Єршова І.Б., Осичнюк Л.М., Мочалова А.А., ДУ «Луганський державний медичний університет», кафедра педіатрії з дитячими інфекціями.
Статтю опубліковано в журналі «Актуальна інфектологія», №2 (3), 2014 рік.
Інформаційний ресурс «Видавничий дім Заславський» www.mif-ua.com

У статті викладено методи діагностики гельмінтних інвазій: мікроскопічні, імуноферментний аналіз, серологічні, полімеразні ланцюгові реакції, біорезонансна діагностика, гемосканування, а також інструментальні (ультразвукове та рентгенологічне дослідження, комп'ютерна томографія) та лабораторні, що мають непряме клінічний аналізкрові, аналіз крові на печінкові проби, аналіз калу на дисбактеріоз). Описано переваги методів, їх недоліки, достовірність отриманих даних. Запропоновано анкети-опитувальники для пацієнтів для виявлення ризику інфікування гельмінтами. Описано переваги методів, їх недоліки, достовірність отриманих даних. Запропоновано анкети-опитувальники для пацієнтів для виявлення ризику інфікування гельмінтами.

Гельмінти надають негативний вплив на організм людини. Вони призводять до алергізації, розвитку полігіповітамінозу, макро- та мікроелементозів, порушення кровотворення та проникності судин, гормональному дисбалансу. Гельмінтози сприяють формуванню хронічних захворювань(холецистит, жовчнокам'яна хвороба, панкреатит, коліт, цукровий діабет, бронхіальна астма, атопічний дерматит), психоемоційних порушень ( хронічна втома, дратівливість, тривожність, гіперактивність у дітей), анемії та ін. При тривалій гельмінтній інвазії може розвиватися вторинний імунодефіцит.

Настороженість лікарів щодо гельмінтозів у населення нині недостатня, а профілактика зводиться до лікування виявлених інвазованих пацієнтів.

Діагностика гельмінтозівґрунтується на клініко-епідемічних та лабораторних даних. Такі ознаки, як астенічний синдром, рецидивна кропив'янка, порушення регенерації шкіри та слизових оболонок, важко піддаються лікуванню атопічний дерматит та бронхообструктивний синдром, полілімфаденопатія та гепатоспленомегалія неясного генезу, аденоїдні вегетації II–III ступеня, «географічна» мова, знижена нестійкий стілецьможуть говорити про наявність гельмінтів.

При серологічному дослідженнівизначають наявність антитіл до гельмінтів (достовірність – близько 60 %): при підозрі на ехінококоз, цистицеркоз, трихінельоз, токсокароз широко використовують реакції непрямої гемаглютинації, аглютинації латексу, зв'язування комплементу, імунофлюоресценції.
Не у всіх випадках методи визначення специфічних антитіл мають достатню специфічність і достовірність. Антигенний склад гельмінта залежить як від виду, а й від стадії; проходячи складний цикл розвитку від яйця до дорослої особини, гельмінти змінюють антигенний склад Крім того, в імунодіагностичних реакціях використовуються соматичні антитіла, а в організмі господаря антитіла виробляються здебільшого на екскрети та секрети гельмінту. Неспецифічна сенсибілізація організму, спільність деяких антигенів трематод, найпростіших і людини створюють високу питому вагу хибнопозитивних реакцій у титрах нижче достовірно діагностичних.

Метод визначення гельмінтів за допомогою полімеразної ланцюгової реакції є високоспецифічним і високочутливим, але через дорожнечу та складність не може бути скринінговим, коли, наприклад, потрібно обстежити групу дітей з дитячого закладу.

Імунна система не завжди реагує (розпізнає та знищує) на наявність гельмінтів в організмі. Це пояснюється тим, що деякі гельмінти мають міцну та хімічно стійку капсулу або покриті речовиною, яка не розпізнається. імунною системою; локалізуються в тканинах, найбільш захищених від запальних реакцій, наприклад, у спинному мозку; багато видів з них в травному трактівиділяють антиензими, що рятує їхню відмінність від загибелі; мають велику тривалість життя (роками, а іноді до смерті самої людини); харчуються за рахунок гліколізу чистих вуглеводів; мають такі пристрої, як присоски, гачки та ін, що сприяє фіксації всередині організму; у багатьох видів існує статеве розмноження, при якому відбувається обмін генною інформацією, що призводить до посилення гетерогенної популяції, зменшення вразливості; мають високим рівнемплодючість.

При ультразвуковому , рентгенологічному дослідженні органів черевної порожнини , комп'ютерної томографії можна виявити непрямі ознакигельмінтозів: гепатоспленомегалію, нерівномірність паренхіми печінки та селезінки за рахунок дрібних гіперехогенних сигналів, збільшені лімфатичні вузлиу воротах селезінки та самі гельмінти (ехінококи, клубки кишкових гельмінтів тощо).

Гемосканування - якісне дослідження крові за допомогою потужного темнопольного мікроскопа, можна побачити стан клітин крові (форму, розмір, активність, колір і т.д.), наявність неспецифічних елементів та речовин – все це безпосередньо чи опосередковано говорить про наявність в організмі гельмінтів. Зображення відображається на екрані монітора за допомогою вбудованої відеокамери в мікроскопі. Цей метод діагностики має високу достовірність.

Непрямими лабораторними ознаками гельмінтозівможуть бути анемія, базофілія, еозинофілія, збільшення рівня аспартатамінотрансферази. Так, при токсокарозі виявляється лейкемоїдна реакція еозинофілів (понад 20 %) на стійкому фоні. алергічного синдрому(атопічний дерматит з вираженим свербінням та резистентністю до традиційної терапії, тяжка бронхіальна астма). Пригнічення нормальної кишкової паличкив аналізі калу на дисбактеріоз також може говорити про можливий гельмінтоз.

З урахуванням поширеності гельмінтозів ми пропонуємо анкетувизначення ризику інфікування гельмінтами.

