प्राप्तकर्त्याच्या पेशींमध्ये हायब्रिड डीएनएचा परिचय करून देण्याच्या पद्धती. ट्यूमर आणि स्टेम पेशींना लक्ष्यित डीएनए वितरणाची पद्धत
डीएनए लस(तसेच जनुक लस, न्यूक्लिक अॅसिड लस)- एक अनुवांशिक अभियांत्रिकी रचना जी सेलमध्ये दाखल केल्यानंतर, रोगजनक प्रथिने किंवा ट्यूमर प्रतिजनांचे उत्पादन सुनिश्चित करते आणि रोगप्रतिकारक प्रतिसादास कारणीभूत ठरते. डीएनए लस शरीरात प्रवेश करणे याला अनुवांशिक लसीकरण म्हणतात. पारंपारिक लसींपेक्षा डीएनए लसीकरणाचे अनेक फायदे आहेत. विशेषतः, असे दिसून आले आहे की अशा लसी केवळ अँटीबॉडीज (ह्युमरल इम्युनिटी) चे उत्पादनच देत नाहीत तर विशिष्ट साइटोटॉक्सिक प्रतिसाद (सेल्युलर प्रतिकारशक्ती) देखील प्रदान करतात, जी पूर्वी केवळ थेट लसींनीच साध्य करता येत होती. आज, डीएनए लसींचा वापर मानवांवर उपचार करण्यासाठी केला जात नाही, परंतु अनुवांशिक लसीकरणाचा अंदाज आहे. संपूर्ण ओळरोग
निर्मितीचा इतिहास
लसीकरणासाठी डीएनए तुकड्यांचा वापर करण्याची कल्पना 1950 आणि 1960 च्या दशकात दिसून आली. प्रयोगांच्या मालिकेनंतर, असे आढळून आले की डीएनएची अनुवांशिक माहिती दुसर्या सेलमध्ये हस्तांतरित केल्यानंतर लिप्यंतरण आणि अनुवादित करण्याची क्षमता राखून ठेवते. त्याच वर्षी, असे आढळून आले की पोलिओ विषाणूच्या जीनोमचा प्राण्यांमध्ये प्रवेश केल्याने ऍन्टीबॉडीजचे उत्पादन उत्तेजित होते. नंतर सक्रियकरण विनोदी प्रतिकारशक्तीगैर-संसर्गजन्य एजंट्सपासून मिळवलेल्या डीएनए रेणूंसाठी दर्शविले आहे. 1990 च्या दशकापासून, वैज्ञानिक प्रयोगशाळांनी डीएनएच्या इम्युनोस्टिम्युलेटरी गुणधर्मांची अधिकाधिक तपासणी करण्यास सुरुवात केली आहे. 1992 मध्ये, टॅंग आणि सहकाऱ्यांनी हे दाखवून दिले की प्लाझ्मिडमध्ये घातलेले मानवी वाढ संप्रेरक जनुक स्थिरपणे उंदरांमध्ये व्यक्त केले जाते आणि संश्लेषित हार्मोन प्रतिजन म्हणून रोगप्रतिकारक यंत्रणेद्वारे ओळखले जाते आणि प्रतिपिंडांचे उत्पादन उत्तेजित करते. ह्युमरल प्रतिकारशक्तीला उत्तेजित करण्यासाठी प्लाझमिड डीएनएचा परिचय करून देण्याच्या प्रक्रियेला टँगो "अनुवांशिक लसीकरण" असे म्हणतात. तथापि, पुढच्याच वर्षी, शास्त्रज्ञांच्या दुसर्या गटाने सांगितले की इन्फ्लूएंझा विषाणूच्या प्लाझमिड एन्कोडिंग प्रथिनांच्या परिचयामुळे विनोदी आणि सेल्युलर प्रतिसाद दोन्ही झाला. एचआयव्ही जीन्स असलेल्या प्लास्मिडसाठी त्याच वर्षीच्या प्रतिकारशक्तीच्या दोन्ही शाखांचा समावेश देखील आढळून आला. 1995 पासून, डीएनए लसीकरणामुळे रोगप्रतिकारक शक्ती सक्रिय होऊ शकते याचे पुरावे समोर येऊ लागले आहेत. कर्करोग. सुमारे 20 वर्षांपूर्वी, डीएनए लसींच्या पहिल्या नैदानिक चाचण्या झाल्या, ज्यात, सर्व प्रथम, नवीन पद्धतीची सुरक्षितता प्रदर्शित करणे अपेक्षित होते. रुग्णांना एचआयव्ही, इन्फ्लूएंझा विषाणू, नागीण, हिपॅटायटीस बी, मलेरियाचे कारक घटक असलेल्या जनुकांचे इंजेक्शन दिले गेले. सर्व चाचण्यांचे परिणाम खूपच उत्साहवर्धक होते: डीएनए लसी सातत्याने व्यक्त केल्या गेल्या, रोगप्रतिकारक प्रतिसादाला उत्तेजन दिले आणि गंभीर दुष्परिणाम होऊ शकले नाहीत, जे त्यांच्या पुढील संशोधनासाठी प्रेरणा म्हणून काम केले.
डीएनए लस तयार करणे
संरचनात्मकदृष्ट्या, डीएनए लस ही एक वेक्टरमध्ये एम्बेड केलेला न्यूक्लियोटाइड क्रम आहे जो विशिष्ट प्रतिजन किंवा प्रतिजनांना एन्कोड करतो. मध्ये वेक्टर अनुवांशिक अभियांत्रिकीन्यूक्लिक अॅसिड रेणू म्हणतात जो पेशींमध्ये अनुवांशिक सामग्री वितरीत करतो आणि त्याची प्रतिकृती किंवा अभिव्यक्ती सुनिश्चित करतो. पूर्वी, व्हायरसवर आधारित वेक्टरचा वापर सेलमध्ये जीन्स वाहतूक करण्यासाठी केला जात असे: एक सुधारित (कमकुवत) व्हेरिओला व्हायरस, एडिनोव्हायरस आणि रेट्रोव्हायरस. व्हायरल व्हेक्टर बरेच प्रभावी आहेत, परंतु त्यांच्यात व्हेक्टरच्या तुलनेने उच्च इम्युनोजेनिसिटीशी संबंधित साइड इफेक्ट्सची लक्षणीय शक्यता आहे. म्हणून, आज एक जिवाणू प्लाझमिड बहुतेकदा वेक्टर म्हणून वापरला जातो - एक लहान स्थिर गोलाकार डीएनए रेणू स्वायत्त प्रतिकृती करण्यास सक्षम आहे. स्वतःहून, प्लाझमिड इच्छित विशिष्ट रोगप्रतिकारक प्रतिसादास कारणीभूत ठरत नाही; यासाठी, इम्युनोजेनिक प्रथिनांची जीन्स त्यात शिवली जातात. तसेच, डीएनए लसीमध्ये युकेरियोटिक पेशींमध्ये जनुक अभिव्यक्तीसाठी आवश्यक नियामक अनुक्रम असणे आवश्यक आहे. तयार झालेले डीएनए बॅक्टेरियाच्या सेलमध्ये वितरित केले जाते, जेथे त्याच्या प्रतींची संख्या वाढविली जाते. यानंतर प्लाझमिड्सचे पृथक्करण आणि शुद्धीकरण केले जाते जे इच्छित घाला वाहून नेतात.
प्लाझमिड वेक्टर डिझाइन
डीएनए लसींच्या निर्मितीमधील महत्त्वाचा टप्पा म्हणजे वेक्टरची रचना (बांधकाम) होय. प्लाझमिड व्हेक्टरची आवश्यक रचना म्हणजे निर्बंध स्थळे, निवडण्यायोग्य मार्कर आणि जिवाणू पेशीमध्ये डीएनए लसीच्या प्रतिकृतीचे मूळ. प्रतिजन संश्लेषण होण्यासाठी, डीएनए लसीमध्ये प्रवर्तक आणि पॉलीएडेनिलेशन सिग्नल असणे आवश्यक आहे. प्रवर्तक हा लसीच्या परिणामकारकतेचा एक महत्त्वाचा घटक आहे, कारण ते रोगप्रतिकारक प्रतिसादाची ताकद ठरवते: विषाणू किंवा ट्यूमर प्रतिजन एन्कोडिंग जनुकाची अधिक अभिव्यक्ती, रोगप्रतिकारक प्रतिसाद मजबूत. SV40 व्हायरस किंवा सायटोमेगॅलॉव्हायरस (CMV) हा सर्वात सामान्यपणे वापरला जाणारा प्रवर्तक आहे. mRNA ट्रान्स्क्रिप्ट्स स्थिर करण्यासाठी, बहुधा बोवाइन ग्रोथ हार्मोन जनुकातून मिळविलेला पॉलीएडेनिलेशन सिग्नल प्लाझमिडमध्ये घातला जातो. (BGH)किंवा SV40 व्हायरस. जिवाणू प्रतिजैविक प्रतिरोधक जीन्स निवडण्यायोग्य मार्कर म्हणून निवडले जातात, बहुतेकदा कॅनामायसिन प्रतिरोधक जनुक. डीएनए लसींची रचना करताना, प्रतिकृतीचा सर्वात लोकप्रिय बिंदू एस्चेरिचिया कोली.
लसीकरणासाठी जनुकांची निवड
वेक्टर हा डीएनए लसीचा एक महत्त्वाचा घटक आहे, परंतु त्याची इम्युनोजेनिसिटी तंतोतंत इन्सर्टद्वारे निश्चित केली जाते, प्रतिजन एन्कोडिंग डीएनए अनुक्रम. विषाणूजन्य प्रतिजनांपैकी, फ्यूजन प्रथिने लसीकरणासाठी सर्वात योग्य आहेत; हे तुलनेने संरक्षित प्रथिने आहेत जे व्हायरसला सेलमध्ये प्रवेश करण्यास परवानगी देतात. ग्राम-पॉझिटिव्ह बॅक्टेरियाविरूद्ध लसीकरणासाठी, प्लाझमिड व्हेक्टरमध्ये त्या बॅक्टेरियाच्या प्रथिनांचे जीन्स घालण्याचा सल्ला दिला जातो जे रोगाचे पॅथोजेनेसिस ठरवतात. ग्राम-नकारात्मक बॅक्टेरियाच्या प्रथिनांपैकी, त्यांच्याकडे उच्च प्रतिकारशक्ती आहे. उपचारात्मक अँटीट्यूमर डीएनए लसींसाठी, कर्करोग सेल मार्कर प्रथिने वापरली जातात.
पेशींमध्ये डीएनए लस वितरीत करण्याच्या पद्धती
तयार झालेली लस मानवी किंवा प्राण्यांच्या शरीराला दिली जाणे आवश्यक आहे, जिथे त्याचे गंतव्य प्रतिजन-प्रस्तुत पेशी (APC) - मॅक्रोफेजेस, डेंड्रिटिक पेशी, बी-लिम्फोसाइट्स आहेत. येथे, अँटिजेनिकचे संश्लेषण आणि अनुवादानंतरचे बदल घडून येतील, ज्यानंतर ते रोगप्रतिकारक यंत्रणेचे लक्ष वेधण्यासाठी सेल झिल्लीमध्ये घातले जाईल. एपीसीला पुरेसे प्लाझमिड वितरीत करणे ही मुख्य समस्या आहे. सेलमध्ये अनुवांशिक सामग्री वितरीत करण्याच्या पद्धती सहसा 2 गटांमध्ये विभागल्या जातात: व्हायरल आणि नॉन-व्हायरल. व्हायरल व्हॅक्टर्समध्ये अनेक लक्षणीय तोटे असल्याने, या विभागात केवळ डीएनए लसी वितरित करण्यासाठी नॉन-व्हायरल पद्धती सादर केल्या आहेत.
मायक्रोइंजेक्शन
1990 च्या दशकाच्या सुरुवातीस, पद्धतीच्या साधेपणामुळे, पेशीमध्ये डीएनएचा परिचय करण्याचा इंट्रामस्क्युलर मायक्रोइंजेक्शन हा सर्वात सामान्य मार्ग होता. हे करण्यासाठी, डीएनए पाण्यात विरघळली जाते किंवा आयसोटोनिक द्रावण, आवश्यक असल्यास, एक सहायक (एक पदार्थ जो रोगप्रतिकारक प्रतिसाद वाढवतो) जोडा. नंतर, पातळ काचेच्या नळीचा वापर करून, द्रावण स्नायूंच्या ऊतीमध्ये इंजेक्ट केले जाते, जेथे एपीसीची भूमिका डेंड्रिटिक पेशींद्वारे केली जाते. डेंड्रिटिक सेलच्या न्यूक्लियसमध्ये एकदा, लस व्यक्त करणे सुरू होते आणि प्रतिजन प्रथिनांचे संश्लेषण होते. मायक्रोइंजेक्शनच्या मदतीने, डीएनए त्वचेखालीलपणे, थायमस, यकृत, ट्यूमर टिश्यूमध्ये इंजेक्ट केले जाऊ शकते, परंतु स्नायूंच्या ऊतीमध्ये डीएनए लसीची सर्वात लांब (एक वर्षापर्यंत) अभिव्यक्ती दिसून येते. ना धन्यवाद उच्च एकाग्रतालॅन्गरहन्स पेशी (डेंड्रिटिक पेशींचा एक उपप्रकार), डीएनए लसीकरणासाठी एक आकर्षक लक्ष्य त्वचा आहे. इंट्राडर्मल (त्वचेखालील) प्रशासनासाठी, मायक्रोनीडल्सचा एक अॅरे वापरला जातो, ज्याची लांबी अनेक शंभर मायक्रॉन आहे. इंट्राडर्मल लसीकरणासाठी विविध पर्याय आहेत. डीएनए सोल्यूशनच्या पुढील स्थानिक इंजेक्शनसाठी त्याची पारगम्यता वाढवण्यासाठी त्वचेच्या स्ट्रॅटम कॉर्नियम (त्वचेचा बाह्य स्तर, सामान्यतः 10-20 मायक्रॉन) मायक्रोनीडल्सच्या अॅरेसह सैल करणे समाविष्ट करणे सोपे आहे. त्वचेखाली विरघळणाऱ्या कोरड्या लसीने लेपित मायक्रोनीडल्सचा वापर अधिक प्रभावी आहे. या पद्धतीची कार्यक्षमता सहसा कमी असते, कारण डीएनए प्रथम इंटरसेल्युलर स्पेसमध्ये प्रवेश करतो आणि त्यानंतरच पेशींमध्ये समाविष्ट होतो.
इलेक्ट्रोपोरेशन
इलेक्ट्रोपोरेशन - पारंपारिक दृष्टीकोनजिवाणू पेशी आणि सेल संस्कृतींना डीएनए वितरणासाठी, विद्युत आवेग लागू करण्याच्या आधारावर. अशा आवेग सेल झिल्लीमध्ये छिद्र तयार करतात, ज्यामुळे नकारात्मक चार्ज केलेल्या डीएनएमध्ये प्रवेश करणे सुलभ होते. ही पद्धत प्राणी आणि मानवांना डीएनए लसींच्या वितरणासाठी स्वीकारण्यात आली आहे आणि पारंपारिक इंजेक्शनची कार्यक्षमता लक्षणीय वाढवू शकते. इलेक्ट्रोपोरेशनसाठी डिव्हाइसमध्ये विद्युत प्रवाहाचा स्त्रोत आणि डिस्पोजेबल ग्रिड असते, ज्यामध्ये सिरिंज आणि सुई इलेक्ट्रोड असतात. सिरिंज स्नायूंच्या ऊतींमध्ये लस टोचते आणि इलेक्ट्रोड्स एक विद्युत क्षेत्र तयार करतात जे मायोसाइट्स आणि डेंड्रिटिक पेशींमध्ये डीएनएच्या प्रवेशास सुलभ करते. आजपर्यंत, अशी उपकरणे विकसित केली गेली आहेत जी लसीकरणाची प्रभावीता पारंपारिक इंजेक्शनच्या तुलनेत 1000 पटीने वाढवू शकतात. डीएनए लसीच्या इंट्रामस्क्यूलर आणि त्वचेखालील प्रशासनासाठी इलेक्ट्रोपोरेशनचा वापर केला जाऊ शकतो. तोटे म्हणजे इंजेक्शन साइटवर थोडासा वेदना, विशेष उपकरणांची आवश्यकता. विद्युत क्षेत्राऐवजी, चुंबकीय क्षेत्र वापरले जाऊ शकते. अशी उपकरणे समान तत्त्वावर कार्य करतात, परंतु या प्रकरणात, प्रक्रिया पूर्णपणे वेदनारहित आणि पेशींना कमी हानीकारक असते.
विद्युत क्षेत्राची क्रिया केवळ पेशींद्वारे डीएनए लसीचे शोषण वाढवत नाही तर रोगप्रतिकारक प्रतिसादाच्या विकासास देखील उत्तेजित करते. इलेक्ट्रोपोरेशनच्या वापरामुळे टिशूचे किरकोळ नुकसान होते - स्थानिक दाहक प्रक्रिया विकसित होते. जेव्हा पेशींचे नुकसान होते तेव्हा केमोकिन्स सोडले जातात, त्यामुळे मॅक्रोफेज, लिम्फोसाइट्स आणि डेंड्रिटिक पेशी त्यांच्याकडे पाठवल्या जातात. इंजेक्शन साइटवर रोगप्रतिकारक पेशींची एकाग्रता वाढल्याने लसीची प्रभावीता वाढते.
सोनोपोरेशन
सोनोपोरेशन ही अल्ट्रासाऊंड वापरून पेशींमध्ये परदेशी डीएनए हस्तांतरित करण्याची एक पद्धत आहे. अल्ट्रासाऊंड सेल झिल्लीची पारगम्यता वाढवते, परिणामी एक्सोजेनस डीएनए सेलमध्ये अधिक सहजपणे प्रवेश करतो. सोनोपोरेशनचा वापर पहिल्यांदा 1986 मध्ये सेलमध्ये जीन्स हस्तांतरित करण्यासाठी केला गेला. कॉर्निया, मेंदू, हाडांच्या ऊती, मूत्रपिंड, स्वादुपिंड, भ्रूण ऊतक, कंकाल आणि हृदयाच्या स्नायूंच्या पेशींमध्ये डीएनए रेणूंचा परिचय करण्यासाठी ही पद्धत वापरली जाते. इतर पद्धतींच्या तुलनेत, सोनोपोरेशनचा थोडासा अभ्यास केला जातो, त्याची प्रभावीता सुधारण्यासाठी अधिक प्रयत्न करणे आवश्यक आहे, विशेषत: संपूर्ण जीवाच्या पातळीवर.
