Gdy jaja robaków znajdują się na różnych obiektach środowiskowych (gleba, woda, warzywa itp.), zawsze konieczne jest określenie ich żywotności na podstawie wyglądu, barwienia żywotnymi barwnikami, hodowania w optymalnych warunkach i przygotowania próbki biologicznej, tj.

Karmienie zwierząt laboratoryjnych.

Oznaczanie żywotności jaj lub larw robaków w wyglądzie. Jaja robaków są pod mikroskopem najpierw przy małym powiększeniu, a następnie przy dużym powiększeniu. W zdeformowanych i martwych jajach robaków skorupa jest rozdarta lub wygięta do wewnątrz, plazma jest mętna, poluzowana. Jaja podzielone na segmenty mają kulki rozszczepiające (blastomery) o nierównej wielkości, nieregularny kształt, są często przesunięte na jeden biegun. Czasami zdarzają się nienormalne jaja, które mając zewnętrzne deformacje rozwijają się normalnie. W żywych larwach ascaridów drobna ziarnistość występuje tylko w środkowej części ciała, gdy umierają, ziarnistość rozprzestrzenia się po całym ciele, pojawiają się duże błyszczące szkliste wakuole - tak zwane sznury pereł.

Aby określić żywotność dojrzałych jaj glisty, włosogłówki, owsików, aktywne ruchy larw należy wywołać lekkim podgrzaniem preparatu (do temperatury nie przekraczającej 37 ° C). Dogodniej jest obserwować żywotność larw ascaris i włosogłówki po ich wyizolowaniu ze skorupki jaja, naciskając na szklankę nakrywkową preparatu igłą preparacyjną lub pęsetą.

W larwach inwazyjnych ascaridów często widać czapeczkę, która złuszczała się na końcu głowy, a u larw włosogłówki, które zakończyły rozwój w jaju, w dużym powiększeniu w tym miejscu znajduje się mandryn. W martwych larwach robaków, niezależnie od ich lokalizacji (w jaju lub poza nim), obserwuje się rozkład ciała. W tym przypadku wewnętrzna struktura larwy staje się grudkowata lub ziarnista, a ciało staje się mętne i nieprzejrzyste. W ciele znajdują się wakuole, a na naskórku znajdują się pęknięcia.

Żywotność teniidowych onkosfer (bydlęcych, świńskich tasiemców itp.) określa ruch zarodków, gdy są one wystawione na działanie enzymów trawiennych. Jaja umieszcza się na szkiełku zegarkowym z sokiem żołądkowym psa lub sztucznym sokiem dwunastniczym. Skład tego ostatniego: pankreatyna 0,5 g, wodorowęglan sodu 0,09 g, woda destylowana 5 ml. Okulary zegarkowe z jajami umieszcza się w termostacie w temperaturze 36-38 ° C na 4 godziny.W tym przypadku żywe zarodki są uwalniane z muszli. Muszle żywych onkosfer rozpuszczają się również w zakwaszonej pepsynie i zasadowym roztworze trypsyny po 6-8 godzinach w termostacie w 38°C.

Jeśli jaja teniidowe zostaną umieszczone w 1% roztworze siarczku sodu lub 20% roztworze podchlorynu sodu lub w 1% roztworze wody chlorowej o temperaturze 36-38 ° C, dojrzałe i żywe zarodki są uwalniane z błon i nie nie zmieniać przez 1 dzień. Niedojrzałe i martwe onkosfery kurczą się lub pęcznieją i gwałtownie rosną, a następnie „rozpuszczają się” w ciągu 10 minut - 2 h. Żywe zarodki teniidów również aktywnie poruszają się w mieszaninie 1% roztworu chlorku sodu, 0,5% roztworu wodorowęglanu sodu i żółci w 36- 38 °C.

Żywotność skolex echinokoków określa się przy niskim ogrzewaniu. W tym celu skoleksy lub kapsułki z czerwiem umyte w wodzie umieszcza się w kropli wody na szkiełku z otworem, przykrywa szkiełkiem nakrywkowym i bada pod mikroskopem ze stopniem ogrzewania w temperaturze 38-39 ° C. W przypadku braku stołu grzewczego preparat jest podgrzewany dowolnym źródłem ciepła. Jednocześnie żywotne skoleksy aktywnie się poruszają, zmniejszając lub rozluźniając przyssawki, wydłużając i skracając trąbkę. Jeśli skoleksy zostaną umieszczone w 0,5-1% wodnym roztworze filicylenu w temperaturze pokojowej, wszystkie żywotne skoleksy szybko się pojawią i umrą. Nieżywotne skoleksy nie okazują się.

Żywotność fasciolia adolescariae pobranych z roślin i innych obiektów zbiorników wodnych sprawdza się badając je na szkiełku w soli fizjologicznej pod mikroskopem ze stopniem grzewczym. Po podgrzaniu larwy przywr w torbieli zaczynają się poruszać.

Żywotność jaj tasiemca karłowatego zależy od umiejscowienia haczyków na zarodku.

W żywych jajach tasiemca karłowatego występują powolne, wahadłowe ruchy protoplazmy oraz prawie niezauważalne wydłużenia i przesunięcia zaostrzonych końców bocznej pary haczyków od pary środkowej.

Skurcze protoplazmy zarodka i haczyki zarodkowe pomagają zarodkowi uwolnić się najpierw od skorup onkosfery, a następnie od zewnętrznej skorupy jaja.

W żywym jaju środkowa para i boczne pary haczyków są ułożone równolegle; w niektórych jajach ostrza par bocznych są zbliżone i ustawione pod kątem mniejszym niż 45° w stosunku do środkowej pary haczyków.

Umierający embrion konwulsyjnie kurczy się i leniwie rozsuwa haczyki. W martwym zarodku ruch haczyków ustaje, a one układają się bezładnie, niekiedy haczyki poprzeczne do sąsiedniej pary rozsuwają się pod kątem prostym, rozwartym lub ostrym.

Czasami obserwuje się marszczenie zarodka, tworzenie ziarnistości. Dokładniejsza metoda opiera się na pojawieniu się ruchów onkosfery podczas gwałtownej zmiany temperatury: od 5-10 do 38-40 °C.

Określanie żywotności niedojrzałych nicieni należy badać w wilgotnej komorze (szalki Petriego), umieszczając jaja ascaris w 3% roztworze formaliny przygotowanym w izotonicznym roztworze chlorku sodu w temperaturze 24-30 ° C, jaja włosogłówki w 3% roztwór kwasu solnego o temperaturze 30-35 °C, jaja owsików w izotonicznym roztworze chlorku sodu o temperaturze 37 °C. Szalki Petriego należy otwierać 1-3 razy w tygodniu w celu lepszego napowietrzenia i ponownie zwilżyć bibułę filtracyjną czystej wody.

Obserwacje rozwoju jaj robaków przeprowadza się co najmniej 2 razy w tygodniu. Brak oznak rozwoju w ciągu 2-3 miesięcy wskazuje na ich nieżywotność. Oznakami rozwoju jaj helmintów są najpierw etapy miażdżenia, podziału zawartości jaja na oddzielne blastomery. W pierwszym dniu rozwija się do 16 blastomerów, które przechodzą do drugiego etapu - morula itp.

Jaja tęgoryjców hoduje się w szklanym cylindrze (50 cm wysokości i 7 cm średnicy) zamkniętym korkiem. Mieszankę równych objętości sterylnego piasku, węgla drzewnego i kału z jajami tęgoryjca, rozcieńczoną wodą do konsystencji półpłynnej, ostrożnie wlewa się na dno cylindra za pomocą szklanej rurki. W ciągu 1-2 dni osiadania w ciemności w temperaturze 25-30 ° C z jaj wylęgają się larwy rabditoidów, a po 5-7 dniach stają się już filariowate: larwy czołgają się po ścianach cylindra, gdzie są widoczne nawet gołym okiem. Jaja przywr naturalnie rozwijające się w wodzie, takie jak opisthorchis, diphyllobotriid, fasciol itp., umieszcza się na szkiełku zegarkowym, szalce Petriego lub w innym naczyniu, wylewa się niewielką warstwę zwykła woda. Przy hodowli jaj fascioli należy wziąć pod uwagę, że szybciej rozwijają się one w ciemności, natomiast miracidium powstaje w żywych jajach w temperaturze 22-24°C w ciągu 9-12 dni. Kiedy mikroskopia rozwijające się jaja Wyraźnie widoczne są ruchy przywr miracidium. Fasciola miracidium wyłania się ze skorupek jaj tylko w świetle. Podczas uprawy woda jest zmieniana po 2-3 dniach.

Larwy tęgoryjca i strongyloid są hodowane na agarze na szalce Petriego z węglem zwierzęcym. Po przebywaniu w termostacie w temperaturze 26-30°C przez 5-6 dni larwy rozprzestrzeniły się na agarze, pozostawiając po sobie ścieżkę bakterii (metoda Fülleborna).

Metoda Harady i Mori (1955). Do probówek umieszczonych na statywie dodaje się 7 ml wody destylowanej. Za pomocą drewnianego patyczka weź 0,5 g kału i wykonaj rozmaz na bibule filtracyjnej (15X150 mm) 5 cm od lewej krawędzi (ta operacja jest wykonywana na kartce papieru w celu ochrony powierzchni stołu laboratoryjnego). Następnie pasek z rozmazem wkłada się do probówki tak, aby lewy koniec wolny od rozmazu sięgał dna probówki. Górny koniec pokryty jest kawałkiem celofanu i ciasno owinięty gumką. Na probówce napisz numer i nazwisko badanego. W tym stanie probówki są przechowywane przez 8-10 dni w temperaturze 28°C. Aby zbadać kulturę, zdejmij i zdejmij celofanową osłonę i usuń pasek bibuły filtracyjnej pęsetą. W takim przypadku należy zachować ostrożność, ponieważ niewielka liczba zakaźnych larw może przemieścić się na górny koniec bibuły filtracyjnej lub na ścianę probówki i wniknąć pod powierzchnię celofanu.

Rurki umieszcza się na gorąco kąpiel wodna w temperaturze 50 °C przez 15 minut, po czym zawartość wstrząsnąć i szybko przelać do 15 ml probówki w celu sedymentacji larw. Po odwirowaniu supernatant usuwa się, a osad przenosi się na szkiełko, przykrywa szkiełkiem nakrywkowym i pod mikroskopem pod małym powiększeniem.

Do diagnostyki różnicowej larw nitkowatych konieczne jest wykorzystanie danych przedstawionych w tabeli. 13.

Metody barwienia jaj i larw robaków. Martwe tkanki w większości przypadków postrzegają kolory szybciej niż żywe. Cechy te są wykorzystywane w helmintologii do określania żywotności jaj i larw robaków. Jednak w niektórych przypadkach niektóre farby są lepiej odbierane przez żywe tkanki niż martwe.

Tabela 13. Diagnostyka różnicowa nitkowatych larw A.duodenale, N.americanus, Strongyloides stercoralis, Trichostrongylus spp.

Do różnicowego rozpoznawania żywych i martwych jaj i larw stosuje się następujące farby i metody.

Leukobaza błękitu metylenowego służy do barwienia żywych i martwych tkanek. Żywa komórka lub tkanka redukuje błękit metylenowy do bezbarwnej leukobazy, martwa tkanka nie ma tej zdolności i dlatego nabiera koloru.

Do barwienia jaj Ascaris można użyć błękitu metylenowego w roztworze kwasu mlekowego z zasadą kaustyczną (błękit metylenowy 0,05 g, soda kaustyczna 0,5 g, kwas mlekowy 15 ml). Żywe jaja nie odbierają koloru, zarodki martwych jaj są zabarwione Kolor niebieski.

Metoda barwienia nie ma zastosowania do jaj niedojrzałych glisty i włosogłówki; zabarwiona skorupa barwi się i dlatego nie jest widoczne, czy komórka zarodkowa wewnątrz jaja uległa zabarwieniu.

