Методи сучасної діагностики гельмінтозів. ІІІ

При виявленні яєць гельмінтів на різних об'єктах навколишнього середовища (ґрунт, вода, овочі та ін.) завжди необхідно визначати їх життєздатність на вигляд, фарбуванням вітальними фарбами, культивуванням в оптимальних умовах і постановкою біологічної проби, тобто.

Згодовуванням лабораторним тваринам.

Визначення життєздатності яєць або личинок гельмінтів на вигляд. Яйця гельмінтів мікроскопують спочатку при малому, потім за великому збільшенні. У деформованих і мертвих яєць гельмінтів оболонка розірвана або прогнута всередину, мутна плазма, розпушена. У сегментованих яєць кулі дроблення (бластоміри) нерівного розміру, неправильної формичасто зрушені до одного полюса. Іноді зустрічаються аномальні яйця, які, маючи зовнішні потворності, розвиваються нормально. У живих личинок аскарид дрібна зернистість є лише у середній частині тіла, у міру їх загибелі зернистість поширюється у всьому тілі, з'являються великі блискучі гіалінові вакуолі - звані перлинні нитки.

Для визначення життєздатності зрілих яєць аскарид, волосоголовців, гостриків слід викликати активні рухи личинок легким підігрівом препарату (до температури не вище 37 °С). Життєздатність личинок аскарид та волосоголовців зручніше спостерігати після їх виділення із шкаралупи яйця натисканням на покривне скло препарату препарувальною голкою або пінцетом.

У інвазійних личинок аскарид часто помічається чехлик, що відшарувався на головному кінці, а в личинок власоголовів, що закінчили розвиток в яйці, на цьому місці при великому збільшенні виявляється стилет. У загиблих личинок гельмінтів незалежно від місця їхнього перебування (в яйці або поза ним) помічають розпад тіла. При цьому внутрішня структура личинки стає глибчастою або зернистою, а тіло каламутним і непрозорим. У тілі виявляються вакуолі, але в кутикулі - розриви.

Життєздатність онкосфер теніїд (бичачого, свинячого ціп'яків та ін.) визначають за рухом зародків при впливі на них травних ферментів. Яйця поміщають на годинникове скло зі шлунковим соком собаки або штучним соком дуоденальним. склад останнього: панкреатину 0,5 г, натрію бікарбонату 0,09 г, дистильованої води 5 мл. Годинникове скло з яйцями ставлять у термостат при 36-38 “З на 4 год. При цьому живі зародки звільняються від оболонок. Оболонки живих онкосфер також розчиняються в підкисленому пепсині та в лужному розчині трипсину через 6-8 годин у термостаті при 38 °С.

Якщо помістити яйця тенію в 1% розчин натрію сульфіду, або 20% розчин натрію гіпохлориду, або ж в 1% розчин хлорної води при 36-38 ° С, зрілі та живі зародки звільняються від оболонок і не змінюються протягом 1 доби. Незрілі і мертві онкосфери зморщуються або набухають і різко збільшуються, а потім «розчиняються» протягом 10 хв - 2 год. 38 °С.

Життєздатність сколексів ехінококів визначають при слабкому нагріванні. Для цього відмиті у воді сколекси або виводкові капсули поміщають у краплю води на предметне скло з ямочкою, покривають покривним склом і досліджують під мікроскопом з нагрівальним столиком при температурі 38-39 °С. Якщо немає нагрівального столика, препарат підігрівають за допомогою будь-якого джерела тепла. При цьому життєздатні сколекс активно рухаються, скорочуючи або розслаблюючи присоски, подовжуючи і коротшаючи хоботок. Якщо помістити сколекси в 0,5-1% водний розчин філіцилену при кімнатній температурі, то всі життєздатні сколекс швидко вивернуться і загинуть. Нежиттєздатні сколекси у своїй не вивертаються.

Життєздатність адолескаріїв фасціол, зібраних на рослинах та інших об'єктах водойм, перевіряють дослідженням їх на предметному склі у фізіологічному розчині під мікроскопом із нагрівальним столиком. При підігріванні личинки трематоди, що у цисті, починають рухатися.

Життєздатність яєць карликового ціп'яка визначають за розташуванням гачків на зародку.

У живих яйцях карликового ціп'яка відбуваються мляві маятникоподібні рухи протоплазми і майже непомітні розсування та зрушення загострених кінців латеральної пари гаків в сторони від середньої пари.

Скорочення протоплазми зародка та зародкових гачків допомагають зародку звільнитися спочатку від оболонок онкосфери, а потім від зовнішньої оболонки яйця.

У живому яйці медіанна пара і бічні пари гаків розташовані паралельно, в деяких яйцях леза бічних пар зближені і розташовані по відношенню до середньої пари гачків під кутом менше 45 °.

Зародок, що гине, конвульсивно скорочується і мляво розсовує гаки. У загиблому зародку рух гаків припиняється, і вони розташовуються безладно, іноді ж латеральні по відношенню до сусідньої пари гаки бувають розсунуті під прямим, тупим або гострим кутом.

Іноді спостерігаються зморщування зародка, утворення зернистості. Більш точний метод, заснований на появі онкосферних рухів при різкій зміні температур: від 5-10 до 38-40 °С.

Визначення життєздатності незрілих нематод слід вивчати у вологій камері (чашках Петрі), поміщаючи яйця аскарид у 3% розчин формаліну, приготований на ізотонічному розчині натрію хлориду при температурі 24-30 ° С, яйця власоголов у 3% розчин 3 °С, яйця гостриків в ізотонічний розчин хлориду натрію при температурі 37 “С. Чашки Петрі слід відкривати 1-3 рази на тиждень для кращої аерації та знову зволожувати фільтрувальний папір чистою водою.

Спостереження за розвитком яєць гельмінтів ведуть не менше 2 разів на тиждень. Відсутність ознак розвитку протягом 2-3 місяців свідчить про їх нежиттєздатність. Ознаками розвитку яєць гельмінтів є спочатку стадії дроблення, розподіл вмісту яйця на окремі бластомери. Протягом першої доби розвивається до 16 бластомірів, які переходять у другу стадію – морулу тощо.

Яйця анкілостомід культивують у скляному циліндрі (висотою 50 см та діаметром 7 см), закритому пробкою. Суміш з рівних обсягів стерильного піску, деревного вугілля та випорожнень з яйцями анкілостомід, розведену водою до напіврідкої консистенції, обережно наливають на дно циліндра за допомогою скляної трубки. Протягом 1-2-добового відстоювання в темряві при температурі 25-30 ° С з яєць вилуплюються рабдитоподібні личинки, а через 5-7 діб вони стають вже філярієподібними: личинки виповзають вгору по стінках циліндра, де видно навіть неозброєним оком. Природно розвиваються у воді яйця трематод, наприклад опісторхів, дифілоботріїд, фасціол та ін., поміщають на годинникове скло, чашку Петрі або в іншу посудину, наливають невеликий шар звичайної води. При культивуванні яєць фасціол слід врахувати, що вони швидше розвиваються в темряві, при цьому в живих яйцях при температурі 22-24 ° С через 9-12 діб формується мірацидій. При мікроскопуванні яєць, що розвиваютьсятрематод добре помітні рухи мірацидію. Мірацидій фасціоли з оболонок яйця виходить лише на світлі. При культивуванні воду змінюють через 2-3 добу.

Личинки анкілостомід і стронгілоїд культивують на агарі в чашці Петрі з тваринним вугіллям. Після перебування в термостаті при температурі 26-30 ° С протягом 5-6 діб личинки розповзаються по агару, залишаючи за собою доріжку з бактерій (метод Фюллеборна).

Метод Harada та Mori (1955). У пробірки, вміщені в штатив, додають 7 мл дистильованої води. Дерев'яною паличкою беруть 0,5 г випорожнень і роблять мазок на фільтрувальному папері (15X150 мм) в 5 см від лівого краю (цю операцію проводять на аркуші паперу, щоб захистити поверхню лабораторного столу). Потім смужку з мазком вставляють пробірку так, щоб вільний від мазка лівий кінець досягав дна пробірки. Верхній кінець накривають шматком целофану і щільно охоплюють резинкою. На пробірці пишуть номер та прізвище обстежуваного. У такому стані пробірки зберігають протягом 8-10 діб за температури 28 °С. Для вивчення культури знімають та видаляють целофанову покришку та витягують пінцетом смужку фільтрувального паперу. При цьому слід виявляти обережність, оскільки невелика кількість інвазійних личинок може пересуватися до верхнього кінця фільтрувального паперу або стінки пробірки і проникати під поверхню целофану.

Пробірки поміщають у гарячу водяну банюпри температурі 50 °С на 15 хв, після чого вміст їх струшують і швидко переливають у 15-мілілітрову пробірку для осадження личинок. Після центрифугування надосадову рідину видаляють, а осад переносять на предметне скло, покривним покривним склом і мікроскопують під малим збільшенням.

Для диференціального діагнозу філярієподібних личинок необхідно користуватися даними, наведеними в табл. 13.

Методи фарбування яєць та личинок гельмінтів. Мертві тканини здебільшого сприймають фарби швидше, ніж живі. Ці особливості використовують у гельмінтології для визначення життєздатності яєць та личинок гельмінтів. Однак у окремих випадках деякі фарби краще сприймаються живими тканинами, ніж мертвими.

Таблиця 13. Диференційна діагностика філярнеподібних личинок A. duodenale, N. americanus, Strongyloides stercoralis, Trichostrongylus spp.

Для диференціального розпізнавання живих та мертвих яєць та личинок застосовують такі фарби та способи.

Для фарбування живих та мертвих тканин використовують лейкобазу метиленового синього. Жива клітина або тканина редукують метиленовий синій в безбарвну лейкобазу, мертва тканина не має такої здатності, тому набуває забарвлення.

Метод фарбування не застосовується для незрілих яєць аскарид і волосоголовців; пігментована оболонка фарбується, і тому не видно, чи забарвилася зародкова клітина всередині яйця.

Забарвлення личинок аскарид основним розчином фарби діаманткрезилового синього в концентрації 1:10 ТОВ здійснюють наступним чином: на предметне скло наносять краплю рідини з яйцями аскарид та краплю основного розчину фарби. Препарат накривають покривним склом, яке щільно притискають до предметного при легкому постукуванні препарувальною голкою. Під мікроскопом спостерігають кількість личинок, що вийшли, і ступінь їх офарблюваності, після чого цей же препарат переглядають повторно через 2-3 год. Живими вважаються тільки недеформовані личинки, що не забарвилися протягом 2 год.

