Pri náleze vajíčok helmintov na rôznych objektoch prostredia (pôda, voda, zelenina a pod.) je vždy potrebné zistiť ich životaschopnosť podľa vzhľadu, farbenia životne dôležitými farbivami, kultivácie za optimálnych podmienok a nastavením biologickej vzorky, t.j.

Kŕmenie laboratórnych zvierat.

Stanovenie životaschopnosti vajíčok alebo lariev helmintov vo vzhľade. Vajíčka helmintov sa mikroskopujú najskôr pri malom zväčšení, potom pri veľkom zväčšení. V deformovaných a mŕtvych vajíčkach helmintov je škrupina roztrhnutá alebo ohnutá dovnútra, plazma je zakalená, uvoľnená. Segmentované vajíčka majú štiepne guľôčky (blastoméry) nerovnakej veľkosti, nepravidelný tvar, sú často posunuté na jeden pól. Niekedy existujú abnormálne vajíčka, ktoré sa po vonkajších deformáciách vyvíjajú normálne. U živých lariev ascaris je jemná zrnitosť prítomná len v strednej časti tela, pri odumieraní sa zrnitosť šíri po celom tele, objavujú sa veľké lesklé hyalínové vakuoly - takzvané perlové šnúry.

Na stanovenie životaschopnosti zrelých vajíčok ascaridov, bičíkovcov, červov by sa aktívne pohyby lariev mali vyvolať miernym zahriatím prípravku (na teplotu nepresahujúcu 37 ° C). Vhodnejšie je pozorovať životaschopnosť lariev vretenice a vretenice po ich izolovaní z obalu vajíčka stlačením krycieho sklíčka preparátu pitevnou ihlou alebo pinzetou.

U lariev invazívnych ascaridov je často vidieť čiapočku, ktorá sa odlúpla na hlavovom konci, a u lariev bičíkovcov, ktoré ukončili vývoj vo vajíčku, sa na tomto mieste nachádza pri veľkom zväčšení mandrén. U mŕtvych lariev helmintov, bez ohľadu na ich umiestnenie (vo vajíčku alebo mimo neho), je zaznamenaný rozpad tela. V tomto prípade sa vnútorná štruktúra larvy stáva hrudkovitou alebo zrnitou a telo sa stáva zakaleným a nepriehľadným. V tele sa nachádzajú vakuoly a na kutikule sa nachádzajú zlomy.

Životaschopnosť teniidných onkosfér (hovädzí, prasacia pásomnica atď.) je určená pohybom embryí, keď sú vystavené tráviacim enzýmom. Vajíčka sú umiestnené na hodinovom sklíčku so psou žalúdočnou šťavou alebo umelou duodenálnou šťavou. Zloženie posledne menovaného: pankreatín 0,5 g, hydrogénuhličitan sodný 0,09 g, destilovaná voda 5 ml. Poháre na hodinky s vajíčkami sa umiestnia na 4 hodiny do termostatu pri 36-38 ° C. V tomto prípade sa živé embryá uvoľnia zo škrupín. Škrupiny živých onkosfér sa rozpúšťajú aj v okyslenom pepsíne a v alkalickom roztoku trypsínu po 6-8 hodinách v termostate pri 38°C.

Ak sa teniidné vajcia umiestnia do 1% roztoku sulfidu sodného alebo 20% roztoku chlórnanu sodného alebo do 1% roztoku chlórovej vody pri teplote 36-38 °C, zrelé a živé embryá sa uvoľnia zo škrupín a nezmeniť 1 deň. Nezrelé a mŕtve onkosféry sa scvrkávajú alebo napučiavajú a prudko sa zväčšujú a následne sa „rozpustia“ do 10 minút – 2 hodín Živé embryá teniidov sa aktívne pohybujú aj v zmesi 1% roztoku chloridu sodného, ​​0,5% roztoku hydrogénuhličitanu sodného a žlče pri 36- 38 °C.

Životaschopnosť scolex echinokokov sa určuje pri nízkom zahrievaní. Za týmto účelom sa skolexy alebo plodové tobolky umyté vo vode umiestnia do kvapky vody na podložnom sklíčku s otvorom, prikryjú sa krycím sklíčkom a skúmajú sa pod mikroskopom s vyhrievacím stolíkom pri teplote 38-39 ° C. Ak nie je k dispozícii ohrievací stôl, prípravok sa ohrieva pomocou akéhokoľvek zdroja tepla. Zároveň sa životaschopné skolexy aktívne pohybujú, zmenšujú alebo uvoľňujú prísavky, predlžujú a skracujú proboscis. Ak sa skolexy umiestnia do 0,5 až 1 % vodného roztoku filicilénu pri teplote miestnosti, potom všetky životaschopné skolexy rýchlo vypadnú a zomrú. Neživotaschopné skolexy sa neukazujú.

Životaschopnosť fasciolia adolescaria zozbieraných z rastlín a iných objektov vodných útvarov sa kontroluje ich skúmaním na podložnom sklíčku vo fyziologickom roztoku pod mikroskopom s vyhrievacím stolíkom. Pri zahrievaní sa larvy motolice v cyste začnú pohybovať.

Životaschopnosť vajíčok trpasličej pásomnice je určená umiestnením háčikov na embryu.

V živých vajíčkach pásomnice trpasličej sa vyskytujú pomalé kyvadlové pohyby protoplazmy a takmer nepostrehnuteľné predlžovanie a posúvanie zahrotených koncov bočného páru háčikov smerom od stredného páru.

Kontrakcie protoplazmy embrya a zárodočných háčikov pomáhajú embryu oslobodiť sa najskôr z obalov onkosféry a potom z vonkajšieho obalu vajíčka.

V živom vajci sú stredný pár a bočné páry háčikov usporiadané paralelne, v niektorých vajciach sú lopatky bočných párov spojené a umiestnené pod uhlom menším ako 45° vzhľadom na stredný pár háčikov.

Umierajúce embryo sa kŕčovito sťahuje a pomaly odtláča háky od seba. V mŕtvom embryu sa pohyb háčikov zastaví a sú usporiadané nepravidelne, niekedy sú háčiky laterálne od susedného páru posunuté od seba v pravom, tupom alebo ostrom uhle.

Niekedy sa pozoruje zvrásnenie embrya, tvorba zrnitosti. Presnejšia metóda je založená na objavení sa pohybov onkosféry počas prudkej zmeny teploty: od 5-10 do 38-40 °C.

Stanovenie životaschopnosti nezrelých háďatiek by sa malo študovať vo vlhkej komore (Petriho misky) umiestnením vajíčok ascaris do 3 % roztoku formalínu pripraveného v izotonickom roztoku chloridu sodného pri teplote 24 – 30 °C, vajíčok bičíkovcov do 3 % roztoku kyseliny chlorovodíkovej pri teplote 30 – 35 °C, vajíčka hlísty v izotonickom roztoku chloridu sodného pri teplote 37 °C. Petriho misky by ste mali pre lepšie prevzdušnenie otvárať 1-3x týždenne a filtračný papier znovu navlhčiť čistá voda.

Pozorovania vývoja vajíčok helmintov sa vykonávajú najmenej 2-krát týždenne. Absencia príznakov vývoja v priebehu 2-3 mesiacov naznačuje ich neživotaschopnosť. Známky vývoja vajíčok helmintov sú najskôr štádiá drvenia, rozdelenie obsahu vajíčka na samostatné blastoméry. Počas prvého dňa sa vyvinie až 16 blastomér, ktoré prechádzajú do druhého štádia - morula atď.

Vajíčka húsenice sa pestujú v sklenenom valci (50 cm vysoký a 7 cm v priemere) uzavretom zátkou. Na dno valca sa pomocou sklenenej trubice opatrne naleje zmes rovnakých objemov sterilného piesku, dreveného uhlia a výkalov s vajíčkami machovky, zriedená vodou na polotekutú konzistenciu. Počas 1-2 dní usadzovania v tme pri teplote 25-30 °C sa z vajíčok vyliahnu rabditoidné larvy, ktoré sa po 5-7 dňoch stanú už filariformnými: larvy sa plazia po stenách valca, kde sú viditeľné aj voľným okom. Vajíčka trematódy prirodzene sa vyvíjajúce vo vode, ako napríklad opisthorchis, diphyllobotriid, fasciol atď., sa umiestnia na hodinové sklíčko, Petriho misku alebo do inej nádoby, naleje sa malá vrstva obyčajná voda. Pri pestovaní vajíčok fascioly treba brať do úvahy, že v tme sa rýchlejšie vyvíjajú, pričom miracidium vzniká v živých vajíčkach pri teplote 22-24°C za 9-12 dní. Pri mikroskopii vyvíjajúce sa vajíčka trematódy miracidium pohyby sú jasne viditeľné. Fasciola miracidium vystupuje z vaječných škrupín len na svetle. Pri pestovaní sa voda mení po 2-3 dňoch.

Larvy a strongyloid sa pestujú na agare v Petriho miske so živočíšnym uhlím. Po 5-6 dňoch v termostate pri teplote 26-30 °C sa larvy rozšíria po agare a zanechajú za sebou cestu baktérií (Füllebornova metóda).

Metóda Haradu a Moriho (1955). Do skúmaviek umiestnených na stojane sa pridá 7 ml destilovanej vody. Drevenou tyčinkou odoberte 0,5 g výkalov a urobte rozmazanie na filtračný papier (15 x 150 mm) 5 cm od ľavého okraja (táto operácia sa vykonáva na hárku papiera na ochranu povrchu laboratórneho stola). Potom sa prúžok s náterom vloží do skúmavky tak, aby ľavý koniec voľný od náteru dosiahol dno skúmavky. Horný koniec je pokrytý kúskom celofánu a pevne obalený elastickým pásom. Na skúmavku napíšte číslo a priezvisko subjektu. V tomto stave sa skúmavky skladujú 8-10 dní pri teplote 28 °C. Ak chcete študovať kultúru, odstráňte a odstráňte celofánový kryt a odstráňte pásik filtračného papiera pomocou pinzety. V tomto prípade treba byť opatrný, pretože malý počet infekčných lariev sa môže presunúť na horný koniec filtračného papiera alebo na stenu skúmavky a preniknúť pod povrch celofánu.

Rúry sa umiestnia do horúceho vodný kúpeľ pri teplote 50 °C počas 15 minút, potom sa obsah pretrepe a rýchlo naleje do 15 ml skúmavky na sedimentáciu lariev. Po odstredení sa supernatant odstráni a zrazenina sa prenesie na podložné sklíčko, prikryje sa krycím sklíčkom a mikroskopuje sa pri malom zväčšení.

Na diferenciálnu diagnostiku filariformných lariev je potrebné použiť údaje uvedené v tabuľke. 13.

Metódy farbenia vajíčok a lariev helmintov. Mŕtve tkanivá vo väčšine prípadov vnímajú farby rýchlejšie ako živé. Tieto znaky sa používajú v helmintológii na určenie životaschopnosti vajíčok a lariev helmintov. V niektorých prípadoch sú však niektoré farby lepšie vnímané živými tkanivami ako mŕtvymi.

Tabuľka 13. Diferenciálna diagnostika vláknitých lariev A.duodenale, N.americanus, Strongyloides stercoralis, Trichostrongylus spp.

Na rozdielne rozpoznávanie živých a mŕtvych vajíčok a lariev sa používajú nasledujúce farby a metódy.

Leukobáza metylénovej modrej sa používa na farbenie živých a mŕtvych tkanív. Živá bunka alebo tkanivo redukuje metylénovú modrú na bezfarebnú leukobázu, mŕtve tkanivo túto schopnosť nemá, a preto získava farbu.

Na farbenie vajíčok ascaris môžete použiť metylénovú modrú v roztoku kyseliny mliečnej s lúhom (metylénová modrá 0,05 g, lúh sodný 0,5 g, kyselina mliečna 15 ml). Živé vajcia nevnímajú farbu, embryá mŕtvych vajec sú zafarbené Modrá farba.

Metóda farbenia nie je použiteľná pre nezrelé vajíčka škrkavky a bičíkovcov; pigmentovaná škrupina sa farbí, a preto nie je vidieť, či sa zafarbila zárodočná bunka vo vnútri vajíčka.