बॅलिस्टिक ट्रान्सफेक्शन
बॅलिस्टिक ट्रान्सफेक्शन हे डीएनए रेणूंनी लेपित 1-3 मायक्रॉन व्यासासह जड धातू (सोने, टंगस्टन) च्या सूक्ष्म कणांसह अवयव आणि ऊतकांच्या शेलिंग (बॉम्बर्डमेंट) वर आधारित आहे. अशा प्रकारे सादर केलेली, डीएनए लस लक्ष्य पेशींमध्ये व्यक्त केली जाते आणि त्यांची उत्पादने रक्तप्रवाहात प्रवेश करतात. कणांना प्रवेग प्रदान करण्यासाठी, लहान शस्त्रांसारखे उपकरण वापरले जाते - जीन गन किंवा जीन गन. सूक्ष्म कण सेल झिल्लीतून जातात आणि अनुवांशिक रचना थेट सेल न्यूक्लियसमध्ये घेऊन जातात. मायक्रोपार्टिकल्सच्या प्रवेशाची खोली, एक नियम म्हणून, लहान आहे - 1 मिमी पर्यंत, म्हणून ही पद्धत प्रामुख्याने त्वचेच्या किंवा जवळच्या कूर्चाच्या ऊतकांच्या अभिसरणासाठी वापरली जाते. विशेष शेलिंग परिस्थिती सूक्ष्म कणांना 4-5 मिमी खोलीपर्यंत प्रवेश करण्यास आणि स्ट्रीटेड स्नायू तंतूंमध्ये जनुकांची रचना स्थानांतरित करण्यास परवानगी देते. सामान्यतः, थेट शॉटच्या मध्यभागी असलेल्या पेशी मरतात, तर केंद्रापासून 0.6-1 सेमी अंतरावर असलेल्या पेशी सर्वात यशस्वीरित्या प्रो-ट्रान्फॉर्म केलेल्या पेशी असतात. या तंत्रज्ञानाला बायोबालिस्टिक्स किंवा बायोलिस्टिक्स असेही म्हणतात.
पहिली जीन गन शास्त्रज्ञांच्या गटाने 1983 ते 1986 दरम्यान वनस्पती पेशींमध्ये परिवर्तन करण्याच्या उद्देशाने तयार केली होती. ऑटोमॅटिक नेलिंगसाठी उपकरणातून विकसित केलेले ते पिस्तूल होते. रिपोर्टर (मार्कर) जनुकातील डीएनए टंगस्टन बॉलवर लागू करण्यात आला आणि पेट्री डिशमध्ये शूट केला गेला. रिपोर्टर जीनच्या अभिव्यक्तीने लसीकरणाची प्रभावीता दर्शविली. आज, सोन्याचे किंवा चांदीचे कण डीएनए वितरीत करण्यासाठी वापरले जातात, कारण ते टंगस्टनच्या विपरीत पेशीसाठी विषारी नसतात.
उच्च दाबाखाली
1999 मध्ये, इंजेक्शन उपकरणे विकसित केली गेली जी सुईचा वापर न करता डीएनए लस देण्यास सक्षम आहेत. अशी उपकरणे लॉरेन्ट्झ फोर्समुळे कार्य करतात: एक लहान शक्तिशाली चुंबक महत्त्वपूर्ण दबाव निर्माण करतो, पिस्टन चालवतो, जो बाहेर पडतो. औषधी उत्पादनआवाजाच्या वेगाने. वर्तमान ताकद बदलून, आपण इंजेक्शनची खोली निवडू शकता आणि औषधांचा डोस घेऊ शकता. ही प्रक्रिया पूर्णपणे वेदनारहित आहे आणि यापूर्वी मधुमेहाच्या रूग्णांना इन्सुलिन देण्यासाठी आणि मोठ्या प्रमाणात लसीकरणासाठी वापरली जात होती. या पद्धतीचा एक महत्त्वपूर्ण तोटा असा आहे की उच्च दाबाने इंजेक्शन केलेल्या रेणूंची रचना सैद्धांतिकदृष्ट्या बदलू शकते. असे असले तरी, हे तंत्रज्ञानपरिचय सुधारणे सुरूच आहे, आणि आज अशी उपकरणे विकसित केली गेली आहेत जी 16 मिमी खोलीपर्यंत डीएनए पोहोचवू शकतात.
थेट जिवाणू वेक्टरचा भाग म्हणून
लाइव्ह बॅक्टेरियल वेक्टर हे स्ट्रेन आहेत साल्मोनेला, शिगेलाकिंवा लिस्टीरिया,जे जैवसंश्लेषण किंवा आक्रमण जनुकांमध्ये उत्परिवर्तन करतात जे रोगजनकता आणि यजमानामध्ये त्यांची व्यवहार्यता टिकवून ठेवण्याची क्षमता काढून टाकतात किंवा वातावरण. त्याऐवजी, इम्युनोजेनिक प्रोटीनसाठी आवश्यक जीन्स बॅक्टेरियाच्या जीनोममध्ये घातली जातात. क्षीण जीवाणू तोंडावाटे (तोंडाद्वारे, गिळण्याद्वारे) किंवा इंट्रानासली (अनुनासिक उघडण्यामध्ये इंजेक्शनद्वारे) प्रशासित केला जातो, म्हणून लसीकरणाच्या या पद्धतीला कोणत्याही उपकरणाची आवश्यकता नसते. याव्यतिरिक्त, असे प्रशासन श्लेष्मल त्वचा रोगप्रतिकारक प्रतिक्रिया उत्तेजित करते, जे महत्वाचे आहे कारण बहुतेक रोगजनक तोंडातून आणि नाकातून शरीरात प्रवेश करतात. पोटाला बायपास करून, कमकुवत जीवाणू आत प्रवेश करतात छोटे आतडे. पुढे, बॅक्टेरियम पीअर प्लेक्समध्ये प्रवेश करतो - आतड्यांसंबंधी लिम्फ नोड्स. एकदा पेयर्स पॅचच्या मध्यभागी, जीवाणू मॅक्रोफेजसाठी लक्ष्य बनतात आणि फॅगोसाइटोसिस करतात. मॅक्रोफेज सायटोप्लाझममध्ये, जीवाणू डीएनए लस सोडतो, त्यानंतर डीएनए न्यूक्लियसमध्ये प्रवेश करतो आणि जीवाणू रोगप्रतिकारक प्रणालीद्वारे निरुपद्रवी बनतो.
लिपोसोम्समध्ये पॅकेजिंग
लिपोसोम्स - गोलाकार रचना (सुमारे 100 एनएम व्यास), ज्यामध्ये दुहेरी लिपिड थर असतो. लिपोसोम्स आतून पोकळ असतात, जे सहसा सॉल्व्हेंटने भरलेले असतात परंतु प्रसूतीसाठी वापरले जाऊ शकतात विविध पदार्थडीएनए लसींचा समावेश आहे. त्यांचे हायड्रोफोबिक शेल त्यांना सेल झिल्लीसह फ्यूज करण्यास आणि त्यांची सामग्री सेलमध्ये वाहून नेण्यास अनुमती देते. लिपोसोम्सचा वापर 1965 मध्ये सुरू झाला आणि बायोनॅनोटेक्नॉलॉजीच्या विकासासाठी हे एक शक्तिशाली इंजिन बनले आहे.
लक्ष्य पेशींमध्ये डीएनए कंस्ट्रक्‍टचा थेट परिचय करण्याची एक आश्वासक पद्धत म्हणजे पॉझिटिव्ह चार्ज्ड लिपिड्सपासून बनवलेल्या कॅशनिक लिपोसोम्सचा भाग म्हणून अनुवांशिक रचना प्रदान करणे. नकारात्मक चार्ज केलेल्या डीएनए रेणूसह कॅशनिक लिपोसोम्स डीएनए-लिपिड कॉम्प्लेक्स - लिपोप्लेक्स बनवतात. अशा कॉम्प्लेक्स वापरण्याचे फायदे म्हणजे मोठ्या प्रमाणात माहिती वाहून नेण्याची क्षमता, गैर-संक्रामकता, याव्यतिरिक्त, ते उत्पादनासाठी सोपे आणि स्वस्त आहेत. 2003 मध्ये, अत्यंत लहान, मिलिमायक्रॉन लिपोसोम्स तयार केले गेले होते जे पॉलिथिलीन ग्लायकोल पॉलिमरसह लेपित होते, जे रक्त-मेंदूच्या अडथळ्याद्वारे उपचारात्मक डीएनए वाहून नेण्यास आणि मेंदूच्या न्यूरॉन्सपर्यंत पोहोचविण्यास सक्षम होते, जे पूर्वी अशक्य होते.
पॉलीप्लेक्सचे बनलेले आहे
सेलमध्ये डीएनए रचनांचा परिचय करून देण्यासाठी मोठे आकार(> 10 kb) पॉलीप्लेक्सेस वापरले जातात - सकारात्मक चार्ज केलेले पॉलिमर (पॉलिकेशन्स) आणि नकारात्मक चार्ज केलेले DNA रेणू असलेल्या प्रणाली. अशा कॉम्प्लेक्सचा आकार 100 एनएम पेक्षा कमी असतो, जो एकीकडे त्यांना मॅक्रोफेज पचन (200 एनएम पेक्षा मोठ्या कणांवर प्रतिक्रिया देतो म्हणून) उघड करतो आणि दुसरीकडे, ते फिल्टर न करता येण्याइतके मोठे असतात. मूत्रपिंड
पॉलीकेशन्स डीएनए रेणूला कॉम्प्लेक्समध्ये संकुचित करतात, त्यामुळे त्याची स्थिरता आणि न्यूक्लीजच्या क्रियेपासून संरक्षण सुनिश्चित होते. कॅशनिक प्रथिने, सिंथेटिक अमीनो ऍसिड होमोपॉलिमर (पॉलीलिसिन्स, पॉलीअर्जिनिन), चिटोसन पॉलिसेकेराइड, पॉलीथिलीनामाइन डीएनए-बाइंडिंग पॉलिमर म्हणून काम करू शकतात. सहसा, पॉलीप्लेक्सच्या रचनेत पॉलीकेशन जास्त असते, परिणामी हे कॉम्प्लेक्स विद्रव्य आणि सकारात्मक चार्ज होते. जर विशिष्ट सेल रिसेप्टरसाठी लिगँड पॉलीप्लेक्सशी संलग्न असेल तर डीएनए लस विशिष्ट पेशी प्रकाराकडे निर्देशित केली जाऊ शकते. पॉलीप्लेक्समध्ये अनुवांशिक सामग्रीच्या वितरणाच्या प्रक्रियेमध्ये दोन टप्प्यांचा समावेश होतो: बाह्य (इंजेक्शन साइटपासून लक्ष्य पेशींकडे जाणारा मार्ग) आणि इंट्रासेल्युलर (लक्ष्य पेशींशी संवाद, एंडोसाइटोसिस, एंडोसोम्समधून बाहेर पडणे, न्यूक्लियसमध्ये वितरण). कॉम्प्लेक्सद्वारे पार होणारा पहिला अडथळा म्हणजे रक्त आणि बाह्य पेशी मॅट्रिक्स. म्हणून, पॉलीप्लेक्सचे असे भौतिक आणि रासायनिक मापदंड त्याची स्थिरता वाढवण्यासाठी, रक्तातील प्रथिनांशी अनिष्ट संवाद टाळण्यासाठी आणि रोगप्रतिकारक प्रतिक्रिया टाळण्यासाठी निवडले जातात. रासायनिक निसर्गपॉलीकेशन एकदा लक्ष्यित पेशींमध्ये, पॉलीप्लेक्स प्लाझ्मा झिल्लीवर शोषले जाते, एंडोसाइटोसिसद्वारे शोषले जाते, त्यानंतर ते एंडोसोम सोडले पाहिजे आणि कॅशनिक पॉलिमर आणि डीएनए रेणूमध्ये वेगळे केले पाहिजे. फ्री डीएनए न्यूक्लियसमध्ये पाठविला जातो आणि पॉलिमर केशन्स सेलमधून बाहेर पडतात आणि शरीरातून उत्सर्जित होतात.
| डीएनए लसींसाठी सर्वात सामान्य वितरण पद्धतींची वैशिष्ट्ये | ||
| पद्धत | फायदे | दोष |
| इंट्रामस्क्युलर किंवा त्वचेखालील इंजेक्शन्स |
|
|
| इलेक्ट्रोपोरेशन |
|
|
| जनुक बंदूक |
|
|
| उच्च दाबामुळे परिचय |
|
|
| लिपोसोम्समध्ये पॅकेजिंग |
|
|
रोगप्रतिकारक प्रतिसादाच्या विकासाची यंत्रणा
सेलमध्ये संश्लेषित प्रतिजन प्रक्रिया होते, त्यानंतर ते रोगप्रतिकारक पेशींना सादर केले जाते. प्रक्रिया म्हणजे प्रतिजैनिक प्रथिने इम्युनोजेनिक पेप्टाइडच्या तुकड्यांमध्ये विभाजित करणे. प्रेझेंटेशन म्हणजे प्रतिरक्षाक्षम पेशींच्या प्रमुख हिस्टोकॉम्पॅटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स (MHC) च्या रेणूंशी जोडलेले प्रतिजन तुकडा सादर करणे. या रेणूंचे दोन सर्वात महत्त्वाचे वर्ग आहेत: MHC वर्ग I (MHC-I) आणि MHC वर्ग II (MHC-II). प्रत्येक वर्गाच्या रेणूंना बांधण्यासाठी, प्रतिजन सेलच्या विशेष विभागांमध्ये तयार केले जाते. अंतर्जात प्रतिजन प्रथिने डिग्रेडेशनसाठी प्रोटीझोमकडे निर्देशित केली जातात, त्यानंतर ते सेल पृष्ठभागावर MHC-I सह कॉम्प्लेक्समध्ये सादर केले जातात. येथे, जेव्हा ते भेटतात, तेव्हा ते CD8 + T-सेल्स (T-Killers) द्वारे ओळखले जातात, जे साइटोटॉक्सिक रोगप्रतिकारक प्रतिक्रिया लागू करतात. एक्सोजेनस प्रथिने लाइसोम्निमल प्रोटीसेसद्वारे क्लीव्ह केली जातात, MHC-II मध्ये समाविष्ट केली जातात आणि CD4+ T-cell (T-helper) रिसेप्टर्सद्वारे ओळखली जातात. नंतरचे कारण सेल्युलर आणि विनोदी प्रतिसाद दोन्ही.
MHC-I मार्गाद्वारे प्रतिजन सादरीकरण
डीएनए लसीकरण प्रदान करते अंतर्जात संश्लेषणप्रतिजन, म्हणून हा मार्ग प्रबळ आहे. MHC-I मार्गावर प्रतिजन प्रक्रिया अनेक चरणांमध्ये होते. न्यूक्लियसमध्ये संश्लेषित केलेले प्रथिने सायटोप्लाझममध्ये नेले जाते, प्रोटीसोम लहान पेप्टाइड्समध्ये क्लीव्ह केले जाते - एपिटॉप्स, जे विशेष प्रतिजन ट्रान्सपोर्टर प्रोटीन (टीएपी) द्वारे एंडोप्लाज्मिक रेटिक्युलम (ईपीआर) मध्ये हस्तांतरित केले जातात. ईपीआरमध्ये, प्रत्येक एपिटोप एमएचसी-आय रेणूसह एकत्र केला जातो, त्यानंतर तयार केलेले कॉम्प्लेक्स ग्लायकोसिलेशनसाठी गोल्गी उपकरण (एजी) कडे पाठवले जाते. तेथून, वेसिकलच्या संरचनेतील कॉम्प्लेक्स प्लाझ्मा झिल्लीकडे झुकते. प्लाझ्मा झिल्लीसह वेसिकलच्या संलयनानंतर, कॉम्प्लेक्स पेशीच्या पृष्ठभागावर दिसून येते, जिथे ते टी-किलर रिसेप्टर्सद्वारे ओळखले जाते, ज्यामध्ये सायटोटॉक्सिक क्रियाकलाप असतो.
MHC-II मार्गाद्वारे प्रतिजन सादरीकरण
पेप्टाइड्सचा मुख्य स्त्रोत जे MChS-II ला बांधतात ते बाह्य प्रथिने आहेत जे एंडोसाइटोसिसद्वारे सेलमध्ये प्रवेश करतात. तथापि, असे दिसून आले आहे की काही इंट्रासेल्युलर प्रथिने MChS-II सह कॉम्प्लेक्समध्ये देखील सादर केली जाऊ शकतात. या प्रकरणात, नवीन संश्लेषित प्रथिने, साइटोप्लाझममध्ये प्रवेश केल्यानंतर, लाइसोसोममध्ये हस्तांतरित केली जातात, जिथे ऍसिडिक प्रोटीजच्या कृती अंतर्गत प्रतिजन क्लीव्ह केले जाते. त्यानंतर, एपिटोप्स असलेले लाइसोसोम एमसीएचएस-II रेणू वाहून नेणाऱ्या वेसिकलशी जोडले जाते. युनायटेड वेसिकलच्या आत, एक एपिटोप-एमसीएचएस-II कॉम्प्लेक्स तयार होतो; प्लाझमलेमासह वेसिकलचे संलयन झाल्यानंतर, ते पेशीच्या पृष्ठभागावर आणले जाते. येथे, हे कॉम्प्लेक्स टी-हेल्पर रिसेप्टर्सद्वारे ओळखले जाते, परिणामी त्यांचे सक्रियकरण होते. यामुळे सेल्युलर (टी-किलरचे सक्रियकरण) आणि विनोदी प्रतिकारशक्ती (बी-लिम्फोसाइट्स सक्रिय करणे) या दोन्हींना उत्तेजन मिळते.
घुलनशील प्रथिने प्रतिजनांसह पारंपारिक लसीकरण हे टी-मदत्यांना एकत्रित करण्याच्या उद्देशाने आहे. टी-हेल्पर्सचा तुलनेने कमी प्रतिसाद हा डीएनए लसींचा एक तोटा आहे. तसेच, डीएनए लसींची सध्याची पिढी उच्च प्रतिपिंड टायटर्सचे उत्पादन करण्यास सक्षम नाही. टी-हेल्पर पेशींची सक्रियता वाढवण्यासाठी, प्रतिजन MChS-II मार्गाकडे पुनर्निर्देशित करणे आवश्यक आहे. हे करण्यासाठी, डीएनए लसीमध्ये लायसोसोमल लोकॅलायझेशनचा सिग्नल घातला जातो; संश्लेषित प्रतिजन लाइसोसोमकडे निर्देशित केले जाईल, याचा अर्थ असा की तो MChS-II चा मार्ग घेईल.
डीएनए लसीची कार्यक्षमता सुधारण्यासाठी धोरणे
डीएनए लसींच्या भविष्याशी संबंधित मुख्य प्रश्न त्यांची परिणामकारकता कशी वाढवायची हा आहे. विकसित डीएनए लसींना अनुकूल करण्यासाठी सध्या मोठ्या प्रमाणात अभ्यास सुरू आहेत. सोल्यूशनचा शोध दोन दिशांनी चालवला जातो: लसीची अभिव्यक्ती वाढवणे आणि एन्कोड केलेल्या प्रतिजनची इम्युनोजेनिकता वाढवणे.
ट्रान्सक्रिप्शनल घटक ऑप्टिमायझेशन
डीएनए लसीचा एक महत्त्वाचा घटक प्रवर्तक आहे. बॅक्टेरियल प्रवर्तक सस्तन प्राण्यांच्या पेशींमध्ये प्रतिजैविक अभिव्यक्तीसाठी योग्य नाहीत, म्हणून प्रवर्तक त्याऐवजी वापरले गेले. ऑन्कोजेनिक व्हायरस. आता, लसींची सुरक्षितता सुधारण्यासाठी, ते मानवी सायटोमेगॅलव्हायरस (CMV) सारख्या गैर-कार्सिनोजेनिक वस्तूंपासून प्रवर्तकांसह बदलले गेले आहेत. बहुतेक डीएनए लसींसाठी, हे प्रवर्तक इष्टतम पर्याय आहे: ते पेशींच्या विस्तृत श्रेणीमध्ये अत्यंत व्यक्त केले जाते. विशिष्ट ऊतींमधील जनुक अभिव्यक्तीसाठी, या ऊतक प्रकारासाठी विशिष्ट प्रवर्तक वापरण्याचे आश्वासन दिले जाते. उदाहरणार्थ, स्नायू CPK प्रवर्तकाचा वापर केल्याने प्रतिपिंड संश्लेषणात दहापट वाढ होते आणि CMV प्रमोटरसह समान DNA लस वापरण्यापेक्षा टी-सेल प्रतिसादाची स्थापना होते. साइटोस्केलेटल प्रथिनांपैकी एक एन्कोडिंग करणार्या डेस्मिन जनुकाच्या प्रवर्तकाने देखील मायोसाइट्समध्ये उच्च कार्यक्षमता दर्शविली. केराटिनोसाइट्स (एपिथेलियल टिश्यूच्या पेशी) मध्ये डीएनए लसीची अभिव्यक्ती वाढवण्यासाठी, मेटालोथिओनिन जनुकाचे प्रवर्तक (जड धातूंना बांधणारे प्रथिने) किंवा व्हिटॅमिन डी हायड्रॉक्सीलेज जनुक 3 वापरले जातात.
