Szczepionka DNA(Również szczepionka genowa, na bazie szczepionki kwasy nukleinowe) - genetycznie zmodyfikowany konstrukt, który po wprowadzeniu do komórki zapewnia wytwarzanie białek patogenu lub antygenów nowotworowych i wywołuje odpowiedź immunologiczną. Wprowadzenie szczepionek DNA do organizmu nazywa się immunizacją genetyczną. Szczepienie DNA ma kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnymi szczepionkami. W szczególności wykazano, że takie szczepionki zapewniają nie tylko wytwarzanie przeciwciał (odporność humoralna), ale także specyficzną odpowiedź cytotoksyczną (odporność komórkową), co wcześniej było osiągalne tylko przy użyciu żywych szczepionek. Obecnie szczepionek DNA nie stosuje się w leczeniu ludzi, ale przewiduje się, że immunizacja genetyczna pomoże przezwyciężyć szereg chorób.

Historia stworzenia

Pomysł wykorzystania fragmentów DNA do szczepień pojawił się w latach 50. i 60. XX wieku. Po serii eksperymentów stwierdzono, że informacja genetyczna DNA zachowuje zdolność do transkrypcji i translacji po przeniesieniu do innej komórki. W tym samym roku odkryto, że wprowadzenie genomu wirusa polio do zwierząt stymuluje produkcję przeciwciał. Późniejsza aktywacja Odporność humoralna pokazano dla cząsteczek DNA pochodzących z czynników niezakaźnych. Od lat 90. laboratoria naukowe zaczęły coraz częściej badać immunostymulujące właściwości DNA. W 1992 roku Tang i współpracownicy wykazali, że gen ludzkiego hormonu wzrostu wstawiony do plazmidu ulega stabilnej ekspresji u myszy, a syntetyzowany hormon jest rozpoznawany przez układ odpornościowy jako antygen i stymuluje produkcję przeciwciał. Proces wprowadzania plazmidowego DNA w celu stymulacji odporności humoralnej został nazwany Tango „immunizacją genetyczną”. Jednak rok później inna grupa naukowców stwierdziła, że ​​wprowadzenie plazmidu kodującego białka wirusa grypy powoduje zarówno odpowiedź humoralną, jak i komórkową. Indukcję obu gałęzi odporności tego samego roku stwierdzono również dla plazmidu zawierającego geny HIV. Od 1995 roku zaczęły pojawiać się dowody na to, że szczepienie DNA może aktywować układ odpornościowy przeciwko rakowi. Około 20 lat temu odbyły się pierwsze badania kliniczne szczepionek DNA, które miały przede wszystkim wykazać bezpieczeństwo nowej metody. Pacjentom wstrzykiwano geny wirusa HIV, wirusa grypy, opryszczki, wirusowego zapalenia wątroby typu B, czynnika sprawczego malarii. Wyniki wszystkich testów były dość zachęcające: szczepionki DNA były konsekwentnie eksprymowane, wywoływały odpowiedź immunologiczną i nie powodowały poważnych skutków ubocznych, co było impulsem do dalszych badań.

Konstrukcja szczepionki DNA

Strukturalnie szczepionka DNA to sekwencja nukleotydowa wbudowana w wektor, który koduje określony antygen lub antygeny. Wektor w inżynierii genetycznej to cząsteczka kwasu nukleinowego, która służy do dostarczania materiału genetycznego do komórek i zapewnia jego replikację lub ekspresję. Wcześniej do transportu genów do komórki używano wektorów opartych na wirusach: zmodyfikowanego (osłabionego) wirusa ospy wietrznej, adenowirusów i retrowirusów. Wektory wirusowe są dość skuteczne, ale mają duże prawdopodobieństwo wystąpienia działań niepożądanych związanych ze stosunkowo wysoką immunogennością samego wektora. Dlatego dzisiaj najczęściej jako wektor stosuje się plazmid bakteryjny - małą stabilną kolistą cząsteczkę DNA zdolną do autonomicznej replikacji. Plazmid sam w sobie nie powoduje pożądanej specyficznej odpowiedzi immunologicznej, w tym celu wszyte są w niego geny białek immunogennych. Ponadto szczepionka DNA musi zawierać sekwencje regulatorowe niezbędne do ekspresji genów w komórkach eukariotycznych. Gotowy konstrukt DNA dostarczany jest do komórki bakteryjnej, gdzie zwiększa się liczba jego kopii. Następnie następuje izolacja i oczyszczanie plazmidów, które niosą pożądaną wstawkę.

Projekt wektora plazmidowego

Ważnym etapem w tworzeniu szczepionek DNA jest zaprojektowanie (konstrukcja) wektora. Obowiązkowymi strukturami wektora plazmidowego są miejsca restrykcyjne, marker selekcyjny i początek replikacji szczepionki DNA w komórce bakteryjnej. Aby mogła zajść synteza antygenu, szczepionka DNA musi zawierać promotor i sygnał poliadenylacji. Promotor jest ważnym czynnikiem skuteczności szczepionki, ponieważ determinuje siłę odpowiedzi immunologicznej: im większa ekspresja genu kodującego antygen wirusowy lub nowotworowy, tym silniejsza odpowiedź immunologiczna. Najczęściej stosowanym promotorem jest wirus SV40 lub wirus cytomegalii (CMV). Aby ustabilizować transkrypty mRNA, do plazmidu wprowadza się sygnał poliadenylacji, najczęściej pochodzący z genu bydlęcego hormonu wzrostu. (BGH) lub wirus SV40. Jako markery selekcyjne wybiera się bakteryjne geny oporności na antybiotyki, często gen oporności na kanamycynę. Przy projektowaniu szczepionek DNA najpopularniejszym miejscem pochodzenia replikacji Escherichia coli.

Selekcja genów do immunizacji

Wektor jest ważnym składnikiem szczepionki DNA, ale o jego immunogenności decyduje właśnie wstawka, czyli sekwencja DNA kodująca antygen. Spośród antygenów wirusowych białka fuzyjne najlepiej nadają się do immunizacji; są to stosunkowo konserwatywne białka, które umożliwiają wirusowi wniknięcie do komórki. W przypadku szczepienia przeciwko bakteriom Gram-dodatnim wskazane jest wstawienie do wektora plazmidowego genów tych białek bakteryjnych, które determinują patogenezę choroby. Spośród białek bakterii Gram-ujemnych wykazują one wysoką immunogenność. W terapeutycznych szczepionkach przeciwnowotworowych DNA stosuje się białka markerowe komórek rakowych.

