изпражнения, предотвратяват неговото утаяване. Яйцата на хелминтите се утаяват с малко количество фибри. Утайката може да се почисти от останалия детрит чрез третиране с 10% оцетна киселина и етер. В този случай остава само едно яйце от хелминти, което значително улеснява тяхното идентифициране.

Напредък на изследванията. 6 ml разтвор на натриев нитрат със специфично тегло 1,15 се излива в градуирана центрофужна епруветка. Изсипете 7 ml 1% разтвор на оцетна киселина в друга епруветка. Въвежда се проба от изпражнения (до знака от 7,5 ml за проба от 0,5 g и до 8 ml за проба от 1,0 g). Разбъркайте старателно пробата със стъклена пръчка. Прецежда се през фуния с еднослойна марля, като се наслагва върху разтвор на натриев нитрат. Епруветката с наслоения филтрат се центрофугира при 1500-2000 rpm за 5 минути. Изхвърлете супернатантата чрез бързо обръщане на епруветката. Добавете 3-4 ml 10% разтвор на оцетна киселина и 0,5 ml етер в епруветка с утайка, затворете с гумена запушалка и разклатете. Повторете центрофугирането за 1 минута. Изхвърлете супернатантата. Утайката се прехвърля върху предметно стъкло, покрива се с покривно стъкло и се изследва под микроскоп.

ХЕЛМИНТОЛОГИЧНИ ИЗСЛЕДВАНИЯ НА ЖЛЪЧКА, ДУОДЕНАЛНО СЪДЪРЖАНИЕ, ХРАЧКИ, КРЪВ, УРИНА И МУСКУЛИ

Откриване на яйца и ларви на хелминти в дуоденалното съдържание и жлъчката. Изследването на жлъчката и дуоденалното съдържимо се извършва при съмнение за хелминтиаза на черния дроб и жлъчния мехур (описторхоза, клонорхиаза, дикроцелиаза) и дванадесетопръстника(стронгилоидоза).

Напредък на изследванията. Съдържанието на дванадесетопръстника и жлъчката (порции A, B, C) се получават по обичайния начин чрез сондиране. За порция B се препоръчва да се получи рефлекс на жлъчния мехур чрез въвеждане на 33% разтвор през сонда магнезиев сулфат. От изследваната течност се избират плаващи в нея люспи и се разглеждат под микроскоп, след което се смесва с равно количество серен етер. Сместа се разклаща старателно и се центрофугира. Супернатантата се изхвърля и цялата утайка се изследва под микроскоп.

При липса на гной и слуз жлъчката и дуоденалното съдържание се центрофугират без смесване с етер.

Изследване на храчки. В хелминтологичната практика се извършва изследване на храчки, за да се лабораторна диагностикапарагонимоза. Понякога се откриват шистозомни яйца, ларви на ascaris, елементи на ехинококов пикочен мехур.

Приготвя се нативна цитонамазка от храчка върху предметно стъкло, което се изследва под микроскоп.

При обилно съдържание на гной в храчката се смесва с 0,5% разтвор на сода каустик или калий каустик, разклаща се в продължение на 5 минути и се центрофугира. Утайката е микроскопична.

Изследване на кръвта. Кръвта се изследва, ако пациентът има съмнение за филариаза.

Поради факта, че при някои видове филариаза (лоиаза, вухерериоза, причинена от субпериодичен щам), ларвите (микрофиларии) са в периферна кръвсамо през деня, а при някои (бругиаза, вухерериоза, причинена от периодичен щам) - само през нощта, съответно по това време те вземат кръв за анализ.

Техниката на вземане на кръвни проби, подготовката на препарати (тънка намазка и дебела капка), тяхното оцветяване (по Романовски) и изследването са подобни на тези при лабораторната диагностика на малария.

микрофиларии различни видовесе различават по дължина, ширина, извивка на тялото, наличие или отсъствие на капачка, форма на опашния край, местоположение на ядреното вещество в тялото и опашната област на ларвите.

Напредък на изследванията. Урината се утаява най-малко 30 минути, след което горният слой се отцежда, оставяйки 10-15 ml утайка, която се излива в центрофужни епруветки и се центрофугира за 1-2 минути. След източване на супернатанта, утайката се прехвърля върху предметно стъкло и се изследва под микроскоп.

ИЗСЛЕДВАНЕ НА МУСКУЛНА БИОПТИЯ

Метод на трихинелоскопия. Необходимостта от изследване на биопсични проби от мускулите на пациента възниква при съмнение за трихинелоза.

Биопсията се извършва съгласно общите правила. Делтоидният мускул обикновено се биопсира. По време на патологоанатомичното изследване е възможно да се направи биопсия на мускулите на диафрагмата, хранопровода, езика, дъвкателните и междуребрените мускули, флексорите на крайниците, мускулите на очната ябълка, тъй като те са най-интензивно засегнати от ларвите на трихинела.

В лабораторията биопсирано парче мускул се нарязва на много малки парчета (микротом), които се поставят между две стъкла, смачкващи мускулните влакна, и се изследват под микроскоп. В момента за тази цел широко се използват специални микроскопи, трихинелоскопи.

При трихинелозата при трихинелоскопия по мускулните влакна се откриват рязко изпъкнали овални (лимоноподобни) трихинелни капсули. Средният размер на човешките капсули е 0,4 x 0,26 mm. Капсулата, като правило, съдържа една трихинела, спирално сгъната на 2,5 оборота. При висок интензитет на инвазия една капсула може да съдържа 2 или 3 ларви. Мускулните влакна, съседни на капсулата, губят напречната си набразденост и придобиват хомогенен вид.

Месото се изследва по същия начин месни продуктикоето е причинило инфекцията.

Метод на мускулно храносмилане. Методът е по-ефективен.

Напредък на изследванията. Изследваните мускули се нарязват на ситно и се заливат с изкуствен стомашен сок в съотношение 1:15-20. Получената смес се поставя в термостат при 37°С за 12-16 ч. След този период утайката се изследва под микроскоп, в който сред масата остатъци от смлени мускулни влакна се откриват свободни ларви на трихинела.