Вказується можливість фарбування препаратів розчином йоду щодо життєздатності яєць аскаридий птахів. Як барвник у цьому випадку використовують 5% спиртовий розчин йоду. При його нанесенні на препарат зародки мертвих яєць аскаридій протягом 1-3 с. помаранчевий колір. Мертві яйця опісторха та онкосфери бичачого ціп'якафарбуються розчином толуїдинового синього (1:1000), а мертві онкосфери бичачого ціп'яка - розчином діаманткрезилового синього (1:10 000). При цьому набувають кольору зародка та оболонки як мертвих, так і живих яєць. Тому після фарбування яйця та онкосфери відмивають у чистій воді та додатково забарвлюють сафраніном (у розведенні 1:10 000 10 % розчину спирту). Спирт видаляє фарбу з оболонок, а сафранін надає їм червоного кольору. В результаті живі яйця забарвлюються у червоний колір, зародок у мертвих – у синій, а оболонка залишається червоною. Мертві зародки онкосфер бичачого ціп'яка швидко, протягом декількох хвилин, забарвлюються в яскраво-червоний або рожевий колірсафраніном або в синій колір діаманткрезиловим синім у розведенні 1:4000 або індигокарміном у розведенні 1:1000-1:2000.

Живі зародки не змінюються під впливом цих фарб навіть через 2-7 год.

Для визначення життєздатності яєць карликового ціп'яка рекомендується використовувати наступні фарби: 1) діаманткрезиловий синій (1:8000) - через 1 год у мертвих яєць особливо яскраво забарвлюється онкосфера, яка різко виділяється на блідому або безбарвному тлі решти яйця; 2) сафранін: у розведенні 1:8000 при дії протягом 2 год та 1:5000 – протягом 3-5 год; 3) 50% розчин пирогалловой кислоти в розведенні 1:2 - при дії протягом 1 год при температурі 29-30 “З (що нижча температура, то триваліший процес фарбування).

Живі плероцеркоїди широкого лентеца дуже добре фарбуються водним розчином (1:1000) нейтральрот протягом 5-20 хв. Для отримання стійкого рожевого забарвлення, що не зникає протягом 5 діб і не впливає на рухливість плероцеркоїдів, зазвичай достатньо 10 хв. Ступінь забарвлення контролюють шляхом перегляду личинок у чистому ізотонічному розчинінатрію хлориду, для чого плероцеркоїди періодично витягають з фарби. Доцільно застосовувати метиленовий синій для фарбування мертвих плероцеркоїдів.

Р.Е.Чобанов та ін. (1986) запропонували методику визначення життєздатності яєць та личинок гельмінтів з використанням як барвника пігменту «рубрин», одержуваного при культивуванні пліснявого гриба Peniciliium rubrum. Для цього використовують 3% водний розчин барвника.

Процес забарвлення яєць і личинок завершується через 1,5 год. Нежиттєздатні яйця гостриків, бичачого і карликового ціп'яків, анкілостомід, трихостронгілід набувають інтенсивного рожевого кольору, личинки анкілостомід і трихостронгілід - червоний. Менш яскраве забарвлення спостерігається у яєць аскарид та волосоголовців, оскільки, виділяючись з кишечника, вони вже мають темно-коричневий колір: Життєздатні яйця та личинки не забарвлюються

Фізико-хімічні методи стимуляції виходу мирувдії з яєць трематод. Методи розроблені С.М.Герман та С.А.Беером (1984) для визначення життєздатності яєць опісторхів та дикроцеліумів шляхом впливу реакційного середовища на яйця. Якщо вони живі, відбувається виходження мирацидію. Методи засновані на фізикохімічній активації залози вилуплення мірацидію та стимуляції рухової активності личинки. Стимуляція досягається впливом на яйця трематоди спеціального реакційного середовища у поєднанні з послідовними прийомами – створенням перепаду температур, підсушуванням суспензії яєць, впливом слабкого струму рідини в досліджуваній краплі, які сприяють масовому виходу мироцидів із яєць.

Визначення життєздатності яєць опісторха за методом Герман, Беера. Завис яєць у воді (водопровідній, що відстояла) попередньо охолоджують до 10-12 °С. Усі наступні операції здійснюють за кімнатної температури (18-22 °С). У центрифужну пробірку вносять одну краплю (приблизно 0,05 мл) суспензії, що містить 100-400 яєць. Пробірки ставлять до штатива на 5-10 хв, щоб осадити яйця. Потім вузькою смужкою фільтрувального паперу обережно відсмоктують надлишок води до повного видалення. У пробірку додають 2 краплі середовища, струшують, вміст переносять піпеткою на предметне скло і залишають на 5-10 хв, злегка похитуючи (або поміщають під фен) для створення слабких струмів рідини в досліджуваній краплі суспензії. Ця операція, що імітує перистальтику кишківника молюска, дозволяє активізувати вихід мірацидіїв. Після цього до суспензії додають ще 2 краплі середовища і потім мікроскопують препарат за допомогою звичайного світлового мікроскопа (Х200). За цей час у яєць із життєздатним мирацидієм має відкритися кришечка, при цьому личинка активно виходить у середу. Завдяки наявності в ній етанолу мірацидій через 3-5 хв знерухомлюється, а потім фарбується барвником, що знаходиться в середовищі. У результаті легко виявляють та підраховують мірацидії.

Приготування реакційного середовища. Середовище готують на 0,05 М трис-HCi буфері в оптимальних режимах pH 8,0-9,5. У буфер додають етанол до 10-13% і барвник (сафранін, метиленовий синій та інші, що працюють в межах pH) до слабкого фарбування рідини (наприклад, для сафраніну його кінцева концентрація становитиме 1:50 000). Можна використовувати інший буфер, що працює в лужних межах pH, наприклад 0,05 М фосфатний (pH 8,5). Отже, середовище містить 96% етанол – 12 частин; барвник ( матковий розчин) - 1-10 частин; 0,05 М тріс-НС! буфер (pH 8,5-9,5) – до 100 частин. Приклад середовища: 12 частин 96% етанолу, 1 частина насиченого розчину сафраніну, решта до 100 частин - 0,05 М буфер трис-HCl, pH 9,5.

Визначення життєздатності яєць дикроцеліуму методом Герман, Беера, Стратана. Краплю суспензії, що містить 100-150 яєць трематоди, поміщають у центрифужну пробірку на 1-2 хв для осадження яєць. Потім обережно підсушують рідину за допомогою смужки фільтрувального паперу. Додають пастерівською піпеткою 1-2 краплі реакційного середовища та інкубують на водяній бані при 28-30 °С 2-3 хв. Склад середовища: 6 частин бутанолу, 94 частини 0,4% розчину хлориду натрію або 0,3% розчину калію хлориду в дистильованій воді. Яйця в середовищі переносять піпеткою на предметне скло і залишають на 1,5-2 години при кімнатній температурі (18-22 °С), при цьому кожні 25-30 хв (у міру підсихання) додають по 1-2 краплі (0,05 мл) розчину бутанолу в дистильованій воді. Після цього препарат мікроскопують при 100-200-кратному збільшенні. Життєздатність визначають за кількістю яєць, що розкрилися, з вийшли мирацидиями. Бутанол проникає через пори оболонки яєць, досягає мірацидіїв та активізує їх. Інкубація при зазначеній температурі посилює цей процес. Бутанол в концентрації 3-7% згубний для мирицидію, що вийшов з яйця. Перенесення суспензії яєць з пробірки на предметне скло дозволяє на момент виходу мірацидію (через 30-40 хв) знизити концентрацію бутанолу за рахунок випаровування до безпечного рівня (1,5-0,5 %). Наявність в середовищі хлориду натрію в концентрації 0,1-0,5% (або хлориду калію в концентрації 0,05-0,4%) зумовлює активність мироцидію, що вийшов. На відміну від дрібних прозорих яєць опісторха яйця дикроцеліуму мають темнозабарвлену оболонку, у них добре помітна кришечка, відкрита після виходу мірацидію. Тому життєздатність яєць дикроцеліуму зручніше оцінювати шляхом підрахунку яєць, що розкрилися, а не фарбування і підрахунку мірацидіїв.

Люмінесцентний метод дослідження яєць та личинок гельмінтів.

Вперше в гельмінтологічній практиці методи люмінесцентної мікроскопії були застосовані в 1955 році. При цьому повідомлялося, що люмінесцентна мікроскопія дає можливість диференціювати живі та мертві об'єкти без пошкодження яйця. Для флюоресценції використовувалися не УФ-промені, а синьо-фіолетова частина видимого світла, зі звичайним мікроскопом та предметним склом; до освітлювача "ОІ-18" застосовувався спеціальний набір кольорових фільтрів.

Було встановлено, що живі та мертві яйця аскарид, гостриків, карликових ціп'яків, бичачого ціп'яка, широкого лентеця та інших гельмінтів люмінескують неоднаково. Це явище спостерігається як при первинній люмінесценції без застосування барвників, так і при фарбуванні флюорохромами (акридиновий помаранчевий, корифосфін, примулін, ауролін, сульфат берлерину, трипафлавін, риванол, акрихін та ін.).

Незабарвлені живі несегментовані яйця аскарид світяться яскраво-зеленим світлом із жовтуватим відтінком; у мертвих яєць оболонка випромінює зелене світло значно яскравіше, ніж темно-зелена зародкова; у яєць аскарид з личинкою проявляється лише оболонка, а в мертвих і оболонка, і личинка яскраво-жовтого кольору.

Непігментовані та несегментовані живі яйця гостриків та карликових ціп'яків випромінюють зеленувато-жовте світло; у мертвих яєць інтенсивно люмінескує оболонка на тлі темно-зеленої зародкової маси. При вторинній люмінесценції (при фарбуванні акридиновим помаранчевим у розведенні 1:10 ТОВ та 1:50 ТОВ від 30 хв до 2 год) оболонка живих та мертвих нематод, трематод та цестод люмінескує неоднаково.

Шкаралупа живих і мертвих Ascaris lumbricoides, Toxocara leonina, Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. diminuta, T.saginatus, D.latum забарвлюється в оранжево-червоний колір. Зародки живих Asc. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum та онкосфери бичачого ціп'яка люмінескують тьмяним темно-зеленим або сіро-зеленим кольором. Мертві зародки цих яєць гельмінтів випромінюють «гаряче» оранжево-червоне світло. Живі личинки гостриків і токсокар (звільнені від шкаралупи яйця) випромінюють тьмяне сіро-зелене світло, при їх загибелі колір змінюється від головного кінця в світло-зелений, потім жовтий, помаранчевий і, нарешті, яскраво-оранжевий.

