Pre adekvátnu a účinnú liečbu mnohých infekčných ochorení je potrebné stanoviť presnú diagnózu včas. Pri riešení tohto problému sa dnes využívajú high-tech diagnostické metódy založené na metódach molekulárnej biológie. V súčasnosti je polymerázová reťazová reakcia (PCR) už široko používaná v praktickej medicíne ako najspoľahlivejší laboratórny diagnostický nástroj.

Čo vysvetľuje popularitu PCR v súčasnosti?

Po prvé, táto metóda sa používa na identifikáciu patogénov rôznych infekčných chorôb s vysokou presnosťou.

Po druhé, sledovať účinnosť liečby.

V rôznych príručkách, prospektoch, článkoch, ale aj vysvetlivkách medicínskych špecialistov sa často stretávame s používaním nezrozumiteľných výrazov a slov. Je naozaj ťažké hovoriť o high-tech produktoch vedy obyčajnými slovami.

Aká je podstata a mechanika PCR diagnostiky?

Každý živý organizmus má svoje vlastné jedinečné gény. Gény sa nachádzajú v molekule DNA, ktorá je v skutočnosti „vizitkou“ každého konkrétneho organizmu. DNA (genetický materiál) je veľmi dlhá molekula, ktorá sa skladá zo stavebných blokov nazývaných nukleotidy. Pre každý patogén infekčných chorôb sú umiestnené prísne špecifické, to znamená v určitom poradí a kombinácii. Keď je potrebné pochopiť, či má osoba konkrétny patogén, odoberie sa biologický materiál (krv, moč, sliny, náter), ktorý obsahuje DNA alebo fragmenty DNA mikróbov. Množstvo genetického materiálu patogénu je však veľmi malé a nie je možné povedať, ku ktorému mikroorganizmu patrí. Na vyriešenie tohto problému slúži PCR. Podstatou polymerázovej reťazovej reakcie je, že sa odoberie malé množstvo materiálu na výskum, ktorý obsahuje DNA, a počas procesu PCR sa množstvo genetického materiálu, ktorý patrí konkrétnemu patogénu, zvyšuje, a tak ho možno identifikovať.

PCR diagnostika je genetická štúdia biomateriálu.

Myšlienka metódy PCR patrí americkému vedcovi K. Mullinsovi, ktorý navrhol v roku 1983. Široké klinické využitie však získal až v polovici 90-tych rokov XX storočia.

Poďme sa zaoberať terminológiou, čo to je - DNA atď. Každá bunka akejkoľvek živej bytosti (zviera, rastlina, človek, baktérie, vírus) má chromozómy. Chromozómy sú správcami genetickej informácie, ktorá obsahuje celú sekvenciu génov každej konkrétnej živej bytosti.

Každý chromozóm sa skladá z dvoch reťazcov DNA, ktoré sú navzájom stočené do špirály. DNA je chemicky deoxyribonukleová kyselina, ktorá pozostáva zo štruktúrnych zložiek – nukleotidov. Existuje 5 typov nukleotidov – tymín (T), adenozín (A), guanín (G), cytozín (C) a uracil (U). Nukleotidy sú usporiadané jeden po druhom v prísnej individuálnej sekvencii a tvoria gény. Jeden gén môže pozostávať z 20-200 takýchto nukleotidov. Napríklad gén kódujúci produkciu inzulínu má dĺžku 60 párov báz.

Nukleotidy majú vlastnosť komplementarity. To znamená, že opačný adenín (A) v jednom reťazci DNA je vždy tymín (T) v druhom reťazci a opačný guanín (G) - cytozín (C). Schematicky to vyzerá takto:
G – C
T - A
A - T
Táto vlastnosť komplementarity je kľúčová pre PCR.

Okrem DNA má rovnakú štruktúru aj RNA – kyselina ribonukleová, ktorá sa od DNA líši tým, že namiesto tymínu používa uracil. RNA - je nositeľkou genetickej informácie v niektorých vírusoch, ktoré sa nazývajú retrovírusy (napríklad HIV).

Molekuly DNA a RNA sa môžu „rozmnožovať“ (táto vlastnosť sa využíva pri PCR). Deje sa to nasledovne: dve vlákna DNA alebo RNA sa od seba vzdialia do strán, na každé vlákno sedí špeciálny enzým, ktorý syntetizuje nový reťazec. Syntéza prebieha podľa princípu komplementarity, to znamená, že ak je nukleotid A v pôvodnom reťazci DNA, potom T bude v novosyntetizovanom reťazci, ak G - potom C atď. Tento špeciálny „stavebný“ enzým potrebuje „semienko“ – sekvenciu 5-15 nukleotidov – na spustenie syntézy. Toto „semeno“ je definované pre každý gén (gén chlamýdií, mykoplazmy, vírusy) experimentálne.

Takže každý cyklus PCR pozostáva z troch etáp. V prvej fáze nastáva takzvané odvíjanie DNA – teda oddelenie dvoch reťazcov DNA spojených navzájom. V druhom je „semeno“ pripojené k časti vlákna DNA. A nakoniec, predlžovanie týchto reťazcov DNA, ktoré je produkované enzýmom "staviteľ". V súčasnosti celý tento zložitý proces prebieha v jednej skúmavke a pozostáva z opakovaných cyklov reprodukcie stanovenej DNA s cieľom získať veľké množstvo kópií, ktoré je možné následne odhaliť bežnými metódami. To znamená, že z jedného vlákna DNA získame stovky alebo tisíce.

Etapy štúdie PCR

Zber biologického materiálu na výskum

Ako vzorka slúži rôzny biologický materiál: krv a jej zložky, moč, sliny, sekréty slizníc, likvor, výtok z povrchov rán, obsah telových dutín. Všetky biologické vzorky sa odoberajú pomocou jednorazových nástrojov a odobratý materiál sa umiestni do sterilných plastových skúmaviek alebo sa umiestni na kultivačné médium, po čom nasleduje preprava do laboratória.

K odobratým vzorkám sa pridajú potrebné reagencie a umiestnia sa do programovateľného termostatu – termocykléra (zosilňovača). V cykléri sa cyklus PCR opakuje 30-50 krát, pozostáva z troch fáz (denaturácia, žíhanie a predlžovanie). Čo to znamená? Uvažujme podrobnejšie.

Etapy okamžitej PCR reakcie, kopírovanie genetického materiálu

jaFáza PCR - Príprava genetického materiálu na kopírovanie.
Vyskytuje sa pri teplote 95 ° C, zatiaľ čo vlákna DNA sú odpojené a môžu na nich sedieť „semená“.

„Semená“ priemyselne vyrábajú rôzne výskumné a výrobné združenia, laboratóriá kupujú hotové. Zároveň „semeno“ na detekciu napríklad chlamýdií funguje iba na chlamýdie atď. Ak sa teda biomateriál testuje na prítomnosť chlamýdiovej infekcie, potom sa do reakčnej zmesi vloží „semeno“ na chlamýdie; ak testujeme biomateriál na vírus Epstein-Barrovej, potom „semeno“ na vírus Epstein-Barrovej.

IIštádium – Spojenie genetického materiálu pôvodcu infekcie a „semena“.
Ak existuje DNA vírusu alebo baktérie, ktorá sa má určiť, "semeno" sedí na tejto DNA. Tento proces pridávania primérov je druhým krokom PCR. Táto fáza prebieha pri teplote 75°C.