Larvy Ascaris sa zafarbia zásaditým roztokom brilantno-krezylovej modrej farby v koncentrácii 1:10 000 nasledovne: na podložné sklíčko sa nanesie kvapka tekutiny s vajíčkami ascaris a kvapka roztoku základnej farby. Preparát sa prekryje krycím sklíčkom, ktoré sa ľahkým poklepaním pitevnou ihlou pevne pritlačí k predmetu. Pod mikroskopom sa sleduje počet vyliahnutých lariev a stupeň ich sfarbenia, potom sa po 2-3 hodinách znova skúma ten istý prípravok.Za živé sa považujú len nezdeformované larvy, ktoré sa nefarbili 2 hodiny.Mŕtve larvy sa sfarbia, keď škrupina sa zlomí (čiastočne alebo úplne).

Je indikovaná možnosť farbenia prípravkov roztokom jódu pri určovaní životaschopnosti vajíčok vtákov ascaridia. V tomto prípade sa ako farbivo používa 5% alkoholový roztok jódu. Keď sa aplikuje na prípravok, embryá mŕtvych vajíčok ascarídia sa zafarbia za 1-3 s. oranžová farba. Mŕtve vajíčka opisthorchis a onkosfér býčia pásomnica zafarbené roztokom toluidínovej modrej (1:1000), a mŕtve onkosféry pásomnice hovädzej - roztokom brilantnej-krezylovej modrej (1:10 000). Súčasne embryá a škrupiny mŕtvych aj živých vajec získavajú farbu. Preto sa vajíčka a onkosféry po farbení premyjú v čistej vode a dodatočne farbia safranínom (zriedeným 1:10 000 10% roztokom alkoholu). Alkohol zo škrupín odstráni farbivo a safranín im dodá červenú farbu. Výsledkom je, že živé vajcia sú sfarbené do červena, embryo mŕtvych vajec je modré a škrupina zostáva červená. Mŕtve embryá onkosfér pásomnice hovädzieho dobytka sa rýchlo, v priebehu niekoľkých minút, sfarbia do jasne červenej resp ružová farba safranín alebo modrá briliantovo-kresylová modrá pri riedení 1:4000 alebo indigokarmínová pri riedení 1:1000-1:2000.

Živé embryá sa vplyvom týchto farieb nemenia ani po 2-7 hodinách.

Na určenie životaschopnosti vajíčok pásomnice trpasličej sa odporúča použiť tieto farby: 1) brilantná kresylová modrá (1: 8000) - po 1 hodine je onkosféra mŕtvych vajíčok obzvlášť jasne zafarbená, čo ostro vyniká na svetle alebo bezfarebné pozadie zvyšku vajíčka; 2) safranín: pri zriedení 1:8000 pri expozícii počas 2 hodín a 1:5000 počas 3-5 hodín; 3) 50% roztok kyseliny pyrogalovej v zriedení 1:2 - pri vystavení 1 hodine pri teplote 29-30 °C (čím nižšia teplota, tým dlhší je proces farbenia).

Živé plerocerkoidy pásomnice širokej sa veľmi dobre farbia vodným roztokom (1:1000) neutrálnych úst počas 5-20 minút. Na získanie pretrvávajúcej ružovej farby, ktorá nezmizne do 5 dní a neovplyvňuje pohyblivosť plerocerkoidov, zvyčajne stačí 10 minút. Stupeň sfarbenia je riadený prezeraním lariev v čistote izotonický roztok chlorid sodný, pri ktorom sa z náteru pravidelne odstraňujú plerocerkoidy. Na farbenie mŕtvych plerocerkoidov je vhodné použiť metylénovú modrú.

R. E. Chobanov a kol., (1986) navrhli metódu stanovenia životaschopnosti vajíčok a lariev helmintov s použitím rubrínového pigmentu získaného počas kultivácie ako farbiva. plesňová huba Peniciliium rubrum. Na tento účel použite 3% vodný roztok farbiva.

Proces farbenia vajíčok a lariev je ukončený po 1,5 hodine.Neživotaschopné vajíčka červov, hovädzích a trpasličích pásomníc, ankylostomidov, trichostrongylidov nadobúdajú intenzívnu ružovú farbu, larvy ankylostomidov a trichostrongyloidov sčervenajú. Menej jasná farba je pozorovaná u vajíčok ascaris a bičíkovcov, pretože vyčnievajúce z čriev už majú tmavo hnedá farba: Životaschopné vajíčka a larvy sa nefarbia.

Fyzikálno-chemické metódy na stimuláciu uvoľňovania miracdia z vajíčok motolice. Metódy boli vyvinuté S. M. Germanom a S. A. Beerom (1984) na stanovenie životaschopnosti vajíčok opisthorchia a dicrocélia vystavením vajíčok reakčnému médiu. Ak sú nažive, vychádza miracidium. Metódy sú založené na fyzikálno-chemickej aktivácii liahnej žľazy miracidium a stimulácii motorickej aktivity larvy. Stimulácia sa dosiahne vystavením vajíčok motolice špeciálnemu reakčnému médiu v kombinácii s postupnými metódami - vytvorenie teplotného rozdielu, sušenie suspenzie vajíčok, vystavenie slabému toku kvapaliny v testovacej kvapke, ktoré prispievajú k hromadnému uvoľňovaniu miracidií z vajíčok.

Stanovenie životaschopnosti vajec opistorch metódou Hermana, Beera. Suspenzia vajec vo vode (kohútik, usadená) sa vopred ochladí na 10-12 ° C. Všetky nasledujúce operácie sa uskutočňujú pri teplote miestnosti (18-22 °C). Jedna kvapka (asi 0,05 ml) suspenzie obsahujúcej 100 až 400 vajec sa pridá do centrifugačnej skúmavky. Skúmavky sa umiestnia do stojana na 5-10 minút, aby sa vajíčka vyzrážali. Potom sa úzkym prúžkom filtračného papiera opatrne odsaje prebytočná voda, kým sa úplne neodstráni. Do skúmavky sa pridajú 2 kvapky média, pretrepú sa, obsah sa prenesie pipetou na podložné sklíčko a nechá sa 5-10 minút, pričom sa mierne pretrepáva (alebo sa umiestni pod sušič vlasov), aby sa vytvorili slabé prúdy kvapaliny v skúmavke. skúmaná kvapka suspenzie. Táto operácia, ktorá napodobňuje črevnú peristaltiku mäkkýšov, vám umožňuje aktivovať uvoľňovanie miracidií. Potom sa k suspenzii pridajú ďalšie 2 kvapky média a prípravok sa potom mikroskopicky skúma pomocou bežného svetelného mikroskopu (X200). Počas tejto doby by vajíčka so životaschopnými miracidiami mali otvoriť veko, zatiaľ čo larva sa aktívne vynorí do prostredia. V dôsledku prítomnosti etanolu v ňom sa miracídium imobilizuje za 3 až 5 minút a potom sa zafarbí farbivom v médiu. Výsledkom je, že miracidia sa ľahko detegujú a počítajú.

Príprava reakčného média. Médium sa pripraví v 0,05 M Tris-HCi pufri pri optimálnych podmienkach pH 8,0-9,5. Do tlmivého roztoku sa pridáva etanol až do 10-13% a farbivo (safranín, metylénová modrá a iné pracujúce v rozmedzí pH), kým sa kvapalina mierne nezafarbí (napríklad pre safranín bude jej konečná koncentrácia 1:50 000). Môžete použiť iný pufor, ktorý funguje v alkalickom rozsahu pH, ako je napríklad 0,05 M fosfát (pH 8,5). Preto médium obsahuje 96% etanolu - 12 dielov; farbivo ( materský likér) - 1-10 dielov; 0,05 M Tris-HC! pufer (pH 8,5-9,5) - až 100 dielov. Stredný príklad: 12 dielov 96% etanolu, 1 diel nasýteného roztoku safranínu, zvyšok do 100 dielov - 0,05 M Tris-HCl tlmivý roztok, pH 9,5.

Stanovenie životaschopnosti vajíčok dikrocélia metódou Hermana, Beera, Stratana. Kvapka suspenzie obsahujúcej 100 až 150 vajíčok motolice sa umiestni do centrifugačnej skúmavky na 1 až 2 minúty, aby sa vajíčka usadili. Potom sa kvapalina opatrne vysuší pásikom filtračného papiera. Pridajte 1-2 kvapky reakčného média pomocou Pasteurovej pipety a inkubujte vo vodnom kúpeli pri 28-30 °C počas 2-3 minút. Zloženie média: 6 dielov butanolu, 94 dielov 0,4% roztoku chloridu sodného alebo 0,3% roztoku chloridu draselného v destilovanej vode. Vajíčka v médiu sa prenesú pipetou na podložné sklíčko a nechajú sa 1,5 – 2 hodiny pri izbovej teplote (18 – 22 °C), pričom každých 25 – 30 minút (po zaschnutí) pridajte 1 – 2 kvapky (0,05 ml) roztoku butanolu v destilovanej vode. Potom sa preparát mikroskopuje pri 100- až 200-násobnom zväčšení. Životaschopnosť je určená počtom otvorených vajíčok s uvoľnenými miracidiami. Butanol preniká cez póry škrupiny vajec, dostáva sa k miracidiám a aktivuje ich. Inkubácia pri výraznej teplote tento proces umocňuje. Butanol v koncentrácii 3-7% je škodlivý pre miracídium, ktoré sa objavilo z vajíčka. Prenesenie suspenzie vajíčok zo skúmavky na podložné sklíčko umožňuje v čase, keď miracidium opustí (po 30-40 minútach), znížiť koncentráciu butanolu v dôsledku odparovania na bezpečnú úroveň (1,5-0,5 %). Prítomnosť chloridu sodného v médiu v koncentrácii 0,1-0,5% (alebo chloridu draselného v koncentrácii 0,05-0,4%) určuje aktivitu uvoľneného miracídia. Na rozdiel od malých priehľadných vajíčok opisthorcha majú vajíčka dikrocélia tmavo sfarbenú škrupinu, majú dobre viditeľné viečko, ktoré je po uvoľnení miracídia otvorené. Preto sa životaschopnosť vajíčok dikrocélia pohodlnejšie hodnotí počítaním vajíčok, ktoré sa otvorili, než farbením a počítaním miracidií.

Luminiscenčná metóda na štúdium vajíčok a lariev helmintov.

Prvýkrát v helmintologickej praxi boli metódy luminiscenčnej mikroskopie aplikované v roku 1955. Uvádza sa, že luminiscenčná mikroskopia umožňuje rozlíšiť živé a mŕtve predmety bez poškodenia vajíčka. Na fluorescenciu sa nepoužili UV lúče, ale modrofialová časť viditeľného svetla s konvenčným mikroskopom a sklíčkami; pre iluminátor OI-18 bola použitá špeciálna sada farebných filtrov.

Zistilo sa, že živé a mŕtve vajíčka škrkaviek, škrkaviek, pásomníc, pásomníc hovädzieho dobytka, širokých pásomníc a iných helmintov luminiscujú odlišne. Tento jav je pozorovaný ako počas primárnej luminiscencie bez použitia farbív, tak aj pri farbení fluorochrómmi (akridínová oranž, korifosfín, primulín, aurolín, berlerín sulfát, tripaflavín, rivanol, chinakrín atď.).

Nenatreté živé nesegmentované vajíčka škrkavky žiaria jasnozelenou farbou so žltkastým odtieňom; v mŕtvych vajciach škrupina vyžaruje zelené svetlo oveľa jasnejšie ako tmavozelené embryo; vo vajíčkach škrkavky s larvou sa objavuje iba škrupina, zatiaľ čo u mŕtvych je škrupina aj larva jasne žltá.

Nepigmentované a nesegmentované živé vajíčka pinworms a pygmy tapeworms vyžarujú zelenožlté svetlo; v mŕtvych vajciach škrupina intenzívne luminiscuje na pozadí tmavozelenej embryonálnej hmoty. Pri sekundárnej luminiscencii (pri farbení akridínovou oranžou v riedení 1:10 OOO a 1:50 OOO od 30 minút do 2 hodín) škrupina živých a mŕtvych hlíst, motolíc a cestód luminiscuje odlišne.

Škrupina živých a mŕtvych Ascaris lumbricoides, Toxocara leonina, Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. diminuta, T.saginatus, D.latum sa sfarbuje do oranžovočervena. Embryá živých Asc. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum a onkosféry pásomnice hovädzej luminiscujú v matnej tmavozelenej alebo sivozelenej farbe. Mŕtve embryá týchto vajíčok helmintov vyžarujú „horiace“ oranžovo-červené svetlo. Živé larvy a toxokáry (vaječné škrupiny) vyžarujú matné sivozelené svetlo a keď uhynú, farba sa zmení z hlavy na „horiacu“ svetlozelenú, potom žltú, oranžovú a nakoniec jasne oranžovú.