Изкуственият стомашен сок може да бъде закупен в аптека или приготвен в лаборатория. За да направите това, добавете 10 ml концентрирана солна киселина към 1 литър дестилирана вода; преди употреба 30 g пепсин се добавят към 1 литър разредена киселина.

КОЛИЧЕСТВЕНИ МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНЕ

Количествените методи на изследване се използват за определяне на интензивността на инвазията, оценка на ефективността на различни антихелминтни лекарства, определяне на качеството на обезпаразитяване, наблюдение на провежданите масови терапевтични и превантивни мерки и др.

Количественото определяне на яйца от хелминти се извършва по два метода: метода на Stoll и метода на Krasilnikov и Volkova (1974).

Метод на Стол. За да проведете изследването, трябва да имате микроскоп, стъклена колба с маркировка от 56 и 60 ml, измервателен цилиндър, стъклени перли, гумена запушалка за колбата, градуирани пипети, предметни стъкла и 0,4% разтвор на натриев хидроксид.

Напредък на изследванията. Изсипете децинормален разтвор на натриев хидроксид (приблизително 0,4% концентрация) в колбата с мерителен цилиндър до марката 56 ml и добавете фекалии, докато нивото на течността достигне марката 60 ml (т.е. 4 ml фекалии). Сместа се разклаща добре със стъклени перли за 1 минута, като съдът се затваря с гумена запушалка (може и с клечка). Веднага след разклащане с градуирана пипета се събират 0,075 ml от сместа (съдържа 0,005 ml фецес), прехвърлят се върху предметно стъкло и броят на яйцата в препарата се преброява под микроскоп. За да се определи броят на яйцата в 1 g изпражнения, намереният брой се умножава по 200.

Сравнението на броя на яйцата в препарата, открити в пациента преди и след лечението, ни позволява да преценим ефективността на обезпаразитяването.

Методът на Stoll е прост, дава сравними резултати при всички хелминтиази, чиито патогени систематично отделят яйца в червата на пациента. Недостатъкът на метода обаче е относително ниската му чувствителност, особено при ниска интензивност на инвазията.

Метод Красилников-Волкова. При изследването по този метод най-малко 1 g изпражнения се смесват в стъклена колба или голяма епруветка с 1% разтвор на Lotus (или 1,5% разтвор на Extra) в съотношение 1:10. Суспензията се разклаща старателно, докато се образува хомогенна суспензия, след което 0,1 ml от суспензията (еквивалентно на 0,01 g изпражнения) бързо се събира с градуирана пипета и се прехвърля върху предметно стъкло. Препаратът се покрива с покривно стъкло или целофанова плоча (20 х 30 mm), отлежава най-малко един ден при 50% воден разтворглицерин.

Пребройте броя на яйцата в целия препарат. За да се изчисли броят на яйцата в 1 g изпражнения, полученото число трябва да се умножи по 100.

Този метод има редица предимства пред метода на Stoll. Първо, той е по-чувствителен и позволява откриване на хелминти с ниска степен на инвазия. Второ, много е удобно за масови прегледи, тъй като детергентните разтвори, като консерванти за яйца от хелминти, позволяват да се провеждат изследвания на не съвсем свеж материал. Предпоставка за това обаче е събирането на фекалиите директно в разтвора на препарата.

За количествено изследване може да се използва всеки от описаните унифицирани качествени методи, базирани на принципа на плаващите яйца. Но в този случай трябва да се вземе за анализ същото количество изпражнения, същият обем флотационен разтвор. Изчисляването на степента на инвазия може да се направи, като се знае броят на яйцата в 1 g изпражнения, съгласно таблицата по-долу.

Интензивността на инвазията зависи от броя на яйцата на хелминтите

в 1 g фекалии

СЕРОЛОГИЧНА ДИАГНОСТИКА

Тези методи, базирани на откриването на специфични антитела в кръвния серум, се използват за диагностични и скринингови цели.

Серологичните методи включват:

Реакция на пръстеновидно утаяване (RCP) (трихинелоза, цистицеркоза);

Реакция на пръстеновидно утаяване в епруветки на студено (трихинелоза, цистицеркоза);

Реакция на микропреципитация върху живи ларви (трихинелоза, аскаридоза);

Реакцията на индиректна хемаглутинация (RIHA) (трихинелоза, ехинококоза, алвеококоза, цистицеркоза и др.);

Реакция на латексна аглутинация (RAL) (ехинококоза, алвеококоза, трихинелоза, тениаринхоза и др.);

Реакция на свързване на комплемента (RSK) (трихинелоза, ехинококоза, цистицеркоза);

Реакцията на ензимно белязани антитела (REMA) (ехинококоза, онхоцеркоза, шистозомиаза, трихинелоза, токсокароза);

ELISA (трихинелоза, описторхоза, токсокароза, токсоплазмоза и др.).

За установяване на серологични реакции се произвеждат стандартни антигени или се приготвят самостоятелно (например от ехинококови мехури на овце), произвеждат се специални тест системи за ELISA.

Специални методиизследване на ентеробиоза, тениаринхоза, тениоза

Остъргване от перианалните гънки. За да получите изстъргване от перианалните гънки, можете да използвате дървена шпатула, целофанова лента, целулозна хартия или лента, клечки за очи със специален адхезивен слой:

а) изстъргване с дървена шпатула (шпатула е сплескана клечка или клечка), навлажнена с 1% разтвор на глицерин (или 0,5% разтвор сода за пиене), се извършва чрез леко остъргване от повърхността на перианалните гънки по цялата обиколка на ануса. Полученото остъргване се прехвърля с ръба на покривното стъкло от края на шпатулата върху предметно стъкло в капка от 50% разтвор на глицерол, покрива се със същото покривно стъкло и се микроскопира. Недостатъкът на метода е липсата на откриване на яйца и дразнещ ефект;

б) по метода на Торгушин се прави флъш памучен тампонвърху дървена или друга шпатула, навлажнена с 50% разтвор на глицерин, и се приготвя намазка върху предметно стъкло в капка глицерин;