IIIštádium - Kopírovanie genetického materiálu pôvodcu infekcie.
Ide o proces skutočného predlžovania alebo rozmnožovania genetického materiálu, ku ktorému dochádza pri 72°C. K "semenám" sa priblíži tvorca enzýmov a syntetizuje nové vlákno DNA. S ukončením syntézy nového reťazca DNA končí aj cyklus PCR. To znamená, že v jednom cykle PCR sa množstvo genetického materiálu zdvojnásobí. Napríklad v počiatočnej vzorke bolo 100 molekúl DNA vírusu, po prvom cykle PCR už bude vo vzorke 200 molekúl DNA testovaného vírusu. Jeden cyklus trvá 2-3 minúty.

Aby sa vytvoril dostatok genetického materiálu na identifikáciu, zvyčajne sa vykoná 30-50 cyklov PCR, čo trvá 2-3 hodiny.

Štádium identifikácie rozmnožovaného genetického materiálu

Tu sa samotná PCR končí a potom prichádza rovnako významná fáza identifikácie. Na identifikáciu sa používa elektroforéza alebo označené "semená". Pri použití elektroforézy sa výsledné vlákna DNA oddelia podľa veľkosti a prítomnosť fragmentov DNA rôznych dĺžok indikuje pozitívny výsledok analýzy (to znamená prítomnosť konkrétneho vírusu, baktérie atď.). Pri použití označených „semien“ sa do konečného produktu reakcie pridáva chromogén (farbivo), v dôsledku čoho je enzymatická reakcia sprevádzaná tvorbou farby. Vývoj farby priamo naznačuje, že v pôvodnej vzorke je prítomný vírus alebo iné detekovateľné činidlo.

Dnes je možné pomocou označených „semien“, ako aj vhodného softvéru okamžite „čítať“ výsledky PCR. Ide o takzvanú real-time PCR.

Prečo je diagnostika PCR taká cenná?

Jednou z významných výhod metódy PCR je jej vysoká citlivosť – od 95 do 100 %. Tieto výhody však musia byť založené na nevyhnutnom dodržaní nasledujúcich podmienok:

1. správny odber vzoriek, preprava biologického materiálu;
2. dostupnosť sterilných nástrojov na jedno použitie, špeciálnych laboratórií a vyškoleného personálu;
3. prísne dodržiavanie metodiky a sterility počas analýzy

Citlivosť sa líši pre rôzne zistené mikróby. Takže napríklad citlivosť metódy PCR na detekciu vírusu hepatitídy C je 97-98%, citlivosť na detekciu ureaplazmy je 99-100%.

Schopnosti, ktoré sú súčasťou analýzy PCR, vám umožňujú dosiahnuť neprekonateľnú analytickú špecifickosť. To znamená presne identifikovať mikroorganizmus, ktorý sa hľadal, a nie podobný alebo blízko príbuzný.
Diagnostická senzitivita a špecifickosť metódy PCR často prevyšuje metódu kultivácie, ktorá sa nazýva „zlatý štandard“ na detekciu infekčných ochorení. Vzhľadom na trvanie kultivačného rastu (od niekoľkých dní do niekoľkých týždňov) je výhoda metódy PCR zrejmá.

PCR v diagnostike infekcií
Výhody metódy PCR (senzitivita a špecifickosť) predurčujú široké možnosti využitia v modernej medicíne.
Hlavné oblasti použitia diagnostiky PCR:

1. diagnostika akútnych a chronických infekčných ochorení rôznej lokalizácie
2. sledovanie účinnosti terapie
3. objasnenie typu patogénu

PCR sa používa v pôrodníctve, gynekológii, neonatológii, pediatrii, urológii, venerológii, nefrológii, klinike infekčných chorôb, oftalmológii, neurológii, ftizeiopulmonológii atď.

Použitie diagnostiky PCR sa uskutočňuje v spojení s inými výskumnými metódami (ELISA, PIF, RIF atď.). Ich kombináciu a účelnosť určuje ošetrujúci lekár.

Infekčné agens detekované pomocou PCR

Vírusy:

1. Retrovírusy HIV-1 a HIV-2
2. herpetiformné vírusy
3. vírus herpes simplex typu 1 a 2

Polymerázová reťazová reakcia (PCR)- experimentálna metóda molekulárnej biológie, čo je špecifická amplifikácia nukleových kyselín indukovaná syntetickými oligonukleotidovými primermi in vitro.

Myšlienka vývoja metódy PCR patrí americkému výskumníkovi Karymu Mullisovi, ktorý v roku 1983 vytvoril metódu, ktorá umožnila amplifikovať DNA počas cyklických zdvojení pomocou enzýmu DNA polymerázy v umelých podmienkach. Niekoľko rokov po zverejnení tejto myšlienky, v roku 1993, za ňu dostal K. Mullis Nobelovu cenu.

Na začiatku použitia metódy, po každom cykle zahrievania-chladenia, bolo potrebné do reakčnej zmesi pridať DNA polymerázu, pretože pri vysokej teplote sa rýchlo inaktivovala. Postup bol veľmi neefektívny, vyžadoval si veľa času a enzýmov. V roku 1986 bol výrazne upravený použitím DNA polymerázy z termofilných baktérií. Tieto enzýmy sú schopné odolať mnohým reakčným cyklom, čo vám umožňuje automatizovať PCR. Jedna z najčastejšie používaných termostabilných DNA polymeráz bola izolovaná z baktérií. Thermus aquaticus a pomenované Taq-DNA polymeráza.

Podstata metódy. Metóda je založená na viacnásobnom selektívnom kopírovaní určitej oblasti DNA pomocou enzýmu Taq-DNA polymerázy. Polymerázová reťazová reakcia umožňuje získať amplifikáty dlhé až niekoľko tisíc párov báz. Na zvýšenie dĺžky produktu PCR na 20-40 tisíc párov báz sa používa zmes rôznych polymeráz, ale stále je to oveľa menej ako dĺžka chromozomálnej DNA eukaryotickej bunky.

Reakcia sa uskutočňuje v programovateľnom termostate (zosilňovači) - zariadení, ktoré môže prebiehať dostatočne rýchlo

chladenie a zahrievanie skúmaviek (zvyčajne s presnosťou aspoň 0,1 °C). Zosilňovače umožňujú nastaviť komplexné programy vrátane tých s možnosťou „horúceho štartu“ a následného uloženia. Pre real-time PCR sa vyrábajú zariadenia vybavené fluorescenčným detektorom. Nástroje sú dostupné aj s automatickým vekom a priehradkou na mikrodoštičky, čo umožňuje ich integráciu do automatizovaných systémov.

Zvyčajne sa počas PCR vykoná 20-45 cyklov, z ktorých každý pozostáva z troch stupňov: denaturácia, žíhanie primérov, predĺženie (obr. 6.1 a 6.2). Na obr. 6.1 je znázornená dynamika zmien teploty v skúmavke počas cyklu PCR.

Ryža. 6.1. Graf zmeny teploty v skúmavke počas jedného cyklu polymerázovej reťazovej reakcie

Denaturácia templátu DNA sa uskutočňuje zahrievaním reakčnej zmesi na 94-96 °C počas 5-90 s, aby sa reťazce DNA rozptýlili. Je potrebné poznamenať, že pred prvým cyklom sa reakčná zmes predhreje na 2–5 minút, aby sa úplne denaturovala počiatočná matrica, čo umožňuje znížiť množstvo nešpecifických reakčných produktov.

