За адекватно и ефективно лечение на много инфекциозни заболявания е необходимо да се установи точна диагноза своевременно. За решаването на този проблем днес се използват високотехнологични диагностични методи, базирани на методите на молекулярната биология. В момента полимеразната верижна реакция (PCR) вече се използва широко в практическата медицина като най-надеждното лабораторно диагностично средство.

Какво обяснява популярността на PCR в момента?

Първо, този метод се използва за идентифициране на патогени на различни инфекциозни заболявания с висока точност.

На второ място, за наблюдение на ефективността на лечението.

В различни наръчници, проспекти, статии, както и разяснения на медицински специалисти, често срещаме използването на неразбираеми термини и думи. Наистина е трудно да се говори за високотехнологични продукти на науката с обикновени думи.

Каква е същността и механиката на PCR диагностиката?

Всеки жив организъм има свои уникални гени. Гените се намират в молекулата на ДНК, която всъщност е "визитната картичка" на всеки отделен организъм. ДНК (генетичен материал) е много дълга молекула, която се състои от градивни елементи, наречени нуклеотиди. За всеки патоген на инфекциозни заболявания те са разположени строго специфични, тоест в определена последователност и комбинация. Когато е необходимо да се разбере дали човек има определен патоген, се взема биологичен материал (кръв, урина, слюнка, намазка), който съдържа ДНК или ДНК фрагменти на микроба. Но количеството на генетичния материал на патогена е много малко и е невъзможно да се каже към кой микроорганизъм принадлежи. За решаването на този проблем служи PCR. Същността на полимеразната верижна реакция е, че се взема малко количество материал за изследване, съдържащ ДНК, и по време на процеса на PCR количеството генетичен материал, принадлежащ на определен патоген, се увеличава и по този начин той може да бъде идентифициран.

PCR диагностиката е генетично изследване на биоматериал.

Идеята за PCR метода принадлежи на американския учен К. Мълинс, който той предложи през 1983 г. Въпреки това, той получи широко клинично приложение едва в средата на 90-те години на XX век.

Нека да се справим с терминологията, какво е това - ДНК и т.н. Всяка клетка на всяко живо същество (животно, растение, човек, бактерия, вирус) има хромозоми. Хромозомите са пазители на генетична информация, която съдържа цялата последователност от гени на всяко конкретно живо същество.

Всяка хромозома се състои от две вериги на ДНК, които са усукани в спирала една спрямо друга. ДНК е химически дезоксирибонуклеинова киселина, която се състои от структурни компоненти - нуклеотиди. Има 5 вида нуклеотиди - тимин (Т), аденозин (А), гуанин (G), цитозин (С) и урацил (U). Нуклеотидите се подреждат един след друг в строго индивидуална последователност, образувайки гени. Един ген може да се състои от 20-200 такива нуклеотида. Например, генът, кодиращ производството на инсулин, е дълъг 60 базови двойки.

Нуклеотидите имат свойството на комплементарност. Това означава, че срещу аденин (А) в едната верига на ДНК винаги има тимин (Т) в другата верига, а срещу гуанин (G) - цитозин (С). Схематично изглежда така:
G - C
Т - А
А - Т
Това свойство на комплементарност е ключово за PCR.

В допълнение към ДНК, РНК има същата структура - рибонуклеинова киселина, която се различава от ДНК по това, че използва урацил вместо тимин. РНК - е пазител на генетична информация в някои вируси, които се наричат ​​ретровируси (например ХИВ).

Молекулите на ДНК и РНК могат да се "умножават" (това свойство се използва за PCR). Това се случва по следния начин: две вериги на ДНК или РНК се отдалечават една от друга настрани, специален ензим седи на всяка нишка, която синтезира нова верига. Синтезът протича според принципа на комплементарността, т.е. ако нуклеотид А е в оригиналната ДНК верига, тогава Т ще бъде в новосинтезираната, ако G - тогава С и т.н. Този специален ензим "строител" се нуждае от "семе" - последователност от 5-15 нуклеотида - за да започне синтеза. Това „семе“ е дефинирано за всеки ген (ген на хламидия, микоплазма, вируси) експериментално.

И така, всеки PCR цикъл се състои от три етапа. В първия етап се случва т. нар. размотаване на ДНК – тоест разделяне на двете вериги на ДНК, свързани една с друга. Във втория "семето" е прикрепено към част от ДНК веригата. И накрая, удължаването на тези ДНК вериги, което се произвежда от ензима "строител". Понастоящем целият този сложен процес се извършва в една епруветка и се състои от повтарящи се цикли на възпроизвеждане на определената ДНК, за да се получат голям брой копия, които след това могат да бъдат открити с конвенционални методи. Тоест от една верига на ДНК получаваме стотици или хиляди.

Етапи на PCR изследване

Вземане на биологичен материал за изследване

Различен биологичен материал служи като проба: кръв и нейните компоненти, урина, слюнка, секрети от лигавиците, гръбначно-мозъчна течност, отделяне от раневи повърхности, съдържание на телесни кухини. Всички биопроби се събират с инструменти за еднократна употреба, като събраният материал се поставя в стерилни пластмасови епруветки или върху хранителна среда, последвано от транспортиране до лабораторията.

Необходимите реактиви се добавят към взетите проби и се поставят в програмируем термостат – термоциклер (усилвател). В циклера цикълът на PCR се повтаря 30-50 пъти, състоящ се от три етапа (денатурация, отгряване и удължаване). Какво означава това? Нека разгледаме по-подробно.

Етапи на незабавна PCR реакция, копиране на генетичен материал

азPCR етап - Подготовка на генетичен материал за копиране.
Възниква при температура от 95 ° C, докато нишките на ДНК са разединени и „семената“ могат да седят върху тях.

"Семената" се произвеждат индустриално от различни научно-производствени асоциации, а лабораториите купуват готови. В същото време „семето“ за откриване например на хламидия работи само за хламидия и т.н. По този начин, ако биоматериалът се тества за наличие на хламидийна инфекция, тогава в реакционната смес се поставя "семе" за хламидия; ако тествате биоматериала за вируса на Epstein-Barr, тогава "семето" за вируса на Epstein-Barr.

IIетап - Комбиниране на генетичния материал на инфекциозния агент и "семето".
Ако има ДНК на вируса или бактерията, която трябва да се определи, „семето“ се намира върху тази ДНК. Този процес на добавяне на праймер е втората стъпка от PCR. Този етап протича при температура 75°C.

