Ершова И.Б., Осичнюк Л.М., Мочалова А.А., Държавна институция „Луганска държавна медицински университет“, Отделение по педиатрия с детски инфекции.
Статията е публикувана в списание „Актуална инфектология”, № 2 (3), 2014 г.
Информационен ресурс „Издателство Заславски” www.mif-ua.com

Статията очертава методи за диагностициране на хелминтни инвазии: микроскопски, ензимен имуноанализ, серологичен, полимеразна верижна реакция, биорезонансна диагностика, хемосканиране, както и инструментални (ултразвуково и рентгеново изследване, компютърна томография) и лабораторни, които имат косвено значение ( клиничен анализкръв, кръвен тест за чернодробни функционални тестове, тест за изпражнения за дисбактериоза). Описани са предимствата на методите, техните недостатъци и надеждността на получените данни. Предлагат се въпросници за пациентите, за да се идентифицира рискът от инфекция с хелминти. Описани са предимствата на методите, техните недостатъци и надеждността на получените данни. Предлагат се въпросници за пациентите, за да се идентифицира рискът от инфекция с хелминти.

Хелминтите имат отрицателен ефект върху човешкото тяло. Те водят до алергизация, развитие на полихиповитаминоза, макро- и микроелементоза, нарушена хемопоеза и съдова пропускливост, хормонален дисбаланс. Хелминтните инфекции допринасят за образуването хронични заболявания(холецистит, холелитиаза, панкреатит, колит, захарен диабет, бронхиална астма, атопичен дерматит), психо-емоционални разстройства ( хронична умора, раздразнителност, тревожност, хиперактивност при деца), анемия и др. При продължителна хелминтна инвазия може да се развие вторичен имунен дефицит.

Бдителността на лекарите по отношение на хелминтните инфекции сред населението в момента е недостатъчна и превенцията се свежда до лечение на идентифицирани инвазирани пациенти.

Диагностика на хелминтозисе базира на клинични, епидемиологични и лабораторни данни. Признаци като астеничен синдром, рецидивираща уртикария, нарушена регенерация на кожата и лигавиците, трудно лечим атопичен дерматит и бронхообструктивен синдром, полилимфаденопатия и хепатоспленомегалия с неясен произход, аденоидни вегетации II-III степен, „географски” език, намален или селективен апетит , нестабилен стол, може да показва наличието на хелминти.

При серологично изследванеопределяне на наличието на антитела срещу хелминти (надеждност - около 60%): ако се подозира ехинококоза, цистицеркоза, трихинелоза, токсокароза, широко се използват реакции на индиректна хемаглутинация, латексна аглутинация, фиксиране на комплемента и имунофлуоресценция.
Не във всички случаи методите за определяне на специфични антитела имат достатъчна специфичност и надеждност. Антигенният състав на хелминта зависи не само от вида, но и от етапа; преминавайки през сложен цикъл на развитие от яйцето до възрастен, хелминтите променят своя антигенен състав. В допълнение, соматичните антитела се използват в имунодиагностични реакции, а в тялото на гостоприемника антителата се произвеждат главно към екскретите и секретите на хелминта. Неспецифичната сенсибилизация на тялото, сходството на някои антигени на трематоди, протозои и хора създават голям процент фалшиво положителни реакции в титри под надеждно диагностичните.

Метод за определяне на хелминти полимеразна верижна реакция е високоспецифичен и силно чувствителен, но поради високата си цена и сложност не може да се използва за скрининг, когато например е необходимо да се изследва група деца от детско заведение.

Имунната система не винаги реагира (разпознава и унищожава) на наличието на хелминти в тялото. Това е така, защото някои хелминти имат издръжлива и химически устойчива капсула или са покрити с вещество, което не се разпознава имунната система; локализиран в тъкани, които са най-защитени от възпалителни реакции, например в гръбначния мозък; много видове от тях в храносмилателния трактотделят антиензими, което ги спасява от смърт; имат голяма продължителност на живота (години, а понякога и до смъртта на лицето); хранят се с гликолиза на нетни въглехидрати; имат устройства като вендузи, куки и др., които улесняват фиксирането вътре в тялото; много видове имат полово размножаване, при които се обменя генна информация, което води до увеличаване на хетерогенната популация и намаляване на уязвимостта; имат високо нивоплодовитост.

При ултразвукова , рентгеново изследване на органи коремна кухина , компютърна томография могат да бъдат идентифицирани косвени признацихелминтиази: хепатоспленомегалия, неравности на черния дроб и паренхима на далака поради малки хиперехогенни сигнали, повишена лимфни възлив портите на далака и самите хелминти (ехинококи, топки от чревни хелминти и др.).

Хемоскениране - качествен кръвен преглед с помощта на мощен микроскоп с тъмно поле, можете да видите състоянието на кръвните клетки (форма, размер, активност, цвят и т.н.), наличието на неспецифични елементи и вещества - всичко това пряко или косвено показва наличието на хелминти в тялото. Изображението се показва на екрана на монитора с помощта на вградената видеокамера в микроскопа. Този диагностичен метод е много надежден.

Индиректна лаборатория знаци хелминтозаМоже да има анемия, базофилия, еозинофилия, повишени нива на аспартат аминотрансфераза. Така при токсокароза се открива левкемоидна реакция на еозинофили (повече от 20%) на фона на персистираща алергичен синдром(атопичен дерматит със силен сърбеж и устойчивост на традиционна терапия, тежка бронхиална астма). Потискане на нормалното колиизследването на изпражненията за дисбактериоза също може да покаже възможна хелминтиаза.

Като се има предвид разпространението на хелминтиазите, ние предлагаме въпросникза определяне на риска от хелминтна инфекция.

• Плуване в сладководни водоеми.
• Не мийте ръцете си със сапун и гореща вода преди хранене.
• Пийте вода от непроверени източници.
• Ядеш домашна мас с ивици месо.
• Ядете ли леко осолена риба?
• Ядете средно сварено месо (с кръв).
• Ядете ли леко осолен, нефабрично приготвен хайвер?
• Не мийте кокоши яйцасъс сапун.
• Не мийте банани, портокали, мандарини преди ядене.
• Наторете градината си с оборски тор.
• Яжте зеленчуци направо от градината.
• Яжте плодове и горски плодове направо от градината.
• Яжте паднали плодове.
• Не изсипвайте вряща вода върху всичките си зеленчуци, за да направите салати.
• Съхранявайте морковите в пясък, взет от двора.
• Ходете боси по тревата.
• Членовете на семейството са имали хелминтни инвазии.
• Семейството има куче или котка.