Ryža. 6.2. Schéma prvého cyklu polymerázovej reťazovej reakcie

Fáza žíhania základného náteru. Pri postupnom znižovaní teploty sa priméry komplementárne viažu na templát. Teplota žíhania závisí od zloženia primérov a je zvyčajne o 4-5 °C nižšia ako vypočítaná teplota topenia. Trvanie fázy je 5-60 s.

Počas ďalšej fázy - predĺženie- dochádza k syntéze dcérskeho reťazca DNA na materskej matrici. Teplota predĺženia závisí od polymerázy. Bežne používané Taq a Pfu DNA polymerázy sú najaktívnejšie pri 72 °C. Čas predĺženia, hlavne v závislosti od dĺžky produktu PCR, je typicky 1 minúta na 1000 párov báz.

Čo vám umožňuje odhaliť v biologickom materiáli malé množstvá, presnejšie, určitých jeho fragmentov a mnohonásobne ich znásobiť. Potom sa identifikujú vizuálne gélovou elektroforézou. Reakciu vyvinul v roku 1983 K. Mullis a zaradil ju do zoznamu výnimočných objavov posledných rokov.

Aké sú mechanizmy PCR

Celá technika je založená na schopnosti nukleových kyselín sa replikovať, čo sa v tomto prípade uskutočňuje umelo v laboratóriu. Reprodukcia DNA nemôže začať v žiadnej oblasti molekuly, ale iba v oblastiach s určitou nukleotidovou sekvenciou - štartovacie fragmenty. Na spustenie polymerázovej reťazovej reakcie sú potrebné priméry (alebo DNA sondy). Sú to krátke fragmenty reťazca DNA s danou nukleotidovou sekvenciou. Sú komplementárne (to znamená zodpovedajúce) k východiskovým miestam

Samozrejme, aby sa vytvorili priméry, vedci musia študovať nukleotidovú sekvenciu toho, ktorý je zapojený do techniky. Práve tieto DNA sondy poskytujú špecifickosť reakcie a jej iniciáciu. nebude fungovať, ak sa vo vzorke nenájde aspoň jedna molekula požadovanej DNA. Vo všeobecnosti sú na uskutočnenie reakcie potrebné vyššie uvedené priméry, sada nukleotidov, tepelne odolná DNA polymeráza. Posledne menovaný je enzým, ktorý katalyzuje syntézu nových molekúl nukleových kyselín na základe vzorky. Všetky tieto látky, vrátane biologického materiálu, v ktorom je potrebné detekovať DNA, sa spoja do reakčnej zmesi (roztoku). Je umiestnený v špeciálnom termostate, ktorý vykonáva veľmi rýchly ohrev a chladenie za daný čas - cyklus. Zvyčajne je ich 30-50.

Ako táto reakcia prebieha?

Jeho podstatou je, že počas jedného cyklu sú priméry pripojené k požadovaným úsekom DNA, po ktorých sa pôsobením enzýmu zdvojnásobí. Na základe výsledných reťazcov DNA sa v nasledujúcich cykloch syntetizujú nové a nové identické fragmenty molekuly.

Polymerázová reťazová reakcia prebieha postupne, rozlišujú sa jej nasledujúce stupne. Prvý je charakterizovaný zdvojnásobením množstva produktu počas každého cyklu ohrevu a chladenia. V druhom štádiu sa reakcia spomalí, keďže sa enzým poškodí a stratí aj aktivitu. Navyše sú vyčerpané zásoby nukleotidov a primerov. V poslednom štádiu - plató - sa produkty už nehromadia, pretože sa minuli činidlá.

Kde sa používa

Polymerázová reťazová reakcia nachádza nepochybne najširšie uplatnenie v medicíne a vede. Používa sa vo všeobecnej aj súkromnej biológii, veterinárnej medicíne, farmácii a dokonca aj v ekológii. Navyše, v druhom prípade to robia preto, aby monitorovali kvalitu potravinárskych výrobkov a environmentálnych objektov. Polymerázová reťazová reakcia sa aktívne používa vo forenznej praxi na potvrdenie otcovstva a identifikáciu osoby. Vo forenznej, ako aj v paleontológii je táto technika často jediným východiskom, keďže na výskum je zvyčajne k dispozícii veľmi málo DNA. Samozrejme, metóda našla veľmi široké uplatnenie v praktickej medicíne. Je to nevyhnutné v takých oblastiach, ako je genetika, infekčné a onkologické ochorenia.

Stránka poskytuje referenčné informácie len na informačné účely. Diagnóza a liečba chorôb by sa mala vykonávať pod dohľadom špecialistu. Všetky lieky majú kontraindikácie. Vyžaduje sa odborná rada!

Metóda polymerická reťazová reakcia bol objavený takmer pred tridsiatimi rokmi americkým vedcom menom Carrie Mullis. Táto technika je široko používaná v medicíne ako diagnostický nástroj a jej podstatou je kopírovanie úseku DNA pomocou špeciálneho enzýmu ( polymeráza) umelo in vitro.

V akých oblastiach medicíny sa táto metóda používa?

Na čo slúži kopírovanie DNA a ako môže poslúžiť medicíne?
Táto technika umožňuje:

• Izolujte a klonujte gény.
• Diagnostikujte genetické a infekčné choroby.
• Určiť otcovstvo. Dieťa zdedí niektoré genetické vlastnosti od svojich biologických rodičov, no má svoju jedinečnú genetickú identitu. Prítomnosť niektorých génov, ktoré sú identické s rodičovskými génmi, nám umožňuje hovoriť o vytvorení príbuzenstva.

Polymerázová reťazová reakcia sa využíva aj vo forenznej praxi.

Na mieste činu kriminalisti odoberajú vzorky genetických materiálov. Patria sem: vlasy, sliny, krv. Následne je možné vďaka technike polymerázovej reakcie amplifikovať DNA a porovnať identitu odobratej vzorky s genetickým materiálom podozrivej osoby.

V medicíne sa polymerázová reťazová reakcia účinne používa:

• V pulmonologickej praxi - na rozlíšenie bakteriálnych a vírusových typov pneumónie, tuberkulózy.
• V gynekologickej a urologickej praxi - určiť ureaplazmózu, chlamýdie, mykoplazmovú infekciu, gardnerelózu, herpes, kvapavku.
• v gastroenterologickej praxi.
• V hematológii - na stanovenie onkovírusov a cytomegalovírusovej infekcie.
• V expresnej diagnostike takých infekčných chorôb, ako je vírusová hepatitída, záškrt, salmonelóza.

V súčasnosti je táto metóda najrozšírenejšia v diagnostike infekčných ochorení ( hepatitída vírusovej etiológie, HIV, pohlavne prenosné choroby, tuberkulóza, kliešťová encefalitída).

Čo sa deje počas reakcie?

Samotná reakcia je chemicky jednoduchá. Ako zdroj DNA pre reakciu môže poslúžiť kvapka krvi, vlas, kúsok kože atď. Teoreticky si reakcia vyžaduje správne činidlá, skúmavku, vzorku biologického materiálu a zdroj tepla.

Polymerázová reakcia umožňuje odhaliť infekciu, aj keď je vo vzorke s biologickým materiálom prítomná len jedna alebo niekoľko molekúl DNA patogénu.