IIIетап - Копиране на генетичния материал на инфекциозния агент.
Това е процесът на действителното удължаване или възпроизвеждане на генетичен материал, който се случва при 72°C. Ензим-строител се доближава до "семената" и синтезира нова верига на ДНК. С края на синтеза на нова ДНК верига завършва и PCR цикълът. Тоест в един PCR цикъл количеството генетичен материал се удвоява. Например, в първоначалната проба имаше 100 ДНК молекули на вирус, след първия PCR цикъл вече ще има 200 ДНК молекули на тествания вирус в пробата. Един цикъл е с продължителност 2-3 минути.

За да се генерира достатъчно генетичен материал за идентификация, обикновено се извършват 30-50 PCR цикъла, което отнема 2-3 часа.

Етап на идентификация на размножения генетичен материал

Самият PCR приключва тук и след това идва също толкова значимият етап на идентификация. За идентификация се използва електрофореза или етикетирани "семена". Когато се използва електрофореза, получените ДНК вериги се разделят по размер и наличието на ДНК фрагменти с различна дължина показва положителен резултат от анализа (т.е. наличието на определен вирус, бактерия и др.). Когато се използват етикетирани "семена", към крайния продукт на реакцията се добавя хромоген (багрило), в резултат на което ензимната реакция се придружава от образуването на цвят. Развитието на цвят показва директно, че в оригиналната проба присъства вирус или друг откриваем агент.

Днес, използвайки етикетирани "семена", както и подходящ софтуер, е възможно незабавно да "разчетете" резултатите от PCR. Това е така нареченият PCR в реално време.

Защо PCR диагностиката е толкова ценна?

Едно от съществените предимства на PCR метода е неговата висока чувствителност – от 95 до 100%. Въпреки това, тези предимства трябва да се основават на задължителното спазване на следните условия:

1. правилно вземане на проби, транспортиране на биологичен материал;
2. наличие на стерилни инструменти за еднократна употреба, специални лаборатории и обучен персонал;
3. стриктно спазване на методиката и стерилност по време на анализа

Чувствителността варира за различните открити микроби. Така например чувствителността на PCR метода за откриване на вируса на хепатит С е 97-98%, чувствителността за откриване на уреаплазма е 99-100%.

Възможностите, присъщи на PCR анализа ви позволяват да постигнете ненадмината аналитична специфичност. Това означава да се идентифицира точно търсеният микроорганизъм, а не подобен или тясно свързан.
Диагностичната чувствителност и специфичност на метода PCR често надвишава тези на културелния метод, който се нарича "златен стандарт" за откриване на инфекциозни заболявания. Като се има предвид продължителността на растежа на културата (от няколко дни до няколко седмици), предимството на PCR метода става очевидно.

PCR в диагностиката на инфекции
Предимствата на PCR метода (чувствителност и специфичност) определят широк спектър от приложения в съвременната медицина.
Основните области на приложение на PCR диагностиката:

1. диагностика на остри и хронични инфекциозни заболявания с различна локализация
2. проследяване на ефективността на терапията
3. изясняване на вида на патогена

PCR се използва в акушерството, гинекологията, неонатологията, педиатрията, урологията, венерологията, нефрологията, клиниката по инфекциозни болести, офталмологията, неврологията, фтизиопулмологията и др.

Използването на PCR диагностика се извършва заедно с други изследователски методи (ELISA, PIF, RIF и др.). Тяхната комбинация и целесъобразност се определят от лекуващия лекар.

Инфекциозни агенти, открити чрез PCR

Вируси:

1. HIV-1 и HIV-2 ретровируси
2. херпетиформни вируси
3. вирус на херпес симплекс тип 1 и 2

Полимеразна верижна реакция (PCR)- експериментален метод на молекулярната биология, който представлява специфична амплификация на нуклеинови киселини, индуцирана от синтетични олигонуклеотидни праймери инвитро.

Идеята за разработване на метода PCR принадлежи на американския изследовател Кари Мулис, който през 1983 г. създава метод, който прави възможно амплифицирането на ДНК по време на циклични удвоявания с помощта на ензима ДНК полимераза при изкуствени условия. Няколко години след публикуването на тази идея, през 1993 г., К. Мълис получава Нобелова награда за нея.

В началото на използването на метода, след всеки цикъл на нагряване-охлаждане, беше необходимо да се добави ДНК полимераза към реакционната смес, тъй като тя бързо се инактивира при висока температура. Процедурата беше много неефективна, изискваше много време и ензими. През 1986 г. той е значително модифициран чрез използване на ДНК полимераза от термофилни бактерии. Тези ензими са в състояние да издържат на много реакционни цикли, което ви позволява да автоматизирате PCR. Една от най-често използваните термостабилни ДНК полимерази е изолирана от бактерии. Thermus aquaticusи именуван Taq-ДНК полимераза.

Същността на метода.Методът се основава на многократно селективно копиране на определена ДНК област с помощта на ензима Taq-ДНК полимераза. Полимеразната верижна реакция дава възможност да се получат амплификации с дължина до няколко хиляди базови двойки. За да се увеличи дължината на PCR продукта до 20-40 хиляди базови двойки, се използва смес от различни полимерази, но все още е много по-малка от дължината на хромозомната ДНК на еукариотна клетка.

Реакцията се извършва в програмируем термостат (усилвател) - устройство, което може да извърши достатъчно бързо

охлаждане и нагряване на епруветки (обикновено с точност най-малко 0,1 °C). Усилвателите ви позволяват да задавате сложни програми, включително такива с възможност за "горещ старт" и последващо съхранение. За PCR в реално време се произвеждат устройства, оборудвани с флуоресцентен детектор. Инструментите се предлагат и с автоматичен капак и отделение за микроплака, което им позволява да бъдат интегрирани в автоматизирани системи.

Обикновено по време на PCR се извършват 20-45 цикъла, всеки от които се състои от три етапа: денатурация, отгряване на праймера, удължаване (фиг. 6.1 и 6.2). На фиг. 6.1 показва динамиката на температурните промени в епруветката по време на PCR цикъла.

Ориз. 6.1.Графика на промяната на температурата в епруветката по време на един цикъл на полимеразната верижна реакция

Денатурация на ДНК матрицасе извършва чрез нагряване на реакционната смес до 94-96 ° C за 5-90 s, така че ДНК веригите да се диспергират. Трябва да се отбележи, че преди първия цикъл реакционната смес се загрява предварително за 2-5 минути, за да се денатурира напълно първоначалната матрица, което позволява да се намали количеството на неспецифичните реакционни продукти.