в) по метода на Кеворкова около 5 ml се изсипват в центрофужна епруветка сварена вода, поставете шпатула (пръчка) с памучен тампон в нея. Преди вземане на материала тампонът леко се притиска към вътрешната стена на епруветката, с него се избърсват перианалните гънки и шпатулата с тампона се вкарва в епруветката. Тампонът в епруветката се разклаща добре, промивката се центрофугира в продължение на 3 минути и получената утайка се изследва под микроскоп;

г) изстъргване с лейкопласт по Греъм. Парче лепяща лента (прозрачна полиетиленова лента с адхезивен слой за детско творчество, но е по-добре да използвате операционен филм LPO-1, LPO-2) с дължина 8-10 cm се залепва с лепкав слой към перианалните гънки от кожата, като я държите за краищата и след това прехвърляте върху предметното стъкло с лепкав слой надолу (краищата на лентата, които излизат извън ръбовете на стъклото, се отрязват), очилата се номерират и данните на пациента и номерът на стъклото се записват в дневника. В лабораторията лентата се отлепва в единия край на голямо разстояние, под нея се капват 1-2 капки вазелиново масло или глицерин (за отстраняване на оптични дефекти) и се микроскопира;

д) изстъргване със стъклени клечки за очи, чиято повърхност е покрита със специален лепилен състав. Пръчките за очи са монтирани в специален статив. Материалът се взема чрез контакт на плоската част на шпатулата с кожата на перианалния отвор. След това пръчката се фиксира отново в статив за транспортиране. Микроскопията се извършва директно върху шпатулата от двете страни (без предметни стъкла и покривни стъкла) с предварително монтиране в касети при ниско увеличение (окуляр х 10, обектив х 8). В края на работата пръчките се дезинфекцират чрез кипене в сапунен разтвор, а стативът и касетите се третират със спирт и се измиват със сапунен разтвор на сода. Състав на лепилото: клеол - 10 g, рициново масло- 2,5 g, етилов етер - 5 g, етилов алкохол 96% - 2,5 g.

Шпатулите се потапят в разтвор на лепило, след което се сушат на въздух при стайна температура. Лепилният филм, образуван на повърхността, остава няколко дни.

Методът е удобен за масово изследване на детското население за ентеробиоза и възрастното население за тениидози.

В допълнение към метода на остъргване за тениаринхоза и тениоза, се използват и методът на изследване и макроскопският метод, описан по-горе (когато се открият сегменти).

Специални методи за изследване на стронгилоидоза

Използвайте етерно-оцетния метод за откриване на яйца (вижте по-горе) и метода на Берман за откриване на ларви в изпражненията.

Метод на Берман. Изследвайте пресни изпражнения, по-добре след приемане на слабително. 5 g проба от изпражнения се поставя върху метално сито (мрежата е покрита с два слоя марля отвътре) в стъклена фуния, фиксирана в статив. На долния край на фунията се поставя гумена тръба със скоба (апарат на Берман).

Мрежата с изпражнения се повдига и във фунията се излива вода, загрята до 40-50 ° C, така че долната част на мрежата да се потопи във вода и изпражненията да са напълно покрити с вода. След 2-4 часа скобата на гумената тръба бързо се отваря и течността се спуска в центрофужната тръба. След центрофугиране (1-2 минути) Горна часттечността бързо се отцежда, а утайката в количество 1 ml се нанася на тънък слой върху предметно стъкло и се микроскопира при слабо увеличение на микроскопа.

IMP и TM метод. Част от изпражненията с размер на ядка се поставят в химическа чаша, изсипват се с топъл 40 ° C физиологичен разтвор, така че изпражненията да се покрият с разтвор, оставят се за 20 минути. След 20 минути течността се излива в петриево блюдо и се наблюдава под бинокулярния микроскоп MBS.

За диагностициране на стронгилоидоза, особено за проследяване на ефективността на лечението, се препоръчва комбинирането на метода на Берман с изследване на съдържанието на дванадесетопръстника.

Специални методи за изследване на нематодоза

Нематози

аскаридоза

В анамнезата се обръща внимание на отношението към градинарството, градинарството. Яденето на сурови зеленчуци, салати от тези зеленчуци.

Клиничните прояви на ранната фаза на аскаридозата се дължат на алергични промени в организма. Ранният или мигриращият ларвен стадий на аскаридоза често се проявява при наличие на треска с телесна температура до 38 ° и по-висока, със симптомен комплекс от белодробно увреждане и наличие на тежка еозинофилия в кръвта. В повечето случаи при децата първите признаци на заболяването са неразположение, слабост, повтарящи се главоболия, изпотяване, понякога болки в мускулите и ставите. Често има обилен обрив тип уртикария със силен или умерен сърбеж. Диагнозата на ранната фаза се потвърждава от рентгенови изследвания за наличие на летливи частици в белите дробове. еозинофилни инфилтратиЛефлър. Намазките от пресни храчки често показват еозинофилни клетки, червени кръвни клетки, кристали на Charcot-Leyden и ларви на Ascaris.

В чревния имагинален стадий на аскаридоза има комбинация от прояви от стомашно-чревния и астеничния синдром, ентероколитичен симптоми на болка. При децата често има намаляване на теглото, понякога доста значително. Гадене, повишено слюноотделяне, раздразнителност, задържане психомоторно развитие, намалена интелигентност.

За лабораторна диагностика на чревни ул

Ершова И.Б., Осичнюк Л.М., Мочалова А.А., Държавна институция „Луганска държавна медицински университет”, Отделение по педиатрия с детски инфекции.
Статията е публикувана в сп. "Актуална инфектология", № 2 (3), 2014 г.
Информационен ресурс "Издателство Заславски" www.mif-ua.com

Статията описва методите за диагностициране на хелминтни инвазии: микроскопски, ензимен имуноанализ, серологичен, полимеразна верижна реакция, биорезонансна диагностика, хемосканиране, както и инструментални (ултразвуково и рентгеново изследване, компютърна томография) и лабораторни, които имат косвено значение ( клиничен анализкръвен тест, чернодробен тест, тест за изпражнения за дисбактериоза). Описани са предимствата на методите, техните недостатъци и надеждността на получените данни. Предлагат се въпросници за пациентите за идентифициране на риска от инфекция с хелминти. Описани са предимствата на методите, техните недостатъци и надеждността на получените данни. Предлагат се въпросници за пациентите за идентифициране на риска от инфекция с хелминти.

