Для адекватного та ефективного лікування багатьох інфекційних захворювань потрібне своєчасне встановлення точного діагнозу. У вирішенні цього завдання у наші дні залучаються високотехнологічні методи діагностики, засновані на методах молекулярної біології. Зараз полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) вже досить широко застосовується в практичній медицині як найбільш надійний інструмент лабораторної діагностики.

Чим пояснюється популярність ПЛР нині?

По-перше, цей метод використовується для виявлення збудників різних інфекційних захворювань із високою точністю.

По-друге, контролю ефективності проведеного лікування.

У різних посібниках, проспектах, статтях, а також поясненнях лікарів-фахівців ми часто стикаємося з вживанням незрозумілих термінів та слів. Дійсно важко розповісти про високотехнологічні продукти науки звичайними словами.

У чому суть та механіка ПЛР діагностики?

Кожен живий організм має унікальні гени. Гени знаходяться в молекулі ДНК, яка власне і є «візитною карткою» кожного конкретного організму. ДНК (генетичний матеріал) - це дуже довга молекула, яка складається з "цеглинок", званих нуклеотидами. У кожного збудника інфекційних захворювань вони розташовані строго специфічно, тобто у певній послідовності та комбінації. Коли необхідно зрозуміти, чи є у людини той чи інший збудник, забирається біологічний матеріал (кров, сеча, слина, мазок), який містить ДНК або фрагменти ДНК мікроба. Але кількість генетичного матеріалу збудника дуже мала, і неможливо сказати якому саме мікроорганізму він належить. Для вирішення цього завдання і служить ПЛР. Суть полімеразної ланцюгової реакції полягає в тому, що береться мала кількість матеріалу для дослідження, що містить ДНК, а в процесі ПЛР відбувається збільшення кількості генетичного матеріалу, що належить конкретному збуднику і, таким чином, його можна ідентифікувати.

ПЛР діагностика - генетичне дослідження біоматеріалу.

Ідея методу ПЛР належить американському вченому K.Mullins, яку він запропонував 1983 року. Однак широке клінічне застосування набула лише в середині 90-х років XX століття.

Розберемося з термінологією, що це таке – ДНК тощо. Кожна клітина будь-якої живої істоти (тварини, рослини, людини, бактерії, вірусу) має хромосоми. Хромосоми – це зберігачі генетичної інформації, які містять усю послідовність генів кожної конкретної живої істоти.

Кожна хромосома складається із двох ниток ДНК, закручених у спіраль одна щодо одної. ДНК – хімічно це дезоксирибонуклеїнова кислота, яка складається із структурних компонентів – нуклеотидів. Нуклеотидів буває 5 видів – тімін (Т), аденозин (А), гуанін (Г), цитозин (Ц) та урацил (У). Нуклеотиди розташовуються один за одним у суворій індивідуальній послідовності, утворюючи гени. Один ген може складатися із 20-200 таких нуклеотидів. Наприклад, ген, що кодує вироблення інсуліну, складається з 60 пар нуклеотидів.

Нуклеотиди мають властивість комплементарності. Це означає, що навпроти аденіну (А) в одному ланцюжку ДНК обов'язково стоїть тимін (Т) в іншому ланцюжку, а навпроти гуаніну (Г) – цитозин (Ц). Схематично виглядає так:
Г - Ц
Т - А
А - Т
Дана властивість комплементарності є ключовою для проведення ПЛР.

Крім ДНК таку ж структуру має РНК - рибонуклеїнова кислота, що відрізняється від ДНК тим, що замість тиміну в ній використовується урацил. РНК є зберігачем генетичної інформації у деяких вірусів, які називаються ретровірусами (наприклад, ВІЛ).

Молекули ДНК і РНК можуть «розмножуватися» (ця властивість використовується щодо ПЛР). Відбувається це наступним чином: дві нитки ДНК або РНК, що відходять одна від одної в сторони, на кожну нитку сідає спеціальний фермент, який синтезує новий ланцюжок. Синтез йде за принципом комплементарності, тобто, якщо у вихідному ланцюжку ДНК стоїть нуклеотид А, то у знову синтезованій стоятиме Т, якщо Г - то Ц і т.д. Цей спеціальний фермент -«будівельник» для початку синтезу потребує «затравки» - послідовності з 5-15 нуклеотидів. Ця «затравка» визначена для кожного гена (гена хламідії, мікоплазми, вірусів) експериментально.

Отже, кожен цикл ПЛР складається із трьох стадій. У першу стадію відбувається так зване розкручування ДНК – тобто поділ пов'язаних між собою двох кіл ДНК. По-друге – відбувається приєднання «затравки» до ділянки нитки ДНК. І, нарешті, подовження даних ниток ДНК, яке виробляється ферментом-«будівельником». В даний час весь цей складний процес протікає в одній пробірці і складається з циклів розмноження, що повторюються, визначається ДНК з метою отримання великої кількості копій, які можуть бути, потім виявлені звичайними методами. Тобто з однієї нитки ДНК ми отримуємо сотні чи тисячі.

Етапи проведення ПЛР дослідження

Забір біологічного матеріалу для дослідження

Як проба служить різний біологічний матеріал: кров та її компоненти, сеча, слина, що відокремлюється слизових оболонок, спинномозкова рідина, що відокремлюється ранових поверхонь, вміст порожнин тіла. Усі біопроби збираються одноразовими інструментами, а набраний матеріал укладають у пластикові стерильні пробірки або поміщають на культуральні середовища, з подальшим транспортуванням до лабораторії.

У забрані проби додають необхідні реагенти та ставлять у програмований термостат – термоциклер (ампліфікатор). В ампліфікаторі 30-50 разів повторюється цикл ПЛР, що складається з трьох етапів (денатурація, відпал та подовження). Що це означає? Розглянемо докладніше.

Етапи безпосередньо ПЛР реакції, копіювання генетичного матеріалу

IЕтап ПЛР - Підготовка генетичного матеріалу для копіювання.
Відбувається при температурі 95 ° С, при цьому нитки ДНК роз'єднуються, і на них можуть сідати «затравки».

Затравки виготовляють промисловим способом різні науково-виробничі об'єднання, а лабораторії купують уже готові. При цьому «затравка» для виявлення, наприклад, хламідії працює тільки для хламідії і т.д. Таким чином, якщо тестується біоматеріал на наявність хламідійної інфекції, то реакційну суміш міститься «затравка» для хламідій; якщо тестування біоматеріалу на вірус Епштейн-Барра, то і "затравка" для вірусу Епштейн-Барра.