Metody dostarczania szczepionek DNA do komórek

Gotowa szczepionka musi zostać dostarczona do organizmu człowieka lub zwierzęcia, gdzie jej celem są komórki prezentujące antygen (APC) – makrofagi, komórki dendrytyczne, limfocyty B. Tutaj nastąpi synteza i posttranslacyjna modyfikacja antygenu, po czym zostanie on wstawiony do błony komórkowej, aby przyciągnąć uwagę układu odpornościowego. Głównym problemem jest dostarczenie wystarczającej ilości plazmidu do APC. Metody dostarczania materiału genetycznego do komórki dzieli się zwykle na 2 grupy: wirusowe i niewirusowe. Ponieważ wektory wirusowe mają wiele istotnych wad, w tej części przedstawiono tylko niewirusowe metody dostarczania szczepionek DNA.

mikroiniekcja

Na początku lat 90. mikroiniekcje domięśniowe były najczęstszym sposobem wprowadzania DNA do komórki ze względu na prostotę metody. Aby to zrobić, DNA rozpuszcza się w wodzie lub roztwór izotoniczny w razie potrzeby dodać adiuwant (substancję wzmacniającą odpowiedź immunologiczną). Następnie za pomocą cienkiej szklanej rurki roztwór wstrzykuje się do tkanki mięśniowej, gdzie rolę APC pełnią komórki dendrytyczne. W jądrze komórki dendrytycznej szczepionka zaczyna ulegać ekspresji i następuje synteza białek antygenowych. Za pomocą mikroiniekcji DNA można wstrzyknąć podskórnie, do grasicy, wątroby, tkanka nowotworowa Jednak to właśnie w tkance mięśniowej obserwuje się najdłuższą (do roku) ekspresję szczepionki DNA. Dzięki wysokie stężenie Komórki Langerhansa (podtyp komórek dendrytycznych), atrakcyjnym celem dla szczepienia DNA jest skóra. Do podawania śródskórnego (podskórnego) stosuje się szereg mikroigieł, których długość wynosi kilkaset mikronów. Istnieją różne opcje szczepienia śródskórnego. Łatwiej jest objąć rozluźnienie za pomocą szeregu mikroigieł warstwy rogowej naskórka (zewnętrznej warstwy skóry, zwykle 10-20 mikronów) w celu zwiększenia jej przepuszczalności dla dalszego miejscowego wstrzyknięcia roztworu DNA. Skuteczniejsze jest zastosowanie mikroigieł pokrytych suchą szczepionką, która rozpuszcza się pod skórą. Skuteczność tej metody jest zwykle niska, ponieważ DNA najpierw dostaje się do przestrzeni międzykomórkowej, a dopiero potem zostaje zawarte w komórkach.

elektroporacja

Elektroporacja to tradycyjne podejście do dostarczania DNA do komórek bakteryjnych i kultur komórkowych oparte na zastosowaniu impulsu elektrycznego. Taki impuls tworzy pory w błonie komórkowej, co ułatwia wejście ujemnie naładowanego DNA. Metoda ta została przyjęta do dostarczania szczepionek DNA zwierzętom i ludziom i może znacznie zwiększyć skuteczność konwencjonalnej iniekcji. Urządzenie do elektroporacji zawiera źródło prądu elektrycznego oraz jednorazową siatkę, która składa się ze strzykawki i elektrod igłowych. Strzykawka wstrzykuje szczepionkę do tkanki mięśniowej, a elektrody wytwarzają pole elektryczne, które ułatwia wejście DNA do miocytów i komórek dendrytycznych. Do tej pory opracowano urządzenia, które mogą zwiększyć skuteczność szczepienia 1000 razy w porównaniu z konwencjonalnym zastrzykiem. Elektroporację można stosować zarówno domięśniowo, jak i wstrzyknięcie podskórne szczepionki DNA. Wady to niewielka bolesność w miejscu wstrzyknięcia, konieczność stosowania specjalistycznych urządzeń. Zamiast pola elektrycznego można zastosować pole magnetyczne. Takie urządzenia działają na tej samej zasadzie, ale w tym przypadku zabieg jest całkowicie bezbolesny i mniej szkodliwy dla komórek.

Działanie pola elektrycznego nie tylko zwiększa wchłanianie szczepionki DNA przez komórki, ale także stymuluje rozwój odpowiedzi immunologicznej. Zastosowanie elektroporacji prowadzi do niewielkich uszkodzeń tkanek – miejscowych proces zapalny. Kiedy komórki są uszkodzone, uwalniane są chemokiny, więc wysyłane są do nich makrofagi, limfocyty i komórki dendrytyczne. Zwiększenie stężenia komórek odpornościowych w miejscu wstrzyknięcia zwiększa skuteczność szczepionki.

Sonoporacja

Sonoporacja to metoda przenoszenia obcego DNA do komórek za pomocą ultradźwięków. Ultradźwięki zwiększają przepuszczalność błony komórkowej, dzięki czemu egzogenne DNA łatwiej przenika do wnętrza komórki. Sonoporacja została po raz pierwszy zastosowana do przeniesienia genów do komórki w 1986 roku. Ta metoda służy do wprowadzania cząsteczek DNA do komórek rogówki, mózgu, tkanka kostna, nerki, trzustka, tkanka embrionalna, mięśnie szkieletowe i sercowe. W porównaniu z innymi metodami sonoporacja jest mało zbadana, potrzeba znacznie więcej wysiłku, aby poprawić jej skuteczność, zwłaszcza na poziomie całego organizmu.

Transfekcja balistyczna

Transfekcja balistyczna polega na łuskaniu (bombardowaniu) narządów i tkanek mikrocząstkami metali ciężkich (złota, wolframu) o średnicy 1-3 mikronów pokrytych cząsteczkami DNA. Wprowadzona w ten sposób szczepionka DNA ulega ekspresji w komórkach docelowych, a ich produkty dostają się do krwioobiegu. Aby zapewnić przyspieszenie cząstek, stosuje się urządzenie podobne do broni strzeleckiej - pistolet genowy lub pistolet genowy. Mikrocząsteczki przechodzą przez błony komórkowe i przenoszą konstrukt genetyczny bezpośrednio do jądra komórkowego. Głębokość penetracji mikrocząstek z reguły jest niewielka - do 1 mm, dlatego metodę stosuje się głównie do transfekcji skóry lub sąsiednich tkanka chrzęstna. Specjalne warunki łuskania pozwalają mikrocząsteczkom wnikać na głębokość 4-5 mm i przenosić konstrukty genowe do włókien mięśni poprzecznie prążkowanych. Zazwyczaj komórki znajdujące się bezpośrednio w centrum strzału umierają, podczas gdy w strefie 0,6-1 cm od środka są to komórki, które z największym powodzeniem protransformują. Technologia ta nazywana jest również biobalistyką lub biolistyką.

Pierwszy pistolet genowy został stworzony przez grupę naukowców w latach 1983-1986 w celu transformacji komórek roślinnych. Był to pistolet opracowany z urządzenia do automatycznego wbijania gwoździ. DNA z genu reporterowego (markerowego) nałożono na kulkę wolframową i wystrzelono na szalkę Petriego. Ekspresja genu reporterowego wskazywała na skuteczność immunizacji. Obecnie cząsteczki złota lub srebra są używane do dostarczania DNA, ponieważ nie są toksyczne dla komórki, w przeciwieństwie do cząsteczek wolframu.