• Купаєтесь у прісноводних водоймах.
• Не миєте руки перед їжею з милом у гарячій воді.
• Вживаєте воду з неперевірених джерел.
• Вживаєте в їжу домашнє сало з прожилками м'яса.
• Вживаєте в їжу малосольну рибу.
• Вживаєте в їжу слабопрожарене м'ясо (з кров'ю).
• Вживаєте малосольну ікру незаводського приготування.
• Не миєте курячі яйцяз милом.
• Чи не миєте банани, апельсини, мандарини перед вживанням.
• Удобрюєте город гноєм.
• Вживаєте овочі прямо з грядки.
• Вживаєте фрукти та ягоди прямо з грядки.
• Вживаєте фрукти, що впали.
• Не обдайте всю зелень окропом для приготування салатів.
• Зберігайте моркву у піску, взятому у дворі.
• Ходіть босими ногами травою.
• Члени сім'ї мали глистові інвазії.
• У сім'ї є собака чи кішка.

За кожну відповідь « так- 2 бали, іноді» - 1, « ні» - 0. При сумі балів 0-5 ймовірність інфікування мізерно мала, 6-12 - можливе інфікування, 13-25 - висока ймовірність, більше 25 балів - дуже висока. При двох останніх результатах необхідні регулярне обстеження та, можливо, профілактичне лікування.

Оскільки клінічні проявигельмінтози не завжди специфічні, а в початкових стадіях - неспецифічні, ми пропонуємо анкету для пацієнтів для самодіагностики гельмінтозів.

• Буває свербіж в області ануса вранці.
• Нудота вранці під час чищення зубів.
• Лушпиння пальців рук або ніг зі злущуванням пластів шкіри.
• Алергічна висипка на шкірі, свербіж шкіри.
• Лушпиння і набряклість в області повік.
• Підвищена стомлюваність, млявість, сонливість.
• Підвищене почуття голоду.
• Відчуття дискомфорту у животі.
• Зниження маси тіла.
• Наявність кількох хронічних захворювань органів шлунково-кишкового тракту, суглобів, бронхолегеневої системи.
• Погане самопочуття, відсутність офіційного діагнозу, тривале неефективне лікування.
• Періодичний підйом температури, що супроводжується м'язовими та суглобовими болями.

Відповідь « так» принаймні на 2–3 питання говорить про високої ймовірностізараження гельмінтами.

ВИСНОВКИ

1. На сучасному етапінемає лабораторних методів дослідження на гельмінтози, які мають 100% надійність.

2. Найбільшу достовірність у діагностиці гельмінтозів мають полімеразна ланцюжкова реакціята біорезонансна діагностика

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

Ефективним та зручним методом гельмінтологічного дослідження є вивчення товстого мазка по Като, Суть якого полягає у виявленні яєць гельмінтів в товстому мазку фекалій, просвітлених гліцерином і підфарбованих малахітовою зеленню. Склад суміші Като – 6 мл 3% водного розчину малахітової зелені, 500 мл гліцерину, 500 мл 6% розчину фенолу. Розчин стабільний, може зберігатись при кімнатній температурі. Для приготування препаратів шматочки фекалій величиною з горошину наносять на предметне скло, плівкою покривають гідрофільного целофану, витриманого в суміші Като протягом 24 год, і притискають його до скла для рівномірного розподілу матеріалу. Просвітлені протягом 40-60 хв мазки мікроскопують. Підраховують виявлені яйця гельмінтів і морфологічними ознакамивизначають їх видову приналежність. Метод дозволяє виявити яйця аскарид, волосоголовець, цестод, трематод, меншою мірою - анкілостомід і карликового ціп'яка.

Широко застосовуються також методи збагачення. Принцип флотаційних методів полягає у суспендуванні фекалій у сольовому розчині, що має велику відносну густину в порівнянні з яйцями гельмінтів, внаслідок чого вони спливають на поверхню. Під мікроскопом досліджується вміст поверхневої плівки. Як збагачувальні суміші використовують розчини: кухонну сіль - 400 г в 1 л води (відносна щільність по Фюллеборну -1,18); азотнокислий натрій - 1 кг в 1 л води (відносна щільність по "Калантарян-1,38); азотнокислий натрій - 900 г та азотнокислий калій - 400 г в 1 л води (відносна щільність по Брудастову та Красноносу-1,48). розчини кип'ятять та охолоджують.
Для дослідження вносять 5-10 г фекалій у скляну або фаянсову склянку, додають до неї 100-200 мл. сольового розчинуі ретельно розмішують. Потім видаляють великі частки, що спливли, дерев'яним шпателем або совочком з паперу або картону і відразу ж прикладають до поверхневої плівки широке предметне скло так, щоб сольовий розчин і предметне скло повністю стикалися. Після 30-40-хвилинного відстоювання суміші знімають предметне скло, кладуть під мікроскоп плівкою догори і ретельно переглядають всю поверхню. Щоб уникнути висихання, можна додати 2-3 краплі 50% розчину гліцерину. Поверхневу плівку можна знімати також дротяною петлею. Ефективність флотаційних методів підвищується зі збільшенням відносної щільності сольових розчинів. За допомогою цих методів можна виявляти яйця нематод, цестод та трематод.

Для виявлення яєць у фекаліях застосовують метод седиментації за Красильниковим.. Фекалії змішують з 1% розчином детергенту (пральний порошок «Лотос» та ін.) у співвідношенні 1:10 до утворення суспензії. Під впливом детергенту розчиняються різні компоненти фекалій (білки, жири, тканинні елементи). Через 30 хв вміст пробірки струшують протягом 1-2 хв, після чого центрифугують 5 хв. З осаду готують препарати та переглядають під мікроскопом.
У польових умовах, і навіть при масових обстеженнях населення ураженість гельмінтами зручно застосовувати метод товстого мазка по Като. У стаціонарних умовпри обстеженні хворих краще використовувати найбільш ефективні флотаційні методи. При використанні цих методів під час мікроскопії доцільно підраховувати виявлені у препараті яйця. При дотриманні стандартності навішування або об'єму, взятих для дослідження фекалій (наприклад, 1 чайна або столова ложка), і єдиного єдиного обсягу сольових розчинів можна орієнтовно судити про інтенсивність інвазій. Цей кількісний облік може бути корисним при обґрунтуванні призначеного лікування та оцінці ефективності проведеної дегельмінтизації. Крім того, для встановлення інтенсивності інфекції можуть бути використані інші більш точні кількісні методи, зокрема метод Столла.