Pri farbení fluorochrómmi - coryfosfyllum, primulín - v mŕtvych vajíčkach ascaridov a bičíkovcov sa pozoruje žiara od fialovo-žltej po medeno-červenú. Životaschopné vajíčka neluminiscujú, ale sfarbujú sa do tmavozelena. Živé vajíčka motolice Paragonimus westermani a Clonorchis sinensis po farbení akridínovou oranžovou neluminiscujú, zatiaľ čo mŕtve vajíčka vyžarujú žltkastozelené svetlo.

Na stanovenie životaschopnosti lariev helmintov možno použiť aj luminiscenčnú metódu. Takže fluorochromované roztokom akridínovej oranžovej (1: 2000) larvy strongylátu, rhabdita žiara: živé - zelené (s odtieňom), mŕtve - jasne oranžové svetlo. Živé larvy Trichinella nežiaria alebo žiaria slabo, keď sú ošetrené 10 minút roztokmi fluoresceín izotiokyanátu, auramínu atď. Fluorochromované mŕtve larvy (v koncentrácii 1:5000) jasne žiaria.

Živé miracidia, ktoré vyšli z škrupiny, vyžarujú tlmené modrasté svetlo so sotva znateľným svetložltým korolom riasiniek, ale 10-15 minút po smrti sa javia ako jasné „horiace“ svetlo zelené a potom oranžovo-červené svetlo.

Priame metódy: detekcia samotných helmintov, ich fragmentov, vajíčok, lariev vo výkaloch, moči, sekrécii dvanástnika, spúte, nazálnom a vaginálnom hliene, obsahu subungválnych priestorov, biopsia kúskov tkaniva.

Pri diagnostike nie je možné akoukoľvek metódou identifikovať vajíčka alebo larvy všetkých druhov helmintov žijúcich v zažívacie ústrojenstvo osoba. Pri použití flotačnej metódy teda vajíčka motolice a v niektorých prípadoch aj neoplodnené vajíčka škrkaviek neplávajú do povrchového filmu (kvôli vysokej špecifickej hmotnosti). Vo výkaloch je veľmi zriedkavé nájsť vajíčka červov, teniidné onkosféry, ktoré sa zisťujú špeciálnymi výskumnými metódami: zoškrabanie z perianálnych záhybov pre červy a teniidy, sedimentačné metódy pre motolice (vajcia pistorch atď.). Preto pri cielenom vyšetrení pacienta na helmintiázy by mal lekár v odporúčaní uviesť, ktorým helmintom treba venovať hlavnú pozornosť (diagnostiku), čo umožní laborantovi zvoliť vhodnú techniku ​​na identifikáciu tohto typu helmintov. Výkaly odobraté z rôzne miesta výkaly v množstve najmenej 50 gramov (čajová lyžička) v čistej sklenenej miske by mali byť odoslané do laboratória najneskôr jeden deň po defekácii a vyšetrené v deň prijatia.

Ak je potrebné ponechať výkaly do druhého dňa, umiestnite ich na chladné miesto (0-4 ° C) alebo naplňte niektorým z konzervačných látok.

Pred štúdiom sa výkaly zmiešajú s tyčinkou tak, aby boli vajíčka helmintov rovnomerne rozložené v celkovej hmote.

Ak sa v prípravku nájdu vajíčka helmintov, prezeranie sa nezastaví, pretože. môže ísť o dvojitú alebo trojitú inváziu.

Monitorovanie účinnosti liečby helmintiázy sa vykonáva vyšetrením výkalov na vajíčka helmintov 2-3 týždne alebo 2-3 mesiace po liečbe, v závislosti od zisteného helmintu.

Makroskopické metódy sa používajú na zisťovanie celých pohlavne dospelých helmintov alebo ich fragmentov vo výkaloch voľným okom alebo ručnou lupou.

Často na povrchu výkalov po defekácii môžete vidieť aktívne lezúce pinworms; vylučuje s výkalmi škrkavka; niekedy si ľudia sami všimnú vypúšťanie helmintov. U pacientov s diphyllobotriázou môžu vyniknúť fragmenty strobily pásomnice (vo forme "rezancov") a u pacientov infikovaných teniidami (bravčová alebo hovädzia pásomnica) segmenty helmintov (vo forme "bielych rezov" ) často opúšťajú výkaly (vo forme „bielych rezov“) alebo aktívne vyliezajú z konečníka.

Makroskopická metóda je hlavná pre odlišná diagnóza teniidóza a teniarhynchóza (v kombinácii s prieskumom).

Zo špeciálnych makroskopických metód sa používa metóda sekvenčného umývania výkalov.

Výkaly sa zmiešajú vo vode, aby sa získala jednotná suspenzia, potom sa pri dobrom osvetlení starostlivo skúmajú v oddelených malých častiach v čiernych fotografických kyvetách alebo na tmavom pozadí v Petriho miskách. Všetky podozrivé biele častice, veľké útvary podozrivé z úlomkov helmintov sa odstránia pomocou pinzety alebo pitevnej ihly a skúmajú sa pod lupou medzi dvoma podložnými sklíčkami. Malé helminty alebo hlavy pásomníc sa skúmajú pod lupou v kvapke glycerínu alebo pod mikroskopom.

Pri použití tejto metódy na diagnostiku segmentov bravčovej, hovädzej pásomnice, širokej pásomnice sa umyté segmenty vložia medzi dva poháre a pri pohľade na svetlo pod lupou alebo pri malom zväčšení mikroskopu sa druh určí podľa stavba maternice (u zrelého segmentu pásomnice bravčovej 8-12 bočných konárov a u pásomnice býčej 18-32, častejšie 28-32, u širokej pásomnice sú segmenty širšie a maternica je v stred vo forme "rozety"). Ak je maternica zle viditeľná, môže sa najprv nejaký čas držať v 50% roztoku glycerínu, po ktorom sú jasne viditeľné aj opustené maternicové kmene.

Pri určovaní týchto cestód podľa štruktúry odletených hlavičiek sa tieto opatrne vložia hrdlom do kvapky glycerolu medzi podložné sklíčka (alebo sa prekryjú krycím sklíčkom) a bez stláčania sa skúmajú pod mikroskopom pri malom zväčšení.

Mikroskopické metódy rozdelené na jednoduché, zložité a špeciálne.

Jednoduché metódy sú natívny náter, natívny náter Lugolovým roztokom, metódy hustého náteru pod celofánom podľa Kata, krútenia (podľa Shulmana) a perianálneho zoškrabovania.

Komplexné metódy sú efektívnejšie a sú založené na koncentrácii vajec v prípravkoch. Zahŕňajú predbežnú úpravu výkalov tekutými činidlami, v dôsledku čoho sa vajíčka helmintov buď vyzrážajú, alebo plávajú na povrch kvapaliny.

Komplexné metódy zahŕňajú metódy obohatenia:

a) flotácia (keď je špecifická hmotnosť vajec menšia ako špecifická hmotnosť fyziologického roztoku a vajcia plávajú do povrchového filmu);

b) sedimentácia (keď je špecifická hmotnosť vajec väčšia ako špecifická hmotnosť soľných roztokov a vajcia sa usadia v sedimente).

Špeciálnymi metódami na zisťovanie vajíčok a lariev helmintov, cýst a vegetatívnych foriem prvokov sú metódy škrabania, flotácie, sedimentácie, larvoskopia, protozooskopie, štúdium žlče a metódy farbenia náterov výkalov, spúta atď.

Jednoduché metódy na vyšetrenie výkalov

natívny náter. Z rôznych častí podávanej porcie sa drevenou tyčinkou odoberie malá čiastočka exkrementu, dobre sa rozotrie na podložnom sklíčku v kvapke 50% roztoku glycerínu a na 2-3 podložných sklíčkach sa urobí tenký náter. Najmenej 3 preparáty sa skúmajú pod mikroskopom. Nevýhoda metódy: pozerá sa na malé množstvo materiálu, preto sa nepoužíva ako samostatná metóda.

Metóda krútenia(Shulman). 2,0 až 3,0 g výkalov sa umiestni do pohára, dôkladne sa premieša sklenenou tyčinkou s 5-násobným objemom fyziologického roztoku alebo destilovanej vody, pričom sa rýchlo pohybuje 2 až 3 minúty a tyčinka sa rýchlo vyberie zo zmesi. Kvapka zmesi na konci tyčinky sa prenesie na podložné sklíčko a podrobí sa mikroskopii. Princíp odstredivej sily spôsobuje nahromadenie vajíčok a lariev na palici.

Metóda hrubého rozmazania Kato s celofánom. Chemické činidlá: 100% glycerol, 6% roztok fenolu (100 ml vody + 6 g fenolu), 3% roztok malachitovej zelene (2,5 ml destilovanej vody + 75 ml malachitovej zelene).

Príprava pracovného roztoku: 100 ml 6% roztoku fenolu + 100 ml čistého glycerínu + 1,2 ml 3% roztoku malachitovej zelene.

Príprava celofánových prúžkov: narežú sa celofánové prúžky, ktorých veľkosť zodpovedá podložnému sklíčku. Celofán musí byť hydrofilný (vhodný je celofán, ktorý horí, ak sa roztopí, tak je nevhodný). V pracovnom roztoku je možné spracovať až 5 tisíc pásov. Doba expozície celofánových prúžkov, kým sú pripravené na použitie v pracovnom roztoku, je najmenej 24 hodín.

Pokrok vo výskume. 50 mg výkalov (veľkosť veľkého hrášku) sa nanesie na podložné sklíčko, rozotrie sa jednotlivou tyčinkou (sklenená, drevená), prikryje sa celofánovým prúžkom a navrchu sa rozotrie gumenou zátkou, kým sa nedosiahne rovnomerný hustý náter. . Liečivo sa suší pri izbovej teplote hodinu alebo v termostate pri 40°C 20-30 minút a mikroskopicky (dobu expozície možno pri izbovej teplote predĺžiť na 5-6 hodín alebo viac).

Z hľadiska účinnosti sa táto metóda približuje k metóde flotácie, ale odhaľuje intenzívnu a strednú intenzitu invázie.

Používa sa ako nezávislá diagnostická metóda a odporúča sa na hromadné vyšetrenie populácie.

V klinických diagnostických laboratóriách sa používa ako jednotná metóda na diagnostiku helmintov pri absencii špecifických diagnóz v pokynoch lekárov.

Metódy perianálneho škrabania a natívneho náteru Lugolovým roztokom sú popísané v časti o špeciálnych metódach.

Sofistikované metódy obohacovania fekálií

Metódy obohacovania sú založené na rozdiele v špecifickej hmotnosti vajíčok helmintov a použitom soľnom roztoku.

Pri aplikácii flotačnej metódy je možné použiť nasledujúce soľné roztoky:

1. Roztok dusičnanu olovnatého PbNO3 (dusičnan olovnatý) s hustotou 1,5. Pripravené v množstve 650 g látky na 1 liter vody. Soľ sa po častiach rozpustí v horúcej vode v smaltovanej miske, zahrieva sa na sporáku a neustále sa mieša, kým sa úplne nerozpustí. Roztok nie je potrebné filtrovať. Roztok sa pripravuje v deň štúdie, pretože sa časom vyzráža a jeho hustota začne klesať po 24 hodinách. vo veľkom počte, potom v nasledujúcich dňoch pred štúdiom sa zahrieva a mieša sediment. Príprava roztoku sa vykonáva v digestore, pretože dusičnan olovnatý je soľ ťažkého kovu.

2. Roztok dusičnanu amónneho NH4NO3 (granulovaný alebo obyčajný dusičnan amónny) s hustotou 1,3 sa pripraví rovnakým spôsobom ako predchádzajúci, ale v množstve 1500 g látky na 1 liter. horúca voda.

3. Pripraví sa roztok dusičnanu sodného NaNO3 alebo dusičnanu sodného s hustotou 1,38-1,4 v množstve 1000 g látky na 1 liter horúcej vody.

4. Pripraví sa roztok tiosíranu sodného Na2S2O3×5H2O (hyposiričitan sodný) s hustotou 1,4 v množstve 1750 g látky na 1 liter horúcej vody.

5. Pripraví sa roztok síranu sodného Na2SO4 (epsomská soľ) s hustotou 1,26-1,28 v množstve 920 g látky na 1 liter horúcej vody.

6. Pripraví sa roztok chloridu zinočnatého ZnCl2 (chlorid zinočnatý) s hustotou 1,82 v množstve 2000 g látky na 1 liter horúcej vody. Ochladený roztok nekryštalizuje.

