W celu odpowiedniego i skutecznego leczenia wielu chorób zakaźnych konieczne jest terminowe ustalenie dokładnej diagnozy. W dzisiejszym rozwiązywaniu tego problemu zaangażowane są zaawansowane technologicznie metody diagnostyczne oparte na metodach biologii molekularnej. W chwili obecnej reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest już szeroko stosowana w medycynie praktycznej jako najbardziej niezawodne laboratoryjne narzędzie diagnostyczne.

Co tłumaczy popularność PCR w chwili obecnej?

Po pierwsze, metoda ta służy do identyfikacji patogenów różnych chorób zakaźnych z dużą dokładnością.

Po drugie, aby monitorować skuteczność leczenia.

W różnych podręcznikach, prospektach, artykułach, a także wyjaśnieniach lekarzy specjalistów często spotykamy się z użyciem niezrozumiałych terminów i słów. Naprawdę trudno jest mówić zwykłymi słowami o zaawansowanych technologicznie produktach nauki.

Jaka jest istota i mechanika diagnostyki PCR?

Każdy żywy organizm ma swoje unikalne geny. Geny znajdują się w cząsteczce DNA, która w rzeczywistości jest „wizytówką” każdego konkretnego organizmu. DNA (materiał genetyczny) to bardzo długa cząsteczka, która składa się z cegiełek zwanych nukleotydami. Dla każdego patogenu chorób zakaźnych znajdują się one ściśle specyficzne, to znaczy w określonej kolejności i kombinacji. Kiedy konieczne jest zrozumienie, czy dana osoba ma określony patogen, pobierany jest materiał biologiczny (krew, mocz, ślina, rozmaz), który zawiera fragmenty DNA lub DNA drobnoustroju. Ale ilość materiału genetycznego patogenu jest bardzo mała i nie można powiedzieć, do którego mikroorganizmu należy. Do rozwiązania tego problemu służy PCR. Istotą reakcji łańcuchowej polimerazy jest to, że pobierana jest niewielka ilość materiału do badań zawierającego DNA, a podczas procesu PCR ilość materiału genetycznego należącego do konkretnego patogenu wzrasta, a tym samym może być zidentyfikowany.

Diagnostyka PCR to badanie genetyczne biomateriału.

Idea metody PCR należy do amerykańskiego naukowca K. Mullinsa, którą zaproponował w 1983 roku. Jednak uzyskał szerokie zastosowanie kliniczne dopiero w połowie lat 90. XX wieku.

Zajmijmy się terminologią, co to jest - DNA itp. Każda komórka jakiejkolwiek żywej istoty (zwierzęcia, rośliny, człowieka, bakterii, wirusa) ma chromosomy. Chromosomy są strażnikami informacji genetycznej, która zawiera całą sekwencję genów każdej konkretnej żywej istoty.

Każdy chromosom składa się z dwóch nici DNA, które są skręcone względem siebie w spiralę. DNA to chemicznie kwas dezoksyrybonukleinowy, który składa się ze składników strukturalnych - nukleotydów. Istnieje 5 rodzajów nukleotydów - tymina (T), adenozyna (A), guanina (G), cytozyna (C) i uracyl (U). Nukleotydy są ułożone jeden po drugim w ściśle indywidualnej kolejności, tworząc geny. Jeden gen może składać się z 20-200 takich nukleotydów. Na przykład gen kodujący produkcję insuliny ma długość 60 par zasad.

Nukleotydy mają właściwość komplementarności. Oznacza to, że przeciwnie do adeniny (A) w jednej nici DNA zawsze znajduje się tymina (T) w drugiej, a przeciwna guanina (G) - cytozyna (C). Schematycznie wygląda tak:
G - C
T - A
W
Ta właściwość komplementarności jest kluczowa dla PCR.

Oprócz DNA, RNA ma tę samą strukturę - kwas rybonukleinowy, który różni się od DNA tym, że wykorzystuje uracyl zamiast tyminy. RNA - przechowuje informacje genetyczne niektórych wirusów, zwanych retrowirusami (na przykład HIV).

Cząsteczki DNA i RNA mogą się „mnożyć” (ta właściwość jest używana do PCR). Dzieje się to w następujący sposób: dwie nici DNA lub RNA odsuwają się od siebie na boki, na każdej nitce znajduje się specjalny enzym, który syntetyzuje nowy łańcuch. Synteza przebiega zgodnie z zasadą komplementarności, to znaczy, jeśli nukleotyd A znajduje się w pierwotnym łańcuchu DNA, to T będzie w nowo zsyntetyzowanym, jeśli G - to C itd. Ten specjalny „budowniczy” enzym potrzebuje „ziarna” – sekwencji 5-15 nukleotydów – aby rozpocząć syntezę. To „nasiono” jest zdefiniowane dla każdego genu (gen chlamydii, mykoplazmy, wirusy) eksperymentalnie.

Tak więc każdy cykl PCR składa się z trzech etapów. W pierwszym etapie następuje tak zwane odwijanie DNA - czyli oddzielenie dwóch połączonych ze sobą nici DNA. W drugim „ziarno” jest przyczepione do odcinka nici DNA. I wreszcie wydłużenie tych nici DNA, które jest wytwarzane przez enzym „budowniczy”. Obecnie cały ten złożony proces odbywa się w jednej probówce i składa się z powtarzających się cykli reprodukcji określonego DNA w celu uzyskania dużej liczby kopii, które można następnie wykryć konwencjonalnymi metodami. Oznacza to, że z jednej nici DNA otrzymujemy setki lub tysiące.

Etapy badania PCR

Zbieranie materiału biologicznego do badań

Za próbkę służy różnorodny materiał biologiczny: krew i jej składniki, mocz, ślina, wydzieliny błon śluzowych, płyn mózgowo-rdzeniowy, wydzielina z powierzchni ran, zawartość jam ciała. Wszystkie biopróbki są pobierane za pomocą jednorazowych instrumentów, a zebrany materiał jest umieszczany w sterylnych plastikowych probówkach lub umieszczany na pożywce hodowlanej, a następnie transportowany do laboratorium.

Niezbędne odczynniki są dodawane do pobranych próbek i umieszczane w programowalnym termostacie – termocyklerze (wzmacniaczu). W cyklerze cykl PCR powtarza się 30-50 razy, składający się z trzech etapów (denaturacja, annealing i elongacja). Co to znaczy? Rozważmy bardziej szczegółowo.

Etapy natychmiastowej reakcji PCR, kopiowanie materiału genetycznego

IEtap PCR - Przygotowanie materiału genetycznego do kopiowania.
Występuje w temperaturze 95 ° C, podczas gdy nici DNA są odłączone, a „nasiona” mogą na nich siedzieć.

„Nasiona” są produkowane przemysłowo przez różne stowarzyszenia badawczo-produkcyjne, a laboratoria kupują gotowe. Jednocześnie „ziarno” do wykrywania na przykład chlamydii działa tylko na chlamydię itp. Tak więc, jeśli biomateriał jest testowany na obecność infekcji chlamydiami, wówczas „ziarno” chlamydii jest umieszczane w mieszaninie reakcyjnej; w przypadku testowania biomateriału na obecność wirusa Epstein-Barr, to „nasiono” wirusa Epstein-Barr.

IIetap - Łączenie materiału genetycznego czynnika zakaźnego i „nasienia”.
Jeśli istnieje DNA wirusa lub bakterii, które mają zostać określone, „nasiono” znajduje się na tym DNA. Ten proces dodawania startera jest drugim etapem PCR. Ten etap odbywa się w temperaturze 75°C.