ट्रान्सक्रिप्शन इनिशिएशनचा स्तर वाढतो मागेवापर खाते शक्तिशाली प्रवर्तक आणि वर्धक,आणि समाप्ती वैशिष्ट्ये मर्यादित घटक बनू शकतात. पॉलीएडेनिलेशनची कार्यक्षमता आणि प्राथमिक आरएनए ट्रान्सक्रिप्टची प्रक्रिया पॉलीए सिग्नलच्या अनुक्रमानुसार बदलते. म्हणजेच, पॉलीएडेनिलेशन अनुक्रम प्रतिजन संश्लेषणास प्रभावित करते. उदाहरणार्थ, SV40 विषाणूचा मोठ्या प्रमाणावर वापरला जाणारा पॉलीए सिग्नल ससा β-ग्लोबिन जनुक किंवा बोवाइन ग्रोथ हार्मोन जनुकाच्या पॉलीएडेनिलेशन सिग्नलपेक्षा कमी प्रभावी आहे.
कार्यक्षम भाषांतरासाठी, सस्तन प्राणी mRNA मध्ये तथाकथित असणे आवश्यक आहे कोझाक क्रम.हा क्रम डीएनए रचनेत समाविष्ट केल्याने प्रतिजन संश्लेषणाची पातळी लक्षणीयरीत्या वाढू शकते. जेणेकरुन आरएनए पॉलिमरेझ जनुकाचा स्टॉप कोडॉन सोडू शकत नाही आणि लांबलचक प्रोटीनचे संश्लेषण होत नाही, जे नंतर योग्य शैली प्राप्त करू शकत नाही, जनुक संपुष्टात येऊ शकते दुहेरी स्टॉप लाइन.
डीएनए लसींची रचना करताना ते प्रयत्नही करतात त्याचे कोडन ऑप्टिमाइझ करा.ऑप्टिमायझेशन प्रक्रियेचा अर्थ जीन अनुक्रमात कोडन बदलणे अशा प्रकारे आहे की प्रथिनांचा अमीनो ऍसिड क्रम बदलत नाही, परंतु त्याच्या mRNA च्या अनुवादाची कार्यक्षमता वाढते. याचे कारण असे आहे की बहुतेक अमीनो ऍसिड एकापेक्षा जास्त सीमांनी कोड केलेले असतात. प्रत्येक कोडॉनचे स्वतःचे tRNA असते आणि सेलमधील वेगवेगळ्या tRNA चे प्रतिनिधित्व सारखे नसते आणि ते जीवाच्या प्रकारानुसार बदलते. कोडन अशा प्रकारे निवडले जातात की प्रतिजन संश्लेषणादरम्यान इच्छित tRNA ची उपस्थिती मर्यादित घटक बनत नाही.
प्रतिजन ऑप्टिमायझेशन
जरी रोगप्रतिकारक प्रतिसादाची ताकद डीएनए लसीच्या अभिव्यक्तीच्या पातळीशी संबंधित आहे, तथापि, प्रत्येक प्रतिजनासाठी एक विशिष्ट पठार आहे, ज्यानंतर प्रतिजैनिक प्रथिनांचे प्रमाण वाढल्यास प्रतिपिंडाचे उत्पादन वाढेल. त्याच वेळी, प्रतिजन अनुकूल करून एक मजबूत रोगप्रतिकारक प्रतिसाद प्राप्त केला जाऊ शकतो. उदाहरणार्थ, द्वारे प्रतिजन-सादर करणार्या पेशींसाठी विशिष्ट रिसेप्टरमध्ये लिगँडसह प्रतिजन एकत्र करणे.असे लिगँड हे CD40 मार्कर प्रोटीन, Fms-आकाराचे टायरोसिन किनेज-3 चे बाह्य कोशिकीय डोमेन किंवा टी-किलर प्रतिजन-4 असू शकते. लिगँड-रिसेप्टरच्या परस्परसंवादामुळे, एपीसीच्या प्रतिजैविक प्रथिने कॅप्चर करण्याची कार्यक्षमता वाढते.
प्रोटीसोम किंवा लाइसोसोममध्ये प्रतिजन ऱ्हास सुलभ करारोगप्रतिकारक प्रतिक्रिया देखील उत्तेजित करा. प्रतिजनचे प्रोटीओलिओटिक क्लीवेज वाढविण्यासाठी, त्याच्या अनुक्रमात सर्वव्यापी सिग्नल घातला जातो. कोट त्रुटी: खराब कॉल: शीर्षक नसलेल्या रेफ टॅगमध्ये इनपुट असणे आवश्यक आहे.संपूर्ण प्रतिजन ऐवजी डीएनए लसी एन्कोडिंगचा वापर, वेगवेगळ्या उत्पत्तीचे अनेक एपिटोप्स,आपल्याला रोगप्रतिकारक प्रतिसादाच्या स्पेक्ट्रमचा लक्षणीय विस्तार करण्यास अनुमती देते.
अँटीट्यूमर डीएनए लसींसाठी, संयोजन प्रभावी आहे "ट्यूमर प्रतिजन + व्हायरल किंवा बॅक्टेरियल प्रतिजन".उदाहरणार्थ, टिटॅनस टॉक्सिन एपिटोपसह ट्यूमर प्रतिजनचे संयोजन कर्करोगाच्या पेशींविरूद्ध किलर टी पेशींच्या सक्रियतेमध्ये लक्षणीय वाढ करते.
सहायकांचा समावेश
पारंपारिक लस वापरताना, रोगप्रतिकारक प्रतिसाद वाढविण्यासाठी त्यांच्यामध्ये सहायक जोडले जातात. डीएनए लस जिवाणू उत्पत्तीची आहे, म्हणून ती स्वतः एक इम्युनोस्टिम्युलंट आहे. रोगप्रतिकारक प्रतिसाद वाढविण्यासाठी, सहायक जीन्स डीएनए लसीमध्ये घातली जातात किंवा अतिरिक्त प्लास्मिड वापरला जातो जो इम्युनोस्टिम्युलेटरी प्रथिने एन्कोड करतो.
जिवाणू CpG डायन्यूक्लियोटाइड्सचा इम्युनोस्टिम्युलेटिंग प्रभाव
प्लाझमिडचे कार्य केवळ पेशींना जीन्स पोहोचवण्यापुरते मर्यादित नाही. 1893 मध्ये, असे आढळून आले की जिवाणू लायसेट्सचे मिश्रण कर्करोगाच्या ट्यूमरची प्रगती कमी करते, परंतु 1983 पर्यंत हे स्थापित झाले नाही की लाइसेटचे इम्युनोस्टिम्युलेटरी गुणधर्म बॅक्टेरियाच्या डीएनए रेणूंमुळे होते. 1995 मध्ये, हे दर्शविले गेले की रोगप्रतिकारक उत्तेजना जिवाणू DNA मध्ये CpG motifs मुळे होते. जिवाणूंमध्ये, तसेच डीएनए विषाणूंमध्ये, हे आकृतिबंध नॉन-मिथाइलेटेड असतात. मानवांमध्ये आणि उच्च प्राइमेट्समध्ये, त्याउलट, बहुतेक CpG डायन्यूक्लियोटाइड्समधील सायटोसिनमध्ये मिथाइल गट असतो. म्हणून, CpG नॉन-मेथिलेशन आकृतिबंध मानवी शरीराद्वारे रोगजनक-संबंधित आण्विक नमुना (PAMPs) म्हणून समजले जातात. रामरी संयुगे टोल-सारख्या रिसेप्टर्सद्वारे ओळखले जातात, जे लिगँडच्या प्रकारावर अवलंबून, अनेक प्रकारांमध्ये विभागले जातात. CpG unmethylation motifs B lymphocytes, dendritic पेशी आणि नैसर्गिक किलर पेशींच्या एंडोप्लाज्मिक रेटिक्युलम झिल्लीवर स्थित TLR-9 रिसेप्टरद्वारे ओळखले जातात. रिसेप्टरला नॉन-मेथिलेटेड CpG आकृतिबंधांमध्ये बांधून प्रतिक्रियांचे कॅस्केड ट्रिगर करते ज्यामुळे प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स - इंटरफेरॉन-1 आणि IL-12 चे संश्लेषण होते.
साइटोकिन्स आणि इतर इम्युनोमोड्युलेटर्सची अभिव्यक्ती
डीएनए लसीकरणासाठी, सायटोकाइन जीन्स बहुतेकदा सहायक म्हणून वापरली जातात. साइटोकाइन्स हा प्रथिने रेणूंचा एक वर्ग आहे जो शरीरातील इंटरसेल्युलर आणि इंटरसिस्टम परस्परसंवादाचे नियमन करतो, विशेषतः, रोगप्रतिकारक प्रणालीचे कार्य. सर्व साइटोकाइन्स, आणि त्यापैकी 30 पेक्षा जास्त ज्ञात आहेत, रोगप्रतिकारक प्रतिक्रिया सुधारू शकतात. सायटोकिन्स IL2, IL-12, इंटरफेरॉन γ, IL-15, IL-18 आणि IL-23 चा प्रथम श्रेणीतील टी-मदतकांवर उत्तेजक प्रभाव पडतो. द्वितीय श्रेणीतील टी-मदतकांच्या क्रियेत बदल करणार्या सायटोकिन्समध्ये हे समाविष्ट आहे: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 I IL-13. कोणत्या प्रकारची रोगप्रतिकारक शक्ती वाढवायची आहे त्यानुसार सायटोकाइनचा प्रकार निवडला जातो.
केमोकाइन्सच्या मदतीने रोगप्रतिकारक प्रतिक्रिया वाढवणे शक्य आहे. केमोकाइन्स हे सायटोकाइन्सचे एक कुटुंब आहे ज्यामुळे रोगप्रतिकारक पेशींसह संवेदनशील पेशींचे केमोटॅक्सिस होऊ शकतात. विशेषत:, केमोकाइन रिसेप्टर्स केमोकाइन पेशींवर प्रतिजन आढळतात. केमोकाइनला त्याच्या रिसेप्टरला बांधून घेतल्याने एपीसीच्या आत अँटीजेन-केमोकाइन कॉम्प्लेक्सचा एंडोसाइटोसिस होतो. ही रणनीती अँटीव्हायरल डीएनए लसी आणि अँटीट्यूमर लसींच्या विकासासाठी प्रभावीपणे वापरली जाते.
सहायकाचे कार्य HSP70 प्रथिने (उष्मा-शॉक प्रथिने, प्रथिने) द्वारे देखील केले जाऊ शकते. उष्णतेचा धक्का). HSP70 चा इम्युनोस्टिम्युलेटरी इफेक्ट बाह्य पेशींमध्ये प्रवेश करण्याच्या आणि APC रिसेप्टर्सला बांधण्याच्या क्षमतेवर आधारित आहे. बाहेरून HSP70 वाहतूक करण्याची यंत्रणा अद्याप पूर्णपणे स्पष्ट केलेली नाही, परंतु बहुधा अनेक मार्ग आहेत - एक्सोसाइटोसिस, बाहेरून स्राव किंवा चॅनेलमधून बाहेर पडणे. HSP70 ला त्याच्या रिसेप्टरला बांधून ठेवल्याने डेंड्रिटिक सेल सक्रिय होते, प्रतिजन सादरीकरणात मध्यस्थी होते आणि केमोकाइन उत्पादनास उत्तेजन मिळते. प्रतिजन HSP70 मध्ये जोडलेले असल्यामुळे, ते बाह्य पेशींमध्ये देखील प्रवेश करते, त्यामुळे ते MES-II मार्गाद्वारे सादर केले जाऊ शकते आणि B पेशी सक्रिय करू शकतात. डीएनए लस स्वयंप्रतिकार प्रतिक्रिया टाळण्यासाठी जिवाणू HSP70 जनुक वापरतात.
डीएनए लसींचे फायदे आणि तोटे
डीएनए लसीकरण पद्धतीचे अनेक फायदे आहेत, त्यापैकी सर्वात महत्त्वाचे म्हणजे विनोदी आणि सेल्युलर रोगप्रतिकारक प्रतिसादांना चालना देणे. डीएनए-आधारित लस दीर्घकालीन प्रतिजन अभिव्यक्ती प्रदान करतात आणि त्यानुसार, एक स्थिर रोगप्रतिकारक प्रतिसाद देतात. डीएनए लसीकरणाच्या विकासास चालना देणार्‍या अतिरिक्त घटकांमध्ये लस निर्मितीची सुलभता आणि कमी खर्च यांचा समावेश होतो.
| फायदे | दोष |
|---|---|
|
|
डीएनए लसींचा वापर
डीएनए लसींच्या पहिल्या नैदानिक अभ्यासांनी, नवीन पद्धतीच्या सुरक्षिततेसह, त्याची कमी कार्यक्षमता दर्शविली. डीएनए लसीकरणाचे वचन लक्षात घेऊन, वैज्ञानिक प्रयोगशाळांनी, बायोटेक कंपन्यांसह, नवीन पद्धतीला अनुकूल करण्यासाठी त्यांचे प्रयत्न निर्देशित केले आणि काही वर्षांतच लक्षणीय प्रगती झाली. 2005 मध्ये, पहिल्या DNA लसीला FDA ची मान्यता मिळाली. अन्न आणि औषध प्रशासन)प्राण्यांमध्ये वापरण्यासाठी. 2013 पर्यंत, शंभराहून अधिक डीएनए लसी क्लिनिकल चाचण्यांमध्ये आहेत आणि चार डीएनए लसी प्राण्यांच्या उत्पादनात वापरण्यासाठी परवानाकृत आहेत.
पशुवैद्यकीय औषधांमध्ये डीएनए लस
चारही FDA-मंजूर लसी प्लास्मिड्सवर आधारित आहेत. त्यापैकी तीनसाठी, निर्मात्याने प्रशासनाच्या पद्धतीची शिफारस केली - इंट्रामस्क्युलरली, लाइफटाइड® लसीसाठी - इलेक्ट्रोपोरेशनसह एकत्रित इंजेक्शन. जर उर्वरित लस रोगप्रतिकारक शक्ती सक्रिय करण्याच्या उद्देशाने असतील, तर LifeTide® लसीसाठी, इम्युनोस्टिम्युलेटरी प्रभाव अतिरिक्त आहे. लसीचे उत्पादन म्हणजे सोमॅटोलिबेरिन, हा हार्मोन जो पिट्यूटरी ग्रंथीद्वारे वाढ हार्मोन आणि प्रोलॅक्टिन सोडण्यास उत्तेजित करतो. डुकरांमध्ये शेवटच्या दोन संप्रेरकांच्या कृतीमुळे प्राण्यांच्या वस्तुमानात वाढ होते आणि केरांच्या संख्येत वाढ होते. त्याच वेळी, प्राण्यांमध्ये प्लाझमिड एन्कोडिंग सोमाटोलिबेरिनचा परिचय टी-लिम्फोसाइट्स, नैसर्गिक किलरचे उत्पादन उत्तेजित करते आणि त्यामुळे शरीराची रोगप्रतिकारक शक्ती वाढते.
| लसीचे ब्रँड नाव | परवान्याचे वर्ष | लक्ष्य | प्राणी | लस उत्पादन | लसीचा उद्देश |
|---|---|---|---|---|---|
| West Nile-Innovator® (USA) | 2005 | वेस्ट नाईल व्हायरस | घोडे | PreM-E व्हायरसचे स्ट्रक्चरल प्रोटीन | व्हायरसपासून संरक्षण |
| Apex-IHN® (कॅनडा) | 2005 | हेमॅटोपोएटिक ऊतकांच्या संसर्गजन्य नेक्रोसिसचे कारक एजंट | सॅल्मन कुटुंबातील मासे | विषाणूजन्य ग्लायकोप्रोटीन | माशांच्या अन्नाचे प्रमाण आणि गुणवत्ता वाढवणे |
| LifeTide® SW 5 (ऑस्ट्रेलिया) | 2008 | वाढ संप्रेरक | डुक्कर आणि इतर पशुधन | डुक्कर somatoliberin | पेरण्यांमध्ये वाढलेली कचरा; प्रसूतिपूर्व मृत्यू आणि विकृतीत घट लक्षणीयरीत्या कमी करते |
| ONCEPT® (यूएसए) | 2010 | मेलेनोमा | कुत्रे | मानवी टायरोसिनेज | रेडिओथेरपीचा पर्याय म्हणून आणि सर्जिकल हस्तक्षेपमेलेनोमाच्या उपचारात |
डीएनए लसीकरणाची शक्यता
कर्करोग डीएनए लस
सेल्युलर आणि विनोदी प्रतिरक्षा प्रतिसादाचा समावेश खात्रीपूर्वक दर्शविला गेला आहे परदेशी प्रतिजनसंबंधित संसर्गजन्य रोग, कर्करोगाच्या उपचारांसाठी डीएनए लसींचा वापर आतापर्यंत कमी यशस्वी झाला आहे. प्रभावी अँटीट्यूमर रोग प्रतिकारशक्ती निर्माण करणे हे एक कठीण काम आहे. क्लिनिकल संशोधनअँटीट्यूमर डीएनए लसींची संपूर्ण सुरक्षितता आणि कमी विषारीपणाची पुष्टी केली, तथापि, त्यांनी प्राप्त केलेल्या रोगप्रतिकारक प्रतिसादाची प्रभावीता कमकुवत असल्याचे दिसून आले आणि काही प्रकरणांमध्ये, ट्यूमरविरोधी क्रियाकलाप सामान्यतः संशयास्पद आहे.
व्हायरल आणि बॅक्टेरियाच्या रोगजनकांविरूद्ध डीएनए लस
क्षय विरुद्ध डीएनए लस
बॅक्टेरियाद्वारे कर्बोदकांमधे किण्वन (ग्लायकोलिसिस) झाल्यामुळे pH मध्ये स्थानिक बदल हे कॅरीजचे कारण आहे. वुहान इन्स्टिट्यूट ऑफ व्हायरोलॉजी (चीन) च्या शास्त्रज्ञांनी क्षय रोगजनकांपैकी एकावर निर्देशित केलेली डीएनए लस विकसित केली आहे - स्ट्रेप्टोकोकस म्यूटन्स.ही लस प्लाझमिडवर आधारित आहे आणि दोन प्रथिने एन्कोड करते: पृष्ठभागावरील प्रथिने सेंट. mutans PAcआणि फ्लॅगेलिन, जिवाणू पासून साधित केलेली साल्मोनेलाजे सहायक म्हणून काम करते. प्रीक्लिनिकल अभ्यासाच्या टप्प्यावर, लस नाकाद्वारे प्रयोगशाळेतील उंदीरांना दिली गेली, त्यानंतर रक्ताच्या सीरममध्ये इम्युनोग्लोबुलिन जी आणि लाळेतील सेक्रेटरी इम्युनोग्लोबुलिन ए चे स्तर प्राण्यांमध्ये तपासले गेले. अभ्यासानंतर, शास्त्रज्ञांना असे आढळून आले की रक्त आणि लाळ दोन्हीमध्ये रोगप्रतिकारक प्रथिनांची पातळी वाढली आहे, परंतु, सर्वात महत्त्वाचे म्हणजे, वसाहतींच्या वाढीस प्रतिबंध केला गेला आहे. स्ट्रेप्टोकोकस म्यूटन्सदात मुलामा चढवणे वर. म्हणजेच, लसीकरण केलेल्या प्राण्यांचे दात क्षरणांपासून चांगले संरक्षित होते.