7. Nasýtený roztok chloridu sodného NaCl (bežná soľ) s hustotou 1,18-1,2. Na! l vody, po častiach pridajte 400 - 420 g soli do smaltovaného vedra s vriacou vodou za stáleho miešania, kým sa úplne nerozpustí. Ako sa roztok ochladzuje, vyzrážajú sa kryštály chloridu sodného.

Merná hmotnosť flotačných roztokov sa meria aerometrom až po úplnom vychladnutí roztoku pri izbovej teplote.

Flotačné metódy sú najúčinnejšie na detekciu vajíčok pásomnice pygmej, vretenice, hákovca, ascaris a pásomnice širokej.

Povrchovú fóliu je možné odstrániť drôtenou slučkou alebo skleneným sklíčkom.

V nasýtenom roztoku chloridu sodného je možné film skúmať po 30-40 minútach, v roztoku dusičnanu amónneho - po 10-20-30 minútach po usadení.

Pri odstraňovaní filmu pomocou drôtenej slučky sa skúma najmenej 8 kvapiek.

Sklíčka sa z filmu odstránia viac vajec než drôtené slučky. Sklo musí byť v kontakte s kvapalinou flotačného roztoku, ktorá sa pridáva do kadičky pomocou pipety. Po usadení sa sklo vyberie, navlhčený povrch položíme na sklo väčšia veľkosť a skúmané pod mikroskopom. Sklíčka musia byť pred použitím odmastené.

Na výskum musíte mať: podložné sklíčka, chemické poháre, drôtené slučky, kyvety, Petriho misky, pipety, hrušky, sklenené alebo drevené varešky.

Pokrok vo výskume. 5 g výkalov sa zaleje 10-násobným množstvom flotačného roztoku (najlepšie so špecifickou hmotnosťou 1,38-1,40), dôkladne sa premieša, nerozpustné veľké častice sa odstránia zhora a suspenzia sa nechá 10-15 minút. Potom sa film odstráni buď pomocou slučky na podložnom sklíčku alebo pomocou podložného skla. Na riedenie výkalov je lepšie vziať poháre s objemom 30-50 ml, naliať roztok zarovnaný s okrajmi (alebo podplniť 2-3 mm) a zmes prikryť podložným sklíčkom a potom pridať flotačný roztok pipetujte, kým sa nedostane do kontaktu so sklíčkom. Po 10-20 minútach sa sklo rýchlo vyberie a film, ktorý na ňom zostane, sa mikroskopicky skenuje bez krycieho skla.

Usadzovacie-sedimentačné metódy

Sedimentačné metódy sa používajú na detekciu vajíčok geohelmintov, biohelmintov vo výkaloch a ako špeciálne metódy výskumu opisthorchiázy.

Goryachev-Zolotukhin metóda(zjednodušená Gorjačovova metóda). Asi 1,5 g výkalov sa rozmieša v chemickom pohári v 3-4 ml vody. Výsledná suspenzia sa prefiltruje cez dve vrstvy gázy do centrifugačnej skúmavky, pričom sa opatrne navrství na vrch 4 až 5 ml nasýteného roztoku chloridu sodného, ​​ktorý je v nej prítomný. Skúmavky sa umiestnia do stojana na 15-20 hodín.Počas tejto doby sa usadia ťažké vajíčka motolice. Získajte dve jasne ohraničené vrstvy. Sediment sa mikroskopicky skúma.

Éter-formalínová metóda. Používa sa na diagnostiku všetkých črevných invázií a ako špeciálna metóda pre vajíčka prvokov a opisthorchií.

Vybavenie: odstredivka pri 3000 ot./min.; odstredivkové odmerné skúmavky, lieviky; kovové sitko (čaj) alebo dvojvrstvový obväz; Podložné sklíčka a krycie sklíčka; drevené (alebo sklenené) palice; bavlna, obväz.

Chemické činidlá: 10 % roztok formalínu (1 diel farmaceutického roztoku formalínu a 4 diely destilovanej vody); etyléter (lekársky).

7 ml 10% roztoku formalínu sa naleje do centrifugačných skúmaviek a umiestni sa 1 g výkalov (také množstvo výkalov, že roztok v skúmavke stúpne na 8 ml). Výkaly sa miešajú s formalínom, kým sa nevytvorí homogénna zmes, a potom sa prelejú cez kovové sitko (alebo dvojvrstvovú gázu, obväz) do ďalšej skúmavky odstredivky (ak na sitku zostanú výkaly, treba sitko prepláchnuť formalínom). Do tejto centrifugačnej skúmavky pridajte 2 ml éteru, zazátkujte a 30 sekúnd intenzívne pretrepávajte.

Zmes sa centrifuguje pri 3000 otáčkach za minútu počas jednej minúty (možné dve minúty pri 1500 otáčkach za minútu). V dôsledku reakcie éter-formalínu dochádza ku koagulácii proteínov vo forme korku na vrchu skúmavky a k vyzrážaniu vajíčok helmintov. Vrstva koagulantu sa odstráni, supernatant sa vypustí, zrazenina sa nanesie na podložné sklíčko priamo zo skúmavky alebo Pasteurovou pipetou, prekryje sa krycím sklíčkom a prezrie sa pod mikroskopom.

Metóda zrážania éterom a octom. Princípom éterovo-octového zrážania vajíčok hlíst je postupné ošetrenie vzoriek výkalov 10 % vodným roztokom octová kyselina a éter. Kyselina octová je lepšia ako ostatné chemické zlúčeniny emulguje vzorku stolice. Preniká do nestrávených častíc, pozostávajúcich najmä z vlákniny, ktorá, keď skvelý obsah zasahovať do výskumu zrážaním po odstredení. Následné pridanie éteru do skúmavky a miešanie vedie k extrakcii kyseliny octovej z obsahu skúmavky spolu s fekálnymi časticami, ktoré sú ňou impregnované. Keďže merná hmotnosť zmesi éteru a kyseliny octovej je menšia ako merná hmotnosť vody, vzorky stolice ošetrené týmito látkami sa vznášajú a vajíčka helmintov, ktoré majú veľkú špecifickú hmotnosť, sa usadia.

Množstvo zrazeniny získané po vyzrážaní éterom a octom je 3 až 4-krát menšie ako po vyzrážaní éterom a formalínom. To značne uľahčuje detekciu vajíčok helmintov v ňom a umožňuje študovať sediment ako celok so vzorkou 0,5-1 g Toxicita éterovo-octovej metódy je 5-krát nižšia.

Pokrok vo výskume. 7 ml 10 % roztoku kyseliny octovej sa naleje do odstredivej skúmavky a pridá sa 1 g vzorky stolice (t. j. také množstvo stolice, pri ktorom roztok kyseliny octovej stúpne na 8 ml). Dôkladne premiešajte pohárom alebo drevenou vareškou. Preceďte cez lievik s dvoma vrstvami gázy do inej centrifugačnej skúmavky. K emulzátu sa pridajú 2 ml etyléteru (t.j. do 10 ml). Skúmavky sa uzavrú gumovou zátkou (je možné z injekčnej liekovky s penicilínom) a pretrepávajú sa 15 sekúnd. Po odstránení zátky sa skúmavky odstreďujú jednu minútu pri 3000 otáčkach za minútu počas 2 minút. Supernatant sa zo skúmavky odstráni. V niektorých prípadoch vytvorená fekálna zátka interferuje s výtokom supernatantu. V tomto prípade sa korok oddelí od stien skúmavky sklenenou alebo drevenou tyčou. Celá zrazenina sa napipetuje na podložné sklíčko a pod krycím sklíčkom sa pri malom zväčšení podrobí mikroskopii. Zrazenina je zvyčajne malá a bezfarebná. Vajíčka hlíst, najmä malých motolíc, sú dobre detekované.

Chemická sedimentačná metóda. Princíp štúdie je založený na sedimentácii vajíčok zo vzorky stolice vo fyziologickom roztoku so špecifickou hmotnosťou 1,15. Podstata metódy spočíva v priamom odstreďovaní skúmavky, pri ktorej sa zátka stolice emulgovaná v 1% roztoku kyseliny octovej navrství na roztok dusičnanu sodného (hmotnosť 1,16). Vysoká merná hmotnosť soľného roztoku a bublinky uvoľnené chemickou reakciou, prenikajúce vrstvou homogenizovaných výkalov, zabraňujú jeho sedimentácii. Vajíčka helmintov sa vyzrážajú s malým množstvom vlákniny. Sediment možno vyčistiť od zvyškov detritu tak, že sa naň pôsobí 10 % kyselinou octovou a éterom. V tomto prípade zostáva iba jedno helmintové vajíčko, čo značne uľahčuje ich identifikáciu.

Pokrok vo výskume. 6 ml roztoku dusičnanu sodného so špecifickou hmotnosťou 1,15 sa naleje do odmernej centrifugačnej skúmavky. Do ďalšej skúmavky nalejte 7 ml 1% roztoku kyseliny octovej. Zavedie sa vzorka výkalov (až po značku 7,5 ml pre vzorku 0,5 g a do 8 ml pre vzorku 1,0 g). Vzorku dôkladne premiešajte sklenenou tyčinkou. Precedíme cez lievik s jednou vrstvou gázy a navrstvíme na roztok dusičnanu sodného. Skúmavka s vrstveným filtrátom sa 5 minút odstreďuje pri 1500-2000 ot./min. Zlikvidujte supernatant rýchlym prevrátením skúmavky. Do skúmavky so zrazeninou pridajte 3-4 ml 10% roztoku kyseliny octovej a 0,5 ml éteru, uzatvorte gumovou zátkou a pretrepte. Opakujte centrifugáciu počas 1 minúty. Zlikvidujte supernatant. Zrazenina sa prenesie na podložné sklíčko, prikryje sa krycím sklíčkom a skúma sa pod mikroskopom.

HELMINTOLOGICKÉ ŠTÚDIE ŽĽUČKY, OBSAHU DUODENÁLNEHO, spúta, KRVI, MOČU A SVALOV

Detekcia vajíčok a lariev helmintov v obsahu dvanástnika a žlči. Štúdium obsahu žlče a dvanástnika sa vykonáva s podozrením na helmintiázy pečene a žlčníka (opistorchiáza, klonorchiáza, dikroceliáza) a dvanástnik(strongyloidóza).

Pokrok vo výskume. Duodenálny obsah a žlč (časti A, B, C) sa získajú obvyklým spôsobom pomocou sondovania. Pre časť B sa odporúča získať reflex žlčníka zavedením 33 % roztoku cez sondu síran horečnatý. Zo skúmanej kvapaliny sa vyberú vločky plávajúce v nej a prezerajú sa pod mikroskopom a potom sa zmiešajú s rovnakým množstvom éteru síry. Zmes sa dôkladne pretrepe a odstredí. Supernatant sa odstráni a celá zrazenina sa skúma pod mikroskopom.

Pri absencii hnisu a hlienu sa obsah žlče a dvanástnika odstredí bez zmiešania s éterom.

Vyšetrenie spúta. V helmintologickej praxi sa vykonáva vyšetrenie spúta laboratórna diagnostika paragonimóza. Niekedy sa zistia vajíčka schistosome, larvy ascaris, prvky echinokokového močového mechúra.

Zo spúta sa pripraví natívny náter na podložnom sklíčku, ktorý sa skúma pod mikroskopom.

S bohatým obsahom hnisu v spúte sa zmieša s 0,5% roztokom hydroxidu sodného alebo hydroxidu draselného, ​​pretrepáva sa 5 minút a odstredí sa. Sediment sa mikroskopicky skúma.

Štúdia krvi. Krv sa vyšetruje, ak má pacient podozrenie na filariózu.

Vzhľadom na to, že pri niektorých typoch filarióz (loiáza, wuchererióza spôsobená subperiodickým kmeňom) sú larvy (mikrofilárie) v periférna krv len cez deň a pri niektorých (brugiaza, wuhererióza spôsobená periodickou záťažou) - iba v noci, respektíve v tomto čase berú krv na rozbor.

Technika odberu krvi, príprava preparátov (tenký náter a hrubá kvapka), ich farbenie (podľa Romanovského) a štúdia sú podobné ako pri laboratórnej diagnostike malárie.

mikrofilárie odlišné typy sa líšia dĺžkou, šírkou, zakrivením tela, prítomnosťou alebo neprítomnosťou uzáveru, tvarom chvostového konca, umiestnením jadrovej substancie v tele a chvostovou oblasťou lariev.