При фарбуванні флюорохромами - корифосфілом, примуліном - у мертвих яєць аскарид і волосоголовців спостерігається свічення від лілово-жовтого до мідно-червоного кольору. Життєздатні яйця не люмінескують, а забарвлюються у темно-зелений колір. Живі яйця трематод Paragonimus westermani і Clonorchis sinensis не люмінескують після фарбування акридиновим помаранчевим, а від мертвих яєць виходить жовтувато-зелене світло.

Метод люмінесценції може бути застосований і визначення життєздатності личинок гельмінтів. Так, флюорохромовані розчином акридинового помаранчевого (1:2000) личинки стронгілятів, рабдитат світяться: живі – зеленим (з відтінком), мертві – яскраво-оранжевим світлом. Живі личинки трихінелл не світяться або дають слабке світіння при 10-хвилинній обробці розчинами ізотіоціанату флюоресцеїну, аураміну та ін. Флюорохромовані мертві личинки (в концентрації 1:5000) дають яскраве свічення.

Живі мірацидії, що вийшли з оболонки, випромінюють тьмяне блакитне світло з ледь помітним світло-жовтим віночком вій, але через 10-15 хв після загибелі проявляються яскравим світлом, що горить, світло-зеленим, а потім оранжево-червоним світлом.

Прямі методи: виявлення самих гельмінтів, їх фрагментів, яєць, личинок у фекаліях, сечі, дуоденальному секреті, мокротинні, носовому та вагінальному слизу, вмісті піднігтьових просторів, біопсованих шматочках тканини.

При діагностиці не можна якимось одним методом виявити яйця або личинки всіх видів гельмінтів, що мешкають у травної системилюдини. Так, при використанні методу флотації поверхневу плівку не спливають (через високу питому вагу) яйця трематод, у деяких випадках незапліднені яйця аскарид. У калі дуже рідко можна виявити яйця гостриків, онкосфери теніїд, які виявляються спеціальними методами досліджень: зішкріб з періанальних складок для гостриків і теніїд, методи осадження для трематод (яйця опісторха та ін.). Тому для цілеспрямованого обстеження хворого на гельмінтози лікар у напрямку має вказати, на які гельмінти слід звернути основну увагу (діагноз), що дозволить лаборанту вибрати відповідну методику виявлення даного виду гельмінта. Фекалії, взяті з різних місцьвипорожнення в кількості не менше 50 грамів (чайна ложка) в чистий скляний посуд, повинні бути відправлені в лабораторію не пізніше ніж через добу після дефекації та досліджені в день надходження.

У разі необхідності збереження калу до наступного дня його поміщають у холодне місце (0-4°С) або заливають одним із консервантів.

Перед дослідженням кал перемішують паличкою, щоб яйця гельмінтів виявилися рівномірно розподіленими у загальній масі.

При виявленні у препараті яєць будь-якого гельмінта перегляд не припиняють, тому що. може бути подвійна чи потрійна інвазія.

Контроль за ефективністю лікування гельмінтозів здійснюється шляхом дослідження фекалій на яйця гельмінтів через 2-3 тижні або через 2-3 місяці після лікування, залежно від виявленого гельмінту.

Макроскопічні методи служать виявлення в калі цілих статевозрілих гельмінтів чи його фрагментів неозброєним оком чи з допомогою ручної лупи.

Часто на поверхні калу після дефекації можна бачити активно гострих гостриків; виділяються з фекаліями аскариди; іноді люди самі помічають відходження гельмінтів. У хворих на дифілоботріоз можуть виділятися уривки стробіли лентеца (у вигляді "локшини"), а у інвазованих тенідами (свинячий або бичачий ціп'як) з калом часто відходять членики гельмінтів (у вигляді "білих обсічок") або вони активно виповзають з анального отвору.

Макроскопічний метод є основним для диференціальної діагностикитенієдозу та теніарингоспу (у поєднанні з опитуванням).

Зі спеціальних макроскопічних методів застосовується метод послідовного промивання фекалій.

Фекалії розмішуються у воді для отримання рівномірної суспензії, після чого при хорошому освітленні їх ретельно переглядають окремими невеликими порціями у чорних фотографічних кюветах або на темному тлі у чашках Петрі. Пінцетом або препарувальною голкою витягують усі підозрілі білі частинки, великі утворення, підозрілі на фрагменти гельмінтів, і розглядають їх під лупою між двома предметними шибками. Дрібних гельмінтів чи голівки цестод розглядають під лупою у краплі гліцерину чи під мікроскопом.

При використанні цього методу для діагностики члеників свинячого, бичачого ланцюгів, широкого лентеца відмиті членики поміщають між двома стеклами і, переглядаючи на світ під лупою або малим збільшенням мікроскопа, визначають видову приналежність до будови матки (у зрілого членика свинячого ціп'яка від центрального стовбура 12 бічних відгалужень, а у бичачого ціп'яка 18-32, частіше 28-32, у широкого лентеца членики більше завширшки і матка в центрі у вигляді "розетки"). Якщо матку погано видно, її попередньо можна потримати деякий час у 50% розчині гліцерину, після чого навіть запустілі стовбури матки проглядаються добре.

При визначенні цих цестод за будовою головок, що відійшли, їх з шийкою обережно кладуть у краплю гліцерину між предметними стеклами (або покривають покривним склом) і, не передавлюючи, розглядають під мікроскопом при малому збільшенні.

Мікроскопічні методиподіляються на прості, складні та спеціальні.

До простих належать методи нативного мазка, нативний мазок розчином Люголя, методи товстого мазка під целофаном по Като, закручування (по Шульману) та періанального зіскрібка.

Складні методи є більш ефективними та засновані на концентрації яєць у препаратах. Вони включають попередню обробку фекалій рідкими реактивами, в результаті чого яйця гельмінтів або випадають в осад, або спливають на поверхню рідини.

До складних методів належать методи збагачення:

а) флотаційні (коли питома вага яєць менша за питому вагу сольового розчину і яйця спливають у поверхневу плівку);

б) седиментаційні (коли подовжня вага яєць більша за питому вагу сольових розчинів і яйця осідають в осад).

Спеціальними методами виявлення яєць та личинок гельмінтів, цист та вегетативних форм найпростіших є методи зішкрібання, флотації, седиментації, ларвоскопії, протозооскопії, дослідження жовчі та методи фарбування мазків калу, мокротиння та ін.

Прості методи дослідження фекалій

Нативний мазок. Невелику частинку випорожнень беруть дерев'яною паличкою з різних ділянок доставленої порції, добре розтирають на склі в краплі 50%-ного розчину гліцерину і роблять на 2-3 предметних стеклах тонкий мазок. Переглядають під мікроскопом щонайменше 3 препаратів. Недолік методу: проглядається мала кількість матеріалу, тому як самостійний метод не застосовується.

Метод закручування(Шульман). 2,0-3,0 г випорожнень кладуть у склянку, ретельно розмішують скляною паличкою з 5-кратним об'ємом фізіологічного розчину або дистильованої води, виробляючи швидкі рухи протягом 2-3 хв, і швидко виймають паличку із суміші. Краплю суміші на кінці палички переносять на предметне скло та мікроскопують. Принцип відцентрової сили викликає скупчення яєць та личинок на паличці.

Метод товстого мазка по Като з целофаном. Хімічні реактиви: 100%-ний гліцерин, 6%-ний розчин фенолу (100 мл води + 6 г фенолу), 3%-ний розчин малахітової зелені (2,5 мл дистильованої води + 75 мл малахітової зелені).

Приготування робочого розчину: 100 мл 6% розчину фенолу + 100 мл чистого гліцерину + 1,2 мл 3% розчину малахітової зелені.

Приготування целофанових смужок: нарізаються смужки з целофану розмір яких відповідає предметному склу. Целофан має бути гідрофільний (придатний целофан, який горить; якщо плавиться, то непридатний). У робочому розчині можна обробити до 5 тис. смужок. Термін експозиції целофанових смужок до готовності до вживання у робочому розчині не менше 24 год.

Хід дослідження. На предметне скло наносять 50 мг фекалій (з велику горошину), розтирають індивідуальною паличкою (скляною, дерев'яною), накривають целофановою смужкою та зверху притирають гумовою пробкою до отримання рівномірного товстого мазка. Препарат висушують при кімнатній температурі протягом години або термостаті при 40°С протягом 20-30 хв і мікроскопують (час витримки можна збільшити при кімнатній температурі до 5-6 годину і більше).

За ефективністю даний метод наближається до методу флотації, але виявляє інвазію інтенсивну та середню інтенсивність.

Застосовується як самостійний метод діагностики та рекомендується для масового обстеження населення.

У клініко-діагностичних лабораторіях застосовується як уніфікований метод діагностики гельмінтів за відсутності у напрямах лікарів конкретних діагнозів.

Методи періанального зішкрібання і нативного мазка з розчином Люголя описані в розділі спеціальних методів.

Складні методи збагачення фекалій

В основу методів збагачення покладено різницю питомої ваги яєць гельмінтів і сольового розчину, що застосовується.

При застосуванні методу флотації можуть бути використані такі сольові розчини:

1. Розчин нітрату свинцю PbNO3 (азотнокислого свинцю) із щільністю 1,5. Готується із розрахунку 650 г речовини на 1 л води. Сіль розчиняють порціями у гарячій воді в емальованому посуді, підігріваючи на плиті та постійно помішуючи до повного розчинення. Фільтрувати розчин необов'язково. Розчин готують у день дослідження, так як з часом він дає осад, і щільність його починає падати вже через 24 год. велику кількість, то наступні дні перед дослідженням його підігрівають, розмішуючи осад. Приготування розчину проводиться у витяжній шафі, оскільки нітрат свинцю – сіль важкого металу.

2. Розчин нітрату амонію NH4NO3 (гранульованої або звичайної аміачної селітри) із щільністю 1,3 готують так само, як і попередній, але з розрахунку 1500 г речовини на 1 л гарячої води.

3. Розчин нітрату натрію NaNO3 або азотнокислого натрію з щільністю 1,38-1,4 готують із розрахунку 1000 г речовини на 1 літр гарячої води.

4. Розчин тіосульфату натрію Na2S2O3×5H2O (гіпосульфіту натрію) з щільністю 1,4 готують із розрахунку 1750 г речовини на 1 л гарячої води.

5. Розчин сульфату натрію Na2SO4 (англійської солі) із щільністю 1,26-1,28 готують із розрахунку 920 г речовини на 1 л гарячої води.

6. Розчин хлориду цинку ZnCl2 (хлористого цинку) із щільністю 1,82 готують із розрахунку 2000 г речовини на 1 л гарячої води. Остиглий розчин не кристалізується.