डीएनए लस आणि स्वयंप्रतिकार रोगांसाठी उपचार
टाइप 1 मधुमेह DNA लस
टाईप 1 डायबिटीज मेलीटस हे लॅन्गरहॅन्सच्या स्वादुपिंडाच्या बेटांमध्ये स्थित इंसुलिन-उत्पादक बीटा पेशींच्या नुकसानीद्वारे वैशिष्ट्यीकृत आहे. बीटा पेशींच्या नुकसानाचे मुख्य कारण म्हणजे किलर टी पेशींद्वारे स्वयंप्रतिकार नुकसान. अतिक्रियाशील रोगप्रतिकारक प्रणालीपासून बीटा पेशींचे संरक्षण करण्यासाठी, स्टॅनफोर्ड (यूएसए) आणि लीडेन (नेदरलँड) विद्यापीठातील शास्त्रज्ञांनी BHT-3021 DNA लस विकसित केली. ही लस प्लाझमिडच्या आधारे तयार केली गेली आहे आणि इंसुलिन पूर्ववर्ती, प्रोइनसुलिन एन्कोड करते. ही एक पूर्वलक्षी लस आहे: जर पारंपारिक लसींनी रोगप्रतिकारक प्रतिक्रिया सक्रिय केल्या पाहिजेत, तर BHT-3021, त्याउलट, लॅन्गरहॅन्सच्या बेटांवर निर्देशित टी-किलरच्या साइटोटॉक्सिक प्रभावाला तटस्थ करते.
पहिल्या टप्प्यात वैद्यकीय चाचण्या BHT-3021 ने 80 लोकांच्या गटावर त्याची प्रभावीता दर्शविली. त्यापैकी अर्ध्या लोकांना 12 आठवड्यांसाठी दर सात दिवसांनी BHT-3021 चे इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन मिळाले आणि उर्वरित अर्ध्या लोकांना प्लेसबो मिळाले. या कालावधीनंतर, लस प्राप्त झालेल्या गटाने रक्तातील सी-पेप्टाइड्सच्या पातळीत वाढ दर्शविली, जी बीटा-सेल कार्याची पुनर्संचयित करते. सहभागींपैकी एकामध्ये कोणतेही गंभीर दुष्परिणाम नोंदवले गेले नाहीत. लसीचा प्रभाव 2 महिने टिकून होता.
परिचय
1 अनुवांशिक अभियांत्रिकी एन्झाइमचे प्रमुख गट
1.1 प्रतिबंध एंजाइम
1.1.1 प्रतिबंधांच्या कृतीची यंत्रणा
1.1.2 प्रतिबंध नकाशे बांधणे
१.३ लिगासेस
2 सेलमध्ये नवीन जनुकाचा परिचय
2.1 प्रोकेरियोट्समध्ये जनुक अभिव्यक्तीचे नियमन
2.2 सेलमध्ये जनुकाचा थेट परिचय करण्यासाठी पद्धती
2.3 सस्तन प्राण्यांच्या पेशींमध्ये जनुकांचा परिचय
2.4 अनुवांशिक परिवर्तन सोमाटिक पेशीसस्तन प्राणी
2.5 जीन थेरपी
2.6 ट्रान्सजेनिक प्राणी मिळवणे
निष्कर्ष
संदर्भग्रंथ
परिचय
अनुवांशिक अभियांत्रिकी म्हणजे कार्यात्मकपणे सक्रिय अनुवांशिक संरचना (रीकॉम्बिनंट डीएनए) चे इन विट्रो बांधकाम किंवा दुसऱ्या शब्दांत, कृत्रिम अनुवांशिक कार्यक्रम (बाएव ए.ए.) तयार करणे. ई.एस. पिरुझ्यान यांच्या मते, अनुवांशिक अभियांत्रिकी ही प्रायोगिक पद्धतींची एक प्रणाली आहे जी प्रयोगशाळेत (चाचणी ट्यूबमध्ये) तथाकथित रीकॉम्बिनंट किंवा हायब्रिड डीएनए रेणूंच्या स्वरूपात कृत्रिम अनुवांशिक संरचना तयार करणे शक्य करते.
आम्ही एका पूर्वनिर्धारित कार्यक्रमानुसार, शरीराच्या बाहेर आण्विक अनुवांशिक प्रणाली तयार करण्याबद्दल बोलत आहोत आणि त्यानंतरच्या सजीवामध्ये त्यांचा परिचय करून देतो. या प्रकरणात, रीकॉम्बिनंट डीएनए बनतो अविभाज्य भागप्राप्तकर्त्याच्या जीवाचे अनुवांशिक उपकरण आणि त्यास नवीन अद्वितीय अनुवांशिक, जैवरासायनिक आणि नंतर शारीरिक गुणधर्म प्रदान करते.
अनुवांशिक अभियांत्रिकीचे उद्दिष्ट असे रीकॉम्बिनंट डीएनए रेणू तयार करणे हे आहे जे अनुवांशिक उपकरणामध्ये समाविष्ट केल्यावर, शरीराला मानवांसाठी उपयुक्त असे गुणधर्म देतील.
रिकॉम्बिनंट डीएनए तंत्रज्ञान खालील पद्धती वापरते:
निर्बंध न्यूक्लीजद्वारे डीएनएचे विशिष्ट क्लीव्हेज, वैयक्तिक जनुकांचे अलगाव आणि हाताळणी गतिमान करणे;
शुद्ध केलेल्या डीएनए तुकड्यांच्या सर्व न्यूक्लियोटाइड्सचा वेगवान अनुक्रम, जो तुम्हाला जनुकाच्या सीमा आणि त्याद्वारे एन्कोड केलेला अमीनो ऍसिड अनुक्रम निर्धारित करण्यास अनुमती देतो;
रीकॉम्बिनंट डीएनएचे बांधकाम;
न्यूक्लिक अॅसिड हायब्रिडायझेशन, जे पूरक न्यूक्लिक अॅसिड सिक्वन्स बांधण्याच्या क्षमतेवर आधारित विशिष्ट आरएनए किंवा डीएनए अनुक्रम अधिक अचूकता आणि संवेदनशीलतेसह शोधण्याची परवानगी देते;
डीएनए क्लोनिंग: पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शनद्वारे इन विट्रो अॅम्प्लीफिकेशन किंवा डीएनए तुकड्याचा जीवाणू सेलमध्ये परिचय, जे अशा परिवर्तनानंतर, लाखो प्रतींमध्ये हा तुकडा पुनरुत्पादित करते;
पेशी किंवा जीवांमध्ये रीकॉम्बिनंट डीएनएचा परिचय.
अनुवांशिक अभियांत्रिकीचा इतिहास
जैव रसायनशास्त्र आणि आण्विक अनुवंशशास्त्राच्या विविध शाखांमधील अनेक संशोधकांच्या कार्यामुळे अनुवांशिक अभियांत्रिकी प्रकट झाली. बर्याच वर्षांपासून, प्रथिने मॅक्रोमोलेक्यूल्सचा मुख्य वर्ग मानला जातो. एक गृहितक देखील होते की जीन्स प्रथिन स्वरूपाची असतात. 1944 मध्येच एव्हरी, मॅक्लिओड आणि मॅककार्थी यांनी दाखवून दिले की डीएनए आनुवंशिक माहितीचा वाहक आहे. तेव्हापासून, न्यूक्लिक अॅसिडचा गहन अभ्यास सुरू झाला. एका दशकानंतर, 1953 मध्ये जे. वॉटसन आणि एफ. क्रिक यांनी दुहेरी-अडकलेले DNA मॉडेल तयार केले. हे वर्ष आण्विक जीवशास्त्राच्या जन्माचे वर्ष मानले जाते.
1950 आणि 1960 च्या दशकाच्या शेवटी, अनुवांशिक कोडचे गुणधर्म स्पष्ट केले गेले आणि 1960 च्या अखेरीस, त्याची सार्वत्रिकता प्रायोगिकरित्या पुष्टी झाली. गेला गहन विकासआण्विक अनुवांशिकता, ज्याच्या वस्तू ई. कोलाय, त्याचे विषाणू आणि प्लास्मिड्स होत्या. अखंड डीएनए रेणू, प्लाझमिड्स आणि विषाणूंच्या अत्यंत शुद्ध केलेल्या तयारींना वेगळे करण्यासाठी पद्धती विकसित केल्या गेल्या आहेत. विषाणू आणि प्लाझमिड्सचे डीएनए जैविक पद्धतीने पेशींमध्ये आणले गेले सक्रिय फॉर्म, त्याची प्रतिकृती आणि संबंधित जीन्सची अभिव्यक्ती सुनिश्चित करणे. 70 च्या दशकात, अनेक एंजाइम शोधले गेले जे डीएनए परिवर्तनाच्या प्रतिक्रियांना उत्प्रेरित करतात. अनुवांशिक अभियांत्रिकी पद्धतींच्या विकासामध्ये निर्बंध एंझाइम आणि डीएनए लिगासेस विशेष भूमिका बजावतात.
अनुवांशिक अभियांत्रिकीच्या विकासाचा इतिहास तीन टप्प्यात विभागला जाऊ शकतो. पहिला टप्पा विट्रोमध्ये रीकॉम्बीनंट डीएनए रेणू मिळविण्याच्या मूलभूत शक्यतेच्या पुराव्यासह जोडलेला आहे. ही कामे वेगवेगळ्या प्लाझमिड्समधील संकरित उत्पादनाशी संबंधित आहेत. पासून मूळ डीएनए रेणू वापरून रीकॉम्बिनंट रेणू तयार करण्याची शक्यता विविध प्रकारचेआणि बॅक्टेरियाचे प्रकार, त्यांची व्यवहार्यता, स्थिरता आणि कार्यप्रणाली.
दुसरा टप्पा प्रोकेरिओट्स आणि विविध प्लाझमिड्सच्या क्रोमोसोमल जनुकांमधील रीकॉम्बीनंट डीएनए रेणू मिळविण्याच्या कामाच्या प्रारंभाशी संबंधित आहे, त्यांची स्थिरता आणि व्यवहार्यता सिद्ध करते.
तिसरा टप्पा म्हणजे युकेरियोटिक जीन्स, प्रामुख्याने प्राण्यांच्या जनुकांचा, वेक्टर डीएनए रेणूंमध्ये (डीएनए जीन ट्रान्सफरसाठी वापरला जातो आणि प्राप्तकर्त्याच्या सेलच्या अनुवांशिक उपकरणामध्ये समाकलित होण्यास सक्षम) मध्ये समाविष्ट करण्याच्या कामाची सुरुवात आहे.
औपचारिकपणे, अनुवांशिक अभियांत्रिकीची जन्मतारीख 1972 मानली पाहिजे, जेव्हा पी. बर्ग, एस. कोहेन, एच. बॉयर आणि सहकर्मचाऱ्यांनी स्टॅनफोर्ड येथे SV40 विषाणू, बॅक्टेरियोफेज आणि ई. कोलाईचे डीएनए तुकडे असलेले पहिले रीकॉम्बिनंट डीएनए तयार केले. विद्यापीठ.
1 अनुवांशिक अभियांत्रिकी एन्झाइमचे प्रमुख गट
अनुवांशिक अभियांत्रिकी हे आण्विक अनुवांशिकतेचे वंशज आहे, परंतु त्याचा जन्म अनुवांशिक एन्झाइमोलॉजी आणि न्यूक्लिक अॅसिड रसायनशास्त्राच्या यशामुळे झाला आहे, कारण एन्झाईम हे आण्विक हाताळणीचे साधन आहेत. जर आपण कधीकधी मायक्रोमॅनिपुलेटर्ससह पेशी आणि सेल्युलर ऑर्गेनेल्ससह कार्य करू शकलो, तर डीएनए आणि आरएनए मॅक्रोमोलेक्यूल्ससह कार्य करताना नाही, अगदी लहान मायक्रोसर्जिकल उपकरणे देखील मदत करतील. काय करायचं? एन्झाईम्स "स्कॅल्पेल", "कात्री" आणि "स्टिचिंगसाठी धागे" म्हणून कार्य करतात.
केवळ तेच न्यूक्लियोटाइड्सचे विशिष्ट क्रम शोधू शकतात, तेथे एक रेणू "कट" करू शकतात किंवा त्याउलट, डीएनए साखळीतील छिद्र "रफ़ू" करू शकतात. हे एन्झाईम दीर्घकाळ सेलमध्ये कार्यरत आहेत, पेशी विभाजनादरम्यान डीएनएची प्रतिकृती (दुप्पट) करणे, नुकसान दुरुस्त करणे (रेणूची अखंडता पुनर्संचयित करणे), जनुकीय माहिती वाचणे आणि सेलमधून सेलमध्ये हस्तांतरित करणे. किंवा सेलच्या आत. अनुवांशिक अभियंत्याचे कार्य एंजाइम निवडणे आहे जे कार्य सेट पूर्ण करेल, म्हणजेच ते न्यूक्लिक अॅसिडच्या विशिष्ट विभागासह कार्य करू शकेल.
हे लक्षात घेतले पाहिजे की अनुवांशिक अभियांत्रिकीमध्ये वापरले जाणारे एन्झाईम प्रजाती-विशिष्ट नसतात, म्हणून प्रयोगकर्ता त्याच्याद्वारे निवडलेल्या अनुक्रमात कोणत्याही उत्पत्तीच्या डीएनए तुकड्यांना एकत्रित करू शकतो. हे अनुवांशिक अभियांत्रिकी निसर्गाद्वारे स्थापित केलेल्या प्रजातींच्या अडथळ्यांवर मात करण्यास आणि आंतरविशिष्ट क्रॉसिंग करण्यास अनुमती देते.
रीकॉम्बीनंट डीएनएच्या निर्मितीमध्ये वापरल्या जाणार्या एन्झाईम्सना अनेक गटांमध्ये विभागले जाऊ शकते:
डीएनए तुकड्यांची निर्मिती करणारे एन्झाइम्स (प्रतिबंध एंझाइम);
डीएनए (पॉलिमरेझ) किंवा आरएनए (रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस) टेम्पलेटवर डीएनएचे संश्लेषण करणारे एन्झाईम्स;
डीएनए तुकड्यांना जोडणारे एन्झाइम्स (लिगेसेस);
एन्झाईम्स जे डीएनए तुकड्यांच्या टोकांची रचना बदलणे शक्य करतात.
1.1 प्रतिबंध एंजाइम
हे सामान्यतः स्वीकारले जाते की "प्रतिबंध एंझाइम", "प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिझ" आणि "साइट विशिष्ट एंडोडिओक्सायरिबोन्यूक्लिझ" या शब्द समानार्थी मानले जातात.
सर्व जिवाणू प्रतिबंध एंडोन्यूक्लीसेस विशिष्ट, ऐवजी लहान डीएनए अनुक्रम ओळखतात आणि त्यांना बांधतात. या प्रक्रियेसोबत डीएनए रेणू एकतर ओळखीच्या ठिकाणी किंवा इतर कोणत्याही साइटवर कापला जातो, जो एंजाइमच्या प्रकाराद्वारे निर्धारित केला जातो. प्रतिबंधात्मक क्रियाकलापांसह, जिवाणूच्या ताणामध्ये डीएनए मेथिलेट करण्याची क्षमता असते; ही प्रक्रिया निर्बंधांप्रमाणेच डीएनए अनुक्रमांसाठी समान विशिष्टतेद्वारे दर्शविली जाते. ज्या ठिकाणी प्रतिबंधक एंझाइम बांधला जातो त्याच ठिकाणी मिथिलेस अॅडेनाइन किंवा सायटोसिनच्या अवशेषांमध्ये मिथाइल गट जोडते. मेथिलेशनच्या परिणामी, साइट निर्बंधासाठी प्रतिरोधक बनते. म्हणून, मेथिलेशन डीएनए कापण्यापासून संरक्षण करते.
प्रतिबंधांचे 3 मुख्य वर्ग आहेत: 1, 2 आणि 3.
सर्व निर्बंध एंझाइम दुहेरी-असरलेल्या DNA वर काटेकोरपणे परिभाषित अनुक्रम ओळखतात, परंतु 1ल्या वर्गाचे प्रतिबंधक एंझाइम डीएनए रेणूच्या अनियंत्रित बिंदूंवर ब्रेक करतात आणि 2रे आणि 3र्‍या वर्गाचे प्रतिबंधक एन्झाईम्स काटेकोरपणे परिभाषित बिंदूंवर डीएनए ओळखतात आणि तोडतात. ओळख साइट्स किंवा त्यांच्यापासून निश्चित अंतरावर. अंतर.
प्रकार 1 आणि 3 च्या एन्झाईम्समध्ये एक जटिल सब्यूनिट रचना असते आणि त्यात दोन प्रकारचे क्रियाकलाप असतात - सुधारणे (मेथिलेटिंग) आणि एटीपी-आश्रित एंडोन्यूक्लिझ.
द्वितीय श्रेणीतील एन्झाईम्समध्ये 2 स्वतंत्र प्रथिने असतात: एक निर्बंध एंडोन्यूक्लिझ आणि एक सुधारित मेथिलेझ, म्हणून, अनुवांशिक अभियांत्रिकीमध्ये फक्त वर्ग 2 एन्झाईम वापरल्या जातात. त्यांना कॉफॅक्टर म्हणून मॅग्नेशियम आयन आवश्यक आहेत.
सध्या, 500 पेक्षा जास्त वर्ग 2 प्रतिबंध वेगळे केले गेले आहेत, तथापि, विविध सूक्ष्मजीवांपासून विलग केलेल्या एन्झाईम्समध्ये, डीएनएवर समान अनुक्रम ओळखणारे काही आहेत. अशा जोड्या किंवा गटांना आयसोस्किझोमर म्हणतात. खरा आयसोस्किझोमेरिझम ओळखला जातो, जेव्हा एंजाइम समान न्यूक्लियोटाइड क्रम ओळखतात आणि त्याच बिंदूंवर डीएनए खंडित करतात आणि खोटे, जेव्हा एन्झाईम्स, डीएनएवर समान साइट ओळखतात, त्याच ठिकाणी वेगवेगळ्या बिंदूंवर ब्रेक करतात.
बहुतेक वर्ग 2 प्रतिबंधक 4 ते 6 न्यूक्लियोटाइड जोड्या असलेले अनुक्रम ओळखतात, म्हणून प्रतिबंध लहान- आणि मोठ्या-कट मध्ये विभागले जातात. स्मॉल-कटिंग रिस्ट्रिक्शन एन्झाइम टेट्रान्यूक्लियोटाइड ओळखतात आणि सहा न्यूक्लियोटाइड जोड्यांचा क्रम ओळखणाऱ्या मोठ्या-कटिंग रिस्ट्रिक्शन एन्झाईम्सपेक्षा रेणूंमध्ये जास्त ब्रेक लावतात. हे या वस्तुस्थितीमुळे आहे की चार न्यूक्लियोटाइड्सच्या विशिष्ट क्रमाच्या घटनेची संभाव्यता सहा न्यूक्लियोटाइड्सच्या अनुक्रमापेक्षा खूप जास्त आहे. उदाहरणार्थ, बॅक्टेरियोफेज T7 च्या 40,000 bp DNA मध्ये E. coli पासून R1 द्वारे ओळखल्या जाणार्या क्रमाचा अभाव आहे.