Pod wysokim ciśnieniem

W 1999 roku opracowano urządzenia do iniekcji, które są w stanie podawać szczepionkę DNA bez użycia igły. Takie urządzenia działają dzięki sile Lorentza: mały silny magnes wytwarza znaczne ciśnienie, przewodzi tłok, który wyrzuca produkt leczniczy z prędkością dźwięku. Zmieniając moc prądu, możesz wybrać głębokość wstrzyknięcia i dawkować leki. Procedura jest całkowicie bezbolesna i była wcześniej stosowana do podawania insuliny pacjentom z cukrzycą oraz do szczepień na dużą skalę. Istotną wadą tej metody jest to, że wysokie ciśnienie może teoretycznie zmienić strukturę wstrzykiwanych cząsteczek. Jednak ta technologia wprowadzania jest nadal ulepszana i obecnie opracowano urządzenia, które mogą dostarczać DNA na głębokość do 16 mm.

Jako część żywego wektora bakteryjnego

Żywe wektory bakteryjne to szczepy salmonela, Shigella Lub Listeria, które niosą mutację w genach biosyntezy lub inwazji, które eliminują chorobotwórczość i zdolność do utrzymania ich żywotności u żywiciela lub środowisko. Zamiast tego, geny niezbędne dla białek immunogennych są wstawiane do genomu bakteryjnego. Atenuowaną bakterię podaje się doustnie (przez usta, połykając) lub donosowo (wstrzykując do otworu nosowego), więc ta metoda szczepienia nie wymaga żadnego sprzętu. Ponadto takie podawanie stymuluje odpowiedź immunologiczną błony śluzowej, co jest ważne, ponieważ większość patogenów dostaje się do organizmu przez usta i otwory nosowe. Omijając żołądek, osłabiona bakteria dostaje się do jelita cienkiego. Ponadto bakteria przenika do płytek Peera - jelitowych węzłów chłonnych. Znajdując się w środku kępek Peyera, bakterie stają się celem dla makrofagów i przechodzą fagocytozę. W cytoplazmie makrofaga bakteria uwalnia szczepionkę DNA, po czym DNA dostaje się do jądra, a bakteria zostaje unieszkodliwiona przez układ odpornościowy.

Pakowanie w liposomy

Liposomy – kuliste formacje (o średnicy około 100 nm), składające się z podwójnej warstwy lipidowej. Liposomy są puste w środku, które zwykle są wypełnione rozpuszczalnikiem, ale mogą być używane do dostarczania różne substancje w tym szczepionki DNA. Ich hydrofobowa powłoka pozwala im łączyć się z błonami komórkowymi i transportować ich zawartość do wnętrza komórki. Wykorzystanie liposomów rozpoczęło się w 1965 roku i stało się potężnym motorem rozwoju bionanotechnologii.

Obiecującą metodą bezpośredniego wprowadzenia konstruktu DNA do komórek docelowych jest dostarczenie konstruktu genetycznego w postaci kationowych liposomów zbudowanych z dodatnio naładowanych lipidów. Kationowe liposomy z ujemnie naładowaną cząsteczką DNA tworzą kompleks DNA-lipid - lipopleks. Zaletą stosowania takich kompleksów jest możliwość przenoszenia dużej ilości informacji, niezakaźność, ponadto są one proste i niedrogie w produkcji. W 2003 roku powstały niezwykle małe, milimikronowe liposomy pokryte polimerem glikolu polietylenowego, które są w stanie przenosić terapeutyczne DNA przez barierę krew-mózg i dostarczać je do neuronów mózgu, co wcześniej było niemożliwe.

Składa się z polyplexu

Polipleksy, układy składające się z dodatnio naładowanych polimerów (polikationów) i ujemnie naładowanych cząsteczek DNA, służą do wprowadzania do komórki dużych konstruktów DNA (>10 kb). Wielkość takich kompleksów jest mniejsza niż 100 nm, co z jednej strony naraża je na trawienie przez makrofagi (ponieważ reagują na cząsteczki większe niż 200 nm), z drugiej strony są na tyle duże, że nie dają się przefiltrować nerki.

Polikationy kondensują cząsteczkę DNA w kompleksy, zapewniając w ten sposób jej stabilność i ochronę przed działaniem nukleaz. Białka kationowe, syntetyczne homopolimery aminokwasów (polilizyny, poliargininy), polisacharyd chitozanu, polietylenoamina mogą służyć jako polimery wiążące DNA. Zwykle polikation występuje w nadmiarze w składzie polipleksu, w wyniku czego kompleks ten jest rozpuszczalny i naładowany dodatnio. Jeśli do polipleksu jest przyłączony ligand dla określonego receptora komórkowego, wówczas szczepionka DNA może być skierowana do określonego typu komórek. Proces dostarczania materiału genetycznego w obrębie polipleksu obejmuje dwa etapy: zewnątrzkomórkowy (droga z miejsca wstrzyknięcia do komórek docelowych) i wewnątrzkomórkowy (interakcja z komórkami docelowymi, endocytoza, wyjście z endosomów, dostarczenie do jądra). Pierwszą barierą do pokonania przez kompleks jest krew i macierz zewnątrzkomórkowa. Dlatego dobiera się takie parametry fizyczne i chemiczne polipleksu, aby zwiększyć jego stabilność, uniknąć niepożądanych interakcji z białkami krwi oraz reakcji immunologicznej wywołanej chemicznym charakterem polikationu. Po dotarciu do komórek docelowych polipleks jest wchłaniany przez błonę plazmatyczną, wchłaniany przez endocytozę, po czym musi opuścić endosom i zdysocjować na kationowy polimer i cząsteczkę DNA. Wolne DNA jest wysyłane do jądra, a kationy polimeru opuszczają komórkę i są wydalane z organizmu.

Charakterystyka najpopularniejszych metod dostarczania szczepionek DNA
metoda	Zalety	Wady
Iniekcje domięśniowe lub podskórne	Nie jest wymagany żaden specjalny sprzęt Ekspresja stała lub długoterminowa DNA jest przenoszone do sąsiednich tkanek	Słaba efektywność Potrzebujesz stosunkowo duża liczba DNA
elektroporacja	Wysoka wydajność	uszkodzenie tkanek
pistolet genowy	Wysoka celność Wymaga niewielkiej ilości DNA	Wymaga obojętnych mikrocząstek Uszkodzenie komórek w miejscu strzału
Wprowadzenie z powodu wysokiego ciśnienia	Stosunkowo prosta metoda Nie ma potrzeby stosowania mikrocząstek DNA może penetrować na głębokość od kilku mm do 1,5 cm	Wpływa na strukturę DNA Niska skuteczność immunizacji Wymaga dużej ilości DNA (do 300 mcg)
Pakowanie w liposomy	Wysoka wydajność in vitro Łatwość produkcji Duża pojemność Można łączyć z innymi metodami Na podanie dożylne szczepionka ma potencjał dotarcia do wszystkich tkanek Podanie donosowe zapewnia ekspresję szczepionki w błonie śluzowej nosa i produkcję immunoglobulin klasy A (IgA)	Możliwa toksyczność Słaba efektywność na żywo