Ориз. 6.2.Схема на първия цикъл на полимеразната верижна реакция

Етап на отгряване на грунд.С постепенно понижаване на температурата праймерите се свързват комплементарно с шаблона. Температурата на отгряване зависи от състава на праймерите и обикновено е с 4-5°C по-ниска от изчислената температура на топене. Продължителността на етапа е 5-60 s.

По време на следващия етап - удължаване- има синтез на дъщерната верига на ДНК върху майчината матрица. Температурата на удължаване зависи от полимеразата. Често използваните Taq и Pfu ДНК полимерази са най-активни при 72°C. Времето на удължаване, главно зависимо от дължината на PCR продукта, обикновено е 1 минута на 1000 базови двойки.

Което ви позволява да откриете в биологичен материал малки количества, по-точно определени фрагменти от него, и да ги умножите многократно. След това те се идентифицират визуално чрез гел електрофореза. Реакцията е разработена през 1983 г. от K. Mullis и е включена в списъка на изключителните открития през последните години.

Какви са механизмите на PCR

Цялата техника се основава на способността на нуклеиновите киселини да се самовъзпроизвеждат, което в случая се извършва изкуствено в лаборатория. Възпроизвеждането на ДНК не може да започне в която и да е област на молекулата, а само в области с определена нуклеотидна последователност - начални фрагменти. За да започне полимеразната верижна реакция, са необходими праймери (или ДНК проби). Това са къси фрагменти от ДНК верига с дадена нуклеотидна последователност. Те са комплементарни (т.е. кореспондиращи) на началните места

Разбира се, за да създадат праймери, учените трябва да проучат нуклеотидната последователност на този, който участва в техниката. Именно тези ДНК сонди осигуряват специфичността на реакцията и нейното започване. няма да работи, ако поне една молекула от желаната ДНК не бъде намерена в пробата. Като цяло, горните праймери, набор от нуклеотиди, устойчива на топлина ДНК полимераза са необходими за протичане на реакцията. Последният е ензим, който катализира синтеза на нови молекули нуклеинова киселина въз основа на пробата. Всички тези вещества, включително биологичния материал, в който е необходимо да се открие ДНК, се комбинират в реакционна смес (разтвор). Поставя се в специален термостат, който извършва много бързо нагряване и охлаждане за определено време - цикъл. Обикновено има 30-50 от тях.

Как протича тази реакция?

Същността му е, че по време на един цикъл праймерите се прикрепват към желаните участъци от ДНК, след което се удвоява под действието на ензима. На базата на получените ДНК вериги в следващите цикли се синтезират нови и нови идентични фрагменти от молекулата.

Полимеразната верижна реакция протича последователно, като се разграничават следващите й етапи. Първият се характеризира с удвояване на количеството продукт по време на всеки цикъл на нагряване и охлаждане. Във втория етап реакцията се забавя, тъй като ензимът е повреден и също губи активност. Освен това се изчерпват запасите от нуклеотиди и праймери. На последния етап - плато - продуктите вече не се натрупват, тъй като реагентите са свършили.

Къде се използва

Несъмнено полимеразната верижна реакция намира най-широко приложение в медицината и науката. Използва се в общата и частната биология, ветеринарната медицина, фармацията и дори екологията. Освен това в последните те правят това, за да наблюдават качеството на хранителните продукти и обектите на околната среда. Полимеразната верижна реакция се използва активно в съдебната практика за потвърждаване на бащинството и идентифициране на човек. В криминалистиката, както и в палеонтологията, тази техника често е единственият изход, тъй като обикновено много малко ДНК е достъпно за изследване. Разбира се, методът е намерил много широко приложение в практическата медицина. Необходимо е в области като генетика, инфекциозни и онкологични заболявания.

Сайтът предоставя справочна информация само за информационни цели. Диагностиката и лечението на заболяванията трябва да се извършват под наблюдението на специалист. Всички лекарства имат противопоказания. Необходим е експертен съвет!

Метод полимеразна верижна реакцияе открит преди почти тридесет години от американски учен на име Кари Мълис. Техниката се използва широко в медицината като диагностичен инструмент и същността й е да копира участък от ДНК с помощта на специален ензим ( полимераза) изкуствено ин витро.

В какви области на медицината се използва този метод?

За какво е копирането на ДНК и как то може да служи на медицината?
Тази техника позволява:

• Изолирайте и клонирайте гени.
• Диагностика на генетични и инфекциозни заболявания.
• Определете бащинството. Детето наследява някои от генетичните характеристики от своите биологични родители, но има своя собствена уникална генетична идентичност. Наличието в него на някои гени, които са идентични с родителските гени - ни позволява да говорим за установяване на родство.

Полимеразна верижна реакция се използва и в съдебномедицинската практика.

На местопрестъплението криминалистите събират проби от генетични материали. Те включват: коса, слюнка, кръв. Впоследствие, благодарение на техниката на полимеразна реакция, е възможно да се амплифицира ДНК и да се сравни идентичността на взетата проба с генетичния материал на заподозряното лице.

В медицината полимеразната верижна реакция се използва ефективно:

• В пулмологичната практика - за диференциране на бактериални и вирусни видове пневмония, туберкулоза.
• В гинекологичната и урологичната практика - за определяне на уреаплазмоза, хламидия, микоплазмена инфекция, гарднерелоза, херпес, гонорея.
• в гастроентерологичната практика.
• В хематологията - за определяне на онковируси и цитомегаловирусна инфекция.
• При експресна диагностика на такива инфекциозни заболявания като вирусен хепатит, дифтерия, салмонелоза.

В момента този метод е най-широко използван при диагностицирането на инфекциозни заболявания ( хепатит с вирусна етиология, ХИВ, полово предавани болести, туберкулоза, енцефалит, пренасян от кърлежи).

Какво се случва по време на реакция?

Самата реакция е химически проста. Като източник на ДНК за реакцията може да послужи капка кръв, косъм, парче кожа и др. На теория реакцията изисква правилните реагенти, епруветка, проба от биологичен материал и източник на топлина.

Полимеразната реакция позволява да се открие инфекция, дори ако в пробата с биологичен материал присъства само една или няколко ДНК молекули на патогена.