Хелминтите имат отрицателен ефект върху човешкото тяло. Те водят до алергизация, развитие на полихиповитаминоза, макро- и микроелементози, нарушена хемопоеза и съдова пропускливост, хормонален дисбаланс. Хелминтиазите допринасят за образуването на хронични заболявания (холецистит, холелитиаза, панкреатит, колит, диабет, бронхиална астма, атопичен дерматит), психоемоционални разстройства ( хронична умора, раздразнителност, тревожност, хиперактивност при деца), анемия и др. При продължителна хелминтна инвазия може да се развие вторичен имунен дефицит.

Бдителността на лекарите по отношение на хелминтозите сред населението в момента е недостатъчна и профилактиката се свежда до лечение на идентифицирани инвазирани пациенти.

Диагностика на хелминтозивъз основа на клинични епидемиологични и лабораторни данни. Признаци като астеничен синдром, рецидивираща уртикария, нарушена регенерация на кожата и лигавиците, трудно лечим атопичен дерматит и бронхообструктивен синдром, полилимфаденопатия и хепатоспленомегалия с неизвестен произход, аденоидни вегетации II-III степен, "географски" език, намален или селективен апетит, нестабилни изпражнения, могат да показват наличието на хелминти.

При серологично изследванеопределяне на наличието на антитела срещу хелминти (надеждност - около 60%): ако се подозира ехинококоза, цистицеркоза, трихинелоза, токсокароза, широко се използват индиректна хемаглутинация, латексна аглутинация, фиксиране на комплемента, имунофлуоресцентни реакции.
Не във всички случаи методите за определяне на специфични антитела имат достатъчна специфичност и надеждност. Антигенният състав на хелминта зависи не само от вида, но и от етапа; преминавайки през сложен цикъл на развитие от яйцето до възрастен, хелминтите променят антигенния състав. В допълнение, соматичните антитела се използват в имунодиагностични реакции, а в тялото на гостоприемника антителата се произвеждат главно срещу хелминтни екскрети и секрети. Неспецифичната сенсибилизация на тялото, сходството на някои антигени на трематоди, протозои и хора създават голям процент фалшиви положителни реакции в титри под надеждно диагностичните.

Метод за определяне на хелминти полимеразна верижна реакция е високоспецифичен и силно чувствителен, но поради високата цена и сложност не може да бъде скрининг, когато например трябва да се изследва група деца от детско заведение.

Имунната система не винаги реагира (разпознава и унищожава) на наличието на хелминти в тялото. Това е така, защото някои хелминти имат здрава и химически устойчива капсула или са покрити с вещество, което не се разпознава. имунна система; локализирани в тъкани, които са най-защитени от възпалителни реакции, например в гръбначен мозък; много видове от тях отделят антиензими в храносмилателния тракт, което ги спасява от смърт; имат дълга продължителност на живота (с години, а понякога и до смъртта на самия човек); хранят се с гликолизата на чисти въглехидрати; имат такива устройства като вендузи, куки и др., което допринася за фиксиране вътре в тялото; при много видове има сексуално размножаване, при което се извършва обмен на генетична информация, което води до увеличаване на хетерогенна популация, намаляване на уязвимостта; притежавам високо нивоплодовитост.

При ултразвукова , Рентгеново изследване на органи коремна кухина , компютърна томография възможно е да се идентифицират индиректни признаци на хелминтиаза: хепатоспленомегалия, неравномерен паренхим на черния дроб и далака поради малки хиперехогенни сигнали, увеличени лимфни възли в хилуса на далака и самите хелминти (ехинококи, сплитания на чревни хелминти и др.).

Хемоскениране - качествено изследване на кръвта с помощта на мощен микроскоп с тъмно поле, можете да видите състоянието на кръвните клетки (форма, размер, активност, цвят и т.н.), наличието на неспецифични елементи и вещества - всичко това пряко или косвено показва наличието на хелминти в тялото. Изображението се показва на екрана на монитора с помощта на вградената видеокамера в микроскопа. Този диагностичен метод има висока надеждност.

Индиректна лаборатория знаци хелминтозиможе да има анемия, базофилия, еозинофилия, повишаване на нивото на аспартат аминотрансферазата. И така, при токсокароза се открива левкемоидна реакция на еозинофили (повече от 20%) на фона на персистиращи алергичен синдром(атопичен дерматит със силен сърбеж и устойчивост на традиционна терапия, тежка бронхиална астма). Инхибирането на нормалната Е. coli в анализа на изпражненията за дисбактериоза също може да показва възможна хелминтиаза.

Като се има предвид разпространението на хелминтиазите, предлагаме въпросникза определяне на риска от инфекция с хелминти.

• Плуване в прясна вода.
• Не мийте ръцете си със сапун и гореща вода преди хранене.
• Питейна вода от непроверени източници.
• Яжте домашна мас с ивици месо.
• Яжте солена риба.
• Яжте недопечено месо (с кръв).
• Яжте нефабричен леко осолен хайвер.
• Не мийте пилешките яйца със сапун.
• Не мийте банани, портокали, мандарини преди употреба.
• Наторете градината си с оборски тор.
• Яжте зеленчуци направо от градината.
• Яжте плодове и горски плодове направо от градината.
• Консумирайте паднали плодове.
• Не заливайте цялата зеленина с вряща вода за салати.
• Съхранявайте морковите в пясък, взет от двора.
• Ходете боси по тревата.
• Членовете на семейството са имали хелминтни инвазии.
• Семейството има куче или котка.