IIIetap - Kopiowanie materiału genetycznego czynnika zakaźnego.
Jest to proces faktycznego wydłużania lub reprodukcji materiału genetycznego, który zachodzi w temperaturze 72°C. Budowniczy enzymu zbliża się do „nasion” i syntetyzuje nową nić DNA. Wraz z zakończeniem syntezy nowej nici DNA kończy się również cykl PCR. Oznacza to, że w jednym cyklu PCR ilość materiału genetycznego podwaja się. Np. w początkowej próbce było 100 cząsteczek DNA wirusa, po pierwszym cyklu PCR w próbce będzie już 200 cząsteczek DNA badanego wirusa. Jeden cykl trwa 2-3 minuty.

W celu wygenerowania wystarczającej ilości materiału genetycznego do identyfikacji wykonuje się zwykle 30-50 cykli PCR, co zajmuje 2-3 godziny.

Etap identyfikacji rozmnożonego materiału genetycznego

Tu kończy się sam PCR, a potem następuje równie istotny etap identyfikacji. Do identyfikacji stosuje się elektroforezę lub oznakowane „nasiona”. Podczas korzystania z elektroforezy powstałe nici DNA są rozdzielone wielkością, a obecność fragmentów DNA o różnych długościach wskazuje na pozytywny wynik analizy (to znaczy na obecność określonego wirusa, bakterii itp.). Stosując znakowane „nasiona”, do końcowego produktu reakcji dodaje się chromogen (barwnik), w wyniku czego reakcji enzymatycznej towarzyszy powstawanie koloru. Pojawienie się koloru wskazuje bezpośrednio na obecność wirusa lub innego wykrywalnego czynnika w oryginalnej próbce.

Dziś, przy użyciu oznaczonych „nasion”, a także odpowiedniego oprogramowania, można od razu „odczytać” wyniki PCR. Jest to tak zwany PCR w czasie rzeczywistym.

Dlaczego diagnostyka PCR jest tak cenna?

Jedną z istotnych zalet metody PCR jest jej wysoka czułość – od 95 do 100%. Jednak zalety te muszą opierać się na niezbędnym przestrzeganiu następujących warunków:

1. prawidłowe pobieranie próbek, transport materiału biologicznego;
2. dostępność sterylnych, jednorazowych instrumentów, specjalnych laboratoriów i przeszkolonego personelu;
3. ścisłe przestrzeganie metodologii i sterylność podczas analizy

Czułość różni się dla różnych wykrytych drobnoustrojów. Na przykład czułość metody PCR do wykrywania wirusa zapalenia wątroby typu C wynosi 97-98%, czułość wykrywania ureaplazmy wynosi 99-100%.

Możliwości tkwiące w analizie PCR pozwalają osiągnąć niezrównaną specyficzność analityczną. Oznacza to dokładne zidentyfikowanie poszukiwanego mikroorganizmu, a nie podobnego lub blisko spokrewnionego.
Czułość i swoistość diagnostyczna metody PCR często przewyższa czułość i specyficzność metody hodowlanej, która jest nazywana „złotym standardem” wykrywania chorób zakaźnych. Biorąc pod uwagę czas wzrostu hodowli (od kilku dni do kilku tygodni) przewaga metody PCR staje się oczywista.

PCR w diagnostyce infekcji
Zalety metody PCR (czułość i swoistość) determinują szerokie spektrum zastosowań we współczesnej medycynie.
Główne obszary zastosowania diagnostyki PCR:

1. diagnostyka ostrych i przewlekłych chorób zakaźnych o różnej lokalizacji
2. monitorowanie skuteczności terapii
3. wyjaśnienie rodzaju patogenu

PCR jest stosowany w położnictwie, ginekologii, neonatologii, pediatrii, urologii, wenerologii, nefrologii, klinice chorób zakaźnych, okulistyce, neurologii, fthisiopulmonologii itp.

Zastosowanie diagnostyki PCR odbywa się w połączeniu z innymi metodami badawczymi (ELISA, PIF, RIF itp.). Ich połączenie i celowość określa lekarz prowadzący.

Czynniki zakaźne wykryte przez PCR

Wirusy:

1. Retrowirusy HIV-1 i HIV-2
2. wirusy opryszczkowe
3. wirus opryszczki pospolitej typu 1 i 2

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)- eksperymentalna metoda biologii molekularnej, czyli swoista amplifikacja kwasów nukleinowych indukowana syntetycznymi starterami oligonukleotydowymi in vitro.

Pomysł na opracowanie metody PCR należy do amerykańskiego badacza Kary Mullisa, który w 1983 roku stworzył metodę, która umożliwiła amplifikację DNA podczas cyklicznego podwajania za pomocą enzymu polimerazy DNA w sztucznych warunkach. Kilka lat po opublikowaniu tego pomysłu, w 1993 roku, K. Mullis otrzymał za niego Nagrodę Nobla.

Na początku stosowania metody, po każdym cyklu grzania-chłodzenia, konieczne było dodanie do mieszaniny reakcyjnej polimerazy DNA, która szybko ulegała inaktywacji w wysokiej temperaturze. Procedura była bardzo nieefektywna, wymagała dużo czasu i enzymu. W 1986 roku został znacząco zmodyfikowany przez zastosowanie polimerazy DNA z bakterii termofilnych. Enzymy te są w stanie wytrzymać wiele cykli reakcji, co pozwala zautomatyzować PCR. Jedna z najczęściej stosowanych termostabilnych polimeraz DNA została wyizolowana z bakterii. Thermus aquaticus i nazwany Taq-polimeraza DNA.

Istota metody. Metoda opiera się na wielokrotnym selektywnym kopiowaniu określonego regionu DNA przy użyciu enzymu polimerazy Taq-DNA. Reakcja łańcuchowa polimerazy umożliwia uzyskanie amplifikatów o długości do kilku tysięcy par zasad. Aby zwiększyć długość produktu PCR do 20-40 tysięcy par zasad, stosuje się mieszaninę różnych polimeraz, ale wciąż jest to znacznie mniej niż długość chromosomalnego DNA komórki eukariotycznej.

Reakcja odbywa się w programowalnym termostacie (wzmacniaczu) - urządzeniu, które może przeprowadzić wystarczająco szybko

chłodzenie i ogrzewanie probówek (zwykle z dokładnością co najmniej 0,1°C). Wzmacniacze pozwalają na ustawianie złożonych programów, w tym tych z możliwością „gorącego startu” i późniejszego przechowywania. Do PCR w czasie rzeczywistym produkowane są urządzenia wyposażone w detektor fluorescencyjny. Instrumenty są również dostępne z automatyczną pokrywą i komorą na mikropłytki, co umożliwia ich integrację z systemami automatycznymi.

Zwykle podczas PCR wykonuje się 20-45 cykli, z których każdy składa się z trzech etapów: denaturacji, przyłączania starterów, elongacji (ryc. 6.1 i 6.2). Na ryc. 6.1 pokazuje dynamikę zmian temperatury w probówce podczas cyklu PCR.

Ryż. 6.1. Wykres zmiany temperatury w probówce podczas jednego cyklu reakcji łańcuchowej polimerazy

Denaturacja matrycy DNA przeprowadza się przez ogrzewanie mieszaniny reakcyjnej do 94-96°C przez 5-90 s tak, aby łańcuchy DNA uległy rozproszeniu. Należy zauważyć, że przed pierwszym cyklem mieszanina reakcyjna jest podgrzewana przez 2-5 min w celu całkowitej denaturacji macierzy wyjściowej, co pozwala na zmniejszenie ilości niespecyficznych produktów reakcji.