За всеки отговор " да" - 2 точки, " Понякога" - 1, " не" - 0. При оценка 0–5 вероятността от инфекция е незначителна, 6–12 - инфекция е възможна, 13–25 - висока вероятност, повече от 25 точки - много висока. При последните два резултата са необходими редовни прегледи и евентуално превантивно лечение.

Тъй като клинични проявихелминтните инфекции не винаги са специфични, а в началните етапи - неспецифични, предлагаме въпросник за пациенти за самодиагностика хелминтоза.

• Сутрин има сърбеж в ануса.
• Гадене сутрин при миене на зъбите.
• Белене на пръстите на ръцете или краката с белене на слоеве кожа.
• Алергичен кожен обрив, сърбеж по кожата.
• Пилинг и подуване в областта на клепачите.
• Повишена умора, летаргия, сънливост.
• Повишено чувство на глад.
• Усещане за дискомфорт в корема.
• Загуба на телесно тегло.
• Наличие на няколко хронични органни заболявания стомашно-чревния тракт, стави, бронхопулмонална система.
• Лошо здраве, липса на официална диагноза, дългосрочно неефективно лечение.
• Периодично повишаване на температурата, придружено от болки в мускулите и ставите.

отговор " да» говори за поне 2–3 въпроса голяма вероятностхелминтни инфекции.

ИЗВОДИ

1. Включено модерен етапНяма лабораторни методи за изследване на хелминтни инфекции, които да са 100% надеждни.

2. Полимеразните тестове имат най-голяма надеждност при диагностицирането на хелминтиазите. верижна реакцияи биорезонансна диагностика.

ЛИТЕРАТУРА

Ефективен и удобен метод за хелминтологично изследване е изследване на дебела цитонамазка по Kato, чиято същност е да се открият яйца на хелминти в дебела петна от изпражнения, изчистени с глицерин и оцветени с малахитово зелено. Съставът на сместа Kato е 6 ml 3% воден разтвор на малахитово зелено, 500 ml глицерин, 500 ml 6% разтвор на фенол. Разтворът е стабилен и може да се съхранява при стайна температура. За да се приготвят препаратите, парчета изпражнения с размер на грахово зърно се нанасят върху предметно стъкло, покриват се с филм от хидрофилен целофан, напоен в сместа Kato за 24 часа, и се притискат върху стъклото, за да се разпредели равномерно материала. Пречистените за 40-60 минути натривки се изследват под микроскоп. Откритите яйца на хелминти се преброяват и морфологични характеристикиопределя техния вид. Методът ви позволява да идентифицирате яйца от кръгли червеи, камшични червеи, цестоди, трематоди и в по-малка степен анкилостоми и джуджета.

Също така широко използван методи за обогатяване. Принципът на флотационните методи е да се суспендират изпражненията във физиологичен разтвор, който има по-висока относителна плътност в сравнение с яйцата на хелминтите, в резултат на което те изплуват на повърхността. Съдържанието на повърхностния филм се изследва под микроскоп. Като обогатителни смеси се използват следните разтвори: готварска сол - 400 g в 1 l вода (относителна плътност по Фулеборн -1,18); натриев нитрат - 1 кг в 1 л вода (относителна плътност по "Калантарян-1,38); натриева селитра - 900 г и калиев нитрат - 400 г в 1 л вода (относителна плътност по Брудастов и Краснонос - 1,48). Приготвен разтворите се кипват и охлаждат.
За изследване добавете 5-10 g изпражнения в стъклена или фаянсова чаша, добавете към него 100-200 ml физиологичен разтвори разбъркайте старателно. След това плаващите големи частици се отстраняват с дървена шпатула или лъжичка от хартия или картон и незабавно върху повърхностния филм се нанася широко предметно стъкло, така че физиологичният разтвор и предметното стъкло да са в пълен контакт. След като се остави сместа да се утаи за 30-40 минути, предметното стъкло се отстранява, поставя се под микроскоп с филма нагоре и цялата повърхност се изследва внимателно. За да избегнете изсушаване, можете да добавите 2-3 капки 50% разтвор на глицерин. Повърхностният филм може да се отстрани и с телена примка. Ефективността на флотационните методи се увеличава с увеличаване на относителната плътност на солевите разтвори. С помощта на тези методи е възможно да се открият яйца от нематоди, цестоди и трематоди.

За откриване на яйца в изпражненията се използва методът на утаяване на Красилников. Изпражненията се смесват с 1% разтвор на препарат (прах за пране Lotus и др.) в съотношение 1:10 до образуване на суспензия. Под въздействието на детергента различни компоненти на изпражненията (протеини, мазнини, тъканни елементи) се разтварят. След 30 минути съдържанието на епруветката се разклаща за 1-2 минути, след което се центрофугира за 5 минути. От утайката се приготвят препарати, които се изследват под микроскоп.
В полеви условия, както и по време на масови изследвания на населението за хелминтна инвазия, е удобно да се използва методът на дебелото намазване Като. IN стационарни условияПри изследване на пациенти е за предпочитане да се използват най-ефективните флотационни методи. При използване на тези методи по време на микроскопия е препоръчително да се преброят яйцата, намерени в препарата. Ако пробата или обемът, взет за изследване на изпражненията, е стандартизиран (например 1 чаена лъжица или супена лъжица) и постоянен равномерен обем на физиологичните разтвори, може грубо да се прецени интензивността на инвазиите. Това количествено отчитане може да бъде полезно за обосноваване на предписаното лечение и оценка на ефективността на обезпаразитяването. В допълнение, други по-точни количествени методи, по-специално методът на Stoll, могат да се използват за установяване на интензивността на инфекцията.