За всеки отговор да"- 2 точки," понякога"- едно, " Не» - 0. При резултат 0-5 вероятността от инфекция е незначителна, 6-12 - възможна инфекция, 13-25 - висока вероятност, повече от 25 точки - много висока. При последните два резултата са необходими редовни прегледи и евентуално превантивно лечение.

Тъй като клиничните прояви на хелминтиазите не винаги са специфични, а в началните етапи са неспецифични, предлагаме въпросник за пациентите. самодиагностика хелминтози.

• Сутрин има сърбеж в ануса.
• Гадене сутрин при миене на зъбите.
• Белене на пръстите на ръцете или краката, с отлющване на слоеве кожа.
• Алергичен обрив по кожата, сърбеж по кожата.
• Пилинг и подуване на клепачите.
• Повишена умора, летаргия, сънливост.
• Повишено чувство на глад.
• Усещане за дискомфорт в корема.
• Отслабване.
• Наличие на множество хронични заболявания на органите стомашно-чревния тракт, стави, бронхопулмонална система.
• Лошо здраве, липса на официална диагноза, продължително неефективно лечение.
• Периодично повишаване на температурата, придружено от болки в мускулите и ставите.

Отговор " да" На понеза 2-3 въпроса говори за висока вероятностхелминтни инфекции.

ИЗВОДИ

1. Включено настоящ етапняма лабораторни методи за изследване на хелминтиази, които да са 100% надеждни.

2. Полимераза верижна реакцияи биорезонансна диагностика.

БИБЛИОГРАФИЯ

Изследване на изпражненията

Микроскопията първо се извършва при ниско увеличение (X80). Най-простите могат да бъдат заменени с по-силно пречупване на светлината, а някои видове с тяхното движение или промяна на формата. Обект, който се вижда при малко увеличение, се изследва при увеличение от 400 или 600. При липса на опит петна трябва да се гледат веднага при голямо увеличение, което обаче значително увеличава времето за изследване на препарата. Гледането на петна при голямо увеличение трябва да се извършва при по-силна светлина, като се регулира с кондензатор.

диференциални знаци определени видовеамебите в нативна намазка са формата и размерите на тялото, видимостта на ядрото, естеството на образуването на псевдоподии, движението, разделянето на цитоплазмата на екто- и ендоплазма, естеството на включванията (фагоцитирани еритроцити, и т.н.). При разграничаване на флагелатите - размерът и формата на тялото, броят на флагелите, естеството на движението, наличието или отсъствието на вълнообразна мембрана. Специфичните особености на балантидиите са размер, форма на тялото, движение, реснички, цитостома и др.

Основната отличителна черта на вегетативните форми на протозоите в живо състояние е движението. Открива се в намазки различни видовенеподвижни образувания - растителни влакна, мускулни влакна, спори, гъби и др. Те не трябва да се вземат предвид при протозоологичната диагностика.

Методът на нативната цитонамазка е прост и достъпен за всяка лаборатория. Позволява при откриване на тъканни форми на дизентерийни амеби с фагоцитирани еритроцити да се постави абсолютно точна диагноза амебна дизентерия, а при откриване на балантидия и лямблия се поставя диагноза балантидиаза и лямблиоза.

Оцветяване на петна с разтвор на Лугол . Това оцветяване се използва за диагностициране на протозои чрез кисти. Използва се при изследване на формализирани, полуоформени и кашави изпражнения.

За да се приготви намазка, краят на дървена пръчица се замърсява с изпражнения и се измива в капка йоден разтвор (J - 1,0 g, KJ - 2 g, дестилирана вода - 100 ml), нанесена върху предметно стъкло, докато се получи равномерна емулсия получено. Препаратът се покрива с покривно стъкло и след 3-5 мин. микроскопичен. Намазката трябва да е достатъчно прозрачна, за да може да се изследва в пропускаща светлина.

Сред останките несмляна храна, спори, гъбички, йодофилни бактерии протозойни кисти, боядисани в кафяв или зеленикаво-жълт цвят, се отличават със строго определена, характерна за всеки вид форма, размер, отчетливи очертания на ръбовете, наличието на гладка, прозрачна, двойна кръгова мембрана, съдържанието на цитоплазмата, както и наличието на ядра с неясна структура. В кистите на амеба се виждат гликогенни вакуоли, оцветени в кафяв (тъмнокафяв) цвят. Степента на оцветяване на тези вакуоли и очертанията на техните граници варират в протозойните цисти от един и същи вид в зависимост от тяхната зрялост.

7.7. Методи за определяне на жизнеспособността на яйца и ларви на хелминти

Жизнеспособността на яйцата на хелминтите се определя от външния им вид, чрез оцветяване с витални багрила, чрез култивиране при оптимални условия и чрез поставяне на биологична проба.

7.7.1. Определяне на жизнеспособността на яйца или ларви на хелминти по външен вид

Яйцата на хелминтите се микроскопират първо при ниско увеличение, след това при голямо увеличение. При деформирани и мъртви яйца на хелминти черупката е разкъсана или огъната навътре, плазмата е мътна, разхлабена. В сегментираните яйца топчетата на разцепване (бластомерите) са различни по размер, с неправилна форма и често изместени към единия полюс. Понякога има анормални яйца, които, имайки външни деформации, се развиват нормално. В живите ларви на кръгли червеи фината грануларност присъства само в средната част на тялото, докато умират, тя се разпространява по цялото тяло, появяват се големи блестящи хиалинни вакуоли, така наречените "низи от перли".

За да се определи жизнеспособността на зрелите яйца на ascarids, whipworms, pinworms, активните движения на ларвите трябва да бъдат предизвикани чрез леко нагряване на препарата (до температура не по-висока от 37 ° C). По-удобно е да се наблюдава жизнеспособността на ларвите на ascaris и камшичен червей, след като са изолирани от черупката на яйцето чрез натискане върху покривното стъкло на препарата с дисекционна игла или пинсети.