Для діагностики теніарингоспу та ентеробіозузастосовують метод дослідження періанально-ректальних зіскрібків. Дерев'яним шпателем, змоченим у 50% розчині гліцерину, роблять зіскрібок з періанальних складок вранці до дефекації в колі заднього проходуі нижніх відділівпряма кишка. Отриманий матеріал, очищений зі шпателя краєм покривного скла, поміщають на предметне скло до краплі 50% розчину гліцерину, накривають покривним склом та досліджують під мікроскопом. Можна також дослідити смужку целюлозної стрічки, яку спочатку притискають клейкою стороною до пернальних складок, потім поміщають на предметне скло і мікроскопують.

Виявлення личинок нематод у фекаліях за методом Бермана. Метод ґрунтується на термотропній властивості личинок. Для дослідження беруть 1 столову ложку фекалій, поміщають в металеву сітку або сітку з кількох шарів марлі на дротяному каркасі. Сітку встановлюють у вирву, укріплену в штативі. До лійки приєднується гумова трубка із затискачем. Піднявши сітку, вирву заповнюють водою (температура +40°...+50°С) так, щоб Нижня частинасітка була занурена у воду. Личинки з фекалій активно мігрують у теплу водуі, осідаючи, накопичуються в нижній частині вирви. Через 2-4 години затиск відкривають, воду спускають в центрифужну пробірку і центрифугують протягом 2-3 хв. Потім зливають надосадову рідину, осад переносять на предметне скло і переглядають під мікроскопом, де шукають рухливі личинки збудника стронгілоїдозу.

Метод Харада та Морі дозволяє диференціювати личинки анкілостом та некаторами. Личинки анкілостомід культивують на фільтрувальному папері. З цією метою 0,5 г свіжих фекалій, взятих у хворого не пізніше ніж через 1 годину після дефекації, наносять на смужки фільтрувального паперу, розміром 12X1,5 см, залишаючи обидва кінці смужки чистими. Один кінець смужки занурюють у пробірку, четверта частина якої заповнена водою, а інший затискають пробкою. Пробірки ставлять у термостат за нормальної температури +26... + 28°С. Личинки, що розвинулися з яєць, опускаються по фільтрувальному паперу і осідають на дно пробірки. Через 5-6 днів смужку паперу видаляють, а рідину, що залишилася в пробірці, досліджують під лупою або центрифугують. Осад, що утворився при центрифугуванні, досліджують під світловим мікроскопом. При використанні замість пробірок чотиригранних скляних банок (розміром 15ХЮХ7 см), до стінок яких прикріплюють по 4 паперові смужки, ефективність аналізів підвищується (Г. М. Маруашвілі з співавт., 1966).

Методи дослідження на шистосомози . Дослідження фекалій - порцію фекалій змішують з 250 мл води, проціджують через 3 шари марлі в конічний посуд, який наповнюють доверху водою. Через 30 хв шар рідини зливають, до осаду доливають свіжу порцію води. Осад промивають до отримання прозорої надосадової рідини та мікроскопують.

Метод лярвоскопії - в колбу Ерленмейєра з напаяною збоку скляною трубочкою, спрямованою вгору, поміщають 20-25 г фекалій і промивають водопровідною водою. Потім колбу накривають темним папером, залишивши світла напаяну скляну трубочку при температурі +25...+30°С. Мирацидії, що вилупилися, концентруються у меніска в бічній трубочці, де їх можна бачити за допомогою лупи або неозброєним оком. Дослідження сечі -100 мл сечі, зібраної в період між 10 год. ранку і 14 год. дня, або добову порцію відстоюють, а потім центрифугують при 1500 об/хв. Отриманий осад наносять на предметне скло і мікроскопують. ВООЗ рекомендує метод фільтрування всієї порції сечі. Після фільтрування фільтри обробляють формаліном або підігрівають (щоб убити яйця), а потім зволожують водним розчином нінгідрину. У підсушених препаратах зародки яєць набувають фіолетового забарвлення.

Застосування імунологічних методів дослідження для діагностики шистосомозів пов'язано з труднощами, так як дорослі шистосоми та їх яйця містять велика кількістьантигенів, що викликають імунні реакції, які не є видоспецифічними (Д. Бредлі, 1979).

У нашій країні для встановлення імунологічних реакцій при гельмінтозах випускається цілий рядстандартних діагностикумів. Практичне застосуваннямають алергічна шкірна пробана ехінококоз і альвеококоз, РЛА з ехінококовим антигеном, РСК на холоді, реакція преципітації на холоді в різних модифікаціях (кільцева преципітація, преципітація в пробірках або капілярах, які ставляться з трихінельозним, цистицерказним і містицеркозним. Стандартні діагностикуми для встановлення вищезгаданих серологічних реакцій виготовляються підприємствами з виробництва бактерійних препаратів. До діагностикумів, що випускаються, підприємство-виробник додає докладні інструкції про правила зберігання, терміни придатності препарату і настанови щодо застосування відповідних антигенів з технікою постановки реакції.

У Останніми рокамиПерелік серологічних реакцій, які застосовуються для діагностики гельмінтозів, значно розширився. З цією метою використовуються наступні реакції: РІГА, непрямої імунофлюоресценції (РІФ), імунодифузії в гелі (РІД), зустрічного імуноелектрофорезу (ВІЕФ), РЕМА. Ці реакції можуть використовуватися при аскаридозі, токсокарозі, трихінельозі, анкілостомідозі, філяріатозах, ехінококозі та альвеококкозі, опісторгозі, шистосомозі, парагонімозі. Однак для цих реакції в нашій країні не випускаються стандартні діагностикуми і не регламентована техніка їх постановки. Окремі лабораторії, в основному наукові, готують самостійно специфічні антигени та застосовують їх у різних модифікаціях. Опис цих методів широко представлено в літературі і не є суворо уніфікованим. Інтерпретація даних імунологічного аналізуповинна ґрунтуватися на вивченні динаміки імунної відповіді з урахуванням рівня специфічності та чутливості кожної застосовуваної серологічної реакції. Тому при постановці діагнозу, а також при сероепідеміологічних обстеженнях населення доцільно користуватися кількома найбільш чутливими реакціями. З цих позицій добре зарекомендували себе реакції ВІЕФ та РЕМА, які відрізняються високою чутливістю та досить високою специфічністю (П. Амбруаз-Тома, 1978; І. Є. Балад, 1979; Г. М. Негряну, 1980; А. М. Пономарьова, 1981; А. Я. Лисенко, 1978, та ін). Ефективність РЕМА перевірена при амебіазі, лейшманіозі, трипаносомозі та токсоплазмозі (Г. А. Єрмолін, 1980).