Pokrok vo výskume. Moč sa usadzuje najmenej 30 minút, potom sa vrchná vrstva scedí, pričom zostane 10 – 15 ml sedimentu, ktorý sa naleje do centrifugačných skúmaviek a odstreďuje 1 – 2 minúty. Po vypustení supernatantu sa zrazenina prenesie na podložné sklíčko a skúma sa pod mikroskopom.

ŠTÚDIA SVALOVEJ BIOPTY

Trichinoskopická metóda. Potreba štúdia bioptických vzoriek svalov pacienta vzniká pri podozrení na trichinelózu.

Biopsia sa vykonáva podľa všeobecných pravidiel. Z deltového svalu sa zvyčajne robí biopsia. Pri patoanatomickom vyšetrení je možné urobiť biopsiu svalov bránice, pažeráka, jazyka, žuvacích a medzirebrových svalov, ohýbačov končatín, svalov očnej buľvy, keďže sú larvami Trichinella najviac postihnuté.

V laboratóriu sa bioptovaný kúsok svalu rozreže na veľmi malé kúsky (mikrotóm), ktoré sa vložia medzi dva poháre, rozdrvia svalové vlákna a vyšetrí sa pod mikroskopom. V súčasnosti sa na tento účel široko používajú špeciálne mikroskopy, trichineloskopy.

V prípade trichinelózy trichinoskopia pozdĺž svalových vlákien odhalí ostro vystupujúce kapsuly trichinelózy oválneho tvaru (podobné citrónu). Priemerná veľkosť ľudských kapsúl je 0,4 x 0,26 mm. Kapsula spravidla obsahuje jednu trichinelu špirálovito zloženú do 2,5 závitu. Pri vysokej intenzite invázie môže jedna kapsula obsahovať 2 alebo 3 larvy. Svalové vlákna susediace s kapsulou strácajú svoje priečne pruhovanie a nadobúdajú homogénny vzhľad.

Mäso sa skúma rovnakým spôsobom mäsové výrobky ktoré spôsobili infekciu.

Metóda trávenia svalov. Metóda je efektívnejšia.

Pokrok vo výskume. Študované svaly sú jemne nasekané a naplnené umelou žalúdočnou šťavou v pomere 1:15-20. Výsledná zmes sa umiestni na 12-16 hodín do termostatu pri 37°C.Po uplynutí tejto doby sa mikroskopuje sediment, v ktorom sa medzi masou zvyškov natrávených svalových vlákien nachádzajú voľné larvy Trichinella.

Umelá žalúdočná šťava sa dá kúpiť v lekárni alebo pripraviť v laboratóriu. Za týmto účelom pridajte 10 ml koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej do 1 litra destilovanej vody; pred použitím sa do 1 litra zriedenej kys. pridá 30 g pepsínu.

KVANTITATÍVNE VÝSKUMNÉ METÓDY

Kvantitatívne metódy výskumu sa využívajú pri zisťovaní intenzity invázie, hodnotení účinnosti rôznych antihelmintík, zisťovaní kvality odčervenia, sledovaní prebiehajúcich hromadných liečebno-preventívnych opatrení a pod.

Kvantitatívne stanovenie vajíčok helmintov sa uskutočňuje dvoma metódami: metódou Stoll a metódou Krasilnikova a Volkovej (1974).

Stollova metóda. Na vykonanie štúdie musíte mať mikroskop, sklenenú banku s označením 56 a 60 ml, odmerný valec, sklenené guľôčky, gumenú zátku do banky, odmerné pipety, podložné sklíčka a 0,4 % roztok hydroxidu sodného.

Pokrok vo výskume. Do banky s odmerným valcom nalejte desaťnormálny roztok hydroxidu sodného (koncentrácia približne 0,4 %) až po značku 56 ml a pridávajte výkaly, kým hladina tekutiny nedosiahne značku 60 ml (t. j. 4 ml výkalov). Zmes sa dôkladne pretrepáva so sklenenými guľôčkami po dobu 1 minúty, pričom nádoba sa uzatvorí gumovou zátkou (môžete miešať aj tyčinkou). Ihneď po pretrepaní sa 0,075 ml zmesi odoberie odmernou pipetou (obsahuje 0,005 ml výkalov), prenesie sa na podložné sklíčko a pod mikroskopom sa spočíta počet vajíčok v prípravku. Na určenie počtu vajíčok v 1 g výkalov sa nájdený počet vynásobí 200.

Porovnanie počtu vajíčok v prípravku, zistených u pacienta pred a po liečbe, nám umožňuje posúdiť účinnosť odčervenia.

Stollova metóda je jednoduchá, dáva porovnateľné výsledky pri všetkých helmintiázach, ktorých patogény systematicky vylučujú vajíčka do pacientových čriev. Nevýhodou metódy je však jej relatívne nízka citlivosť, najmä pri nízkej intenzite invázie.

Krasilnikov-Volkova metóda. Pri skúmaní tejto metódy sa minimálne 1 g výkalov zmieša v sklenenej banke alebo veľkej skúmavke s 1% roztokom Lotus (alebo 1,5% roztokom Extra) v pomere 1:10. Suspenzia sa dôkladne pretrepáva, kým sa nevytvorí homogénna suspenzia, potom sa rýchlo odoberie 0,1 ml suspenzie (zodpovedá 0,01 g stolice) pomocou odmernej pipety a prenesie sa na podložné sklíčko. Prípravok sa prikryje krycím sklom alebo celofánovou doskou (20 x 30 mm), vyzrieva minimálne jeden deň v 50 % vodný roztok glycerín.

Spočítajte počet vajec v celej príprave. Na výpočet počtu vajec v 1 g výkalov je potrebné výsledné číslo vynásobiť 100.

Táto metóda má oproti Stollovej metóde množstvo výhod. Po prvé, je citlivejší a umožňuje odhaliť helminty s nízkym stupňom invázie. Po druhé, je to veľmi výhodné pre hromadné skúšky, pretože roztoky detergentov, ktoré sú konzervačnými látkami pre vajíčka hlíst, umožňujú vykonávať štúdie nie celkom čerstvého materiálu. Predpokladom na to je však zber fekálií priamo do čistiaceho roztoku.

Pre kvantitatívny výskum možno použiť ktorúkoľvek z opísaných jednotných kvalitatívnych metód založených na princípe plávajúcich vajec. Ale v tomto prípade by sa na analýzu malo odobrať rovnaké množstvo výkalov, rovnaký objem flotačného roztoku. Stupeň invázie je možné vypočítať s vedomím počtu vajíčok v 1 g výkalov podľa nižšie uvedenej tabuľky.

Intenzita invázie v závislosti od počtu vajíčok helmintov

v 1 g výkalov

SÉROLOGICKÁ DIAGNOSTIKA

Tieto metódy, založené na detekcii špecifických protilátok v krvnom sére, sa používajú na diagnostické a skríningové účely.

Sérologické metódy zahŕňajú:

kruhová precipitačná reakcia (RCP) (trichinóza, cysticerkóza);

Reakcia zrážania krúžku v skúmavkách v chlade (trichinóza, cysticerkóza);

Reakcia mikroprecipitácie na živých larvách (trichinóza, askarióza);

Reakcia nepriamej hemaglutinácie (RIHA) (trichinóza, echinokokóza, alveokokóza, cysticerkóza atď.);

Latexová aglutinačná reakcia (RAL) (echinokokóza, alveokokóza, trichinelóza, teniarinhoz atď.);

Reakcia fixácie komplementu (RCC) (trichinóza, echinokokóza, cysticerkóza);

Reakcia enzýmovo značených protilátok (REMA) (echinokokóza, onchocerciáza, schistosomiáza, trichinelóza, toxokaróza);

ELISA (trichinóza, opisthorchiáza, toxokaróza, toxoplazmóza atď.).

Na nastavenie sérologických reakcií sa vyrábajú štandardné antigény alebo sa pripravujú nezávisle (napríklad z echinokokových mechúrov oviec), vyrábajú sa špeciálne testovacie systémy pre ELISA.

Špeciálne metódy výskum enterobiózy, taeniarhynchózy, taeniaózy

Škrabanie z perianálnych záhybov. Na získanie zoškrabania z perianálnych záhybov môžete použiť drevenú špachtľu, celofánový pásik, celulózový papier alebo pásku, tyčinky na oči so špeciálnou lepiacou vrstvou:

a) škrabanie drevenou špachtľou (špachtľa je sploštená zápalka alebo palica) navlhčenou 1 % roztokom glycerínu (alebo 0,5 % roztokom pitná sóda), sa vykonáva ľahkým zoškrabaním z povrchu perianálnych záhybov po celom obvode konečníka. Výsledný zoškrab sa prenesie okrajom krycieho sklíčka z konca špachtle na sklíčko do kvapky 50% roztoku glycerolu, prekryje sa rovnakým krycím sklíčkom a podrobí sa mikroskopii. Nevýhodou metódy je nedostatok detekcie vajec a dráždivý účinok;

b) podľa Torgushinovej metódy sa urobí splachovanie vatový tampón na drevenú alebo inú špachtľu navlhčenú 50 % roztokom glycerínu a na podložnom sklíčku pripravte náter v kvapke glycerínu;

c) podľa metódy Kevorkovej sa asi 5 ml naleje do centrifugačnej skúmavky prevarená voda, vložte do nej špachtľu (tyčinku) s vatovým tampónom. Pred odberom materiálu sa tampón mierne pritlačí k vnútornej stene skúmavky, utrie sa ním perianálne záhyby a špachtľa s tampónom sa vloží do skúmavky. Tampón v skúmavke sa dôkladne pretrepe, premývacia kvapalina sa odstreďuje 3 minúty a výsledná zrazenina sa skúma pod mikroskopom;

d) zoškrabanie lepiacou páskou podľa Grahama. Kúsok lepiacej pásky (priehľadná polyetylénová páska s lepiacou vrstvou pre detskú kreativitu, ale je lepšie použiť operačnú fóliu LPO-1, LPO-2) v dĺžke 8-10 cm sa lepiacou vrstvou nalepí na perianálne záhyby kože, držte ju za konce a potom sa preniesli na predmetné sklo lepivou vrstvou nadol (konce pásky, ktoré presahujú okraje skla, sú odrezané), okuliare sú očíslované a údaje o pacientovi a číslo pohára sa zaznamená do denníka. V laboratóriu sa páska na jednom konci na veľkú vzdialenosť odlepí, nakvapká sa pod ňu 1-2 kvapky vazelínového oleja alebo glycerínu (na odstránenie optických defektov) a mikroskopuje sa;

e) škrabanie sklenenými očnými tyčinkami, ktorých povrch je potiahnutý špeciálnou lepiacou kompozíciou. Očné tyčinky sú inštalované v špeciálnom statíve. Materiál sa odoberá kontaktom plochej časti špachtle na kožu perianálneho otvoru. Potom je tyč opäť upevnená v statíve na prepravu. Mikroskopia sa vykonáva priamo na špachtli obojstranne (bez sklíčok a krycích sklíčok) s predmontážou do kaziet pri malom zväčšení (okulár x 10, objektív x 8). Na konci práce sa tyčinky dezinfikujú varením v mydlovom roztoku a statív a kazety sa ošetria alkoholom a umyjú sa mydlovým roztokom sódy. Zloženie lepidla: cleol - 10 g, Ricínový olej- 2,5 g, etyléter - 5 g, etylalkohol 96% - 2,5 g.

Špachtle sa ponoria do roztoku lepidla a potom sa sušia na vzduchu pri izbovej teplote. Priľnavý film vytvorený na povrchu zostáva niekoľko dní.

Metóda je vhodná na hromadné vyšetrenie detskej populácie na enterobiózu a dospelej populácie na tenidózy.

Okrem metódy škrabania pri teniarhynchóze a teniáze sa používa aj metóda prieskumu a makroskopická metóda opísaná vyššie (pri detekcii segmentov).

Špeciálne metódy výskumu strongyloidózy

Éterovo-octová metóda sa používa na detekciu vajíčok (pozri vyššie) a Bermanova metóda na detekciu lariev v stolici.

Bermanova metóda. Preskúmajte čerstvé výkaly, lepšie po užití preháňadla. Vzorka trusu s hmotnosťou 5 g sa umiestni na kovové sito (sieťka je vo vnútri vystlaná dvoma vrstvami gázy) v sklenenom lieviku upevnenom na statíve. Na spodný koniec lievika sa nasadí gumená hadička so svorkou (Bermanov prístroj).