Mechanizm rozwoju odpowiedzi immunologicznej

Syntetyzowany w komórce antygen podlega obróbce, po czym jest prezentowany komórkom immunokompetentnym. Przetwarzanie to rozszczepianie białka antygenowego na immunogenne fragmenty peptydowe. Prezentacja oznacza przedłożenie fragmentu antygenu połączonego z cząsteczkami głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) komórek immunokompetentnych. Istnieją dwie najważniejsze klasy tych cząsteczek: MHC klasy I (MHC-I) i MHC klasy II (MHC-II). Aby związać się z cząsteczkami każdej klasy, antygen jest przygotowywany w wyspecjalizowanych przedziałach komórki. Endogenne białka antygenowe są kierowane do proteasomu w celu degradacji, po czym są prezentowane w kompleksie z MHC-I na powierzchni komórki. Tutaj, kiedy się spotykają, są rozpoznawane przez limfocyty T CD8 + (zabójcy T), które realizują cytotoksyczną odpowiedź immunologiczną. Białka egzogenne są rozszczepiane przez proteazy lizomnimalne, włączane do MHC-II i rozpoznawane przez receptory komórek T CD4+ (pomocniczych). Te ostatnie powodują zarówno odpowiedzi komórkowe, jak i humoralne.

Prezentacja antygenu przez szlak MHC-I

Szczepienie DNA zapewnia synteza endogenna antygen, więc ta ścieżka jest dominująca. Przetwarzanie antygenu wzdłuż szlaku MHC-I zachodzi w kilku etapach. Białko syntetyzowane w jądrze jest transportowane do cytoplazmy, proteasom jest rozszczepiany na krótkie peptydy - epitopy, które są przenoszone do retikulum endoplazmatycznego (EPR) przez specjalne białka transportujące antygen (TAP). W EPR każdy epitop jest łączony z cząsteczką MHC-I, po czym utworzony kompleks jest przesyłany do aparatu Golgiego (AG) w celu glikozylacji. Stamtąd kompleks w składzie pęcherzyka zmierza do błony plazmatycznej. Po fuzji pęcherzyka z błoną plazmatyczną kompleks pojawia się na powierzchni komórki, gdzie jest rozpoznawany przez receptory T-killer, które wykazują działanie cytotoksyczne.

Prezentacja antygenu przez szlak MHC-II

Głównym źródłem peptydów wiążących się z MChS-II są białka egzogenne, które dostały się do komórki na drodze endocytozy. Wykazano jednak, że niektóre białka wewnątrzkomórkowe mogą być również prezentowane w kompleksie z MChS-II. W tym przypadku nowo zsyntetyzowane białka po wejściu do cytoplazmy przenoszone są do lizosomów, gdzie antygen jest rozszczepiany pod działaniem kwaśnych proteaz. Następnie lizosom zawierający epitopy łączy się z pęcherzykiem niosącym cząsteczkę MChS-II. Wewnątrz zrośniętego pęcherzyka tworzy się kompleks epitop-MChS-II, który po fuzji pęcherzyka z plazmalemmą jest wynoszony na powierzchnię komórki. Tutaj kompleks ten jest rozpoznawany przez receptory T-pomocnicze, co powoduje ich aktywację. Prowadzi to do stymulacji zarówno odporności komórkowej (aktywacja limfocytów T), jak i humoralnej (aktywacja limfocytów B).

Tradycyjne szczepienie rozpuszczalnymi antygenami białkowymi ma na celu mobilizację T-pomocników. Stosunkowo niska odpowiedź T-pomocników jest jedną z wad szczepionek DNA. Również obecna generacja szczepionek DNA nie jest zdolna do indukowania produkcji wysokich mian przeciwciał. Aby zwiększyć aktywację komórek pomocniczych T, antygen musi zostać przekierowany na szlak MChS-II. W tym celu w szczepionkę DNA wbudowany jest sygnał lokalizacji lizosomalnej; zsyntetyzowany antygen zostanie wysłany do lizosomów, co oznacza, że ​​podąży ścieżką MChS-II

Strategie poprawy skuteczności szczepionki DNA

Główne pytanie dotyczące przyszłości szczepionek DNA dotyczy tego, jak zwiększyć ich skuteczność. Obecnie prowadzonych jest wiele badań mających na celu optymalizację opracowanych szczepionek DNA. Poszukiwanie rozwiązania odbywa się w dwóch kierunkach: zwiększenia ekspresji szczepionki oraz zwiększenia immunogenności zakodowanego antygenu.

Optymalizacja elementu transkrypcyjnego

Ważnym składnikiem szczepionki DNA jest promotor. Promotory bakteryjne nie nadają się do ekspresji antygenów w komórkach ssaków, więc zamiast nich zastosowano promotory wirusów onkogennych. Teraz, aby poprawić bezpieczeństwo szczepionek, zostały one zastąpione promotorami z obiektów nierakotwórczych, takich jak ludzki wirus cytomegalii (CMV). W przypadku większości szczepionek DNA ten promotor jest optymalnym wyborem: ulega silnej ekspresji w wielu różnych komórkach. Do ekspresji genów w określonych tkankach obiecujące jest wykorzystanie promotorów specyficznych dla tego typu tkanek. Na przykład zastosowanie promotora mięśniowej CPK po podaniu prowadzi do dziesięciokrotnego wzrostu syntezy przeciwciał i indukcji odpowiedzi komórek T niż zastosowanie podobnej szczepionki DNA z promotorem CMV. Promotor genu desminy kodującego jedno z białek cytoszkieletu również wykazywał wysoką skuteczność w miocytach. W celu zwiększenia ekspresji szczepionki DNA w keratynocytach (komórkach tkanki nabłonkowej) stosuje się promotory genu metalotioneiny (białka wiążącego metale ciężkie) lub genu 3 hydroksylazy witaminy D.

Poziom inicjacji transkrypcji ma tendencję do wzrostu za konto użytkowania silny promotor i wzmacniacz, a funkcje zakończenia mogą stać się czynnikiem ograniczającym. Wydajność poliadenylacji i obróbki pierwotnego transkryptu RNA zmienia się w zależności od sekwencji sygnału poliA. Oznacza to, że sekwencja poliadenylacji wpływa na syntezę antygenu. Na przykład szeroko stosowany sygnał poliA wirusa SV40 jest mniej skuteczny niż sygnał poliadenylacji króliczego genu β-globiny lub genu bydlęcego hormonu wzrostu.