V priebehu reakcie dochádza vplyvom enzýmu DNA polymerázy k zdvojnásobeniu ( replikácie) úsek DNA. Samotná deoxyribonukleová kyselina skrátene DNA) je pre nás dôležitý tým, že zabezpečuje ukladanie a prenos genetickej informácie do dcérskych buniek. DNA má tvar špirály, ktorá pozostáva z opakujúcich sa blokov. Tieto bloky tvoria nukleotidy, ktoré sú najmenšou jednotkou DNA. Nukleotidy sa tvoria z aminokyselín.

Proces replikácie úsekov DNA nastáva počas opakovaných cyklov. V každom takomto cykle sa skopíruje a zdvojnásobí nielen pôvodný fragment DNA, ale aj tie fragmenty, ktoré sa už zdvojnásobili v predchádzajúcom amplifikačnom cykle. To všetko sa podobá procesu geometrickej progresie.

Existuje:

• prirodzené zosilnenie ( teda proces kopírovania a množenia DNA), ktorý sa vyskytuje v našom tele a je deterministickým, vopred určeným procesom.
• Umelé zosilnenie, ku ktorému dochádza v dôsledku polymerázovej reťazovej reakcie. V tomto prípade je proces kopírovania riadený a umožňuje duplikovať aj krátke úseky nukleovej kyseliny.

Po dokončení každého kopírovacieho cyklu sa počet fragmentov nukleových kyselín exponenciálne zvyšuje. Preto sa samotný proces nazýva „reťazová reakcia“.

Po tridsiatich až štyridsiatich cykloch dosahuje počet fragmentov niekoľko miliárd.

Na zosilnenie in vitro (in vitro) je potrebné, aby v biomédiu odobratom na diagnostiku bol prítomný špecifický cudzí fragment DNA ( teda nie DNA pacienta, ale patogénu). Ak vo vytvorenom roztoku nie je žiadny špecifický fragment, reťazová reakcia pod pôsobením polymerázy sa nespustí. To vysvetľuje skutočnosť vysokej špecifickosti PCR.

Etapy diagnostiky PCR

1. DNA sa izoluje z testovaného materiálu.
2. DNA sa pridáva do špeciálneho roztoku nukleotidov.
3. Roztok sa zahreje na teplotu 90 - 95 stupňov Celzia, aby sa proteín DNA poskladal.
4. Znížte teplotu na 60 stupňov.
5. Keď sa cykly zvyšovania a poklesu teploty opakujú, počet segmentov nukleovej kyseliny sa zvyšuje.

6. Prevedením elektroforézy sa výsledok spočíta a vypočítajú sa výsledky zdvojnásobenia.

Aké sú výhody tejto diagnostiky?

• Všestrannosť: Pre túto metódu je vhodná akákoľvek vzorka nukleovej kyseliny.
• Vysoká špecifickosť: patogén má jedinečné sekvencie DNA, ktoré sú preň špecifické. Preto výsledky vykonanej PCR budú spoľahlivé, nie je možné zameniť gén jedného patogénu s génom iného patogénu.
• Citlivosť na prítomnosť čo i len jednej molekuly patogénu.

• Malé množstvo materiálu potrebného na výskum. Postačí aj kvapka krvi. Schopnosť získať výsledok s použitím minimálneho objemu vzorky je veľmi dôležitá pre pediatrický, neonatologický, neurologický výskum, ako aj v praxi súdneho lekárstva.
• Schopnosť identifikovať pomalú, chronickú infekciu, a nielen akútnu.
• Mnoho kultúr spôsobujúcich choroby je veľmi ťažké kultivovať v skúmavke inými metódami a polymerázová reakcia umožňuje množenie kultúry v správnom množstve.

Aké sú nevýhody tejto diagnostiky?

• Ak materiál určený na PCR obsahuje DNA nielen živého patogénu, ale aj mŕtveho, obe DNA budú amplifikované. Preto liečba po diagnóze nemusí byť úplne správna. Po určitom čase je lepšie prejsť kontrolou účinnosti liečby.
• Určitým spôsobom za nevýhodu možno považovať aj precitlivenosť na prítomnosť mikroorganizmov. Koniec koncov, normálne v ľudskom tele existuje podmienene patogénna mikroflóra, to znamená, že ide o mikroorganizmy, ktoré žijú v črevách, žalúdku a iných vnútorných orgánoch. Tieto mikroorganizmy môžu človeku ublížiť len za určitých nepriaznivých podmienok – nedodržiavanie hygienických požiadaviek, kontaminovaná pitná voda a pod. Technika PCR amplifikuje DNA aj týchto mikroorganizmov, hoci nevedú k patológii.
• PCR rôznych testovacích systémov môže ukázať výsledky, ktoré sa budú navzájom líšiť. Existuje mnoho modifikácií tejto techniky: vnorené», « asymetrické», « obrátený», « kvantitatívne» PCR a ďalšie.

Federálna agentúra pre vzdelávanie

Štátna vzdelávacia inštitúcia

Vyššie odborné vzdelanie

"Kareliánska štátna pedagogická akadémia"

Kurz na tému:

Polymerázová reťazová reakcia (PCR) a jej aplikácia

Vyplnila: študentka Koryagina Valeria Aleksandrovna

Kontrolovala: Karpikova Natalya Mikhailovna

Petrozavodsk 2013

Úvod

Kapitola 1 Prehľad literatúry

1.5.4 Plató efekt

1.5.6 Zosilnenie

Záver

Úvod

Posledných dvadsať rokov sa nieslo v znamení rozsiahleho zavádzania molekulárno-genetických metód do biologických, lekárskych a poľnohospodárskych vied.

Začiatkom 70. rokov sa zdalo, že molekulárna biológia dosiahla určitý stupeň dokonalosti. V tomto období boli mikroorganizmy hlavným objektom molekulárneho genetického výskumu. Prechod na eukaryoty postavil výskumníkov pred úplne nové problémy, ktoré nebolo možné vyriešiť pomocou metód genetickej analýzy, ktoré v tom čase existovali. Prelom vo vývoji molekulárnej genetiky bol možný vďaka objaveniu sa nového experimentálneho nástroja - reštrikčných endonukleáz. V nasledujúcich rokoch sa počet metód priamej analýzy DNA založených na kvalitatívne odlišných prístupoch začal rýchlo zvyšovať.

V mnohých prípadoch moderné technológie umožnili začať hlbšie študovať jemnú štrukturálnu a funkčnú organizáciu jadrových a mimojadrových genómov rôznych organizmov. To malo osobitný význam pre vývoj nových metód diagnostiky a liečby rôznych chorôb. Nemenej dôležitá bola možnosť využitia výdobytkov molekulárnej genetiky v populačnej biológii a šľachtení na identifikáciu a analýzu genetickej variability populácií, odrôd a kmeňov, identifikáciu a certifikáciu ekonomicky hodnotných jedincov, vytváranie geneticky modifikovaných organizmov a riešenie ďalších problémov.

Každá metóda má svoje výhody a nevýhody. Neexistuje univerzálna metóda, ktorá by dokázala vyriešiť všetky vzniknuté problémy. Preto je výber konkrétnej metódy pre prebiehajúci výskum jednou z najdôležitejších etáp každej vedeckej práce.