7. Насичений розчин хлориду натрію NaCl (кухонна сіль) із щільністю 1,18-1,2. На! л води додають 400-420 г солі порціями в емальоване відро з окропом, постійно розмішуючи до повного розчинення. При охолодженні розчину випадають кристали натрію хлориду.

Питома вага флотаційних розчинів вимірюється аерометром лише після повного остигання розчину за кімнатної температури.

Методи флотації найбільш ефективні виявлення яєць карликового ціп'яка, власоглава, анкілостомід, аскарид, широкого лентеца.

Поверхневу плівку можна знімати за допомогою дротяної петлі або предметного скла.

У насиченому розчині кухонної солі плівку можна досліджувати через 30-40 хв, у розчині аміачної селітри – через 10-20-30 хв після відстоювання.

При знятті плівки дротяною петлею досліджують щонайменше 8 крапель.

Предметне скло знімають з плівки більше яєцьніж дротяні петлі. Скло повинно стикатися з рідиною флотаційного розчину, яку додають у склянку піпеткою. Після відстоювання скло знімають, кладуть змоченою поверхнею вгору на скло більшого розмірута досліджують під мікроскопом. Предметне скло перед використанням обов'язково знежирює.

Для проведення досліджень необхідно мати: предметне скло, хімічні стаканчики, дротяні петлі, кювети, чашки Петрі, піпетки, груші, скляні або дерев'яні палички.

Хід дослідження. 5 г фекалій заливають 10-кратною кількістю флотаційного розчину (краще питомою вагою 1,38-1,40), ретельно розмішують, знімають великі частинки, що зверху не розчиняються, і залишають завись на 10-15 хв. Потім плівку знімають або петлею на предметне скло або предметним склом. Для розведення випорожнень краще взяти стаканчики ємністю 30-50 мл, налити розчин нарівні з краями (або недолівать 2-3 мм) і суміш покрити предметним склом, а потім додати піпеткою флотаційний розчин до його зіткнення з предметним склом. Через 10-20 хв скло швидко зняти і плівку, що залишилася на ньому, мікроскопувати без покривного скла.

Методи осадження-седиментації

Методи седиментації застосовуються для виявлення в калі яєць геогельмінтів, біогельмінтів і як спеціальні методи дослідження на опісторхоз.

Метод Горячова-Золотухіна(Спрощений метод Горячова). Близько 1,5 г калу розмішують у хімічному стаканчику 3-4 мл води. Отриману завись фільтрують через два шари марлі в центрифужну пробірку, нашаровуючи обережно зверху на 4-5 мл насиченого розчину кухонної солі, що є в ній. Пробірки ставлять до штатива на 15-20 год. За цей час важкі яйця трематод осідають. Отримують два чітко розмежовані шари. Осад мікроскопують.

Ефір-формаліновий метод.Застосовується для діагностики всіх кишкових інвазій і як спеціальний метод на найпростіші та яйця опісторхів.

Обладнання: центрифуга на 3000 об/хв; центрифужні градуйовані пробірки, вирви; металеве ситечко (чайне) або двошаровий бинт; предметне та покривне скло; дерев'яні (або скляні) палички; вата, бинт.

Хімреактиви: 10%-ний розчин формаліну (1 частина розчину формаліну аптечного та 4 частини дистильованої води); етиловий ефір (медичний).

У центрифужні пробірки наливають 7 мл 10% розчину формаліну і поміщають 1 г фекалій (така кількість фекалій, щоб розчин в пробірці піднявся до 8 мл). Фекалії змішують з формаліном до утворення однорідної суміші, а потім через металеве ситечко (або двошарову марлю, бинт) переливають в іншу центрифужну пробірку (якщо на ситечці залишилися фекалії, то ситечко треба ополоснути формаліном). Додати 2 мл ефіру в цю центрифужну пробірку, закрити пробкою та енергійно струшувати протягом 30 сек.

Суміш центрифугують при 3000 об/хв протягом однієї хвилини (можна протягом двох хвилин при 1500 об/хв). За рахунок реакції ефір-формаліну відбувається коагуляція білків у вигляді пробки зверху пробірки, а осад випадають яйця гельмінтів. Шар коагулянту прибирають, зливається надосадова рідина, осад наноситься на предметне скло прямо з пробірки або пастерівською піпеткою, накривається покривним склом і проглядається під мікроскопом.

Метод ефір-оцтового осадження. Принцип ефір-оцтового осадження яєць гельмінтів полягає в послідовній обробці проб фекалій 10% водним розчином оцтової кислотита ефіром. Оцтова кислота краща за інших хімічних сполукемульгує пробу фекалій. Вона проникає в неперетравлені частинки, що складаються переважно з клітковини, які при великому змістізаважають дослідженням, випадаючи осад після центрифугування. Подальше додавання в пробірку ефіру та перемішування призводить до вилучення з вмісту пробірки оцтової кислоти разом з просоченими нею каловими частинками. Так як питома вага суміші ефіру з оцтовою кислотою менше питомої ваги води, проби калу, оброблені цими речовинами, спливають, а яйця гельмінтів, що мають велику питому вагу, осідають.

Кількість осаду, отриманого після ефір-оцтового осадження, у 3-4 рази менше, ніж після ефір-формалінового. Це значно полегшує виявлення в ньому яєць гельмінтів і дозволяє досліджувати осад цілком при навішуванні в 0,5-1 г. Токсичність ефіроцтового методу в 5 разів нижче.

Хід дослідження. У градуйовану центрифужну пробірку наливають 7 мл 10% розчину оцтової кислоти і вносять навішування калу 1 г (тобто така кількість калу, при якому розчин оцтової кислоти піднімається до 8 мл). Ретельно розмішують скляною чи дерев'яною паличкою. Проціджують через вирву з двома шарами марлі в іншу центрифужну пробірку. До емульгату додають 2 мл етилового ефіру (тобто до 10 мл). Пробірки закривають гумовою пробкою (можна від пеніцилінового флакона) та струшують 15 сек. Забравши пробку, пробірки центрифугують протягом однієї хвилини при 3000 об/хв протягом 2 хв. Надосадову рідину з пробірки зливають. У деяких випадках калова пробка, що утворилася, заважає зливу надосадової рідини. В цьому випадку скляною чи дерев'яною паличкою відокремлюють пробку від стінок пробірки. Осад піпеткою повністю переносять на предметне скло та мікроскопують під покривним склом при малому збільшенні. Осад, як правило, невеликий, безбарвний. Яйця гельмінтів, особливо дрібні трематодні яйця, добре виявляються.

Хіміко-седиментаційний метод. Принцип дослідження ґрунтується на осадженні яєць із проби фекалій у сольовому розчині з питомою вагою 1,15. Сутність методу полягає в безпосередньому центрифугуванні пробірки, в якій розчин азотнокислого натрію (уд. вага 1,16) нашаровується пробка калу, емульгована в 1%-ному розчині оцтової кислоти. Висока питома вага сольового розчину і бульбашки, що виділяються за рахунок хімічної реакції, пронизують шар гомогенізованого калу, перешкоджають його осадженню. Яйця гельмінтів випадають у осад з невеликою кількістю клітковини. Осад можна очистити від детриту, що залишився, обробивши його 10%-ним розчином оцтової кислоти і ефіром. У цьому випадку залишаються лише одні яйця гельмінтів, що значно полегшує їхнє виявлення.

Хід дослідження. У градуйовану центрифужну пробірку наливають 6 мл розчину азотнокислого натрію з питомою вагою 1,15. В іншу пробірку наливають 7 мл 1%-ного розчину оцтової кислоти. Вносять пробу фекалій (до мітки 7,5 мл при пробі 0,5 г і до 8 мл при пробі 1,0 г). Ретельно перемішують пробу скляною паличкою. Проціджують через вирву з одним шаром марлі, нашаровуючи на розчин азотнокислого натрію. Пробірку з нашарованим фільтратом центрифугують при 1500-2000 об/хв протягом 5 хв. Швидким перевертанням пробірки зливають надосадову рідину. У пробірку з осадом додають 3-4 мл 10% розчину оцтової кислоти і 0,5 мл ефіру, закривають гумовою пробкою і струшують. Проводять повторне центрифугування протягом 1 хв. Зливають надосадову рідину. Осад переносять на предметне скло, накривають покривним склом та мікроскопують.

ГЕЛЬМІНТОЛОГІЧНІ ДОСЛІДЖЕННЯ ЖОВЧІ, ДУОДЕНАЛЬНОГО ЗМІСТНОГО, МОКРОТИ, КРОВІ, МОЧІ ТА М'ЯЗІВ

Виявлення яєць та личинок гельмінтів у дуоденальному вмісті та жовчі. Дослідження жовчі та дуоденального вмісту проводиться при підозрі на гельмінтози печінки та жовчного міхура (описторгосп, клоноргосп, дикроцеліоз) та дванадцятипалої кишки(стронгілоїдоз).

Хід дослідження. Дуоденальний вміст та жовч (порції А, В, С) отримують звичайним шляхом за допомогою зондування. Для порції рекомендується обов'язково отримувати рефлекс жовчного міхура введенням через зонд 33% розчину сірчанокислої магнезії. З досліджуваної рідини вибирають і переглядають під мікроскопом пластівці, що плавають у ній, а потім змішують її з рівною кількістю сірчаного ефіру. Суміш ретельно збовтують та центрифугують. Надосадову рідину зливають, а весь осад досліджують під мікроскопом.

За відсутності гною та слизу жовч та дуоденальний вміст центрифугують, не змішуючи з ефіром.

Дослідження мокротиння. У гельмінтологічній практиці дослідження мокротиння проводиться з метою лабораторної діагностикипарагонімозу. Іноді при цьому виявляються яйця шистосом, личинки аскариди, елементи міхура ехінококу.

З мокротиння готують нативний мазок на предметному склі, яке досліджують під мікроскопом.

При рясному вмісті мокротиння гною її змішують з 0,5% розчином їдкого натру або їдкого калію, струшують протягом 5 хвилин і центрифугують. Осад мікроскопують.

Дослідження крові. Кров досліджують при підозрі на наявність у хворого на філяріози.

У зв'язку з тим, що при деяких видах філяріозів (лоаоз, вухерериоз, викликаний субперіодичним штамом) личинки (мікрофілярії) бувають у периферичної кровітільки вдень, а за деяких (бругіоз, вухереріоз, викликаний періодичним штамом) – лише вночі, відповідно в цей час беруть кров для аналізу.

Техніка забору крові, приготування препаратів (тонкий мазок і товста крапля), їх фарбування (за Романовським) та дослідження аналогічні таким при лабораторній діагностиці малярії.

Мікрофілярії різних видіввідрізняють по довжині, ширині, вигину тіла, наявності або відсутності чохлика, формі хвостового кінця, розташування ядерної субстанції в тілі та хвостовому відділі личинок.