Dla sprawnej translacji mRNA ssaków musi mieć tzw Sekwencja Kozaka. Wstawienie tej sekwencji do konstruktu DNA może znacznie zwiększyć poziom syntezy antygenu. Aby polimeraza RNA NIE pominęła kodonu stop genu i nie nastąpiła synteza wydłużonego białka, które nie może następnie uzyskać prawidłowej stylizacji, gen może zostać zakończony linia podwójna.

Projektując szczepionki DNA też się starają zoptymalizować jego kodony. Procedura optymalizacyjna polega na zamianie kodonów w sekwencji genu w taki sposób, aby sekwencja aminokwasowa białka nie uległa zmianie, ale wzrosła wydajność translacji jego mRNA. Powodem jest to, że większość aminokwasów jest kodowana przez więcej niż jedną granicę. Każdy kodon ma swój własny tRNA, a reprezentacja różnych tRNA w komórce nie jest taka sama, a także zmienia się w zależności od rodzaju organizmu. Kodony dobierane są w taki sposób, aby obecność pożądanego tRNA podczas syntezy antygenu nie stała się czynnikiem ograniczającym.

Optymalizacja antygenu

Chociaż siła odpowiedzi immunologicznej koreluje z poziomem ekspresji szczepionki DNA, to jednak dla każdego antygenu występuje pewien plateau, po którym wzrost ilości białka antygenowego spowoduje wzrost produkcji przeciwciał. Jednocześnie można uzyskać silniejszą odpowiedź immunologiczną poprzez optymalizację antygenu. Na przykład przez łączenie antygenu z ligandem do specyficznego receptora dla komórek prezentujących antygen. Takim ligandem może być białko markerowe CD40, domena zewnątrzkomórkowa kinazy tyrozynowej-3 w kształcie Fms lub antygen-4 zabójcy T. Dzięki interakcji ligand-receptor zwiększa się skuteczność wychwytywania białka antygenowego APC.

Ułatwiają degradację antygenu w proteasomie lub lizosomie stymulują również odpowiedź immunologiczną. Aby wzmocnić cięcie proteolityczne antygenu, do jego sekwencji wstawiany jest sygnał ubikwitynacji. Błąd cytatu: Złe wywołanie: tag referencyjny bez tytułu musi zawierać dane wejściowe. Stosowanie szczepionek DNA kodujących zamiast całego antygenu, wiele epitopów różne pochodzenie, pozwala znacznie rozszerzyć spektrum odpowiedzi immunologicznej.

W przypadku szczepionek przeciwnowotworowych DNA połączenie jest skuteczne „antygen nowotworowy + antygen wirusowy lub bakteryjny”. Na przykład połączenie antygenu nowotworowego z epitopem toksyny tężcowej znacznie zwiększa aktywację limfocytów T zabójców przeciwko komórkom nowotworowym.

Włączenie adiuwantów

W przypadku stosowania tradycyjnych szczepionek dodaje się do nich adiuwanty w celu zwiększenia odpowiedzi immunologicznej. Szczepionka DNA ma pochodzenia bakteryjnego, więc ona sama jest immunostymulantem. W celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej do szczepionki DNA wprowadza się geny adiuwantowe lub stosuje się dodatkowy plazmid kodujący białka immunostymulujące.

Immunostymulujące działanie bakteryjnych dinukleotydów CpG

Funkcja plazmidu nie ogranicza się do dostarczania genów do komórek. Już w 1893 roku odkryto, że mieszanka lizatów bakteryjnych zmniejsza postęp guzów nowotworowych, ale dopiero w 1983 roku ustalono, że immunostymulujące właściwości lizatu wynikają z cząsteczek DNA bakterii. W 1995 roku wykazano, że motywy CpG w bakteryjnym DNA powodują stymulację immunologiczną. W bakteriach, jak również w wirusach DNA, motywy te są niemetylowane. Przeciwnie, u ludzi i wyższych naczelnych cytozyna w większości dinukleotydów CpG zawiera grupę metylową. Dlatego motywy braku metylacji CpG są postrzegane przez organizm ludzki jako wzorce molekularne związane z patogenem (PAMP). Związki Ramriego rozpoznawane są przez receptory Toll-podobne, które w zależności od typu ligandu dzielą się na kilka typów. Motywy demetylacji CpG są rozpoznawane przez receptor TLR-9 zlokalizowany na błonach retikulum endoplazmatycznego limfocytów B, komórek dendrytycznych i komórek NK. Związanie receptora z niemetylowanymi motywami CpG uruchamia kaskadę reakcji indukujących syntezę cytokin prozapalnych – interferonu-1 i IL-12.

Ekspresja cytokin i innych immunomodulatorów

Do szczepienia DNA geny cytokin są najczęściej stosowane jako adiuwanty. Cytokiny to klasa cząsteczek białkowych, które regulują interakcje międzykomórkowe i międzyukładowe w organizmie, w szczególności funkcjonowanie układu odpornościowego. Wszystkie cytokiny, a znanych jest ich ponad 30, mogą modulować odpowiedź immunologiczną. Cytokiny IL2, IL-12, interferon γ, IL-15, IL-18 i IL-23 mają stymulujący wpływ na T-pomocników pierwszej klasy. Do cytokin modulujących działanie T-pomocników drugiej klasy należą: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 I IL-13. Typ cytokiny jest wybierany zgodnie z tym, jaki rodzaj odpowiedzi immunologicznej ma być wzmocniony.

Możliwe jest osiągnięcie wzrostu odpowiedzi immunologicznej za pomocą chemokin. Chemokiny to rodzina cytokin, które mogą powodować chemotaksję komórek wrażliwych, w tym odpornościowych. W szczególności, receptory chemokin znajdują się na komórkach chemokin prezentujących antygen. Wiązanie chemokiny z jej receptorem prowadzi do endocytozy kompleksu antygen-chemokina wewnątrz APC. Strategia ta jest skutecznie wykorzystywana zarówno przy opracowywaniu przeciwwirusowych szczepionek DNA, jak i przeciwnowotworowych.

Funkcję adiuwanta może pełnić również białko HSP70 (białka szoku cieplnego, białka szoku cieplnego). Immunostymulujące działanie HSP70 opiera się na jego zdolności do wnikania do przestrzeni pozakomórkowej i wiązania się z receptorami APC. Mechanizm transportu HSP70 na zewnątrz nie został jeszcze w pełni wyjaśniony, ale najprawdopodobniej istnieje kilka dróg – egzocytoza, wydzielanie na zewnątrz lub wyjście przez kanał. Wiązanie HSP70 z jego receptorem powoduje aktywację komórek dendrytycznych, pośredniczy w prezentacji antygenu i stymuluje produkcję chemokin. Ponieważ antygen jest połączony z HSP70, wchodzi również do przestrzeni pozakomórkowej, dzięki czemu może być prezentowany przez szlak MES-II i aktywować limfocyty B. Szczepionki DNA wykorzystują bakteryjny gen HSP70, aby uniknąć reakcji autoimmunologicznych.