За диагностика на тениаринхоза и ентеробиозаИзползва се методът за изследване на перианално-ректални остъргвания. С дървена шпатула, напоена с 50% разтвор на глицерин, изстържете перианалните гънки сутрин преди дефекация в обиколката анусаи долни секцииректума. Полученият материал, почистен от шпатула с ръба на покривно стъкло, се поставя върху предметно стъкло в капка 50% разтвор на глицерол, покрива се с покривно стъкло и се изследва под микроскоп. Можете също така да разгледате лента от целулозна лента, която първо се притиска с адхезивната страна към перинаралните гънки, след което се поставя върху предметно стъкло и се изследва под микроскоп.

Откриване на ларви на нематоди в изпражненията по метода на Берман. Методът се основава на термотропното свойство на ларвите. За изследване вземете 1 супена лъжица изпражнения и ги поставете в метална мрежа или мрежа от няколко слоя марля върху телена рамка. Мрежата е монтирана във фуния, монтирана на статив. Към фунията е прикрепена гумена тръба със скоба. Повдигайки мрежата, напълнете фунията с вода (температура +40°...+50°C), така че долна частмрежата беше потопена във вода. Ларвите от изпражненията активно мигрират към топла водаи, утаявайки се, се натрупват в долната част на фунията. След 2-4 часа скобата се отваря, водата се източва в центрофужна епруветка и се центрофугира за 2-3 минути. След това супернатантната течност се отцежда, утайката се прехвърля върху предметно стъкло и се изследва под микроскоп, където се откриват подвижни ларви на причинителя на стронгилоидозата.

Метод на Харада и Mori прави възможно разграничаването между ларвите на анкилостома и некатор. Ларвите на анкилостомите се култивират върху филтърна хартия. За целта върху ленти от филтърна хартия с размери 12Х1,5 см се нанасят 0,5 g пресни изпражнения, взети от болния не по-късно от 1 час след дефекацията, като двата края на лентата се оставят чисти. Единият край на лентата се потапя в епруветка, една четвърт от която се пълни с вода, а другият се захваща със запушалка. Епруветките се поставят в термостат при температура +26... + 28°C. Ларвите, които се развиват от яйцата, се спускат през филтърната хартия и се утаяват на дъното на епруветката. След 5-6 дни хартиената лента се отстранява и течността, останала в епруветката, се изследва под лупа или се центрофугира. Образуваната при центрофугирането утайка се изследва под светлинен микроскоп. При използване на тетраедрични стъклени буркани (с размери 15xxx7 cm) вместо епруветки, с 4 хартиени ленти, прикрепени към стените, ефективността на анализите се увеличава (G.M. Maruashvili et al., 1966).

Методи за изследване на шистозомиаза . Изследване на изпражнения - порция изпражнения се смесва с 250 мл вода, прецежда се през 3 пласта марля в коничен съд, който се пълни до горе с вода. След 30 минути течният слой се отцежда и към утайката се добавя прясна порция вода. Утайката се промива, докато се получи бистър супернатант и се изследва под микроскоп.

Метод на ларвоскопия - 20-25 g изпражнения се поставят в ерленмайерова колба със запоена отстрани стъклена тръба, насочена нагоре, и се измиват с чешмяна вода. След това колбата се покрива с тъмна хартия, оставяйки запоена стъклена тръба на светлина при температура +25...+30°C. Излюпените мирацидии се концентрират в менискуса в страничната тръба, където могат да се видят с лупа или с просто око. Изследване на урината - 100 ml урина, събрана между 10 и 14 часа, или дневна порция, се утаяват и след това се центрофугират при 1500 rpm. Получената утайка се нанася* върху предметно стъкло и се изследва под микроскоп. СЗО препоръчва метод за филтриране на цялата проба от урина. След филтриране филтрите се обработват с формалдехид или се нагряват (за унищожаване на яйцата) и след това се навлажняват с воден разтвор на нинхидрин. В изсушени препарати яйчните ембриони придобиват лилав цвят.

Приложение на имунологични изследователските методи за диагностициране на шистозомиаза са свързани с трудности, тъй като възрастните шистозоми и техните яйца съдържат голям бройантигени, които причиняват имунни реакции, които не са видово специфични (D. Bradley, 1979).

У нас за стадиране на имунологични реакции при хелминтоза се произвежда цяла поредицастандартна диагностика. Практическо приложениеимате алергии кожен тестза ехинококоза и алвеококоза, RLA с ехинококов антиген, RSC на студено, преципитационна реакция на студено в различни модификации (пръстеновидни утайки, утайки в епруветки или капиляри, които се поставят с антигени на трихинелоза, цистицеркоза и мигроаскариоза). Стандартните диагностични комплекти за извършване на горепосочените серологични реакции се произвеждат от предприятия, произвеждащи бактериални препарати. Производителят предоставя подробни инструкции за произведените диагностични комплекти относно правилата за съхранение, срока на годност на лекарството и инструкциите за употребата на съответните антигени с техниката на поставяне на реакцията.

IN последните годиниСписъкът на серологичните реакции, използвани за диагностициране на хелминтоза, се разшири значително. За тези цели се използват следните реакции: RIGA, индиректна имунофлуоресценция (RIF), имунодифузия в гел (RID), противоимуноелектрофореза (CIEF), CEMA. Тези реакции могат да се използват при аскариаза, токсокароза, трихинелоза, анкилостомоза, филариаза, ехинококоза и алвеококоза, описторхоза, шистозомиаза, парагонимиаза. За тези реакции обаче у нас не се издават стандартни диагностични тестове и не е регламентирана техниката за диагностицирането им. Отделни лаборатории, предимно научни, самостоятелно подготвят специфични антигени и ги използват в различни модификации. Описанието на тези методи е широко представено в литературата и не е строго унифицирано. Интерпретация на данни имунологичен анализтрябва да се основава на изследване на динамиката на имунния отговор, като се вземе предвид нивото на специфичност и чувствителност на всяка използвана серологична реакция. Ето защо при поставяне на диагноза, както и по време на сероепидемиологични изследвания на населението, е препоръчително да се използват няколко от най-чувствителните реакции. От тази гледна точка реакциите VIEF и REMA са се доказали добре, които се отличават с висока чувствителност и доста висока специфичност (P. Ambroise-Thomas, 1978; I. E. Ballad, 1979; G. M. Negreanu, 1980; A. M. Ponomareva, 1981; A. Я. Лисенко, 1978 г. и др.). Ефективността на REMA е тествана при амебиаза, лайшманиоза, трипанозомиаза и токсоплазмоза (G. A. Ermolin, 1980).