Kapitola 1 Prehľad literatúry

1.1 História objavu polymerázovej reťazovej reakcie (PCR)

V roku 1983 K.B. Mullis a spol., publikovali a patentovali metódu polymerázovej reťazovej reakcie (PCR), ktorá bola predurčená na to, aby mala hlboký vplyv na všetky oblasti výskumu a aplikácie nukleových kyselín. Význam tejto metódy pre molekulárnu biológiu a genetiku sa ukázal byť taký veľký a zrejmý, že o sedem rokov neskôr bola autorovi udelená Nobelova cena za chémiu.

Na začiatku použitia metódy, po každom cykle zahrievania a chladenia, sa do reakčnej zmesi musela pridať DNA polymeráza, pretože bola inaktivovaná pri vysokej teplote potrebnej na oddelenie reťazcov špirály DNA. Reakčný postup bol relatívne neefektívny, vyžadoval veľa času a enzýmov. V roku 1986 sa výrazne zlepšila metóda polymerázovej reťazovej reakcie. Bolo navrhnuté použiť DNA polymerázy z termofilných baktérií. Tieto enzýmy sa ukázali ako termostabilné a boli schopné odolať mnohým reakčným cyklom. Ich použitie umožnilo zjednodušiť a zautomatizovať PCR. Jedna z prvých termostabilných DNA polymeráz bola izolovaná z baktérií Thermus aquaticusa pomenované Taq-polymeráza.

Možnosť amplifikácie akéhokoľvek segmentu DNA, ktorého nukleotidová sekvencia je známa, a jeho získania po PCR v homogénnej forme a preparatívnom množstve, robí z PCR alternatívnu metódu molekulárneho klonovania krátkych fragmentov DNA. V tomto prípade nie je potrebné aplikovať zložité metodické techniky, ktoré sa využívajú v genetickom inžinierstve pri klasickom klonovaní. Rozvoj metódy PCR výrazne rozšíril metodologické možnosti molekulárnej genetiky a najmä genetického inžinierstva natoľko, že radikálne zmenil a posilnil vedecký potenciál mnohých jej oblastí.

1.2 Odrody polymerázovej reťazovej reakcie (PCR)

· Nested PCR- používa sa na zníženie počtu vedľajších produktov reakcie. Použite dva páry primérov a vykonajte dve po sebe idúce reakcie. Druhý pár primérov amplifikuje oblasť DNA v produkte prvej reakcie.

· Invertovaná PCR- používa sa, keď je známa len malá oblasť v rámci požadovanej sekvencie. Táto metóda je užitočná najmä vtedy, keď je potrebné určiť susedné sekvencie po vložení DNA do genómu. Na implementáciu invertovanej PCR sa uskutoční séria rezov DNA reštrikčnými enzýmami<#"justify">primer polymerázovej reťazovej reakcie

· Skupinovo špecifická PCR- PCR pre príbuzných<#"center">1.3 Polymerázová reťazová reakcia

Polymerázová reťazová reakcia (PCR), objavená v polovici 80. rokov 20. storočia, môže v priebehu niekoľkých hodín miliónkrát zvýšiť počet kópií pôvodnej vzorky. Počas každého cyklu reakcie sa z pôvodnej molekuly vytvoria dve kópie. Každá zo syntetizovaných kópií DNA môže slúžiť ako templát pre syntézu nových kópií DNA v ďalšom cykle. Opakované opakovanie cyklov teda vedie k exponenciálnemu nárastu počtu kópií. Z výpočtov vyplýva, že aj keď ide o 30 cyklov, počet kópií pôvodnej molekuly bude viac ako 1 miliarda. Aj keď vezmeme do úvahy, že nie všetky amplikóny sa počas každého cyklu duplikujú, celkový počet kópií je napriek tomu dosť veľký údaj.

Každý cyklus polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) pozostáva z nasledujúcich krokov:

· Denaturácia – Zvýšenie teploty spôsobí, že sa dvojvláknová molekula DNA rozvinie a rozdelí na dve jednovláknové;

· Žíhanie - Zníženie teploty umožňuje primérom pripojiť sa ku komplementárnym oblastiam molekuly DNA;

· Predlžovanie – enzým DNA polymeráza dopĺňa komplementárne vlákno.

Na amplifikáciu vybraného fragmentu sa použijú dva oligonukleotidové priméry (semená) lemujúce určitú oblasť DNA. Priméry orientované 3 - končia smerom k sebe a v smere sekvencie, ktorú je potrebné zosilniť. DNA polymeráza uskutočňuje syntézu (kompletizáciu) vzájomne komplementárnych reťazcov DNA, počnúc primérmi. Počas syntézy DNA sa priméry fyzicky vkladajú do reťazca novosyntetizovaných molekúl DNA. Každý reťazec molekuly DNA vytvorený pomocou jedného z primérov môže slúžiť ako templát na syntézu komplementárneho reťazca DNA pomocou druhého priméru.

1.4 Vedenie polymerázovej reťazovej reakcie (PCR)

Polymerázová reťazová reakcia sa uskutočňuje v špeciálnych tenkostenných polypropylénových skúmavkách, ktoré sú svojou veľkosťou kompatibilné s použitým tepelným cyklovačom (zosilňovačom) - zariadením, ktoré riadi teplotné a časové charakteristiky fáz polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) .

1.5 Princíp metódy polymerázovej reťazovej reakcie

Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je in vitro metóda amplifikácie DNA, ktorá dokáže izolovať a znásobiť špecifickú sekvenciu DNA miliardkrát v priebehu niekoľkých hodín. Možnosť získať obrovské množstvo kópií jednej striktne definovanej oblasti genómu výrazne zjednodušuje štúdium existujúcej vzorky DNA.

Na uskutočnenie polymerázovej reťazovej reakcie je potrebné splniť niekoľko podmienok:

1.5.1 Prítomnosť viacerých zložiek v reakčnej zmesi

Hlavné zložky reakčnej (PCR) zmesi sú: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, zmes nukleotidových trifosfátov (ATP, GTP, CTP, TTP), primery (oligonukleotidy), analyzovaný preparát DNA, termostabilná DNA polymeráza. Každá zo zložiek reakčnej zmesi sa priamo zúčastňuje polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) a koncentrácia činidiel priamo ovplyvňuje priebeh amplifikácie.

· Tris-HCl - určuje pH reakčnej zmesi, vytvára pufrovaciu kapacitu. Aktivita DNA polymerázy závisí od pH média, takže hodnota pH priamo ovplyvňuje priebeh polymerázovej reťazovej reakcie. Zvyčajne sa hodnota pH pohybuje v rozmedzí 8 - 9,5. Vysoké pH je spôsobené tým, že ako teplota stúpa, pH Tril-HCl pufra klesá.

· KCl - koncentrácia chloridu draselného do 50 mm ovplyvňuje priebeh procesov denaturácie a žíhania, koncentrácia nad 50 mm inhibuje DNA polymerázu.

· MgCl 2- pretože DNA polymeráza je Mg 2+- závislý enzým, potom koncentrácia horčíkových iónov ovplyvňuje aktivitu enzýmu (Mg 2+tvorí komplexy s NTP – práve tieto komplexy sú substrátom pre polymerázu). Vysoká koncentrácia vedie k zvýšeniu nešpecifickej amplifikácie a nízka vedie k inhibícii reakcie, optimum (pre rôzne polymerázy) je v oblasti 0,5 - 5 mM. Okrem toho koncentrácia horečnatých solí ovplyvňuje priebeh procesov denaturácie a žíhania - zvýšenie koncentrácie Mg 2+spôsobuje zvýšenie teploty topenia DNA (t.j. teploty, pri ktorej sa 50 % dvojvláknových reťazcov DNA rozbije na jednovláknové reťazce).