Хід дослідження. Сечу відстоюють не менше 30 хв, потім верхній шар зливають, залишаючи 10-15 мл осаду, які розливають у центрифужні пробірки, і центрифугують протягом 1-2 хв. Злив надосадову рідину, осад переносять на предметне скло та досліджують під мікроскопом.

ДОСЛІДЖЕННЯ БІОПТАТІВ М'ЯЗІВ

Метод трихінелоскопії. Необхідність у дослідженні біоптатів м'язів хворого виникає при підозрі на трихінельоз.

Біопсія проводиться за загальними правилами. Зазвичай роблять біопсію дельтоподібного м'яза. При паталогоанатомічному дослідженні можна робити біопсію м'язів діафрагми, стравоходу, язика, жувальних та міжреберних м'язів, згиначів кінцівок, м'язів очного яблука, оскільки вони найбільш інтенсивно уражаються личинками трихінел.

У лабораторії біопсований шматочок м'язів розрізають на дуже дрібні шматочки (мікротом), які поміщають між двома стеклами, роздавлюючи м'язові волокна, і досліджують під мікроскопом. В даний час для цієї мети широко використовуються спеціальні мікроскопи - трихінелоскоп.

У випадку трихінеллеза при трихінелоскопії по ходу м'язових волокон виявляються овальної форми, що різко виділяються (схожі на лимон), трихінельозні капсули. Середня величина капсул у людини становить 0,4 х 0,26 мм. У капсулі, як правило, міститься одна спірально згорнута 2,5 обороту трихінелла. При високій інтенсивності інвазії в одній капсулі може бути 2 або 3 личинки. Суміжні з капсулою м'язові волокна втрачають свою поперечну смугастість і набувають гомогенного вигляду.

У такий же спосіб досліджують м'ясо або мясні продукти, що стали причиною зараження.

Метод перетравлення м'язів. Метод ефективніший.

Хід дослідження. Досліджувані м'язи дрібно подрібнюють та заливають штучним шлунковим соком у співвідношенні 1:15-20. Отриману суміш поміщають у термостат при 37°З 12-16 год. Після закінчення цього терміну мікроскопують осад, в якому серед маси залишків переварених м'язових волокон виявляються личинки трихінел у вільному стані.

Штучний сік можна придбати в аптеці або приготувати в лабораторії. Для цього до 1 л дистильованої води додають 10 мл концентрованої хлористоводневої кислоти; перед використанням до 1 л розведеної кислоти додають 30 г пепсину.

КІЛЬКІСНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Кількісні методи дослідження застосовуються щодо інтенсивності інвазії, оцінці ефективності різних антигельмінтних препаратів, визначенні якості дегельмінтизації, контролі проведених масових лікувально-профілактичних заходів та інших.

Кількісне визначення яєць гельмінтів проводиться двома методами: методом Столла та методом Красильникова та Волкової (1974).

Метод Столла. Для проведення дослідження необхідно мати мікроскоп, скляну колбу з відміткою 56 і 60 мл, мірний циліндр, скляні намисто, гумову пробку для колби, градуйовані піпетки, предметні стекла та 0,4% розчин їдкого натру.

Хід дослідження. У колбу мірним циліндром наливають децинормальний розчин їдкого натру (приблизно 0,4% концентрації) до мітки 56 мл і додають випорожнення до тих пір, поки рівень рідини не досягне позначки 60 мл (тобто 4 мл випорожнень). Суміш ретельно збовтують зі скляними намистами протягом 1 хвилини, закривши посудину гумовою пробкою (можна перемішати і паличкою). Відразу після збовтування набирають градуйованою піпеткою 0,075 мл суміші (у ній міститься 0,005 мл випорожнень), переносять на предметне скло та підраховують кількість яєць у препараті під мікроскопом. Щоб визначити кількість яєць в 1 г випорожнень, виявлену кількість множать на 200.

Порівняння числа яєць у препараті, виявлене у хворого до проведення лікування та після нього дозволяє судити про ефективність дегельмінтизації.

Метод Столла простий, дає порівняні результати при всіх гельмінтоз, збудники яких систематично виділяють яйця в кишечник хворого. Однак недоліком методу є відносно низька чутливість, особливо при слабкій інтенсивності інвазії.

Метод Красильникова-Волкової. При дослідженні цим методом не менше 1 г фекалій змішують у скляній колбці або великій пробірці з 1% розчином Лотоса (або 1,5% розчином Екстри) у співвідношенні 1:10. Завис ретельно збовтують до утворення гомогенної суспензії, потім швидко набирають градуйованої піпеткою 0,1 мл суспензії (що дорівнює 0,01 г фекалій) і переносять на предметне скло. Препарат покривають покривним склом або целофановою пластинкою (20 х 30 мм), витриманою не менше однієї доби в 50% водному розчинігліцерину.

Підраховують кількість яєць у всьому препараті. Для розрахунку кількості яєць в 1 г фекалій отриману кількість треба помножити на 100.

Цей метод має низку переваг перед методом Столла. По-перше, він більш чутливий і дозволяє виявляти гельмінтів при слабкому ступені інвазії. По-друге, він дуже зручний при масових обстеженнях, оскільки розчини детергентів, будучи консервантами яєць гельмінтів, дозволяють проводити дослідження та не зовсім свіжого матеріалу. Однак обов'язковою умовою є збір фекалій безпосередньо в розчин детергенту.

Для кількісного дослідження можна застосовувати будь-який з описаних уніфікованих якісних методів, що ґрунтуються на принципі випливання яєць. Але в цьому випадку для аналізу повинно бути взято одну і ту ж кількість фекалій, той самий обсяг флотаційного розчину. Розрахунок ступеня інвазії можна зробити, знаючи кількість яєць в 1 г фекалій, за наведеною таблицею.

Інтенсивність інвазії в залежності від кількості яєць гельмінтів

в 1 г фекалій

СЕРОЛОГІЧНІ МЕТОДИ ДІАГНОСТИКИ

Ці методи, засновані на виявленні специфічних антитіл у сироватці крові, застосовуються з діагностичною та скринінговою цілями.

До серологічних методів належать:

Реакція кільцепреципітації (РКП) (трихінельоз, цистицеркоз);

Реакція кільцепреципітації у пробірках на холоді (трихінельоз, цистицеркоз);

Реакція мікропреципітації на живих личинках (трихінельоз, аскаридоз);

Реакція непрямої гемаглютинації (РНГА) (трихінельоз, ехінококоз, альвеококоз, цистицеркоз та ін.);

Реакція аглютинації латексу (РАЛ) (ехінококоз, альвеококоз, трихінельоз, теніарингосп та ін);

Реакція зв'язування комплементу (РСК) (трихінельоз, ехінококоз, цистицеркоз);

Реакція ензим-мічених антитіл (РЕМА) (ехінококоз, онхоцеркоз, шистосомози, трихінельоз, токсокароз);

Імуноферментний аналіз (ІФА) (трихінельоз, опісторхоз, токсокароз, токсоплазмоз та ін.).

Для постановки серологічних реакцій випускаються стандартні антигени або вони готуються самостійно (наприклад, з ехінококових бульбашок овець), випускаються спеціальні тест-системи для ІФА.

Спеціальні методидослідження на ентеробіоз, теніарингосп, теніоз

Зішкріб з періанальних складок. Для отримання зіскрібка з періанальних складок можна застосовувати дерев'яний шпатель, целофанову смужку, целюлозний папір або стрічку, очні палички зі спеціальним клейовим шаром:

а) зішкріб дерев'яним шпателем (шпатель - сірник або паличка), змоченим 1% розчином гліцерину (або 0,5% розчином питної соди), проводиться легким зіскоблюванням з поверхні періанальних складок по всьому колу анального отвору. Отриманий зіскрібок переносять краєм покривного скла з кінця шпателя на предметне скло в краплю 50% розчину гліцерину, накривають цим же покривним склом і мікроскопують. Недоліком методу є недостатня виявність яєць та подразнювальна дія;

б) за методом Торгушина роблять змив ватним тампономна дерев'яному або іншому шпателі, змоченому 50% розчином гліцерину, готують мазок на предметному склі в краплі гліцерину;

в) за методом Кеворкової в центрифужну пробірку наливають близько 5 мл кип'яченої води, поміщають у нього шпатель (паличку) із ватним тампоном. Перед взяттям матеріалу тампон злегка віджимають внутрішню стінку пробірки, обтирають їм періанальні складки і вкладають шпатель з тампоном в пробірку. Ретельно збовтують тампон у пробірці, центрифугують змив 3 хв і отриманий осад досліджують під мікроскопом;

г) зішкріб липкою стрічкою по Грехем. Частина липкої стрічки (прозора поліетиленова стрічка з липким шаром для дитячої творчості, але краще використовувати операційну плівку ЛПО-1, ЛПО-2) довжиною 8-10 см приклеюють липким шаром до періанальних складок шкіри, тримаючи за кінці, а потім переносять її на предметне скло липким шаром вниз (кінці стрічки, що виходять за краї скла відрізають), скла нумеруються, а в журналі записуються дані хворого та номер скла. У лабораторії стрічку з одного кінця відклеюють на великому протязі, капають під неї 1-2 краплі вазелінової олії або гліцерину (для усунення оптичних дефектів) та мікроскопують;

д) зіскрібок за допомогою скляних очних паличок, поверхня яких покрита спеціальним клейовим складом. Очні палички встановлюються у спеціальний штатив. Забір матеріалу проводиться шляхом дотику плоскої частини лопаточки до шкіри періанального отвору. Потім паличка знову зміцнюється штатив для транспортування. Мікроскопія проводиться безпосередньо на лопаточці з обох боків (без предметного та покривного скла) з попереднім кріпленням у касети при малому збільшенні (окуляр х 10, об'єктив х 8). Після закінчення роботи палички дезінфікуються кип'ятінням у мильному розчині, а штатив та касети обробляються спиртом та промиваються мильно-содовим розчином. Склад клею: клеол – 10 г, касторове масло– 2,5 г, етиловий ефір – 5 г, етиловий спирт 96% – 2,5 г.

Лопаточки вмочуються в розчин клею, потім висушуються повітря при кімнатній температурі. Клейка плівка, що утворилася на поверхні, зберігається протягом декількох днів.

Метод зручний при масовому обстеженні дитячого населення на ентеробіоз та дорослого населення на теніїдози.

Додатково до методу зіскрібка при теніарингоспі та теніозі застосовуються також метод опитування та описаний вище макроскопічний метод (при виявленні члеників).