Ryż. 6.2. Schemat pierwszego cyklu reakcji łańcuchowej polimerazy

Etap wyżarzania podkładu. Wraz ze stopniowym spadkiem temperatury startery wiążą się komplementarnie z matrycą. Temperatura wyżarzania zależy od składu podkładów i jest zwykle o 4-5°C niższa niż obliczona temperatura topnienia. Czas trwania etapu to 5-60 s.

W kolejnym etapie - wydłużenie- w macierzy matki zachodzi synteza potomnej nici DNA. Temperatura wydłużania zależy od polimerazy. Powszechnie stosowane polimerazy DNA Taq i Pfu są najbardziej aktywne w 72°C. Czas elongacji, głównie zależny od długości produktu PCR, wynosi zazwyczaj 1 minutę na 1000 par zasad.

Co pozwala na wykrycie w materiale biologicznym niewielkich ilości, a dokładniej pewnych jego fragmentów, i ich wielokrotne pomnożenie. Następnie identyfikuje się je wizualnie za pomocą elektroforezy żelowej. Reakcja została opracowana w 1983 roku przez K. Mullisa i wpisana na listę wybitnych odkryć ostatnich lat.

Jakie są mechanizmy PCR

Cała technika opiera się na zdolności kwasów nukleinowych do samoreplikacji, którą w tym przypadku przeprowadza się sztucznie w laboratorium. Reprodukcja DNA nie może rozpocząć się w żadnym regionie cząsteczki, ale tylko w regionach o określonej sekwencji nukleotydowej - fragmentach początkowych. Aby rozpoczęła się reakcja łańcuchowa polimerazy, potrzebne są startery (lub sondy DNA). Są to krótkie fragmenty łańcucha DNA o określonej sekwencji nukleotydowej. Są komplementarne (czyli odpowiadające) do miejsc startowych

Oczywiście, aby stworzyć startery, naukowcy muszą zbadać sekwencję nukleotydową podmiotu zaangażowanego w technikę. To właśnie te sondy DNA zapewniają specyficzność reakcji i jej inicjację. nie zadziała, jeśli w próbce nie zostanie znaleziona co najmniej jedna cząsteczka pożądanego DNA. Ogólnie rzecz biorąc, powyższe startery, zestaw nukleotydów, odporna na ciepło polimeraza DNA są niezbędne do zajścia reakcji. Ten ostatni to enzym, który katalizuje syntezę nowych cząsteczek kwasu nukleinowego na podstawie próbki. Wszystkie te substancje, w tym materiał biologiczny, w którym konieczne jest wykrycie DNA, łączy się w mieszaninę reakcyjną (roztwór). Umieszczony jest w specjalnym termostacie, który wykonuje bardzo szybkie nagrzewanie i schładzanie przez zadany czas – cykl. Zwykle jest ich 30-50.

Jak przebiega ta reakcja?

Jego istotą jest to, że podczas jednego cyklu startery są przyłączane do pożądanych odcinków DNA, po czym podwajają się pod wpływem działania enzymu. Na podstawie powstałych nici DNA w kolejnych cyklach syntetyzowane są nowe i nowe identyczne fragmenty cząsteczki.

Reakcja łańcuchowa polimerazy przebiega sekwencyjnie, rozróżnia się jej kolejne etapy. Pierwszy charakteryzuje się podwojeniem ilości produktu podczas każdego cyklu ogrzewania i chłodzenia. W drugim etapie reakcja ulega spowolnieniu, ponieważ enzym ulega uszkodzeniu, a także traci aktywność. Ponadto wyczerpane są rezerwy nukleotydów i starterów. Na ostatnim etapie - plateau - produkty już się nie gromadzą, ponieważ skończyły się odczynniki.

Gdzie jest używany

Niewątpliwie reakcja łańcuchowa polimerazy znajduje najszersze zastosowanie w medycynie i nauce. Znajduje zastosowanie w biologii ogólnej i prywatnej, weterynarii, farmacji, a nawet ekologii. Co więcej, w tych ostatnich robią to w celu monitorowania jakości produktów spożywczych i obiektów środowiskowych. Reakcja łańcuchowa polimerazy jest aktywnie wykorzystywana w praktyce sądowej w celu potwierdzenia ojcostwa i identyfikacji osoby. W kryminalistyce, a także w paleontologii, ta technika jest często jedynym wyjściem, ponieważ zwykle bardzo mało DNA jest dostępne do badań. Oczywiście metoda znalazła bardzo szerokie zastosowanie w medycynie praktycznej. Jest niezbędny w takich dziedzinach jak genetyka, choroby zakaźne i onkologiczne.

Witryna zawiera informacje referencyjne wyłącznie w celach informacyjnych. Diagnostyka i leczenie chorób powinno odbywać się pod nadzorem specjalisty. Wszystkie leki mają przeciwwskazania. Wymagana jest porada eksperta!

metoda reakcja łańcuchowa polimerazy została odkryta prawie trzydzieści lat temu przez amerykańskiego naukowca o nazwisku Carrie Mullis. Technika ta jest szeroko stosowana w medycynie jako narzędzie diagnostyczne, a jej istotą jest kopiowanie odcinka DNA za pomocą specjalnego enzymu ( polimeraza) sztucznie in vitro.

W jakich dziedzinach medycyny stosowana jest ta metoda?

Do czego służy kopiowanie DNA i jak może służyć medycynie?
Ta technika pozwala:

• Wyizoluj i sklonuj geny.
• Diagnozuj choroby genetyczne i zakaźne.
• Ustal ojcostwo. Dziecko dziedziczy niektóre cechy genetyczne od swoich biologicznych rodziców, ale ma swoją własną unikalną tożsamość genetyczną. Obecność w nim niektórych genów, które są identyczne z genami rodzicielskimi – pozwala mówić o ustanowieniu pokrewieństwa.

Reakcja łańcuchowa polimerazy jest również stosowana w praktyce sądowej.

Na miejscu zbrodni kryminalistyczni zbierają próbki materiałów genetycznych. Należą do nich: włosy, ślina, krew. Następnie, dzięki technice reakcji polimerazy, możliwa jest amplifikacja DNA i porównanie tożsamości pobranej próbki z materiałem genetycznym osoby podejrzanej.

W medycynie skutecznie wykorzystuje się reakcję łańcuchową polimerazy:

• W praktyce pulmonologicznej - do różnicowania bakteryjnych i wirusowych typów zapalenia płuc, gruźlicy.
• W praktyce ginekologicznej i urologicznej - w celu określenia ureaplazmozy, chlamydii, infekcji mykoplazmą, gardnerelozy, opryszczki, rzeżączki.
• w praktyce gastroenterologicznej.
• W hematologii - w celu określenia zakażenia onkowirusami i cytomegalowirusem.
• W ekspresowej diagnostyce takich chorób zakaźnych jak wirusowe zapalenie wątroby, błonica, salmonelloza.

Obecnie ta metoda jest najszerzej stosowana w diagnostyce chorób zakaźnych ( zapalenie wątroby o etiologii wirusowej, HIV, choroby przenoszone drogą płciową, gruźlica, kleszczowe zapalenie mózgu).

Co się dzieje podczas reakcji?