· NTP - nukleotid trifosfáty sú priame monoméry nukleových kyselín. Aby sa zabránilo ukončeniu reťazca, odporúča sa rovnaký pomer všetkých štyroch nukleotidových trifosfátov. Nízka koncentrácia týchto zložiek v reakčnej zmesi zvyšuje pravdepodobnosť chýb pri konštrukcii komplementárneho reťazca DNA.

· Priméry - Najoptimálnejšie je použitie primérov s rozdielom teploty topenia nie väčším ako 2 - 4 o C. Niekedy pri dlhodobom skladovaní pri teplote 4 o Pri alebo po veľkom počte zmrazení - rozmrazení tvoria priméry sekundárne štruktúry - diméry, čím sa znižuje účinnosť PCR. Odstránenie tohto problému sa redukuje na inkubáciu vo vodnom kúpeli (T=95 o C) po dobu 3 minút a následné rýchle ochladenie na 0 °C OD.

· DNA preparáty - množstvo a kvalita preparátu DNA (matrice) priamo ovplyvňuje priebeh a parametre polymerázovej reťazovej reakcie. Nadbytok vzorky DNA inhibuje polymerázovú reťazovú reakciu (PCR). Účinnosť polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) môžu znižovať aj nečistoty rôznych látok v prípravku DNA: octan sodný, chlorid sodný, izopropanol, etanol, heparín, fenol, močovina, hemoglobín atď.

· DNA polymeráza - pri použití malého množstva DNA polymerázy sa pozoruje pokles syntézy konečného produktu priamo úmerný veľkosti fragmentov. 2- až 4-násobný nadbytok polymerázy vedie k vzniku difúznych spektier a 4 až 16-násobný nešpecifický spektier s nízkou molekulovou hmotnosťou. Rozsah použitých koncentrácií je 0,5 - 1,5 jednotky aktivity v zmysle 25 ul zmesi PCR.

Okrem hlavných zložiek zmesi PCR sa používa množstvo ďalších látok, ktoré zlepšujú kvalitatívne a kvantitatívne ukazovatele PCR: acetamid (5%) - zvýšenie rozpustnosti hlavných zložiek; betaín (sodná soľ) - stabilizácia DNA polymerázy, zníženie teploty topenia DNA, vyrovnanie teploty topenia; hovädzí albumín (10-100 μg / ml) - stabilizácia DNA polymerázy; dimetylsulfoxid (1-10%) - zvýšenie rozpustnosti hlavných zložiek; formamid (2-10%) - zvýšenie špecifickosti žíhania; glycerol (15-20%) - zvýšenie tepelnej stability enzýmu, zníženie teploty denaturácie vzorky DNA; síran amónny - zníženie teploty denaturácie a žíhania.

1.5.2 Cyklus a teplota

Všeobecný pohľad na program polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) je nasledujúci:

etapa. Predĺžená primárna denaturácia preparátu DNA.1 cyklus

etapa. Rýchla denaturácia preparátu DNA. Žíhanie základného náteru. Predĺženie.30 - 45 cyklov.

etapa. Predĺžené predĺženie. Ochladenie reakčnej zmesi 1 cyklus.

Každý prvok fázy - denaturácia, žíhanie, predĺženie - má individuálne teplotné a časové charakteristiky. Parametre teploty a doby prietoku každého prvku sa vyberajú empiricky v súlade s kvalitatívnymi a kvantitatívnymi ukazovateľmi produktov amplifikácie.

Denaturácia. Počas tohto prvku polymerázovej reťazovej reakcie sa molekula dvojvláknovej DNA rozdelí na dve jednovláknové. Teplotné parametre denaturácie sú v rozmedzí 90 - 95 o C, ale v prípade vzorky DNA s vysokým obsahom guanínu a cytozínu treba teplotu zvýšiť na 98 o C. Teplota denaturácie by mala byť dostatočná na úplnú denaturáciu – rozštiepenie reťazcov DNA a vyhnúť sa „náhlemu ochladeniu“ alebo rýchlemu žíhaniu, avšak termostabilná DNA polymeráza je pri vysokých teplotách menej stabilná. Výber optimálnych parametrov denaturačnej teploty pre pomer primér/vzorka (príprava DNA) je teda dôležitou podmienkou amplifikácie. Ak je teplota denaturácie v prvom kroku vyššia ako 95 o C sa odporúča po primárnej denaturácii pridať do reakčnej zmesi DNA polymerázu. Trvanie tohto prvku štádia počas polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) by malo postačovať na úplnú denaturáciu DNA, ale zároveň by nemalo výrazne ovplyvniť aktivitu DNA polymerázy pri danej teplote.

Žíhanie. Teplota žíhania (T a ) je jedným z najdôležitejších parametrov polymerázovej reťazovej reakcie. Teplota žíhania pre každý špecifický primer sa volí individuálne. Závisí to od dĺžky a nukleotidového zloženia priméru. Zvyčajne je nižšia o 2 - 4 o Z hodnoty bodu topenia (T m ) základný náter. Ak je teplota žíhania systému pod optimom, potom sa zvyšuje počet nešpecifických amplifikovaných fragmentov a naopak vyššia teplota znižuje počet amplifikovaných produktov. V tomto prípade môže koncentrácia špecifických amplikónov prudko klesnúť až do inhibície polymerázovej reťazovej reakcie (PCR). Predĺženie doby žíhania tiež vedie k zvýšeniu počtu nešpecifických amplikónov.

Predĺženie. Typicky má každý typ termostabilnej DNA polymerázy individuálne teplotné optimum aktivity. Rýchlosť syntézy komplementárneho reťazca DNA enzýmom je tiež hodnota špecifická pre každú polymerázu (v priemere je to 30 – 60 nukleotidov za sekundu alebo 1 – 2 000 báz za minútu), takže čas predĺženia sa volí v závislosti na type DNA polymerázy a dĺžke amplifikovanej oblasti.

1.5.3 Základné princípy výberu primérov

Pri vytváraní testovacieho systému PCR je jednou z hlavných úloh správny výber primerov, ktoré musia spĺňať niekoľko kritérií:

Priméry musia byť špecifické. Osobitná pozornosť sa venuje 3 - konce primérov, pretože práve z nich Taq polymeráza začína dopĺňať reťazec komplementárnej DNA. Ak je ich špecificita nedostatočná, potom je pravdepodobné, že v skúmavke s reakčnou zmesou dôjde k nežiaducim procesom, konkrétne k syntéze nešpecifickej DNA (krátke alebo dlhé fragmenty). Pri elektroforéze je viditeľný vo forme ťažkých alebo ľahkých prídavných pásov. To sťažuje vyhodnotenie výsledkov reakcie, pretože je ľahké zameniť špecifický produkt amplifikácie so syntetizovanou cudzou DNA. Časť primerov a dNTP sa spotrebuje na syntézu nešpecifickej DNA, čo vedie k významnej strate citlivosti.

Priméry by nemali vytvárať diméry a slučky, t.j. žíhaním primérov k sebe alebo k sebe navzájom by sa nemali vytvárať stabilné dvojreťazce.