При виявленні яєць гельмінтів на різних об'єктах навколишнього середовища (ґрунт, вода, овочі та ін) завжди необхідно визначати їх життєздатність по зовнішньому вигляду, фарбуванням вітальними фарбами, культивуванням оптимальних умовах і постановкою біологічної проби, тобто.

Згодовуванням лабораторним тваринам.

Визначення життєздатності яєць або личинок гельмінтів на вигляд. Яйця гельмінтів мікроскопують спочатку при малому, потім за великому збільшенні. У деформованих і мертвих яєць гельмінтів оболонка розірвана або прогнута всередину, мутна плазма, розпушена. У сегментованих яєць кулі дроблення (бластомери) нерівного розміру, неправильної форми, часто зрушені одного полюсу. Іноді зустрічаються аномальні яйця, які, маючи зовнішні потворності, розвиваються нормально. У живих личинок аскарид дрібна зернистість є лише у середній частині тіла, у міру їх загибелі зернистість поширюється у всьому тілі, з'являються великі блискучі гіалінові вакуолі - звані перлинні нитки.

Для визначення життєздатності зрілих яєць аскарид, волосоголовців, гостриків слід викликати активні рухиличинок легким підігрівом препарату (до температури не вище 37 ° С). Життєздатність личинок аскарид та волосоголовців зручніше спостерігати після їх виділення із шкаралупи яйця натисканням на покривне скло препарату препарувальною голкою або пінцетом.

У інвазійних личинок аскарид часто помічається чехлик, що відшарувався на головному кінці, а у личинок власоголовів, що закінчили розвиток в яйці, на цьому місці при великому збільшенні виявляється стилет. У загиблих личинок гельмінтів незалежно від місця їхнього перебування (в яйці або поза ним) помічають розпад тіла. При цьому внутрішня структура личинки стає глибчастою або зернистою, а тіло каламутним і непрозорим. У тілі виявляються вакуолі, але в кутикулі - розриви.

Життєздатність онкосфер теніїд (бичачого, свинячого ціп'яків та ін.) визначають за рухом зародків при впливі на них травних ферментів. Яйця поміщають на годинникове скло з шлунковим сокомсобаки чи штучним дуоденальним соком. склад останнього: панкреатину 0,5 г, натрію бікарбонату 0,09 г, дистильованої води 5 мл. Годинникове скло з яйцями ставлять у термостат при 36-38 “З на 4 год. При цьому живі зародки звільняються від оболонок. Оболонки живих онкосфер також розчиняються в підкисленому пепсині та в лужному розчині трипсину через 6-8 годин у термостаті при 38 °С.

Якщо помістити яйця тенід в 1% розчин натрію сульфіду, або 20% розчин натрію гіпохлориду, або в 1% розчин хлорної води при 36-38 ° С, зрілі і живі зародки звільняються від оболонок і не змінюються протягом 1 доби. Незрілі і мертві онкосфери зморщуються або набухають і різко збільшуються, а потім «розчиняються» протягом 10 хв - 2 год. 38 °С.

Життєздатність сколексів ехінококів визначають при слабкому нагріванні. Для цього відмиті у воді сколекси або виводкові капсули поміщають у краплю води на предметне скло з ямочкою, покривають покривним склом і досліджують під мікроскопом з нагрівальним столиком при температурі 38-39 °С. Якщо немає нагрівального столика, препарат підігрівають за допомогою будь-якого джерела тепла. При цьому життєздатні сколекс активно рухаються, скорочуючи або розслаблюючи присоски, подовжуючи і коротшаючи хоботок. Якщо помістити сколекси в 0,5-1% водний розчин філіцилену при кімнатній температурі, то всі життєздатні сколекс швидко вивернуться і загинуть. Нежиттєздатні сколекси у своїй не вивертаються.

Життєздатність адолескаріїв фасціол, зібраних на рослинах та інших об'єктах водойм, перевіряють дослідженням їх на предметному склі фізіологічному розчиніпід мікроскопом із нагрівальним столиком. При підігріванні личинки трематоди, що у цисті, починають рухатися.

Життєздатність яєць карликового ціп'яка визначають за розташуванням гачків на зародку.

У живих яйцях карликового ціп'яка відбуваються мляві маятникоподібні рухи протоплазми і майже непомітні розсування та зрушення загострених кінців латеральної пари гачків убік від середньої пари.

Скорочення протоплазми зародка та зародкових гачків допомагають зародку звільнитися спочатку від оболонок онкосфери, а потім від зовнішньої оболонки яйця.

У живому яйці медіанна пара і бічні пари гаків розташовані паралельно, в деяких яйцях леза бічних пар зближені і розташовані по відношенню до середньої пари гачків під кутом менше 45 °.

Зародок, що гине, конвульсивно скорочується і мляво розсовує гаки. У загиблому зародку рух гаків припиняється, і вони розташовуються безладно, іноді ж латеральні по відношенню до сусідньої пари гаки бувають розсунуті під прямим, тупим або гострим кутом.

Іноді спостерігаються зморщування зародка, утворення зернистості. Більш точний метод, заснований на появі онкосферних рухів при різкій зміні температур: від 5-10 до 38-40 °С.