Sama reakcja jest chemicznie prosta. Kropla krwi, włos, kawałek skóry itp. mogą służyć jako źródło DNA do reakcji. Teoretycznie reakcja wymaga odpowiednich odczynników, probówki, próbki materiału biologicznego i źródła ciepła.

Reakcja polimerazy umożliwia wykrycie infekcji, nawet jeśli w próbce z materiałem biologicznym obecna jest tylko jedna lub kilka cząsteczek DNA patogenu.

W trakcie reakcji pod wpływem enzymu polimerazy DNA dochodzi do podwojenia ( replikacja) fragment DNA. Sam kwas dezoksyrybonukleinowy DNA w skrócie) jest dla nas ważne, ponieważ zapewnia przechowywanie i przekazywanie informacji genetycznej komórkom potomnym. DNA ma postać spirali, która składa się z powtarzających się bloków. Te bloki tworzą nukleotydy, które są najmniejszą jednostką DNA. Nukleotydy powstają z aminokwasów.

Proces replikacji odcinków DNA zachodzi podczas powtarzających się cykli. W każdym takim cyklu nie tylko oryginalny fragment DNA jest kopiowany i podwajany, ale także te fragmenty, które już podwoiły się w poprzednim cyklu amplifikacji. Wszystko to przypomina proces postępu geometrycznego.

Istnieje:

• naturalne wzmocnienie ( czyli proces kopiowania i mnożenia DNA), która zachodzi w naszym ciele i jest deterministycznym, z góry określonym procesem.
• Sztuczna amplifikacja, która zachodzi w wyniku reakcji łańcuchowej polimerazy. W tym przypadku proces kopiowania jest kontrolowany i umożliwia powielanie nawet krótkich odcinków kwasu nukleinowego.

Po zakończeniu każdego cyklu kopiowania liczba fragmentów kwasu nukleinowego rośnie wykładniczo. Dlatego sam proces nazywa się „reakcją łańcuchową”.

Po trzydziestu do czterdziestu cyklach liczba fragmentów sięga kilku miliardów.

Do wzmocnienia in vitro (in vitro) konieczne jest, aby w pobranym do diagnostyki biopożywce znajdował się określony obcy fragment DNA ( to znaczy nie DNA pacjenta, ale patogen). Jeśli w utworzonym roztworze nie ma określonego fragmentu, reakcja łańcuchowa pod działaniem polimerazy nie rozpocznie się. To wyjaśnia fakt wysokiej specyficzności PCR.

Etapy diagnostyki PCR

1. Z materiału testowego izoluje się DNA.
2. DNA dodaje się do specjalnego roztworu nukleotydów.
3. Roztwór jest podgrzewany do temperatury 90 – 95 stopni Celsjusza, dzięki czemu białko DNA fałduje się.
4. Zmniejsz temperaturę do 60 stopni.
5. W miarę powtarzania się cykli wzrostu i spadku temperatury liczba segmentów kwasu nukleinowego wzrasta.

6. Przeprowadzając elektroforezę, sumuje się wynik i oblicza wyniki podwojenia.

Jakie są zalety tej diagnostyki?

• Wszechstronność: Do tej metody nadaje się każda próbka kwasu nukleinowego.
• Wysoka specyficzność: patogen posiada unikalne sekwencje DNA, które są dla niego specyficzne. Dzięki temu wyniki wykonanej reakcji PCR będą wiarygodne, nie da się pomylić genu jednego patogenu z genem innego patogenu.
• Wrażliwość na obecność nawet pojedynczej cząsteczki patogenu.

• Niewielka ilość materiału potrzebna do badań. Wystarczy kropla krwi. Możliwość uzyskania wyniku przy minimalnej objętości próbki jest bardzo ważna w badaniach pediatrycznych, neonatologicznych, neurologicznych, a także w praktyce medycyny sądowej.
• Możliwość identyfikacji powolnej, przewlekłej infekcji, a nie tylko ostrej.
• Wiele chorobotwórczych kultur bardzo trudno jest hodować w probówce innymi metodami, a reakcja polimerazy pozwala na propagację kultury w odpowiedniej ilości.

Jakie są wady tej diagnostyki?

• Jeśli materiał przeznaczony do PCR zawiera DNA nie tylko żywego patogenu, ale także zmarłego, oba DNA zostaną zamplifikowane. W związku z tym leczenie po postawieniu diagnozy może nie być całkowicie prawidłowe. Po pewnym czasie lepiej zdać kontrolę skuteczności leczenia.
• Nadwrażliwość na obecność drobnoustrojów można również uznać w pewien sposób za wadę. W końcu normalnie w ludzkim ciele występuje warunkowo patogenna mikroflora, to znaczy są to mikroorganizmy żyjące w jelitach, żołądku i innych narządach wewnętrznych. Te mikroorganizmy mogą zaszkodzić osobie tylko w pewnych niesprzyjających warunkach - nieprzestrzeganie wymagań higienicznych, zanieczyszczona woda pitna itp. Technika PCR wzmacnia DNA nawet tych mikroorganizmów, chociaż nie prowadzą one do patologii.
• PCR różnych systemów testowych może wykazywać wyniki, które będą się od siebie różnić. Istnieje wiele modyfikacji tej techniki: zagnieżdżone», « asymetryczny», « odwrotny», « ilościowy» PCR i inne.

Federalna Agencja ds. Edukacji

Państwowa instytucja edukacyjna

Wyższe wykształcenie zawodowe

„Państwowa Akademia Pedagogiczna w Karelii”

Zajęcia na ten temat:

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) i jej zastosowanie

Wypełnił: studentka Koryagina Valeria Aleksandrowna

Sprawdził: Karpikova Natalia Michajłowna

Pietrozawodsk 2013

Wstęp

Rozdział 1 Przegląd literatury

1.5.4 Efekt płaskowyżu

1.5.6 Wzmocnienie

Wniosek

Wstęp

Ostatnie dwadzieścia lat to okres powszechnego wprowadzania metod genetyki molekularnej do nauk biologicznych, medycznych i rolniczych.

Na początku lat 70. wydawało się, że biologia molekularna osiągnęła pewien stopień doskonałości. W tym okresie głównym przedmiotem badań genetyki molekularnej były mikroorganizmy. Przejście do eukariontów postawiło badaczy przed zupełnie nowymi problemami, których nie można było rozwiązać za pomocą istniejących wówczas metod analizy genetycznej. Przełom w rozwoju genetyki molekularnej stał się możliwy dzięki pojawieniu się nowego narzędzia eksperymentalnego - endonukleaz restrykcyjnych. W kolejnych latach liczba metod bezpośredniej analizy DNA, opartych na jakościowo różnych podejściach, zaczęła gwałtownie rosnąć.

W wielu przypadkach nowoczesne technologie umożliwiły rozpoczęcie badania na głębszym poziomie dokładnej organizacji strukturalnej i funkcjonalnej genomów jądrowych i pozajądrowych różnych organizmów. Miało to szczególne znaczenie dla rozwoju nowych metod diagnozowania i leczenia różnych chorób. Nie mniej ważna była możliwość wykorzystania osiągnięć genetyki molekularnej w biologii populacji i hodowli do identyfikacji i analizy zmienności genetycznej populacji, odmian i szczepów, identyfikacji i certyfikacji osobników wartościowych gospodarczo, tworzenia organizmów modyfikowanych genetycznie oraz rozwiązywania innych problemów.

Każda metoda ma swoje zalety i wady. Nie ma uniwersalnej metody, która mogłaby rozwiązać wszystkie pojawiające się problemy. Dlatego wybór konkretnej metody do prowadzonych badań jest jednym z najważniejszych etapów każdej pracy naukowej.