Когато се открият яйца на хелминти върху различни обекти на околната среда (почва, вода, зеленчуци и др.), Винаги е необходимо да се определи тяхната жизнеспособност чрез външен вид, оцветяване с витални бои, култивиране при оптимални условия и поставяне на биологична проба, т.е.

Хранене на лабораторни животни.

Определяне на жизнеспособността на яйца или ларви на хелминти по външен вид. Яйцата на хелминтите се микроскопират първо при ниско, след това при голямо увеличение. При деформирани и мъртви яйца на хелминти черупката е разкъсана или огъната навътре, плазмата е мътна и разхлабена. При сегментираните яйца топките за смачкване (бластомерите) са с различни размери, неправилна форма и често изместени към единия полюс. Понякога има анормални яйца, които въпреки външните деформации се развиват нормално. При живите ларви на кръгли червеи има фина зърнистост само в средната част на тялото, когато те умират, зърнистостта се разпространява по цялото тяло и се появяват големи блестящи хиалинни вакуоли - така наречените нишки от перли.

За да определите жизнеспособността на зрели яйца на кръгли червеи, камшични червеи и острици, трябва да се обадите активни движенияларви чрез леко нагряване на препарата (до температура не по-висока от 37 °C). По-удобно е да се наблюдава жизнеспособността на ларвите на аскариди и червеи след изолирането им от черупката на яйцето чрез натискане върху покривното стъкло на препарата с дисекционна игла или пинсети.

При инвазивните ларви на кръгли червеи често се вижда обвивка, която се отлепва в края на главата, а при ларвите на камшичен червей, които са завършили развитието си в яйцето, на това място се открива стилет при голямо увеличение. При мъртвите ларви на хелминти, независимо от тяхното местоположение (в яйцето или извън него), се забелязва разпадане на тялото. В този случай вътрешната структура на ларвата става блокова или гранулирана, а тялото става мътна и непрозрачна. В тялото се намират вакуоли, а по кутикулата се откриват счупвания.

Жизнеспособността на тениидните онкосфери (говежда, свинска тения и др.) се определя от движението на ембрионите, когато са изложени на тях храносмилателни ензими. Яйцата се поставят върху часовниково стъкло с стомашен соккучета или изкуствен дуоденален сок. Съставът на последния: панкреатин 0,5 g, натриев бикарбонат 0,09 g, дестилирана вода 5 ml. Часовниците с яйца се поставят в термостат при 36-38 ° С за 4 часа. В същото време живите ембриони се освобождават от черупките. Обвивките на живите онкосфери също се разтварят в подкислен пепсин и в алкален разтвор на трипсин след 6-8 часа в термостат при 38 °C.

Ако поставите яйцата на taeniid в 1% разтвор на натриев сулфид, или 20% разтвор на натриев хипохлорид, или в 1% разтвор на хлорирана вода при 36-38 ° C, зрелите и живи ембриони се освобождават от мембраните и правят не се променя в рамките на 1 ден. Незрелите и мъртви онкосфери се свиват или набъбват и рязко се увеличават и след това се "разтварят" в рамките на 10 минути - 2 часа. Живите ембриони на тенидите също се движат активно в смес от 1% разтвор на натриев хлорид, 0,5% разтвор на натриев бикарбонат и жлъчка при 36-38. °C.

Жизнеспособността на сколекса на ехинококите се определя при слабо нагряване. За целта измити във вода сколекси или разплодни капсули се поставят в капка вода върху предметно стъкло с отвор, покриват се с покривно стъкло и се изследват под микроскоп с нагряващ етап при температура 38-39 °C. Ако няма нагревателна маса, лекарството се нагрява с помощта на произволен източник на топлина. В същото време жизнеспособните сколекси активно се движат, свивайки или отпускайки смукателите, удължавайки и скъсявайки хоботчето. Ако поставите сколекса в 0,5-1% воден разтвор на филицилен при стайна температура, тогава всички жизнеспособни сколекси бързо ще се окажат и ще умрат. Нежизнеспособните сколекси не се извиват.

Жизнеспособността на Adolescaria fascioli, събрана върху растения и други обекти във водни тела, се проверява чрез изследването им върху предметно стъкло в физиологичен разтворпод микроскоп с нагряващ етап. Когато ларвите на трематодите се нагреят, те започват да се движат.

Жизнеспособността на яйцата на тенията джудже се определя от разположението на кукичките на ембриона.

В живите яйца на тенията джудже се наблюдават бавни махалообразни движения на протоплазмата и почти незабележимо раздалечаване и преместване на заострените краища на страничната двойка куки встрани от средната двойка.

Контракциите на протоплазмата на ембриона и ембрионалните кукички помагат на ембриона да се освободи първо от мембраните на онкосферата, а след това от външната обвивка на яйцето.

В живо яйце средната двойка и страничните двойки куки са разположени успоредно; в някои яйца остриетата на страничните двойки са близо една до друга и са разположени под ъгъл по-малък от 45 ° по отношение на средната двойка куки.

Умиращият ембрион се свива конвулсивно и бавно раздалечава куките. При мъртъв ембрион движението на куките спира и те са разположени безредно, понякога куките странично на съседната двойка се раздалечават под прав, тъп или остър ъгъл.

Понякога се наблюдава набръчкване на ембриона и образуване на гранулация. По-точен метод се основава на появата на движения на онкосферата по време на рязка промяна на температурата: от 5-10 до 38-40 ° C.

Определянето на жизнеспособността на незрелите нематоди трябва да се изследва във влажна камера (блюда на Петри), като яйцата на кръглите червеи се поставят в 3% разтвор на формалдехид, приготвен в изотоничен разтвор на натриев хлорид при температура 24-30 ° C, яйцата на червеите в 3 % разтвор на солна киселина при температура 30-35 °C, яйца на острици в изотоничен разтвор на натриев хлорид при температура 37 °C. Петриевите блюда трябва да се отварят 1-3 пъти седмично за по-добра аерация и филтърната хартия трябва да се намокри отново с чиста вода.