По време на реакцията, благодарение на ензима ДНК полимераза, настъпва удвояване ( репликация) участък от ДНК. Самата дезоксирибонуклеинова киселина ДНК накратко) е важен за нас, тъй като осигурява съхранението и предаването на генетична информация към дъщерните клетки. ДНК има формата на спирала, която се състои от повтарящи се блокове. Тези блокове изграждат нуклеотиди, които са най-малката единица на ДНК. Нуклеотидите се образуват от аминокиселини.

Процесът на репликиране на участъци от ДНК се случва по време на повтарящи се цикли. Във всеки такъв цикъл не само оригиналният ДНК фрагмент се копира и удвоява, но и тези фрагменти, които вече са се удвоили в предишния цикъл на амплификация. Всичко това наподобява процеса на геометрична прогресия.

съществува:

• естествено усилване ( тоест процесът на копиране и умножаване на ДНК), което се случва в нашето тяло и е детерминистичен, предварително определен процес.
• Изкуствено усилване, което възниква поради полимеразната верижна реакция. В този случай процесът на копиране се контролира и дава възможност да се дублират дори къси участъци от нуклеинова киселина.

След завършване на всеки цикъл на копиране, броят на фрагментите от нуклеинова киселина нараства експоненциално. Ето защо самият процес се нарича "верижна реакция".

След тридесет до четиридесет цикъла броят на фрагментите достига няколко милиарда.

За усилване инвитро (инвитро) необходимо е във взетата за диагностика биосреда да присъства специфичен чужд ДНК фрагмент ( тоест не ДНК на пациента, а патогена). Ако в създадения разтвор няма специфичен фрагмент, верижната реакция под действието на полимеразата няма да започне. Това обяснява факта на високата специфичност на PCR.

Етапи на PCR диагностика

1. От тестовия материал се изолира ДНК.
2. ДНК се добавя към специален разтвор от нуклеотиди.
3. Разтворът се нагрява до температура от 90 - 95 градуса по Целзий, така че ДНК протеинът да се сгъне.
4. Намалете температурата до 60 градуса.
5. Тъй като циклите на повишаване и понижаване на температурата се повтарят, броят на сегментите на нуклеиновата киселина се увеличава.

6. Чрез провеждане на електрофореза резултатът се сумира и се изчисляват резултатите от удвояването.

Какви са предимствата на тази диагностика?

• Универсалност: Всяка проба от нуклеинова киселина е подходяща за този метод.
• Висока специфичност: патогенът има уникални ДНК последователности, които са специфични за него. Следователно резултатите от проведената PCR ще бъдат надеждни, невъзможно е да се обърка генът на един патоген с гена на друг патоген.
• Чувствителност към наличието дори на една молекула от патогена.

• Малко количество материал, необходим за изследване. Дори капка кръв ще свърши работа. Възможността за получаване на резултат с минимален обем проба е много важна за педиатрични, неонатологични, неврологични изследвания, както и в практиката на съдебната медицина.
• Способността да се идентифицира бавна, хронична инфекция, а не само остра.
• Много култури, причиняващи болести, са много трудни за култивиране в епруветка с други методи, а полимеразната реакция позволява културата да бъде размножена в точното количество.

Какви са недостатъците на тази диагностика?

• Ако материалът, предназначен за PCR, съдържа ДНК не само на жив патоген, но и на починал, и двете ДНК ще бъдат амплифицирани. Съответно лечението след диагнозата може да не е напълно правилно. След известно време е по-добре да преминете контрола на ефективността на лечението.
• Свръхчувствителността към наличието на микроорганизми също може да се счита по някакъв начин за недостатък. В края на краищата, обикновено в човешкото тяло има условно патогенна микрофлора, тоест това са микроорганизми, които живеят в червата, стомаха и други вътрешни органи. Тези микроорганизми могат да навредят на човек само при определени неблагоприятни условия - неспазване на хигиенните изисквания, замърсена питейна вода и др. PCR техниката амплифицира ДНК дори на тези микроорганизми, въпреки че те не водят до патология.
• PCR на различни системи за тестване може да покаже резултати, които ще се различават един от друг. Има много модификации на тази техника: вложени», « асиметричен», « обърнат», « количествен» PCR и др.

Федерална агенция за образование

Държавно учебно заведение

Висше професионално образование

"Карелска държавна педагогическа академия"

Курсова работа по темата:

Полимеразна верижна реакция (PCR) и нейното приложение

Изпълнено от: студент Корягина Валерия Александровна

Проверено от: Карпикова Наталия Михайловна

Петрозаводск 2013 г

Въведение

Глава 1 Преглед на литературата

1.5.4 Ефект на платото

1.5.6 Усилване

Заключение

Въведение

Последните двадесет години бяха белязани от широкото въвеждане на молекулярно-генетичните методи в биологичните, медицинските и селскостопанските науки.

До началото на 70-те години изглеждаше, че молекулярната биология е достигнала известна степен на съвършенство. През този период микроорганизмите са основният обект на молекулярно-генетичните изследвания. Преходът към еукариоти поставя изследователите пред напълно нови проблеми, които не могат да бъдат решени с помощта на методите за генетичен анализ, съществуващи по това време. Пробивът в развитието на молекулярната генетика стана възможен благодарение на появата на нов експериментален инструмент - рестрикционни ендонуклеази. През следващите години броят на методите за директен ДНК анализ, базирани на качествено различни подходи, започна бързо да нараства.

В много случаи съвременните технологии позволяват да се започне изследване на фината структурна и функционална организация на ядрените и извънядрените геноми на различни организми на по-дълбоко ниво. Това беше от особено значение за разработването на нови методи за диагностика и лечение на различни заболявания. Не по-малко важна беше възможността за използване на постиженията на молекулярната генетика в популационната биология и развъждането за идентифициране и анализ на генетичната променливост на популации, сортове и щамове, идентифициране и сертифициране на икономически ценни индивиди, създаване на генетично модифицирани организми и решаване на други проблеми.

Всеки метод има своите предимства и недостатъци. Няма универсален метод, който да разреши всички възникнали проблеми. Следователно изборът на конкретен метод за провежданото изследване е един от най-важните етапи на всяка научна работа.

Глава 1 Преглед на литературата

1.1 История на откриването на полимеразната верижна реакция (PCR)

През 1983 г. К.Б. Mullis et al публикуват и патентоват метода на полимеразната верижна реакция (PCR), който е предопределен да има дълбоко въздействие върху всички области на изследване и приложение на нуклеинови киселини. Значението на този метод за молекулярната биология и генетика се оказва толкова голямо и очевидно, че седем години по-късно авторът е удостоен с Нобелова награда за химия.