Sieťka s výkalmi sa zdvihne a do lievika sa naleje voda zohriata na 40-50 °C tak, aby spodná časť sieťky bola ponorená do vody a výkaly boli úplne pokryté vodou. Po 2-4 hodinách sa svorka na gumenej trubici rýchlo otvorí a kvapalina klesne do odstredivkovej trubice. Po odstredení (1-2 min.) vyššia časť kvapalina sa rýchlo scedí a zrazenina v množstve 1 ml sa nanesie v tenkej vrstve na podložné sklíčko a mikroskopicky pri malom zväčšení mikroskopu.

Metóda IMP a TM. Časť výkalov veľkosti orecha sa umiestni do chemickej kadičky, naleje sa teplým 40 ° C fyziologickým roztokom tak, aby sa výkaly pokryli roztokom, nechá sa 20 minút. Po 20 minútach sa kvapalina naleje do Petriho misky a pozoruje sa pod MBS binokulárnym mikroskopom.

Na diagnostiku strongyloidózy, najmä na sledovanie účinnosti liečby, sa odporúča kombinovať Bermanovu metódu so štúdiom duodenálneho obsahu.

Špeciálne metódy výskumu nematodózy

Nematózy

Ascariáza

V anamnéze sa upriamuje pozornosť na postoj k záhradníctvu, záhradkárstvu. Jesť surovú zeleninu, šaláty z tejto zeleniny.

Klinické prejavy počiatočnej fázy askariózy sú dôsledkom alergických zmien v tele. Skoré alebo migrujúce larválne štádium askariózy sa často vyskytuje v prítomnosti horúčky s telesnou teplotou do 38 ° a viac, s komplexom symptómov poškodenia pľúc a s prítomnosťou závažnej krvnej eozinofílie. Vo väčšine prípadov sú u detí prvými príznakmi ochorenia malátnosť, slabosť, opakujúce sa bolesti hlavy, potenie, niekedy aj bolesti svalov a kĺbov. Často sa vyskytuje hojná vyrážka typu urtikárie so závažným alebo stredne závažným svrbením. Diagnózu včasnej fázy potvrdzujú röntgenové štúdie na prítomnosť prchavých častíc v pľúcach. eozinofilné infiltráty Leffler. Nátery z čerstvého spúta často ukazujú eozinofilné bunky, červené krvinky, Charcot-Leidenove kryštály a larvy ascaris.

V črevnom imaginárnom štádiu askariózy dochádza ku kombinácii prejavov z gastrointestinálneho a astenického syndrómu, enterokolického symptómy bolesti. U detí často dochádza k poklesu hmotnosti, niekedy aj dosť výrazne. Nevoľnosť, zvýšené slinenie, podráždenosť, zadržiavanie psychomotorický vývoj, znížená inteligencia.

Na laboratórnu diagnostiku črevnej st

Ershova I.B., Osychnyuk L.M., Mochalová A.A., Štátna inštitúcia „Štát Lugansk lekárska univerzita“, Klinika pediatrie s detskými infekciami.
Článok bol publikovaný v časopise "Aktuálna infektológia", č.2 (3), 2014.
Informačný zdroj "Vydavateľstvo Zaslavsky" www.mif-ua.com

Článok popisuje metódy diagnostiky helmintických invázií: mikroskopické, enzýmové imunoanalýzy, sérologické, polymerázová reťazová reakcia, biorezonančná diagnostika, hemoskenovanie, ako aj inštrumentálne (ultrazvukové a röntgenové vyšetrenie, počítačová tomografia) a laboratórne, ktoré majú nepriamy význam ( klinická analýza krvný test, pečeňový test, test stolice na dysbakteriózu). Opísané sú výhody metód, ich nevýhody a spoľahlivosť získaných údajov. Pre pacientov sú navrhnuté dotazníky na identifikáciu rizika infekcie helmintmi. Opísané sú výhody metód, ich nevýhody a spoľahlivosť získaných údajov. Pre pacientov sú navrhnuté dotazníky na identifikáciu rizika infekcie helmintmi.

Helminty majú negatívny vplyv na ľudský organizmus. Vedú k alergizácii, rozvoju polyhypovitaminózy, makro- a mikroelementóz, poruche krvotvorby a vaskulárnej permeability a hormonálnej nerovnováhe. Helmintiázy prispievajú k vzniku chronických ochorení (cholecystitída, cholelitiáza, pankreatitída, kolitída, cukrovka, bronchiálna astma, atopická dermatitída), psychoemočné poruchy ( chronická únava, podráždenosť, úzkosť, hyperaktivita u detí), anémia atď. Pri dlhšej helmintickej invázii sa môže vyvinúť sekundárna imunodeficiencia.

Ostražitosť lekárov ohľadom helmintiáz v populácii je v súčasnosti nedostatočná a prevencia sa redukuje na liečbu zistených infikovaných pacientov.

Diagnóza helmintiáz na základe klinických epidemiologických a laboratórnych údajov. Príznaky ako astenický syndróm, recidivujúca žihľavka, zhoršená regenerácia kože a slizníc, ťažko liečiteľná atopická dermatitída a broncho-obštrukčný syndróm, polylymfadenopatia a hepatosplenomegália neznámeho pôvodu, adenoidné vegetácie II-III stupňa, „geografický“ jazyk, znížená alebo selektívna chuť do jedla, nestabilná stolica, môže naznačovať prítomnosť helmintov.

o sérologická štúdia určiť prítomnosť protilátok proti helmintom (spoľahlivosť - asi 60%): pri podozrení na echinokokózu, cysticerkózu, trichinelózu, toxokarózu sa široko používa nepriama hemaglutinácia, latexová aglutinácia, fixácia komplementu, imunofluorescenčné reakcie.
Nie vo všetkých prípadoch majú metódy na stanovenie špecifických protilátok dostatočnú špecifickosť a spoľahlivosť. Antigénne zloženie helmintu závisí nielen od druhu, ale aj od štádia; prechádza zložitým cyklom vývoja od vajíčka po dospelý, helminty menia antigénne zloženie. Okrem toho sa pri imunodiagnostických reakciách využívajú somatické protilátky a v organizme hostiteľa sa tvoria protilátky najmä proti exkréciám a sekrétom helmintov. Nešpecifická senzibilizácia organizmu, zhoda niektorých antigénov motolíc, prvokov a ľudí vytvára vysoký podiel falošne pozitívnych reakcií v titroch pod spoľahlivo diagnostickými.

Metóda určovania helmintov pomocou polymerická reťazová reakcia je vysoko špecifická a vysoko citlivá, no pre vysokú cenu a náročnosť nemôže ísť o skríning, keď je napríklad potrebné vyšetriť skupinu detí z detského ústavu.

Imunitný systém nie vždy reaguje (rozpozná a zničí) na prítomnosť helmintov v tele. Niektoré helminty totiž majú pevnú a chemicky odolnú kapsulu alebo sú potiahnuté látkou, ktorú nemožno rozoznať. imunitný systém; lokalizované v tkanivách, ktoré sú najviac chránené pred zápalovými reakciami, napríklad v miecha; mnohé druhy vylučujú v tráviacom trakte antienzýmy, čo ich zachraňuje pred smrťou; mať dlhú očakávanú dĺžku života (roky a niekedy až do smrti samotnej osoby); živia sa glykolýzou čistých sacharidov; mať také zariadenia, ako sú prísavky, háčiky atď., Čo prispieva k fixácii vo vnútri tela; u mnohých druhov dochádza k sexuálnej reprodukcii, pri ktorej dochádza k výmene genetických informácií, čo vedie k zvýšeniu heterogénnej populácie, zníženiu zraniteľnosti; vlastniť vysoký stupeň plodnosť.

o ultrazvukové , Röntgenové vyšetrenie orgánov brušná dutina , Počítačová tomografia je možné identifikovať nepriame príznaky helmintiáz: hepatosplenomegáliu, nerovnomerný parenchým pečene a sleziny v dôsledku malých hyperechoických signálov, zväčšené lymfatické uzliny v hile sleziny a samotných helmintov (echinokoky, spleti črevných helmintov atď.).

Hemosskenovanie - kvalitatívna štúdia krvi pomocou výkonného mikroskopu v tmavom poli, môžete vidieť stav krviniek (tvar, veľkosť, aktivitu, farbu atď.), prítomnosť nešpecifických prvkov a látok - to všetko priamo alebo nepriamo indikuje prítomnosť helmintov v tele. Obraz sa zobrazuje na obrazovke monitora pomocou vstavanej videokamery v mikroskope. Táto diagnostická metóda má vysokú spoľahlivosť.

Nepriame laboratórium znamenia helmintiázy môže sa vyskytnúť anémia, bazofília, eozinofília, zvýšenie hladiny aspartátaminotransferázy. Takže pri toxokaróze sa zistí leukemoidná reakcia eozinofilov (viac ako 20%) na pozadí pretrvávajúcich alergický syndróm(atopická dermatitída so silným svrbením a odolnosťou voči tradičná terapiaťažká bronchiálna astma). Inhibícia normálnej E. coli pri analýze výkalov na dysbakteriózu môže tiež naznačovať možnú helmintiázu.

Vzhľadom na prevalenciu helmintiáz navrhujeme dotazník určiť riziko infekcie helmintmi.

• Plávať v sladkej vode.
• Pred jedlom si neumývajte ruky mydlom a horúcou vodou.
• Pitná voda z neoverených zdrojov.
• Jedzte domácu masť s pásikmi mäsa.
• Jedzte solené ryby.
• Jedzte nedostatočne tepelne upravené mäso (s krvou).
• Jedzte nevýrobný jemne nasolený kaviár.
• Kuracie vajcia neumývajte mydlom.
• Banány, pomaranče, mandarínky pred použitím neumývajte.
• Hnojte svoju záhradu maštaľným hnojom.
• Jedzte zeleninu priamo zo záhrady.
• Jedzte ovocie a bobule priamo zo záhrady.
• Konzumujte opadané ovocie.
• Všetku zeleninu nezalievajte vriacou vodou na šaláty.
• Mrkvu skladujte v piesku prevzatom z dvora.
• Choďte naboso po tráve.
• Členovia rodiny mali helmintické zamorenie.
• Rodina má psa alebo mačku.

Za každú odpoveď Áno"- 2 body," niekedy"- jeden," Nie» - 0. Pri skóre 0-5 je pravdepodobnosť infekcie zanedbateľná, 6-12 - možná infekcia, 13-25 - vysoká pravdepodobnosť, viac ako 25 bodov - veľmi vysoká. Pri posledných dvoch výsledkoch je potrebné pravidelné vyšetrenie a prípadne preventívna liečba.

Keďže klinické prejavy helmintiáz nie sú vždy špecifické a v počiatočných štádiách sú nešpecifické, ponúkame pacientom dotazník samodiagnostika helmintiázy.

• Ráno je svrbenie v konečníku.
• Nevoľnosť ráno pri čistení zubov.
• Odlupovanie prstov na rukách alebo nohách s odlupovaním vrstiev kože.
• Alergická vyrážka na koži, svrbenie kože.
• Olupovanie a opuch očných viečok.
• Zvýšená únava, letargia, ospalosť.
• Zvýšený pocit hladu.
• Pocit nepohodlia v bruchu.
• Strata váhy.
• Prítomnosť viacerých chronických orgánových ochorení gastrointestinálny trakt, kĺby, bronchopulmonálny systém.
• Zlý zdravotný stav, chýbajúca oficiálna diagnóza, predĺžená neúčinná liečba.
• Pravidelné zvýšenie teploty sprevádzané bolesťou svalov a kĺbov.

odpoveď " Áno"zapnuté najmenej na 2-3 otázky hovorí o vysoká pravdepodobnosť helmintové infekcie.