IIетап – Об'єднання генетичного матеріалу збудника інфекції та «затравки».
Якщо є ДНК визначається вірусу або бактерії, «затравка» сідає на цю ДНК. Цей процес приєднання «затравки» є другий етап ПЛР. Ця стадія проходить при температурі 75°С.

IIIЕтап - Копіювання генетичного матеріалу збудника інфекції.
Це процес власне подовження або розмноження генетичного матеріалу, що відбувається за 72°С. До «затравки» підходить фермент-«будівельник» і синтезує новий ланцюжок ДНК. З закінченням синтезу нового ланцюжка ДНК, закінчується цикл ПЛР. Тобто за один цикл ПЛР відбувається збільшення кількості генетичного матеріалу вдвічі. Наприклад, у вихідній пробі було 100 молекул ДНК якогось вірусу, після першого циклу ПЛР у пробі буде вже 200 молекул ДНК тестованого вірусу. Один цикл триває 2-3 хвилини.

Для утворення достатньої кількості генетичного матеріалу для ідентифікації зазвичай проводиться 30-50 циклів ПЛР, що займає 2-3 години.

Етап ідентифікації розмноженого генетичного матеріалу

Власне ПЛР на цьому закінчується і далі йде не менш значний етап ідентифікації. Для ідентифікації використовують метод електрофорезу або мічені "затравки". При використанні електрофорезу отримані нитки ДНК поділяються за розмірами, і наявність фрагментів ДНК різної довжини свідчить про позитивний результат аналізу (тобто наявність того чи іншого вірусу, бактерії тощо). При використанні мічених «затравок» до кінцевого продукту реакції додають хромоген (барвник), внаслідок чого ферментативна реакція супроводжується утворенням забарвлення. Розвиток забарвлення прямо свідчить, що вірус або інший агент присутній у вихідній пробі.

На сьогоднішній день, використовуючи мічені «затравки», а також відповідне програмне забезпечення, можна робити одразу і «читання» результатів ПЛР. Це так звана real-time ПЛР.

Чому ПЛР діагностика має таку цінність?

Однією із суттєвих переваг методу ПЛР є висока чутливість – від 95 до 100%. Однак ці переваги повинні базуватися на неодмінному дотриманні таких умов:

1. коректний паркан, транспортування біологічного матеріалу;
2. наявність стерильного, одноразового інструментарію, спеціальних лабораторій та навченого персоналу;
3. суворе дотримання методики та стерильності під час проведення аналізу

Чутливість відрізняється для різних мікробів, що виявляються. Так, наприклад, чутливість методу ПЛР виявлення вірусу гепатиту С становить 97-98%, чутливість виявлення уреаплазми – 99-100%.

Можливості, закладені у ПЛР-аналізі, дозволяють досягти неперевершеної аналітичної специфічності. Це означає виявлення саме того мікроорганізму, який шукали, а не схожого чи близькоспорідненого.
Діагностична чутливість і специфічність методу ПЛР, найчастіше перевищують такі й у культурального методу, званого «золотим стандартом» виявлення інфекційних захворювань. Враховуючи тривалість вирощування культури (від кількох днів до кількох тижнів), перевага методу ПЛР стає очевидною.

ПЛР у діагностиці інфекцій
Переваги методу ПЛР (чутливість та специфічність) визначають широкий спектр застосування у сучасній медицині.
Основні сфери застосування ПЛР-діагностики:

1. діагностика гострих та хронічних інфекційних захворювань різної локалізації
2. контроль ефективності проведеної терапії
3. уточнення виду збудника

ПЛР використовується в акушерстві, гінекології, неонатології, педіатрії, урології, венерології, нефрології, клініці інфекційних хвороб, офтальмології, неврології, фтизіопульмонології та ін.

Використання ПЛР-діагностики проводиться разом з іншими методами дослідження (ІФА, ПІФ, РІФ та ін.). Їх поєднання і доцільність визначає лікар.

Збудники інфекцій, що виявляються методом ПЛР

Віруси:

1. ретровіруси HIV-1 та HIV-2
2. герпетиформні віруси
3. вірус простого герпесу 1 та 2 типів

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)- експериментальний метод молекулярної біології, який є специфічною ампліфікацією нуклеїнових кислот, що індукується синтетичними олігонуклеотидними праймерами. in vitro.

Ідея розробки методу ПЛР належить американському досліднику Kary Mullis, який у 1983 р. створив метод, що дозволив ампліфікувати ДНК у ході циклічних подвоєнь за допомогою ферменту ДНК-полімерази у штучних умовах. Через кілька років після опублікування цієї ідеї, 1993 р., К. Mullis отримав за неї Нобелівську премію.

На початку використання методу після кожного циклу нагрівання-охолодження доводилося додавати реакційну суміш ДНК-полимеразу, оскільки вона швидко инактивировалась при високій температурі. Процедура була дуже неефективною, вимагала багато часу та ферменту. У 1986 р. її суттєво модифікували за рахунок використання ДНК-полімерази з термофільних бактерій. Ці ферменти здатні витримувати безліч циклів реакції, що дозволяє автоматизувати проведення ПЛР. Одна з найбільш часто використовуваних термостабільних ДНК-полімераз була виділена з бактерій Thermus aquaticusі названа Taq-ДНК-полімеразою.

Суть методу.Метод заснований на багаторазовому вибірковому копіюванні певної ділянки ДНК за допомогою ферменту Taq-ДНК-полімерази. Полімеразна ланцюгова реакція дозволяє отримати ампліфікати завдовжки кілька тисяч пар нуклеотидів. Для збільшення довжини ПЛР-продукту до 20-40 тис. пар нуклеотидів застосовують суміш різних полімераз, але все одно це значно менше за довжину хромосомної ДНК еукаротичної клітини.

Реакція проводиться в термостаті (ампліфікаторі) - приладі, який може проводити досить швидко.

охолодження та нагрівання пробірок (зазвичай з точністю не менше 0,1 ° С). Ампліфікатори дозволяють задавати складні програми, у тому числі з можливістю «гарячого старту» та подальшого зберігання. Для ПЛР як реального часу випускають прилади, обладнані флуоресцентним детектором. Існують також прилади з автоматичною кришкою та відділенням для мікропланшет, що дозволяє вбудовувати їх у автоматизовані системи.

Зазвичай під час проведення ПЛР виконується 20-45 циклів, кожен із яких складається з трьох стадій: денатурації, відпалу праймерів, елонгації (рис. 6.1 і 6.2). На рис. 6.1 представлено динаміку зміни температури в пробірці під час проведення циклу ПЛР.