Rozdział 1 Przegląd literatury

1.1 Historia odkrycia reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)

W 1983 roku K.B. Mullis i wsp. opublikowali i opatentowali metodę reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), która miała wywrzeć głęboki wpływ na wszystkie obszary badań i zastosowań kwasów nukleinowych. Znaczenie tej metody dla biologii molekularnej i genetyki okazało się tak wielkie i oczywiste, że siedem lat później autor otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii.

Na początku stosowania metody, po każdym cyklu grzania-chłodzenia, do mieszaniny reakcyjnej trzeba było dodać polimerazę DNA, ponieważ była ona inaktywowana w wysokiej temperaturze niezbędnej do rozdzielenia łańcuchów helisy DNA. Procedura reakcji była stosunkowo nieefektywna, wymagała dużo czasu i enzymu. W 1986 roku znacznie udoskonalono metodę reakcji łańcuchowej polimerazy. Zaproponowano zastosowanie polimeraz DNA z bakterii termofilnych. Enzymy te okazały się termostabilne i były w stanie wytrzymać wiele cykli reakcji. Ich zastosowanie umożliwiło uproszczenie i automatyzację PCR. Jedna z pierwszych termostabilnych polimeraz DNA została wyizolowana z bakterii Thermus aquaticusi nazwany Taq-polimeraza.

Możliwość amplifikacji dowolnego segmentu DNA, którego sekwencja nukleotydowa jest znana, i otrzymanie jej po PCR w postaci jednorodnej i ilości preparatywnej, czyni PCR alternatywną metodą klonowania molekularnego krótkich fragmentów DNA. W tym przypadku nie ma potrzeby stosowania skomplikowanych technik metodologicznych, które są wykorzystywane w inżynierii genetycznej w klonowaniu konwencjonalnym. Rozwój metody PCR znacznie rozszerzył możliwości metodologiczne genetyki molekularnej, aw szczególności inżynierii genetycznej, do tego stopnia, że ​​radykalnie zmienił i wzmocnił potencjał naukowy wielu jej dziedzin.

1.2 Odmiany reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)

· Zagnieżdżony PCR- stosowany w celu zmniejszenia liczby produktów ubocznych reakcji. Użyj dwóch par starterów i przeprowadź dwie kolejne reakcje. Druga para starterów amplifikuje region DNA w produkcie pierwszej reakcji.

· Odwrócony PCR- jest używany, gdy znany jest tylko mały obszar w pożądanej kolejności. Metoda ta jest szczególnie przydatna, gdy konieczne jest określenie sąsiednich sekwencji po wstawieniu DNA do genomu. W celu wdrożenia odwróconego PCR przeprowadza się serię cięć DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych<#"justify">starter do reakcji łańcuchowej polimerazy

· PCR specyficzny dla grupy- PCR dla krewnych<#"center">1.3 Reakcja łańcuchowa polimerazy

Odkryta w połowie lat 80. reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) może zwiększyć liczbę kopii oryginalnej próbki miliony razy w ciągu kilku godzin. Podczas każdego cyklu reakcji z oryginalnej cząsteczki powstają dwie kopie. Każda ze zsyntetyzowanych kopii DNA może służyć jako matryca do syntezy nowych kopii DNA w następnym cyklu. Tak więc wielokrotne powtarzanie cykli prowadzi do wykładniczego wzrostu liczby kopii. Z obliczeń wynika, że ​​nawet przy 30 cyklach liczba kopii oryginalnej cząsteczki wyniesie ponad 1 miliard. Nawet jeśli weźmiemy pod uwagę, że nie wszystkie amplikony są duplikowane w każdym cyklu, łączna liczba kopii mimo to jest dość duża.

Każdy cykl reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) składa się z następujących etapów:

· Denaturacja - wzrost temperatury powoduje, że dwuniciowa cząsteczka DNA rozwija się i dzieli na dwie jednoniciowe;

· Annealing - Obniżenie temperatury umożliwia starterom przyłączenie się do komplementarnych regionów cząsteczki DNA;

· Elongacja - enzym polimeraza DNA uzupełnia nić komplementarną.

Do amplifikacji wybranego fragmentu stosuje się dwa startery oligonukleotydowe (ziarna) flankujące określony region DNA. Podkłady zorientowane 3 - kończy się ku sobie i w kierunku sekwencji, którą należy wzmocnić. Polimeraza DNA przeprowadza syntezę (uzupełnienie) wzajemnie komplementarnych łańcuchów DNA, zaczynając od starterów. Podczas syntezy DNA startery są fizycznie wstawiane do łańcucha nowo syntetyzowanych cząsteczek DNA. Każda nić cząsteczki DNA utworzona przy użyciu jednego ze starterów może służyć jako matryca do syntezy komplementarnej nici DNA przy użyciu drugiego startera.

1.4 Przeprowadzanie reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)

Reakcja łańcuchowa polimerazy przeprowadzana jest w specjalnych cienkościennych probówkach polipropylenowych, kompatybilnych rozmiarem z zastosowanym termocyklerem (wzmacniaczem) - urządzeniem kontrolującym charakterystykę temperaturową i czasową etapów reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) .

1.5 Zasada metody reakcji łańcuchowej polimerazy

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) to metoda amplifikacji DNA in vitro, która umożliwia wyizolowanie i powielenie określonej sekwencji DNA miliardy razy w ciągu kilku godzin. Możliwość uzyskania ogromnej liczby kopii jednego ściśle określonego regionu genomu znacznie upraszcza badanie istniejącej próbki DNA.

Aby przeprowadzić reakcję łańcuchową polimerazy, należy spełnić szereg warunków:

1.5.1 Obecność wielu składników w mieszaninie reakcyjnej

Głównymi składnikami mieszaniny reakcyjnej (PCR) są: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, mieszanina trifosforanów nukleotydów (ATP, GTP, CTP, TTP), starterów (oligonukleotydów), analizowanego preparatu DNA, termostabilnej polimerazy DNA. Każdy ze składników mieszaniny reakcyjnej jest bezpośrednio zaangażowany w łańcuchową reakcję polimerazy (PCR), a stężenie odczynników bezpośrednio wpływa na przebieg amplifikacji.

· Tris-HCl - określa pH mieszaniny reakcyjnej, tworzy pojemność buforową. Aktywność polimerazy DNA zależy od pH podłoża, więc wartość pH bezpośrednio wpływa na przebieg reakcji łańcuchowej polimerazy. Zwykle wartość pH mieści się w zakresie 8 - 9,5. Wysokie pH wynika z faktu, że wraz ze wzrostem temperatury pH buforu Tril-HCl spada.

· KCl - stężenie chlorku potasu do 50 mm wpływa na przebieg procesów denaturacji i wygrzewania, stężenie powyżej 50 mm hamuje polimerazę DNA.

· MgCl 2- ponieważ polimeraza DNA to Mg 2+- enzym zależny, wówczas stężenie jonów magnezu wpływa na aktywność enzymu (Mg 2+tworzy kompleksy z NTP - to właśnie te kompleksy są substratem dla polimerazy). Wysokie stężenie prowadzi do wzrostu niespecyficznej amplifikacji, a niskie do hamowania reakcji, optimum (dla różnych polimeraz) mieści się w zakresie 0,5-5 mM. Dodatkowo stężenie soli magnezu wpływa na przebieg procesów denaturacji i wyżarzania – wzrost stężenia Mg 2+powoduje wzrost temperatury topnienia DNA (tj. temperatury, w której 50% dwuniciowych nici DNA jest rozbijanych na jednoniciowe nici).