ZÁVERY

1. Zapnuté súčasné štádium neexistujú žiadne laboratórne metódy na testovanie helmintiáz, ktoré by boli 100% spoľahlivé.

2. Polymeráza reťazová reakcia a biorezonančná diagnostika.

BIBLIOGRAFIA

Vyšetrenie výkalov

Mikroskopia sa najskôr vykoná pri malom zväčšení (X80). Najjednoduchšie sa dajú nahradiť silnejším lomom svetla a niektoré druhy ich pohybom či zmenou tvaru. Objekt videný pri malom zväčšení sa skúma pri zväčšení 400 alebo 600. Pri absencii skúseností treba šmuhy okamžite prezerať pri veľkom zväčšení, čím sa však výrazne predĺži čas na štúdium preparátu. Prezeranie šmúh pri veľkom zväčšení by sa malo vykonávať pri silnejšom svetle, pričom ho upravte pomocou kondenzora.

diferenciálne znaky určité typy améby v natívnom nátere sú tvar a veľkosť tela, viditeľnosť jadra, povaha tvorby pseudopódií, pohyb, delenie cytoplazmy na ekto- a endoplazmu, povaha inklúzií (fagocytované erytrocyty, atď.). Pri rozlišovaní bičíkatých druhov - veľkosť a tvar tela, počet bičíkov, charakter pohybu, prítomnosť alebo neprítomnosť zvlnenej membrány. Špecifickými znakmi balantidií sú veľkosť, tvar tela, pohyb, mihalnice, cytostóm atď.

Hlavným rozlišovacím znakom vegetatívnych foriem prvokov v živom stave je pohyb. Nájdené v škvrnách rôzne druhy fixované útvary – rastlinné vlákno, svalové vlákna, spóry, huby a pod. Nemali by sa brať do úvahy pri protozoologickej diagnostike.

Metóda natívneho náteru je jednoduchá a dostupná pre každé laboratórium. Umožňuje pri náleze tkanivových foriem dyzentérických améb s fagocytovanými erytrocytmi stanoviť absolútne presnú diagnózu amébovej dyzentérie a pri zistení balantidií a giardií je stanovená diagnóza balantidiózy a giardiózy.

Farbenie sa rozmazáva Lugolovým roztokom . Toto zafarbenie sa používa na diagnostiku prvokov cystami. Používa sa pri štúdiu formalizovaných, poloformovaných a kašovitých výkalov.

Na prípravu náteru sa koniec drevenej tyčinky zašpiní výkalmi a premyje sa kvapkou roztoku jódu (J - 1,0 g, KJ - 2 g, destilovaná voda - 100 ml) naneseným na podložné sklíčko, kým nevznikne homogénna emulzia. získané. Prípravok sa prekryje krycím sklíčkom a po 3-5 minútach. mikroskopické. Náter musí byť dostatočne transparentný, aby sa dal študovať v prechádzajúcom svetle.

Medzi zvyškami nestrávené jedlo, spóry, huby, jodofilné baktérie protozoálne cysty, natreté hnedou alebo zelenožltou farbou, sa vyznačujú presne definovaným, pre každý druh charakteristickým tvarom, veľkosťou, zreteľnými obrysmi okrajov, prítomnosťou hladkého, priehľadného, ​​dvojitého obvodová membrána, obsah cytoplazmy, ako aj prítomnosť jadier s nevýraznou štruktúrou. V cystách améb sú viditeľné glykogénové vakuoly zafarbené hnedou (tmavohnedou) farbou. Stupeň sfarbenia týchto vakuol a obrysy ich hraníc sa v cystách prvokov rovnakého druhu líšia v závislosti od ich zrelosti.

7.7. Metódy stanovenia životaschopnosti vajíčok a lariev helmintov

Životaschopnosť vajíčok helmintov je určená ich vzhľadom, farbením životne dôležitými farbivami, kultiváciou v optimálnych podmienkach a nastavením biologickej vzorky.

7.7.1. Stanovenie životaschopnosti vajíčok alebo lariev helmintov podľa vzhľadu

Vajíčka helmintov sa mikroskopujú najskôr pri malom zväčšení, potom pri veľkom zväčšení. V deformovaných a mŕtvych vajciach helmintov je škrupina roztrhnutá alebo ohnutá dovnútra, plazma je zakalená, uvoľnená. V segmentovaných vajíčkach sú štiepne gule (blastoméry) nerovnaké veľkosti, nepravidelného tvaru, často posunuté k jednému pólu. Niekedy existujú abnormálne vajíčka, ktoré sa po vonkajších deformáciách vyvíjajú normálne. Živé larvy ascaridov majú jemnú zrnitosť len v strednej časti tela, odumieraním sa šíri po tele, vznikajú veľké lesklé hyalínové vakuoly, takzvané „šnúrky perál“.

Na stanovenie životaschopnosti zrelých vajíčok ascaridov, bičíkovcov, červov by sa aktívne pohyby lariev mali vyvolať miernym zahriatím prípravku (na teplotu nepresahujúcu 37 ° C). Vhodnejšie je pozorovať životaschopnosť lariev vretenice a vretenice po ich izolovaní z obalu vajíčka stlačením krycieho sklíčka preparátu pitevnou ihlou alebo pinzetou.

U lariev invazívnych ascaridov je často vidieť čiapočku, ktorá sa odlúpla na hlavovom konci, a u lariev bičíkovcov, ktoré ukončili vývoj vo vajíčku, sa na tomto mieste nachádza pri veľkom zväčšení mandrén. Mŕtve larvy helmintov, bez ohľadu na ich umiestnenie (vo vajíčku alebo mimo neho), si všimnú rozpad tela. V tomto prípade sa vnútorná štruktúra larvy stáva hrudkovitou alebo zrnitou a telo sa stáva zakaleným a nepriehľadným. V tele sa nachádzajú vakuoly a na kutikule sa nachádzajú zlomy.

Životaschopnosť teniidných onkosfér (hovädzí, prasacia pásomnica atď.) je určená pohybom embryí, keď sú vystavené tráviacim enzýmom. Vajíčka sú umiestnené na hodinovom sklíčku so psou žalúdočnou šťavou alebo umelou duodenálnou šťavou. Zloženie druhého: pankreatín - 0,5 g, hydrogénuhličitan sodný - 0,09 g, destilovaná voda - 5 ml. Hodinkové sklá s vajíčkami sa umiestnia na 4 hodiny do termostatu pri 36 - 38 °C. V tomto prípade sa živé embryá uvoľnia z membrán. Škrupiny živých onkosfér sa rozpúšťajú aj v okyslenom pepsíne a v alkalickom roztoku trypsínu po 6–8 hodinách v termostate pri 38 °C.

Ak sa teniidné vajíčka vložia do 1% roztoku sulfidu sodného alebo 20% roztoku chlórnanu sodného alebo do 1% roztoku chlórovej vody s teplotou 36 - 38 °C, zrelé a živé embryá sa uvoľnia zo škrupín a neuvoľnia sa. zmena počas 1 dňa. Nezrelé a mŕtve onkosféry sa scvrkávajú alebo napučiavajú a dramaticky zväčšujú a potom sa „rozpustia“ v priebehu 10 minút až 2 hodín. Živé embryá teniidov sa tiež aktívne pohybujú v zmesi 1% roztoku chloridu sodného, ​​0,5% roztoku hydrogénuhličitanu sodného a žlče pri teplote 36 - 38 ° C.

Životaschopnosť fasciolia adolescaria zozbieraných z rastlín a iných objektov vodných útvarov sa kontroluje ich skúmaním na podložnom sklíčku vo fyziologickom roztoku pod mikroskopom s vyhrievacím stolíkom. Pri zahrievaní sa larvy motolice v cyste začnú pohybovať.

Na určenie životaschopnosti vajíčok pásomnice pygmy je metóda Ionina N.S. najjednoduchšia: v živých vajíčkach je stredný pár embryonálnych háčikov buď rovnobežný s laterálnymi háčikmi, alebo tieto háčiky zvierajú so základňou uhol menší. ako 45° s mediánom. V mŕtvych vajciach bočné páry zvierajú uhol pri základni so stredným párom viac ako 45 ° alebo sú háčiky náhodne rozptýlené (ich párové usporiadanie sa stráca); niekedy dochádza k vráskaniu embrya, tvorbe zrnitosti. Presnejšia metóda je založená na objavení sa pohybov onkosféry počas prudkej zmeny teploty: od 5 - 10 ° do 38 - 40 ° C.

Stanovenie životaschopnosti nezrelých vajíčok háďatiek by sa malo študovať vo vlhkej komore (Petriho misky), pričom vajíčka ascaris sa umiestnia do 3% roztoku formalínu pripraveného v izotonickom roztoku chloridu sodného pri teplote 24 - 30 °C, vajíčka bičíkovcov sa umiestnia do 3% roztoku chloridu sodného. % roztoku kyseliny chlorovodíkovej pri teplote 30 - 35 °C; vajce červov v izotonickom roztoku chloridu sodného pri 37 °C. Petriho misky otvárajte 1 až 2-krát týždenne pre lepšie prevzdušnenie a filtračný papier opäť navlhčite čistou vodou.

Pozorovania vývoja vajíčok helmintov sa vykonávajú najmenej 2-krát týždenne. Absencia príznakov vývoja v priebehu 2-3 mesiacov naznačuje ich neživotaschopnosť. Známky vývoja vajíčok helmintov sú najskôr štádiá drvenia, rozdelenie obsahu vajíčka na samostatné blastoméry. Počas prvých dní sa vyvinie až 16 blastomér, ktoré prechádzajú do druhého štádia - morula atď.

Vajíčka húsenice sa pestujú v sklenenom valci (50 cm vysoký a 7 cm v priemere) uzavretom zátkou. Na dno valca sa pomocou sklenenej trubice opatrne naleje zmes rovnakých objemov sterilného piesku, dreveného uhlia a výkalov s vajíčkami machovca, zriedená vodou na polotekutú konzistenciu. Počas 1 - 2 dní usadzovania v tme pri teplote 25 - 30 °C sa z vajíčok vyliahnu rabditoidné larvy, ktoré sa po 5 - 7 dňoch stanú už filariformnými: larvy vyliezajú po stenách valca, kde sa sú viditeľné aj voľným okom.

Vajíčka trematód, ktoré sa prirodzene vyvíjajú vo vode, ako napríklad opisthorchis, diphyllobothriidy, fascioly a iné, sa umiestnia na hodinové sklíčko, Petriho misku alebo do inej nádoby a nalejú sa malou vrstvou obyčajnej vody. Pri pestovaní vajíčok fascioly treba brať do úvahy, že v tme sa rýchlejšie vyvíjajú, pričom miracidium sa tvorí v živých vajíčkach pri teplote 22–24 °C po 9–12 dňoch. Pri mikroskopii vyvíjajúcich sa vajíčok motolice sú jasne viditeľné pohyby miracidia. Fasciola miracidium vystupuje z vaječných škrupín len na svetle.

Fulleborn metóda. Larvy háčikovca a strongylidov sa kultivujú na agare v Petriho miske so živočíšnym uhlím. Po udržaní v termostate pri teplote 25 – 30 °C počas 5 – 6 hodín sa larvy rozšíria po agare a zanechajú za sebou cestu baktérií.

Metóda Harada a Mori. Do skúmaviek umiestnených na stojane sa pridá 7 ml destilovanej vody. Drevenou tyčinkou odoberte 0,5 g výkalov a urobte rozmazanie na filtračný papier (15 x 150 mm) 5 cm od ľavého okraja (táto operácia sa vykonáva na hárku papiera na ochranu povrchu laboratórneho stola). Potom sa prúžok s náterom vloží do skúmavky tak, aby ľavý koniec voľný od náteru dosiahol dno skúmavky. Horný koniec zakryte kúskom celofánu a pevne ho omotajte gumičkou. Na skúmavku napíšte číslo, názov predmetu. V tomto stave sa skúmavky uchovávajú 8-10 dní pri teplote 28 °C. Na štúdium lariev odstráňte a odstráňte celofánový kryt a odstráňte pásik filtračného papiera pomocou pinzety. V tomto prípade treba byť opatrný, pretože malý počet infekčných lariev sa môže presunúť na horný koniec filtračného papiera alebo na stenu skúmavky a preniknúť pod povrch celofánu.

Skúmavky sa umiestnia do horúceho vodného kúpeľa s teplotou 50 °C na 15 minút, potom sa obsah pretrepe a rýchlo sa naleje do 15 ml skúmavky na sedimentáciu lariev. Po odstredení sa supernatant odstráni a zrazenina sa prenesie na podložné sklíčko, prikryje sa krycím sklíčkom a mikroskopuje sa pri malom zväčšení.

Pre diferenciálnu diagnostiku filariformných lariev je potrebné použiť údaje v tabuľke 3.

Tabuľka 3

DIFERENCIÁLNA DIAGNOSTIKA FILARIOVANÝCH LARVOYOV A. DUODENALE, N. AMERICANUS, S. STERCORALIS, triCHOStrONGYLUS SP.