लहान-विभाजन प्रतिबंधांमध्ये Hpa II आणि Alu (आर्थ्रोबॅक्टर ल्यूटसपासून), मोठे-विभाजन - Eco R I (Escherichia coli पासून) आणि Hind III यांचा समावेश होतो. जर आपण असे गृहीत धरले की निर्बंध एंझाइम ओळखण्याची ठिकाणे डीएनए साखळीसह यादृच्छिकपणे वितरीत केली गेली आहेत, तर चार न्यूक्लियोटाइड्सचा क्रम (साइट) ओळखणाऱ्या एन्झाईम्सचे लक्ष्य प्रत्येक 256 बेस जोड्यांमध्ये सरासरी 1 वेळा आणि सहा न्यूक्लियोटाइड्स ओळखणाऱ्या एन्झाईम्ससाठी, नंतर. 4096 बेस जोड्या. जर निर्बंध स्थळ जनुकाच्या आत असेल, तर डीएनए प्रतिबंध एंझाइमसह उपचार केल्याने ते निष्क्रिय होईल. लहान-कटिंग प्रतिबंधकांसह उपचार केल्यावर अशा घटनेची संभाव्यता खूप जास्त असते आणि मोठ्या-कटिंग एंडोन्यूक्लीज वापरताना नगण्य असते. म्हणून, एक अखंड जनुक प्राप्त करण्यासाठी, अनेक मोठ्या-कटिंग प्रतिबंधांद्वारे क्लीवेज वैकल्पिकरित्या चालते किंवा "अंडरस्ट्रिक्शन" पद्धत वापरली जाते, उदा. निर्बंध अशा परिस्थितीत केले जातात जेथे क्लीवेज फक्त एका साइटवर होते.
रिकॉम्बिनंट डीएनए प्राप्तकर्त्याच्या पेशींमध्ये सादर केला जातो. अनुवांशिक अभियांत्रिकीमध्ये, अशा प्राप्तकर्त्या पेशी दोन भूमिका बजावतात. 1. ते जनुक बँकेत संश्लेषित रीकॉम्बिनंट डीएनएचे क्लोन शोधणे शक्य करतात. 2 त्यानंतर, अशा प्राप्तकर्त्या सेलचा वापर लक्ष्य उत्पादने मिळविण्यासाठी केला जाऊ शकतो.
असा रीकॉम्बिनंट डीएनए कोणत्या प्रकारचा व्हेक्टर मिळाला आणि कोणत्या जीवांच्या पेशींमध्ये सेल किंवा प्रोटोप्लास्टचे रूपांतर करून किंवा इलेक्ट्रोपोरेशन पद्धती वापरून त्याचा परिचय करून देणे आवश्यक आहे, या आधारावर रीकॉम्बिनंट डीएनए सादर करण्याची पद्धत विचारात घेतली जाते. फेजेसच्या आधारे रिकॉम्बिनंट डीएनए प्राप्त झाल्यास, ते वेगळ्या डीएनएमध्ये सादर केले जाऊ शकते - हे ट्रान्सव्हेक्शन आहे. अखंड फेज कणांचा परिचय करणे शक्य आहे - हे एक संक्रमण आहे (कॉस्मिड्स, फास्मिड्स).
डॉ. अनुवांशिक देवाणघेवाण पद्धती - संयुग्मन, ट्रान्सडक्शन.
वनस्पती पेशींमध्ये - वनस्पतींच्या प्रोटोप्लास्ट्सचे परिवर्तन, वनस्पती पेशी किंवा ऊतींचे पुनर्संयोजक डीएनए सह उपचार; न्यूक्लियसमध्ये रीकॉम्बिनंट डीएनएचे इंजेक्शन मोठ्या प्रमाणावर वापरले जातात; लिपोसोमचा वापर. लिपोसोम्स गोलाकार रचना असतात ज्यात लिपिड शेल असते, ज्याच्या आत रीकॉम्बिनंट डीएनए असतो. प्राण्यांच्या पेशींमध्ये प्रवेश करण्यासाठी - व्हायरल इन्फेक्शन, इलेक्ट्रोपोरेशन पद्धत, न्यूक्लियसमध्ये मायक्रोइंजेक्शन. जर, रीकॉम्बिनंट डीएनएच्या परिचयानंतर, शरीरातील सर्व पेशींना त्याचा वारसा मिळाला, तर एक ट्रान्सजेनिक जीव मिळविण्याबद्दल बोलतो.
इलेक्ट्रोपोरेशन - पेशी किंवा प्रोटोप्लास्ट थोड्या काळासाठी उच्च व्होल्टेज करंट (2000-4000 व्होल्ट) च्या संपर्कात येतात. परिणामी, पेशीच्या पडद्यामध्ये सुमारे छिद्रे तयार होतात. 30 एनएम, जे 1-2 मिनिटांसाठी अस्तित्वात असू शकते आणि ज्याद्वारे रीकॉम्बिनंट डीएनए सेलमध्ये प्रवेश करू शकतो. नंतर छिद्र बंद होतात आणि डीएनए सेलमध्ये राहतो. हा एक सार्वत्रिक मार्ग आहे.
बॅलिस्टिक पद्धत- प्रामुख्याने युकेरियोट्समध्ये वापरले जाते. बॅलिस्टिक गन वापरल्या जातात ज्यामध्ये AK किंवा W कण येतात, ज्यावर रीकॉम्बिनंट डीएनए फवारला जातो. नंतर, P येथे अक्रिय वायूंच्या मदतीने, अशा कणांना बंदुकीतून सेल कल्चरमध्ये सोडले जाते. विविध नमुन्यांनुसार, काही कण न्यूक्लियसमध्ये प्रवेश करतात आणि रीकॉम्बिनंट डीएनए तेथे टिकून राहतात.
रीकॉम्बीनंट डीएनए सह क्लोन शोधा.
हा टप्पा कठीण आणि अप्रत्याशित आहे.
सर्वात सोपी पद्धत म्हणजे रीकॉम्बीनंट डीएनएच्या परिचयानंतर फिनोटाइपद्वारे क्लोन शोधणे.(उदा. रंगद्रव्य). पूरक चाचण्या वापरल्या जाऊ शकतात, परंतु सक्रिय उत्पादनाच्या संश्लेषणामध्ये दोषपूर्ण उत्परिवर्ती पेशी असणे आवश्यक आहे.
हायब्रिडायझेशन पद्धती - विशिष्ट लेबल केलेल्या डीएनए किंवा आरएनए प्रोबची उपस्थिती आवश्यक आहे. अधिक वेळा त्यांना पी 32 ने लेबल केले जाते. प्रोब्स म. शोधलेल्या जनुकाच्या सर्वात पुराणमतवादी भागाशी संबंधित लहान ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड अनुक्रम. या संरक्षित अनुक्रमांमध्ये प्रोकेरियोट्ससाठी 100 पर्यंत न्यूक्लियोटाइड्स आणि युकेरियोट्ससाठी 1000 पर्यंत समाविष्ट असू शकतात.
रीकॉम्बीनंट डीएनएच्या परिचयानंतर, माध्यमावर तयार झालेल्या वसाहती एका विशेष नायट्रोसेल्युलोज फिल्टरमध्ये हस्तांतरित केल्या जातात. त्यांना अल्कली वापरून लिसिस आणि त्यानंतरच्या डीएनए विकृतीकरणाच्या अधीन केले जाते. डीएनए फिल्टरला जोरदार बांधतो. फिल्टर धुऊन त्यावर रेडिओअॅक्टिव्ह लेबल असलेल्या प्रोबने प्रक्रिया केली जाते आणि या प्रोबने ज्या क्लोनशी संपर्क साधला आहे ते निश्चित केले जाते.
इम्यूनोकेमिकल पद्धती - रीकॉम्बीनंट डीएनएच्या परिचयानंतर क्लोन लायज्ड केले जातात आणि संबंधित उत्पादनास अँटीबॉडीजसह उपचार केले जातात. या प्रतिपिंडांना लेबल केले जाते.
जिवाणू पेशीमध्ये रीकॉम्बिनंट डीएनएचा परिचय करून देण्याची प्रक्रिया म्हणतात परिवर्तन. परिवर्तनाचा परिणाम म्हणजे होस्ट सेलद्वारे नवीन डीएनए अनुक्रमांचे संपादन आणि परिणामी, नवीन फिनोटाइपिक गुणधर्म, उदाहरणार्थ, विशिष्ट प्रतिजैविकांना प्रतिकार. अशा प्रयोगांमध्ये वापरल्या जाणार्या यजमान सेलमध्ये विशिष्ट फिनोटाइप असणे आवश्यक आहे आर-, म्हणजे त्यात निर्बंध एंझाइम नसावेत; ते सामान्य पुनर्संयोजनासाठी अक्षम असणे आवश्यक आहे ( recA-)जेणेकरुन एक्सोजेनस डीएनए होमोलोगस रीकॉम्बिनेशनद्वारे सुधारित होणार नाही. या उद्देशासाठी सर्वात मोठ्या प्रमाणावर वापरल्या जाणार्या संस्कृतींपैकी एक म्हणजे जीवाणूंचा प्रयोगशाळा ताण. ई कोलाय्- K12 ताण.
परकीय डीएनए शोषू शकणार्‍या पेशींना म्हणतात सक्षमयोग्यता ई कोलाय्प्रेरित करणे आवश्यक आहे, आणि इतर काही जीवाणूंमध्ये ही मालमत्ता सुरुवातीला असते. विशेष पोषक माध्यम किंवा संस्कृती परिस्थिती वापरून सक्षम पेशींचे प्रमाण वाढवता येते. योग्यतेच्या रासायनिक प्रेरकांना प्रतिरोधक किंवा नैसर्गिक क्षमता नसलेल्या जीवाणूंसाठी, इतर डीएनए वितरण प्रणाली वापरल्या जातात.
प्रयोगशाळेच्या प्रॅक्टिसमध्ये जिवाणू पेशींच्या परिवर्तनासाठी सर्वात सामान्यपणे वापरल्या जाणार्या पद्धती आहेत:
परिवर्तन ई कोलाय्कॅल्शियम क्लोराईड उपचार करून;
इलेक्ट्रोपोरेशन- ~4.5 ms च्या कालावधीसह वर्तमान नाडीच्या प्रभावाखाली सेल पारगम्यतेमध्ये वाढ;
परिवर्तनाचे परिणाम परिमाण केले जाऊ शकतात: एकतर निर्धारित करून वारंवारता, किंवा कार्यक्षमतापरिवर्तने
परिवर्तन वारंवारतासेल लोकसंख्येतील पेशींचे प्रमाण आहे ज्यांना परदेशी डीएनए प्राप्त झाला आहे; पेशींच्या एकूण संख्येत ट्रान्सफॉर्मंटची संख्या म्हणून व्यक्त केले जाते.
परिवर्तन कार्यक्षमता- परिवर्तनासाठी घेतलेल्या DNA च्या प्रति 1 µg ट्रान्सफॉर्मंटची संख्या.
या विभागात सादर केलेल्या pBR322 प्लास्मिड वेक्टरचा वापर करून रीकॉम्बिनंट डीएनए क्लोनिंगची माहिती प्रायोगिक योजनेच्या स्वरूपात सारांशित केली आहे आणि आकृती 20 मध्ये सादर केली आहे.
तांदूळ. 20. प्लाझमिड वेक्टर pBR322 मध्ये DNA चे क्लोनिंग
1, 2, 3, 4 आणि 5 - क्लोनिंग प्रक्रियेचे टप्पे (मजकूर पहा).
1. pBR322 DNA एम्पीसिलिन रेझिस्टन्स साइटवर प्रतिबंध एंडोन्यूक्लीज PstI सह कापला जातो.
2. दाता DNA चे तुकडे, PstI वापरून मिळवलेले आणि चिकट टोके असलेले, रेखीय pBR322 वेक्टर सारखे, DNA ligase वापरून वेक्टर DNA ला बांधलेले असतात. अशा रचना तयार होण्याचा परिणाम म्हणजे एम्पीसिलिनला प्रतिकार प्रदान करणार्या जनुकाचा नाश. अशाप्रकारे, पेशींमध्ये सादर केल्यावर पुन्हा संयोजक डीएनए तयार केला जातो ई कोलाय्एम्पीसिलीनच्या सहाय्याने त्यांचे अस्तित्व सुनिश्चित करण्यात सक्षम होणार नाही.
3. पेशी ई कोलाय्रीकॉम्बीनंट डीएनए सह परिवर्तन.
4. परिवर्तन प्रक्रियेनंतर, सेल सस्पेंशन आगर प्लेट्सवर आणि प्रतिजैविक टेट्रासाइक्लिन असलेल्या पोषक माध्यमांवर प्लेट केले जाते. या टप्प्यावर, निवड होते, म्हणजे. टेट्रासाइक्लिन असलेल्या माध्यमावर वाढू शकणार्‍या पेशींची निवड. या आगरवर वाढलेल्या पेशींमध्ये रीकॉम्बिनंट डीएनए आणि पीबीआर३२२ डीएनए असतो, ज्यामध्ये दात्याचा डीएनए समाविष्ट नसतो; वेक्टरची मूळ रचना पुनर्संचयित केली.
5. वैयक्तिक सेल वसाहती ई कोलाय्टेट्रासाइक्लिन उपसंस्कृती असलेल्या कपवर दोन कप कपांवर उगवले जाते, त्यापैकी एक अॅम्पीसिलीनसह आगर असतो आणि दुसरा टेट्रासाइक्लिन असतो. रीकॉम्बीनंट प्लाझमिड डीएनए असलेल्या पेशी केवळ टेट्रासाइक्लिन आगरवर वाढतात, कारण एम्पीसिलिनला प्रतिकार देणारे जनुक दात्याच्या डीएनएच्या प्रवेशामुळे नष्ट होते. मूळ पासून पेशी असताना, i.e. पुनर्प्राप्त pBR322 व्हेक्टर डीएनए दोन्ही प्लेट्सवर वाढतात, कारण दोन्ही प्रतिजैविकांना प्रतिकार करणारी जनुके मूळमध्ये असतात, म्हणजे. मूळ स्थितीत.
निवडलेल्या क्लोनच्या पेशींमधून ई कोलाय्प्लास्मिड डीएनए काढा आणि त्याच्या संरचनेचे विश्लेषण करा.
इतर प्लास्मिड वेक्टर
1980 च्या दशकाच्या अगदी सुरुवातीला बोलिव्हर आणि रॉड्रिग्ज यांनी सुरू केलेला pBR322 वेक्टरचा युग आजही चालू आहे. तथापि, त्याच्या सर्व विश्वासार्हतेसाठी आणि वेक्टरच्या सर्व आवश्यकतांचे क्लासिक पालन करण्यासाठी, या वेक्टरमध्ये क्लोनिंगसाठी फक्त काही सोयीस्कर साइट्स आहेत. शिवाय, त्यावर आधारित रीकॉम्बीनंट डीएनएच्या प्रयोगांमध्ये रूपांतरित पेशींची निवड करण्यास बराच वेळ लागतो. पर्यायी, अधिक प्रगत, क्लोनिंग प्रणाली विकसित करण्याची गरज होती. अशा प्रकारे, pUC कुटुंबातील वेक्टरचा एक गट तयार केला गेला. या कुटुंबातील सदिशांच्या नावात, "U" आणि "C" ही अक्षरे शब्दांची पहिली अक्षरे आहेत. कॅलिफोर्निया विद्यापीठ. या विद्यापीठाच्या संशोधकांनी वेक्टरची मालिका तयार केली आहे ज्यात एक महत्त्वपूर्ण वैशिष्ट्य आहे - एकात्मिक सिंथेटिकच्या डीएनए संरचनेत उपस्थिती. पॉलीलिंकर, जे या वेक्टरसाठी अद्वितीय असलेल्या अनेक निर्बंध एंडोन्युक्लीजसाठी ओळखण्याच्या साइट्सचा बनलेला एक न्यूक्लियोटाइड क्रम आहे - MCS (एकाधिक क्लोनिंग साइट्स). pUC कुटुंबातील वैयक्तिक वेक्टरची नावे भिन्न आहेत दुहेरी अंक, आणि वेगवेगळ्या वेक्टर्सची प्राथमिक रचना MCS साइट्स MCS - पॉलीलिंकरमधील एकाधिक क्लोनिंग साइट्सच्या रचनेमध्ये भिन्न आहे.
उदाहरण म्हणून pUC19 वेक्टर वापरून या गटात समाविष्ट केलेल्या वेक्टरच्या वैशिष्ट्यांचा अधिक तपशीलवार विचार करूया (चित्र 21).
प्लाझमिड pUC19 2686 bp लांब आहे. आणि त्यात समाविष्ट आहे: एम्पीसिलिन प्रतिरोधक जनुक; β-galactosidase जनुकाचा नियमन केलेला विभाग (lacZ")लैक्टोज ऑपेरॉन ई कोलाय्जनुक लाख,कोडिंग रिप्रेसर जे जनुक अभिव्यक्ती नियंत्रित करते lacZ";पॉलीलिंकर - एंडोन्यूक्लीजसाठी अनेक अद्वितीय ओळख साइट्ससह एक लहान क्रम (EcoRI, SacI, KrpI, XmaI, SmaI, BamHI, XbaI, SalI, HincII, AccI, BspMI, PstI, SphI आणि HindIII); ColE1 प्लास्मिडच्या प्रतिकृतीची उत्पत्ती.
तांदूळ. 21. प्लास्मिड वेक्टर pUC19
नकाशा मजकुरात स्पष्ट केला आहे.
एम्पिसिलीनला प्रतिकार करणार्या जनुकाच्या pUC19 प्लाझमिडमधील उपस्थितीमुळे या प्रतिजैविकासह पोषक माध्यमांवर आधारित हा वेक्टर किंवा रीकॉम्बिनंट डीएनए असलेले ई. कोलाई क्लोन निवडणे शक्य होते. मानल्या गेलेल्या वेक्टरच्या संरचनेचे असे मॉड्यूलर घटक lacZ", lacIआणि MCS मुळे रीकॉम्बिनंट डीएनए सह क्लोनची निवड वेगवान आणि तीव्र करणे शक्य होते.
जर अपरिवर्तित pUC19 प्लास्मिड असलेल्या पेशी isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) च्या उपस्थितीत वाढतात, जे एक प्रेरक आहे. लाख-ऑपेरॉन, नंतर जनुक उत्पादन लाख,तथाकथित दाबणारा, जनुकाच्या प्रवर्तक-ऑपरेटर क्षेत्राशी बांधील होऊ शकणार नाही lacZ",आणि परिणामी, जनुकाच्या प्लाझमिड तुकड्याचे प्रतिलेखन आणि भाषांतर होईल lacZ"या तुकड्याचे उत्पादन गुणसूत्र DNA द्वारे एन्कोड केलेल्या प्रथिनाशी बांधले जाईल α-पूरक), आणि परिणामी, सक्रिय ß-galactosidase तयार होते. एकाधिक प्रतिबंध साइट्स (पॉलिलिंकर) सह एक क्रम जीनमध्ये घातला जातो lacZ"जेणेकरून त्याचा फंक्शनल β-galactosidase च्या उत्पादनावर परिणाम होत नाही आणि जर त्याचा सब्सट्रेट 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) माध्यमात असेल तर या सजीवांच्या शरीरात निर्मार्ण होणारे द्रव्य हायड्रोलायझेशन करून निळ्या रंगाचे उत्पादन तयार केले जाते जे अपरिवर्तित असलेल्या पेशींच्या वसाहतींवर डाग लावतात, उदा. परदेशी डीएनए, pUC19 प्लाझमिड (Fig. 22) समाविष्ट केल्याशिवाय.