· NTP - trifosforany nukleotydów to bezpośrednie monomery kwasów nukleinowych. Aby zapobiec terminacji łańcucha, zaleca się równy stosunek wszystkich czterech trifosforanów nukleotydów. Niskie stężenie tych składników w mieszaninie reakcyjnej zwiększa prawdopodobieństwo błędów w budowie komplementarnej nici DNA.

· Podkłady - Najbardziej optymalne jest stosowanie podkładów o różnicy temperatur topnienia nie większej niż 2 - 4 o C. Czasami podczas długotrwałego przechowywania w temperaturze 4 o Przy lub po dużej ilości zamrażania - rozmrażania startery tworzą struktury drugorzędowe - dimery, zmniejszając wydajność PCR. Eliminacja tego problemu sprowadza się do inkubacji w łaźni wodnej (T=95 o C) przez 3 minuty, a następnie szybkie schłodzenie do 0°C Z.

· Preparaty DNA - ilość i jakość preparatu (matrycy) DNA bezpośrednio wpływa na przebieg i parametry reakcji łańcuchowej polimerazy. Nadmiar próbki DNA hamuje reakcję łańcuchową polimerazy (PCR). Zanieczyszczenia różnymi substancjami w preparacie DNA mogą również zmniejszać wydajność reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR): octan sodu, chlorek sodu, izopropanol, etanol, heparyna, fenol, mocznik, hemoglobina itp.

· Polimeraza DNA - przy użyciu niewielkiej ilości polimerazy DNA obserwuje się spadek syntezy produktu końcowego wprost proporcjonalnie do wielkości fragmentów. Nadmiar polimerazy 2–4 razy prowadzi do pojawienia się widm rozproszonych, a 4–16 razy widm niespecyficznych o niskiej masie cząsteczkowej. Stosowany zakres stężeń wynosi 0,5 - 1,5 jednostki aktywności w przeliczeniu na 25 µl mieszaniny PCR.

Oprócz głównych składników mieszaniny PCR stosuje się szereg dodatkowych substancji, które poprawiają jakościowe i ilościowe wskaźniki PCR: acetamid (5%) - wzrost rozpuszczalności głównych składników; betaina (sól sodowa) – stabilizacja polimerazy DNA, obniżenie temperatury topnienia DNA, wyrównanie temperatury topnienia; albumina bydlęca (10-100 μg / ml) - stabilizacja polimerazy DNA; dimetylosulfotlenek (1-10%) - zwiększający rozpuszczalność głównych składników; formamid (2-10%) - wzrost specyficzności wygrzewania; glicerol (15-20%) - wzrost stabilności termicznej enzymu, obniżenie temperatury denaturacji próbki DNA; siarczan amonu - obniżenie temperatury denaturacji i wyżarzania.

1.5.2 Cykl i temperatura

Ogólny widok programu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) jest następujący:

etap. Przedłużona pierwotna denaturacja preparatu DNA.1 cykl

etap. Szybka denaturacja preparatu DNA. Wyżarzanie podkładu. Wydłużenie.30 - 45 cykli.

etap. Przedłużone wydłużenie. Chłodzenie mieszaniny reakcyjnej 1 cykl.

Każdy element etapu – denaturacja, wyżarzanie, wydłużenie – posiada indywidualną charakterystykę temperaturową i czasową. Parametry temperatury i czasu przepływu każdego pierwiastka dobierane są empirycznie, zgodnie z jakościowymi i ilościowymi wskaźnikami produktów amplifikacji.

Denaturacja. Podczas tego elementu reakcji łańcuchowej polimerazy dwuniciowa cząsteczka DNA zostaje podzielona na dwie jednoniciowe. Parametry temperaturowe denaturacji mieszczą się w zakresie 90 - 95 o C, ale w przypadku próbki DNA z dużą zawartością guaniny i cytozyny temperaturę należy podnieść do 98 o C. Temperatura denaturacji powinna być wystarczająca do całkowitej denaturacji – rozszczepienia nici DNA i uniknięcia „nagłego ochłodzenia” lub szybkiego przyłączania, jednak termostabilna polimeraza DNA jest mniej stabilna w wysokich temperaturach. Zatem dobór optymalnych parametrów temperatury denaturacji dla stosunku starter/próbka (preparat DNA) jest ważnym warunkiem amplifikacji. Jeśli temperatura denaturacji w pierwszym kroku jest wyższa niż 95 o C, zaleca się dodanie polimerazy DNA do mieszaniny reakcyjnej po pierwotnej denaturacji. Czas trwania tego elementu etapu podczas reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) powinien być wystarczający do całkowitej denaturacji DNA, ale jednocześnie nie wpływać znacząco na aktywność polimerazy DNA w danej temperaturze.

Wyżarzanie. Temperatura wyżarzania (T a ) jest jednym z najważniejszych parametrów reakcji łańcuchowej polimerazy. Temperatura wyżarzania dla każdego konkretnego startera jest dobierana indywidualnie. Zależy to od długości i składu nukleotydowego startera. Zwykle jest niższa o 2 - 4 o Od wartości temperatury topnienia (T m ) Elementarz. Jeżeli temperatura wyżarzania układu jest poniżej optimum, to liczba niespecyficznych amplifikowanych fragmentów wzrasta i odwrotnie, wyższa temperatura zmniejsza liczbę amplifikowanych produktów. W takim przypadku stężenie określonych amplikonów może gwałtownie spaść, aż do zahamowania reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Wydłużenie czasu annealingu prowadzi również do wzrostu liczby niespecyficznych amplikonów.

Wydłużenie. Zazwyczaj każdy rodzaj termostabilnej polimerazy DNA ma indywidualny optimum temperaturowe aktywności. Szybkość syntezy komplementarnej nici DNA przez enzym jest również wartością specyficzną dla każdej polimerazy (średnio wynosi 30–60 nukleotydów na sekundę lub 1–2 tys. zasad na minutę), więc czas elongacji dobierany jest w zależności od na typ polimerazy DNA i długość amplifikowanego regionu.

1.5.3 Podstawowe zasady doboru podkładów

Podczas tworzenia systemu testowego PCR jednym z głównych zadań jest prawidłowy dobór starterów, które muszą spełniać szereg kryteriów:

Podkłady muszą być konkretne. Szczególną uwagę zwraca się na 3 - końce starterów, ponieważ to od nich polimeraza Taq zaczyna uzupełniać komplementarny łańcuch DNA. Jeżeli ich specyficzność jest niewystarczająca, to prawdopodobne jest, że w probówce z mieszaniną reakcyjną zajdą niepożądane procesy, a mianowicie synteza niespecyficznego DNA (krótkie lub długie fragmenty). Widoczny jest na elektroforezie w postaci ciężkich lub lekkich dodatkowych prążków. Utrudnia to ocenę wyników reakcji, ponieważ łatwo jest pomylić specyficzny produkt amplifikacji ze zsyntetyzowanym obcym DNA. Część starterów i dNTP jest zużywana do syntezy niespecyficznego DNA, co prowadzi do znacznej utraty czułości.

Startery nie powinny tworzyć dimerów i pętli, tj. nie powinno się tworzyć stabilnych podwójnych nici przez przyłączanie starterów do siebie lub do siebie nawzajem.