Zalety i wady szczepionek DNA

Metoda szczepienia DNA ma szereg zalet, z których najważniejszą jest wyzwalanie zarówno humoralnej, jak i komórkowej odpowiedzi immunologicznej. Szczepionki oparte na DNA zapewniają długotrwałą ekspresję antygenu, a co za tym idzie, stabilną odpowiedź immunologiczną. DO dodatkowe czynniki Czynniki przyczyniające się do rozwoju immunizacji DNA obejmują prostotę i niski koszt produkcji szczepionki.

Zalety

Wady

Antygen uzyskuje natywną konformację Aktywacja obu gałęzi odporności: humoralnej i komórkowej Zsyntetyzowany antygen może być selektywnie kierowany na szlak MES-I lub MES-II Może selektywnie działać na różne populacje T-pomocników Zapewnij długotrwałą ekspresję antygenu Proste i szybkie w wykonaniu Niski koszt produkcji Nie wymagają specjalnych warunków przechowywania Może być stosowany zarówno w profilaktyce, jak i leczeniu chorób Potencjalnie skuteczny przeciwko szerokiej gamie chorób: bakteryjnych, wirusowych, autoimmunologicznych i nowotworowych

Słaba immunogenność W przypadku wektorów wirusowych istnieje ryzyko integracji obcego DNA z genomem komórki Możliwy rozwój reakcji autoimmunologicznych Wektory plazmidowe i wirusowe mogą wywoływać niespecyficzną odpowiedź immunologiczną

Stosowanie szczepionek DNA

Pierwsze badania kliniczne szczepionek DNA wraz z bezpieczeństwem nowej metody wykazały jej niską skuteczność. Realizując obietnicę immunizacji DNA, laboratoria naukowe wraz z firmami biotechnologicznymi skierowały swoje wysiłki na optymalizację nowej metody iw ciągu kilku lat poczyniono znaczne postępy. W 2005 roku FDA zatwierdziła pierwszą szczepionkę DNA. Administracja Jedzenia i Leków) do stosowania u zwierząt. Od 2013 roku ponad sto szczepionek DNA jest w badaniach klinicznych, a cztery szczepionki DNA są dopuszczone do stosowania w produkcji zwierzęcej.

Szczepionki DNA w weterynarii

Wszystkie cztery zatwierdzone przez FDA szczepionki są oparte na plazmidach. Dla trzech z nich producent zalecił sposób podania – domięśniowo, dla szczepionki LifeTide® – iniekcję połączoną z elektroporacją. Jeśli pozostałe szczepionki mają na celu aktywację układu odpornościowego, to w przypadku szczepionki LifeTide® efekt immunostymulujący jest dodatkowy. Produktem szczepionki jest Somatoliberin, hormon stymulujący uwalnianie hormonu wzrostu i prolaktyny przez przysadkę mózgową. Działanie dwóch ostatnich hormonów u świń prowadzi do wzrostu masy zwierząt i zwiększenia liczby miotów. Jednocześnie wprowadzenie do organizmu zwierząt plazmidu kodującego Somatoliberynę stymuluje produkcję limfocytów T, naturalnych zabójców, a tym samym zwiększa odporność immunologiczną organizmu.

Marka szczepionki	Rok licencji	Cel	Zwierzę	Produkt szczepionkowy	Cel szczepionki
Zachodni Nil-Innovator® (USA)	2005	wirus Zachodniego Nilu	Konie	Białko strukturalne wirusa PreM-E	Ochrona przed wirusem
Apex-IHN® (Kanada)	2005	Czynnik sprawczy zakaźnej martwicy tkanki krwiotwórczej	Ryba z rodziny łososiowatych	Wirusowa glikoproteina	Zwiększenie ilości i jakości pokarmu dla ryb
LifeTide® SW 5 (Australia)	2008	Hormon wzrostu	Świnie i inne zwierzęta gospodarskie	Świńska somatoliberyna	Zwiększony miot u loch; znacznie zmniejsza zmniejszenie śmiertelności i zachorowalności okołoporodowej
ONCEPT® (USA)	2010	Czerniak	Psy	Ludzka tyrozynaza	Jako alternatywa radioterapia I interwencja chirurgiczna w leczeniu czerniaka

Perspektywy szczepienia DNA

Szczepionki DNA raka

Podczas gdy indukcja komórkowej i humoralnej odpowiedzi immunologicznej została przekonująco wykazana dla obce antygeny związany z choroba zakaźna, stosowanie szczepionek DNA w leczeniu raka było jak dotąd mniej skuteczne. Indukcja skutecznej odporności przeciwnowotworowej jest trudnym zadaniem. Badania kliniczne potwierdzony ogólne bezpieczeństwo i niską toksyczność przeciwnowotworowych szczepionek DNA, jednak skuteczność wywoływanej przez nie odpowiedzi immunologicznej okazała się słaba, a działanie przeciwnowotworowe w niektórych przypadkach generalnie wątpliwe.

Szczepionki DNA przeciwko patogenom wirusowym i bakteryjnym

Szczepionka DNA przeciwko próchnicy

Przyczyną próchnicy jest lokalna zmiana pH w wyniku fermentacji (glikolizy) węglowodanów przeprowadzanej przez bakterie. Naukowcy z Wuhan Institute of Virology (Chiny) opracowali szczepionkę DNA skierowaną przeciwko jednemu z patogenów próchnicy - Streptococcus mutans. Szczepionka jest oparta na plazmidzie i koduje dwa białka: białko powierzchniowe Św. mutans PAc i flagelina, pochodzące z bakterii Salmonella który działa jako adiuwant. Na etapie badań przedklinicznych szczepionkę podawano donosowo gryzoniom laboratoryjnym, po czym u zwierząt sprawdzono poziom immunoglobulin G w surowicy krwi i wydzielniczych immunoglobulin A w ślinie. Po badaniach naukowcy stwierdzili, że poziom białek odpornościowych zarówno we krwi, jak i ślinie wzrósł, ale co ważniejsze, zahamowany został wzrost kolonii. Streptococcus mutans na szkliwo zębów. Oznacza to, że zęby szczepionych zwierząt były lepiej chronione przed próchnicą.

Szczepionki DNA i leczenie chorób autoimmunologicznych

Szczepionka DNA na cukrzycę typu 1

Cukrzyca typu 1 charakteryzuje się utratą komórek beta produkujących insulinę, zlokalizowanych w wyspach trzustkowych Langerhansa. główny powód utrata komórek beta - autoimmunologiczna porażka T-killerów. W celu ochrony komórek beta przed nadaktywnym układem odpornościowym naukowcy z uniwersytetów Stanford (USA) i Leiden (Holandia) opracowali szczepionkę DNA BHT-3021. Szczepionka została stworzona na bazie plazmidu i koduje prekursor insuliny, proinsulinę. To jest szczepionka działająca wstecz: jeśli konwencjonalne szczepionki powinny się aktywować reakcje immunologiczne, to BHT-3021, wręcz przeciwnie, neutralizuje cytotoksyczne działanie T-killerów skierowanych przeciwko wysepkom Langerhansa.