Наблюденията за развитието на яйцата на хелминтите се извършват най-малко 2 пъти седмично. Липсата на признаци на развитие в рамките на 2-3 месеца показва тяхната нежизнеспособност. Признаци за развитието на яйца от хелминти са първите етапи на раздробяване, разделяне на съдържанието на яйцето на отделни бластомери. През първото денонощие се развиват до 16 бластомера, които преминават във втори стадий - морула и т.н.

Яйцата на анкилостомите се култивират в стъклен цилиндър (висок 50 cm и диаметър 7 cm), затворен със запушалка. Смес от равни обеми стерилен пясък, въглен и изпражнения с яйца от анкилостоми, разредени с вода до полутечна консистенция, внимателно се изсипват върху дъното на цилиндъра с помощта на стъклена тръба. По време на 1-2 дни утаяване на тъмно при температура 25-30 ° C, рабдитиформните ларви се излюпват от яйцата и след 5-7 дни те стават филариформени: ларвите пълзят нагоре по стените на цилиндъра, където са видими дори с невъоръжено око. Яйцата на трематоди, които естествено се развиват във вода, например описторхииди, дифилоботрииди, фасциоли и др., се поставят върху часовниково стъкло, петриево блюдо или в друг съд и се изсипва малък слой обикновена вода. При култивирането на яйцата на Fasciola трябва да се има предвид, че те се развиват по-бързо на тъмно, докато мирацидиумът се образува в живите яйца при температура 22-24 ° C след 9-12 дни. При микроскопиране развиващи се яйцатрематоди, движенията на мирацидиума са ясно видими. Miracidium fasciola излиза от черупката на яйцето само на светлина. По време на култивирането водата се сменя след 2-3 дни.

Анкилостомата и стронгилоидните ларви се култивират върху агар в петриево блюдо с животински въглен. След като са били в термостат при температура 26-30 ° C в продължение на 5-6 дни, ларвите пълзят по агара, оставяйки след себе си пътека от бактерии (метод на Fulleborn).

Метод на Харада и Мори (1955). Добавете 7 ml дестилирана вода към епруветките, поставени в стойка. С помощта на дървена пръчка се вземат 0,5 g изпражнения и се прави петно ​​върху филтърна хартия (15X150 mm) на 5 cm от левия ръб (тази операция се извършва върху лист хартия, за да се предпази повърхността на лабораторната маса). След това лентата с цитонамазката се вкарва в епруветката така, че левият край, свободен от цитонамазката, да стига до дъното на епруветката. Горният край се покрива с парче целофан и се увива плътно с ластик. Върху епруветката се изписват номерът и фамилията на изследваното лице. В това състояние епруветките се съхраняват 8-10 дни при температура 28 °C. За да изследвате културата, отстранете целофановото покритие и отстранете лента от филтърна хартия с пинсети. Трябва да се внимава, когато правите това, тъй като малък брой инфекциозни ларви могат да се преместят в горния край на филтърната хартия или отстрани на тръбата и да проникнат под повърхността на целофана.

Епруветките се поставят в горещо водна баняпри температура 50 °C за 15 минути, след което съдържанието им се разклаща и бързо се излива в 15-милилитрова епруветка за утаяване на ларвите. След центрофугиране супернатантата се отстранява и утайката се прехвърля върху предметно стъкло, покрива се с покривно стъкло и се изследва под микроскоп при слабо увеличение.

За диференциална диагнозафилариформени ларви, е необходимо да се използват данните, представени в табл. 13.

Методи за оцветяване на яйца и ларви на хелминти. Мъртвите тъкани в повечето случаи възприемат боите по-бързо от живите. Тези характеристики се използват в хелминтологията за определяне на жизнеспособността на яйцата и ларвите на хелминтите. В някои случаи обаче някои бои се възприемат по-добре от живите тъкани, отколкото от мъртвите.

Таблица 13. Диференциална диагноза на нишковидни ларви на A. duodenale, N. americanus, Strongyloides stercoralis, Trichostrongylus spp.

За диференциално разпознаване на живи и мъртви яйца и ларви се използват следните бои и методи.

Leukobase метиленово синьо се използва за оцветяване на живи и мъртви тъкани. Жива клеткаили тъканта се редуцира метиленово синьо в безцветна левкобаза, мъртвата тъкан няма тази способност, така че придобива цвят.

За оцветяване на яйца от кръгли червеи можете да използвате метиленово синьо в разтвор на млечна киселина с каустик алкали (0,05 g метиленово синьо, 0,5 g натриев хидроксид, 15 ml млечна киселина). Живите яйца не възприемат цвят; ембрионите на мъртвите яйца са оцветени синьо.

Методът на оцветяване не е приложим за незрели яйца на аскариди и камшичести червеи; пигментираната черупка е оцветена и следователно не се вижда дали зародишната клетка вътре в яйцето е оцветена.

Ларвите на Ascaris се оцветяват с основен разтвор на брилянтно крезил синя боя в концентрация 1:10 000. както следва: капка течност с яйца на кръгли червеи и капка от основния разтвор на боята се нанасят върху предметно стъкло. Препаратът се покрива с покривно стъкло, което се притиска плътно към препарата с леко почукване с дисекционна игла. Броят на появилите се ларви и степента на тяхното оцветяване се наблюдават под микроскоп, след което същият препарат се изследва отново след 2-3 часа. За живи се считат само недеформираните ларви, които не са оцветени в продължение на 2 часа черупката се счупва (частично или напълно).