Рис. 6.1.Графік зміни температури в пробірці протягом одного циклу полімеразної ланцюгової реакції

Денатурація ДНК-матриціпроводиться за допомогою нагрівання реакційної суміші до 94-96 °С на 5-90 с, щоб ланцюга ДНК розійшлися. Слід зазначити, перед першим циклом здійснюють попередній прогрів реакційної суміші протягом 2-5 хв для повної денатурації вихідної матриці, що дозволяє знизити кількість неспецифічних продуктів реакції.

Рис. 6.2.Схема першого циклу полімеразної ланцюгової реакції

Стадія відпалу праймерів.При плавному зниженні температури, праймери комплементарно зв'язуються з матрицею. Температура відпалу залежить від складу праймерів і зазвичай вона на 4-5° нижче за розрахункову температуру плавлення. Тривалість стадії – 5-60 с.

Під час наступної стадії - елонгації- відбувається синтез дочірнього ланцюга ДНК на материнській матриці. Температура елонгації залежить від полімерази. Часто використовувані ДНК-полімерази Taq та Pfu найбільш активні при 72 °С. Час елонгації, що в основному залежить від довжини ПЛР-продукту, зазвичай становить 1 хв на кожну тисячу пар підстав.

Який дозволяє виявити в біологічному матеріалі малі кількості точніше, певних її фрагментів, та розмножити їх у багато разів. Потім їх ідентифікують візуально шляхом електрофорезу в гелі. Реакція була розроблена у 1983 р. К. Муллісом та включена до списку видатних відкриттів останніх років.

Які механізми ПЛР

Вся методика базується на здібності нуклеїнових кислот до самостійної реплікації, що в даному випадку проводиться штучно за умов лабораторії. Відтворення ДНК може початися не в будь-якій ділянці молекули, а тільки в ділянках з певною послідовністю нуклеотидів - стартових фрагментах. Щоб полімеразна ланцюгова реакція почалася, потрібні праймери (або ДНК-зонди). Це короткі фрагменти ланцюжка ДНК із заданою нуклеотидною послідовністю. Вони комплементарні (тобто відповідні) стартовим ділянкам

Зрозуміло, щоб створити праймери, вчені повинні вивчити послідовність нуклеотидів тієї, що бере участь у методиці. Саме ці ДНК-зонди забезпечують специфічність реакції та її ініціацію. не піде, якщо в зразку не знайдеться хоча б одна молекула ДНК, що шукається. В цілому, для проведення реакції необхідні вищезазначені праймери, набір нуклеотидів, термостійка ДНК-полімераза. Остання є ферментом - каталізатором реакції синтезу нових молекул нуклеїнової кислоти на основі зразка. Всі ці речовини, включаючи біологічний матеріал, у якому необхідно виявити ДНК, поєднуються в реакційну суміш (розчин). Вона міститься в спеціальний термостат, що виконує її дуже швидке нагрівання та охолодження за заданий час - цикл. Зазвичай їх 30-50.

Як проходить ця реакція

Сутність її в тому, що під час одного циклу праймери приєднуються до потрібних ділянок ДНК, після чого йде подвоєння під дією ферменту. На основі ниток ДНК, що вийшли, в наступних циклах синтезуються нові і нові ідентичні фрагменти молекули.

Полімеразно-ланцюгова реакція йде послідовно, виділяють наступні її стадії. Перша характеризується подвоюванням кількості продукту протягом кожного циклу нагрівання та охолодження. На другій стадії відбувається уповільнення реакції, оскільки фермент ушкоджується, а також втрачає активність. Крім цього, виснажуються запаси нуклеотидів та праймерів. На останній стадії плато продукти більше не накопичуються, оскільки реактиви закінчилися.

Де її застосовують

Безсумнівно, найширше застосування полімеразна ланцюгова реакція знаходить у медицині та науці. Її використовують у загальній та приватній біології, ветеринарній медицині, фармації та навіть екології. При цьому в останній це роблять для відстеження якості продуктів харчування та об'єктів зовнішнього середовища. Активно застосовується полімеразна ланцюгова реакція в криміналістичній практиці для підтвердження батьківства та ідентифікації особи людини. У судово-медичній експертизі, так само, як і в палеонтології, часто ця методика є єдиним виходом, тому що зазвичай для дослідження є дуже мала кількість ДНК. Безумовно, дуже широке застосування метод знайшов у практичній медицині. Він необхідний у таких її областях, як генетика, інфекційні та онкологічні захворювання.

Сайт надає довідкову інформацію виключно для ознайомлення. Діагностику та лікування захворювань потрібно проходити під наглядом фахівця. Усі препарати мають протипоказання. Консультація фахівця є обов'язковою!

Метод полімеразної ланцюгової реакціїбув відкритий майже тридцять років тому американським вченим на ім'я Керрі Мюлліс. Методика широко поширена в медицині як діагностичний інструмент, і суть її полягає в копіюванні ділянки ДНК за допомогою спеціального ферменту ( полімерази) штучним шляхом у пробірці.

У яких сферах медицини застосовується цей метод?

Для чого виконується копіювання ДНК і як це може стати медициною?
Ця методика дозволяє:

• Виділяти та клонувати гени.
• Діагностувати генетичні та інфекційні захворювання.
• Визначати батьківство. Дитина частково успадковує від своїх біологічних батьків генетичні особливості, проте має у своїй свою власну унікальну генетичну ідентифікацію. Наявність у нього деяких генів, ідентичних батьківським генам – дозволяє говорити про встановлення спорідненості.

Полімеразна ланцюгова реакція застосовується також у криміналістичній практиці.

На місці злочину судмедексперти збирають зразки генетичних матеріалів. До них відносяться: волосся, слина, кров. Згодом, завдяки методиці полімеразної реакції, можна ампліфікувати ДНК та порівняти ідентичність взятої проби з генетичним матеріалом підозрюваної людини.

У медицині ефективно використовується полімеразна ланцюгова реакція:

• У пульмонологічній практиці – для диференціації бактеріальних та вірусних видів пневмонії, туберкульозу.
• У гінекологічній та урологічній практиці – для визначення уреаплазмозу, хламідіозу, мікоплазмової інфекції, гарднереллезу, герпесу, гонореї.
• У гастроентерологічній практиці.
• У гематології – для визначення онковірусів та цитомегаловірусної інфекції.
• В експрес-діагностиці таких інфекційних захворювань як вірусні гепатити, дифтерія, сальмонельоз.

В даний час найбільш поширений даний метод у діагностиці інфекційних хвороб ( гепатитів вірусної етіології, ВІЛ, венеричних захворювань, туберкульозу, кліщового енцефаліту.).

Що відбувається під час перебігу реакції?