1.5.4 Plató efekt

Treba poznamenať, že proces akumulácie špecifických amplifikačných produktov trvá exponenciálne len obmedzený čas a potom jeho účinnosť kriticky klesá. Je to spôsobené takzvaným „plató“ efektom.

termínovaný efekt plošina používa sa na opis procesu akumulácie produktov PCR v posledných cykloch amplifikácie.

V závislosti od podmienok a počtu cyklov amplifikačnej reakcie v čase dosiahnutia účinku plošina využitie substrátov (dNTP a primery), stabilita reaktantov (dNTP a enzým), množstvo inhibítorov vrátane pyrofosfátov a DNA duplexov, súťaž o reaktanty s nešpecifickými produktmi alebo primer-diméry, koncentrácia špecifického produktu a neúplná denaturácia pri vysokých koncentráciách amplifikačných produktov.

Čím nižšia je počiatočná koncentrácia cieľovej DNA, tým vyššie je riziko reakcie plateau". Tento bod môže nastať skôr, než bude dostatočný počet špecifických amplifikačných produktov na analýzu. Len dobre optimalizované testovacie systémy sa tomu môžu vyhnúť.

1.5.5 Príprava vzorky biologického materiálu

Na extrakciu DNA sa používajú rôzne techniky v závislosti od úloh. Ich podstata spočíva v extrakcii (extrakcii) DNA z biologického produktu a odstránení alebo neutralizácii cudzích nečistôt na získanie preparátu DNA s čistotou vhodnou pre PCR.

Spôsob získania čistého preparátu DNA, ktorý opísal Marmur, sa považuje za štandardný a už sa stal klasickým. Zahŕňa enzymatickú proteolýzu, po ktorej nasleduje deproteinizácia a reprecipitácia DNA alkoholom. Táto metóda umožňuje získať čistý preparát DNA. Je to však dosť namáhavé a zahŕňa prácu s takými agresívnymi a štipľavými látkami, ako je fenol a chloroform.

Jednou zo súčasných populárnych metód je metóda extrakcie DNA navrhnutá Boomom a kol. Táto metóda je založená na použití silného chaotropného činidla, guanidíntiokyanátu (GuSCN), na lýzu buniek a následnú sorpciu DNA na nosič (sklenené guľôčky, kremelina, sklenené mlieko a pod.). Po premytí zostáva DNA vo vzorke adsorbovaná na nosiči, z ktorého sa dá ľahko odstrániť pomocou elučného pufra. Metóda je pohodlná, technologicky vyspelá a vhodná na prípravu vzoriek na amplifikáciu. Straty DNA sú však možné v dôsledku ireverzibilnej sorpcie na nosiči, ako aj počas početných premývaní. Toto je obzvlášť dôležité pri práci s malým množstvom DNA vo vzorke. Navyše aj stopové množstvá GuSCN môžu inhibovať PCR. Preto je pri použití tejto metódy veľmi dôležitý správny výber sorbentu a starostlivé dodržiavanie technologických odtieňov.

Ďalšia skupina metód prípravy vzoriek je založená na použití iónomeničov typu Chilex, ktoré na rozdiel od skla neadsorbujú DNA, ale naopak nečistoty interferujúce s reakciou. Táto technológia spravidla zahŕňa dva stupne: var vzorky a adsorpciu nečistôt na iónomeniči. Metóda je mimoriadne atraktívna vďaka svojej jednoduchosti prevedenia. Vo väčšine prípadov je vhodný na prácu s klinickým materiálom. Bohužiaľ, niekedy existujú vzorky s nečistotami, ktoré nie je možné odstrániť pomocou iónomeničov. Navyše niektoré mikroorganizmy nemožno zničiť jednoduchým varom. V týchto prípadoch je potrebné zaviesť ďalšie stupne spracovania vzoriek.

Preto by sa výber metódy prípravy vzorky mal posudzovať s pochopením účelu zamýšľaných analýz.

1.5.6 Zosilnenie

Na uskutočnenie amplifikačnej reakcie je potrebné pripraviť reakčnú zmes a pridať do nej analyzovanú vzorku DNA. V tomto prípade je dôležité vziať do úvahy niektoré vlastnosti žíhania primérov. Faktom je, že v analyzovanej biologickej vzorke sú spravidla rôzne molekuly DNA, s ktorými majú priméry použité v reakcii čiastočnú a v niektorých prípadoch významnú homológiu. Okrem toho môžu priméry na seba napojiť za vzniku primér-dimérov. Oboje vedie k značnej spotrebe primerov na syntézu vedľajších (nešpecifických) reakčných produktov a v dôsledku toho výrazne znižuje citlivosť systému. To sťažuje alebo znemožňuje odčítanie výsledkov reakcie počas elektroforézy.

1.6 Zloženie štandardnej reakčnej zmesi PCR

x PCR pufor (100 mM roztok Tris-HCl, pH 9,0, 500 mM roztok KCl, 25 mM roztok MgCl2 ) …….2,5 µl

Voda (MilliQ) ………………………………………………………. 18,8 µl

Zmes nukleotidových trifosfátov (dNTP)

mM roztok z každého……………………………………………….. 0,5 µl

Primer 1 (10 mM roztok) ………………………………………….….1 µl

Primer 2 (10 mM roztok) ………………………………………….….1 µl

DNA polymeráza (5 jednotiek / µl) …………………………………………………0,2 µl

Vzorka DNA (20 ng/µl) …………………………………………..1 µl

1.7 Vyhodnotenie výsledkov reakcií

Aby bolo možné správne posúdiť výsledky PCR, je dôležité pochopiť, že táto metóda nie je kvantitatívna. Teoreticky môžu byť produkty amplifikácie jednotlivých cieľových molekúl DNA detegované elektroforézou už po 30-35 cykloch. V praxi sa to však robí len v prípadoch, keď reakcia prebieha za podmienok blízkych ideálnym, s čím sa v živote často nestretávame. Stupeň čistoty preparátu DNA má obzvlášť veľký vplyv na účinnosť amplifikácie; prítomnosť určitých inhibítorov v reakčnej zmesi, ktorých sa v niektorých prípadoch môže mimoriadne ťažko zbaviť. Niekedy kvôli ich prítomnosti nie je možné amplifikovať ani desaťtisíce cieľových molekúl DNA. Preto často neexistuje priamy vzťah medzi počiatočným množstvom cieľovej DNA a konečným množstvom amplifikačných produktov.

Kapitola 2: Aplikácie polymerázovej reťazovej reakcie

PCR sa používa v mnohých oblastiach na analýzu a vo vedeckých experimentoch.

Kriminalistika

PCR sa používa na porovnanie takzvaných „genetických odtlačkov prstov“. Potrebujeme vzorku genetického materiálu z miesta činu – krv, sliny, semeno, vlasy atď. Porovnáva sa s genetickým materiálom podozrivého. Teoreticky stačí veľmi malé množstvo DNA - jedna kópia. DNA sa rozreže na fragmenty a potom sa amplifikuje pomocou PCR. Fragmenty sa oddelia elektroforézou DNA. Výsledný obraz umiestnenia pásov DNA sa nazýva genetický odtlačok prsta.

Stanovenie otcovstva

Výsledky elektroforézy DNA fragmentov amplifikovaných pomocou PCR. otec. Dieťa. matka. Dieťa zdedilo niektoré znaky genetického odtlačku oboch rodičov, čo dalo nový, jedinečný odtlačok.