W pierwszej fazie badań klinicznych BHT-3021 wykazał swoją skuteczność na grupie 80 osób. Połowa z nich otrzymywała domięśniowe zastrzyki BHT-3021 co siedem dni przez 12 tygodni, a druga połowa otrzymywała placebo. Po tym okresie grupa, która otrzymała szczepionkę, wykazała wzrost poziomu peptydów C we krwi, co wskazuje na przywrócenie funkcji komórek beta. U jednego z uczestników nie odnotowano żadnych poważnych skutków ubocznych. Działanie szczepionki utrzymywało się przez 2 miesiące.

Wstęp

1 Główne grupy enzymów inżynierii genetycznej

1.1 Enzymy restrykcyjne

1.1.1 Mechanizm działania restrykcji

1.1.2 Budowa map ograniczeń

1.3 Ligazy

2 Wprowadzenie nowego genu do komórki

2.1 Regulacja ekspresji genów u prokariotów

2.2 Metody bezpośredniego wprowadzania genu do komórki

2.3 Wprowadzenie genów do komórek ssaków

2.4 Transformacja genetyczna komórek somatycznych ssaków

2.5 Terapia genowa

2.6 Pozyskiwanie zwierząt transgenicznych

Wniosek

Bibliografia

Wstęp

Inżynieria genetyczna to konstruowanie in vitro funkcjonalnie aktywnych struktur genetycznych (rekombinowane DNA), czyli innymi słowy tworzenie sztucznych programów genetycznych (Baev A.A.). Według E. S. Piruzyana inżynieria genetyczna to system metod eksperymentalnych, które umożliwiają konstruowanie sztucznych struktur genetycznych w laboratorium (w probówce) w postaci tzw. rekombinowanych lub hybrydowych cząsteczek DNA.

Mówimy o ukierunkowanej, zgodnie z ustalonym programem, budowie molekularnych systemów genetycznych poza organizmem z późniejszym wprowadzeniem ich do żywego organizmu. W tym przypadku zrekombinowane DNA staje się integralną częścią aparatu genetycznego organizmu biorcy i nadaje mu nowe unikalne właściwości genetyczne, biochemiczne, a następnie fizjologiczne.

Celem stosowanej inżynierii genetycznej jest zaprojektowanie takich rekombinowanych cząsteczek DNA, które po wprowadzeniu do aparatu genetycznego nadałyby organizmowi właściwości przydatne dla człowieka.

Technologia rekombinacji DNA wykorzystuje następujące metody:

Specyficzne cięcie DNA przez nukleazy restrykcyjne, przyspieszające izolację i manipulację poszczególnymi genami;

Szybkie sekwencjonowanie wszystkich nukleotydów oczyszczonego fragmentu DNA, co pozwala na określenie granic genu i kodowanej przez niego sekwencji aminokwasowej;

Konstrukcja rekombinowanego DNA;

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych, która umożliwia wykrywanie określonych sekwencji RNA lub DNA z większą dokładnością i czułością w oparciu o ich zdolność do wiązania komplementarnych sekwencji kwasów nukleinowych;

klonowanie DNA: amplifikacja in vitro w reakcji łańcuchowej polimerazy lub wprowadzenie fragmentu DNA do komórki bakteryjnej, która po takiej transformacji odtwarza ten fragment w milionach kopii;

Wprowadzenie rekombinowanego DNA do komórek lub organizmów.

Historia inżynierii genetycznej

Inżynieria genetyczna pojawiła się dzięki pracy wielu badaczy z różnych dziedzin biochemii i genetyki molekularnej. Białka od wielu lat uważane są za główną klasę makrocząsteczek. Pojawiło się nawet przypuszczenie, że geny mają charakter białkowy. Dopiero w 1944 roku Avery, McLeod i McCarthy wykazali, że DNA jest nośnikiem informacji dziedzicznej. Od tego czasu rozpoczęto intensywne badania nad kwasami nukleinowymi. Dziesięć lat później, w 1953 roku, J. Watson i F. Crick stworzyli model dwuniciowego DNA. Ten rok jest uważany za rok narodzin biologii molekularnej.

Na przełomie lat 50. i 60. XX wieku właściwości kod genetyczny, a pod koniec lat 60. eksperymentalnie potwierdzono jego uniwersalność. Nastąpił intensywny rozwój genetyki molekularnej, której przedmiotem była E. coli, jej wirusy i plazmidy. Opracowano metody izolowania wysoce oczyszczonych preparatów nienaruszonych cząsteczek DNA, plazmidów i wirusów. DNA wirusów i plazmidów zostało wprowadzone do komórek w postaci biologicznie aktywnej, zapewniającej jego replikację i ekspresję odpowiednich genów. W latach 70. odkryto szereg enzymów katalizujących reakcje transformacji DNA. Enzymy restrykcyjne i ligazy DNA odgrywają szczególną rolę w rozwoju metod inżynierii genetycznej.

Historię rozwoju inżynierii genetycznej można podzielić na trzy etapy. Pierwszy etap związany jest z udowodnieniem fundamentalnej możliwości otrzymywania rekombinowanych cząsteczek DNA in vitro. Prace te dotyczą wytwarzania hybryd między różnymi plazmidami. Udowodniono możliwość tworzenia rekombinowanych cząsteczek przy użyciu oryginalnych cząsteczek DNA z różnych gatunków i szczepów bakterii, ich żywotność, stabilność i funkcjonowanie.

Drugi etap związany jest z rozpoczęciem prac nad uzyskaniem rekombinowanych cząsteczek DNA pomiędzy genami chromosomalnymi prokariotów a różnymi plazmidami, wykazującymi ich stabilność i żywotność.

Trzeci etap to rozpoczęcie prac nad włączeniem genów eukariotycznych, głównie genów zwierzęcych, do cząsteczek DNA wektora (DNA wykorzystywanego do przenoszenia genów i zdolnego do integracji z aparatem genetycznym komórki biorcy).

Formalnie za datę narodzin inżynierii genetycznej należy uznać rok 1972, kiedy to P. Berg, S. Cohen, H. Boyer i współpracownicy stworzyli w Stanford pierwszy rekombinowany DNA zawierający fragmenty DNA wirusa SV40, bakteriofaga i E. coli Uniwersytet.

1 Główne grupy enzymów inżynierii genetycznej

Inżynieria genetyczna jest potomkiem genetyki molekularnej, ale swoje narodziny zawdzięcza sukcesom enzymologii genetycznej i chemii kwasów nukleinowych, ponieważ enzymy są instrumentami manipulacji molekularnej. Jeśli czasem możemy pracować z komórkami i organellami komórkowymi za pomocą mikromanipulatorów, to żadne, nawet najmniejsze instrumenty mikrochirurgiczne nie pomogą w pracy z makrocząsteczkami DNA i RNA. Co robić? Enzymy działają jak „skalpel”, „nożyczki” i „nici do szycia”.