Сама реакція є хімічно нескладною. Джерелом ДНК для реакції може бути крапля крові, волосся, шматочок шкіри, і т.д. Теоретично, щодо реакції потрібні необхідні реагенти, пробірка, проба з біологічного матеріалу і джерело тепла.

Полімеразна реакція дозволяє виявити інфекцію, навіть якщо в пробі з біологічним матеріалом знаходиться лише одна або кілька ДНК-молекул збудника.

Під час протікання реакції завдяки ферменту ДНК-полімерази відбувається подвоєння ( реплікація) ділянки ДНК. Сама ж дезоксирибонуклеїнова кислота ( скорочено ДНК) важлива для нас тим, що забезпечує зберігання та передачу дочірнім клітинам генетичної інформації. ДНК має вигляд спіралі, яка складається з блоків, що повторюються. Ці блоки становлять нуклеотиди, які є найменшою часткою ДНК. Нуклеотиди утворюються із амінокислот.

Процес реплікації ділянок ДНК відбувається під час циклів, що повторюються. Кожен такий цикл копіюється і подвоюється як вихідний фрагмент ДНК, а й ті фрагменти, які вже подвоїлися у минулий цикл ампліфікації. Усе це нагадує процес геометричної прогресії.

Існує:

• Природна ампліфікація ( тобто процес копіювання та розмноження ДНК), що відбувається у нашому організмі і є детермінованим, зумовленим процесом.
• Штучна ампліфікація, що відбувається завдяки полімеразній ланцюговій реакції. У цьому випадку процес копіювання є керованим і дає змогу подвоїти навіть короткі ділянки нуклеїнової кислоти.

Після завершення кожного циклу копіювання кількість фрагментів нуклеїнової кислоти зростає в геометричній прогресії. Саме тому сам процес називають ланцюговою реакцією.

Через тридцять - сорок циклів кількість фрагментів сягає кількох мільярдів.

Для ампліфікації in vitro (у пробірці) необхідно, щоб у біосередовищі, взятому для діагностики, був присутній специфічний чужорідний фрагмент ДНК ( тобто ДНК не пацієнта, а збудника). Якщо в створеному розчині не буде специфічний фрагмент - ланцюгова реакція під дією полімерази не піде. Цим і пояснюється факт високої специфічності ПЛР.

Етапи ПЛР-діагностики

1. З досліджуваного матеріалу виділяють ДНК.
2. Додають ДНК у спеціальний розчин із нуклеотидів.
3. Нагрівають розчин до температури 90 - 95 градусів Цельсія, щоб білок ДНК згорнувся.
4. Знижують температуру до 60 градусів.
5. При повторенні циклів підвищення-зниження температури кількість ділянок нуклеїнової кислоти зростає.

6. Шляхом проведення електрофорезу підбивається підсумок, і підраховуються результати подвоєння.

Які переваги має ця діагностика?

• Універсальність: для цього підходять будь-які зразки нуклеїнової кислоти.
• Висока специфічність: збудник має унікальні послідовності ланцюжків ДНК, властиві саме йому. Тому результати проведеної ПЛР будуть достовірними, у них неможливо сплутати ген одного збудника з геном іншого збудника.
• Чутливість до наявності навіть одиничної молекули збудника.

• Невеликий обсяг матеріалу, який буде необхідний дослідження. Підійде навіть крапля крові. Можливість отримати результат, використавши мінімальний обсяг проби, є дуже важливою для педіатричних, неонатологічних, неврологічних досліджень, а також у практиці судової медицини.
• Можливість визначення млявої, хронічної інфекції, а не тільки гострої.
• Багато хвороботворних культур дуже складно культивувати в пробірці іншими методиками, а полімеразна реакція дозволяє розмножити культуру в потрібній кількості.

Які недоліки має ця діагностика?

• Якщо у матеріалі, призначеному щодо ПЛР, перебуває ДНК як живого збудника, а й загиблого – відбуватиметься ампліфікація обох ДНК. Відповідно лікування після діагностики може бути призначене не зовсім правильне. За деякий час краще пройти контроль ефективності проведеного лікування.
• Підвищена чутливість до наявності мікроорганізмів теж може вважатися, певною мірою, недоліком. Адже в нормі в людському організмі є умовно-патогенна мікрофлора, тобто це мікроорганізми, які живуть в кишечнику, шлунку, інших внутрішніх органах. Ці мікроорганізми можуть завдати шкоди людині лише за певних несприятливих умов – недотримання гігієнічних вимог, забруднена питна вода тощо. ПЛР-методика ампліфікує ДНК навіть цих мікроорганізмів, хоча вони не призводять до патології.
• ПЛР різних тест-систем може показувати результати, які відрізнятимуться між собою. Існує багато модифікацій цієї методики: « вкладена», « асиметрична», « інвертована», « кількісна» ПЛР та інші.

Федеральне агентство з освіти

Державний освітній заклад

Вищої професійної освіти

"Карельська державна педагогічна академія"

Курсова робота на тему:

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) та її застосування

Виконала: студентка Корягіна Валерія Олександрівна

Перевірила: Карпікова Наталія Михайлівна

Петрозаводськ 2013

Вступ

Розділ 1. Літературний огляд

1.5.4 Ефект "Плато"

1.5.6 Ампліфікація

Висновок

Вступ

Останнє двадцятиріччя ознаменувалося широким впровадженням у біологічні, медичні та сільськогосподарські науки молекулярно-генетичних методів.

На початку 1970-х років здавалося, що молекулярна біологія досягла певної міри завершеності. У цей час головним об'єктом молекулярно-генетичних досліджень були мікроорганізми. Перехід до еукаріотів поставив перед дослідниками абсолютно нові проблеми, які не могли бути вирішені з використанням методів генетичного аналізу, що існували на той час. Прорив у розвитку молекулярної генетики став можливим завдяки появі нового експериментального інструменту – рестрикаційних ендонуклеаз. У наступні роки кількість методів безпосереднього аналізу ДНК, заснованих на підходах, що якісно різняться, почало стрімко збільшуватися.

Сучасні технології в багатьох випадках дозволили більш глибоко розпочати вивчення тонкої структурно-функціональної організації ядерних і позаядерних геномів різних організмів. Особливого значення це мало розробки нових методів діагностики та лікування різних захворювань. Не менш важливим виявилася можливість використання досягнення молекулярної генетики у популяційній біології та в селекції для виявлення та аналізу генетичної мінливості популяцій, сортів та штамів, ідентифікації та паспортизації господарсько цінних особин, створення генетично модифікованих організмів та для вирішення інших питань.