Larwy Ascaris barwi się roztworem zasadowym farby błękit brylantowo-krezylowy w stężeniu 1:10 000 w następujący sposób: kroplę płynu z jajami ascaris i kroplę roztworu farby podstawowej nanosi się na szkiełko. Preparat przykrywa się szkiełkiem nakrywkowym, które mocno dociska się do obiektu lekkim postukaniem igłą preparującą. Pod mikroskopem obserwuje się liczbę wyklutych larw i stopień ich wybarwienia, po czym ten sam preparat jest ponownie oceniany po 2-3 godzinach.Tylko niezdeformowane larwy, które nie wybarwiały się przez 2 godziny, uważa się za żywe. Martwe larwy wybarwiają się, gdy skorupa pęka (częściowo lub całkowicie).

Wskazano na możliwość barwienia preparatów roztworem jodu w określaniu żywotności jaj ptaków ascaridia. W tym przypadku jako barwnik stosuje się 5% alkoholowy roztwór jodu. Po nałożeniu na preparat zarodki martwych jaj ascaridia są barwione w ciągu 1-3 sekund. kolor pomarańczowy. Martwe jaja opisthorchis i onkosfery byk tasiemiec wybarwiono roztworem błękitu toluidynowego (1:1000), a martwe onkosfery bydlęcego tasiemca - roztworem błękitu brylantowo-krezylowego (1:10 000). W tym samym czasie zarodki i skorupki zarówno martwych, jak i żywych jaj nabierają koloru. Dlatego po barwieniu jaja i onkosfery są myte w czystej wodzie i dodatkowo barwione safraniną (rozcieńczoną 1:10 000 10% roztworem alkoholu). Alkohol usuwa barwnik z muszli, a safranina nadaje im czerwony kolor. W rezultacie żywe jaja są zabarwione na czerwono, zarodek martwych jaj jest niebieski, a skorupka pozostaje czerwona. Martwe zarodki onkosfery bydlęcego tasiemca szybko, w ciągu kilku minut, stają się jaskrawoczerwone lub kolor różowy safranina lub błękit brylantowo-krezylowy w rozcieńczeniu 1:4000 lub indygotyna w rozcieńczeniu 1:1000-1:2000.

Żywe zarodki nie zmieniają się pod wpływem tych kolorów nawet po 2-7 godzinach.

W celu określenia żywotności jaj tasiemca karłowatego zaleca się stosowanie następujących farb: 1) błękit krezylowy brylantowy (1:8000) – po 1 godzinie onkosfera martwych jaj jest szczególnie jasno zabarwiona, co wyraźnie odcina się od bladego lub bezbarwne tło reszty jaja; 2) safranina: w rozcieńczeniu 1:8000 przy ekspozycji przez 2 godziny i 1:5000 przez 3-5 godzin; 3) 50% roztwór kwasu pirogalowego w rozcieńczeniu 1:2 - po wystawieniu na 1 godzinę w temperaturze 29-30 ° C (im niższa temperatura, tym dłuższy proces barwienia).

Żywe plerocerkoidy szerokiego tasiemca bardzo dobrze wybarwia się wodnym roztworem (1:1000) obojętnej jamy ustnej przez 5-20 minut. Aby uzyskać trwały różowy kolor, który nie znika w ciągu 5 dni i nie wpływa na ruchomość plerocerkoidów, zwykle wystarczy 10 minut. Stopień wybarwienia jest kontrolowany przez oglądanie larw w czystości roztwór izotoniczny chlorek sodu, dla którego plerocerkoidy są okresowo usuwane z farby. Do barwienia martwych plerocerkoidów zaleca się użycie błękitu metylenowego.

R.E. grzyb pleśniowy Peniciliium rubrum. Aby to zrobić, użyj 3% wodnego roztworu barwnika.

Proces barwienia jaj i larw kończy się po 1,5 h. Nieżywotne jaja owsików, tasiemców bydlęcych i karłowatych, ankylostomidów, trichostrongylidów nabierają intensywnego różu, larwy ankylostomidów i trichostrongylidów stają się czerwone. Mniej jasny kolor obserwuje się w jajach ascaris i włosogłówki, ponieważ wystając z jelit, już mają ciemnobrązowy kolor: Żywe jaja i larwy nie plamią.

Fizykochemiczne metody stymulacji uwalniania mirakdiów z jaj przywr. Metody zostały opracowane przez SM Germana i SA Beera (1984) w celu określenia żywotności jaj opisthorchia i dicrocelium przez wystawienie jaj na działanie medium reakcyjnego. Jeśli żyją, wychodzi miracidium. Metody opierają się na fizykochemicznej aktywacji gruczołu lęgowego miracidium i stymulacji motoryki larw. Stymulację uzyskuje się poprzez wystawienie jaj przywr na specjalne środowisko reakcji w połączeniu z kolejnymi metodami - wytworzeniem różnicy temperatur, wysuszeniem zawiesiny jaj, wystawieniem na działanie słabego prądu cieczy w kropli testowej, które przyczyniają się do masowego uwalniania miracidii z jajka.

Oznaczanie żywotności jaj opistorch metodą Hermana, Beera. Zawiesina jaj w wodzie (z kranu, osiadła) jest wstępnie schładzana do 10-12 ° C. Wszystkie kolejne operacje przeprowadza się w temperaturze pokojowej (18-22°C). Do probówki wirówki dodaje się jedną kroplę (około 0,05 ml) zawiesiny zawierającej 100-400 jaj. Probówki umieszcza się na stojaku na 5-10 minut w celu wytrącenia jaj. Następnie za pomocą wąskiego paska bibuły filtracyjnej ostrożnie odsysa się nadmiar wody, aż do całkowitego usunięcia. Do probówki dodaje się 2 krople pożywki, wstrząsa, zawartość przenosi się pipetą na szkiełko i pozostawia na 5-10 minut, lekko wstrząsając (lub umieszczając pod suszarką do włosów) w celu wytworzenia słabych prądów płynnych w probówce. badany spadek zawieszenia. Ta operacja, która imituje perystaltykę jelit mięczaka, pozwala aktywować uwalnianie miracidii. Następnie do zawiesiny dodaje się jeszcze 2 krople pożywki, a następnie preparat bada się mikroskopowo przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu świetlnego (X200). W tym czasie jaja z żywymi miracidiami powinny otworzyć pokrywę, podczas gdy larwa aktywnie wynurza się do środowiska. Ze względu na obecność w nim etanolu miracidium unieruchamia się w ciągu 3-5 minut, a następnie barwi barwnikiem w pożywce. W rezultacie miracidia są łatwo wykrywane i liczone.

Przygotowanie środowiska reakcyjnego. Pożywkę przygotowuje się w 0,05 M buforze Tris-HCi w optymalnych warunkach pH 8,0-9,5. Do buforu dodaje się etanol w ilości do 10-13% oraz barwnik (safraninę, błękit metylenowy i inne działające w zakresie pH) aż do lekkiego zabarwienia cieczy (np. dla safraniny jej końcowe stężenie wyniesie 1:50 000). Możesz użyć innego buforu, który działa w alkalicznym zakresie pH, takiego jak 0,05 M fosforan (pH 8,5). Dlatego pożywka zawiera 96% etanolu - 12 części; barwnik ( likier macierzysty) - 1-10 części; 0,05 M tris-HC! bufor (pH 8,5-9,5) - do 100 części. Przykład pożywki: 12 części 96% etanolu, 1 część nasyconego roztworu safraniny, reszta do 100 części - 0,05 M bufor Tris-HCl, pH 9,5.

Oznaczanie żywotności jaj dikrocelium metodą Hermana, Beera, Stratana. Kroplę zawiesiny zawierającej 100-150 jaj przywry umieszcza się w probówce wirówki na 1-2 minuty w celu osadzenia jaj. Ciecz jest następnie ostrożnie suszona paskiem bibuły filtracyjnej. Dodać 1-2 krople pożywki reakcyjnej za pomocą pipety Pasteura i inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 28-30°C przez 2-3 minuty. Skład pożywki: 6 części butanolu, 94 części 0,4% roztworu chlorku sodu lub 0,3% roztworu chlorku potasu w wodzie destylowanej. Jaja w pożywce przenosi się pipetą na szkiełko i pozostawia na 1,5-2 godziny w temperaturze pokojowej (18-22°C), natomiast co 25-30 minut (w miarę wysychania) dodajemy 1-2 krople (0,05 ml) roztwór butanolu w wodzie destylowanej. Następnie preparat jest pod mikroskopem w 100-200-krotnym powiększeniu. Żywotność zależy od liczby otwartych jaj z uwolnionymi miracidiami. Butanol przenika przez pory skorupy jaja, dociera do miracidiów i je aktywuje. Inkubacja w oznaczonej temperaturze usprawnia ten proces. Butanol w stężeniu 3-7% jest szkodliwy dla miracidium, które wyłoniło się z jaja. Przeniesienie zawiesiny jaj z probówki na szkiełko umożliwia, do czasu wyjścia miracidium (po 30-40 minutach), zmniejszenie stężenia butanolu w wyniku ulatniania się do bezpiecznego poziomu (1,5-0,5%). Obecność chlorku sodu w pożywce w stężeniu 0,1-0,5% (lub chlorku potasu w stężeniu 0,05-0,4%) determinuje aktywność uwalnianego miracidium. W przeciwieństwie do małych przezroczystych jaj opisthorch, jaja dicrocelium mają ciemną skorupkę, mają wyraźnie widoczną pokrywę, która jest otwarta po uwolnieniu miracidium. Dlatego żywotność jaj dikrocelium jest wygodniej oceniana przez liczenie jaj, które się otworzyły, niż przez barwienie i liczenie miracidiów.

Metoda luminescencyjna do badania jaj i larw robaków.

Po raz pierwszy w praktyce helmintologicznej metody mikroskopii luminescencyjnej zastosowano w 1955 roku. Doniesiono, że mikroskopia luminescencyjna umożliwia odróżnienie żywych i martwych obiektów bez uszkadzania jaja. Do fluorescencji nie użyto promieni UV, ale niebiesko-fioletową część światła widzialnego, za pomocą konwencjonalnego mikroskopu i szkiełek; do oświetlacza OI-18 zastosowano specjalny zestaw filtrów barwnych.

Stwierdzono, że żywe i martwe jaja obleńców, owsików, tasiemców karłowatych, bydlęcych tasiemców, szerokich tasiemców i innych robaków pasożytniczych świecą w różny sposób. Zjawisko to obserwuje się zarówno podczas pierwotnej luminescencji bez użycia barwników, jak i podczas barwienia fluorochromami (oranż akrydynowy, koryfosfina, primulin, aurolina, siarczan berleryny, tripaflawina, rivanol, chinakryna itp.).

Niepomalowane, żywe, niesegmentowane jaja glisty świecą jasnozielono z żółtawym odcieniem; w martwych jajach skorupka emituje zielone światło znacznie jaśniejsze niż ciemnozielone zarodki; w jajach glisty z larwami pojawia się tylko skorupa, podczas gdy w martwych zarówno skorupa, jak i larwa są jasnożółte.

Niepigmentowane i niesegmentowane żywe jaja owsików i tasiemców karłowatych emitują zielonkawo-żółte światło; w martwych jajach skorupa intensywnie mieni się na tle ciemnozielonej masy embrionalnej. Przy wtórnej luminescencji (przy barwieniu oranżem akrydyny w rozcieńczeniu 1:10 OOO i 1:50 OOO od 30 minut do 2 godzin) muszla żywych i martwych nicieni, przywr i tasiemców świeci inaczej.

Muszla żywych i martwych Ascaris lumbricoides, Toxocara leonina, Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. diminuta, T.saginatus, D.latum przybiera barwę pomarańczowo-czerwoną. Zarodki żywych Doc. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum i oncospheres bydlęcego tasiemca świecą w ciemnozielonym lub szarozielonym kolorze. Martwe embriony tych jaj robaków emitują „palące” pomarańczowo-czerwone światło. Żywe larwy owsików i toksokary (skorupki jaj) emitują matowe szaro-zielone światło, a kiedy umierają, kolor zmienia się z czubka głowy na „płonący” jasnozielony, następnie żółty, pomarańczowy i wreszcie jasnopomarańczowy.