Спеціальні методи дослідження на стронгілоїдоз

Застосовують ефір-оцтовий метод виявлення яєць (див. вище) і метод Бермана виявлення личинок у випорожненнях.

Метод Бермана. Досліджують свіжий кал, краще після прийняття проносного. Пробу фекалій 5 г поміщають на металеве сито (сітку всередині вистилають двома шарами марлі) скляну вирву, закріплену в штативі. На нижній кінець вирви надягають гумову трубку із затискачем (апарат Бермана).

Сітку з випорожненнями піднімають і у вирву наливають нагріту до 40-50°С воду таким чином, щоб нижня частина сітки була занурена у воду і кал покрився водою повністю. Через 2-4 години затискач на гумовій трубці швидко відкривають, і рідина спускається в центрифужну пробірку. Після центрифугування (1-2 хв) верхню частинурідини швидко зливають, а осад у кількості 1 мл наносять тонким шаром на предметне скло та мікроскопують під малим збільшенням мікроскопа.

Метод ІМП та ТМ. У хімічний стаканчик поміщають порцію фекалій завбільшки з горіх, заливають теплим 40°З фізрозчином, щоб фекалії покрилися розчином, залишають на 20 хв. Через 20 хв зливають рідину у чашку Петрі та переглядають під бінокулярним мікроскопом МБС.

Для діагностики стронгілоїдозу, особливо для контролю за ефективністю лікування, рекомендується поєднувати метод Бермана з дослідженням дуоденального вмісту.

Спеціальні методи дослідження на нематодози

Нематози

Аскаридоз

В анамнезі звертається увага на ставлення до городництва, садівництва. Вживання сирих овочів, салатів, приготованих із цих овочів.

Клінічні прояви ранньої фази аскаридозу обумовлені алергічними перебудовами організму. Рання або міграційна личинкова стадія аскаридозу протікає нерідко за наявності лихоманки з температурою тіла до 38° та вище, із симптомокомплексом ураження легень, наявністю вираженої еозинофілії крові. У більшості випадків у дітей першими ознаками захворювання є нездужання, слабкість, періодичний головний біль, пітливість, іноді болі в м'язах, суглобах. Нерідко з'являється рясний висип типу кропив'янки з сильним або помірним свербінням. Діагноз ранньої фази підтверджується рентгенологічними дослідженнями на наявність у легких летких еозинофільних інфільтратівЛеффлер. У мазках свіжовиділеного мокротиння нерідко виявляються еозинофільні клітини, еритроцити, кристали Шарко-Лейдена та личинки аскарид.

При кишковій імагінальній стадії аскаридозу відзначається поєднання проявів з боку шлунково-кишкового та астенічного синдромів, ентероколітичний. больовий симптоми. У дітей нерідко відзначається зниження у вазі, часом досить значне. нудота, підвищена салівація, дратівливість, затримка психомоторного розвитку, зниження інтелекту

Для лабораторної діагностики кишкової ст.

Єршова І.Б., Осичнюк Л.М., Мочалова А.А., ДУ «Луганський державний медичний університет», кафедра педіатрії з дитячими інфекціями.
Статтю опубліковано в журналі «Актуальна інфектологія», №2 (3), 2014 рік.
Інформаційний ресурс «Видавничий дім Заславський» www.mif-ua.com

У статті викладено методи діагностики гельмінтних інвазій: мікроскопічні, імуноферментний аналіз, серологічні, полімеразні ланцюгові реакції, біорезонансна діагностика, гемосканування, а також інструментальні (ультразвукове та рентгенологічне дослідження, комп'ютерна томографія) та лабораторні, що мають непряме клінічний аналізкрові, аналіз крові на печінкові проби, аналіз калу на дисбактеріоз). Описано переваги методів, їх недоліки, достовірність отриманих даних. Запропоновано анкети-опитувальники для пацієнтів для виявлення ризику інфікування гельмінтами. Описано переваги методів, їх недоліки, достовірність отриманих даних. Запропоновано анкети-опитувальники для пацієнтів для виявлення ризику інфікування гельмінтами.

Гельмінти надають негативний вплив на організм людини. Вони призводять до алергізації, розвитку полігіповітамінозу, макро- та мікроелементозів, порушення кровотворення та проникності судин, гормонального дисбалансу. Гельмінтози сприяють формуванню хронічних захворювань (холецистит, жовчнокам'яна хвороба, панкреатит, коліт, цукровий діабет, бронхіальна астма, атопічний дерматит), психоемоційних порушень ( хронічна втома, дратівливість, тривожність, гіперактивність у дітей), анемії та ін. При тривалій гельмінтній інвазії може розвиватися вторинний імунодефіцит.

Настороженість лікарів щодо гельмінтозів у населення нині недостатня, а профілактика зводиться до лікування виявлених інвазованих пацієнтів.

Діагностика гельмінтозівґрунтується на клініко-епідемічних та лабораторних даних. Такі ознаки, як астенічний синдром, рецидивна кропив'янка, порушення регенерації шкіри та слизових оболонок, що важко піддаються лікуванню атопічний дерматит та бронхообструктивний синдром, полілімфаденопатія та гепатоспленомегалія неясного генезу, аденоїдні вегетації II–III ступеня, «географічна» мова, знижений або вибірковий апетит, нестійкий стілець, можуть говорити про наявність гельмінтів.

При серологічному дослідженнівизначають наявність антитіл до гельмінтів (достовірність – близько 60 %): при підозрі на ехінококоз, цистицеркоз, трихінельоз, токсокароз широко використовують реакції непрямої гемаглютинації, аглютинації латексу, зв'язування комплементу, імунофлюоресценції.
Не у всіх випадках методи визначення специфічних антитіл мають достатню специфічність і достовірність. Антигенний склад гельмінта залежить як від виду, а й від стадії; проходячи складний цикл розвитку від яйця до дорослої особини, гельмінти змінюють антигенний склад Крім того, в імунодіагностичних реакціях використовуються соматичні антитіла, а в організмі господаря антитіла виробляються здебільшого на екскрети та секрети гельмінту. Неспецифічна сенсибілізація організму, спільність деяких антигенів трематод, найпростіших і людини створюють високу питому вагу хибнопозитивних реакцій у титрах нижче достовірно діагностичних.

Метод визначення гельмінтів за допомогою полімеразної ланцюгової реакції є високоспецифічним і високочутливим, але через дорожнечу та складність не може бути скринінговим, коли, наприклад, потрібно обстежити групу дітей з дитячого закладу.

Імунна система не завжди реагує (розпізнає та знищує) на наявність гельмінтів в організмі. Це пояснюється тим, що деякі гельмінти мають міцну та хімічно стійку капсулу або покриті речовиною, яка не розпізнається. імунною системою; локалізуються в тканинах, найбільш захищених від запальних реакцій, наприклад, спинному мозку; багато видів з них у травному тракті виділяють антиензими, що рятує їх від загибелі; мають велику тривалість життя (роками, а іноді до смерті самої людини); харчуються за рахунок гліколізу чистих вуглеводів; мають такі пристрої, як присоски, гачки та ін, що сприяє фіксації всередині організму; у багатьох видів існує статеве розмноження, при якому відбувається обмін генною інформацією, що призводить до посилення гетерогенної популяції, зменшення вразливості; мають високим рівнемплодючість.

При ультразвуковому , рентгенологічному дослідженні органів черевної порожнини , комп'ютерної томографії можна виявити непрямі ознаки гельмінтозів: гепатоспленомегалію, нерівномірність паренхіми печінки та селезінки за рахунок дрібних гіперехогенних сигналів, збільшені лімфатичні вузли у воротах селезінки та самі гельмінти (ехінококи, клубки кишкових гельмінтів тощо).

Гемосканування - якісне дослідження крові за допомогою потужного темнопольного мікроскопа, можна побачити стан клітин крові (форму, розмір, активність, колір і т.д.), наявність неспецифічних елементів та речовин – все це безпосередньо чи опосередковано говорить про наявність в організмі гельмінтів. Зображення відображається на екрані монітора за допомогою вбудованої відеокамери в мікроскопі. Цей метод діагностики має високу достовірність.

Непрямими лабораторними ознаками гельмінтозівможуть бути анемія, базофілія, еозинофілія, збільшення рівня аспартатамінотрансферази. Так, при токсокарозі виявляється лейкемоїдна реакція еозинофілів (понад 20 %) на стійкому фоні. алергічного синдрому(атопічний дерматит з вираженим свербінням та резистентністю до традиційної терапії, тяжка бронхіальна астма). Пригнічення нормальної кишкової палички в аналізі калу на дисбактеріоз також може говорити про можливий гельмінтоз.

З урахуванням поширеності гельмінтозів ми пропонуємо анкетувизначення ризику інфікування гельмінтами.

Купаєтесь у прісноводних водоймах.
Не миєте руки перед їжею з милом у гарячій воді.
Вживаєте воду з неперевірених джерел.
Вживаєте в їжу домашнє сало з прожилками м'яса.
Вживаєте в їжу малосольну рибу.
Вживаєте в їжу слабопрожарене м'ясо (з кров'ю).
Вживаєте малосольну ікру незаводського приготування.
Не миєте курячі яйця з милом.
Чи не миєте банани, апельсини, мандарини перед вживанням.
Удобрюєте город гноєм.
Вживаєте овочі прямо з грядки.
Вживаєте фрукти та ягоди прямо з грядки.
Вживаєте фрукти, що впали.
Не обдайте всю зелень окропом для приготування салатів.
Зберігайте моркву у піску, взятому у дворі.
Ходіть босими ногами травою.
Члени сім'ї мали глистові інвазії.
У сім'ї є собака чи кішка.

За кожну відповідь « так- 2 бали, іноді» - 1, « ні» - 0. При сумі балів 0-5 ймовірність інфікування мізерно мала, 6-12 - можливе інфікування, 13-25 - висока ймовірність, більше 25 балів - дуже висока. При двох останніх результатах необхідні регулярне обстеження та, можливо, профілактичне лікування.

Оскільки клінічні прояви гельмінтозів не завжди специфічні, а в початкових стадіях – неспецифічні, ми пропонуємо анкету для пацієнтів для самодіагностики гельмінтозів.

Буває свербіж в області ануса вранці.
Нудота вранці під час чищення зубів.
Лушпиння пальців рук або ніг зі злущуванням пластів шкіри.
Алергічна висипка на шкірі, свербіж шкіри.
Лушпиння і набряклість в області повік.
Підвищена стомлюваність, млявість, сонливість.
Підвищене почуття голоду.
Відчуття дискомфорту у животі.
Зниження маси тіла.
Наявність кількох хронічних захворювань органів шлунково-кишкового тракту, суглобів, бронхолегеневої системи.
Погане самопочуття, відсутність офіційного діагнозу, тривале неефективне лікування.
Періодичний підйом температури, що супроводжується м'язовими та суглобовими болями.