Кожен метод має свої переваги та недоліки. Немає універсального методу, який міг би дозволити вирішити всі проблеми, що виникають. Тому вибір конкретного методу для дослідження є одним з найважливіших етапів будь-якої наукової роботи.

Розділ 1. Літературний огляд

1.1 Історія відкриття полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)

У 1983 р. К.Б. Мюлліс та ін. опублікували і запатентували спосіб полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), якому судилося надати глибокий вплив на всі області дослідження та прикладного використання нуклеїнових кислот. Значення цього методу для молекулярної біології та генетики виявилося настільки велике і очевидне, що вже через сім років автору було присуджено Нобелівську премію з хімії.

На початку використання методу після кожного циклу нагрівання-охолодження доводилося додавати в реакційну суміш ДНК-полімеразу, оскільки вона інактивувалася при високій температурі, необхідної для поділу ланцюгів спіралі ДНК. Процедура проведення реакції була порівняно неефективною, вимагала багато часу та ферменту. У 1986 році метод полімеразної ланцюгової реакції був суттєво покращений. Було запропоновано використовувати ДНК-полімерази із термофільних бактерій. Ці ферменти виявилися термостабільними і здатні витримувати безліч циклів реакції. Їх використання дозволило спростити та автоматизувати проведення ПЛР. Одна з перших термостабільних ДНК-полімераз була виділена з бактерій. Thermus aquaticusі названа Taq-полімеразою.

Можливість ампліфікації будь-якого сегмента ДНК, послідовність нуклеотидів якого відома, та отримання його після завершення ПЛР в гомогенному вигляді та препаративній кількості роблять ПЛР альтернативним методом молекулярного клонування коротких фрагментів ДНК. При цьому не виникає необхідності застосування складних методичних прийомів, які використовують в генній інженерії при звичайному клонуванні. Розробка методу ПЛР багато в чому розширила методичні можливості молекулярної генетики, зокрема генної інженерії, причому настільки, що це кардинально змінило і посилило науковий потенціал багатьох її напрямів.

1.2 Різновиди полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)

· Вкладена ПЛР- застосовується зменшення кількості побічних продуктів реакції. Використовують дві пари праймерів та проводять дві послідовні реакції. Друга пара праймерів ампліфікує ділянку ДНК усередині продукту першої реакції.

· Інвертована ПЛР- використовується в тому випадку, якщо відома лише невелика ділянка всередині потрібної послідовності. Цей метод особливо корисний, коли потрібно визначити сусідні послідовності після вставки ДНК геном. Для здійснення інвертованої ПЛР проводять ряд розрізань ДНК – рестриктазами.<#"justify">полімеразна ланцюгова реакція праймер

· Груп-специфічна ПЛР- ПЛР для споріднених<#"center">1.3 Полімеразна ланцюгова реакція

Відкрита в середині 80-х років полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) здатна збільшити кількість копій вихідної проби в мільйони разів протягом декількох годин. У ході кожного циклу реакції вихідної молекули утворюються дві копії. Кожна із синтезованих копій ДНК може бути матрицею для синтезу нових копій ДНК у наступному циклі. Таким чином, багаторазове повторення циклів призводить до зростання кількості копій у геометричній прогресії. З розрахунків випливає, що навіть за наявності 30 циклів кількість копій вихідної молекули складе більше 1 мільярда. Навіть якщо врахувати, що в ході кожного циклу дуплікуються не всі амплікони, загальна кількість копій, незважаючи на це, становить досить велику цифру.

Кожен цикл полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) складається з наступних етапів:

· Денатурація – підвищення температури викликає розкручування та розщеплення дволанцюжкової молекули ДНК на дві одноланцюгові;

· Відпал - Зниження температури дозволяє праймерам приєднатися до комплементарних ділянок молекули ДНК;

· Елонгація – Фермент ДНК-полімеразу добудовує комплементарний ланцюг.

Для ампліфікації обраного фрагмента використовують два олігонуклеотидні праймери (затравки), фланкирующих певну ділянку ДНК. Праймери орієнтовані 3 -Кінцями назустріч один одному і у бік тієї послідовності, яку необхідно ампліфікувати. ДНК-полімераза здійснює синтез (добудову) взаємно комплементарних ланцюгів ДНК, починаючи з праймерів. При синтезі ДНК праймери фізично вбудовуються в ланцюг новосинтезуючих молекул ДНК. Кожен ланцюг молекули ДНК, що утворюється за допомогою одного з праймерів, може служити матрицею синтезу комплементарної ланцюга ДНК за допомогою іншого праймера.

1.4 Проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)

Полімеразну ланцюгову реакцію проводять у спеціальних тонкостінних поліпропіленових пробірках, сумісних за розміром із використовуваним термоциклером (ампліфікатором) - приладом, який контролює температурні та часові характеристики етапів полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).

1.5 Принцип методу полімеразної ланцюгової реакції

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - метод ампліфікації ДНК in vitro, за допомогою якого протягом кількох годин можна виділити та розмножити певну послідовність ДНК у мільярди разів. Можливість отримання величезної кількості копій однієї строго певної ділянки геному значно спрощує дослідження наявного зразка ДНК.

Для проведення полімеразної ланцюгової реакції необхідне дотримання низки умов:

1.5.1 Наявність у реакційній суміші ряду компонентів

Основними компонентами реакційної (ПЛР) суміші є: Трис-HCl, KCl, MgCl 2, суміш нуклеотидтрифосфатів (АТФ, ГТФ, ЦТФ, ТТФ), праймери (олігонуклеотиди), препарат аналізованої ДНК, термостабільна ДНК-полімераза. Кожен із компонентів реакційної суміші безпосередньо бере участь у полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР), а концентрація реагентів безпосередньо впливає на перебіг ампліфікації.

· Трис-HCl – визначає pH реакційної суміші, створює буферну ємність. Активність ДНК-полімерази залежить від pH середовища, тому значення водневого показника безпосередньо впливає на перебіг полімеразної ланцюгової реакції. Зазвичай, значення pH знаходиться в межах 8 - 9,5. Високе значення pH береться через те, що при підвищенні температури pH Трил-HCl буфера падає.

· KCl – концентрація хлориду калію до 50 мМ впливає на перебіг процесів денатурації та відпалу, концентрація понад 50 мМ інгібує ДНК-полімеразу.

· MgCl 2- оскільки ДНК-полімераза є Mg 2+- залежним ферментом, то концентрація іонів магнію впливає активність ферменту (Mg 2+утворює комплекси з НТФ – саме ці комплекси є субстратом для полімерази). Висока концентрація призводить до збільшення неспецифічної ампліфікації, а низька веде до інгібування реакції, оптимум (для різних полімераз) знаходиться в області 0,5 - 5мМ. Крім того, концентрація солей магнію впливає на перебіг процесів денатурації та відпалу - підвищення концентрації Mg 2+викликає підвищення температури плавлення ДНК (тобто температури, при корій 50% дволанцюжкових ниток ДНК роз'єднуються на одноланцюгові).