Po zabarwieniu fluorochromami - coryphosphyllum, primuliną - w martwych jajach ascaridów i włosogłówek obserwuje się blask od liliowożółtego do miedzianoczerwonego. Żywe jaja nie świecą, ale stają się ciemnozielone. Żywe jaja przywr Paragonimus westermani i Clonorchis sinensis nie świecą po zabarwieniu oranżem akrydyny, podczas gdy martwe jaja emitują żółtawo-zielone światło.

Metodę luminescencji można również wykorzystać do określenia żywotności larw robaków. Tak więc, fluorochromowane roztworem oranżu akrydyny (1:2000) larwy strongylanu, blask rhabdita: żywe - zielone (z odcieniem), martwe - jasne pomarańczowe światło. Żywe larwy Trichinella nie świecą ani nie dają słabego blasku po potraktowaniu przez 10 minut roztworami izotiocyjanianu fluoresceiny, auraminy itp. Fluorochromowane martwe larwy (w stężeniu 1:5000) dają jasny blask.

Żywe miracidia, które wyłoniły się z muszli, emitują słabe, niebieskawe światło z ledwo zauważalną jasnożółtą koroną rzęsek, ale 10-15 minut po śmierci pojawiają się jako jasne „płonące” jasnozielone, a następnie pomarańczowo-czerwone światło.

Metody bezpośrednie: wykrycie samych pasożytów, ich fragmentów, jaj, larw w kale, moczu, wydzielinie dwunastnicy, plwocinie, śluzie nosowym i pochwowym, zawartości przestrzeni podpaznokciowych, fragmentach tkanki z biopsji.

Podczas diagnozowania nie można zidentyfikować za pomocą jednej metody jaj lub larw wszystkich rodzajów robaków żyjących w układ trawienny osoba. Tak więc przy zastosowaniu metody flotacji jaja przywry, aw niektórych przypadkach niezapłodnione jaja glist nie unoszą się w błonie powierzchniowej (ze względu na duży ciężar właściwy). W kale bardzo rzadko można znaleźć jaja owsików, onkosfery teniidów, które są wykrywane specjalnymi metodami badawczymi: skrobanie z fałdów okołoodbytniczych dla owsików i teniidów, metody sedymentacji dla przywr (jaja opistorch itp.). Dlatego w celu ukierunkowanego zbadania pacjenta pod kątem robaczycy lekarz na skierowaniu powinien wskazać, na które robaki należy zwrócić szczególną uwagę (diagnoza), co pozwoli asystentowi laboratoryjnemu dobrać odpowiednią technikę identyfikacji tego typu robaków. Kał pobrany z różne miejsca kał w ilości co najmniej 50 gramów (łyżeczka) w czystym szklanym naczyniu należy przesłać do laboratorium nie później niż jeden dzień po wypróżnieniu i zbadać w dniu przyjęcia.

Jeśli konieczne jest zatrzymanie kału do następnego dnia, umieszcza się go w zimnym miejscu (0-4 ° C) lub wypełnia jednym z konserwantów.

Przed badaniem kał miesza się kijem, aby jaja robaków były równomiernie rozłożone w całkowitej masie.

Jeśli w preparacie zostaną znalezione jakiekolwiek jaja robaków, przeglądanie nie jest przerywane, ponieważ. może być podwójna lub potrójna inwazja.

Monitorowanie skuteczności leczenia robaczycy odbywa się poprzez badanie kału pod kątem jaj robaków w 2-3 tygodnie lub 2-3 miesiące po leczeniu, w zależności od wykrytego robaka.

Metody makroskopowe służą do wykrywania gołym okiem lub ręczną lupą całych dojrzałych płciowo robaków lub ich fragmentów w kale.

Często na powierzchni kału po wypróżnieniu widać aktywnie pełzające owsiki; wydalany z kałem glisty; czasami sami ludzie zauważają wyładowanie robaków. U pacjentów z diphyllobothriasis mogą wyróżniać się fragmenty strobilusa tasiemca (w postaci „makaronów”), a u zarażonych teniidami (tasiemiec wieprzowy lub bydlęcy) odcinki robaków (w postaci „białych kawałków” ) często opuszczają kał (w postaci „białych nacięć”) lub aktywnie wypełzają z odbytu.

Metoda makroskopowa jest najważniejsza dla diagnostyka różnicowa teniidoza i teniarhynchosis (w połączeniu z ankietą).

Spośród specjalnych metod makroskopowych stosuje się metodę sekwencyjnego mycia kału.

Kał miesza się z wodą w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny, po czym przy dobrym oświetleniu jest dokładnie badany w oddzielnych małych porcjach w czarnych kuwetach fotograficznych lub na ciemnym tle na szalkach Petriego. Za pomocą pęsety lub igły preparacyjnej wszystkie podejrzane białe cząstki, duże formacje podejrzane o fragmenty robaków są usuwane i badane pod lupą między dwoma szklanymi szkiełkami. Małe robaki lub głowy tasiemców bada się pod lupą w kropli gliceryny lub pod mikroskopem.

Stosując tę ​​metodę do diagnozy segmentów wieprzowych, bydlęcych tasiemca, szerokiego tasiemca, umyte segmenty umieszcza się między dwiema szklankami i patrząc na światło pod lupą lub małym powiększeniem mikroskopu, gatunek określa się za pomocą budowa macicy (w dojrzałym segmencie tasiemca wieprzowego 8-12 gałęzi bocznych, a u byka 18-32, częściej 28-32, u szerokiego tasiemca segmenty są szersze, a macica w środek w formie „rozety”). Jeśli macica jest słabo widoczna, można ją najpierw trzymać przez pewien czas w 50% roztworze gliceryny, po czym wyraźnie widoczne są nawet opuszczone pnie macicy.

Określając te tasiemce na podstawie budowy oderwanych głów, umieszcza się je ostrożnie szyjką w kropli glicerolu między szkiełkami (lub przykrywa szkiełkiem nakrywkowym) i bez ściskania bada pod mikroskopem w małym powiększeniu.

Metody mikroskopowe podzielone na proste, złożone i specjalne.

Proste metody są rozmaz natywny, rozmaz rodzimy płynem Lugola, metody gęstego rozmazu pod celofanem według Kato, skręcanie (wg Shulmana) i skrobanie odbytu.

Złożone metody są bardziej wydajne i opierają się na koncentracji jaj w preparatach. Obejmują one wstępną obróbkę kału ciekłymi odczynnikami, w wyniku której jaja robaków albo wytrącają się, albo wypływają na powierzchnię cieczy.

Złożone metody obejmują metody wzbogacania:

a) flotacja (gdy ciężar właściwy jaj jest mniejszy niż ciężar właściwy roztworu soli i jaja unoszą się na powierzchni filmu);

b) sedymentacja (gdy ciężar właściwy jaj jest większy niż ciężar właściwy roztworów soli i jaja osiadają w osadzie).

Specjalne metody wykrywania jaj i larw robaków, cyst i form wegetatywnych pierwotniaków to metody skrobania, flotacji, sedymentacji, larwoskopii, protozooskopii, badania żółci oraz metody barwienia rozmazów kału, plwociny itp.

Proste metody badania kału

rozmaz natywny. Niewielką cząstkę ekskrementów pobiera się drewnianym patyczkiem z różnych części dostarczonej porcji, dobrze wciera w szkiełko w kropli 50% roztworu gliceryny i na 2-3 szkiełkach wykonuje się cienki rozmaz. Pod mikroskopem bada się co najmniej 3 preparaty. Wada metody: oglądana jest niewielka ilość materiału, dlatego nie jest stosowana jako niezależna metoda.

Metoda skręcania(Szulman). 2,0-3,0 g kału umieszcza się w szklance, dokładnie miesza szklanym prętem z 5-krotną objętością soli fizjologicznej lub wody destylowanej, wykonując szybkie ruchy przez 2-3 minuty i szybko wyjmuje patyczek z mieszaniny. Kroplę mieszaniny na końcu sztyftu przenosi się na szkiełko i pod mikroskopem. Zasada działania siły odśrodkowej powoduje gromadzenie się jaj i larw na patyku.

Metoda gęstego rozmazu Kato z celofanem. Odczynniki chemiczne: 100% glicerol, 6% roztwór fenolu (100 ml wody + 6 g fenolu), 3% roztwór zieleni malachitowej (2,5 ml wody destylowanej + 75 ml zieleni malachitowej).

Przygotowanie roztworu roboczego: 100 ml 6% roztworu fenolu + 100 ml czystej gliceryny + 1,2 ml 3% roztworu zieleni malachitowej.

Przygotowanie pasków celofanowych: tnie się paski celofanowe, których rozmiar odpowiada szkiełku. Celofan musi być hydrofilowy (celofan, który się pali, jest odpowiedni; jeśli się topi, to jest nieodpowiedni). W roztworze roboczym można przetwarzać do 5 tysięcy pasków. Czas ekspozycji pasków celofanowych do momentu użycia w roztworze roboczym wynosi co najmniej 24 godziny.

Postęp badań. 50 mg kału (wielkości dużego grochu) nakłada się na szkiełko, naciera pojedynczym sztyftem (szklanym, drewnianym), przykrywa paskiem celofanowym i pociera gumowym korkiem aż do uzyskania jednolitej gęstej smugi . Lek suszy się w temperaturze pokojowej przez godzinę lub w termostacie w 40°C przez 20-30 minut i mikroskopowo (czas ekspozycji można zwiększyć w temperaturze pokojowej do 5-6 godzin lub więcej).

Pod względem efektywności metoda ta zbliża się do metody flotacyjnej, ale wykazuje intensywną i średnio intensywną inwazję.

Jest stosowany jako samodzielna metoda diagnostyczna i jest zalecany do masowego badania populacji.

W klinicznych laboratoriach diagnostycznych jest stosowany jako ujednolicona metoda diagnozowania robaków w przypadku braku konkretnych diagnoz na kierunkach lekarzy.

Sposoby skrobania odbytu i wymazu natywnego płynem Lugola opisano w części poświęconej metodom specjalnym.

Zaawansowane metody wzbogacania kału

Metody wzbogacania opierają się na różnicy ciężaru właściwego jaj robaków i zastosowanego roztworu soli.

Stosując metodę flotacji można stosować następujące roztwory soli:

1. Roztwór azotanu ołowiu PbNO3 (azotan ołowiu) o gęstości 1,5. Przygotowany w ilości 650 g substancji na 1 litr wody. Sól rozpuszcza się w porcjach w gorącej wodzie w misce emaliowanej, podgrzewa na kuchence i stale miesza, aż do całkowitego rozpuszczenia. Nie jest konieczne filtrowanie roztworu. Roztwór przygotowuje się w dniu badania, ponieważ z czasem wytrąca się, a jego gęstość zaczyna spadać po 24 godzinach. w dużych ilościach, następnie w kolejnych dniach przed badaniem ogrzewa się, mieszając osad. Przygotowanie roztworu odbywa się pod wyciągiem, ponieważ azotan ołowiu jest solą metalu ciężkiego.

2. Roztwór azotanu amonu NH4NO3 (granulowany lub zwykły azotan amonu) o gęstości 1,3 przygotowuje się w taki sam sposób jak poprzedni, ale w ilości 1500 g substancji na 1 litr gorąca woda.

3. Roztwór azotanu sodu NaNO3 lub azotanu sodu o gęstości 1,38-1,4 przygotowuje się w ilości 1000 g substancji na 1 litr gorącej wody.

4. Sporządza się roztwór tiosiarczanu sodu Na2S2O3×5H2O (podsiarczyn sodu) o gęstości 1,4 w ilości 1750 g substancji na 1 litr gorącej wody.

5. Roztwór siarczanu sodu Na2SO4 (sól epsom) o gęstości 1,26-1,28 przygotowuje się w ilości 920 g substancji na 1 litr gorącej wody.

6. Roztwór chlorku cynku ZnCl2 (chlorek cynku) o gęstości 1,82 przygotowuje się w ilości 2000 g substancji na 1 litr gorącej wody. Schłodzony roztwór nie krystalizuje.

7. Nasycony roztwór chlorku sodu NaCl (sól kuchenna) o gęstości 1,18-1,2. Na! l wody, porcjami dodaj 400-420 g soli do emaliowanego wiadra z wrzącą wodą, ciągle mieszając, aż do całkowitego rozpuszczenia. W miarę ochładzania się roztworu wytrącają się kryształy chlorku sodu.