Aj keď sú „genetické odtlačky prstov“ jedinečné, rodinné väzby sa stále dajú vytvoriť vytvorením niekoľkých takýchto odtlačkov prstov. Rovnakú metódu možno použiť s malými úpravami na stanovenie evolučných vzťahov medzi organizmami.

Lekárska diagnostika

PCR umožňuje výrazne urýchliť a uľahčiť diagnostiku dedičných a vírusových ochorení. Požadovaný gén sa amplifikuje pomocou PCR s použitím vhodných primerov a potom sa sekvenuje, aby sa určili mutácie. Vírusové infekcie môžu byť zistené bezprostredne po infekcii, týždne alebo mesiace predtým, ako sa objavia príznaky ochorenia.

Personalizovaná medicína

Niekedy sú lieky pre niektorých pacientov toxické alebo alergénne. Príčiny sú čiastočne v individuálnych rozdieloch v citlivosti a metabolizme liečiv a ich derivátov. Tieto rozdiely sú určené na genetickej úrovni. Napríklad u jedného pacienta môže byť určitý cytochróm aktívnejší, u iného - menej. Aby sa určilo, aký druh cytochrómu má daný pacient, navrhuje sa pred použitím lieku vykonať analýzu PCR. Táto analýza sa nazýva predbežná genotypizácia.

Klonovanie génov

Génové klonovanie je proces izolácie génov a ako výsledok manipulácií genetického inžinierstva získanie veľkého množstva produktu daného génu. PCR sa používa na amplifikáciu génu, ktorý sa potom vloží do vektora, časti DNA, ktorá prenáša cudzí gén do toho istého organizmu alebo iného organizmu, ktorý sa ľahko pestuje. Ako vektory sa používajú napríklad plazmidy alebo vírusová DNA. Vloženie génov do cudzieho organizmu sa zvyčajne využíva na získanie produktu tohto génu – RNA alebo najčastejšie proteínu. Týmto spôsobom sa mnohé proteíny získavajú v priemyselných množstvách na použitie v poľnohospodárstve, medicíne atď.

Sekvenovanie DNA

V metóde sekvenovania s použitím fluorescenčne alebo rádioaktívne značených dideoxynukleotidov je PCR integrálnou súčasťou, pretože práve počas polymerizácie sú nukleotidové deriváty značené fluorescenčnou alebo rádioaktívnou značkou vložené do reťazca DNA. To zastaví reakciu, čo umožňuje určiť polohy špecifických nukleotidov po separácii syntetizovaných vlákien v géli.

Mutagenéza

V súčasnosti sa PCR stala hlavnou metódou mutagenézy. Použitie PCR umožnilo zjednodušiť a urýchliť postup mutagenézy, ako aj zvýšiť jeho spoľahlivosť a reprodukovateľnosť.

Metóda PCR umožnila analyzovať prítomnosť sekvencií ľudského papilomavírusu v rezoch biopsií ľudských cervikálnych novotvarov uložených v parafíne 40 rokov pred touto štúdiou. Navyše, pomocou PCR bolo možné amplifikovať a klonovať fragmenty mitochondriálnej DNA z fosílnych pozostatkov ľudského mozgu vo veku 7 tisíc rokov!

Na lyzátoch jednotlivých ľudských spermií bola preukázaná možnosť simultánnej analýzy dvoch lokusov umiestnených na rôznych nehomologických chromozómoch. Tento prístup poskytuje jedinečnú príležitosť pre jemnú genetickú analýzu a štúdium chromozomálnej rekombinácie, polymorfizmu DNA atď. Metóda analýzy jednotlivých spermií okamžite našla praktické uplatnenie v súdnom lekárstve, pretože HLA typizácia haploidných buniek umožňuje určiť otcovstvo alebo identifikovať zločinec (HLA komplex je súbor génov ľudského hlavného histokompatibilného komplexu; lokusy HLA komplexu sú najpolymorfnejšie zo všetkých známych u vyšších stavovcov: v rámci druhu je na každom lokuse nezvyčajne veľké množstvo rôzne alely – alternatívne formy toho istého génu).

Pomocou PCR je možné identifikovať správnosť integrácie cudzích genetických štruktúr vo vopred určenej oblasti genómu študovaných buniek. Celková bunková DNA sa aneluje s dvoma oligonukleotidovými primérmi, z ktorých jeden je komplementárny k miestu hostiteľskej DNA blízko miesta inzercie a druhý k sekvencii integrovaného fragmentu v antiparalelnom reťazci DNA. Polymerázová reťazová reakcia v prípade nezmenenej štruktúry chromozomálnej DNA na navrhovanom mieste inzercie vedie k vytvoreniu jednovláknových fragmentov DNA neurčitej veľkosti a v prípade plánovanej inzercie dvojvláknových fragmentov DNA známej veľkosť, určená vzdialenosťou medzi miestami nasadenia dvoch primérov. Okrem toho bude stupeň amplifikácie analyzovanej oblasti genómu v prvom prípade lineárne závislý od počtu cyklov av druhom - exponenciálne. Exponenciálna akumulácia počas PCR amplifikovaného fragmentu vopred stanovenej veľkosti umožňuje jeho vizuálne pozorovanie po elektroforetickej frakcionácii preparátu DNA a jednoznačný záver o inzercii cudzej sekvencie do danej oblasti chromozomálnej DNA.

Záver

Metóda PCR je v súčasnosti najpoužívanejšia ako metóda na diagnostiku rôznych infekčných ochorení. PCR umožňuje identifikovať etiológiu infekcie, aj keď vzorka odobratá na analýzu obsahuje len niekoľko molekúl DNA patogénu. PCR sa široko používa pri včasnej diagnostike infekcií HIV, vírusovej hepatitídy atď. K dnešnému dňu neexistuje takmer žiadne infekčné činidlo, ktoré by nebolo možné zistiť pomocou PCR.

Zoznam použitej literatúry

1.Padutov V.E., Baranov O.Yu., Voropaev E.V. Metódy molekulárno - genetickej analýzy. - Minsk: Unipol, 2007. - 176 s.

2.PCR "v reálnom čase" / Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Yu. atď.; vyd. b. n. D.V. Rebrikov; predslov L.A. Osterman a akad. RAS a RAAS E.D. Sverdlov; 2. vydanie, rev. a dodatočné - M.: BINOM. Vedomostné laboratórium, 2009. - 223 s.

.Patrushev L.I. Umelé genetické systémy. - M.: Nauka, 2005. - V 2 tonách

.B. Glick, J. Pasternak Molekulárna biotechnológia. Princípy a aplikácia 589 strán, 2002

5.Shchelkunov S.N. genetické inžinierstvo. - Novosibirsk: Sib. univ. vydavateľstvo, 2004. - 496 s.

Upravil A.A. Vorbyeva "Polymerázová reťazová reakcia a jej využitie v diagnostike v dermatovenerológii"; Lekárska tlačová agentúra - 72 strán

Http://ru. wikipedia.org

http://scholar. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. nie/ - lekársky časopis

Doučovanie

Potrebujete pomôcť s učením témy?

Naši odborníci vám poradia alebo poskytnú doučovacie služby na témy, ktoré vás zaujímajú.
Odoslať žiadosť s uvedením témy práve teraz, aby ste sa dozvedeli o možnosti konzultácie.