· НТФ – нуклеотидтрифосфати є безпосередніми мономерами нуклеїнових кислот. Для запобігання ланцюговій термінації рекомендується рівнокількове співвідношення всіх чотирьох нуклеотидтрифосфатів. Низька концентрація цих компонентів у реакційній суміші збільшує ймовірність помилки при побудові комплементарного ланцюга ДНК.

· Праймери – найбільш оптимальним є використання праймерів з різницею температур плавлення не більше 2 – 4 o С. Іноді при тривалому зберіганні при температурі 4 o З або після великої кількості заморожувань - відтавань праймери утворюють вторинні структури - димери, знижуючи ефективність протікання ПЛР. Усунення цієї проблеми зводиться до інкубації на водяній бані (Т=95 o С) протягом 3 хвилин і наступного різкого охолодження до 0o З.

· Препарати ДНК - кількість та якість препарату ДНК (матриці) безпосередньо впливає на перебіг та параметри полімеразної ланцюгової реакції. Надмірна кількість зразка ДНК пригнічує полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР). Домішки різних речовин, що містяться в препараті ДНК, можуть також зменшити ефективність протікання полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР): ацетат натрію, хлорид натрію, ізопропанол, етанол, гепарин, фенол, сечовина, гемоглобін та ін.

· ДНК-полімераза - при використанні малої кількості ДНК-полімерази спостерігається зменшення синтезу кінцевого продукту прямо пропорційно до розміру фрагментів. Надлишок полімерази в 2-4 рази призводить до появи дифузних спектрів, а в 4-16 разів - низькомолекулярних неспецифічних спектрів. Діапазон використовуваних концентрацій – 0,5 – 1,5 одиниць активності у перерахунку на 25 мкл ПЛР суміші.

Крім основних компонентів ПЛР суміші, використовують ряд додаткових речовин, що покращують якісні та кількісні показники ПЛР: ацетамід (5%) – збільшення розчинності основних компонентів; бетаїн (натрієва сіль) - стабілізація ДНК-полімерази, зниження температури плавлення ДНК, вирівнювання температури плавлення; альбумін бичачий (10-100 мкг/мл) - стабілізація ДНК-полімерази; диметилсульфоксид (1-10%) – підвищення розчинності основних компонентів; формамід (2-10%) – збільшення специфічності відпалу; гліцерин (15-20%) - підвищення термостабільності ферменту, зниження температури денатурації зразка ДНК; сульфат амонію - зниження температури денатурації та відпалу.

1.5.2 Циклічний та температурний режим

Загальний вид програми полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) наступний:

етап. Тривала первинна денатурація препарату ДНК.1 цикл

етап. Швидка денатурація препарату ДНК. Відпал праймерів. Елонгація.30 – 45 циклів.

етап. Тривала елонгація. Охолодження реакційної смеси.1 цикл.

Кожен елемент етапу – денатурація, відпал, елонгація – має індивідуальні температурні та часові характеристики. Параметри температури та часу протікання кожного елемента підбирають емпірично, відповідно до якісних та кількісних показників продуктів ампліфікації.

Денатурація. В ході даного елемента полімеразної ланцюгової реакції відбувається розщеплення дволанцюгової молекули ДНК на дві одноланцюгові. Температурні параметри денатурації знаходяться в області 90-95 o С, але у випадку ДНК-зразка з великим вмістом гуаніну та цитозину, температура має бути збільшена до 98 o Температура денатурації повинна бути достатньою для повної денатурації - розщеплення ниток ДНК і уникнення "раптового охолодження" або швидкого відпалу, проте термостабільна ДНК-полімераза менш стійка при високих температурах. Таким чином, вибір оптимальних температурних параметрів денатурації для співвідношення праймер/зразок (препарат ДНК) є важливою умовою при проведенні ампліфікації. Якщо температура денатурації на першому етапі вище 95 o С, рекомендується додавати ДНК-полімеразу реакційну суміш після первинної денатурації. Тривалість даного елемента етапу в ході полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) повинна бути достатньою для повної денатурації ДНК, але в той же час не впливати на активність ДНК-полімерази при даній температурі.

Відпал. Температура відпалу (Т а ) - один із найважливіших параметрів полімеразної ланцюгової реакції. Температура відпалу кожного конкретного праймера підбирається індивідуально. Вона залежить від довжини та нуклеотидного складу праймера. Зазвичай вона нижча на 2 - 4 o значення температури плавлення (Т m ) Праймер. Якщо температура відпалу системи нижча за оптимальну, то кількість неспецифічних ампліфікованих фрагментів зростає і, навпаки, більш висока температура зменшує кількість ампліфікованих продуктів. При цьому концентрація специфічних ампліконів може різко знижуватися, аж до пригнічення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Збільшення часу відпалу призводить до збільшення кількості неспецифічних ампліконів.

Елонгація. Зазвичай, кожен вид термостабільної ДНК-полімерази має індивідуальний температурний оптимум активності. Швидкість синтезу ферментом комплементарної нитки ДНК також є величиною специфічною для кожної полімерази (в середньому вона становить 30 - 60 нуклеотидів в секунду, або 1 - 2 тис. основ за хвилину), тому час елонгації підбирається залежно від типу ДНК-полімерази і довжини ампліфікується. регіону.

1.5.3 Основні засади підбору праймерів

При створенні ПЛР-тест-системи одним із основних завдань є правильний підбір праймерів, які повинні відповідати низці критеріїв:

Праймери мають бути специфічні. Особливу увагу приділяють 3 -Кінцям праймерів, т. До саме з них починає добудовувати комплементарну ланцюг ДНК Taq-полімераза. Якщо їхня специфічність недостатня, то, ймовірно, що в пробірці з реакційною сумішшю відбуватимуться небажані процеси, а саме синтез неспецифічної ДНК (коротких або довгих фрагментів). Вона видно на електрофорез у вигляді важких або легких додаткових смуг. Це заважає оцінці результатів реакції, тому що легко переплутати специфічний продукт ампліфікації із синтезованою сторонньою ДНК. Частина праймерів та дНТФ витрачається на синтез неспецифічної ДНК, що призводить до значної втрати чутливості.

Праймери нічого не винні утворювати димери і петлі, тобто. не повинно утворюватися стійких подвійних ланцюгів внаслідок відпалу праймерів самих на себе чи один з одним.