Ciężar właściwy roztworów flotacyjnych mierzy się za pomocą aerometru dopiero po całkowitym ochłodzeniu roztworu w temperaturze pokojowej.

Metody flotacyjne są najskuteczniejsze w wykrywaniu jaj tasiemca karłowatego, włosogłówki, tęgoryjca, ascaris i szerokiego tasiemca.

Folię powierzchniową można usunąć za pomocą drucianej pętli lub szklanego szkiełka.

W nasyconym roztworze chlorku sodu folię można badać po 30-40 minutach, w roztworze azotanu amonu - po 10-20-30 minutach po osadzeniu.

Podczas usuwania folii za pomocą drucianej pętli sprawdza się co najmniej 8 kropli.

Slajdy są usuwane z filmu więcej jajek niż pętle z drutu. Szkło musi mieć kontakt z płynnym roztworem flotacyjnym, który jest dodawany do zlewki za pomocą pipety. Po osadzeniu szkło jest usuwane, kładziemy zwilżoną powierzchnię na szkle większy rozmiar i zbadane pod mikroskopem. Slajdy należy odtłuścić przed użyciem.

Do badań potrzebne są: szkiełka, kubki na chemikalia, druciane pętle, kuwety, szalki Petriego, pipety, gruszki, patyczki szklane lub drewniane.

Postęp badań. 5 g kału wlewa się z 10-krotną ilością roztworu flotacyjnego (najlepiej o ciężarze właściwym 1,38-1,40), dokładnie miesza, nierozpuszczalne duże cząstki usuwa się z góry i zawiesinę pozostawia na 10-15 minut. Następnie folię usuwa się za pomocą pętli na szkiełku lub szkiełku. Aby rozcieńczyć kał, lepiej wziąć kubki o pojemności 30-50 ml, wlać roztwór równo z krawędziami (lub pod wypełnienie 2-3 mm) i przykryć mieszaninę szkiełkiem, a następnie dodać roztwór flotacyjny za pomocą pipetować, aż zetknie się ze szkiełkiem. Po 10-20 minutach szkło jest szybko usuwane, a pozostająca na nim folia jest skanowana mikroskopowo bez szkiełka nakrywkowego.

Metody osiadania-sedymentacji

Metody sedymentacyjne są wykorzystywane do wykrywania jaj geohelmintów, biohelmintów w kale oraz jako specjalne metody badawcze przywr.

Metoda Goryacheva-Zolotukhin(uproszczona metoda Goryacheva). Około 1,5 g kału miesza się w szklance chemicznej w 3-4 ml wody. Otrzymaną zawiesinę przesącza się przez dwie warstwy gazy do probówki wirówki, ostrożnie nakładając warstwę na 4-5 ml obecnego w niej nasyconego roztworu chlorku sodu. Probówki umieszcza się na stojaku na 15-20 h. W tym czasie osadzają się ciężkie jaja przywry. Uzyskaj dwie wyraźnie oddzielone warstwy. Osad jest badany mikroskopowo.

Metoda eterowo-formalinowa. Służy do diagnozowania wszystkich inwazji jelitowych oraz jako specjalna metoda na jaja pierwotniaków i przywr.

Wyposażenie: wirówka 3000 obr/min; wirówki z podziałką, lejki; metalowe sitko (herbata) lub dwuwarstwowy bandaż; szkiełka i szkiełka nakrywkowe; drewniane (lub szklane) patyczki; bawełna, bandaż.

Odczynniki chemiczne: 10% roztwór formaliny (1 część farmaceutycznego roztworu formaliny i 4 części wody destylowanej); eter etylowy (medyczny).

Do probówek wirówki wlewa się 7 ml 10% roztworu formaliny i umieszcza 1 g kału (taka ilość kału, aby roztwór w probówce wzrósł do 8 ml). Kał miesza się z formaliną do uzyskania jednorodnej mieszaniny, a następnie przelewa się przez metalowe sitko (lub dwuwarstwową gazę, bandaż) do innej probówki wirówki (jeśli na sitku pozostaje kał, należy je przepłukać formaliną). Dodać 2 ml eteru do tej probówki wirówki, zatkać i energicznie wstrząsać przez 30 sekund.

Mieszaninę odwirowuje się przy 3000 obr./min przez jedną minutę (możliwe przez dwie minuty przy 1500 obr./min). W wyniku reakcji eteru z formaliną dochodzi do koagulacji białek w postaci korka na szczycie probówki i wytrącania się jaj robaków. Warstwę koagulantu usuwa się, supernatant odsącza się, osad nanosi się na szkiełko bezpośrednio z probówki lub pipetą Pasteura, przykrywa szkiełkiem nakrywkowym i ogląda pod mikroskopem.

Metoda strącania eterowo-octowego. Zasada wytrącania eterowo-octowego jaj robaków polega na sekwencyjnym traktowaniu próbek kału 10% roztworem wodnym kwas octowy i eter. Kwas octowy jest lepszy niż inne związki chemiczne emulguje próbkę kału. Wnika w niestrawione cząstki, składające się głównie z błonnika, który, gdy świetna treść zakłócać badania poprzez wytrącanie po odwirowaniu. Późniejsze dodanie eteru do probówki i mieszanie prowadzi do ekstrakcji kwasu octowego z zawartości probówki wraz z nasączonymi nim cząstkami kału. Ponieważ ciężar właściwy mieszaniny eteru i kwasu octowego jest mniejszy niż ciężar właściwy wody, próbki kału potraktowane tymi substancjami unoszą się do góry, a jaja robaków, które mają duży ciężar właściwy, osiadają.

Ilość osadu otrzymanego po wytrąceniu eterem z octem jest 3-4 razy mniejsza niż po wytrąceniu eterem z formaliną. To znacznie ułatwia wykrywanie w nim jaj robaków i pozwala na badanie osadu jako całości za pomocą próbki 0,5-1 g. Toksyczność metody eterowo-octowej jest 5 razy niższa.

Postęp badań. 7 ml 10% roztworu kwasu octowego wlewa się do miarowej probówki wirówki i dodaje 1 g próbkę kału (tj. taką ilość kału, przy której roztwór kwasu octowego wzrasta do 8 ml). Dokładnie wymieszaj szklanym lub drewnianym patyczkiem. Przecedź przez lejek z dwiema warstwami gazy do innej probówki wirówki. Do emulsatu dodaje się 2 ml eteru etylowego (tj. do 10 ml). Probówki zamyka się gumowym korkiem (jest to możliwe z fiolki z penicyliną) i wstrząsa przez 15 sekund. Po usunięciu korka probówki odwirowuje się przez jedną minutę przy 3000 obr./min przez 2 minuty. Supernatant usuwa się z probówki. W niektórych przypadkach uformowany czop kałowy przeszkadza w odprowadzaniu supernatantu. W takim przypadku korek oddziela się od ścianek probówki szklanym lub drewnianym prętem. Cały osad jest pipetowany na szkiełko i pod mikroskopem pod szkiełkiem nakrywkowym przy małym powiększeniu. Osad jest zwykle mały i bezbarwny. Jaja helmintów, zwłaszcza małe przywry, są dobrze wykrywane.

Metoda sedymentacji chemicznej. Zasada badania opiera się na sedymentacji jaj z próbki kału w roztworze soli o ciężarze właściwym 1,15. Istota metody polega na bezpośrednim odwirowaniu probówki, w której na roztwór azotanu sodu (ciężar sp. 1,16) nakłada się warstwę kału zemulgowanego w 1% roztworze kwasu octowego. Wysoki ciężar właściwy roztworu soli oraz uwolnione w wyniku reakcji chemicznej pęcherzyki wnikające w warstwę homogenizowanego kału zapobiegają jego sedymentacji. Jaja robaków wytrącają się niewielką ilością błonnika. Osad można oczyścić z resztek resztek, traktując go 10% kwasem octowym i eterem. W tym przypadku pozostaje tylko jedno jajo robaków, co znacznie ułatwia ich identyfikację.

Postęp badań. Do wyskalowanej probówki wirówki wlewa się 6 ml roztworu azotanu sodu o ciężarze właściwym 1,15. Do innej probówki wlać 7 ml 1% roztworu kwasu octowego. Wprowadza się próbkę kału (do oznaczenia 7,5 ml dla próbki 0,5 g i do 8 ml dla próbki 1,0 g). Dokładnie wymieszaj próbkę szklanym pręcikiem. Odcedź przez lejek z jedną warstwą gazy, nakładając warstwę na roztwór azotanu sodu. Probówkę z warstwowym przesączem odwirowuje się przy 1500-2000 obr./min przez 5 minut. Usunąć supernatant, szybko odwracając probówkę. Do probówki z osadem dodać 3-4 ml 10% roztworu kwasu octowego i 0,5 ml eteru, zamknąć gumowym korkiem i wstrząsnąć. Powtórz wirowanie przez 1 min. Wyrzucić supernatant. Osad przenosi się na szkiełko, przykrywa szkiełkiem nakrywkowym i bada pod mikroskopem.

BADANIA HELMINTOLOGICZNE BILLE, ZAWARTOŚCI DWUNASTINOWEJ, PŁCINY, KRWI, MOCZU I MIĘŚNI

Wykrywanie jaj i larw robaków w treści dwunastnicy i żółci. Badanie zawartości żółci i dwunastnicy wykonuje się z podejrzeniem robaczyc wątroby i pęcherzyka żółciowego (opisthorchiasis, clonorchiasis, dicroceliasis) oraz dwunastnica(strongyloidoza).

Postęp badań. Zawartość dwunastnicy i żółć (porcje A, B, C) pobiera się w zwykły sposób za pomocą sondowania. W przypadku porcji B zaleca się uzyskanie odruchu pęcherzyka żółciowego poprzez wprowadzenie 33% roztworu przez sondę siarczan magnezu. Z badanej cieczy pływające w niej płatki są wybierane i oglądane pod mikroskopem, a następnie mieszane z równą ilością eteru siarkowego. Mieszaninę dokładnie wstrząsa się i odwirowuje. Supernatant odrzuca się, a cały osad bada się pod mikroskopem.

W przypadku braku ropy i śluzu zawartość żółci i dwunastnicy odwirowuje się bez mieszania z eterem.

Badanie plwociny. W praktyce helmintologicznej przeprowadza się badanie plwociny w celu: diagnostyka laboratoryjna paragonimoza. Czasami wykrywane są jaja schistosomów, larwy ascaris, elementy pęcherza bąblowicy.

Natywny rozmaz jest przygotowywany z plwociny na szklanym szkiełku, który jest badany pod mikroskopem.

Przy dużej zawartości ropy w plwocinie miesza się ją z 0,5% roztworem sody kaustycznej lub kaustycznego potasu, wytrząsa przez 5 minut i odwirowuje. Osad jest badany mikroskopowo.

Badanie krwi. Krew jest badana, jeśli pacjent jest podejrzany o filariozę.

Ze względu na to, że w przypadku niektórych typów filariozy (loiasis, wuchereriosis wywołanej przez szczep podokresowy) występują larwy (mikrofilarii) krew obwodowa tylko w ciągu dnia, az niektórymi (brugiaza, wuherioza wywołana okresowym szczepem) - odpowiednio tylko w nocy, w tym czasie pobierają krew do analizy.

Technika pobierania krwi, przygotowanie preparatów (cienki rozmaz i gęsta kropla), ich barwienie (według Romanowskiego) i badanie są podobne do tych w diagnostyce laboratoryjnej malarii.

mikrofilarie różne rodzaje różnią się długością, szerokością, krzywizną ciała, obecnością lub brakiem kapelusza, kształtem końca ogonowego, lokalizacją substancji jądrowej w ciele i obszarem ogonowym larw.

Postęp badań. Mocz osadza się na co najmniej 30 minut, następnie górną warstwę odsącza się, pozostawiając 10-15 ml osadu, który wlewa się do probówek wirówki i wiruje przez 1-2 minuty. Po odsączeniu supernatantu osad przenosi się na szkiełko i bada pod mikroskopem.

BADANIE BIOPTII MIĘŚNI

Metoda trychinoskopii. Przy podejrzeniu włośnicy pojawia się potrzeba badania próbek biopsyjnych mięśni pacjenta.