В началото на използването на метода, след всеки цикъл на нагряване-охлаждане, към реакционната смес трябваше да се добави ДНК полимераза, тъй като тя беше инактивирана при висока температура, необходима за разделяне на веригите на ДНК спиралата. Реакционната процедура беше относително неефективна, изискваше много време и ензими. През 1986 г. методът на полимеразна верижна реакция е значително подобрен. Предложено е да се използват ДНК полимерази от термофилни бактерии. Тези ензими се оказаха термостабилни и успяха да издържат на много реакционни цикли. Използването им направи възможно опростяването и автоматизирането на PCR. Една от първите термостабилни ДНК полимерази е изолирана от бактерии Thermus aquaticusи именуван Taq- полимераза.

Възможността за амплифициране на всеки ДНК сегмент, чиято нуклеотидна последователност е известна, и получаването му след PCR в хомогенна форма и препаративно количество, прави PCR алтернативен метод за молекулярно клониране на къси ДНК фрагменти. В този случай не е необходимо да се прилагат сложни методологични техники, които се използват в генното инженерство при конвенционалното клониране. Развитието на PCR метода значително разшири методологичните възможности на молекулярната генетика, и по-специално на генното инженерство, дотолкова, че коренно промени и засили научния потенциал на много от нейните области.

1.2 Разновидности на полимеразна верижна реакция (PCR)

· Вложен PCR- използва се за намаляване на броя на страничните продукти от реакцията. Използвайте два чифта праймери и извършете две последователни реакции. Втората двойка праймери амплифицира ДНК региона в продукта от първата реакция.

· Обърнат PCR- се използва, когато е известна само малка област в желаната последователност. Този метод е особено полезен, когато е необходимо да се определят съседни последователности след вмъкване на ДНК в генома. За прилагането на инвертирана PCR се извършва серия от ДНК разрези с рестрикционни ензими<#"justify">праймер за полимеразна верижна реакция

· Групово-специфична PCR- PCR за роднини<#"center">1.3 Полимеразна верижна реакция

Открита в средата на 80-те години на миналия век, полимеразната верижна реакция (PCR) може да увеличи броя на копията на оригинална проба милиони пъти в рамките на няколко часа. По време на всеки цикъл на реакцията се образуват две копия от оригиналната молекула. Всяко от синтезираните ДНК копия може да служи като шаблон за синтеза на нови ДНК копия в следващия цикъл. Така многократното повторение на циклите води до експоненциално увеличаване на броя на копията. От изчисленията следва, че дори да има 30 цикъла, броят на копията на оригиналната молекула ще бъде повече от 1 милиард. Дори ако вземем предвид, че не всички ампликони се дублират по време на всеки цикъл, общият брой копия въпреки това е доста голяма цифра.

Всеки цикъл на полимеразна верижна реакция (PCR) се състои от следните стъпки:

· Денатурация - Повишаването на температурата кара двуверижната молекула на ДНК да се развие и да се раздели на две едноверижни;

· Отгряване - Понижаването на температурата позволява на праймерите да се прикрепят към комплементарни области на ДНК молекулата;

· Удължаване - Ензимът ДНК полимераза завършва комплементарната верига.

За амплификация на избрания фрагмент се използват два олигонуклеотидни праймера (семена), фланкиращи определена ДНК област. Ориентирани към грундове 3 - завършват един към друг и по посока на последователността, която трябва да се усили. ДНК полимеразата осъществява синтеза (завършването) на взаимно допълващи се ДНК вериги, започвайки с праймери. По време на синтеза на ДНК праймерите се вмъкват физически във веригата от новосинтезирани ДНК молекули. Всяка верига на ДНК молекулата, образувана с помощта на един от праймерите, може да служи като матрица за синтеза на комплементарна ДНК верига, използвайки другия праймер.

1.4 Провеждане на полимеразна верижна реакция (PCR)

Полимеразната верижна реакция се извършва в специални тънкостенни полипропиленови епруветки, съвместими по размер с използвания термоциклер (усилвател) - устройство, което контролира температурните и времевите характеристики на етапите на полимеразната верижна реакция (PCR) .

1.5 Принцип на метода на полимеразна верижна реакция

Полимеразна верижна реакция (PCR) е in vitro метод за усилване на ДНК, който може да изолира и умножи специфична ДНК последователност милиарди пъти в рамките на няколко часа. Възможността за получаване на огромен брой копия на една строго определена област на генома значително опростява изследването на съществуваща ДНК проба.

За провеждане на полимеразна верижна реакция трябва да бъдат изпълнени редица условия:

1.5.1 Наличие на редица компоненти в реакционната смес

Основните компоненти на реакционната (PCR) смес са: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, смес от нуклеотидни трифосфати (ATP, GTP, CTP, TTP), праймери (олигонуклеотиди), анализиран ДНК препарат, термостабилна ДНК полимераза. Всеки от компонентите на реакционната смес участва пряко в полимеразната верижна реакция (PCR), а концентрацията на реагентите пряко влияе върху хода на амплификацията.

· Tris-HCl - определя pH на реакционната смес, създава буферен капацитет. Активността на ДНК полимеразата зависи от pH на средата, така че стойността на pH пряко влияе върху хода на полимеразната верижна реакция. Обикновено стойността на pH е в диапазона 8 - 9,5. Високото pH се дължи на факта, че с повишаването на температурата pH на Tril-HCl буфера пада.

· KCl - концентрацията на калиев хлорид до 50 mm влияе върху хода на процесите на денатурация и отгряване, концентрацията над 50 mm инхибира ДНК полимеразата.

· MgCl 2- тъй като ДНК полимеразата е Mg 2+- зависим ензим, тогава концентрацията на магнезиеви йони влияе върху активността на ензима (Mg 2+образува комплекси с NTP - именно тези комплекси са субстрат за полимераза). Високата концентрация води до увеличаване на неспецифичното усилване, а ниската води до инхибиране на реакцията, оптималната (за различни полимерази) е в областта от 0,5 - 5 mM. В допълнение, концентрацията на магнезиеви соли влияе върху хода на процесите на денатурация и отгряване - повишаване на концентрацията на Mg 2+причинява повишаване на температурата на топене на ДНК (т.е. температурата, при която 50% от двойноверижните ДНК вериги се разпадат на едноверижни вериги).