1.5.4 Ефект "Плато"

Слід зазначити, що процес накопичення специфічних продуктів ампліфікації геометричної прогресії йде лише обмежений час, а потім його ефективність критично падає. Це з так званим ефектом " плато " .

Термін ефект плато використовують для опису процесу накопичення продуктів ПЛР на останніх циклах ампліфікації.

Залежно від умов та кількості циклів реакції ампліфікації, на момент досягнення ефекту плато впливають утилізація субстратів (дНТФ і праймерів), стабільність реактантів (дНТФ і ферменту), кількість інгібіторів, включаючи пірофосфати та ДНК-дуплекси, конкуренція за реактанти неспецифічними продуктами або праймер-димерами, концентрація специфічного продукту і неповний.

Чим менша початкова концентрація ДНК-мішені, тим вищий ризик виходу реакції на плато". Цей момент може настати до того, як кількість специфічних продуктів ампліфікації буде достатньо, щоб їх можна було проаналізувати. Уникнути цього дозволяють лише добре оптимізовані тест-системи.

1.5.5 Підготовка проби біологічного матеріалу

Для виділення ДНК використовують різні методики в залежності від поставлених завдань. Їх суть полягає в екстракції (вилучення) ДНК з біопрепарату та видаленні або нейтралізації сторонніх домішок для отримання препарату ДНК з чистотою, придатною для постановки ПЛР.

Стандартною і вже класичною вважається методика отримання чистого препарату ДНК, описана Мрамором. Вона включає ферментативний протеоліз з подальшою депротеїнізацією і переосадженням ДНК спиртом. Цей метод дозволяє одержати чистий препарат ДНК. Однак він досить трудомісткий і передбачає роботу з такими агресивними речовинами, що мають різкий запах, як фенол і хлороформ.

Одним з найпопулярніших в даний час є метод виділення ДНК, запропонований Boom із співавторами. Цей метод заснований на використанні для лізису клітин сильного хаотропного агента - гуанідину тіоціонату (GuSCN), та подальшої сорбції ДНК на носії (скляні намисто, діатомова земля, скляне "молоко" і т.д.). Після відмивання в пробі залишається ДНК, сорбована на носії, з якого вона легко знімається за допомогою буфера, що елюює. Метод зручний, технологічний та придатний для підготовки зразка до ампліфікації. Однак можливі втрати ДНК внаслідок незворотної сорбції на носії, а також у процесі численних відмивок. Особливо велике значення це має під час роботи з невеликими кількостями ДНК у зразку. Крім того, навіть слідові кількості GuSCN можуть інгібувати ПЛР. Тому при використанні цього методу дуже важливим є правильний вибір сорбенту та ретельне дотримання технологічних нюансів.

Інша група методів пробопідготовки заснована на використанні іонообмінників типу Chilex, які на відміну від скла сорбують не ДНК, а навпаки, домішки, що заважають реакції. Як правило, ця технологія включає дві стадії: кип'ятіння зразка та сорбція домішок на іонообміннику. Метод надзвичайно привабливий простотою виконання. Найчастіше він придатний до роботи з клінічним матеріалом. На жаль, іноді трапляються зразки з такими домішками, які неможливо видалити за допомогою іонообмінників. Крім того, деякі мікроорганізми не піддаються руйнуванню простим кип'ятінням. У таких випадках необхідно запровадження додаткових стадій обробки зразка.

Таким чином, до вибору методу пробопідготовки слід належати до розуміння цілей проведення передбачуваних аналізів.

1.5.6 Ампліфікація

Для проведення реакції ампліфікації необхідно приготувати реакційну суміш і внести до неї аналізований зразок ДНК. При цьому важливо враховувати деякі особливості відпалу праймерів. Справа в тому, що, як правило, в аналізованому біологічному зразку присутні різноманітні молекули ДНК, до яких праймери, що використовуються в реакції, мають часткову, а в деяких випадках значну, гомологію. Крім того, праймери можуть відпалюватись один з одним, утворюючи праймер-димери. І те, й інше призводить до значної витрати праймерів на синтез побічних (неспецифічних) продуктів реакції та, як наслідок, значно зменшує чутливість системи. Це ускладнює або унеможливлює читання результатів реакції при проведенні електрофорезу.

1.6 Склад стандартної реакційної ПЛР суміші

х ПЛР буфер (100 мМ р-р Трис-HCl, pH 9,0, 500 мМ р-р KCl, 25 мМ р-р MgCl2 ) …….2,5 мкл

Вода (MilliQ) ……………………………………………………….18,8 мкл

Суміш нуклеотидтрифосфатів (дНТФ)

мМ р-р кожного……………………………………….……….0,5 мкл

Праймер 1 (10 мМ р-р) ………………………………………….….1 мкл

Праймер 2 (10 мМ р-р) ………………………………………….….1 мкл

ДНК-полімераза (5 од. / Мкл) ………………………………………0,2 мкл

Зразок ДНК (20 нг/мкл) …………………………………………..1 мкл

1.7 Оцінка результатів реакції

Для правильної оцінки результатів ПЛР важливо розуміти, що цей метод не є кількісним. Теоретично продукти ампліфікації одиничних молекул ДНК-мішені можуть бути виявлені за допомогою електрофорезу після 30-35 циклів. Однак на практиці це виконується лише у випадках, коли реакція проходить в умовах, близьких до ідеальних, що в житті трапляється не часто. Особливо великий вплив ефективність ампліфікації надає ступінь чистоти препарату ДНК, тобто. наявність у реакційній суміші тих чи інших інгібіторів, яких позбутися в деяких випадках буває вкрай складно. Іноді через їхню присутність не вдається ампліфікувати навіть десятки тисяч молекул ДНК-мішені. Таким чином, прямий зв'язок між вихідною кількістю ДНК-мішені та кінцевою кількістю продуктів ампліфікації часто відсутній.

Глава 2: Застосування полімеразної ланцюгової реакції

ПЛР використовується в багатьох областях для проведення аналізів та в наукових експериментах.

Криміналістика

ПЛР використовують для порівняння так званих "генетичних відбитків пальців". Необхідний зразок генетичного матеріалу з місця злочину – кров, слина, сперма, волосся тощо. Його порівнюють із генетичним матеріалом підозрюваного. Досить малої кількості ДНК, теоретично - однієї копії. ДНК розщеплюють на фрагменти, ампліфікують за допомогою ПЛР. Фрагменти поділяють за допомогою електрофорезу ДНК. Отриману картину розташування смуг ДНК називають генетичним відбитком пальців.