तांदूळ. 22. pUC19 वेक्टरमधील DNA क्लोनिंग प्रक्रियेचा क्रम.
1, 2, 3 आणि 4 - क्लोनिंगचे टप्पे (मजकूर पहा)
1. दाता DNA ला प्रतिबंधित एंडोन्यूक्लीजपैकी एकाने उपचार केले जाते ज्यासाठी पॉलीलिंकरमध्ये एक साइट आहे. pUC19 वेक्टर DNA वर त्याच एन्झाइमने उपचार केले जातात
2. रेखीय वेक्टरचे बंधन आणि T4 DNA ligase सह घाला.
3. उष्मायन मिश्रणासह बंधन प्रक्रियेनंतर, α-पूरकतेसाठी सक्षम पेशींचे रूपांतर होते, जे जनुक उत्पादनाशी जोडलेल्या ß-galactosidase (LacZα) च्या त्या भागाचे संश्लेषण करू शकतात. lacZ"सक्रिय एंजाइमच्या निर्मितीसह.
4. उपचार केलेल्या पेशींना एम्पीसिलिन, IPTG आणि ß-galactosidase साठी सब्सट्रेट असलेल्या पोषक माध्यमावर बीज दिले जाते. अ‍ॅम्पिसिलीनच्या उपस्थितीत न बदललेल्या पेशी वाढू शकत नाहीत आणि अखंड प्लाझमिड वाहून नेणाऱ्या पेशी अॅम्पीसिलीनच्या माध्यमावर निळ्या वसाहती तयार करतात. संकरित वाहक यजमान पेशी, उदा. रीकॉम्बिनंट, प्लाझमिड, त्याच माध्यमावर पांढर्‍या वसाहती तयार करतात. हे या वस्तुस्थितीमुळे होते की सामान्यतः जेव्हा पॉलीलिंकरमध्ये परदेशी डीएनए घातला जातो तेव्हा संपूर्ण जनुक उत्पादन तयार होऊ शकत नाही. lacZ", आणि, परिणामी, α-पूरकतेच्या प्रक्रियेत, सक्रिय ß-galactosidase तयार होत नाही, जे X-Gal सब्सट्रेटला अशा उत्पादनास क्लीव्ह करते जे कॉलनी पेशींना निळे डाग प्रदान करते.
बॅक्टेरियोफेजवर आधारित वेक्टर λ
प्लाझमिड वेक्टर्स डीएनए तुकड्यांना क्लोन करणे शक्य करतात ज्यांचा आकार 10 kb पेक्षा जास्त नाही. तथापि, क्रोमोसोमल डीएनए क्लोनिंगच्या समस्येचे निराकरण करण्यासाठी, अगदी लहान जीव, उदाहरणार्थ - बॅक्टेरिया, या डीएनएच्या तुकड्यांचा संपूर्ण संग्रह तयार करणे आवश्यक आहे, म्हणून आपल्याला बर्‍याचदा मोठ्या तुकड्यांसह कार्य करावे लागेल. यासाठी, बॅक्टेरियोफेज λ वर आधारित वेक्टर इ. कोली
जेव्हा फेज λ E. कोलाई पेशींमध्ये प्रवेश करतो. कार्यक्रमांच्या विकासासाठी दोन पर्यायी मार्ग आहेत:
1. लिटिक सायकल- फेज सक्रियपणे गुणाकार करण्यास सुरवात करते आणि सुमारे 20 मिनिटांनंतर 100 नवीन फेज कणांच्या प्रकाशासह सेल नष्ट होतो.
2. लिसोजेनीची अवस्था- फेज डीएनएचा समावेश ई. कोलाई क्रोमोसोममध्ये प्रोफेज म्हणून केला जातो आणि सामान्य जिवाणू पेशींसह सेलमध्ये त्याची प्रतिकृती बनते. तथापि, केव्हा प्रतिकूल परिस्थिती(पोषणाचा अभाव) लिटिक सायकल सुरू होते (चित्र 23):
1. बॅक्टेरियोफेज λ cDNA च्या प्रतिकृती दरम्यान, एक रेखीय रेणू तयार होतो, ज्यामध्ये अंदाजे 50 kb लांबीचे पुनरावृत्ती विभाग असतात. यातील प्रत्येक विभाग पूर्ण-लांबीचा फेज डीएनए चिकट आहे कारण-साइट्स - 12 न्यूक्लियोटाइड्सच्या 5 "-"पुच्छे" एकल-अडकलेल्या. त्यांना चिकट म्हणतात ( कारण) समाप्त होते कारण ते परस्पर पूरक आहेत आणि निर्बंध तुकड्यांच्या चिकट टोकांप्रमाणे एकमेकांशी जोडू शकतात.
2. फेज हेडमध्ये असा एक विभाग असतो, नंतर आधीच एकत्रित केलेली प्रक्रिया डोक्याशी जोडलेली असते.
तांदूळ. 23. बॅक्टेरियोफेजच्या विकासाचा लिटिक मार्ग λ
1 - पूर्ण-लांबीच्या फेज डीएनएच्या एका विभागाच्या फेज हेडमध्ये पॅकेजिंग; 2 - पूर्ण वाढ झालेल्या फेज कणाची असेंब्ली.
फेज λ चा DNA आकार सुमारे 50 kb आहे, आणि त्यातील एक महत्त्वपूर्ण भाग (सुमारे 20 kb) फेज पुनरुत्पादनासाठी आवश्यक नाही आणि होस्ट DNA मध्ये त्याच्या एकत्रीकरणासाठी जबाबदार आहे. या संदर्भात, कल्पना उद्भवली की ते समान आकाराच्या दुसर्या डीएनएच्या तुकड्याने बदलले जाऊ शकते. परिणामी रीकॉम्बिनंट रेणू सेलमध्ये "रीकॉम्बिनंट" फेजच्या डीएनएच्या रूपात प्रतिकृती तयार करेल ज्याने विकासाच्या लिटिक मार्गात "प्रवेश केला आहे". रिकॉम्बिनंट रेणू बॅक्टेरियोफेज λ हेडमध्ये पॅक केले जातात ग्लासमध्येआणि प्रक्रिया जोडल्यानंतर, संसर्गजन्य फेज कण प्राप्त होतात (चित्र 24).
तांदूळ. 24. पेशींमधील DHA तुकड्यांच्या क्लोनिंगसाठी λ-फेज वेक्टरचा वापर इ. कोली.
फेज λ डीएनएच्या इन विट्रो पॅकेजिंगसाठी अर्क तयार करणे दोन स्ट्रेन वापरून चालते ई कोलाय्, त्यातील प्रत्येक फेज λ (चित्र 25) च्या विशिष्ट उत्परिवर्ती ताणाविरूद्ध लाइसोजेनिक आहे. उत्परिवर्तीपैकी एक प्रथिने A (फेज टर्मिनेज पॉलीपेप्टाइड्सपैकी एक) संश्लेषित करण्यास अक्षम आहे, दुसरा प्रथिने E (फेज हेड प्रोटीन) संश्लेषित करण्यास अक्षम आहे. ही दोन्ही प्रथिने फेज λ डीएनएच्या पॅकेजिंगसाठी आवश्यक आहेत. “A”- आणि “E”-अर्क मिश्रित केले जातात आणि concatemeric जोडले जातात (पूर्ण-लांबीच्या फेज डीएनएचे विभाग त्यानुसार पॉलिमराइज्ड कारण-साइट्स) फेज डीएनए जो कापला जाण्यापूर्वी टर्मिनेसला बांधतो कारणसाइट्स आणि फेज हेड्समध्ये पॅकेज केले.
तांदूळ. 25. पॅकिंग ग्लासमध्येफेज λ डीएनए
38 kb पेक्षा कमी लांबीचा DNA रेणू पॅक करताना. एक गैर-संसर्गजन्य फेज कण प्राप्त होतो, आणि 52 टनांपेक्षा जास्त लांबीचे तुकडे, b.p. डोक्यात बसत नाही. 50 kb लांबीचे विभाग. रेषीय डीएनए रेणूमध्ये, ते कॉस साइट्सद्वारे वेगळे केले जातात आणि या स्थळांवर जेव्हा पुढील विभाग डोके भरतो तेव्हा रेणू कापला जातो. डोकेच्या प्रवेशद्वारावर स्थित एन्झाइमद्वारे कटिंग केले जाते.
प्राप्तकर्त्याच्या पेशींमध्ये परदेशी अनुवांशिक माहितीच्या एम्बेडेड तुकड्यासह रीकॉम्बिनंट फेज डीएनए सादर करण्याची प्रक्रिया नैसर्गिक घटनेवर आधारित आहे - फेज डीएनए ट्रान्सडक्शन.
ट्रान्सडक्शन(lat. ट्रान्सडक्शन- हालचाल) ही बॅक्टेरियोफेजद्वारे बॅक्टेरियाचा डीएनए एका पेशीतून दुसऱ्या पेशीमध्ये हस्तांतरित करण्याची प्रक्रिया आहे. अशाप्रकारे, फेज डीएनएवर आधारित रीकॉम्बिनंट डीएनए वापरून जिवाणू पेशींच्या परिवर्तनासाठी प्राप्तकर्त्या पेशींची विशेष तयारी किंवा कोणत्याही विशेष उपकरणाची आवश्यकता नसते.
रिकॉम्बिनंट डीएनए असलेल्या फेज असलेल्या पेशी शोधण्यासाठी आण्विक संकरीकरण आणि इम्यूनोलॉजिकल स्क्रीनिंग पद्धती वापरल्या जातात, ज्याची पुढील भागात चर्चा केली जाईल.
हा शोध जैवतंत्रज्ञानाच्या क्षेत्राशी संबंधित आहे, विशेषत: CXCR4 रिसेप्टर व्यक्त करणार्या ट्यूमर आणि स्टेम पेशींना डीएनएचे लक्ष्यित वितरण करण्याच्या पद्धतीशी. सध्याचा शोध जनुकीय दोष दूर करण्यासाठी आणि रोग टाळण्यासाठी स्टेम आणि घातक ट्यूमर पेशींना अनुवांशिक रचनांच्या लक्ष्यित वितरणासाठी वापरला जाऊ शकतो. या पद्धतीमध्ये वाहक रेणूंच्या संरचनेत सिग्नल अनुक्रम समाविष्ट करून अनुवांशिक रचनांचे वाहक तयार करणे समाविष्ट आहे, जो लाइसिनच्या आठ अमीनो ऍसिड अवशेषांचा डीएनए-बाइंडिंग क्रम आहे - KKKKKKKKK. DNA-बाइंडिंग अनुक्रमात सिग्नल अनुक्रम जोडणे ε-aminohexanoic acid च्या दोन रेणूंच्या लिंकर विभागाचा वापर करून चालते. त्यानंतर, डीएनए/वाहक कॉम्प्लेक्स तयार होतात. नंतर विट्रोमध्ये संक्रमण केले जाते. प्रस्तावित शोधामुळे ट्यूमर आणि स्टेम पेशींना स्वारस्य असलेले जनुक वितरित करण्याची कार्यक्षमता वाढवणे शक्य होते. 2 w.p. f-ly, 4 आजारी.
शोध अनुवांशिक औषधाशी संबंधित आहे, जनुक थेरपी, बायोटेक्नॉलॉजी आणि फार्मास्युटिकल्स आणि जनुक दोष सुधारण्यासाठी आणि रोग टाळण्यासाठी स्टेम आणि घातक ट्यूमर पेशींना अनुवांशिक रचनांच्या लक्ष्यित वितरणासाठी वापरला जाऊ शकतो. या प्रकारच्या पेशींमध्ये व्यक्त होणाऱ्या CXCR4 रिसेप्टरसाठी सिग्नल अनुक्रमांच्या वापराद्वारे जनुकीय रचनांचे ऊतक-विशिष्ट वितरण सुनिश्चित केले जाते.
जीन थेरपी पारंपारिक वैद्यक पद्धतींपासून वेगळे करते ते लक्षणे आणि परिणामांऐवजी रोगाच्या कारणाशी लढण्यावर लक्ष केंद्रित करते. मानवी रोगांच्या विस्तृत श्रेणीवर उपचार किंवा प्रतिबंध करण्यासाठी जीन थेरपी पद्धती सध्या विकसित केल्या जात आहेत. हे दृष्टीकोन विवो आणि एक्स विवो थेरपीमध्ये लागू होऊ शकतात. इन व्हिव्हो थेरपी शरीराच्या ऊतींमध्ये थेट अनुवांशिक रचनांच्या थेट परिचयावर आधारित आहे. एरोसोल डिस्पेंसर किंवा विशिष्ट ऊतकांमध्ये इंजेक्शन्स वापरून डिलिव्हरी इंट्राव्हेनस केली जाऊ शकते. एक्स व्हिव्हो जीन थेरपी शरीरातून विशिष्ट प्रकारच्या पेशींचे पृथक्करण, त्यांच्यामध्ये "उपचारात्मक" जनुक तयार करणे, संक्रमण झालेल्या पेशींची निवड आणि त्यानंतर रुग्णामध्ये पुनर्रोपण यावर आधारित आहे.
अनुवांशिक रचनांच्या वितरणासाठी सध्या विकसित केलेल्या पद्धतींमध्ये तीन मुख्य दिशानिर्देश आहेत:
1) व्हायरल वेक्टरचा भाग म्हणून क्लोनिंग;
२) वापरा भौतिक पद्धतीअभिकर्मक;
3) प्लास्मिड अभिव्यक्ती वेक्टर आणि नॉन-व्हायरल वाहक रेणूंच्या कॉम्प्लेक्सचा वापर.
व्हायरस-मध्यस्थ हस्तांतरण ही लक्ष्यित पेशींना डीएनए वितरीत करण्यासाठी एक अत्यंत कार्यक्षम पद्धत आहे, कारण सुधारित व्हायरल वेक्टरची प्रवेश प्रक्रिया सारखीच असते जी नैसर्गिकरित्या जेव्हा व्हायरस जीनोम होस्ट पेशींमध्ये हस्तांतरित केली जाते. रेट्रो-, एडेनो-, एडेनो-संबंधित व्हायरसच्या आधारे तयार केलेले वेक्टर सर्वात जास्त अभ्यासलेले आहेत. व्हायरसच्या फायद्यांमध्ये, सर्व प्रथम, अभिव्यक्ती वेक्टर आणि वाहक यांच्या गुणधर्मांचे संयोजन, विशिष्ट वितरणाची शक्यता, विभाजन आणि न-विभाजित पेशींचे संक्रमण करण्याची क्षमता, गुणसूत्रात डीएनए एम्बेड करण्याची शक्यता याची खात्री करणे समाविष्ट आहे. दीर्घकालीन अभिव्यक्ती. या फायद्यांमुळे, हा दृष्टिकोन अजूनही जनुक वितरण अभ्यासांमध्ये मोठ्या प्रमाणावर वापरला जातो, जरी त्याचे काही तोटे आहेत. रेट्रो- आणि एडेनो-संबंधित व्हायरसमध्ये क्लोन केलेल्या डीएनए तुकड्यांचा मर्यादित आकार असतो आणि जेव्हा व्हायरस होस्ट जीनोममध्ये घातला जातो तेव्हा इन्सर्टेशनल म्युटाजेनेसिसचा धोका असतो. एडेनोव्हायरल वेक्टर्सचा एक गंभीर तोटा म्हणजे उच्च डोसमध्ये उच्चारित रोगप्रतिकारक प्रतिसाद आणि अॅडेनोव्हायरल कंस्ट्रक्ट्सचे वारंवार इंजेक्शन (वॉल्थर डब्ल्यू., स्टीन यू. जीन ट्रान्सफरसाठी व्हायरल वेक्टर्स: मानवी रोगाच्या उपचारांमध्ये त्यांच्या वापराचा आढावा // औषधे. - 2000. - v. 60. - पी. 249-271, RF पेटंट क्रमांक 2252255, C12N 15/37, C12N 15/86, C12N 15/861, C12N 15/867, प्रकाशित 2005.02).
जीन थेरपी उपचार धोरणांच्या विकासात नग्न प्लाझमिड डीएनए रचनांचे इंजेक्शन हा पहिला दृष्टिकोन होता. "नग्न" डीएनए वापरून रक्तसंक्रमणाची कमी कार्यक्षमतेने अनुवांशिक रचनांच्या वितरणासाठी नवीन पद्धतींच्या विकासास चालना दिली. शरीराच्या पेशींमध्ये डीएनए पोहोचवण्याच्या विविध भौतिक पद्धतींचा अभ्यास करण्यात आला आहे. त्यापैकी सर्वात लोकप्रिय बॅलिस्टिक ट्रान्सफेक्शन आणि इलेक्ट्रोपोरेशन पद्धती आहेत, ज्याचा वापर त्वचा आणि स्नायूंच्या पेशींच्या संक्रमणासाठी मोठ्या प्रमाणावर केला जातो. बॅलिस्टिक ट्रान्सफेक्शनची पद्धत सोन्याच्या किंवा टंगस्टन मायक्रोपार्टिकल्सवर जमा केलेल्या डीएनएच्या सेलमध्ये प्रवेश करण्यावर आधारित आहे. संकुचित वायू किंवा द्रव प्रवाहाच्या दबावाखाली संक्रमण होते. इलेक्ट्रोपोरेशन पद्धत विद्युत प्रवाहाच्या क्रियेमुळे सेल झिल्लीच्या विद्युत संभाव्यतेमध्ये स्थानिक बदलावर आधारित आहे. विद्युत आवेग सेल झिल्लीमध्ये छिद्र तयार करण्यास कारणीभूत ठरतात, ज्यामुळे ते बायोमोलेक्यूल्समध्ये प्रवेश करण्यायोग्य बनतात. विवोमध्ये नग्न डीएनए ट्रान्सफेक्शनच्या कमी कार्यक्षमतेवर मात करण्यासाठी, हायड्रोडायनामिक शॉक पद्धत देखील वापरली जाते - मोठ्या प्रमाणात द्रावणात प्लाझमिड वेक्टरचे इंट्राव्हेनस किंवा इंट्रा-धमनी इंजेक्शन. ट्रान्सफेक्शनच्या विद्यमान भौतिक पद्धतींचे मुख्य तोटे म्हणजे डीएनए वितरणाच्या प्रभावाची कमी कार्यक्षमता आणि स्थानिकता. ते प्लाझमिडवर मात करण्यास परवानगी देतात पेशी आवरणआणि एंडोसोम्समध्ये समाविष्ट करणे टाळा, त्यामुळे एन्झाईमॅटिक डिग्रेडेशन टाळता येईल, परंतु, एक नियम म्हणून, सादर केलेल्या अनुवांशिक रचनांचा दीर्घकालीन टिकाव देऊ नका (वेल्स डीजे जीन थेरपी प्रगती आणि संभावना: इलेक्ट्रोपोरेशन आणि इतर भौतिक पद्धती // जीन थेर. - 2004 . - v.11 18. - पी.1363-1369; वांग एस., जोशी एस., लू एस. कण बॉम्बर्डमेंटद्वारे त्वचेवर डीएनएचे वितरण // पद्धती मोल बायोल. - 2004. - v.245. - पी. 185-196; Herweijer H., Wolff J.A. प्रगती आणि संभावना: नग्न DNA जनुक हस्तांतरण आणि थेरपी // जीन थेरपी. - 2003. - v.10, क्रमांक 6. - P.453-458).