1.5.4 Efekt płaskowyżu

Należy zauważyć, że proces akumulacji określonych produktów amplifikacji trwa wykładniczo tylko przez ograniczony czas, a następnie jego wydajność krytycznie spada. Wynika to z tzw. efektu plateau.

efekt terminowy Płaskowyż stosowane do opisu procesu akumulacji produktów PCR w ostatnich cyklach amplifikacji.

W zależności od warunków i liczby cykli reakcji amplifikacji w momencie uzyskania efektu Płaskowyż wykorzystanie substratów (dNTP i starterów), stabilność substratów (dNTP i enzym), ilość inhibitorów, w tym pirofosforanów i dupleksów DNA, konkurencja o substraty z niespecyficznymi produktami lub starterami-dimerami, stężenie konkretnego produktu , oraz niepełna denaturacja przy wysokich stężeniach produktów amplifikacji.

Im niższe początkowe stężenie docelowego DNA, tym większe ryzyko reakcji plateau". Ten punkt może wystąpić, zanim liczba określonych produktów amplifikacji będzie wystarczająca do analizy. Tylko dobrze zoptymalizowane systemy testowe mogą tego uniknąć.

1.5.5 Przygotowanie próbki materiału biologicznego

Do ekstrakcji DNA stosuje się różne techniki, w zależności od zadań. Ich istota polega na ekstrakcji (ekstrakcji) DNA z produktu biologicznego i usunięciu lub neutralizacji obcych zanieczyszczeń w celu uzyskania preparatu DNA o czystości odpowiedniej do PCR.

Metoda otrzymywania czystego preparatu DNA, opisana przez Marmur, jest uważana za standard i stała się już klasyczna. Obejmuje proteolizę enzymatyczną, a następnie deproteinizację i reprecypitację DNA alkoholem. Ta metoda umożliwia uzyskanie czystego preparatu DNA. Jest to jednak dość pracochłonne i wymaga pracy z tak agresywnymi i ostrymi substancjami, jak fenol i chloroform.

Jedną z popularnych obecnie metod jest metoda ekstrakcji DNA zaproponowana przez Booma i in. Metoda ta opiera się na zastosowaniu silnego środka chaotropowego, tiocyjanianu guanidyny (GuSCN), do lizy komórek, a następnie sorpcji DNA na nośniku (szklane kulki, ziemia okrzemkowa, szklane mleko itp.). Po przemyciu DNA pozostaje w próbce zaadsorbowanej na nośniku, z którego można je łatwo usunąć za pomocą buforu elucyjnego. Metoda jest wygodna, zaawansowana technologicznie i odpowiednia do przygotowania próbki do amplifikacji. Jednak straty DNA są możliwe dzięki nieodwracalnej sorpcji na nośniku, a także podczas licznych prań. Jest to szczególnie ważne podczas pracy z niewielką ilością DNA w próbce. Co więcej, nawet śladowe ilości GuSCN mogą hamować PCR. Dlatego przy stosowaniu tej metody bardzo ważny jest prawidłowy dobór sorbentu i staranne przestrzeganie niuansów technologicznych.

Kolejna grupa metod przygotowania próbek opiera się na wykorzystaniu wymieniaczy jonowych typu Chilex, które w przeciwieństwie do szkła nie adsorbują DNA, ale odwrotnie, zanieczyszczeń zakłócających reakcję. Z reguły technologia ta obejmuje dwa etapy: gotowanie próbki i adsorpcję zanieczyszczeń na wymieniaczu jonowym. Metoda jest niezwykle atrakcyjna ze względu na prostotę wykonania. W większości przypadków nadaje się do pracy z materiałem klinicznym. Niestety czasami zdarzają się próbki z zanieczyszczeniami, których nie można usunąć za pomocą wymieniaczy jonowych. Ponadto niektórych mikroorganizmów nie można zniszczyć przez zwykłe gotowanie. W takich przypadkach konieczne jest wprowadzenie dodatkowych etapów obróbki próbki.

Zatem wybór metody przygotowania próbki należy traktować ze zrozumieniem celów zamierzonych analiz.

1.5.6 Wzmocnienie

Do przeprowadzenia reakcji amplifikacji konieczne jest przygotowanie mieszaniny reakcyjnej i dodanie do niej analizowanej próbki DNA. W takim przypadku ważne jest uwzględnienie niektórych cech wyżarzania gruntu. Faktem jest, że z reguły w analizowanej próbce biologicznej znajdują się różne cząsteczki DNA, z którymi startery użyte w reakcji wykazują częściową, aw niektórych przypadkach znaczącą homologię. Ponadto startery mogą wygrzewać się ze sobą, tworząc dimery starterów. Oba prowadzą do znacznego zużycia starterów do syntezy ubocznych (niespecyficznych) produktów reakcji, a w efekcie znacznie zmniejszają czułość układu. Utrudnia to lub uniemożliwia odczytanie wyników reakcji podczas elektroforezy.

1.6 Skład standardowej mieszaniny reakcyjnej PCR

x bufor PCR (100 mM roztwór Tris-HCl, pH 9,0, 500 mM roztwór KCl, 25 mM roztwór MgCl2 ) …….2,5 µl

Woda (MilliQ) ……………………………………………………….18,8 µl

Mieszanina trifosforanów nukleotydów (dNTP)

mM roztwór każdego ……………………………………………….……….0,5 µl

Primer 1 (roztwór 10 mM) ………………………………………….….1 µl

Primer 2 (roztwór 10 mM) ………………………………………….….1 µl

Polimeraza DNA (5 jednostek / µl) …………………………………………………0,2 µl

Próbka DNA (20 ng/µl) …………………………………………..1 µl

1.7 Ocena wyników reakcji

Aby poprawnie ocenić wyniki PCR, ważne jest, aby zrozumieć, że ta metoda nie jest ilościowa. Teoretycznie produkty amplifikacji pojedynczych docelowych cząsteczek DNA można wykryć za pomocą elektroforezy już po 30-35 cyklach. Jednak w praktyce odbywa się to tylko w przypadkach, gdy reakcja zachodzi w warunkach zbliżonych do ideału, co nie jest często spotykane w życiu. Szczególnie duży wpływ na wydajność amplifikacji ma stopień czystości preparatu DNA; obecność w mieszaninie reakcyjnej pewnych inhibitorów, których w niektórych przypadkach bardzo trudno jest się pozbyć. Czasami ze względu na ich obecność nie jest możliwe amplifikowanie nawet dziesiątek tysięcy docelowych cząsteczek DNA. Tak więc często nie ma bezpośredniego związku między początkową ilością docelowego DNA a końcową ilością produktów amplifikacji.

Rozdział 2: Zastosowania reakcji łańcuchowej polimerazy

PCR jest używany w wielu dziedzinach do analiz i eksperymentów naukowych.

Kryminalistyka

PCR służy do porównywania tak zwanych „genetycznych odcisków palców”. Potrzebujemy próbki materiału genetycznego z miejsca zbrodni – krwi, śliny, nasienia, włosów itp. Porównuje się go z materiałem genetycznym podejrzanego. Teoretycznie wystarczy bardzo mała ilość DNA - jedna kopia. DNA jest cięte na fragmenty, a następnie amplifikowane metodą PCR. Fragmenty rozdziela się metodą elektroforezy DNA. Powstały obraz lokalizacji prążków DNA nazywany jest genetycznym odciskiem palca.

Ustalenie ojcostwa

Wyniki elektroforezy fragmentów DNA amplifikowanych metodą PCR. Ojciec. Dziecko. Matka. Dziecko odziedziczyło pewne cechy odcisku genetycznego obojga rodziców, co dało nowy, niepowtarzalny odcisk.