Biopsję wykonuje się zgodnie z ogólnymi zasadami. Mięsień naramienny jest zwykle poddawany biopsji. W badaniu patoanatomicznym można wykonać biopsję mięśni przepony, przełyku, języka, mięśni żucia i międzyżebrowych, zginaczy kończyn, mięśni gałki ocznej, ponieważ są one najintensywniej zaatakowane przez larwy włosienia.

W laboratorium z biopsji kawałek mięśnia tnie się na bardzo małe kawałki (mikrotom), które umieszcza się między dwiema szklankami, miażdżąc włókna mięśniowe i bada pod mikroskopem. Obecnie szeroko stosowane są do tego celu specjalne mikroskopy, trichinelloskopy.

W przypadku włośnicy trichinoskopia wzdłuż włókien mięśniowych ujawnia ostro wydatne, owalne (podobne do cytryny) kapsułki włośnicy. Średnia wielkość ludzkich kapsułek to 0,4 x 0,26 mm. Kapsułka z reguły zawiera jedną włośnicę zwiniętą spiralnie w 2,5 zwojów. Przy dużej intensywności inwazji jedna kapsułka może zawierać 2 lub 3 larwy. Włókna mięśniowe sąsiadujące z torebką tracą poprzeczne prążkowanie i przybierają jednolity wygląd.

Mięso bada się w ten sam sposób produkty mięsne który spowodował infekcję.

Metoda trawienia mięśni. Metoda jest bardziej wydajna.

Postęp badań. Badane mięśnie są drobno posiekane i wypełnione sztucznym sokiem żołądkowym w proporcji 1:15-20. Otrzymaną mieszaninę umieszcza się w termostacie w temperaturze 37°C na 12-16 h. Po tym okresie osad pod mikroskopem, w którym wśród masy resztek strawionych włókien mięśniowych znajdują się wolne larwy Trichinella.

Sztuczny sok żołądkowy można kupić w aptece lub przygotować w laboratorium. Aby to zrobić, dodaj 10 ml stężonego kwasu solnego do 1 litra wody destylowanej; przed użyciem 30 g pepsyny dodaje się do 1 litra rozcieńczonego kwasu.

METODY BADAŃ ILOŚCIOWYCH

Ilościowe metody badawcze służą do określania intensywności inwazji, oceny skuteczności różnych leków przeciwrobaczych, określania jakości odrobaczania, monitorowania bieżących masowych środków terapeutycznych i profilaktycznych itp.

Ilościowe oznaczenie jaj robaków przeprowadza się dwiema metodami: metodą Stolla oraz metodą Krasilnikova i Volkova (1974).

Metoda Stolla. Do przeprowadzenia badania niezbędny jest mikroskop, kolba szklana z oznaczeniem 56 i 60 ml, cylinder miarowy, kulki szklane, gumowy korek do kolby, pipety miarowe, szkiełka podstawowe i 0,4% roztwór wodorotlenku sodu.

Postęp badań. Do kolby z cylindrem miarowym wlać dziesięcionormalny roztwór wodorotlenku sodu (stężenie około 0,4%) do kreski 56 ml i dodawać kał do poziomu 60 ml (tj. 4 ml kału). Mieszankę dokładnie wstrząsa się szklanymi kulkami przez 1 minutę, zamykając naczynie gumowym korkiem (można również mieszać patyczkiem). Natychmiast po wstrząśnięciu pipetą miarową pobiera się 0,075 ml mieszaniny (zawiera 0,005 ml kału), przenosi się na szkiełko i zlicza pod mikroskopem liczbę jaj w preparacie. Aby określić liczbę jaj w 1 g kału, znalezioną liczbę mnoży się przez 200.

Porównanie ilości jaj w preparacie, stwierdzonych u pacjentki przed i po leczeniu, pozwala ocenić skuteczność odrobaczenia.

Metoda Stolla jest prosta, daje porównywalne wyniki we wszystkich robaczycach, których patogeny systematycznie wydzielają jajeczka do jelit pacjenta. Wadą metody jest jednak jej stosunkowo niska czułość, zwłaszcza przy małej intensywności inwazji.

Metoda Krasilnikowa-Wołkowej. Podczas badania tej metody co najmniej 1 g kału miesza się w szklanej kolbie lub dużej probówce z 1% roztworem Lotus (lub 1,5% roztworem Extra) w stosunku 1:10. Zawiesinę dokładnie wstrząsa się aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny, następnie 0,1 ml zawiesiny (co odpowiada 0,01 g kału) szybko zbiera się za pomocą pipety miarowej i przenosi na szkiełko. Preparat przykrywa się szkiełkiem nakrywkowym lub płytką celofanową (20 x 30 mm), starzonym minimum 1 dzień w 50% roztwór wodny gliceryna.

Policz ilość jaj w całym przygotowaniu. Aby obliczyć liczbę jaj w 1 g kału, uzyskaną liczbę należy pomnożyć przez 100.

Ta metoda ma szereg zalet w stosunku do metody Stoll. Po pierwsze, jest bardziej czuły i umożliwia wykrywanie robaków o niskim stopniu inwazji. Po drugie, jest to bardzo wygodne do badań masowych, ponieważ roztwory detergentów, będące konserwantami jaj robaków, umożliwiają prowadzenie badań niezupełnie świeżego materiału. Warunkiem jest jednak zbieranie kału bezpośrednio do roztworu detergentu.

Do badań ilościowych można zastosować dowolną z opisanych ujednoliconych metod jakościowych opartych na zasadzie pływających jaj. Ale w tym przypadku do analizy należy pobrać tę samą ilość kału, tę samą objętość roztworu flotacyjnego. Stopień inwazji można obliczyć, znając liczbę jaj w 1 g kału, zgodnie z poniższą tabelą.

Intensywność inwazji w zależności od liczby jaj robaków

w 1 g kału

DIAGNOZA SEROLOGICZNA

Metody te, oparte na wykrywaniu swoistych przeciwciał w surowicy krwi, są wykorzystywane do celów diagnostycznych i przesiewowych.

Metody serologiczne obejmują:

Reakcja strącania pierścieniowego (RCP) (włośnica, wągrzyca);

Reakcja strącania pierścieniowego w probówkach na zimno (włośnica, wągrzyca);

Reakcja mikroprecypitacji na żywe larwy (włośnica, glistnica);

Reakcja hemaglutynacji pośredniej (RIHA) (włośnica, bąblowica, alweokokoza, wągrzyca itp.);

Reakcja aglutynacji lateksu (RAL) (bąblowica, alweokokoza, włośnica, teniarinhoz itp.);

Reakcja wiązania dopełniacza (RCC) (włośnica, bąblowica, wągrzyca);

Reakcja przeciwciał znakowanych enzymatycznie (REMA) (bąblowica, onchocerkoza, schistosomatoza, włośnica, toksokaroza);

ELISA (włośnica, przywr, toksokaroza, toksoplazmoza itp.).

Aby ustawić reakcje serologiczne, wytwarza się standardowe antygeny lub przygotowuje się je niezależnie (na przykład z pęcherzy bąblowic owiec), wytwarza się specjalne systemy testowe do testu ELISA.

Metody specjalne badania nad enterobiozą, taeniarhynchosis, taeniasis

Skrobanie z fałdów odbytu. Aby uzyskać zeskrobanie z fałdów okołoodbytniczych, możesz użyć drewnianej szpatułki, paska celofanowego, papieru celulozowego lub taśmy, sztyftów do oczu ze specjalną warstwą klejącą:

a) skrobanie drewnianą szpatułką (łopatka to spłaszczona zapałka lub kij) zwilżona 1% roztworem gliceryny (lub 0,5% roztworem napoje gazowane), wykonuje się poprzez lekkie zdrapywanie z powierzchni fałdów okołoodbytowych na całym obwodzie odbytu. Powstałe skrobanie przenosi się krawędzią szkiełka nakrywkowego z końca szpatułki na szkiełko w kropli 50% roztworu glicerolu, przykryte tym samym szkiełkiem nakrywkowym i pod mikroskopem. Wadą metody jest brak wykrywania jaj i działanie drażniące;

b) zgodnie z metodą Torgusina wykonuje się spłukiwanie wacik na drewnianej lub innej szpatułce zwilżonej 50% roztworem gliceryny i przygotować rozmaz na szklanym szkiełku w kropli gliceryny;

c) zgodnie z metodą Kevorkova około 5 ml wlewa się do probówki wirówkowej gotowana woda, włóż do niej szpatułkę (kij) z wacikiem. Przed pobraniem materiału wacik lekko dociska się do wewnętrznej ścianki probówki, przeciera nim fałdy okołoodbytnicze i wprowadza do probówki szpatułkę z wacikiem. Tampon w probówce dokładnie wstrząsa się, popłuczyny odwirowuje się przez 3 minuty, a powstały osad bada się pod mikroskopem;

d) skrobanie taśmą klejącą wg Grahama. Kawałek taśmy samoprzylepnej (przezroczysta taśma polietylenowa z warstwą klejącą dla dziecięcej kreatywności, ale lepiej użyć folii operacyjnej LPO-1, LPO-2) o długości 8-10 cm przykleja się warstwą klejącą do fałd okołoodbytowych skóry, trzymając ją za końce, a następnie przenosić na badaną szybę lepką warstwą w dół (końcówki taśmy wystające poza krawędzie szyby są odcinane), okulary są ponumerowane, a dane pacjenta a liczba kieliszków jest odnotowywana w dzienniku. W laboratorium taśmę odrywa się z jednego końca na dużą odległość, pod nią kapie się 1-2 krople olejku wazelinowego lub gliceryny (w celu wyeliminowania defektów optycznych) i pod mikroskopem;

e) skrobanie szklanymi patyczkami do oczu, których powierzchnia pokryta jest specjalną kompozycją klejącą. Patyczki do oczu są instalowane w specjalnym statywie. Materiał pobiera się przez kontakt płaskiej części szpatułki ze skórą otworu okołoodbytowego. Następnie kij jest ponownie mocowany w statywie do transportu. Mikroskopia wykonywana jest bezpośrednio na szpatułce z obu stron (bez szkiełek i szkiełek nakrywkowych) ze wstępnym zamocowaniem w kasetach przy małym powiększeniu (okular x 10, obiektyw x 8). Pod koniec pracy patyczki są dezynfekowane przez gotowanie w roztworze mydła, a statyw i kasety są traktowane alkoholem i myte roztworem sody mydlanej. Skład kleju: cleol - 10 g, olej rycynowy- 2,5 g, eter etylowy - 5 g, alkohol etylowy 96% - 2,5 g.

Szpatułki zanurza się w roztworze kleju, a następnie suszy na powietrzu w temperaturze pokojowej. Folia klejąca utworzona na powierzchni utrzymuje się przez kilka dni.

Metoda jest wygodna do masowego badania populacji dzieci pod kątem enterobiozy i populacji dorosłych pod kątem teniidoz.

Oprócz metody skrobania na teniarhynchosis i tenasis stosuje się również metodę ankietową i metodę makroskopową opisaną powyżej (w przypadku wykrycia segmentów).

Specjalne metody badawcze w przypadku węgorzycy

Metodę eterowo-octową stosuje się do wykrywania jaj (patrz wyżej), a metodę Bermana do wykrywania larw w kale.

Metoda Bermana. Zbadaj świeży kał, lepiej po zażyciu środka przeczyszczającego. Próbkę kału o masie 5 g umieszcza się na metalowym sicie (siatka jest wyłożona od wewnątrz dwiema warstwami gazy) w szklanym lejku zamocowanym na trójnogu. Na dolny koniec lejka nakłada się gumową rurkę z zaciskiem (aparat Bermana).

Siatkę z kałem podnosi się i do lejka wlewa się wodę podgrzaną do 40-50 °C tak, aby dolna część siatki była zanurzona w wodzie, a kał całkowicie pokryty wodą. Po 2-4 godzinach zacisk na gumowej rurce jest szybko otwierany, a płyn schodzi do rurki wirówki. Po odwirowaniu (1-2 min) Górna część płyn szybko spuszcza się, a osad w ilości 1 ml nanosi się cienką warstwą na szkiełko i mikroskopowo pod małym powiększeniem mikroskopu.