Възможността за оцветяване на препарати с йоден разтвор е показана при определяне на жизнеспособността на яйцата на птичи кръгли червеи. В този случай 5% се използват като багрило. алкохолен разтворЙода. Когато се нанесе върху препарата, ембрионите на мъртвите яйца на Ascaridia се оцветяват за 1-3 s. оранжево. Мъртви яйца на описторхис и онкосфера говежда тениясе оцветяват с разтвор на толуидиново синьо (1:1000), а мъртвите онкосфери от говежда тения се оцветяват с разтвор на брилянтно крезил синьо (1:10 000). В същото време ембрионите и черупките на мъртвите и живите яйца придобиват цвят. Следователно, след оцветяване, яйцата и онкосферите се измиват чиста водаи допълнително оцветени със сафранин (разреден 1:10 000 в 10% алкохолен разтвор). Алкохолът премахва цвета от черупките, а сафранинът им придава червен цвят. В резултат на това живите яйца стават червени, ембрионът на мъртвите става син, а черупката остава червена. Мъртвите ембриони на онкосфери от говежда тения бързо, в рамките на няколко минути, стават яркочервени или розовосафранин или синьо брилянтно крезил синьо в разреждане 1:4000 или индигокармин в разреждане 1:1000-1:2000.

Живите ембриони не се променят под въздействието на тези багрила дори след 2-7 часа.

За да се определи жизнеспособността на яйцата на тения джудже, се препоръчва използването на следните бои: 1) брилянтно крезилово синьо (1: 8000) - след 1 час онкосферата на мъртвите яйца става особено ярко оцветена, което се откроява рязко на фона на бледото или безцветен фон на останалата част от яйцето; 2) сафранин: разреден 1:8000 с експозиция за 2 часа и 1:5000 за 3-5 часа; 3) 50% разтвор на пирогалова киселина в разреждане 1: 2 - при излагане в продължение на 1 час при температура 29-30 ° C (колкото по-ниска е температурата, толкова по-дълъг процесоцветяване).

Живите плероцеркоиди на тения се оцветяват много добре с воден разтвор (1: 1000) на неутрална глина за 5-20 минути. За да се получи устойчив розов цвят, който не изчезва в рамките на 5 дни и не засяга подвижността на плероцеркоидите, обикновено са достатъчни 10 минути. Степента на оцветяване се контролира чрез преглед на ларвите в чиста изотоничен разтворнатриев хлорид, за който плероцеркоидите периодично се отстраняват от боята. Препоръчително е да използвате метиленово синьо за оцветяване на мъртви плероцеркоиди.

Р. Е. Чобанов и др. (1986) предложиха метод за определяне на жизнеспособността на яйцата и ларвите на хелминтите с помощта на пигмент „рубрин“, получен чрез култивиране на плесента Penicilium rubrum. За да направите това, използвайте 3% воден разтвор на багрило.

Процесът на оцветяване на яйцата и ларвите завършва след 1,5 часа. Нежизнеспособните яйца на острици, говеда и джуджета, анкилостоми, трихостронгилиди придобиват интензивен розов цвят, ларвите на анкилостомите и трихостронгилидите стават червени. По-малко ярък цвят се наблюдава в яйцата на кръгли червеи и камшични червеи, тъй като при освобождаване от червата те вече имат тъмно кафяв цвят: Жизнеспособните яйца и ларви не се оцветяват.

Физико-химични методи за стимулиране на освобождаването на миракулид от яйца на трематоди. Методите са разработени от S.M. German и S.A. Beer (1984) за определяне на жизнеспособността на яйцата от описторхид и дикроцелиум чрез излагане на яйцата на реакционна среда. Ако са живи, мирацидият се освобождава. Методите се основават на физикохимичното активиране на жлезата за люпене на мирацидиум и стимулиране на двигателната активност на ларвата. Стимулирането се постига чрез излагане на трематодни яйца на специална реакционна среда в комбинация с последователни техники - създаване на температурна разлика, изсушаване на суспензия от яйца, излагане на слаб поток от течност в тестовата капка, което допринася за масивно освобождаване на мирацидии от яйцата.

Определяне на жизнеспособността на яйцата на описторхидите по метода на Herman и Beer. Суспензия от яйца във вода (чешмяна, утаена) предварително се охлажда до 10-12 ° C. Всички последващи операции се извършват при стайна температура (18-22 °C). Една капка (приблизително 0,05 ml) от суспензия, съдържаща 100-400 яйца, се добавя към центрофужна епруветка. Епруветките се поставят в решетка за 5-10 минути, за да се утаят яйцата. След това използвайте тясна лента филтърна хартия, за да изсмучете внимателно излишната вода, докато бъде напълно отстранена. Добавете 2 капки среда към епруветката, разклатете, прехвърлете съдържанието с пипета върху предметно стъкло и оставете за 5-10 минути, като леко разклатите (или поставете под сешоар), за да създадете слаби течни течения в тестовата капка суспензия . Тази операция, която имитира перисталтиката на червата на мекотелото, позволява да се активира освобождаването на мирацидия. След това към суспензията се добавят още 2 капки от средата и след това препаратът се микроскопира с помощта на конвенционален светлинен микроскоп (Х200). През това време капакът на яйцата с жизнеспособен мирацидий трябва да се отвори и ларвата активно излиза в околната среда. Благодарение на наличието на етанол в него, мирацидиумът се имобилизира след 3-5 минути и след това се оцветява с багрило, намиращо се в средата. В резултат на това мирацидиите лесно се откриват и преброяват.

Приготвяне на реакционната среда. Средата се приготвя в 0.05 М Tris-HCi буфер при оптимални условия на рН 8.0-9.5. Към буфера се добавят етанол до 10-13% и багрило (сафранин, метиленово синьо и други, работещи в диапазона на рН), докато течността леко се оцвети (например за сафранин крайната му концентрация ще бъде 1:50 000). Можете да използвате друг буфер, който работи в границите на алкално рН, като например 0,05 М фосфат (рН 8,5). Следователно средата съдържа 96% етанол - 12 части; багрило ( матерна луга) - 1-10 части; 0,05 M Tris-NS! буфер (pH 8,5-9,5) - до 100 части. Пример за среда: 12 части 96% етанол, 1 част наситен разтвор на сафранин, останалите до 100 части - 0,05 М Tris-HCl буфер, pH 9,5.