Встановлення батьківства

Результати електрофорезу ДНК-фрагментів, що ампліфіковані за допомогою ПЛР. Батько. Дитина. Матір. Дитина успадкувала деякі особливості генетичного відбитка обох батьків, що дало новий, унікальний відбиток.

Хоча "генетичні відбитки пальців" унікальні, родинні зв'язки все ж таки можна встановити, зробивши кілька таких відбитків. Той самий метод можна застосувати, трохи модифікувавши його, для встановлення еволюційної спорідненості серед організмів.

Медична діагностика

ПЛР дає можливість суттєво прискорити та полегшити діагностику спадкових та вірусних захворювань. Потрібний ген ампліфікують за допомогою ПЛР із використанням відповідних праймерів, а потім секвенують для визначення мутацій. Вірусні інфекції можна виявляти відразу після зараження, за тижні чи місяці до того, як виявляться симптоми захворювання.

Персоналізована медицина

Іноді ліки виявляються токсичними чи алергенними для деяких пацієнтів. Причини цього - частково в індивідуальних відмінностях у сприйнятливості та метаболізмі ліків та їх похідних. Ці відмінності детермінуються генетичному рівні. Наприклад, в одного пацієнта певний цитохром може бути активнішим, у іншого - меншим. Для того, щоб визначити, який різновид цитохрому має даний пацієнт, запропоновано проводити ПЛР-аналіз перед застосуванням ліків. Такий аналіз називають попереднім генотипуванням.

Клонування генів

Клонування генів - це процес виділення генів і в результаті генноінженерних маніпуляцій отримання великої кількості продукту даного гена. ПЛР використовується для того, щоб ампліфікувати ген, який потім вставляється у вектор - фрагмент ДНК, що переносить чужорідний ген у той самий чи інший, зручний для вирощування організм. Як вектори використовують, наприклад, плазміди або вірусну ДНК. Вставку генів у чужорідний організм зазвичай використовують із отримання продукту цього гена - РНК чи, найчастіше, білка. Таким чином у промислових кількостях отримують багато білків для використання в сільському господарстві, медицині та ін.

Секвенування ДНК

У методі секвенування з використанням мічених флуоресцентною міткою або радіоактивним ізотопом дидезоксинуклеотидів ПЛР є невід'ємною частиною, оскільки саме в ході полімеризації в ланцюг ДНК вбудовуються похідні нуклеотидів, мічені флуоресцентною або радіоактивною міткою. Це зупиняє реакцію, дозволяючи визначити положення специфічних нуклеотидів після поділу синтезованих ланцюжків у гелі.

Мутагенез

Нині ПЛР стала основним методом проведення мутагенезу. Використання ПЛР дозволило спростити та прискорити процедуру проведення мутагенезу, а також зробити її більш надійною та відтворюваною.

Метод ПЛР дозволив проаналізувати наявність послідовностей вірусів папіломи людини у зрізах біопсій новоутворень шийки матки людини, залитих парафіном за 40 років до цього дослідження. Більш того, за допомогою ПЛР вдалося ампліфікувати і клонувати фрагменти мітохондріальної ДНК з викопних останків мозку людини віком 7 тисяч років!

На лізатах індивідуальних сперматозоїдів людини продемонстровано можливість одночасно аналізувати два локуси, розташовані на різних негомологічних хромосомах. Такий підхід забезпечує унікальну можливість тонкого генетичного аналізу і вивчення хромосомної рекомбінації, ДНК-поліморфізму та ін. генів головного комплексу гістосумісності людини;

Використовуючи ПЛР, можна виявляти правильність інтеграції чужорідних генетичних структур у заздалегідь визначений район геному клітин, що вивчаються. Сумарна клітинна ДНК відпалюється з двома олігонуклеотидними затравками, одна з яких комплементарна ділянці хазяйської ДНК поблизу точки вбудовування, а інша - послідовності інтегрованого фрагмента антипаралельного ланцюга ДНК. Полімеразна ланцюгова реакція у разі незміненої структури хромосомної ДНК у передбачуваному місці вбудови призводить до утворення фрагментів одноланцюжкової ДНК невизначеного розміру, а у разі запланованого вбудовування - дволанцюжкових фрагментів ДНК відомого розміру, що визначається відстанню між місцями відпалу двох праймерів. Причому ступінь ампліфікації аналізованого району геному в першому випадку перебуватиме в лінійній залежності від кількості циклів, а в другому - в експоненційній. Експоненційне накопичення в процесі ПЛР фрагмента, що ампліфікується, заздалегідь відомого розміру дозволяє візуально спостерігати його після електрофоретичного фракціонування препарату ДНК і робити однозначний висновок про вбудовування чужорідної послідовності в заданий район хромосомної ДНК.

Висновок

Найбільшого поширення метод ПЛР нині отримав як метод діагностики різних інфекційних захворювань. ПЛР дозволяє виявити етіологію інфекції навіть якщо в пробі, взятій на аналіз, міститься лише кілька молекул ДНК збудника. ПЛР широко використовується у ранній діагностиці ВІЛ-інфекцій, вірусних гепатитів тощо. На сьогоднішній день майже немає інфекційного агента, якого не можна було б виявити за допомогою ПЛР.

Список використаної літератури

1.Падутов В.Є., Баранов О.Ю., Воропаєв Є.В. Методи молекулярно – генетичного аналізу. – Мн.: Юніпол, 2007. – 176 с.

2.ПЛР "в реальному часі" / Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофімов Д.Ю. та ін.; за ред. д. б. н. Д.В. Ребрикова; передисл. Л.А. Остермана та акад. РАН та РАСХН О.Д. Свердлова; 2-ге вид., Випр. та дод. - М: БІНОМ. Лабораторія знань, 2009. – 223 с.

.Патрушев Л.І. Штучні генетичні системи. - М.: Наука, 2005. - У 2 т

.Б. Глік, Дж. Пастернак Молекулярна біотехнологія. Принципи та застосування 589 стор., 2002 р.

5.Щелкунов С.М. Генетична інженерія. - Новосибірськ: Сиб. унів. видавничо, 2004. – 496 с.

За редакцією А.А. Ворб'єва "Полімеразна ланцюгова реакція та її застосування для діагностики в дерматовенерології"; Медичне інформаційне агентство - 72 стор.

http://ua. wikipedia.org

http://scholar. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. su/ - медичний журнал

Репетиторство

Потрібна допомога з вивчення якоїсь теми?

Наші фахівці проконсультують або нададуть репетиторські послуги з цікавої для вас тематики.
Надішліть заявкуіз зазначенням теми прямо зараз, щоб дізнатися про можливість отримання консультації.