При инвазивните ларви на аскаридите често се вижда капачка, която се е отлепила в края на главата, а при ларвите на камшичести червеи, които са завършили развитието си в яйцето, при голямо увеличение на това място се открива стилет. Мъртвите ларви на хелминти, независимо от тяхното местоположение (в яйцето или извън него), забелязват разпадането на тялото. В този случай вътрешната структура на ларвата става бучка или гранулирана, а тялото става мътна и непрозрачна. В тялото се намират вакуоли, а на кутикулата се откриват счупвания.

Жизнеспособността на тениидните онкосфери (говежда, свинска тения и др.) се определя от движението на ембрионите, когато са изложени на храносмилателни ензими. Яйцата се поставят върху часовниково стъкло с кучешки стомашен сок или изкуствен дуоденален сок. Съставът на последния: панкреатин - 0,5 g, натриев бикарбонат - 0,09 g, дестилирана вода - 5 ml. Часовниковите стъкла с яйцата се поставят в термостат при 36 - 38°С за 4 часа. В този случай живите ембриони се освобождават от мембраните. Обвивките на живите онкосфери също се разтварят в подкислен пепсин и в алкален разтвор на трипсин след 6-8 часа в термостат при 38 °C.

Ако яйцата на тениите се поставят в 1% разтвор на натриев сулфид или 20% разтвор на натриев хипохлорит, или в 1% разтвор на хлорна вода при 36 - 38 ° C, зрелите и живи ембриони се освобождават от черупките и не промяна за 1 ден. Незрелите и мъртви онкосфери се свиват или набъбват и се уголемяват драматично и след това се "разтварят" в рамките на 10 минути до 2 часа. Живите ембриони на тениидите също се движат активно в смес от 1% разтвор на натриев хлорид, 0,5% разтвор на натриев бикарбонат и жлъчка при 36 - 38 ° C.

Жизнеспособността на Fasciola adolescaria, събрана от растения и други обекти във водни обекти, се проверява чрез изследването им върху предметно стъкло във физиологичен разтвор под микроскоп с нагряващ етап. При нагряване ларвите на трематодите в кистата започват да се движат.

За да се определи жизнеспособността на яйцата на малката тения, методът на N.S. Ionina е най-простият: в живите яйца средната двойка ембрионални куки е или успоредна на страничните, или последните образуват ъгъл в основата по-малък от 45 ° с медианата. В мъртвите яйца страничните двойки образуват ъгъл в основата със средна двойка повече от 45 ° или куките са произволно разпръснати (тяхното сдвоено разположение е загубено); понякога има набръчкване на ембриона, образуване на грануларност. По-точен метод се основава на появата на движения на онкосферата по време на рязка промяна на температурата: от 5 - 10 ° до 38 - 40 ° C.

Определянето на жизнеспособността на незрели яйца на нематоди трябва да се изследва във влажна камера (блюда на Петри), като яйцата на ascaris се поставят в 3% разтвор на формалин, приготвен в изотоничен разтвор на натриев хлорид при температура 24 - 30 ° C, яйцата на червеите в 3 % разтвор на солна киселина при температура 30 - 35 ° С; яйца на острици в изотоничен разтвор на натриев хлорид при 37 °C. Петриевите панички трябва да се отварят 1 до 2 пъти седмично за по-добра аерация и отново да се намокри филтърната хартия с чиста вода.

Развитието на яйцата на хелминтите се следи поне 2 пъти седмично. Липсата на признаци на развитие в рамките на 2-3 месеца показва тяхната нежизнеспособност. Признаци за развитието на хелминтни яйца са първо етапите на раздробяване, разделянето на съдържанието на яйцето на отделни бластомери. През първите дни се развиват до 16 бластомера, които преминават във втори стадий - морула и т.н.

Яйцата на анкилостомите се култивират в стъклен цилиндър (висок 50 cm и диаметър 7 cm), затворен със запушалка. Смес от равни обеми стерилен пясък, въглен и изпражнения с яйца от анкилостоми, разредени с вода до полутечна консистенция, внимателно се изсипват върху дъното на цилиндъра с помощта на стъклена тръба. По време на 1 - 2 дни утаяване на тъмно при температура 25 - 30 ° C, рабдитоидните ларви се излюпват от яйцата и след 5 - 7 дни те вече стават филариформени: ларвите пълзят нагоре по стените на цилиндъра, където се се виждат дори с просто око.

Яйцата на трематоди, които естествено се развиват във вода, като описторхис, дифилоботрииди, фасциоли и други, се поставят върху часовниково стъкло, петриево блюдо или в друг съд и се излива малък слой обикновена вода. При култивиране на яйца на фасциола трябва да се има предвид, че те се развиват по-бързо на тъмно, докато мирацидият се образува в живи яйца при температура 22–24 ° C след 9–12 дни. При микроскопия на развиващите се трематодни яйца ясно се виждат движенията на мирацидия. Fasciola miracidium излиза от черупките на яйцата само на светлина.

Метод на Фулеборн. Ларвите на анкилостомата и стронгилида се култивират върху агар в петриево блюдо с животински въглен. След задържане в термостат при температура 25 - 30 ° C в продължение на 5 - 6 часа, ларвите се разпространяват върху агара, оставяйки след себе си пътека от бактерии.

Метод на Харада и Мори. 7 ml дестилирана вода се добавят към епруветките, поставени в стойка. Вземете 0,5 g изпражнения с дървена клечка и направете намазка върху филтърна хартия (15 х 150 mm) на 5 cm от левия ръб (тази операция се извършва върху лист хартия, за да се предпази повърхността на лабораторната маса). След това лентата с намазката се вкарва в епруветката така, че левият край, свободен от намазката, да достигне дъното на епруветката. Покрийте горния край с парче целофан и го увийте плътно с ластик. На епруветката напишете номера, името на предмета. В това състояние епруветките се съхраняват 8-10 дни при температура 28 °С. За да изследвате ларвите, отстранете и отстранете целофановото покритие и отстранете лента от филтърна хартия с пинсети. В този случай трябва да се внимава, тъй като малък брой инфекциозни ларви могат да се придвижат до горния край на филтърната хартия или до стената на епруветката и да проникнат под повърхността на целофана.