Определяне на жизнеспособността на яйца от дикроцелиум по метода на Herman, Beer, Stratan. Капка суспензия, съдържаща 100-150 яйца на трематоди, се поставя в центрофужна епруветка за 1-2 минути, за да се утаят яйцата. След това течността внимателно се изсушава с помощта на лента от филтърна хартия. Добавете 1-2 капки от реакционната среда с помощта на пипета на Пастьор и инкубирайте във водна баня при 28-30 °C за 2-3 минути. Състав на средата: 6 части бутанол, 94 части 0,4% разтвор на натриев хлорид или 0,3% разтвор на калиев хлорид в дестилирана вода. Яйцата в средата се прехвърлят с пипета върху предметно стъкло и се оставят за 1,5-2 часа на стайна температура (18-22 °C), като се добавят 1-2 капки (0,05) на всеки 25-30 минути (докато изсъхнат ). ml) разтвор на бутанол в дестилирана вода. След това препаратът се изследва под микроскоп при 100-200x увеличение. Жизнеспособността се определя от броя на отворените яйца с освободени мирацидии. Бутанолът прониква през порите на яйчната черупка, достига до мирацидиите и ги активира. Инкубацията при отбелязаната температура усилва този процес. Бутанолът в концентрация 3-7% е вреден за мирацидия, излизащ от яйцето. Прехвърлянето на суспензия от яйца от епруветка в предметно стъкло позволява да се намали концентрацията на бутанол поради изпаряване до безопасно ниво (1,5-0,5%) до момента на освобождаване на мирацидия (след 30-40 минути). Наличието на натриев хлорид в средата в концентрация 0,1-0,5% (или калиев хлорид в концентрация 0,05-0,4%) определя активността на освободения мирацидий. За разлика от малките прозрачни яйца на описторха, яйцата на дикроцелия имат тъмно оцветена черупка, имат ясно видима капачка, която се отваря след излизане на мирацидия. Следователно е по-удобно да се оцени жизнеспособността на яйцата на дикроцелиум чрез преброяване на отворените яйца, отколкото чрез оцветяване и преброяване на мирацидиите.

Луминесцентен метод за изследване на яйца и ларви на хелминти.

За първи път в хелминтологичната практика методите на флуоресцентна микроскопия са използвани през 1955 г. Съобщава се, че флуоресцентната микроскопия позволява да се разграничат живи и мъртви обекти, без да се повреди яйцето. За флуоресценция не са използвани UV лъчи, а синьо-виолетовата част видима светлина, с конвенционален микроскоп и предметни стъкла; За осветителя OI-18 е използван специален комплект цветни филтри.

Установено е, че живите и мъртвите яйца на кръгли червеи, острици, тении джуджета, говежди тении, широки тении и други хелминти флуоресцират по различен начин. Това явление се наблюдава както по време на първична луминесценция без използване на багрила, така и при оцветяване с флуорохроми (акридин оранжево, корифосфин, примулин, ауролин, берлерин сулфат, трипафлавин, риванол, хинин и др.).

Неоцветени, живи, несегментирани яйца на кръгли червеи светят в ярко зелено жълтеникав оттенък; в мъртвите яйца черупката излъчва зелена светлина много по-ярка от тъмнозелената ембрионална черупка; При яйцата на кръглите червеи с ларва се появява само черупката, а при мъртвите яйца и черупката, и ларвата са ярко жълти.

Непигментираните и несегментираните живи яйца на острици и тении джуджета излъчват зеленикаво-жълта светлина; В мъртвите яйца черупката свети интензивно на фона на тъмнозелена ембрионална маса. С вторична луминесценция (при оцветяване с акридиново оранжево в разреждане 1: 10 000 и 1: 50 000 от 30 минути до 2 часа) черупката на живи и мъртви нематоди, трематоди и цестоди луминесцира по различен начин.

Черупката на живи и мъртви Ascaris lumbricoides, Toxocara leonina, Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. diminuta, T.saginatus, D.latum е оцветена в оранжево-червено. Ембриони на живи Asc. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum и онкосферите на говежди тения флуоресцират в матов тъмнозелен или сиво-зелен цвят. Мъртвите ембриони на тези яйца на хелминти излъчват "горяща" оранжево-червена светлина. Живите ларви на острици и токсокари (освободени яйчни черупки) излъчват матова сиво-зелена светлина, когато умрат, цветът се променя от края на главата до „горящо“ светлозелено, след това жълто, оранжево и накрая ярко оранжево.

При оцветяване с флуорохроми - корифосфилус, примулин - мъртвите яйца на кръгли червеи и червеи проявяват блясък от лилаво-жълто до медно-червено. Жизнеспособните яйца не луминесцират, а са боядисани в тъмно зелено. Живите яйца на трематодите Paragonimus westermani и Clonorchis sinensis не луминесцират при оцветяване с акридиново оранжево, но мъртвите яйца излъчват жълтеникаво-зелена светлина.

Методът на луминесценция може да се използва и за определяне на жизнеспособността на ларвите на хелминтите. По този начин ларвите на стронгилат и рабдитатус, флуорохромирани с разтвор на акридиново оранжево (1: 2000), светят: живи - зелени (с оттенък), мъртви - с ярко оранжева светлина. Живите ларви на Trichinella не светят или дават слаб блясък, когато се третират в продължение на 10 минути с разтвори на флуоресцеин изотиоцианат, аурамин и др. Флуорохромираните мъртви ларви (в концентрация 1:5000) дават ярка светлина.

Живите мирацидии, излизащи от черупката, излъчват слаба синкава светлина с едва забележимо светло жълто венче от реснички, но 10-15 минути след смъртта те се появяват с ярка „горяща“ светлозелена и след това оранжево-червена светлина.

Хелминтологични методи за изследване. Методите за диагностициране на хелминтни инфекции се разделят на директни, базирани на директно откриване на самите хелминти или техни фрагменти, както и на ларви и яйца на хелминти (методи за изследване на изпражнения, урина, жлъчка и дуоденално съдържание, храчки, кръв и тъкани, материал получени чрез изстъргване от перианалната област и поднокътните пространства), и индиректни, с помощта на които се разкриват вторични промени, настъпващи в човешкото тяло в резултат на активността на хелминтите (изследвания на морфологичния състав на кръвта, имунологични методидиагностика на хелминтози, рентгенови изследвания и др.). От директните методи най-разпространени са скатологичните, които се делят на макро- и микрохелминтоскопски. В някои случаи се използват специални методи.