Визначення життєздатності незрілих нематод слід вивчати у вологій камері (чашках Петрі), поміщаючи яйця аскарид у 3 % розчин формаліну, приготований на ізотонічному розчині натрію хлориду при температурі 24-30 °С, яйця волосоголов у 3 % 3 °С, яйця гостриків в ізотонічний розчин хлориду натрію при температурі 37 “С. Чашки Петрі слід відкривати 1-3 рази на тиждень для кращої аерації та знову зволожувати фільтрувальний папір чистою водою.

Спостереження за розвитком яєць гельмінтів ведуть не менше 2 разів на тиждень. Відсутність ознак розвитку протягом 2-3 місяців свідчить про їх нежиттєздатність. Ознаками розвитку яєць гельмінтів є спочатку стадії дроблення, розподіл вмісту яйця на окремі бластомери. Протягом першої доби розвивається до 16 бластомірів, які переходять у другу стадію – морулу тощо.

Яйця анкілостомід культивують у скляному циліндрі (висотою 50 см та діаметром 7 см), закритому пробкою. Суміш з рівних обсягів стерильного піску, деревного вугілля та випорожнень з яйцями анкілостомід, розведену водою до напіврідкої консистенції, обережно наливають на дно циліндра за допомогою скляної трубки. Протягом 1-2-добового відстоювання в темряві при температурі 25-30 ° С з яєць вилуплюються рабдитоподібні личинки, а через 5-7 діб вони стають вже філярієподібними: личинки виповзають вгору по стінках циліндра, де видно навіть неозброєним оком. Природно яйця, що розвиваються у воді, трематод, наприклад опісторхів, дифілоботріїд, фасціол та ін., поміщають на годинникове скло, чашку Петрі або в іншу посудину, наливають невеликий шар звичайної води. При культивуванні яєць фасціол слід врахувати, що вони швидше розвиваються в темряві, при цьому в живих яйцях при температурі 22-24 ° С через 9-12 діб формується мірацидій. При мікроскопуванні яєць, що розвиваютьсятрематод добре помітні рухи мірацидію. Мірацидій фасціоли з оболонок яйця виходить лише на світлі. При культивуванні воду змінюють через 2-3 добу.

Личинки анкілостомід і стронгілоїд культивують на агарі в чашці Петрі з тваринним вугіллям. Після перебування в термостаті при температурі 26-30 ° С протягом 5-6 діб личинки розповзаються по агару, залишаючи за собою доріжку з бактерій (метод Фюллеборна).

Метод Harada та Mori (1955). У пробірки, вміщені в штатив, додають 7 мл дистильованої води. Дерев'яною паличкою беруть 0,5 г випорожнень і роблять мазок на фільтрувальному папері (15X150 мм) в 5 см від лівого краю (цю операцію проводять на аркуші паперу, щоб захистити поверхню лабораторного столу). Потім смужку з мазком вставляють пробірку так, щоб вільний від мазка лівий кінець досягав дна пробірки. Верхній кінець накривають шматком целофану і щільно охоплюють резинкою. На пробірці пишуть номер та прізвище обстежуваного. У такому стані пробірки зберігають протягом 8-10 діб за температури 28 °С. Для вивчення культури знімають та видаляють целофанову покришку та витягують пінцетом смужку фільтрувального паперу. При цьому слід виявляти обережність, оскільки невелика кількість інвазійних личинок може пересуватися до верхнього кінця фільтрувального паперу або стінки пробірки і проникати під поверхню целофану.

Пробірки поміщають у гарячу водяну банюпри температурі 50 °С на 15 хв, після чого вміст їх струшують і швидко переливають у 15-мілілітрову пробірку для осадження личинок. Після центрифугування надосадову рідину видаляють, а осад переносять на предметне скло, покривним покривним склом і мікроскопують під малим збільшенням.

Для диференціального діагнозуфілярієподібних личинок необхідно користуватися даними, наведеними в табл. 13.

Методи фарбування яєць та личинок гельмінтів. Мертві тканини здебільшого сприймають фарби швидше, ніж живі. Ці особливості використовують у гельмінтології для визначення життєздатності яєць та личинок гельмінтів. Однак у окремих випадках деякі фарби краще сприймаються живими тканинами, ніж мертвими.

Таблиця 13. Диференційна діагностика філярнеподібних личинок A. duodenale, N. americanus, Strongyloides stercoralis, Trichostrongylus spp.

Для диференціального розпізнавання живих та мертвих яєць та личинок застосовують такі фарби та способи.

Для фарбування живих та мертвих тканин використовують лейкобазу метиленового синього. Жива клітинаабо тканину редукують метиленовий синій в безбарвну лейкобазу, мертва тканина не має такої здатності, тому набуває забарвлення.

Для фарбування яєць аскарид можна використовувати метиленовий синій у розчині молочної кислоти з їдким лугом (метиленового синього 0,05 г, їдкого натру 0,5 г, молочної кислоти 15 мл). Живі яйця забарвлення не сприймають, зародки мертвих яєць забарвлюються в синій колір.

Метод фарбування не застосовується для незрілих яєць аскарид і волосоголовців; пігментована оболонка фарбується, і тому не видно, чи забарвилася зародкова клітина всередині яйця.

Фарбування личинок аскарид основним розчином фарби діаманткрезилового синього концентрації 1:10 ТОВ здійснюють наступним чином: на предметне скло наносять краплю рідини з яйцями аскарид та краплю основного розчину фарби. Препарат накривають покривним склом, яке щільно притискають до предметного при легкому постукуванні препарувальною голкою. Під мікроскопом спостерігають кількість личинок, що вийшли, і ступінь їх офарблюваності, після чого цей же препарат переглядають повторно через 2-3 год. Живими вважаються тільки недеформовані личинки, що не забарвилися протягом 2 год.