Chociaż „genetyczne odciski palców” są unikalne, więzi rodzinne wciąż można nawiązać, wykonując kilka takich odcisków palców. Ta sama metoda może być zastosowana, z niewielkimi modyfikacjami, do ustalenia ewolucyjnych relacji między organizmami.

Diagnostyka medyczna

PCR pozwala znacznie przyspieszyć i ułatwić diagnostykę chorób dziedzicznych i wirusowych. Gen będący przedmiotem zainteresowania jest amplifikowany przez PCR przy użyciu odpowiednich starterów, a następnie sekwencjonowany w celu określenia mutacji. Infekcje wirusowe można wykryć natychmiast po zakażeniu, tygodnie lub miesiące przed pojawieniem się objawów choroby.

Medycyna spersonalizowana

Czasami leki są toksyczne lub uczulające dla niektórych pacjentów. Powodem tego są częściowo indywidualne różnice we wrażliwości i metabolizmie leków i ich pochodnych. Różnice te są określane na poziomie genetycznym. Na przykład u jednego pacjenta pewien cytochrom może być bardziej aktywny, u innego - mniej. W celu określenia jaki rodzaj cytochromu posiada dany pacjent proponuje się wykonanie analizy PCR przed zastosowaniem leku. Ta analiza nazywa się wstępnym genotypowaniem.

Klonowanie genów

Klonowanie genów to proces izolacji genów i w wyniku manipulacji inżynierii genetycznej uzyskanie dużej ilości produktu danego genu. PCR służy do amplifikacji genu, który jest następnie wstawiany do wektora, fragmentu DNA, który przenosi obcy gen do tego samego lub innego organizmu, który jest łatwy w hodowli. Jako wektory stosuje się na przykład plazmidy lub wirusowe DNA. Wstawienie genów do obcego organizmu zwykle służy do uzyskania produktu tego genu - RNA lub najczęściej białka. W ten sposób uzyskuje się wiele białek w ilościach przemysłowych do wykorzystania w rolnictwie, medycynie itp.

sekwencjonowanie DNA

W metodzie sekwencjonowania z użyciem dideoksynukleotydów znakowanych fluorescencyjnie lub radioaktywnie, PCR jest integralną częścią, ponieważ podczas polimeryzacji pochodne nukleotydów znakowane znacznikiem fluorescencyjnym lub radioaktywnym są wprowadzane do łańcucha DNA. To zatrzymuje reakcję, umożliwiając określenie pozycji określonych nukleotydów po rozdzieleniu zsyntetyzowanych nici w żelu.

Mutageneza

Obecnie główną metodą mutagenezy stała się PCR. Zastosowanie PCR pozwoliło uprościć i przyspieszyć procedurę mutagenezy, a także uczynić ją bardziej wiarygodną i powtarzalną.

Metoda PCR umożliwiła analizę obecności sekwencji wirusa brodawczaka ludzkiego w skrawkach biopsyjnych ludzkich nowotworów szyjki macicy zatopionych w parafinie 40 lat przed niniejszym badaniem. Co więcej, za pomocą PCR udało się zamplifikować i sklonować fragmenty mitochondrialnego DNA ze skamieniałych szczątków ludzkiego mózgu w wieku 7 tysięcy lat!

Na lizatach poszczególnych plemników ludzkich wykazano możliwość jednoczesnej analizy dwóch loci zlokalizowanych na różnych chromosomach niehomologicznych. Takie podejście daje wyjątkową okazję do dokładnej analizy genetycznej i badania rekombinacji chromosomów, polimorfizmu DNA itp. Metoda analizy poszczególnych plemników natychmiast znalazła praktyczne zastosowanie w medycynie sądowej, ponieważ typowanie HLA komórek haploidalnych umożliwia ustalenie ojcostwa lub identyfikację ojcostwa. przestępca (kompleks HLA to zestaw genów ludzkiego głównego układu zgodności tkankowej; loci kompleksu HLA są najbardziej polimorficzne ze wszystkich znanych u wyższych kręgowców: w obrębie gatunku, w każdym locus występuje niezwykle duża liczba różne allele - alternatywne formy tego samego genu).

Za pomocą PCR można zidentyfikować poprawność integracji obcych struktur genetycznych we wcześniej określonym regionie genomu badanych komórek. Całkowity DNA komórkowy jest łączony z dwoma starterami oligonukleotydowymi, z których jeden jest komplementarny do miejsca DNA gospodarza w pobliżu punktu insercji, a drugi do sekwencji zintegrowanego fragmentu w antyrównoległej nici DNA. Reakcja łańcuchowa polimerazy w przypadku niezmienionej struktury chromosomalnego DNA w proponowanym miejscu insercji prowadzi do powstania jednoniciowych fragmentów DNA o nieokreślonej wielkości, a w przypadku planowanej insercji dwuniciowych fragmentów DNA o znanej wielkość, określona przez odległość między miejscami hybrydyzacji dwóch starterów. Ponadto stopień amplifikacji analizowanego regionu genomu w pierwszym przypadku będzie liniowo zależny od liczby cykli, aw drugim – wykładniczo. Wykładnicza akumulacja podczas PCR zamplifikowanego fragmentu o określonej wielkości umożliwia wizualną obserwację po frakcjonowaniu elektroforetycznym preparatu DNA i jednoznaczny wniosek o wstawieniu obcej sekwencji do danego regionu chromosomalnego DNA.

Wniosek

Metoda PCR jest obecnie najszerzej stosowana jako metoda diagnozowania różnych chorób zakaźnych. PCR pozwala zidentyfikować etiologię infekcji, nawet jeśli próbka pobrana do analizy zawiera tylko kilka cząsteczek DNA patogenu. PCR jest szeroko stosowany we wczesnej diagnostyce infekcji HIV, wirusowego zapalenia wątroby itp. Do chwili obecnej prawie nie ma czynnika zakaźnego, którego nie można wykryć za pomocą PCR.

Lista wykorzystanej literatury

1.Padutov V.E., Baranov O.Yu., Voropaev E.V. Metody analizy molekularno - genetycznej. - Mińsk: Unipol, 2007. - 176 pkt.

2.PCR „w czasie rzeczywistym” / Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Yu. itd.; wyd. b. n. D.V. Rebrikow; Przedmowa LA. Osterman i Acad. RAS i RAAS E.D. Swierdłow; wyd. 2, ks. i dodatkowe - M.: BINOM. Laboratorium Wiedzy, 2009. - 223 s.

.Patruszew L.I. Sztuczne systemy genetyczne. - M.: Nauka, 2005. - W 2 tony

.B. Glick, J. Pasternak Biotechnologia molekularna. Zasady i zastosowanie 589 stron, 2002

5.Shchelkunov S.N. Inżynieria genetyczna. - Nowosybirsk: Sib. uniw. wydawnictwo, 2004. - 496 s.

Edytowane przez AA Vorbyeva „Reakcja łańcuchowa polimerazy i jej zastosowanie w diagnostyce w dermatowenerologii”; Medyczna Agencja Informacyjna - 72 strony

http://ru. wikipedia.org

http://uczony. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. su/ - Dziennik medyczny

Korepetycje

Potrzebujesz pomocy w nauce tematu?

Nasi eksperci doradzą lub zapewnią korepetycje z interesujących Cię tematów.
Złożyć wniosek wskazanie tematu już teraz, aby dowiedzieć się o możliwości uzyskania konsultacji.