Макрохелмитоскопски методи на изследваненасочени към търсене на хелминти или техни фрагменти (сколекси, сегменти, части от стробили на цестоди). Те се използват за диагностициране на тези хелминтози, при които яйцата не се екскретират в екскрементите на пациента или се екскретират в малки количества и не винаги (например при ентеробиоза, острици се откриват в изпражненията, при тениаза - сегменти).

За да се открият острици или цестодни сегменти в изпражненията, изпражненията се изследват с просто око. За диференциална диагноза Taeniasis, се препоръчва да се гледат изпражненията, разредени с вода, на отделни малки порции в черни фотографски кювети или в панички на Петри на тъмен фон. Големи образувания, съмнителни за фрагменти от хелминти, се изследват под лупа между две предметни стъкла. Ако според клиничните показания след лечението се очаква откриване на малки хелминти или глави на цестоди, тогава подозрителните частици се изследват под лупа в капка глицерин и, ако е необходимо, под микроскоп.

Микрохелминтоскопски методи на изследване(качествени) са насочени към идентифициране на яйца и ларви на хелминти. Използва се методът на дебелото намазване с целофаново покритие по Kato. Като сместа се състои от 6 мл 3% воден разтвор на малахитово зелено, 500 млглицерин и 500 мл 6% разтвор на фенол. Плочи според Kato (хидрофилен целофан се нарязва на парчета с размери 20´ 40 мм) потопен за 24 чв сместа Като, така че да са съседни една на друга (3-5 мл Kato разтвор на 100 плаки). 100 мгизпражненията се нанасят върху предметно стъкло, покриват се с целофаново покритие според Като и се притискат надолу, така че изпражненията да се размажат върху предметното стъкло в рамките на целофановата пластина. Намазката се оставя на стайна температура да изсветли с 40-50 мин.,и след това се изследва под микроскоп. В горещия сезон, за да предотвратите изсъхването на препарата, поставете влажна гъба върху чинията на приготвения препарат.

За пълно откриване на хелминти от всички видове трябва да се използва методът за дебело натриване Kato с целофаново покритие в комбинация с един от методите за обогатяване. Най-често срещаните от тях са методът на Калантарян и методът на Фулеборн.

Метод на Калантарян: в бутилки с широко гърло с обем 100 бр млразбъркайте старателно със стъклена пръчка 5 Жизпражнения, като постепенно се добавя наситен разтвор на натриев нитрат (1 кгнатриев нитрат на 1 лвода при кипене) до ръба на чашата. Едрите частици, които изплуват на повърхността, се отстраняват с хартиена лъжичка. Предметно стъкло се поставя върху повърхността на физиологичния разтвор (физиологичният разтвор се добавя, докато сместа влезе в пълен контакт с предметното стъкло). През 20-30г минслайдът се отстранява и филмът се изследва под микроскоп. При липса на тази сол можете да използвате наситен разтвор на готварска сол според Fholleborn (400 Жсол в 1 лвряща вода).

Поради факта, че яйца с голямо специфично тегло (неоплодени яйца на кръгли червеи, яйца на трематоди и големи цестоди) не плават, освен изследване на повърхностния слой на течността, при използване на метода на Фулеборн е необходимо да се изследва 2-4 препарата от утайката под микроскоп.

Специални лабораторни методи за изследване на различни хелминтози.

Фекален преглед

Микроскопията първоначално се извършва при ниско увеличение (X80). Протозоите могат да бъдат заменени от тяхното по-силно пречупване на светлината, а някои видове могат да бъдат заменени от тяхното движение или промяна на формата. Обект, забелязан при ниско увеличение, се изследва при увеличение от 400 или 600. При липса на опит, прегледът на петна трябва да се направи незабавно при голямо увеличение, което обаче значително увеличава времето за изследване на лекарството. Гледането на удари с четка при голямо увеличение трябва да става при по-силно осветление, като се регулира с помощта на кондензатор.

Диференциални характеристики отделни видовеамебите в нативна намазка са формата и размерите на тялото, видимостта на ядрото, естеството на образуването на псевдоподии, движението, разделянето на цитоплазмата на екто- и ендоплазма, естеството на включванията (фагоцитирани еритроцити, и т.н.). При разграничаване на флагелатите - размерът и формата на тялото, броят на флагелите, естеството на движението, наличието или отсъствието на вълнообразна мембрана. Специфични характеристики на балантидиите са размер, форма на тялото, движение, реснички, цитостома и др.

Основен отличителен белегвегетативните форми на протозоите в живо състояние служат за движение. В намазките се откриват различни видове неподвижни образувания - растителна целулоза, мускулни влакна, спори, гъбички и др. Те не трябва да се вземат предвид при протозоологичната диагностика.

Методът на нативната цитонамазка е прост и достъпен за всяка лаборатория. Позволява при откриване на тъканни форми на дизентерийни амеби с фагоцитирани еритроцити да се постави напълно точна диагнозаамебна дизентерия и ако се открият балантидия и ламблия - диагноза балантидиаза и лямблиоза.

Оцветяване на петна с разтвор на Лугол . Това оцветяване се използва за диагностициране на протозои чрез кисти. Използва се при изследване на оформени, полуоформени и кашави изпражнения.

За да се приготви цитонамазка, краят на дървена пръчица се замърсява с изпражнения и се измива в капка йоден разтвор (J - 1,0 g, KJ - 2 g, дестилирана вода - 100 ml), нанесен върху предметно стъкло, докато се получи равномерна емулсия получено. Препаратът се покрива с покривно стъкло и след 3 – 5 мин. микроскоп. Намазката трябва да е достатъчно прозрачна, за да се изследва в пропускаща светлина.

Сред останките несмляна храна, спори, гъбички, йодофилни бактерии, протозойни цисти, оцветени в кафяво или зеленикаво-жълто, се отличават със строго определена форма, размер, характерни за всеки вид, отчетливи очертания на ръбовете, наличие на гладка, прозрачна, двукръгова обвивка, съдържанието на цитоплазмата, както и наличието на ядра с неясно дефинирана структура. В кистите на амеба се виждат кафяви (тъмнокафяви) гликогенни вакуоли. Степента на оцветяване на тези вакуоли и очертанията на техните граници варират в протозойните цисти от един и същи вид в зависимост от тяхната зрялост.