Вказується можливість фарбування препаратів розчином йоду щодо життєздатності яєць аскаридий птахів. Як барвник у цьому випадку використовують 5 % спиртовий розчинйоду. При його нанесенні на препарат зародки мертвих яєць аскаридій протягом 1-3 с. помаранчевий колір. Мертві яйця опісторха та онкосфери бичачого ціп'якафарбуються розчином толуїдинового синього (1:1000), а мертві онкосфери бичачого ціп'яка - розчином діаманткрезилового синього (1:10 000). При цьому набувають кольору зародка та оболонки як мертвих, так і живих яєць. Тому після фарбування яйця та онкосфери відмивають у чистій водіі додатково забарвлюють сафраніном (у розведенні 1:10 000 10% розчину спирту). Спирт видаляє фарбу з оболонок, а сафранін надає їм червоного кольору. В результаті живі яйця забарвлюються у червоний колір, зародок у мертвих – у синій, а оболонка залишається червоною. Мертві зародки онкосфер бичачого ціп'яка швидко, протягом декількох хвилин, забарвлюються в яскраво-червоний або рожевий колірсафраніном або в синій колір діаманткрезиловим синім у розведенні 1:4000 або індигокарміном у розведенні 1:1000-1:2000.

Живі зародки не змінюються під впливом цих фарб навіть через 2-7 год.

Для визначення життєздатності яєць карликового ціп'яка рекомендується використовувати такі фарби: 1) діаманткрезиловий синій (1:8000) - через 1 год у мертвих яєць особливо яскраво забарвлюється онкосфера, яка різко виділяється на блідому або безбарвному тлі решти яйця; 2) сафранін: у розведенні 1:8000 при дії протягом 2 год та 1:5000 – протягом 3-5 год; 3) 50% розчин пирогалловой кислоти у розведенні 1:2 - при дії протягом 1 год при температурі 29-30 “З (чим нижче температура, тим триваліший процесфарбування).

Живі плероцеркоїди широкого лентеца дуже добре фарбуються водним розчином (1:1000) нейтральрот протягом 5-20 хв. Для отримання стійкого рожевого забарвлення, що не зникає протягом 5 діб і не впливає на рухливість плероцеркоїдів, зазвичай достатньо 10 хв. Ступінь забарвлення контролюють шляхом перегляду личинок у чистому ізотонічному розчинінатрію хлориду, для чого плероцеркоїди періодично витягають з фарби. Доцільно застосовувати метиленовий синій для фарбування мертвих плероцеркоїдів.

Р.Э.Чобанов та інших. (1986) запропонували методику визначення життєздатності яєць і личинок гельмінтів з використанням барвника пігменту «рубрин», одержуваного при культивуванні цвілевого гриба Peniciliium rubrum. Для цього використовують 3% водний розчин барвника.

Процес забарвлення яєць і личинок завершується через 1,5 год. Нежиттєздатні яйця гостриків, бичачого і карликового ціп'яків, анкілостомід, тріхостронгілід набувають інтенсивного рожевого кольору, личинки анкілостомід і тріхостронгілід - червоний. Менш яскраве забарвлення спостерігається у яєць аскарид та волосоголовців, оскільки, виділяючись з кишечника, вони вже мають темно-коричневий колір: Життєздатні яйця та личинки не забарвлюються

Фізико-хімічні методи стимуляції виходу мирувдії з яєць трематод. Методи розроблені С.М.Герман та С.А.Беером (1984) для визначення життєздатності яєць опісторхів та дикроцеліумів шляхом впливу реакційного середовища на яйця. Якщо вони живі, відбувається виходження мирацидію. Методи засновані на фізикохімічній активації залози вилуплення мірацидію та стимуляції рухової активності личинки. Стимуляція досягається впливом на яйця трематоди спеціального реакційного середовища у поєднанні з послідовними прийомами – створенням перепаду температур, підсушуванням суспензії яєць, впливом слабкого струму рідини в досліджуваній краплі, які сприяють масовому виходу мироцидів із яєць.

Визначення життєздатності яєць опісторха за методом Герман, Беера. Завис яєць у воді (водопровідній, що відстояла) попередньо охолоджують до 10-12 °С. Усі наступні операції здійснюють за кімнатної температури (18-22 °С). У центрифужну пробірку вносять одну краплю (приблизно 0,05 мл) суспензії, що містить 100-400 яєць. Пробірки ставлять до штатива на 5-10 хв, щоб осадити яйця. Потім вузькою смужкою фільтрувального паперу обережно відсмоктують надлишок води до повного видалення. У пробірку додають 2 краплі середовища, струшують, вміст переносять піпеткою на предметне скло і залишають на 5-10 хв, злегка похитуючи (або поміщають під фен) для створення слабких струмів рідини в досліджуваній краплі суспензії. Ця операція, що імітує перистальтику кишківника молюска, дозволяє активізувати вихід мірацидіїв. Після цього до суспензії додають ще 2 краплі середовища і потім мікроскопують препарат за допомогою звичайного світлового мікроскопа (Х200). За цей час у яєць із життєздатним мирацидієм має відкритися кришечка, при цьому личинка активно виходить у середу. Завдяки наявності в ній етанолу мірацидій через 3-5 хв знерухомлюється, а потім фарбується барвником, що знаходиться в середовищі. У результаті легко виявляють та підраховують мірацидії.

Приготування реакційного середовища. Середовище готують на 0,05 М трис-HCi буфері в оптимальних режимах pH 8,0-9,5. У буфер додають етанол до 10-13% і барвник (сафранін, метиленовий синій та інші, що працюють в межах pH) до слабкого фарбування рідини (наприклад, для сафраніну його кінцева концентрація становитиме 1:50 000). Можна використовувати інший буфер, що працює в лужних межах pH, наприклад 0,05 М фосфатний (pH 8,5). Отже, середовище містить 96% етанол – 12 частин; барвник ( матковий розчин) - 1-10 частин; 0,05 М тріс-НС! буфер (pH 8,5-9,5) – до 100 частин. Приклад середовища: 12 частин 96% етанолу, 1 частина насиченого розчину сафраніну, решта до 100 частин - 0,05 М буфер трис-HCl, pH 9,5.