· NTP - нуклеотидните трифосфати са директни мономери на нуклеиновите киселини. За да се предотврати прекъсването на веригата, се препоръчва еднакво съотношение на четирите нуклеотидни трифосфата. Ниската концентрация на тези компоненти в реакционната смес увеличава вероятността от грешки при изграждането на комплементарната ДНК верига.

· Грундове - Най-оптимално е използването на грундове с разлика в точката на топене не повече от 2 - 4 о C. Понякога при продължително съхранение при температура 4 о С, или след голям брой замразяване - размразяване, праймерите образуват вторични структури - димери, намаляващи ефективността на PCR. Отстраняването на този проблем се свежда до инкубиране на водна баня (Т=95 о В) за 3 минути и последващо бързо охлаждане до 0o ОТ.

· ДНК препарати - количеството и качеството на ДНК препарата (матрицата) пряко влияе върху хода и параметрите на полимеразната верижна реакция. Излишната ДНК проба инхибира полимеразната верижна реакция (PCR). Примесите на различни вещества в ДНК препарата също могат да намалят ефективността на полимеразната верижна реакция (PCR): натриев ацетат, натриев хлорид, изопропанол, етанол, хепарин, фенол, урея, хемоглобин и др.

· ДНК полимераза - при използване на малко количество ДНК полимераза се наблюдава намаляване на синтеза на крайния продукт правопропорционално на размера на фрагментите. Излишъкът от полимераза 2-4 пъти води до появата на дифузни спектри и 4-16 пъти - неспецифични спектри с ниско молекулно тегло. Диапазонът на използваните концентрации е 0,5 - 1,5 единици активност по отношение на 25 µl от PCR сместа.

В допълнение към основните компоненти на PCR сместа се използват редица допълнителни вещества, които подобряват качествените и количествените показатели на PCR: ацетамид (5%) - повишаване на разтворимостта на основните компоненти; бетаин (натриева сол) - стабилизиране на ДНК полимераза, понижаване на точката на топене на ДНК, изравняване на точката на топене; говежди албумин (10-100 μg / ml) - стабилизиране на ДНК полимераза; диметилсулфоксид (1-10%) - повишаване на разтворимостта на основните компоненти; формамид (2-10%) - повишаване на специфичността на отгряването; глицерол (15-20%) - повишаване на термичната стабилност на ензима, намаляване на температурата на денатурация на ДНК проба; амониев сулфат - понижаване на температурата на денатурация и отгряване.

1.5.2 Цикъл и температура

Общият изглед на програмата за полимеразна верижна реакция (PCR) е както следва:

сцена. Продължителна първична денатурация на ДНК препарата.1 цикъл

сцена. Бърза денатурация на ДНК препарата. Грунд отгряване. Удължение.30 - 45 цикъла.

сцена. Продължително удължаване. Охлаждане на реакционната смес 1 цикъл.

Всеки елемент от етапа - денатурация, отгряване, удължаване - има индивидуални температурни и времеви характеристики. Параметрите на температурата и времето на протичане на всеки елемент се избират емпирично, в съответствие с качествените и количествени показатели на продуктите на амплификацията.

Денатурация. По време на този елемент от полимеразната верижна реакция двуверижната ДНК молекула се разделя на две едноверижни. Температурните параметри на денатурация са в диапазона 90 - 95 о С, но в случай на ДНК проба с високо съдържание на гуанин и цитозин, температурата трябва да се повиши до 98 о C. Температурата на денатуриране трябва да е достатъчна за пълно денатуриране - разцепване на ДНК веригите и избягване на "внезапно охлаждане" или бързо отгряване, но термостабилната ДНК полимераза е по-малко стабилна при високи температури. По този начин изборът на оптимални температурни параметри на денатурация за съотношението праймер/проба (приготвяне на ДНК) е важно условие за амплификация. Ако температурата на денатурация в първия етап е над 95 о C, се препоръчва да се добави ДНК полимераза към реакционната смес след първична денатурация. Продължителността на този елемент от етапа по време на полимеразната верижна реакция (PCR) трябва да бъде достатъчна за пълна денатурация на ДНК, но в същото време да не повлиява значително активността на ДНК полимеразата при дадена температура.

Отгряване. Температура на отгряване (Т а ) е един от най-важните параметри на полимеразната верижна реакция. Температурата на отгряване за всеки конкретен грунд се избира индивидуално. Зависи от дължината и нуклеотидния състав на праймера. Обикновено е по-ниска с 2 - 4 о От стойността на точката на топене (Т м ) грунд. Ако температурата на отгряване на системата е под оптималната, тогава броят на неспецифичните амплифицирани фрагменти се увеличава и, обратно, по-високата температура намалява броя на амплифицираните продукти. В този случай концентрацията на специфични ампликони може рязко да намалее, до инхибиране на полимеразната верижна реакция (PCR). Увеличаването на времето за отгряване също води до увеличаване на броя на неспецифичните ампликони.

Удължение. Обикновено всеки тип термостабилна ДНК полимераза има индивидуален температурен оптимум на активност. Скоростта на синтез на комплементарна ДНК верига от ензим също е стойност, специфична за всяка полимераза (средно тя е 30–60 нуклеотида в секунда или 1–2 хиляди бази в минута), така че времето за удължаване се избира в зависимост от вида на ДНК полимеразата и дължината на амплифицираната област.

1.5.3 Основни принципи на избор на грунд

При създаването на PCR тестова система една от основните задачи е правилният избор на праймери, които трябва да отговарят на редица критерии:

Грундовете трябва да са специфични. Особено внимание се обръща на 3 - краищата на праймерите, тъй като именно от тях Taq полимеразата започва да завършва комплементарната ДНК верига. Ако тяхната специфичност е недостатъчна, тогава е вероятно в епруветката с реакционната смес да се появят нежелани процеси, а именно синтез на неспецифична ДНК (къси или дълги фрагменти). Вижда се при електрофореза под формата на тежки или леки допълнителни ивици. Това затруднява оценката на резултатите от реакцията, тъй като е лесно да се обърка специфичен продукт на амплификация със синтезирана чужда ДНК. Част от праймерите и dNTPs се изразходват за синтеза на неспецифична ДНК, което води до значителна загуба на чувствителност.

Грундовете не трябва да образуват димери и бримки, т.е. не трябва да се образуват стабилни двойни нишки чрез отгряване на праймерите към самите тях или един към друг.

1.5.4 Ефект на платото

Трябва да се отбележи, че процесът на натрупване на специфични продукти на усилване експоненциално отнема само ограничено време, след което неговата ефективност спада критично. Това се дължи на така наречения ефект на "плато".