Metoda IMP i TM. Porcję kału wielkości orzecha umieszcza się w zlewce chemicznej, zalewa ciepłą solanką o temperaturze 40 ° C, tak aby kał był przykryty roztworem, pozostawiony na 20 minut. Po 20 minutach płyn wylewa się na szalkę Petriego i ogląda pod mikroskopem dwuokularowym MBS.

W diagnostyce węgorzycy, zwłaszcza w celu monitorowania skuteczności leczenia, zaleca się łączenie metody Bermana z badaniem treści dwunastnicy.

Specjalne metody badawcze dla nicieni

Nicienie

Glistnica

W anamnezie zwraca się uwagę na stosunek do ogrodnictwa, ogrodnictwa. Spożywanie surowych warzyw, sałatek z tych warzyw.

Objawy kliniczne wczesnej fazy glistnicy są spowodowane zmianami alergicznymi w ciele. Wczesne lub migrujące stadium larwalne glistnicy często występuje w obecności gorączki o temperaturze ciała do 38 ° i wyższej, z zespołem objawów uszkodzenia płuc i obecnością ciężkiej eozynofilii we krwi. W większości przypadków u dzieci pierwszymi objawami choroby są złe samopoczucie, osłabienie, nawracające bóle głowy, pocenie się, a czasem bóle mięśni i stawów. Często występuje obfita wysypka typu pokrzywki z silnym lub umiarkowanym swędzeniem. Rozpoznanie wczesnej fazy potwierdzają badania rentgenowskie na obecność lotnych cząstek w płucach. nacieki eozynofilowe Lefflera. Świeże rozmazy plwociny często wykazują komórki eozynofilowe, czerwone krwinki, kryształy Charcot-Leiden i larwy ascaris.

W jelitowym stadium glistnicy występuje połączenie objawów z zespołu żołądkowo-jelitowego i astenicznego, enterokolitycznego objawy bólowe. U dzieci często dochodzi do spadku masy ciała, czasem dość znacznego. Nudności, zwiększone wydzielanie śliny, drażliwość, zatrzymanie rozwój psychomotoryczny, zmniejszona inteligencja.

Do diagnostyki laboratoryjnej jelit

Erszowa I.B., Osychnyuk L.M., Mochalowa A.A., Instytucja Państwowa „Państwo Ługańsk Uniwersytet medyczny”, Katedra Pediatrii z Zakażeniami Dziecięcymi.
Artykuł został opublikowany w czasopiśmie „Actual Infectology”, nr 2 (3), 2014.
Zasób informacyjny „Wydawnictwo Zaslavsky” www.mif-ua.com

W artykule opisano metody diagnozowania inwazji robaków: mikroskopowe, immunoenzymatyczne, serologiczne, reakcja łańcuchowa polimerazy, diagnostyka biorezonansowa, hemoskanowanie, a także instrumentalne (badanie ultrasonograficzne i rentgenowskie, tomografia komputerowa) i laboratoryjne, które mają znaczenie pośrednie ( analiza kliniczna badanie krwi, badanie wątroby, badanie kału w kierunku dysbakteriozy). Opisano zalety metod, ich wady oraz wiarygodność uzyskanych danych. Proponowane są kwestionariusze dla pacjentów w celu określenia ryzyka zakażenia robakami pasożytniczymi. Opisano zalety metod, ich wady oraz wiarygodność uzyskanych danych. Proponowane są kwestionariusze dla pacjentów w celu określenia ryzyka zakażenia robakami pasożytniczymi.

Robaki mają negatywny wpływ na organizm człowieka. Prowadzą do alergii, rozwoju polihipowitaminozy, makro- i mikroelementoz, upośledzenia hematopoezy i przepuszczalności naczyń oraz zaburzenia równowagi hormonalnej. Helminthiases przyczyniają się do powstawania chorób przewlekłych (zapalenie pęcherzyka żółciowego, kamica żółciowa, zapalenie trzustki, zapalenie okrężnicy, cukrzyca, astma oskrzelowa, atopowe zapalenie skóry), zaburzenia psychoemocjonalne ( chroniczne zmęczenie, drażliwość, lęk, nadpobudliwość u dzieci), niedokrwistość itp. W przypadku długotrwałej inwazji robaków może rozwinąć się wtórny niedobór odporności.

Czujność lekarzy wobec robaczyc w populacji jest obecnie niewystarczająca, a profilaktyka ogranicza się do leczenia zidentyfikowanych zarażonych pacjentów.

Diagnoza robaczyc na podstawie klinicznych danych epidemiologicznych i laboratoryjnych. Objawy takie jak zespół asteniczny, nawracająca pokrzywka, zaburzona regeneracja skóry i błon śluzowych, trudne do leczenia atopowe zapalenie skóry i zespół obturacyjny oskrzeli, polilimfadenopatia i hepatosplenomegalia niewiadomego pochodzenia, wegetacje gruczołowe II-III stopnia, język „geograficzny”, zmniejszony lub selektywny apetyt, niestabilny stolec, mogą wskazywać na obecność robaków.

Na badanie serologiczne określić obecność przeciwciał przeciwko robakom pasożytniczym (niezawodność - około 60%): w przypadku podejrzenia bąblowicy, wągrzycy, włośnicy, toksokarozy, szeroko stosowane są hemaglutynacja pośrednia, aglutynacja lateksu, wiązanie dopełniacza, reakcje immunofluorescencyjne.
Nie we wszystkich przypadkach metody określania swoistych przeciwciał mają wystarczającą specyficzność i niezawodność. Skład antygenowy robaka zależy nie tylko od gatunku, ale także od etapu; przechodzenie przez złożony cykl rozwoju od jajka do dorosły, robaki zmieniają skład antygenowy. Ponadto w reakcjach immunodiagnostycznych wykorzystuje się przeciwciała somatyczne, a w organizmie gospodarza przeciwciała wytwarzane są głównie przeciwko wydalaniom i wydzielinie robaków. Niespecyficzne uczulenie organizmu, powszechność niektórych antygenów przywr, pierwotniaków i ludzi powoduje wysoki odsetek fałszywie dodatnich reakcji w mianach poniżej wiarygodnych diagnostycznych.

Metoda oznaczania robaków za pomocą reakcja łańcuchowa polimerazy jest wysoce specyficzny i bardzo wrażliwy, ale ze względu na wysoki koszt i złożoność nie może być badaniem przesiewowym, gdy na przykład należy zbadać grupę dzieci z placówki dziecięcej.

Układ odpornościowy nie zawsze reaguje (rozpoznaje i niszczy) na obecność robaków w organizmie. Dzieje się tak, ponieważ niektóre robaki mają mocną i odporną chemicznie kapsułkę lub są pokryte substancją, która nie jest rozpoznawalna. układ odpornościowy; zlokalizowane w tkankach najlepiej chronionych przed reakcjami zapalnymi, na przykład w rdzeń kręgowy; wiele gatunków z nich wydziela antyenzymy w przewodzie pokarmowym, co chroni je przed śmiercią; mieć długą oczekiwaną długość życia (przez lata, a czasem do śmierci samej osoby); żywią się glikolizą czystych węglowodanów; posiadać takie urządzenia jak przyssawki, haczyki itp., które przyczyniają się do fiksacji wewnątrz ciała; u wielu gatunków występuje rozmnażanie płciowe, w którym następuje wymiana informacji genetycznej, co prowadzi do wzrostu niejednorodnej populacji, zmniejszenia podatności; posiadać wysoki poziom płodność.

Na ultradźwiękowy , Badanie rentgenowskie narządów Jama brzuszna , tomografii komputerowej możliwe jest zidentyfikowanie pośrednich objawów robaczyc: hepatosplenomegalia, nierówny miąższ wątroby i śledziony z powodu małych sygnałów hiperechogenicznych, powiększone węzły chłonne we wnęce śledziony i same robaki (echinokoki, splątki robaków jelitowych itp.).

Hemoscanning - jakościowe badanie krwi za pomocą silnego mikroskopu ciemnego pola, można zobaczyć stan komórek krwi (kształt, wielkość, aktywność, kolor itp.), obecność niespecyficznych pierwiastków i substancji - wszystko to bezpośrednio lub pośrednio wskazuje na obecność robaków w ciele. Obraz wyświetlany jest na ekranie monitora za pomocą wbudowanej kamery wideo w mikroskopie. Ta metoda diagnostyczna ma wysoką niezawodność.

Laboratorium pośrednie oznaki robaczyce może wystąpić niedokrwistość, bazofilia, eozynofilia, wzrost poziomu aminotransferazy asparaginianowej. Tak więc, w przypadku toksokarozy, na tle uporczywego wykrycia wykryto reakcję białaczkową eozynofili (ponad 20%) zespół alergiczny(atopowe zapalenie skóry z silnym swędzeniem i opornością na tradycyjna terapia, ciężka astma oskrzelowa). Hamowanie normalnej E. coli w analizie kału pod kątem dysbakteriozy może również wskazywać na możliwą robaczycę.

Biorąc pod uwagę występowanie helminthiases, sugerujemy kwestionariusz w celu określenia ryzyka zakażenia robakami pasożytniczymi.

• Pływaj w słodkiej wodzie.
• Nie myj rąk przed jedzeniem mydłem i gorącą wodą.
• Woda pitna z niezweryfikowanych źródeł.
• Zjedz domowy smalec z pasemkami mięsa.
• Jedz solone ryby.
• Jedz niedogotowane mięso (z krwią).
• Jedz niefabryczny lekko solony kawior.
• Nie myj jaj kurzych mydłem.
• Nie myj bananów, pomarańczy, mandarynek przed użyciem.
• Nawozić swój ogród obornikiem.
• Jedz warzywa prosto z ogródka.
• Jedz owoce i jagody prosto z ogródka.
• Spożywaj opadłe owoce.
• Nie zalewaj wszystkich zieleni wrzątkiem do sałatek.
• Przechowuj marchewki w piasku zabranym z podwórka.
• Chodź boso po trawie.
• Członkowie rodziny mieli plagi robaków.
• Rodzina ma psa lub kota.

Za każdą odpowiedź TAk„- 2 punkty”, czasami" - jeden, " Nie» - 0. Przy wyniku 0-5 prawdopodobieństwo infekcji jest znikome, 6-12 - możliwa infekcja, 13-25 - wysokie prawdopodobieństwo, powyżej 25 punktów - bardzo wysokie. W przypadku dwóch ostatnich wyników konieczne jest regularne badanie i ewentualnie leczenie zapobiegawcze.

Ponieważ objawy kliniczne robaczyc nie zawsze są specyficzne, a na początkowych etapach są niespecyficzne, oferujemy kwestionariusz dla pacjentów samodiagnoza robaczyce.

• Rano w odbycie pojawia się swędzenie.
• Nudności rano podczas mycia zębów.
• Obieranie palców rąk i nóg, z złuszczaniem warstw skóry.
• Wysypka alergiczna na skórze, swędząca skóra.
• Peeling i obrzęk powiek.
• Zwiększone zmęczenie, letarg, senność.
• Zwiększone uczucie głodu.
• Uczucie dyskomfortu w jamie brzusznej.
• Utrata wagi.
• Obecność wielu przewlekłych chorób narządów przewód pokarmowy, stawy, układ oskrzelowo-płucny.
• Zły stan zdrowia, brak oficjalnej diagnozy, przedłużające się nieskuteczne leczenie.
• Okresowy wzrost temperatury, któremu towarzyszy ból mięśni i stawów.

Odpowiadać " TAk" na przynajmniej na 2-3 pytania, o których mowa wysokie prawdopodobieństwo infekcje robaków.