Визначення життєздатності яєць дикроцеліуму методом Герман, Беера, Стратана. Краплю суспензії, що містить 100-150 яєць трематоди, поміщають у центрифужну пробірку на 1-2 хв для осадження яєць. Потім обережно підсушують рідину за допомогою смужки фільтрувального паперу. Додають пастерівською піпеткою 1-2 краплі реакційного середовища та інкубують на водяній бані при 28-30 °С 2-3 хв. Склад середовища: 6 частин бутанолу, 94 частини 0,4% розчину хлориду натрію або 0,3% розчину калію хлориду в дистильованій воді. Яйця в середовищі переносять піпеткою на предметне скло і залишають на 1,5-2 години при кімнатній температурі (18-22 °С), при цьому кожні 25-30 хв (у міру підсихання) додають по 1-2 краплі (0,05 мл) розчину бутанолу в дистильованій воді. Після цього препарат мікроскопують при 100-200-кратному збільшенні. Життєздатність визначають за кількістю яєць, що розкрилися, з вийшли мирацидиями. Бутанол проникає через пори оболонки яєць, досягає мірацидіїв та активізує їх. Інкубація при зазначеній температурі посилює цей процес. Бутанол в концентрації 3-7% згубний для мирицидію, що вийшов з яйця. Перенесення суспензії яєць з пробірки на предметне скло дозволяє на момент виходу мірацидію (через 30-40 хв) знизити концентрацію бутанолу за рахунок випаровування до безпечного рівня (1,5-0,5 %). Наявність у середовищі хлориду натрію в концентрації 0,1-0,5% (або хлориду калію в концентрації 0,05-0,4%) обумовлює активність мироцидію, що вийшов. На відміну від дрібних прозорих яєць опісторха яйця дикроцеліуму мають темнозабарвлену оболонку, у них добре помітна кришечка, відкрита після виходу мірацидію. Тому життєздатність яєць дикроцеліуму зручніше оцінювати шляхом підрахунку яєць, що розкрилися, а не фарбування і підрахунку мирацидіїв.

Люмінесцентний метод дослідження яєць та личинок гельмінтів.

Вперше в гельмінтологічній практиці методи люмінесцентної мікроскопії були застосовані в 1955 р. При цьому повідомлялося, що люмінесцентна мікроскопія дає можливість диференціювати живі та мертві об'єкти без ушкодження яйця. Для флюоресценції використовувалися не УФ-промені, а синьо-фіолетова частина видимого світла, З звичайним мікроскопом і предметним склом; до освітлювача "ОІ-18" застосовувався спеціальний набір кольорових фільтрів.

Було встановлено, що живі та мертві яйця аскарид, гостриків, карликових ціп'яків, бичачого ціп'яка, широкого лентеця та інших гельмінтів люмінескують неоднаково. Це явище спостерігається як при первинній люмінесценції без застосування барвників, так і при фарбуванні флюорохромами (акридиновий помаранчевий, корифосфін, примулін, ауролін, сульфат берлерину, трипафлавін, риванол, акрихін та ін.).

Незабарвлені живі несегментовані яйця аскарид світяться яскраво-зеленим світлом жовтуватим відтінком; у мертвих яєць оболонка випромінює зелене світло значно яскравіше, ніж темно-зелена зародкова; у яєць аскарид з личинкою проявляється лише оболонка, а в мертвих і оболонка, і личинка яскраво-жовтого кольору.

Непігментовані та несегментовані живі яйця гостриків та карликових ціп'яків випромінюють зеленувато-жовте світло; у мертвих яєць інтенсивно люмінескує оболонка на тлі темно-зеленої зародкової маси. При вторинній люмінесценції (при фарбуванні акридиновим помаранчевим у розведенні 1:10 ТОВ та 1:50 ТОВ від 30 хв до 2 год) оболонка живих та мертвих нематод, трематод та цестод люмінескує неоднаково.

Шкаралупа живих і мертвих Ascaris lumbricoides, Toxocara leonina, Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. diminuta, T.saginatus, D.latum забарвлюється в оранжево-червоний колір. Зародки живих Asc. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum та онкосфери бичачого ціп'яка люмінескують тьмяним темно-зеленим або сіро-зеленим кольором. Мертві зародки цих яєць гельмінтів випромінюють «гаряче» оранжево-червоне світло. Живі личинки гостриків і токсокар (звільнені від шкаралупи яйця) випромінюють тьмяне сіро-зелене світло, при їх загибелі колір змінюється від головного кінця в світло-зелений, потім жовтий, помаранчевий і, нарешті, яскраво-оранжевий.

При фарбуванні флюорохромами - корифосфілом, примуліном - у мертвих яєць аскарид і волосоголовців спостерігається свічення від лілово-жовтого до мідно-червоного кольору. Життєздатні яйця не люмінескують, а забарвлюються у темно-зелений колір. Живі яйця трематод Paragonimus westermani і Clonorchis sinensis не люмінескують після фарбування акридиновим помаранчевим, а від мертвих яєць виходить жовтувато-зелене світло.

Метод люмінесценції може бути застосований і визначення життєздатності личинок гельмінтів. Так, флюорохромовані розчином акридинового помаранчевого (1:2000) личинки стронгілятів, рабдитат світяться: живі – зеленим (з відтінком), мертві – яскраво-оранжевим світлом. Живі личинки трихінелл не світяться або дають слабке світіння при 10-хвилинній обробці розчинами ізотіоціанату флюоресцеїну, аураміну та ін. Флюорохромовані мертві личинки (в концентрації 1:5000) дають яскраве свічення.

Живі мірацидії, що вийшли з оболонки, випромінюють тьмяне блакитне світло з ледь помітним світло-жовтим віночком вій, але через 10-15 хв після загибелі проявляються яскравим світло-зеленим, а потім оранжево-червоним світлом.

Гельмінтологічні методи досліджень. Методи діагностики гельмінтозів поділяють на прямі, засновані на безпосередньому виявленні самих гельмінтів або їх фрагментів, а також личинок і яєць гельмінтів (методи дослідження фекалій, сечі, жовчі та дуоденального вмісту, мокротиння, крові та тканин, матеріалу, отриманого при зіскрібці з пери піднігтьових просторів), і непрямі, за допомогою яких виявляють вторинні зміни, що виникають в організмі людини в результаті життєдіяльності гельмінтів (дослідження морфологічного складу крові, імунологічні методидіагностики гельмінтозів, рентгенологічні дослідження тощо). З прямих методів найбільш поширені копрологічні, які поділяються на макро- та мікрогельмінтоскопічні. У окремих випадках використовують спеціальні методи.