Larvy	Rozmery	Charakteristické črty
A. duodenale	Dĺžka tela asi 660 mikrónov, uzáver - 720 nm	Pruhovanie uzáveru je menej výrazné, ústny výbežok menej nápadný, predný koniec tela (nie však uzáver) je tupý, priemer črevnej trubice je menší ako bulbus pažeráka, kaudálny koniec je tupý
N. americanus	Dĺžka tela asi 590 μm, uzáver - 660 nm	Pošva je nápadne pruhovaná, najmä v kaudálnej časti tela, ústa sa javia ako tmavé, predný koniec tela (nie však puzdro) je zaoblený ako úzky koniec. kuracie vajce, predná časť črevnej trubice takého priemeru, ako je bulbus pažeráka, koniec chvosta je ostro špicatý
S. stercoralis	Dĺžka tela asi 500 µm	Larva bez pošvy, pažerák má asi polovicu dĺžky tela, chvost je tupý alebo rozvetvený
Trichostrongylus sp.	Dĺžka tela asi 750 mikrónov	Črevný lúmen nie je rovný, ale kľukatý, kaudálny koniec je zaoblený a má tvar gombíka

7.7.2. Metódy farbenia vajíčok a lariev helmintov

Mŕtve tkanivá vo väčšine prípadov vnímajú farby rýchlejšie ako živé. Tieto znaky sa používajú v helmintológii na určenie životaschopnosti vajíčok a lariev helmintov. V niektorých prípadoch sú však niektoré farby lepšie vnímané živými tkanivami ako mŕtvymi.

Na diferenciálne stanovenie živých a mŕtvych vajíčok a lariev sa používajú nasledujúce farby a metódy.

Leukobáza metylénovej modrej sa často používa na farbenie živých a mŕtvych tkanív. Živá bunka alebo tkanivo redukuje metylénovú modrú na bezfarebnú leukobázu, mŕtve tkanivo túto schopnosť nemá, a preto získava farbu.

Kritériom pre stav vajíčka je zafarbenie embrya, ale nie škrupiny. Táto schopnosť súvisí s podmienkami smrti vajíčka. V prípadoch, keď vláknitá škrupina v mŕtvom vajci nestráca svoje polopriepustné vlastnosti, neprejde farbivami, takže mŕtve embryo nebude zafarbené. Farebné embryo vždy naznačuje smrť vajíčka.

Na farbenie vajec Ascaris môžete použiť metylénovú modrú v roztoku kyseliny mliečnej s lúhom (metylénová modrá 0,05 g, lúh sodný 0,5 g, kyselina mliečna - 15 ml). Živé vajcia nevnímajú farbu; embryá mŕtvych vajíčok zmodrajú. Larvy Ascaris sa farbia zásaditým roztokom brilantno-krezylovej modrej farby v koncentrácii 1:10 000 nasledovne: na podložné sklíčko sa nanesie kvapka tekutiny s vajíčkami ascaris a kvapka roztoku základnej farby. Preparát sa prekryje krycím sklíčkom, ktoré sa ľahkým poklepaním pitevnou ihlou tesne pritlačí na podložné sklo. Pod mikroskopom sa sleduje počet vyliahnutých lariev a stupeň ich sfarbenia; potom sa ten istý liek po 2 až 3 hodinách znova prehodnotí. Za živé sa považujú iba nedeformované larvy, ktoré sa nezafarbili 2 hodiny. Mŕtve larvy buď nevychádzajú z vajíčok, alebo sa farbia, keď sa škrupina zlomí (čiastočne alebo úplne).

Pri určovaní životaschopnosti vajíčok vtákov ascaridia je možné zafarbiť prípravky 5 % alkoholový roztok jód. Keď sa aplikuje na liek, embryá mŕtvych vajíčok ascarid na 1 - 3 sekundy. sú zafarbené na oranžovo.

Mŕtve vajíčka opisthorchis a onkosféry pásomnice hovädzieho dobytka sa zafarbia roztokom toluidínovej modrej (1:1000) a mŕtve onkosféry pásomnice hovädzieho dobytka sa zafarbia roztokom brilantnej a krezylovej modrej (1:10000). Súčasne embryá a škrupiny mŕtvych aj živých vajec získavajú farbu. Preto sa vajíčka a onkosféry po farbení premyjú v čistej vode a dodatočne farbia safranínom (pri riedení 1:10 000 alkohol, 10°C). Alkohol odstraňuje farbivo zo škrupín a safranín farbí do červena. Výsledkom je, že živé vajcia sčervenajú; vajcia s mŕtvymi embryami - v modrej farbe a škrupina zostáva červená. Mŕtve embryá onkosfér pásomnice hovädzieho dobytka sa rýchlo, v priebehu niekoľkých minút, farbia jasne červenou alebo ružovou safranínom alebo modrou brilantne-krezylovou modrou v riedení 1:4000 alebo indigokarmínom v riedení 1:1000 - 1 :2000. Živé embryá sa vplyvom týchto farieb nemenia ani po 2 - 7 hodinách.

Na určenie životaschopnosti vajíčok pásomnice trpasličej sa odporúča použiť nasledujúce farby:

1. Brilantná kreasylová modrá (1:8000) - po 1 hodine je onkosféra mŕtvych vajíčok obzvlášť jasne sfarbená, čo ostro vyniká na bledom alebo bezfarebnom pozadí zvyšku vajíčka.

2. Safranín (1:8000 na 2 hodiny a 1:5000 na 3 až 5 hodín).

3. 50% roztok kyseliny pyrogalovej v riedení 1:2 - pri vystavení 1 hodine pri teplote 29 - 30 °C (čím nižšia teplota, tým dlhší je proces farbenia).

7.7.3. Luminiscenčná metóda na štúdium vajíčok a lariev helmintov

Fluorescenčná mikroskopia umožňuje rozlíšiť živé a mŕtve predmety bez poškodenia vajíčka. Nepoužíva sa na fluorescenciu ultrafialové lúče a modrofialová časť viditeľného svetla pomocou bežného mikroskopu a podložných sklíčok; k iluminátoru OI-18 je pridaná špeciálna sada farebných filtrov.

Živé a mŕtve vajíčka škrkaviek, červov, pásomníc, pásomníc hovädzieho dobytka, pásomníc a iných helmintov luminiscujú odlišne. Tento jav je pozorovaný ako počas primárnej luminiscencie bez použitia farbív, tak aj pri farbení fluorochrómmi (akridínová oranž, korifosfín, primulín, aurolín, berlerín sulfát, tripaflavín, rivanol, chinakrín atď.).

Nesfarbené, živé nesegmentované vajíčka škrkavky žiaria jasnozelenou farbou so žltkastým odtieňom; v mŕtvych vajciach škrupina vyžaruje zelené svetlo oveľa jasnejšie ako tmavozelená embryonálna časť; vo vajíčkach škrkavky s larvou sa objavuje iba škrupina, zatiaľ čo u mŕtvych je škrupina aj larva jasne žltá.

Nepigmentované a nesegmentované živé vajíčka červov a trpasličích pásomníc vyžarujú zelenožlté svetlo, v mŕtvych vajíčkach škrupina intenzívne luminiscuje na pozadí tmavozelenej embryonálnej hmoty.

Pri sekundárnej luminiscencii (pri farbení akridínovou oranžou pri riedení 1:10 000 a 1:50 000 od 30 minút do 2 hodín) sa škrupina živých a mŕtvych háďatiek, motolíc a cestód rozžiari odlišne.

Škrupina živých a odumretých vajíčok škrkaviek, toxocarov, škrkaviek, pásomníc, pásomníc potkaních, pásomníc býčích, pásomníc sa sfarbuje do oranžovočervena. Embryá živých vajíčok ascaris, toxascaris, potkanej pásomnice, širokej pásomnice a onkosféry pásomnice hovädzej luminiscujú matnou tmavozelenou alebo sivozelenou farbou. Mŕtve embryá vajíčok týchto helmintov vyžarujú „horiacu“ oranžovo-červenú farbu. Živé larvy a toxokáry (vaječné škrupiny) vyžarujú matné sivozelené svetlo, keď uhynú, farba sa zmení z hlavového konca na „horiacu“ svetlozelenú, potom žltú, oranžovú a nakoniec na jasne oranžovú.

Pri farbení fluorochrómami - coryfosfyllum, primulín, mŕtve vajíčka ascaridov a bičíkovcov vykazujú žiaru od lila-žltej po medeno-červenú. Životaschopné vajíčka neluminiscujú, ale sfarbujú sa do tmavozelena.

Živé vajíčka motolice (Paragonimus a Clonorchis) po zafarbení akridínovou oranžovou neluminiscujú a z mŕtvych vajíčok pochádza žltozelená farba.

Na stanovenie životaschopnosti lariev helmintov možno použiť aj luminiscenčnú metódu. Takže fluorochromované roztokom akridínovej oranžovej (1:2000) larvy strongylátu, rhabdita žiaria: živé - zelené (s odtieňom), mŕtve - jasne oranžové svetlo.

Živé miracidia, ktoré vyšli z ulity, vyžarujú tlmené modrasté svetlo so sotva znateľným svetložltým korolom riasiniek, ale 10-15 minút po smrti sa javia ako jasné „horiace“ svetlo zelené a potom oranžovo-červené svetlo.

7.7.4. biologická testovacia metóda

Napríklad na stanovenie životaschopnosti vajíčok ascaris (prasiatka ascaris, ľudí, toxocara, toxascaris atď.) na zviera (morčatá, myši) je potrebných aspoň 100 - 300 vajíčok s vyvinutou larvou. Vajíčka Ascaris v izotonickom roztoku chloridu sodného sa pipetujú cez ústa myši alebo morčaťa. Po 6-7 dňoch sa zviera porazí, otvorí a jeho pečeň a pľúca sa oddelene vyšetrí na prítomnosť lariev Ascaris. Na tento účel sa pečeň a pľúca rozrežú na malé kúsky nožnicami a vyšetrí sa podľa Bermanovej alebo Supryagovej metódy (časť 6.1.2).

Ak boli zvieratá infikované živými invazívnymi vajíčkami, potom sa pri pitve v pečeni a pľúcach našli migrujúce larvy ascaris.

V prípade infekcie môžu byť vajíčka fascioly vo výkaloch laboratórnych zvierat zistené u králikov po 2 mesiacoch, u morčiat - po 50 dňoch, u myší - po 35-40 dňoch.

Pre rýchlejšiu reakciu sa laboratórne zvieratá otvoria po 20-30 dňoch a pečeň sa vyšetrí na prítomnosť mladých fasciolov.

Na stanovenie životaschopnosti vajíčok pásomnice pygmy sa tiež odporúča kŕmiť nimi predtým neinfikované biele myši, po 92–96 hodinách nasleduje pitva zvierat a detekcia cysticerkoidov v črevných klkoch alebo cestodách v lúmene čreva.

Na stanovenie životaschopnosti vajíčok opisthorchis sa odporúča metóda (German S.M., Beer S.A., 1984), založená na fyzikálno-chemickej aktivácii liahnej žľazy miracidium a stimulácii motorickej aktivity larvy, ktorá vedie k otvoreniu vajíčka. viečka a aktívne uvoľňovanie miracídia v experimentálnych podmienkach.

Suspenzia vajec opisthorchis vo vode sa vopred ochladí na 10 - 12 ° C (všetky nasledujúce operácie sa vykonávajú pri izbovej teplote 19 - 20 ° C). Do centrifugačnej skúmavky sa pridá 1 kvapka suspenzie obsahujúcej 100-150 vajec. Skúmavka sa umiestni na statív na 5-10 minút. Počas tejto doby majú všetky vajíčka čas klesnúť na dno. Potom sa pomocou prúžku filtračného papiera opatrne odsaje prebytočná voda a do skúmavky sa pridajú 2 kvapky špeciálneho média. Médium sa pripraví v 0,005 M Tris-HCl pufri; Do tlmivého roztoku sa pridá 12 - 13% roztok etanolu a farbivo (purpurová, safranín, eozín, metylénová modrá atď.). Skúmavka sa pretrepe, jej obsah sa prenesie pipetou na podložné sklíčko a nechá sa 10 minút za mierneho pretrepávania. Potom pridajte 2 kvapky uvedeného média. Prípravok je pripravený na mikroskopovanie pod bežným svetelným mikroskopom pri 20-násobnom zväčšení.

Počas tejto doby sa viečko životaschopných lariev otvorí a miracidium aktívne vstupuje do uvedeného média. Kvôli prítomnosti etanolu v ňom sú po 2-5 minútach imobilizované a následne zafarbené farbivom. Môžu byť ľahko detekované a spočítané pod mikroskopom.