WNIOSKI

1. Wł. obecny etap nie ma metod laboratoryjnych do badania robaczycy, które są w 100% wiarygodne.

2. Polimeraza reakcja łańcuchowa i diagnostyka biorezonansowa.

BIBLIOGRAFIA

Badanie kału

Mikroskopia jest najpierw przeprowadzana przy małym powiększeniu (X80). Najprostsze można zastąpić silniejszym załamaniem światła, a niektóre gatunki ich ruchem lub zmianą kształtu. Obiekt widziany w małym powiększeniu badany jest w powiększeniu 400 lub 600. W przypadku braku doświadczenia rozmazy należy natychmiast oglądać w dużym powiększeniu, co jednak znacznie wydłuża czas badania preparatu. Oglądanie rozmazów przy dużym powiększeniu należy wykonywać w mocniejszym świetle, dostosowując je kondensorem.

znaki różnicowe pewne rodzaje ameby w natywnym rozmazie to kształt i wielkość ciała, widoczność jądra, charakter powstawania pseudopodia, ruch, podział cytoplazmy na ekto- i endoplazmę, charakter wtrąceń (fagocytowane erytrocyty, itp.). Rozróżniając gatunki wiciowców - wielkość i kształt ciała, liczbę wici, charakter ruchu, obecność lub brak falistej błony. Specyficzne cechy balantidii to rozmiar, kształt ciała, ruch, rzęski, cytostom itp.

Główną cechą wyróżniającą wegetatywne formy pierwotniaków w stanie żywym jest ruch. Znalezione w rozmazach różnego rodzaju utrwalone formacje - włókno roślinne, włókna mięśniowe, zarodniki, grzyby itp. Nie powinny być brane pod uwagę w diagnostyce protozoologicznej.

Metoda rozmazów natywnych jest prosta i dostępna dla każdego laboratorium. Pozwala to, po znalezieniu tkankowych form ameb czerwonkowych ze sfagocytowanymi erytrocytami, postawić absolutnie dokładną diagnozę czerwonki pełzakowej, a w przypadku wykrycia balantidiów i giardii diagnozę balantidiazy i lambliozy.

Barwienie rozmazów płynem Lugola . Barwa ta służy do diagnozowania pierwotniaków przez cysty. Jest stosowany w badaniu sformalizowanych, półformowanych i papkowatych odchodów.

Aby przygotować rozmaz, koniec drewnianego patyczka zabrudzi się kałem i umyje w kropli roztworu jodu (J - 1,0 g, KJ - 2 g, woda destylowana - 100 ml) nałożonej na szkiełko do uzyskania jednorodnej emulsji uzyskany. Preparat przykrywa się szkiełkiem nakrywkowym i po 3-5 minutach. mikroskopijny. Rozmaz musi być wystarczająco przezroczysty, aby można go było badać w świetle przechodzącym.

Wśród resztek niestrawione jedzenie, zarodniki, grzyby, bakterie jodofilowe cysty pierwotniaków, pomalowane na kolor brązowy lub zielonkawo-żółty, wyróżniają się ściśle określonym, charakterystycznym dla każdego gatunku kształtem, wielkością, wyraźnymi obrysami krawędzi, obecnością gładkiej, przezroczystej, dwu- błona obwodowa, zawartość cytoplazmy, a także obecność jąder o niewyraźnej strukturze. W cystach ameby widoczne są wakuole glikogenu zabarwione na kolor brązowy (ciemnobrązowy). Stopień wybarwienia tych wakuoli i zarys ich granic różni się w cystach pierwotniaków tego samego gatunku, w zależności od ich dojrzałości.

7.7. Metody określania żywotności jaj i larw helmintów

Żywotność jaj helmintów zależy od ich wyglądu, barwienia barwnikami witalnymi, hodowli w optymalnych warunkach i przygotowania próbki biologicznej.

7.7.1. Oznaczanie żywotności jaj lub larw robaków przez wygląd

Jaja robaków są pod mikroskopem najpierw przy małym powiększeniu, a następnie przy dużym powiększeniu. W zdeformowanych i martwych jajach robaków skorupa jest rozdarta lub wygięta do wewnątrz, plazma jest mętna, poluzowana. W segmentowanych jajach kulki rozszczepiające (blastomery) są nierównej wielkości, mają nieregularny kształt i często są przesunięte do jednego bieguna. Czasami zdarzają się nienormalne jaja, które mając zewnętrzne deformacje rozwijają się normalnie. W żywych larwach glisty drobna ziarnistość występuje tylko w środkowej części ciała, gdy umierają, rozprzestrzenia się po całym ciele, pojawiają się duże błyszczące szkliste wakuole, tak zwane „sznury pereł”.

Aby określić żywotność dojrzałych jaj glisty, włosogłówki, owsików, aktywne ruchy larw należy wywołać lekkim podgrzaniem preparatu (do temperatury nie przekraczającej 37 ° C). Dogodniej jest obserwować żywotność larw ascaris i włosogłówki po ich wyizolowaniu ze skorupki jaja, naciskając na szklankę nakrywkową preparatu igłą preparacyjną lub pęsetą.

W larwach inwazyjnych ascaridów często widać czapeczkę, która złuszczała się na końcu głowy, a u larw włosogłówki, które zakończyły rozwój w jaju, w dużym powiększeniu w tym miejscu znajduje się mandryn. Martwe larwy robaków, niezależnie od ich lokalizacji (w jaju lub poza nim), zauważają rozkład ciała. W tym przypadku wewnętrzna struktura larwy staje się grudkowata lub ziarnista, a ciało staje się mętne i nieprzejrzyste. W ciele znajdują się wakuole, a na naskórku znajdują się pęknięcia.

Żywotność teniidowych onkosfer (bydlęcych, świńskich tasiemców itp.) określa ruch zarodków, gdy są one wystawione na działanie enzymów trawiennych. Jaja umieszcza się na szkiełku zegarkowym z sokiem żołądkowym psa lub sztucznym sokiem dwunastniczym. Skład tego ostatniego: pankreatyna - 0,5 g, wodorowęglan sodu - 0,09 g, woda destylowana - 5 ml. Okulary zegarkowe z jajkami umieszcza się w termostacie w temperaturze 36 - 38 ° C na 4 godziny. W tym przypadku żywe embriony są uwalniane z błon. Muszle żywych onkosfer rozpuszczają się również w zakwaszonej pepsynie i zasadowym roztworze trypsyny po 6-8 godzinach w termostacie w 38 °C.

Jeśli jaja teniidowe zostaną umieszczone w 1% roztworze siarczku sodu lub 20% roztworze podchlorynu sodu lub w 1% roztworze wody chlorowej o temperaturze 36 - 38 ° C, dojrzałe i żywe zarodki są uwalniane z muszli i nie zmienić w ciągu 1 dnia. Niedojrzałe i martwe onkosfery kurczą się lub puchną i dramatycznie powiększają się, a następnie „rozpuszczają” w ciągu 10 minut do 2 godzin. Żywe zarodki teniidów również aktywnie poruszają się w mieszaninie 1% roztworu chlorku sodu, 0,5% roztworu wodorowęglanu sodu i żółci w temperaturze 36 - 38 ° C.

Żywotność fasciolia adolescariae pobranych z roślin i innych obiektów zbiorników wodnych sprawdza się badając je na szkiełku w soli fizjologicznej pod mikroskopem ze stopniem grzewczym. Po podgrzaniu larwy przywr w torbieli zaczynają się poruszać.

Aby określić żywotność jaj tasiemca karłowatego, metoda Ionina N.S. jest najprostsza: w żywych jajach środkowa para embrionalnych haczyków jest albo równoległa do bocznych, albo te ostatnie tworzą kąt u podstawy mniejszy niż 45 ° z medianą. W martwych jajach pary boczne tworzą kąt u podstawy z medianą pary większą niż 45 ° lub haczyki są losowo rozrzucone (utrata ich parzystości); czasami pojawia się marszczenie zarodka, tworzenie ziarnistości. Dokładniejsza metoda opiera się na pojawieniu się ruchów onkosfery podczas gwałtownej zmiany temperatury: od 5 - 10 ° do 38 - 40 ° C.

Określając żywotność niedojrzałych jaj nicieni należy badać w komorze wilgotnej (szalki Petriego), umieszczając jaja ascaris w 3% roztworze formaliny przygotowanym w izotonicznym roztworze chlorku sodu w temperaturze 24 - 30°C, jaja włosogłówki w 3 % roztwór kwasu solnego w temperaturze 30 - 35 ° C; jaja owsików w izotonicznym roztworze chlorku sodu w temperaturze 37 °C. Szalki Petriego należy otwierać 1 do 2 razy w tygodniu dla lepszego napowietrzenia i ponownie zwilżyć bibułę filtracyjną czystą wodą.

Obserwacje rozwoju jaj robaków przeprowadza się co najmniej 2 razy w tygodniu. Brak oznak rozwoju w ciągu 2-3 miesięcy wskazuje na ich nieżywotność. Oznakami rozwoju jaj helmintów są najpierw etapy miażdżenia, podziału zawartości jaja na oddzielne blastomery. W ciągu pierwszych dni rozwija się do 16 blastomerów, które przechodzą do drugiego etapu - morula itp.

Jaja tęgoryjców hoduje się w szklanym cylindrze (50 cm wysokości i 7 cm średnicy) zamkniętym korkiem. Mieszankę równych objętości sterylnego piasku, węgla drzewnego i kału z jajami tęgoryjca, rozcieńczoną wodą do konsystencji półpłynnej, ostrożnie wylewa się na dno cylindra za pomocą szklanej rurki. W ciągu 1-2 dni zalegania w ciemności w temperaturze 25-30 °C z jaj wylęgają się larwy rabditoidów, a po 5-7 dniach stają się już filariowate: larwy pełzają po ścianach cylindra, gdzie są widoczne nawet gołym okiem.

Jaja przywr, które naturalnie rozwijają się w wodzie, takie jak opisthorchis, diphyllobothriids, fasciols i inne, umieszcza się na szkiełku zegarkowym, szalce Petriego lub w innym naczyniu i wlewa niewielką warstwę zwykłej wody. Przy hodowli jaj fascioli należy wziąć pod uwagę, że szybciej rozwijają się one w ciemności, natomiast w żywych jajach w temperaturze 22-24°C tworzy się miracidium po 9-12 dniach. Podczas mikroskopii rozwijających się jaj przywr wyraźnie widoczne są ruchy miracidium. Fasciola miracidium wyłania się ze skorupek jaj tylko w świetle.

Metoda całorodna. Larwy tęgoryjców i strongylidów hoduje się na agarze na szalce Petriego z węglem zwierzęcym. Po utrzymywaniu w termostacie w temperaturze 25 - 30°C przez 5 - 6 godzin larwy rozprzestrzeniły się na agarze, pozostawiając po sobie ścieżkę bakterii.

Metoda Harady i Mori. Do probówek umieszczonych na statywie dodaje się 7 ml wody destylowanej. Za pomocą drewnianego patyczka pobrać 0,5 g kału i rozmazać na bibule filtracyjnej (15 x 150 mm) 5 cm od lewej krawędzi (ta operacja jest wykonywana na kartce papieru w celu ochrony powierzchni stołu laboratoryjnego). Następnie pasek z rozmazem wkłada się do probówki tak, aby lewy koniec wolny od rozmazu sięgał dna probówki. Przykryj górny koniec kawałkiem celofanu i zawiń go mocno gumką. Na probówce napisz numer, nazwę przedmiotu. W tym stanie probówki przechowuje się przez 8-10 dni w temperaturze 28°C. Aby zbadać larwy, zdejmij i zdejmij celofanową osłonę i usuń pasek bibuły filtracyjnej pęsetą. W takim przypadku należy zachować ostrożność, ponieważ niewielka liczba zakaźnych larw może przemieścić się na górny koniec bibuły filtracyjnej lub na ścianę probówki i wniknąć pod powierzchnię celofanu.

Probówki umieszcza się w gorącej łaźni wodnej o temperaturze 50°C na 15 minut, po czym zawartość wstrząsa się i szybko wlewa do 15 ml probówki sedymentacyjnej dla larw. Po odwirowaniu supernatant usuwa się, a osad przenosi się na szkiełko, przykrywa szkiełkiem nakrywkowym i pod mikroskopem pod małym powiększeniem.

Do diagnostyki różnicowej larw nitkowatych konieczne jest wykorzystanie danych z tabeli 3.

Tabela 3

DIAGNOSTYKA RÓŻNICOWA FILAROWANYCH LARWOJÓW A. DUODENALE, N. AMERICANUS, S. STERCORALIS, TRICHOStrONGYLUS SP.