Макрогельмітоскопічні методи дослідженняспрямовані на пошуки гельмінтів або їх фрагментів (сколексів, члеників, частин стробіл цестод). Їх застосовують для діагностики тих гельмінтозів, при яких яйця не виділяються з екскрементами хворого або виділяються в невеликій кількості і не завжди (наприклад, при ентеробіозі у фекаліях виявляють гострики, при теніїдозах - членики).

Для виявлення у фекаліях гостриків чи члеників цестод проводять перегляд фекалій неозброєним оком. Для диференціальної діагностикиТенідоз рекомендується перегляд розріджених водою фекалій окремими невеликими порціями в чорних фотографічних кюветах або в чашках Петрі на темному тлі. Великі утворення, підозрілі на фрагменти гельмінтів, розглядають під лупою між двома предметними шибками. Якщо ж за клінічними показаннями припускають виявлення дрібних гельмінтів або голівок цестод після лікування, то підозрілі частки розглядають під лупою в краплі гліцерину, а в разі потреби під мікроскопом.

Мікрогельмінтоскопічні методи дослідження(якісні) спрямовані на виявлення яєць та личинок гельмінтів. Застосовують метод товстого мазка з целофановою покривною платівкою за Като. Суміш Като складається з 6 мл 3% водного розчину малахітової зелені, 500 млгліцерину та 500 мл 6% розчину фенолу. Платівки по Като (гідрофільний целофан розрізають на частини розміром 20 40 мм) занурюють на 24 году суміш Като так, щоб вони прилягали один до одного (3-5 млрозчину Като на 100 платівок). 100 мгфекалій наносять на предметне скло, накривають покривною целофановою пластинкою по Като і придавлюють так, щоб фекалії розмазалися по предметному склу в межах целофанової пластинки. Мазок залишають за кімнатної температури для освітлення на 40-50 хв,після цього переглядають під мікроскопом. У жарку пору року щоб уникнути висихання препарату на пластинку приготовленого препарату кладуть вологу губку.

Для повного виявлення гельмінтів всіх видів метод товстого мазка з целофановою покривною пластинкою за Като необхідно використовувати у поєднанні з одним із методів збагачення. Найбільш поширеними є метод Калантарян і метод Фюллеборна.

Метод Калантарян: у склянках із широким горлом об'ємом 100 млретельно розмішують скляною паличкою. гфекалій, поступово доливаючи насичений розчин нітрату натрію. кгазотнокислого натрію на 1 лводи при кип'ятінні) до країв склянки. Великі частинки, що спливли на поверхню, видаляють паперовим совочком. До поверхні сольового розчину прикладають предметне скло (сольовий розчин додають до повного дотику суміші з предметним склом). Через 20-30 хвпредметне скло знімають та плівку переглядають під мікроскопом. За відсутності цієї солі можна використовувати насичений розчин кухонної солі за Фголлеборном (400 гсолі в 1 лводи при кип'ятінні).

У зв'язку з тим, що яйця, що мають велику питому вагу (непліднені яйця аскарид, яйця трематод та великих цестод), не спливають, крім дослідження поверхневого шару рідини, при використанні методу Фюллеборна необхідно переглянути під мікроскопом 2-4 препарати з осаду.

Спеціальні лабораторні методи досліджень різних гельмінтози.

Дослідження фекалій

Мікроскопіювання спочатку проводять при слабкому збільшенні (Х80). Найпростіших можна замінити за сильнішою заломлюваністю світла, а деякі види - за їх рухом або зміною форми. Об'єкт, помічений при малому збільшенні, розглядають при збільшенні 400 або 600. При відсутності досвіду перегляд мазків слід проводити відразу при великому збільшенні, що значно збільшує час на вивчення препарату. Перегляд мазків при великому збільшенні слід проводити при сильнішому освітленні, регулюючи його за допомогою конденсора.

Диференційними ознаками окремих видівамеб у нативному мазку є форма і розмір тіла, видимість ядра, характер утворення псевдоподій, рух, розподіл цитоплазми на екто- та ендоплазму, характер включень (фагоцитовані еритроцити та ін.). При диференціюванні видів джгутиконосців - розмір і форма тіла, кількість джгутиків, характер пересування, наявність або відсутність ундулюючої мембрани. Специфічними ознаками балантидії є розмір, форма тіла, рух, вії, цитостом та ін.

Основним відмітною ознакоювегетативних форм найпростіших у живому стані служить рух. У мазках зустрічаються різноманітні нерухомі утворення - рослинна клітковина, м'язові волокна, суперечки, грибки і т.д. Вони не повинні братися до уваги при протозоологічній діагностиці.

Метод нативного мазка простий та доступний для будь-якої лабораторії. Він дозволяє при знаходженні тканинних форм дизентерійних амеб із фагоцитованими еритроцитами поставити зовсім точний діагнозамебної дизентерії, а при виявленні балантидій та лямблій – діагноз балантидіазу та лямбліозу.

Забарвлення мазків розчином Люголю . Це фарбування застосовується для діагностики найпростіших за цистами. Нею користуються при дослідженні оформленого, напівоформленого та кашкоподібного калу.

Для приготування мазка кінець дерев'яної палички мажеться у фекаліях і обмивається в краплі йодного розчину (J - 1,0 г, KJ - 2 г, дистильована вода - 100 мл), нанесеного на предметне скло до отримання рівномірної емульсії. Препарат накривають покривним склом та через 3 – 5 хв. мікроскопують. Мазок повинен бути досить прозорим для вивчення його в світлі, що проходить.

Серед залишків неперетравленої їжі, спор, грибків, йодофільних бактерій цисти найпростіших, пофарбовані в коричневий або зеленувато-жовтий колір, виділяються строго визначеною, характерною для кожного виду формою, розміром, чіткими обрисами країв, наявністю гладкої, прозорої, двоконтурної оболонки, вмістом цитоплазми, з нечітко вираженою структурою. У цистах амеб помітні забарвлені у коричневий (темно-бурий) колір глікогенові вакуолі. Ступінь забарвлення цих вакуолей і обриси їх меж варіюють у найпростіших цистах одного і того ж виду в залежності від їх зрілості.