Епруветките се поставят в гореща водна баня при 50°C за 15 минути, след което съдържанието се разклаща и бързо се излива в 15-ml епруветка за утаяване на ларви. След центрофугиране, супернатантата се отстранява и утайката се прехвърля върху предметно стъкло, покрива се с покривно стъкло и се микроскопира при слабо увеличение.

За диференциална диагноза на филариформени ларви е необходимо да се използват данните в таблица 3.

Таблица 3

ДИФЕРЕНЦИАЛНА ДИАГНОЗА НА ФИЛАРИРАНИ ЛАРВОИ НА A. DUODENALE, N. AMERICANUS, S. STERCORALIS, triCHOStrONGYLUS SP.

Ларви	Размери	Характерни особености
A. duodenale	Дължина на тялото около 660 микрона, шапка - 720 nm	Набраздяването на капачката е по-слабо изразено, изпъкналостта на устата е по-малко забележима, предният край на тялото (но не и капачката) е тъп, диаметърът на чревната тръба е по-малък от луковицата на хранопровода, опашният край е тъп
N. americanus	Дължина на тялото около 590 микрона, шапка - 660 nm	Обвивката е забележимо набраздена, особено в опашната част на тялото, устата изглежда тъмна, предният край на тялото (но не обвивката) е закръглен като тесен край. кокоше яйце, предната част на чревната тръба с диаметър като луковицата на хранопровода, опашният край е остро заострен
S. stercoralis	Дължина на тялото около 500 микрона	Ларва без обвивка, хранопроводът е около половината от дължината на тялото, опашката е тъпа или разклонена
Trichostrongylus sp.	Дължина на тялото около 750 микрона	Чревният лумен не е прав, а зигзагообразен, каудалният край е заоблен и има формата на копче

7.7.2. Методи за оцветяване на яйца и ларви на хелминти

Мъртвите тъкани в повечето случаи възприемат цветовете по-бързо от живите. Тези характеристики се използват в хелминтологията за определяне на жизнеспособността на яйцата и ларвите на хелминтите. В някои случаи обаче някои бои се възприемат по-добре от живите тъкани, отколкото от мъртвите.

За диференциалното определяне на живи и мъртви яйца и ларви се използват следните бои и методи.

Метилен синьо левкобаза често се използва за оцветяване на живи и мъртви тъкани. Жива клетка или тъкан редуцира метиленово синьо до безцветна левкобаза; мъртвата тъкан няма тази способност и следователно придобива цвят.

Критерият за състоянието на яйцето е оцветяването на ембриона, но не и на черупката. Тази способност е свързана с условията на смърт на яйцеклетката. В случаите, когато влакнестата обвивка в мъртвото яйце не губи своите полупропускливи свойства, тя няма да премине багрила, следователно мъртвият ембрион няма да бъде оцветен. Оцветеният ембрион винаги показва смъртта на яйцето.

За оцветяване на яйца от ascaris можете да използвате метиленово синьо в разтвор на млечна киселина с каустик алкали (метиленово синьо 0,05 g, сода каустик 0,5 g, млечна киселина - 15 ml). Живите яйца не възприемат цвят; ембрионите на мъртвите яйца стават сини. Ларвите на Ascaris се оцветяват с основен разтвор на брилянтно-крезилова синя боя в концентрация 1:10 000, както следва: капка течност с яйца на ascaris и капка основен разтвор на боята се нанасят върху предметно стъкло. Препаратът се покрива с покривно стъкло, което се притиска плътно към предметното стъкло с леко почукване с дисекционна игла. Под микроскоп се наблюдават броят на появяващите се ларви и степента на тяхното оцветяване; след което същият препарат се преглежда отново след 2 до 3 часа. Само недеформирани ларви, които не са оцветени в рамките на 2 часа, се считат за живи. Мъртвите ларви или не излизат от яйцата, или се оцветяват, когато черупката се счупи (частично или напълно).

При определяне на жизнеспособността на яйцата на птиците Ascaridia е възможно препаратите да се оцветят с 5% алкохолен разтворйод. Когато се прилага към лекарството, ембрионите на мъртвите яйца на ascarid за 1 - 3 секунди. са боядисани в оранжево.

Мъртвите яйца на описторхиса и онкосферите на говежди тения се оцветяват с разтвор на толуидиново синьо (1: 1000), а мъртвите онкосфери на говежди тения се оцветяват с разтвор на брилянтно-крезилово синьо (1: 10 000). В същото време ембрионите и черупките на мъртвите и живите яйца придобиват цвят. Затова след оцветяването яйцата и онкосферите се измиват с чиста вода и се оцветяват допълнително със сафранин (в разреждане 1:10 000 алкохол, 10°С). Алкохолът премахва боята от черупките, а сафранинът оцветява в червено. В резултат на това живите яйца стават червени; яйца с мъртви ембриони - в синьо, а черупката остава червена. Мъртвите ембриони на онкосфери от говежди тения бързо, в рамките на няколко минути, се оцветяват в ярко червено или розово със сафранин или синьо с брилянтно-крезилово синьо при разреждане 1:4000 или с индигокармин при разреждане 1:1000 - 1. :2000. Живите ембриони не се променят под въздействието на тези цветове дори след 2 - 7 часа.

За да се определи жизнеспособността на яйцата на малката тения, се препоръчва използването на следните бои:

1. Брилянтно creasyl blue (1:8000) - след 1 час онкосферата на мъртвите яйца е особено ярко оцветена, което се откроява рязко на бледия или безцветен фон на останалата част от яйцето.

2. Сафранин (1:8000 за 2 часа и 1:5000 за 3 до 5 часа).

3. 50% разтвор на пирогалова киселина в разреждане 1: 2 - при излагане в продължение на 1 час при температура 29 - 30 ° C (колкото по-ниска е температурата, толкова по-дълъг е процесът на оцветяване).