Відповідь « так» за Крайній міріна 2–3 питання говорить про високої ймовірностізараження гельмінтами.

ВИСНОВКИ

1. На сучасному етапінемає лабораторних методів дослідження на гельмінтози, які мають 100% надійність.

2. Найбільшу достовірність у діагностиці гельмінтозів мають полімеразна ланцюжкова реакціята біорезонансна діагностика

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

Дослідження фекалій

Мікроскопіювання спочатку проводять при слабкому збільшенні (Х80). Найпростіших можна замінити за сильнішою заломлюваністю світла, а деякі види - за їх рухом або зміною форми. Об'єкт, помічений при малому збільшенні, розглядають при збільшенні 400 або 600. При відсутності досвіду перегляд мазків слід проводити відразу при великому збільшенні, що значно збільшує час на вивчення препарату. Перегляд мазків при великому збільшенні слід проводити при сильнішому освітленні, регулюючи його за допомогою конденсора.

Диференційними ознаками окремих видівамеб у нативному мазку є форма і розмір тіла, видимість ядра, характер утворення псевдоподій, рух, поділ цитоплазми на екто- та ендоплазму, характер включень (фагоцитовані еритроцити та ін.). При диференціюванні видів джгутиконосців - розмір і форма тіла, кількість джгутиків, характер пересування, наявність або відсутність ундулюючої мембрани. Специфічними ознаками балантидії є розмір, форма тіла, рух, вії, цитостом та ін.

Основною відмітною ознакою вегетативних форм найпростіших у живому стані є рух. У мазках зустрічаються різного родунерухомі утворення – рослинна клітковина, м'язові волокна, суперечки, грибки тощо. Вони не повинні братися до уваги при протозоологічній діагностиці.

Метод нативного мазка простий та доступний для будь-якої лабораторії. Він дозволяє при знаходженні тканинних форм дизентерійних амеб з фагоцитованими еритроцитами поставити абсолютно точний діагноз амебної дизентерії, а при виявленні балантидій та лямблій – діагноз балантидіазу та лямбліозу.

Забарвлення мазків розчином Люголю . Це фарбування застосовується для діагностики найпростіших за цистами. Нею користуються при дослідженні оформленого, напівоформленого та кашкоподібного калу.

Для приготування мазка кінець дерев'яної палички мажеться у фекаліях і обмивається в краплі йодного розчину (J - 1,0 г, KJ - 2 г, дистильована вода - 100 мл), нанесеного на предметне скло до отримання рівномірної емульсії. Препарат накривають покривним склом та через 3 – 5 хв. мікроскопують. Мазок повинен бути досить прозорим для вивчення його в світлі, що проходить.

Серед залишків неперетравленої їжі, спор, грибків, йодофільних бактерій цисти найпростіших, забарвлені в коричневий або зеленувато-жовтий колір, виділяються строго визначеною, характерною для кожного виду формою, розміром, чіткими обрисами країв, наявністю гладкої, прозорої, двоконтурної оболонки, вмістом цитоплазми, з нечітко вираженою структурою. У цистах амеб помітні забарвлені у коричневий (темно-бурий) колір глікогенові вакуолі. Ступінь забарвлення цих вакуолей і обриси їх меж варіюють у найпростіших цистах одного і того ж виду в залежності від їх зрілості.

7.7. Методи визначення життєздатності яєць та личинок гельмінтів

Життєздатність яєць гельмінтів визначають на вигляд, шляхом фарбування вітальними фарбами, культивуванням в оптимальних умовах і постановкою біологічної проби.

7.7.1. Визначення життєздатності яєць або личинок гельмінтів на вигляд

Яйця гельмінтів мікроскопують спочатку при малому, потім за великому збільшенні. У деформованих і мертвих яєць гельмінтів оболонка розірвана або прогнута всередину, мутна плазма, розпушена. У сегментованих яєць кулі дроблення (бластомери) нерівного розміру, неправильної форми, часто зрушені одного полюсу. Іноді зустрічаються аномальні яйця, які, маючи зовнішні потворності, розвиваються нормально. У живих личинок аскарид дрібна зернистість є лише у середній частині тіла, у міру їх загибелі вона поширюється у всьому тілі, з'являються великі блискучі гіалінові вакуолі, звані " нитки перлів " .

У інвазійних личинок аскарид часто помічається чехлик, що відшарувався на головному кінці, а в личинок власоголовів, що закінчили розвиток в яйці, на цьому місці при великому збільшенні виявляється стилет. У загиблих личинок гельмінтів незалежно від місця перебування (у яйці чи поза ним) помічають розпад тіла. При цьому внутрішня структура личинки стає глибчастою або зернистою, а тіло каламутним і непрозорим. У тілі виявляються вакуолі, але в кутикулі - розриви.

Життєздатність онкосфер теніїд (бичачого, свинячого ціп'яків та ін.) визначають за рухом зародків при впливі на них травних ферментів. Яйця поміщають на годинникове скло зі шлунковим соком собаки або штучним соком дуоденальним. Склад останнього: панкреатину – 0,5 г, натрію бікарбонату – 0,09 г, дистильованої води – 5 мл. Годинникове скло з яйцями ставлять у термостат при 36 - 38 ° С на 4 години. При цьому живі зародки звільняються від оболонок. Оболонки живих онкосфер також розчиняються в підкисленому пепсині та в лужному розчині трипсину через 6 - 8 годин у термостаті при 38 °С.

Якщо помістити яйця тенід в 1% розчин натрію сульфіду або 20% розчин натрію гіпохлориду, або ж в 1% розчин хлорної води при 36 - 38 ° С, зрілі і живі зародки звільняються від оболонок і не змінюються протягом 1 добу. Незрілі та мертві онкосфери зморщуються або набухають і різко збільшуються, а потім розчиняються протягом 10 хвилин - 2 годин. Живі зародки теніїд також активно рухаються в суміші 1% розчину натрію хлориду, 0,5% розчину натрію гідрокарбонату і жовчі при 36 - 38 °С.

Для визначення життєздатності яєць карликового ціп'яка найпростіша методика Іоніної Н.С.: у живих яєць медіанна пара ембріональних гаків або паралельна латеральним, або останні утворюють з медіанною кут біля основи менше 45°. У мертвих яєць латеральні пари утворюють біля основи кут з медіанною парою більше 45° або гаки безладно розкидані (втрачається їхнє парне розташування); іноді спостерігається зморщування зародка, утворення зернистості. Більш точний метод, заснований на появі онкосферних рухів при різкій зміні температур: від 5 - 10° до 38 - 40 °С.

Визначення життєздатності незрілих яєць нематод слід вивчати у вологій камері (чашках Петрі), поміщаючи яйця аскарид у 3%-ний розчин формаліну, приготований на ізотонічному розчині натрію хлориду при температурі 24 - 30 °С, яйця власоголовий в 3 при температурі 30 – 35 °С; яйця гостриків в ізотонічному розчині хлориду натрію при температурі 37 °С. Чашки Петрі слід відкривати 1 - 2 рази на тиждень для кращої аерації та знову зволожувати фільтрувальний папір чистою водою.

Спостереження за розвитком яєць гельмінтів ведуть не менше 2 разів на тиждень. Відсутність ознак розвитку протягом 2 - 3 місяців свідчить про їхню нежиттєздатність. Ознаками розвитку яєць гельмінтів є спочатку стадії дроблення, розподіл вмісту яйця на окремі бластомери. Протягом перших днів розвивається до 16 бластомірів, які переходять у другу стадію - морулу і т.д.

Яйця трематод, які природно розвиваються у воді, наприклад опісторхісів, дифілоботріїд, фасціол та інших, поміщають на годинникове скло, чашку Петрі або в іншу посудину, наливають невеликий шар звичайної води. При культивуванні яєць фасціол слід врахувати, що вони розвиваються швидше в темряві, при цьому в живих яйцях при температурі 22-24 ° С через 9-12 діб формується мірацидій. При мікроскопуванні яєць, що розвиваються, трематод добре помітні рухи мірацидію. Мірацидій фасціоли з оболонок яйця виходить лише на світлі.

Метод Фюлеборну. Личинки анкілостомід і стронгілід культивують на агарі в чашці Петрі з тваринним вугіллям. Після витримування в термостаті при температурі 25 - 30 ° С протягом 5 - 6 годин личинки розповзаються по агару, залишаючи доріжку з бактерій.

Метод Харада та Морі. У пробірки, вміщені в штатив, додають 7 мл дистильованої води. Дерев'яною паличкою беруть 0,5 г випорожнень і роблять мазок на фільтрувальному папері (15 х 150 мм) за 5 см від лівого краю (цю операцію проводять на аркуші паперу, щоб захистити поверхню лабораторного столу). Потім смужку з мазком вставляють пробірку так, щоб вільний від мазка лівий кінець досягав дна пробірки. Накривають верхній кінець шматком целофану і щільно охоплюють гумкою. На пробірці пишуть номер прізвище обстежуваного. У такому стані пробірки зберігають 8-10 діб при температурі 28 °С. Для вивчення личинок знімають та видаляють целофанову кришку і витягують пінцетом смужку фільтрувального паперу. При цьому слід виявляти обережність, оскільки невелика кількість інвазійних личинок може пересуватися до верхнього кінця фільтрувального паперу або стінки пробірки і проникати під поверхню целофану.

Пробірки поміщають у гарячу водяну баню при температурі 50 °С на 15 хвилин, після чого їх струшують і швидко переливають в 15-мілілітрову пробірку для осадження личинок. Після центрифугування надосадову рідину видаляють, а осад переносять на предметне скло, покривним покривним склом і мікроскопують під малим збільшенням.

Для диференціального діагнозу філярієподібних личинок необхідно скористатися даними таблиці 3.

Таблиця 3

ДИФЕРЕНЦІЙНА ДІАГНОСТИКА ФІЛЯРІЄВИДНИХ ЛИЧИНОК A. DUODENALE, N. AMERICANUS, S. STERCORALIS, trICHOStrONGYLUS SP.