नॉन-व्हायरल वाहक हे सस्तन प्राण्यांच्या पेशींमध्ये अनुवांशिक रचनांचे विषाणू-मध्यस्थ हस्तांतरणासाठी पर्याय आहेत. नॉन-व्हायरल वाहक सहजपणे संश्लेषित केले जातात, त्यांच्या बदलाच्या सुलभतेमुळे रेणूंच्या संरचनेत आणि संरचनेत बदल करणे शक्य होते, ज्यामुळे वितरणाचे साधन सुधारते. नॉन-व्हायरल मीडिया वापरताना, वितरित अभिव्यक्ती वेक्टरच्या आकारावर कोणतेही निर्बंध नाहीत. याव्यतिरिक्त, ते कमी विषारी असतात, बहुतेक प्रकरणांमध्ये विशिष्ट रोगप्रतिकारक प्रतिक्रिया निर्माण करत नाहीत आणि व्हायरल वेक्टरपेक्षा व्हिव्होमध्ये वापरणे अधिक सुरक्षित असते. म्हणून, नॉन-व्हायरल वाहकांमध्ये पॅकेज केलेल्या अनुवांशिक रचनाचा परिचय पुन्हा केला जाऊ शकतो. नॉन-व्हायरल वाहकांचा अभ्यास विविध कृत्रिम संयुगे (लिपिड, ऑलिगो- आणि पॉलीपेप्टाइड्स, पॉलिमर इ.) (उदाहरणार्थ, आरएफ पेटंट क्र. 2336090) सह डीएनए कॉम्प्लेक्स तयार करून प्लाझमिड डीएनएच्या संक्रमण गुणधर्मांमध्ये सुधारणा करण्याच्या दिशेने विकसित होत आहे. , A61K 39/00, A61K 47/00, प्रकाशित 2008.10.20). नॉन-व्हायरल डिलिव्हरी वाहनांची सुधारणा मुख्यत्वे शरीराच्या पेशींमध्ये डीएनएच्या प्रवेशातील अडथळ्यांच्या तपशीलवार समजावर अवलंबून असते (श्मिट-वुल्फ जीडी, श्मिट-वुल्फ आयजी. मानवी जनुक थेरपीमध्ये नॉन-व्हायरल आणि हायब्रिड वेक्टर्स: एक अपडेट // ट्रेंड्स मोल मेड. - 2003. - v.9, क्रमांक 2. - P.67-72; गार्डलिक आर, पालफी आर, होडोसी जे., तुर्ना जे., सेलेक पी. जीन थेरपीमध्ये वेक्टर आणि वितरण प्रणाली // मेड साय मॉनिटर . - 2005. - v.11, क्रमांक 4. - P.110-121; Wiethoff C.M., Middaugh C.R. नॉनव्हायरल जनुक वितरणासाठी अडथळे // J Pharm Sci. - 2003. - v.92, क्रमांक 2. - P .203-217).
असे मानले जाते की नॉन-व्हायरल कॅरियरमध्ये खालील वैशिष्ट्ये असावीत:
1) गैर-विषारी, कॉम्पॅक्ट व्हा आणि प्लाझमिड डीएनए एन्झाईमॅटिक डिग्रेडेशनपासून संरक्षित करा, वापरल्यानंतर शरीरातून उत्सर्जित करा;
2) सेलच्या प्लाझ्मा झिल्लीला विशिष्ट बंधनकारक करून सेलमध्ये प्लाझमिडचा प्रवेश सुनिश्चित करा:
3) एंडोसोमल कंपार्टमेंटमधून डीएनए सोडण्याची क्षमता आहे;
न्यूक्लियसमध्ये प्लाझमिडच्या त्यानंतरच्या वाहतुकीसाठी कॉम्प्लेक्समधून डीएनएचे पृथक्करण सुनिश्चित करा.
जीन थेरपीच्या हेतूंसाठी, अनुवांशिक रचना वितरित करण्याची सर्वात पसंतीची पद्धत म्हणजे शरीराच्या पेशी आणि ऊतींमध्ये त्यांचे ऊतक-विशिष्ट हस्तांतरण.
कॉम्प्लेक्सच्या इंट्रासेल्युलर प्रवेशासाठी पहिला अडथळा म्हणजे प्लाझ्मा झिल्ली. बहुतेक कॉम्प्लेक्स इलेक्ट्रोस्टॅटिक शक्तींचा वापर करून सेल पृष्ठभागाशी संवाद साधतात. संभाव्य यंत्रणासेलसह बंधनकारक कॉम्प्लेक्स म्हणजे सेल पृष्ठभागाच्या प्रथिने - ग्लायकोसामिनोग्लायकन्ससह त्यांचा परस्परसंवाद. तथापि, कॉम्प्लेक्समध्ये प्रवेश करण्याच्या या यंत्रणेसह, जीन रचनांचे कोणतेही ऊतक-विशिष्ट हस्तांतरण नाही. त्याच वेळी, अनुवांशिक रचनांच्या ऊती-विशिष्ट वितरणाची समस्या अनेक रोगांसाठी जीन थेरपीसाठी संबंधित आहे. सेल पृष्ठभागासह विशिष्ट परस्परसंवादासाठी, कॉम्प्लेक्समध्ये सेल पृष्ठभागावरील रिसेप्टर्सपासून लिगँड्सचा समावेश होतो. आजपर्यंत, अनेक इंटिग्रिन पेप्टाइड लिगँड्सचे वैशिष्ट्य आहे. यामध्ये, विशेषतः, ट्रायपेप्टाइड फ्रॅगमेंट RGD (अनेक पेशींच्या पृष्ठभागावर इंटिग्रिन असतात), ट्रान्सफरिन (त्याच्या रिसेप्टरमध्ये वाढलेल्या पेशींमध्ये वाढलेली अभिव्यक्ती असते), एशियलरोसोम्युकोइड (एशियालॉगलाइकोप्रोटीन रिसेप्टर यकृताच्या हेपॅटोसाइट्समध्ये विशिष्ट अभिव्यक्ती असते) यांचा समावेश होतो.
चेतापेशींमध्ये अनुवांशिक सामग्रीच्या विशिष्ट वितरणासाठी, झेंग आणि सहकाऱ्यांनी TrkA रिसेप्टरला सिग्नल क्षेत्राचा समावेश असलेला वाहक (नर्व्ह ग्रोथ फॅक्टरमधून 80-108 अमिनो अॅसिड) आणि 10 लाइसिन एमिनो अॅसिड अवशेषांचा डीएनए-बाइंडिंग अनुक्रम वापरण्याचा प्रस्ताव दिला. . हा वाहक, एंडोसोमोलाइटिक एजंट क्लोरोक्वीनच्या उपस्थितीत, जो सेलच्या एंडोसोमल कंपार्टमेंटमधून कॉम्प्लेक्स सोडण्यास सुलभ करतो, टिश्यू-विशिष्टपणे मार्कर जनुक केवळ TrkA रिसेप्टर व्यक्त करणार्या पेशींना वितरित करण्यास सक्षम होता. हे वाहक विविध जनुक थेरपी उपचारांसाठी वापरले जाऊ शकते न्यूरोलॉजिकल रोगजसे की अपस्मार, पार्किन्सन आणि अल्झायमर. तथापि, इतर पेशींच्या प्रकारांना अनुवांशिक सामग्री वितरीत करण्यासाठी ते योग्य नाही (झेंग जे, टू एचपी, मा वाई, लुओ ई, वांग एस ए सिंथेटिक पेप्टाइड ज्यामध्ये लक्ष्यित जनुक वितरणासाठी मज्जातंतूंच्या वाढीच्या घटकाचा लूप 4 आहे // जे जीन मेड 2004; 6 : १२४७ -१२५६).
मानवी स्टेम पेशी विविध मानवी रोगांसाठी पेशी आणि जनुक थेरपीसाठी आश्वासक एजंट मानल्या जातात. त्याच वेळी, ते पेशी प्रकारांचे संक्रमण करणे सर्वात कठीण आहेत. कर्करोगाच्या जीन थेरपीच्या उपचारात, ट्यूमर पेशींमध्ये थेट जनुकांचे वितरण सुनिश्चित करणे आवश्यक आहे.
CXCR4 हे केमोकाइन SDF-1α साठी स्टेम सेल मायग्रेशन फॅक्टर रिसेप्टर आहे. CXCR4 हेमेटोपोएटिक पेशी, संवहनी एंडोथेलियम आणि स्नायू उपग्रह पेशींमध्ये व्यक्त केले जाते. वैशिष्ट्यपूर्ण उच्चस्तरीयया जनुकाची अभिव्यक्ती 20 पेक्षा जास्त प्रकारच्या कर्करोगाच्या ट्यूमरमध्ये (स्तन कर्करोग, प्रोस्टेट कर्करोग इ.), तसेच स्थलांतरित स्टेम पेशींमध्ये. CXCR4 रिसेप्टर व्हायरल केमोकाइन vMIP-II (कपोसीचा सारकोमा विषाणू) ला देखील बांधण्यास सक्षम आहे. अशा प्रकारे, वाहक रेणूंमध्ये CXCR4 रिसेप्टरला बंधनकारक करण्यासाठी सिग्नल अनुक्रमांचा समावेश हा ट्यूमर आणि स्टेम पेशींना लक्ष्यित जनुक वितरणासाठी प्रणाली तयार करण्याचा एक आशादायक मार्ग आहे.
CXCR4 रिसेप्टर व्यक्त करणार्या पेशींना अनुवांशिक सामग्री वितरीत करण्यासाठी, Le Bon आणि सहकार्‍यांनी या रिसेप्टर, AMD3100 साठी सिंथेटिक लिगँडचा वापर केला, जो पॉलीथिलीनेमाइन किंवा कॅशनिक लिपिड्सशी जोडलेला होता. या संयुगांसह अनुवांशिक सामग्रीचे कॉम्प्लेक्स होऊ शकले नाहीत लक्षणीय वाढसिग्नलशिवाय संयुगांच्या तुलनेत CXCR4+ पेशींमध्ये मार्कर जनुक वितरणाची कार्यक्षमता. ले बॉनद्वारे वापरलेले वाहक प्रभावी नव्हते, कारण त्यांच्या मदतीने विशिष्ट वितरण तेव्हाच शक्य आहे जेंव्हा CXCR4 रिसेप्टर (फोरबोल एस्टर) च्या अंतर्गतकरणास प्रोत्साहन देणारा पदार्थ ट्रान्सफेक्शन माध्यमात जोडला जातो. (Le Bon B, Van Craynest N, Daoudi JM, Di Giorgio C, Domb AJ, Vierling P. AMD3100 Conjugates as Components of Targeted Nonviral Gene Delivery Systems: Synthesis and in Vitro Transfection Efficiency of CXCR4-Expressing Cells. /////////// , 15: 413-423).
अशा प्रकारे, अनुवांशिक रचनांचा एक वाहक तयार करण्याची गरज आहे जी CXCR4(+) पेशींना विशिष्ट वितरण प्रदान करू शकते आणि जवळपासच्या ऊतींना प्रभावित करू शकत नाही. अशी पद्धत सध्याच्या आविष्काराने दिली आहे.
आविष्कार CXCR4 रिसेप्टर व्यक्त करणार्या पेशींमध्ये अनुवांशिक रचनांच्या विशिष्ट वितरणासाठी एक पद्धत विकसित करण्याच्या कार्यावर आधारित आहे, ज्यामध्ये, CXCR4 रिसेप्टरसाठी सिग्नल अनुक्रम असलेल्या अनुवांशिक रचनांच्या वाहकांचा वापर करून, वितरणाच्या कार्यक्षमतेत वाढ होते. "स्वारस्य" जनुक प्राप्त होते. हे लक्षात घेणे महत्त्वाचे आहे की दावा केलेल्या वाहकांचे संश्लेषण सॉलिड-फेज पेप्टाइड संश्लेषणाच्या कोणत्याही ज्ञात पद्धती वापरून केले जाऊ शकते.
तांत्रिक समस्येचे निराकरण या वस्तुस्थितीद्वारे प्रदान केले जाते की ट्यूमर आणि स्टेम पेशींना लक्ष्यित वितरणाच्या पद्धतीमध्ये सीएक्ससीआर 4 रिसेप्टर व्यक्त करतात, ज्यामध्ये वाहक रेणूंच्या संरचनेत समाविष्ट करून अनुवांशिक रचनांचे वाहक तयार करणे समाविष्ट आहे. लायसिनच्या आठ अमीनो आम्ल अवशेषांचा डीएनए-बाइंडिंग क्रम - KKKKKKKK, सिग्नल अनुक्रम, डीएनए/कॅरियर कॉम्प्लेक्सची निर्मिती, विट्रोमध्ये संक्रमण पार पाडणे, सिग्नल क्रम गटातून निवडला जातो: 1 ते 8 अमीनो ऍसिडचा एक तुकडा SDF-1α प्रोटीनच्या N-टर्मिनसचा क्रम - KPVSLSYR; SDF-1α प्रोटीनच्या N-टर्मिनसच्या अनुक्रमाचा 1 ते 17 एमिनो ऍसिडचा तुकडा - KPVSLSYRCCPCRFFESH, जेथे 9 आणि 11 अमीनो ऍसिड सेरीनने बदलले जातात; किंवा व्हायरल केमोकाइन vMIP-II - LGASWHRPDK च्या N-टर्मिनल अनुक्रमाचा 1 ते 10 एमिनो ऍसिडचा तुकडा; DNA-बाइंडिंग अनुक्रमात सिग्नल अनुक्रम जोडणे ε-aminohexanoic acid च्या दोन रेणूंच्या लिंकर साइटचा वापर करून चालते.
या प्रकरणात, सिग्नलचा क्रम SDF-1α-KPVSLSYR प्रोटीनच्या N-टर्मिनसच्या अनुक्रमातील अमीनो ऍसिड 1 ते 8 पर्यंतचा एक तुकडा असू शकतो.
वैकल्पिकरित्या, सिग्नल क्रम SDF-1α प्रथिन - KPVSLSYRCCPCRFFESH च्या N-टर्मिनसच्या अनुक्रमाचा 1 ते 17 एमिनो ऍसिडचा तुकडा असू शकतो, जेथे 9 आणि 11 अमीनो ऍसिड सेरीनने बदलले जातात.
व्हायरल केमोकाइन vMIP-II - LGASWHRPDK च्या N-टर्मिनल क्रमाच्या 1 ते 10 एमिनो ऍसिडचा तुकडा, D-amino ऍसिडपासून संश्लेषित, सिग्नल क्षेत्र म्हणून देखील वापरला जाऊ शकतो.
ग्लिसरॉल किंवा क्लोरोक्विनचा वापर वाहक आणि अनुवांशिक सामग्री असलेल्या कॉम्प्लेक्सच्या एंडोसोममधून बाहेर पडण्यासाठी एक घटक म्हणून केला जाऊ शकतो.
प्लाझमिड डीएनए वाहकांसाठी अनुवांशिक सामग्री म्हणून वापरला जाऊ शकतो.
सध्याच्या आविष्कारातील निर्दिष्ट तांत्रिक परिणाम oligolysin रेणू - KKKKKKK (K8) वाहक म्हणून, SDF-1 किंवा vMIP-II प्रथिनांच्या CXCR4 रिसेप्टरला सिग्नल अनुक्रमांसह संयुग्मित, म्हणजे एन-टर्मिनल अनुक्रमांच्या वापराद्वारे प्राप्त केला जातो. SDF-1 केमोकाइन (1 ते 8 aa सह) किंवा SDF-1 केमोकाइनचा एन-टर्मिनल अनुक्रम (1 ते 17 aa पर्यंत, 9 आणि 11 aa च्या बदली सेरीनसह) किंवा एन-टर्मिनल अनुक्रम vMIP-II व्हायरल केमोकाइन (डी-कॉन्फॉर्मेशनमध्ये 1 ते 10 aa पर्यंत). वाहकांच्या रचनेत ऑलिगोलिसिन केकेकेकेकेकेकेची उपस्थिती इलेक्ट्रोस्टॅटिक परस्परसंवादामुळे संयुग्मितांना न्यूक्लिक अॅसिडसह कॉम्प्लेक्स तयार करण्यास परवानगी देते, विशेषत: प्लास्मिड डीएनएसह.
निर्दिष्ट तांत्रिक परिणाम प्रस्तावित माध्यमांच्या तीन प्रकारांद्वारे प्राप्त केला जातो.
पहिल्या प्रकारानुसार निर्दिष्ट तांत्रिक परिणाम या वस्तुस्थितीद्वारे प्राप्त केला जातो की SDF-1 केमोकाइनच्या सिंथेटिक अॅनालॉग्सवर आधारित लहान सीडीपी कॅरियरमध्ये, ज्यामध्ये एक कॅशनिक घटक समाविष्ट आहे, जो प्लाझमिड डीएनए संक्षेपणासाठी वापरला जाणारा K8 ऑलिगोलिसिन आहे आणि एक लिगँड आहे. CXCR4 रिसेप्टरशी परस्परसंवादासाठी घटक, आविष्कारानुसार, SDF-1 प्रोटीनच्या N-टर्मिनसच्या अनुक्रमाचा एक तुकडा (1-8 aa), ज्याची रचना KPVSLSYR आहे आणि अॅगोनिस्टची क्रिया आहे. CXCR4 रिसेप्टर, लिगँड घटक म्हणून वापरला जातो, आणि संयुग्माच्या cationic घटकामध्ये KKKKKKKK रचना असते आणि स्पेसरद्वारे लिगँड घटकाशी जोडलेले असते - दोन रेणू ε-aminohexanoic acid (Ahx).
दुसर्या प्रकारानुसार निर्दिष्ट तांत्रिक परिणाम या वस्तुस्थितीद्वारे प्राप्त केला जातो की वाहक (लांब सीडीपी) मध्ये एसडीएफ -1 केमोकाइनच्या सिंथेटिक अॅनालॉग्सवर आधारित, ज्यामध्ये कॅशनिक घटक समाविष्ट आहे, जो प्लाझ्मिड डीएनए संक्षेपणासाठी वापरला जाणारा K8 ऑलिगोलिसिन आहे आणि CXCR4 रिसेप्टरशी परस्परसंवादासाठी ligand घटक, दावा केलेल्या आविष्कारानुसार, SDF-1 प्रोटीनच्या N-टर्मिनसच्या अनुक्रमाचा एक तुकडा (1-17 aa; aa9 आणि aa11 सेरीनने बदललेला) रचना KPVSLSYRPSSRFFESH आणि CXCR4 रिसेप्टरच्या ऍगोनिस्टची क्रियाशीलता असणे, लिगँड घटक म्हणून वापरले जाते आणि संयुग्माच्या कॅशनिक घटकाची रचना KKKKKKKK आहे आणि स्पेसरद्वारे लिगँड घटकाशी संलग्न आहे - ε-aminohexanoic acid चे दोन रेणू.