срочен ефект плато използвани за описване на процеса на натрупване на PCR продукти в последните цикли на амплификация.

В зависимост от условията и броя на циклите на реакцията на усилване, в момента на постигане на ефекта плато използването на субстрати (dNTPs и праймери), стабилността на реагентите (dNTPs и ензим), количеството инхибитори, включително пирофосфати и ДНК дуплекси, конкуренция за реагенти с неспецифични продукти или праймери-димери, концентрацията на специфичен продукт и непълна денатурация при високи концентрации на продукти на амплификация.

Колкото по-ниска е първоначалната концентрация на таргетната ДНК, толкова по-висок е рискът от реакцията плато". Тази точка може да възникне преди броят на специфичните продукти на амплифициране да е достатъчен за анализиране. Само добре оптимизирани тестови системи могат да избегнат това.

1.5.5 Пробоподготовка на биологичен материал

Използват се различни техники за извличане на ДНК в зависимост от задачите. Тяхната същност се състои в екстракция (извличане) на ДНК от биологичен продукт и отстраняване или неутрализиране на чужди примеси за получаване на ДНК препарат с чистота, подходяща за PCR.

Методът за получаване на чист ДНК препарат, описан от Мармур, се счита за стандартен и вече е станал класически. Включва ензимна протеолиза, последвана от депротеинизация и повторно утаяване на ДНК с алкохол. Този метод дава възможност за получаване на чист ДНК препарат. Това обаче е доста трудоемко и включва работа с такива агресивни и остри вещества като фенол и хлороформ.

Един от популярните в момента методи е методът за екстракция на ДНК, предложен от Boom et al. Този метод се основава на използването на силен хаотропен агент, гуанидин тиоцианат (GuSCN), за клетъчен лизис и последваща сорбция на ДНК върху носител (стъклени перли, диатомит, стъклено мляко и др.). След промиване ДНК остава в пробата, адсорбирана върху носителя, от който може лесно да бъде отстранена с помощта на елуиращ буфер. Методът е удобен, технологичен и подходящ за подготовка на проби за амплификация. Възможни са обаче загуби на ДНК поради необратима сорбция върху носителя, както и по време на многобройни измивания. Това е особено важно при работа с малки количества ДНК в пробата. Нещо повече, дори следи от GuSCN могат да инхибират PCR. Ето защо, когато се използва този метод, правилният избор на сорбент и внимателното спазване на технологичните нюанси са много важни.

Друга група методи за подготовка на пробите се основава на използването на йонообменници тип Chilex, които, за разлика от стъклото, не адсорбират ДНК, а обратното, примеси, които пречат на реакцията. По правило тази технология включва два етапа: кипене на пробата и адсорбция на примеси върху йонообменник. Методът е изключително атрактивен поради своята простота на изпълнение. В повечето случаи е подходящ за работа с клиничен материал. За съжаление, понякога има проби с примеси, които не могат да бъдат отстранени с помощта на йонообменници. Освен това някои микроорганизми не могат да бъдат унищожени чрез обикновено кипене. В тези случаи е необходимо въвеждането на допълнителни етапи на обработка на пробите.

Следователно изборът на метод за подготовка на пробата трябва да се третира с разбиране на целите на предвидените анализи.

1.5.6 Усилване

За да се извърши реакцията на амплификация, е необходимо да се подготви реакционната смес и да се добави анализираната ДНК проба към нея. В този случай е важно да се вземат предвид някои характеристики на отгряването на праймера. Факт е, че като правило в анализираната биологична проба има различни ДНК молекули, към които праймерите, използвани в реакцията, имат частична, а в някои случаи значителна хомоложност. В допълнение, праймерите могат да се отгряват един към друг, за да образуват праймери-димери. И двете водят до значителна консумация на праймери за синтеза на странични (неспецифични) реакционни продукти и в резултат значително намаляват чувствителността на системата. Това прави трудно или невъзможно разчитането на резултатите от реакцията по време на електрофореза.

1.6 Състав на стандартната PCR реакционна смес

x PCR буфер (100 mM разтвор на Tris-HCl, pH 9,0, 500 mM разтвор на KCl, 25 mM разтвор на MgCl2 ) …….2,5 µl

Вода (MilliQ) ………………………………………………………….18,8 µl

Смес от нуклеотидни трифосфати (dNTP)

mM разтвор на всеки………………………………………….……….0,5 µl

Праймер 1 (10 mM разтвор) ………………………………………….1 µl

Праймер 2 (10 mM разтвор) ……………………………………….….1 µl

ДНК полимераза (5 единици / µl) ………………………………………………0,2 µl

ДНК проба (20 ng/µl) …………………………………………..1 µl

1.7 Оценка на резултатите от реакцията

За да се оценят правилно резултатите от PCR, е важно да се разбере, че този метод не е количествен. Теоретично продуктите на амплификация на отделни целеви ДНК молекули могат да бъдат открити чрез електрофореза още след 30-35 цикъла. На практика обаче това се прави само в случаите, когато реакцията протича при условия, близки до идеалните, което не се среща често в живота. Степента на чистота на ДНК препарата има особено голямо влияние върху ефективността на амплификацията; наличието на определени инхибитори в реакционната смес, от които в някои случаи може да бъде изключително трудно да се отървете. Понякога, поради тяхното присъствие, не е възможно да се амплифицират дори десетки хиляди целеви ДНК молекули. По този начин често няма пряка връзка между първоначалното количество целева ДНК и крайното количество продукти на амплификация.

Глава 2: Приложения на полимеразната верижна реакция

PCR се използва в много области за анализ и в научни експерименти.

Криминалистика

PCR се използва за сравняване на така наречените "генетични пръстови отпечатъци". Нуждаем се от проба от генетичен материал от местопрестъплението - кръв, слюнка, сперма, коса и т.н. Сравнява се с генетичния материал на заподозрения. Достатъчно е много малко количество ДНК, теоретично - едно копие. ДНК се нарязва на фрагменти, след което се амплифицира чрез PCR. Фрагментите се разделят чрез ДНК електрофореза. Получената картина на местоположението на ДНК лентите се нарича генетичен пръстов отпечатък.

Установяване на бащинство

Резултати от електрофореза на ДНК фрагменти, амплифицирани чрез PCR. баща. дете. Майка. Детето наследи някои характеристики на генетичния отпечатък на двамата родители, което даде нов, уникален отпечатък.