Личинки	Розміри	Характерні ознаки
A. duodenale	Довжина тіла близько 660 мкм, чохлика – 720 нм.	Смугастість чохлика менш виражена, ротовий виступ менш помітний, передній кінець тіла (але не чохлика) тупий, діаметр кишкової трубки менше, ніж бульбус стравоходу, хвостовий кінець тупий
N. americanus	Довжина тіла близько 590 мкм, чохлика – 660 нм.	Чехлик помітно вичерпано, особливо в хвостовій частині тіла, ротовий виступ здається темним, передній кінець тіла (але не чохлика) закруглений подібно до вузького кінця курячого яйця, передня частина кишкової трубки такого діаметру, як бульбус стравоходу, хвостовий кінець різко загострений.
S. stercoralis	Довжина тіла близько 500 мкм.	Личинка без чохлика, стравохід складає близько половини довжини тіла, хвіст тупий або розгалужений
Trichostrongylus sp.	Довжина тіла близько 750 мкм	Просвіт кишківника не прямий, а зигзагоподібний, хвостовий кінець закруглений і має форму кнопки

7.7.2. Методи фарбування яєць та личинок гельмінтів

Мертві тканини здебільшого сприймають фарби швидше, ніж живі. Ці особливості використовують у гельмінтології для визначення життєздатності яєць та личинок гельмінтів. Однак у окремих випадках деякі фарби краще сприймаються живими тканинами, ніж мертвими.

Для диференціального визначення живих і мертвих яєць та личинок застосовують такі фарби та способи.

Для фарбування живих та мертвих тканин часто використовують лейкобазу метиленового синього. Жива клітина або тканина редукує метиленовий синій в безбарвну лейкобазу, мертва тканина не має такої здатності, тому набуває забарвлення.

Критерієм стану яйця є забарвлення зародка, але з оболонки. Така його здатність пов'язана з умовами загибелі яйця. У тих випадках, коли волокниста оболонка в мертвому яйці не втрачає властивостей напівпроникності, вона не пропускатиме барвники, отже, мертвий зародок не фарбуватиметься. Забарвлений зародок завжди свідчить про загибель яйця.

Для фарбування яєць аскарид можна використовувати метиленовий синій у розчині молочної кислоти з їдким лугом (метиленового синього 0,05 г, їдкого натру 0,5 г, молочної кислоти - 15 мл). Живі яйця забарвлення не сприймають; забарвлюються в синій колір зародка мертвих яєць. Фарбування личинок аскарид основним розчином фарби діаманткрезилового синього концентрації 1:10000 здійснюють наступним чином: на предметне скло наносять краплю рідини з яйцями аскарид і краплю основного розчину фарби. Препарат накривають покривним склом, яке щільно притискають до предметного скла при легкому постукуванні препарувальною голкою. Під мікроскопом спостерігають кількість личинок, що вийшли, і ступінь їх офарблюваності; після цього цей же препарат переглядають повторно через 2 - 3 години. Живими вважаються лише недеформовані личинки, які не забарвилися протягом 2 годин. Мертві личинки або не виходять з яєць, або забарвлюються при розриві шкаралупи (частково або повністю).

При визначенні життєздатності яєць аскаридій птахів можливе фарбування препаратів 5%-ним спиртовим розчиномйоду. При його нанесенні препарат зародки мертвих яєць аскаридий протягом 1 - 3 сек. фарбуються в оранжевий колір.

Мертві яйця опісторхісів і онкосфери бичачого ціп'яка забарвлюються розчином толуїдинового синього (1:1000), а мертві онкосфери бичачого ціп'яка - розчином діаманткрезилового синього (1:10000). При цьому набувають кольору зародка та оболонки як мертвих, так і живих яєць. Тому після фарбування яйця та онкосфери відмивають у чистій воді та додатково забарвлюють їх сафраніном (у розведенні 1:10000 спирту 10 °С). Спирт видаляє фарбу з оболонок, а сафранін забарвлює червоний колір. В результаті живі яйця забарвлюються у червоний колір; яйця з мертвими зародками – у синій, а оболонка залишається червоною. Мертві зародки онкосфер бичачого ціп'яка швидко, протягом декількох хвилин, забарвлюються в яскраво-червоний або рожевий колір сафраніном або синій колір діаманткрезіловим синім у розведенні 1:4000, або індигокарміном у розведенні 1:1000 - 1:200. Живі ембріони не змінюються під впливом цих фарб навіть через 2 - 7 годин.

Для визначення життєздатності яєць карликового ціп'яка рекомендується використовувати такі фарби:

1. Діаманткреазиловий синій (1:8000) – через 1 годину у мертвих яєць особливо яскраво забарвлюється онкосфера, яка різко виділяється на блідому або безбарвному тлі решти яйця.

2. Сафранін (1:8000 при дії протягом 2 годин та 1:5000 – протягом 3 – 5 годин).

3. 50%-ний розчин пирогалловой кислоти у розведенні 1:2 - при дії протягом 1 години при температурі 29 - 30 ° С (чим нижче температура, тим триваліший процес фарбування).

7.7.3. Люмінесцентний метод дослідження яєць та личинок гельмінтів

Люмінесцентна мікроскопія дає можливість диференціювати живі та мертві об'єкти без ушкодження яйця. Для флюоресценції використовуються не ультрафіолетові промені, а синьо-фіолетова частина видимого світла, зі звичайним мікроскопом та предметним склом; до освітлювача ОІ-18 додають спеціальний набір кольорових фільтрів.

Живі та мертві яйця аскарид, гостриків, карликових ціп'яків, бичачого ціп'яка, широкого лентеця та інших гельмінтів люмінескують неоднаково. Це явище спостерігається як при первинній люмінесценції без застосування барвників, так і при фарбуванні флюорохромами (акридиновий помаранчевий, корифосфін, примулін, ауролін, сульфат берлерину, тріпафлавін, риванол, акрихін та ін.).

Незабарвлені, живі несегментовані яйця, аскарид світяться яскраво-зеленим світлом з жовтуватим відтінком; у мертвих яєць оболонка випромінює зелене світло значно яскравіше, ніж темно-зелена зародкова частина; у яєць аскарид з личинкою проявляється лише оболонка, а в мертвих – і оболонка, і личинка яскраво-жовтого кольору.

Непігментовані і несегментовані живі яйця гостриків і карликових ціп'яків випромінюють зеленувато-жовте світло, у мертвих яєць інтенсивно люмінескує оболонка на тлі темно-зеленої зародкової маси.

При вторинній люмінесценції (при фарбуванні акридин помаранчевим у розведенні 1:10000 та 1:50000 від 30 хвилин до 2 годин) оболонка живих та мертвих нематод, трематод та цестод люмінескує неоднаково.

Шкаралупа живих і мертвих яєць аскарид, токсокар, гостриків, карликових ціп'яків, пацюкових ціп'яків, бичачого ціп'яка, лентеців забарвлюється в оранжево-червоний колір. Зародки живих яєць аскарид, токсаскарисів, щурячого ціп'яка, широкого лентеца і онкосфери бичачого ціп'яка люмінескують тьмяним темно-зеленим або сіро-зеленим кольором. Мертві зародки яєць цих гельмінтів випромінюють "гарячий" оранжево-червоний колір. Живі личинки гостриків і токсокар (звільнені від шкаралупи яйця) випромінюють тьмяне сіро-зелене світло, при їх загибелі колір змінюється від головного кінця в світло-зелений, потім жовтий, помаранчевий і, нарешті, в яскраво-оранжевий.

При фарбуванні флюорохромами - корифосфілом, примуліном у мертвих яєць аскарид і волосоголовців спостерігається свічення від лілово-жовтого до мідно-червоного кольору. Життєздатні яйця не люмінескують, а забарвлюються у темно-зелений колір.

Живі яйця трематод (парагонімусів та клонорхісів) не люмінескують після фарбування акридиновим помаранчевим, а від мертвих яєць виходить жовтувато-зелений колір.

Живі мірацидії, що вийшли з оболонки, випромінюють тьмяне блакитне світло з ледь помітним світло-жовтим віночком вій, але через 10 - 15 хвилин після загибелі проявляються яскравим світлом, що горить, світло-зеленим, а потім - оранжево-червоним світлом.

7.7.4. Метод біологічної проби

Наприклад, для визначення життєздатності яєць аскаридат (аскариди свинячі, людини, токсокари, токсаскарис та ін) на одну тварину (морські свинки, миші) необхідно не менше 100 - 300 яєць з личинкою, що розвинулася. Яйця аскаридат в ізотонічному розчині хлориду натрію вводять піпеткою через рот миші або морської свинки. Через 6 - 7 діб тварину забивають, розкривають та досліджують її печінку та легені окремо на наявність личинок аскаридат. Для цього печінка та легені подрібнюють ножицями на дрібні шматочки та досліджують їх за методом Бермана чи Супряги (розділ 6.1.2).

Якщо тварин заражали живими інвазійними яйцями, то при розтині у печінці та легенях виявляють мігруючі личинки аскаридат.

У разі зараження яйця фасціол у фекаліях лабораторних тварин можна виявити у кроликів через 2 місяці, у морських свинок – через 50 діб, у мишей – через 35 – 40 діб.

Для більш швидкого отримання відповіді лабораторних тварин розкривають через 20 – 30 діб та досліджують печінку на наявність молодих фасціол.

Для визначення життєздатності яєць карликового ціп'яка також рекомендується їх згодовування незараженим ними раніше білим мишам з наступним розкриттям тварин через 92 - 96 годин та виявленням цистицеркоїдів у кишкових ворсинках або цестод у просвіті кишечника.

Для визначення життєздатності яєць опісторхісів рекомендується метод (Герман С.М., Беер С.А., 1984), заснований на фізико-хімічній активації залози вилуплення мірацидію та стимуляції рухової активності личинки, що призводить до відкривання кришечки яйця та активного виходу світу умовах.

Завис яєць опісторхісів у воді попередньо охолоджують до 10 - 12 ° С (усі наступні операції здійснюють при кімнатній температурі 19 - 20 ° С). У центрифужну пробірку вносять 1 краплю суспензії, що містить 100 - 150 яєць. Пробірку ставлять у штатив на 5 – 10 хвилин. За цей час усі яйця встигають опуститись на дно. Потім смужкою фільтрувальним папером обережно відсмоктують надлишок води і добирають в пробірку 2 краплі спеціального середовища. Середовище готують на 0,005 М Тріс-HCl буфері; в буфер додають 12 - 13%-ний розчин етанолу та барвник (фуксин, сафранін, еозин, метиленовий синій і т.д.). Пробірку струшують, її вміст переносять на предметне скло піпеткою і залишають на 10 хвилин, злегка похитуючи. Потім додають 2 краплі зазначеного середовища. Препарат готовий до мікроскопування під звичайним світловим мікроскопом при 20-кратному збільшенні.

За цей час у життєздатних личинок відкривається кришечка, і мірацидій активно виходить у вказане середовище. Завдяки наявності в ній етанолу вони через 2 - 5 хвилин знерухомлюються і потім забарвлюються за допомогою барвника. Їх легко можна виявити та порахувати при мікроскопуванні.