तिसर्‍या प्रकारानुसार निर्दिष्ट तांत्रिक परिणाम या वस्तुस्थितीद्वारे प्राप्त केला जातो की वाहक (व्हायरल सीडीपी) मध्ये कपोसीच्या सारकोमा व्हायरस प्रोटीन vMIP-II च्या सिंथेटिक अॅनालॉग्सवर आधारित, ज्यामध्ये के 8 ऑलिगोलिसिन आहे, एक कॅशनिक घटक समाविष्ट आहे, ज्याचा वापर केला जातो. प्लाझमिड डीएनए, आणि रिसेप्टर CXCR4 सह परस्परसंवादासाठी एक लिगँड घटक, दावा केलेल्या आविष्कारानुसार, vMIP-II प्रोटीनच्या N-टर्मिनसच्या अनुक्रमाचा एक तुकडा (1-10 Daa - डी-अमीनो ऍसिडपासून संश्लेषित) , रचना LGASWHRPDK असणे आणि CXCR4 रिसेप्टरच्या विरोधी क्रियाशील असणे, लिगँड घटक म्हणून वापरला जातो आणि संयुग्माच्या कॅशनिक घटकामध्ये KKKKKKKKK रचना असते आणि स्पेसरद्वारे लिगँड घटकाशी जोडलेली असते - ε-aminohex चे दोन रेणू आम्ल
दावा केलेल्या वाहकाचे सर्व तीन रूपे पेप्टाइड संश्लेषणाच्या ज्ञात पद्धती वापरून संश्लेषित केले जाऊ शकतात, उदाहरणार्थ, सॉलिड फेज Boc पद्धत (मेरीफिल्ड, आर.बी. सॉलिड फेज पेप्टाइड संश्लेषण. I. टेट्रापेप्टाइडचे संश्लेषण // जर्नल ऑफ द अमेरिकन केमिकल सोसायटी. 1963. V.85 (14), pp.2149-2154).
विशिष्ट अंमलबजावणी उदाहरणे
आविष्कार आकृती 1 वापरून स्पष्ट केला आहे, जो लहान CDP/DNA, लांब CDP/DNA आणि व्हायरल CDP/DNA कॉम्प्लेक्समध्ये वाढत्या वाहक/डीएनए चार्ज रेशोसह इथिडियम ब्रोमाइड फ्लूरोसेन्सच्या तीव्रतेतील बदल दर्शवितो. फ्लोरोसेन्सच्या तीव्रतेत घट तयार झालेल्या कॉम्प्लेक्सच्या घनतेत वाढ दर्शवते. फ्लोरोसेन्स वक्रांचे पठार हे सूचित करते की कॉम्प्लेक्स एथिडियम ब्रोमाइड फ्लूरोसेन्स शांत करण्यासाठी पुरेशी घनता गाठली आहेत.
आकृती 2 एंडोसोमोलायटिक एजंट ग्लिसरॉलच्या उपस्थितीत लहान CDP/DNA, लांब CDP/DNA आणि व्हायरल CDP/DNA कॉम्प्लेक्ससह संक्रमणानंतर HeLa (CXCR4+) पेशींमधील ल्युसिफेरेस क्रियाकलापांचे अवलंबित्व दाखवते. या प्रकरणात, खालील वाहक/डीएनए चार्ज रेशोवर तयार केलेले कॉम्प्लेक्स वापरले गेले: 3/1, 6/1, 9/1, 12/1. अखंड रेणू, DNA, PEI/DNA 1/8 कॉम्प्लेक्स (प्रयोगाचे सकारात्मक नियंत्रण - व्यावसायिक वाहक ब्रँच्ड पॉलीथिलीनिमाइन 25 kDa - PEI) आणि DNA आणि कंट्रोल पेप्टाइड (CP) असलेले कॉम्प्लेक्स प्रायोगिक नियंत्रणे म्हणून काम करतात. सध्याच्या आविष्कारातील वाहकांपेक्षा CP वेगळे आहे कारण त्यात CXCR4 रिसेप्टर बंधनकारक सिग्नल नाही आणि संरचनात्मकदृष्ट्या एक ऑलिगोलिसिन KKKKKKKK आहे. शॉर्ट सीडीपी, लाँग सीडीपी आणि व्हायरल सीडीपीच्या वाहकांकडून मार्कर जनुक वितरणाची कार्यक्षमता कंट्रोल CP पेक्षा 10-100 पट जास्त होती.
आकृती 3 एन्डोसोमोलाइटिक एजंट ग्लिसरॉलच्या उपस्थितीत लहान CDP/DNA, लांब CDP/DNA आणि व्हायरल CDP/DNA कॉम्प्लेक्ससह संक्रमणानंतर A172 (CXCR4+) पेशींमधील ल्युसिफेरेस क्रियाकलापांचे अवलंबित्व दाखवते. येथे आम्ही खालील वाहक/DNA चार्ज रेशोवर तयार केलेले कॉम्प्लेक्स वापरले: 9/1, 12/1. एक अखंड DNA रेणू, PEI/DNA 1/8 कॉम्प्लेक्स आणि DNA आणि CP पेप्टाइड असलेले कॉम्प्लेक्स प्रायोगिक नियंत्रणे म्हणून काम करतात. शॉर्ट सीडीपी, लाँग सीडीपी आणि व्हायरल सीडीपीच्या वाहकांकडून मार्कर जनुक वितरणाची कार्यक्षमता कंट्रोल सीपीपेक्षा 10 पट जास्त होती.
आकृती 2 आणि आकृती 3 मधील परिणाम CXCR4 रिसेप्टरसाठी सध्याच्या शोधातील वाहकांच्या विशिष्टतेचे समर्थन करतात.
आकृती 4 सीएचओ (CXCR4-) पेशींमध्ये एन्डोसोमोलायटिक एजंट ग्लिसरॉलच्या उपस्थितीत लहान CDP/DNA, लांब CDP/DNA आणि व्हायरल CDP/DNA कॉम्प्लेक्ससह संक्रमणानंतर ल्युसिफेरेस क्रियाकलापांचे अवलंबित्व दर्शविते. खालील वाहक/डीएनए चार्ज रेशोवर तयार केलेले कॉम्प्लेक्स वापरले गेले: 9/1, 12/1. एक अखंड DNA रेणू, PEI/DNA 1/8 कॉम्प्लेक्स आणि DNA आणि CP पेप्टाइड असलेले कॉम्प्लेक्स प्रायोगिक नियंत्रणे म्हणून काम करतात. शॉर्ट सीडीपी, लाँग सीडीपी आणि व्हायरल सीडीपी वाहकांद्वारे मार्कर जनुक वितरणाची कार्यक्षमता नियंत्रण सीपी वापरण्यासारखीच होती.
सिग्नल असलेले वाहक नियंत्रणाच्या तुलनेत रिसेप्टर अभिव्यक्तीशिवाय पेशींमध्ये अनुवांशिक सामग्रीचे वितरण लक्षणीय उच्च पातळी प्रदान करण्यास सक्षम नाहीत.
आविष्काराची अंमलबजावणी खालीलप्रमाणे स्पष्ट केली जाऊ शकते. या रिसेप्टरसाठी सिग्नल अनुक्रम असलेल्या अनुवांशिक सामग्रीच्या वाहकांचा वापर करून CXCR4 रिसेप्टर व्यक्त करणार्या पेशींना अनुवांशिक रचनांचे लक्ष्यित वितरण प्रदान करणे हे सध्याच्या शोधाचे उद्दिष्ट आहे.
पहिल्या टप्प्यावर, "रुची" जनुक असलेल्या अनुवांशिक रचना असलेल्या वाहकाच्या मूर्त स्वरूपांपैकी एकाच्या कॉम्प्लेक्सची निर्मिती केली जाते. तयार केलेल्या कॉम्प्लेक्सचा वापर अनुवांशिक सामग्री योग्य लक्ष्य पेशींपर्यंत पोहोचवण्यासाठी केला जातो. सेल प्रवेश कार्यक्षमतेचे विश्लेषण एन्झाईमॅटिक किंवा इम्युनोहिस्टोकेमिकल पद्धतींनी केले जाते.
कॉम्प्लेक्सची निर्मिती आयसोटोनिक सोल्यूशनमध्ये केली जाते. मीठ-मुक्त बफर HBM (Hepes-buffered mannitol) ला प्राधान्य दिले जाते. परिणामी कॉम्प्लेक्सचा आकार 170-230 एनएम आहे.
प्लाझमिड डीएनए वापरून एखाद्या अवतारात अनुवांशिक रचना केली जाते.
प्लाझमिड डीएनएमध्ये मार्कर (luc, lacZ) किंवा उपचारात्मक जनुक (रोगावर अवलंबून), योग्य प्रवर्तक आणि वर्धक (CMV, SV40, इ.) यांच्या नियंत्रणाखाली आणि इतर आवश्यक घटक असतात, उदाहरणार्थ, होस्टमध्ये प्रतिकृती तयार करण्यासाठी सेल किंवा जीनोममध्ये एकत्रीकरण. कर्करोगावरील जीन थेरपी उपचारांमध्ये, HLA-B7, IL-2, IL-4, TNF, IFN, P53, thymidine kinase आणि इतर जनुकांचा वापर केला जाऊ शकतो.
दुसर्या अवतारात, अनुवांशिक रचना म्हणून, ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्सचा वापर केला जातो, ज्यामध्ये लहान आकाराचे डीएनए किंवा आरएनए असतात, जे mRNA किंवा संश्लेषण दडपण्यासाठी त्याच्या पूर्ववर्ती रचनेतील विशिष्ट क्रमाला पूरक असतात. प्रथिने उत्पादनकिंवा उत्परिवर्तन वाहून नेणाऱ्या एक्सॉनच्या mRNA मधून वगळणे. तयार केलेल्या कॉम्प्लेक्सचा वापर CXCR4 रिसेप्टर व्यक्त करणार्या पेशींना अनुवांशिक सामग्री पोहोचवण्यासाठी केला जातो. सध्याच्या आविष्काराच्या वाहक कॉम्प्लेक्समध्ये प्रवेश मुख्यतः रिसेप्टर-मध्यस्थ वाहतूकद्वारे CXCR4 रिसेप्टरच्या बाह्य कोशिकाशी बंधनकारक करून आणि रिसेप्टरच्या त्यानंतरच्या अंतर्गतीकरणाद्वारे होतो.
वाहक आणि अनुवांशिक सामग्रीचा डोस वैयक्तिकरित्या निर्धारित केला जातो आणि पेशींचा प्रकार, त्यांच्या पृष्ठभागावरील CXCR4 रिसेप्टरचे प्रमाण आणि या पेशींच्या संक्रमणाची जटिलता यावर अवलंबून असते.
या वाहकांची कार्यक्षमता वाढवण्यासाठी, पेशींचे संक्रमण शक्यतो एंडोसोमोलाइटिक एजंट वापरून केले जाते. यामध्ये ग्लिसरॉल, क्लोरोक्विन आणि इतरांचा समावेश आहे. पेशींमध्ये कॉम्प्लेक्स जोडण्यापूर्वी हे पदार्थ ट्रान्सफेक्शन माध्यमात जोडले जातात. ते कॉम्प्लेक्समध्ये बंधनकारक राहतात आणि त्यामुळे त्यांच्या संरचनेवर परिणाम होत नाही.
पेप्टाइड्स, इतर पॉलिमेरिक संयुगे, न्यूक्लिक अॅसिड कॉम्पॅक्ट करण्यास सक्षम लिपोसोम्सचा वापर वाहकाचा डीएनए-बाइंडिंग भाग म्हणून केला जाऊ शकतो. याव्यतिरिक्त, त्यांच्यात एंडोसोमोलाइटिक गुणधर्म असू शकतात (अतिरिक्त एंडोसोमोलाइटिक एजंट वापरण्याची आवश्यकता नाही) आणि आवश्यक असल्यास (उदाहरणार्थ, उपचारात्मक किंवा मार्कर जनुकांच्या वितरणासाठी), न्यूक्लियसमध्ये अनुवांशिक सामग्री वितरीत करतात.
अभिकर्मक परिस्थिती निवडताना, ते सर्वोच्च वितरण कार्यक्षमता प्रदान करण्यासाठी डिझाइन केलेले आहेत. 4 तासांपर्यंत पेशींसह कॉम्प्लेक्स उष्मायन करणे अधिक श्रेयस्कर आहे. तथापि, आपण या वेळी 3 ते 6 तासांपर्यंत बदलू शकता. उष्मायनाची वेळ निघून गेल्यानंतर, माध्यम बदलले जाते आणि पेशींना 24-48 तास (पेशी प्रकार आणि अनुवांशिक सामग्रीवर अवलंबून) स्वारस्य किंवा प्रकटीकरणाच्या जनुकासह सादर केलेल्या रचनांच्या अभिव्यक्तीसाठी सोडले जाते. उपचारात्मक प्रभाव oligonucleotides.
प्रसूतीच्या कार्यक्षमतेचे विश्लेषण एन्झाईमॅटिक किंवा इम्युनोहिस्टोकेमिकल पद्धतींद्वारे केले जाते, जे सादर केलेल्या जनुकांच्या संरचनेच्या प्रकारावर अवलंबून असते.
उदाहरण 1 डीएनए/कॅरियर कॉम्प्लेक्सची निर्मिती आणि गुंतागुंतीच्या प्रक्रियेचा अभ्यास.
cytomegalovirus प्रवर्तकाच्या नियंत्रणाखाली फायरफ्लाय ल्युसिफेरेस जनुक असलेले pCLUC4 प्लाझमिड पेशींमध्ये जनुकांच्या लक्ष्यित वितरणासाठी अनुवांशिक सामग्री म्हणून वापरले गेले. वाहकाच्या अवतारांपैकी एक वापरला गेला.
1X HBM बफरच्या 40 μl मध्ये 1 μg DNA ची सोल्यूशन्स (5% w/v mannitol, 5 mM Hepes, pH 7.5) आणि वेगवेगळ्या DNA/कॅरियर चार्ज रेशोशी संबंधित वाहक सोल्यूशन्स समान प्रमाणात बफरमध्ये तयार केले गेले. वाहक द्रावण हळूहळू एपेनडॉर्फ ट्यूबमध्ये डीएनए सोल्यूशनसह जोडले गेले आणि 20 सेकंदांसाठी जोमाने ढवळले. कॉम्प्लेक्सची निर्मिती पूर्ण करण्यासाठी परिणामी मिश्रण खोलीच्या तपमानावर 30 मिनिटे सोडले गेले.
जटिल परिणामांचे विश्लेषण इथिडियम ब्रोमाइड विस्थापन पद्धतीद्वारे केले जाते. इथिडियम ब्रोमाइड फ्लूरोसेन्स व्हॅरिओस्कॅन फ्लॅश स्पेक्ट्रल स्कॅनिंग मल्टी-मोड रीडर (थर्मो, फिनलंड) वापरून मोजले गेले. इंटरकॅलेटिंग एजंट एथिडिअम ब्रोमाइड (400 ng/ml) सह डीएनए (20 μg/ml) मध्ये वाहक जोडल्यानंतर 590 nm (544 nm वर उत्तेजना) इथिडियम ब्रोमाइडचे विस्थापन दिसून आले. (F-Ff)/(Fb-Ff) सूत्र वापरून विस्थापनाची गणना केली गेली, जिथे Ff आणि Fb अनुक्रमे DNA च्या अनुपस्थितीत आणि उपस्थितीत इथिडिअम ब्रोमाइड फ्लोरोसेन्स तीव्रता आहेत. परिणाम अंजीर मध्ये दर्शविले आहेत.
उदाहरण 2 विट्रो ट्रान्सफेक्शन आयोजित करणे.
HeLa, A172, आणि CHO पेशी 48-वेल कल्चर प्लेट्स (Nunc) मध्ये 24 तास आधी 50,000 पेशी प्रति विहिरीमध्ये 500 μl मानक संस्कृती मिश्रण असलेल्या DMEM संस्कृती माध्यम (GIBCO), 10% गर्भाच्या बोवाइन सीरमचा समावेश होतो. (GIBCO), 2 mM ग्लूटामाइन, पेनिसिलिन (50 U/ml), स्ट्रेप्टोमायसिन (50 µg/ml) आणि 1 mM सोडियम पायरुवेटसह पूरक. कॉम्प्लेक्सचे निलंबन कल्चर प्लेटच्या प्रति विहिरीच्या 2 μg DNA च्या दराने उदाहरण 1 मध्ये वर्णन केलेल्या पद्धतीनुसार तयार केले गेले. DNA/वाहक कॉम्प्लेक्सच्या निलंबनाच्या 10 मिनिटांपूर्वी, पेशी DMEM सह अनेक वेळा धुतल्या गेल्या आणि प्रत्येक विहिरीत 15% ग्लिसरॉल आणि 1.5% इथेनॉल असलेले 500 μl माध्यम जोडले गेले. माध्यमात डीएनए/वाहक कॉम्प्लेक्सचे निलंबन जोडून संक्रमण केले गेले. कॉम्प्लेक्स बनवल्यानंतर, पेशी असलेल्या प्लेट्स थर्मोस्टॅटमध्ये 37 डिग्री सेल्सिअस आणि 5% CO 2 तापमानात 4 तास ठेवल्या गेल्या. उष्मायन वेळेनंतर, पेशी DMEM माध्यमाने धुतल्या गेल्या आणि प्रत्येक विहिरीमध्ये 500 μl मानक कल्चर मिश्रण जोडले गेले. कल्चर प्लेट थर्मोस्टॅटमध्ये 37 डिग्री सेल्सिअस आणि 5% CO 2 तापमानात 48 तास उष्मायन करण्यात आली, त्यानंतर मार्कर जनुक अभिव्यक्ती आढळून आली.
उदाहरण 3 विट्रोमध्ये संक्रमणानंतर ल्युसिफेरेस जनुक अभिव्यक्ती शोधणे.
कल्चर प्लेट्समधून माध्यम काढले गेले, पेशी 1x पीबीएस (पीएच 7.2) मध्ये धुतल्या गेल्या. 80 μl lysis बफर (25 M Gly-Gly, 15 mM MgSO 4, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF; pH 7.8) प्रत्येक विहिरीत जोडले गेले. लुसिफेरेस क्रियाकलाप मोजण्यासाठी अपारदर्शक भिंती असलेल्या पॉलिस्टीरिन प्लेट्समध्ये 50 μl लाइसेट हस्तांतरित केले गेले. मापन स्पेक्ट्रल स्कॅनिंग मल्टी-मोड रीडर व्हॅरिओस्कॅन फ्लॅश (थर्मो, फिनलंड) वापरून केले गेले. ल्युसिफेरेस फ्लॅश मिक्स (20 मिमी ट्रायसिन, 1.07 मिमी (MgCO 3) 4 Mg(OH) 2 × 5 H 2 O, 2.67 mM MgSO 4 , 0 1 mM EDTA, 33.3 mM DTT, ATPM 530 द्रावण वापरून मोजमाप केले गेले. , 270 μM acetyl coenzyme A, 470 μM luciferin). प्रत्येक मोजमाप 10 सेकंदांसाठी केले गेले. इन्स्ट्रुमेंट रीडिंग रिलेटिव लाइट युनिट्स (RLU) मध्ये प्राप्त झाले. कल्चर प्लेटच्या विहिरीतील सेल अर्कांमधून एकूण प्रोटीनच्या 1 मिलीग्राम सापेक्ष प्रकाश युनिटमध्ये प्रयोगाच्या परिणामांचे मूल्यमापन केले गेले. प्रत्येक विहिरीतील प्रथिनांची एकूण मात्रा प्रोटीन परख किट (बायो-रॅड) वापरून मोजली गेली, जी बोवाइन सीरम अल्ब्युमिनसाठी प्रमाणित वक्र आहे. परिणाम आकृती 2, 3, 4 मध्ये दर्शविले आहेत.