7.7.3. Луминесцентен метод за изследване на яйца и ларви на хелминти

Флуоресцентната микроскопия дава възможност да се разграничат живи и мъртви обекти, без да се повреди яйцето. Не се използва за флуоресценция ултравиолетови лъчи, и синьо-виолетовата част от видимата светлина, с обикновен микроскоп и предметни стъкла; към осветителя OI-18 се добавя специален набор от цветни филтри.

Живите и мъртвите яйца на кръгли червеи, острици, малки тении, говежди тении, широки тении и други хелминти светят по различен начин. Това явление се наблюдава както по време на първична луминесценция без използване на багрила, така и при оцветяване с флуорохроми (акридин оранжево, корифосфин, примулин, ауролин, берлерин сулфат, трипафлавин, риванол, хинакрин и др.).

Неоцветени, живи несегментирани яйца на кръгли червеи светят ярко зелено с жълтеникав оттенък; в мъртвите яйца черупката излъчва зелена светлина много по-ярка от тъмнозелената ембрионална част; при яйцата на кръгли червеи с ларва се появява само черупката, докато при мъртвите и черупката, и ларвата са ярко жълти.

Непигментираните и несегментираните живи яйца на острици и джуджета тения излъчват зеленикаво-жълта светлина; в мъртвите яйца черупката интензивно луминесцира на фона на тъмнозелена ембрионална маса.

С вторична луминесценция (при оцветяване на акридиново оранжево при разреждане 1: 10 000 и 1: 50 000 от 30 минути до 2 часа) черупката на живи и мъртви нематоди, трематоди и цестоди луминесцира по различен начин.

Черупката на живи и мъртви яйца на аскариди, токсокар, острици, малки тении, плъхове тении, бичи тении, тении става оранжево-червена. Ембрионите на живи яйца на ascaris, toxascaris, плъхова тения, широка тения и онкосфера на говежда тения луминесцират в мътно тъмнозелен или сиво-зелен цвят. Мъртвите ембриони от яйца на тези хелминти излъчват "горящ" оранжево-червен цвят. Живите ларви на острици и токсокарите (яйчени черупки) излъчват матова сиво-зелена светлина и когато умрат, цветът се променя от края на главата до „горящо“ светлозелено, след това жълто, оранжево и накрая до ярко оранжево.

При оцветяване с флуорохроми - корифосфилум, примулин, мъртвите яйца на аскариди и червеи показват блясък от лилаво-жълто до медно-червено. Жизнеспособните яйца не луминесцират, а стават тъмнозелени.

Живите яйца на трематоди (paragonimus и clonorchis) не луминесцират след оцветяване с акридиново оранжево, а от мъртвите яйца идва жълтеникаво-зелен цвят.

Методът на луминесценция може да се използва и за определяне на жизнеспособността на ларвите на хелминтите. И така, флуорохромен разтвор на акридин оранжев (1: 2000) ларви на стронгилат, рабдита светят: живи - зелени (с оттенък), мъртви - ярко оранжева светлина.

Живите мирацидии, излизащи от черупката, излъчват слаба синкава светлина с едва забележимо светло жълто венче от реснички, но 10-15 минути след смъртта те се появяват като ярка "горяща" светлозелена, а след това оранжево-червена светлина.

7.7.4. биологичен метод за изследване

Например, за да се определи жизнеспособността на яйцата от аскариди (свински аскариди, човешки, токсокара, токсаскарис и др.) За едно животно (морски свинчета, мишки) са необходими най-малко 100 - 300 яйца с развита ларва. Яйцата Ascaris в изотоничен разтвор на натриев хлорид се пипетират през устата на мишка или морско свинче. След 6 - 7 дни животното се заколва, отваря се и черният дроб и белите му дробове се изследват отделно за наличие на ларви на Ascaris. За целта черният дроб и белите дробове се нарязват на малки парчета с ножица и се изследват по метода на Берман или Супряга (точка 6.1.2).

Ако животните са били заразени с живи инвазивни яйца, тогава при аутопсия в черния дроб и белите дробове се откриват мигриращи ларви на Ascaris.

В случай на инфекция яйцата на фасциола в изпражненията на лабораторни животни могат да бъдат открити при зайци след 2 месеца, при морски свинчета - след 50 дни, при мишки - след 35-40 дни.

За по-бърза реакция лабораторните животни се отварят след 20-30 дни и черният дроб се изследва за наличие на млади фасциоли.

За да се определи жизнеспособността на яйцата на малката тения, се препоръчва също да се хранят с тях незаразени преди това бели мишки, последвано от аутопсия на животните след 92-96 часа и откриване на цистицеркоиди в чревните въси или цестоди в чревния лумен.

За определяне на жизнеспособността на яйцата на opisthorchis се препоръчва метод (German S.M., Beer S.A., 1984), базиран на физикохимичното активиране на жлезата за люпене на мирацидиум и стимулиране на двигателната активност на ларвата, което води до отваряне на яйцето капак и активното освобождаване на мирацидий в експериментални условия.

Суспензия от яйца на описторхис във вода се охлажда предварително до 10 - 12 ° C (всички последващи операции се извършват при стайна температура 19 - 20 ° C). 1 капка суспензия, съдържаща 100-150 яйца, се добавя към центрофужна епруветка. Епруветката се поставя в статив за 5-10 минути. През това време всички яйца имат време да потънат на дъното. След това с лента от филтърна хартия внимателно се изсмуква излишната вода и в епруветката се добавят 2 капки специална среда. Средата се приготвя в 0.005 М Tris-HCl буфер; Към буфера се добавят 12 - 13% разтвор на етанол и багрило (магента, сафранин, еозин, метиленово синьо и др.). Епруветката се разклаща, съдържанието й се прехвърля с пипета върху предметно стъкло и се оставя за 10 минути при леко разклащане. След това добавете 2 капки от посочената среда. Препаратът е готов за микроскопиране под конвенционален светлинен микроскоп при 20x увеличение.

През това време капакът на жизнеспособните ларви се отваря и мирацидиумът активно навлиза в посочената среда. Поради наличието на етанол в него, те се обездвижват след 2-5 минути и след това се оцветяват с багрило. Те могат лесно да бъдат открити и преброени под микроскоп.