Въпреки че "генетичните пръстови отпечатъци" са уникални, семейните връзки все още могат да бъдат установени чрез създаване на няколко такива пръстови отпечатъка. Същият метод може да се приложи, с леки модификации, за установяване на еволюционни връзки между организмите.

Медицинска диагностика

PCR позволява значително да се ускори и улесни диагностицирането на наследствени и вирусни заболявания. Генът, който представлява интерес, се амплифицира чрез PCR, като се използват подходящи праймери и след това се секвенира, за да се определят мутациите. Вирусните инфекции могат да бъдат открити веднага след заразяването, седмици или месеци преди появата на симптомите на заболяването.

Персонализирана медицина

Понякога лекарствата са токсични или алергични за някои пациенти. Причините за това са отчасти в индивидуалните различия в чувствителността и метаболизма на лекарствата и техните производни. Тези различия се определят на генетично ниво. Например при един пациент определен цитохром може да е по-активен, при друг - по-малко. За да се определи какъв тип цитохром има даден пациент, се препоръчва да се извърши PCR анализ преди употребата на лекарството. Този анализ се нарича предварително генотипиране.

Генно клониране

Генното клониране е процес на изолиране на гени и в резултат на генно инженерни манипулации получаване на голямо количество от продукта на даден ген. PCR се използва за амплифициране на ген, който след това се вмъква във вектор, част от ДНК, която пренася чуждия ген в същия организъм или друг организъм, който е лесен за отглеждане. Като вектори се използват например плазмиди или вирусна ДНК. Вмъкването на гени в чужд организъм обикновено се използва за получаване на продукт от този ген – РНК или най-често протеин. По този начин се получават много протеини в индустриални количества за използване в селското стопанство, медицината и т.н.

ДНК секвениране

В метода за секвениране, използващ флуоресцентно или радиоактивно белязани дидезоксинуклеотиди, PCR е неразделна част, тъй като по време на полимеризацията нуклеотидните производни, белязани с флуоресцентен или радиоактивен етикет, се вмъкват в ДНК веригата. Това спира реакцията, позволявайки да се определят позициите на специфични нуклеотиди след разделяне на синтезираните нишки в гела.

Мутагенеза

В момента PCR се превърна в основен метод за мутагенеза. Използването на PCR позволи да се опрости и ускори процедурата на мутагенеза, както и да я направи по-надеждна и възпроизводима.

PCR методът направи възможно анализирането на наличието на последователности на човешки папиломен вирус в секции от биопсии на човешки цервикални неоплазми, вградени в парафин 40 години преди това изследване. Освен това с помощта на PCR беше възможно да се увеличат и клонират фрагменти от митохондриална ДНК от вкаменелости на човешкия мозък на възраст 7 хиляди години!

На лизатите на индивидуални човешки сперматозоиди беше демонстрирана възможността за едновременно анализиране на два локуса, разположени на различни нехомоложни хромозоми. Този подход предоставя уникална възможност за фин генетичен анализ и изследване на хромозомна рекомбинация, ДНК полиморфизъм и др. Методът за анализ на отделни сперматозоиди веднага намери практическо приложение в съдебната медицина, тъй като HLA типизирането на хаплоидни клетки позволява да се определи бащинството или да се идентифицира престъпник (HLA комплексът е набор от гени на човешкия основен комплекс за хистосъвместимост; локусите на HLA комплекса са най-полиморфните от всички известни при висшите гръбначни: в рамките на един вид, във всеки локус, има необичайно голям брой различни алели – алтернативни форми на един и същи ген).

С помощта на PCR е възможно да се идентифицира правилността на интегрирането на чужди генетични структури в предварително определена област на генома на изследваните клетки. Общата клетъчна ДНК се загрява с два олигонуклеотидни праймера, единият от които е комплементарен на мястото на ДНК на гостоприемника близо до точката на вмъкване, а другият на последователността на интегрирания фрагмент в антипаралелната ДНК верига. Полимеразната верижна реакция в случай на непроменена хромозомна ДНК структура на предложеното място за вмъкване води до образуването на едноверижни ДНК фрагменти с неопределен размер, а в случай на планирано вмъкване, двойно-верижни ДНК фрагменти от известен размер, определен от разстоянието между местата на отгряване на двата праймера. Освен това степента на амплификация на анализирания регион на генома в първия случай ще зависи линейно от броя на циклите, а във втория - експоненциално. Експоненциалното натрупване по време на PCR на амплифициран фрагмент с предварително определен размер дава възможност да се наблюдава визуално след електрофоретично фракциониране на ДНК препарат и да се направи недвусмислено заключение за вмъкването на чужда последователност в дадена област на хромозомна ДНК.

Заключение

PCR методът в момента е най-широко използваният метод за диагностициране на различни инфекциозни заболявания. PCR ви позволява да идентифицирате етиологията на инфекцията, дори ако пробата, взета за анализ, съдържа само няколко ДНК молекули на патогена. PCR се използва широко в ранната диагностика на HIV инфекции, вирусни хепатити и др. Към днешна дата почти няма инфекциозен агент, който да не може да бъде открит чрез PCR.

Списък на използваната литература

1.Падутов В.Е., Баранов О.Ю., Воропаев Е.В. Методи за молекулярно-генетичен анализ. - Минск: Unipol, 2007. - 176 с.

2.PCR "в реално време" / Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и т.н.; изд. b. н. Д.В. Ребриков; предговор Ел Ей Остерман и акад. RAS и RAAS E.D. Свердлов; 2-ро издание, рев. и допълнителни - М.: БИНОМ. Лаборатория Знание, 2009. - 223 с.

.Патрушев Л.И. Изкуствени генетични системи. - М.: Наука, 2005. - В 2 тона

.Б. Глик, Дж. Пастернак Молекулярна биотехнология. Принципи и приложение 589 стр. 2002г

5.Щелкунов С.Н. генното инженерство. - Новосибирск: Сиб. унив. издателство, 2004. - 496 с.

Редактирано от A.A. Ворбьева „Полимеразна верижна реакция и нейното приложение за диагностика в дерматовенерологията”; Агенция за медицински новини - 72 страници

Http://ru. wikipedia.org

http://учен. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. су/ - медицински журнал

Обучение

Нуждаете се от помощ при изучаването на тема?

Нашите експерти ще съветват или предоставят услуги за обучение по теми, които ви интересуват.
Подайте заявлениепосочване на темата точно сега, за да разберете за възможността за получаване на консултация.