Larwy	Wymiary	Charakterystyczne cechy
A. dwunastnicy	Długość ciała około 660 mikronów, czapeczka - 720 nm	Prążkowanie kapelusza jest mniej wyraźne, występ ust jest mniej zauważalny, przedni koniec ciała (ale nie kapelusz) jest tępy, średnica przewodu jelitowego jest mniejsza niż opuszka przełyku, koniec ogonowy jest tępy
N. americanus	Długość korpusu około 590 μm, czapka - 660 nm	Pochwa jest wyraźnie prążkowana, zwłaszcza w ogonowej części ciała, usta wydają się ciemne, przedni koniec ciała (ale nie pochewka) jest zaokrąglony jak wąski koniec. kurze jajo, przednia część przewodu jelitowego o średnicy takiej jak bańka przełyku, koniec ogona jest ostro zaostrzony
S. stercoralis	Długość ciała około 500 µm	Larwa bez pochewki, przełyk ma około połowy długości ciała, ogon jest tępy lub rozgałęziony
Trichostrongylus sp.	Długość ciała około 750 mikronów	Światło jelita nie jest proste, ale zygzakowate, koniec ogonowy jest zaokrąglony i ma kształt guzika

7.7.2. Metody barwienia jaj i larw robaków

Martwe tkanki w większości przypadków postrzegają kolory szybciej niż żywe. Cechy te są wykorzystywane w helmintologii do określania żywotności jaj i larw robaków. Jednak w niektórych przypadkach niektóre farby są lepiej odbierane przez żywe tkanki niż martwe.

Do różnicowego oznaczania żywych i martwych jaj i larw stosuje się następujące farby i metody.

Leukozasada błękitu metylenowego jest często używana do barwienia żywych i martwych tkanek. Żywa komórka lub tkanka redukuje błękit metylenowy do bezbarwnej leukobazy, martwa tkanka nie ma tej zdolności i dlatego nabiera koloru.

Kryterium stanu jaja jest zabarwienie zarodka, ale nie skorupy. Ta umiejętność jest związana z warunkami śmierci jaja. W tych przypadkach, w których włóknista skorupa w martwym jaju nie traci swoich właściwości półprzepuszczalnych, nie przepuszcza barwników, dlatego martwy zarodek nie zostanie zabarwiony. Kolorowy zarodek zawsze wskazuje na śmierć jaja.

Do barwienia jaj Ascaris można użyć błękitu metylenowego w roztworze kwasu mlekowego z zasadą kaustyczną (błękit metylenowy 0,05 g, soda kaustyczna 0,5 g, kwas mlekowy - 15 ml). Żywe jaja nie dostrzegają koloru; zarodki martwych jaj zmieniają kolor na niebieski. Larwy Ascaris barwi się roztworem zasadowym farby błękit brylantowo-krezylowy w stężeniu 1:10 000 w następujący sposób: kroplę płynu z jajami ascaris i kroplę roztworu farby podstawowej nanosi się na szkiełko. Preparat przykrywa się szkiełkiem nakrywkowym, które mocno dociska się do szkiełka, lekko stukając igłą preparującą. Pod mikroskopem obserwuje się liczbę wyklutych larw i stopień ich wybarwienia; po czym ten sam lek jest ponownie sprawdzany po 2 do 3 godzinach. Tylko niezdeformowane larwy, które nie wybarwiły się przez 2 godziny, uważa się za żywe. Martwe larwy albo nie wychodzą z jaj, albo plamią się, gdy skorupa pęka (częściowo lub całkowicie).

Przy określaniu żywotności jaj ptaków ascaridia możliwe jest barwienie preparatów 5% roztwór alkoholu jod. Po nałożeniu na lek zarodki martwych jaj ascarid przez 1 - 3 sekundy. są barwione na pomarańczowo.

Martwe jaja opisthorchis i onkosfery bydlęcego tasiemca barwiono roztworem błękitu toluidynowego (1:1000), a martwe onkosfery bydlęcego tasiemca barwiono roztworem błękitu brylantowo-krezylowego (1:1000). W tym samym czasie zarodki i skorupki zarówno martwych, jak i żywych jaj nabierają koloru. Dlatego po barwieniu jaja i onkosfery są myte w czystej wodzie i dodatkowo barwione safraniną (w rozcieńczeniu alkoholu 1:10 000, 10°C). Alkohol usuwa barwnik z muszli, a safranina plami na czerwono. W rezultacie żywe jaja stają się czerwone; jaja z martwymi zarodkami - na niebiesko, a skorupka pozostaje czerwona. Martwe zarodki onkosfer tasiemca bydlęcego szybko, w ciągu kilku minut barwi się na jaskrawoczerwono lub różowo safraniną lub błękitem brylantowo-krezylowym w rozcieńczeniu 1:4000 lub indygokarminem w rozcieńczeniu 1:1000 - 1 :2000. Żywe zarodki nie zmieniają się pod wpływem tych kolorów nawet po 2-7 godzinach.

Aby określić żywotność jaj tasiemca karłowatego, zaleca się stosowanie następujących farb:

1. Błękit krezylowy brylantowy (1:8000) - po 1 godzinie onkosfera martwych jaj jest szczególnie mocno wybarwiona, co wyraźnie wyróżnia się na bladym lub bezbarwnym tle reszty jaja.

2. Safranina (1:8000 przez 2 godziny i 1:5000 przez 3 do 5 godzin).

3. 50% roztwór kwasu pirogalowego w rozcieńczeniu 1:2 - po wystawieniu na 1 godzinę w temperaturze 29 - 30°C (im niższa temperatura, tym dłuższy proces barwienia).

7.7.3. Metoda luminescencyjna do badania jaj i larw helmintów

Mikroskopia fluorescencyjna umożliwia odróżnienie żywych i martwych obiektów bez uszkadzania jaja. Nie używany do fluorescencji promienie ultrafioletowe i niebiesko-fioletową część światła widzialnego za pomocą zwykłego mikroskopu i szkiełek; do oświetlacza OI-18 dodawany jest specjalny zestaw filtrów barwnych.

Żywe i martwe jaja obleńców, owsików, tasiemców karłowatych, tasiemców bydlęcych, tasiemców i innych robaków pasożytniczych świecą inaczej. Zjawisko to obserwuje się zarówno podczas pierwotnej luminescencji bez użycia barwników, jak i podczas barwienia fluorochromami (oranż akrydynowy, koryfosfina, primulin, aurolina, siarczan berleryny, tripaflawina, rivanol, chinakryna itp.).

Niepoplamione, żywe, niesegmentowane jaja glisty świecą jasnozielono z żółtawym odcieniem; w martwych jajach skorupa emituje zielone światło znacznie jaśniejsze niż ciemnozielona część embrionalna; w jajach glisty z larwami pojawia się tylko skorupa, podczas gdy w martwych zarówno skorupa, jak i larwa są jasnożółte.

Niepigmentowane i niesegmentowane żywe jaja owsików i tasiemców karłowatych emitują zielonkawo-żółte światło, w martwych jajach skorupa intensywnie świeci na tle ciemnozielonej masy zarodkowej.

W przypadku wtórnej luminescencji (przy barwieniu oranżu akrydyny w rozcieńczeniu 1:10000 i 1:50000 od 30 minut do 2 godzin) skorupa żywych i martwych nicieni, przywr i tasiemców świeci inaczej.

Skorupa żywych i martwych jaj ascaridów, toksokarów, owsików, tasiemców karłowatych, tasiemców szczurów, tasiemców byków, tasiemców staje się pomarańczowo-czerwona. Zarodki żywych jaj ascaris, toxascaris, szczurzego tasiemca, szerokiego tasiemca i onkosfery bydlęcego tasiemca świecą w ciemnozielonym lub szarozielonym kolorze. Martwe embriony jaj tych robaków wydzielają „płonący” pomarańczowo-czerwony kolor. Żywe larwy owsików i toksokary (skorupki jaj) emitują matowe, szaro-zielone światło, kiedy umierają, kolor zmienia się z czubka głowy na „płonący” jasnozielony, następnie żółty, pomarańczowy, a na koniec jasnopomarańczowy.

Po wybarwieniu fluorochromami - coryphosphyllum, primulin, martwe jaja ascaridów i włosogłówki świecą od liliowożółtego do miedzianoczerwonego. Żywe jaja nie świecą, ale stają się ciemnozielone.

Żywe jaja przywr (Paragonimus i Clonorchis) nie świecą po zabarwieniu oranżem akrydyny, a martwe jaja mają żółtawo-zielone zabarwienie.

Metodę luminescencji można również wykorzystać do określenia żywotności larw robaków. Tak więc, fluorochromowane roztworem oranżu akrydyny (1:2000) larwy strongylanu, blask rhabdita: żywe - zielone (z odcieniem), martwe - jasne pomarańczowe światło.

Żywe miracidia, które wyłoniły się z muszli, emitują słabe, niebieskawe światło z ledwo zauważalną jasnożółtą koroną rzęsek, ale 10-15 minut po śmierci pojawiają się jako jasne „płonące” jasnozielone, a następnie pomarańczowo-czerwone światło.

7.7.4. metoda testu biologicznego

Na przykład, aby określić żywotność jaj ascaris (świnie ascaris, ludzie, toxocara, toxascaris itp.) na zwierzę (świnki morskie, myszy), potrzeba co najmniej 100-300 jaj z rozwiniętą larwą. Jaja Ascaris w izotonicznym roztworze chlorku sodu są pipetowane przez usta myszy lub świnki morskiej. Po 6-7 dniach zwierzę ubija się, otwiera i oddzielnie bada wątrobę i płuca na obecność larw ascaris. W tym celu wątroba i płuca są cięte nożyczkami na małe kawałki i badane zgodnie z metodą Bermana lub Supryagi (rozdział 6.1.2).

Jeśli zwierzęta zostały zakażone żywymi jajami inwazyjnymi, to podczas sekcji zwłok w wątrobie i płucach wykryto migrujące larwy ascaris.

W przypadku zakażenia jaja fascioli w kale zwierząt laboratoryjnych można wykryć u królików po 2 miesiącach, u świnek morskich po 50 dniach, u myszy po 35-40 dniach.

Aby uzyskać szybszą odpowiedź, zwierzęta laboratoryjne otwiera się po 20-30 dniach, a wątrobę bada się pod kątem obecności młodych powięzi.

W celu określenia żywotności jaj tasiemca karłowatego zaleca się również karmienie nimi niezarażonych wcześniej białych myszy, a następnie przeprowadzenie autopsji zwierząt po 92–96 godzinach i wykrycie cystycerkoidów w kosmkach jelit lub tasiemcach w świetle jelita.

W celu określenia żywotności jaj opisthorchis zaleca się metodę (niem. S.M., Beer SA, 1984), opartą na fizykochemicznej aktywacji gruczołu wylęgowego miracidium i stymulacji motoryki larw, która prowadzi do otwarcia jaja i aktywne uwalnianie miracidium w warunkach doświadczalnych.

Zawiesina jaj opisthorchis w wodzie jest wstępnie schładzana do 10 - 12 ° C (wszystkie kolejne operacje są przeprowadzane w temperaturze pokojowej 19 - 20 ° C). Do probówki wirówki dodaje się 1 kroplę zawiesiny zawierającej 100-150 jaj. Probówkę umieszcza się na statywie na 5-10 minut. W tym czasie wszystkie jajka mają czas opaść na dno. Następnie paskiem bibuły filtracyjnej ostrożnie odsysa się nadmiar wody i do probówki dodaje się 2 krople specjalnego podłoża. Pożywkę przygotowuje się w 0,005 M buforze Tris-HCl; Do buforu dodaje się 12 - 13% roztwór etanolu i barwnik (magenta, safranina, eozyna, błękit metylenowy itp.). Probówkę wstrząsa się, jej zawartość przenosi się pipetą na szkiełko i pozostawia na 10 minut, lekko wstrząsając. Następnie dodaj 2 krople wskazanego podłoża. Preparat jest gotowy do mikroskopii pod konwencjonalnym mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 20x.

W tym czasie pokrywa żywotnych larw otwiera się, a miracidium aktywnie wnika we wskazane podłoże. Ze względu na obecność w nim etanolu po 2-5 minutach są unieruchamiane, a następnie barwione barwnikiem. Można je łatwo wykryć i policzyć pod mikroskopem.