Tylko oni mogą znaleźć określone sekwencje nukleotydów, „wyciąć” tam cząsteczkę lub odwrotnie „cerować” dziurę w łańcuchu DNA. Enzymy te działają w komórce od dawna, wykonując pracę replikacji (podwajania) DNA podczas podziału komórki, naprawy uszkodzeń (przywracania integralności cząsteczki), w procesach odczytu i przekazywania informacji genetycznej z komórki do komórki lub w komórce. Zadaniem inżyniera genetycznego jest wybranie enzymu, który spełniałby postawione zadania, czyli mógłby pracować z określonym odcinkiem kwasu nukleinowego.

Należy zauważyć, że enzymy stosowane w inżynierii genetycznej nie są gatunkowo specyficzne, więc eksperymentator może łączyć fragmenty DNA dowolnego pochodzenia w jedną całość w wybranej przez siebie sekwencji. Dzięki temu inżynieria genetyczna może pokonać bariery gatunkowe ustanowione przez naturę i przeprowadzić krzyżowanie międzygatunkowe.

Enzymy stosowane w konstrukcji rekombinowanego DNA można podzielić na kilka grup:

Enzymy wytwarzające fragmenty DNA (enzymy restrykcyjne);

Enzymy syntetyzujące DNA na matrycy DNA (polimeraza) lub RNA (odwrotna transkryptaza);

Enzymy łączące fragmenty DNA (ligazy);

Enzymy umożliwiające zmianę struktury końców fragmentów DNA.

1.1 Enzymy restrykcyjne

Ogólnie przyjmuje się, że terminy „enzym restrykcyjny”, „endonukleaza restrykcyjna” i „endodeoksyrybonukleaza specyficzna dla miejsca” są uważane za synonimy.

Wszystkie bakteryjne endonukleazy restrykcyjne rozpoznają specyficzne, raczej krótkie sekwencje DNA i wiążą się z nimi. Procesowi temu towarzyszy cięcie cząsteczki DNA albo w samym miejscu rozpoznawania, albo w innym miejscu, które jest określone przez rodzaj enzymu. Oprócz aktywności restrykcyjnej szczep bakteryjny ma zdolność metylacji DNA; proces ten charakteryzuje się taką samą specyficznością dla sekwencji DNA jak dla restrykcji. Metylaza dodaje grupy metylowe do reszt adeniny lub cytozyny w tym samym miejscu, w którym wiąże się enzym restrykcyjny. W wyniku metylacji miejsce staje się odporne na restrykcję. Dlatego metylacja chroni DNA przed cięciem.

Istnieją 3 główne klasy restrykcji: 1, 2 i 3.

Wszystkie enzymy restrykcyjne rozpoznają ściśle określone sekwencje na dwuniciowym DNA, ale enzymy restrykcyjne klasy 1 dokonują pęknięć w dowolnych punktach cząsteczki DNA, a enzymy restrykcyjne klasy 2 i 3 rozpoznają i rozszczepiają DNA w ściśle określonych punktach w obrębie rozpoznawania miejsc lub w ustalonej odległości od nich.

Enzymy typu 1 i 3 mają złożoną budowę podjednostek i wykazują dwa rodzaje aktywności – modyfikującą (metylującą) oraz endonukleazę zależną od ATP.

Enzymy drugiej klasy składają się z 2 oddzielnych białek: endonukleazy restrykcyjnej i metylazy modyfikującej, dlatego w inżynierii genetycznej stosuje się tylko enzymy klasy 2. Potrzebują jonów magnezu jako kofaktorów.

Obecnie wyizolowano ponad 500 restryktaz klasy 2, jednak wśród enzymów wyizolowanych z różnych mikroorganizmów są takie, które rozpoznają te same sekwencje DNA. Takie pary lub grupy nazywane są izoschizomerami. Rozróżnia się izoschizomerię prawdziwą, gdy enzymy rozpoznają tę samą sekwencję nukleotydów i łamią DNA w tych samych punktach, oraz fałszywą, gdy enzymy rozpoznając to samo miejsce na DNA, dokonują przerw w różnych punktach w obrębie tego samego miejsca.

Większość restryktaz klasy 2 rozpoznaje sekwencje zawierające od 4 do 6 par nukleotydów, dlatego restryktazy dzielą się na małe i duże. Enzymy restrykcyjne o małym cięciu rozpoznają tetranukleotyd i wprowadzają znacznie więcej pęknięć w cząsteczkach niż enzymy restrykcyjne o dużym cięciu, które rozpoznają sekwencję sześciu par nukleotydów. Wynika to z faktu, że prawdopodobieństwo wystąpienia określonej sekwencji czterech nukleotydów jest znacznie większe niż sekwencji sześciu nukleotydów. Na przykład DNA bakteriofaga T7 o wielkości 40 000 pz nie ma sekwencji rozpoznawanej przez R1 z E. coli.

Do drobnorozszczepiających restryktaz należą Hpa II i Alu (z Arthrobacter luteus), wielkorozszczepialne - Eco RI (z Escherichia coli) i Hind III. Jeżeli przyjmiemy, że miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne rozmieszczone są losowo wzdłuż łańcucha DNA, to cel dla enzymów rozpoznających sekwencję (miejsce) czterech nukleotydów powinien wystąpić średnio 1 raz na 256 par zasad, a dla enzymów rozpoznających sześć nukleotydów po 4096 par zasad. Jeśli miejsce restrykcyjne znajduje się wewnątrz genu, to traktowanie enzymem restrykcyjnym DNA doprowadzi do jego inaktywacji. Prawdopodobieństwo wystąpienia takiego zdarzenia jest bardzo duże w przypadku leczenia restrykcjazami drobnotnącymi i nieistotne w przypadku stosowania endonukleaz wielkotnących. Dlatego w celu uzyskania nienaruszonego genu rozszczepianie przeprowadza się naprzemiennie kilkoma restrykcjami o dużym cięciu lub stosuje się metodę „underrestriction”, tj. restrykcję przeprowadza się w warunkach, w których cięcie występuje tylko w jednym miejscu.

Liczne badania pokazują, że stosowanie różnych wirusów jest bardzo skutecznym rozwiązaniem, co pozwala przebić się przez mechanizmy obronne organizmu a następnie infekują komórki, wykorzystując je do rozprzestrzeniania wirusa. Do przeprowadzenia tej procedury inżynierowie genetyczni wybrali najbardziej odpowiednie wirusy z grupy retrowirusów i adenowirusów. Retrowirusy dostarczają informacji genetycznej w postaci kwasu rybonukleinowego (RNA), cząsteczki podobnej do DNA, która pomaga przetwarzać informacje genetyczne zapisane w DNA. Gdy tylko możliwe jest wniknięcie w głąb tzw. komórki docelowej, z cząsteczki RNA uzyskuje się kopię cząsteczki DNA. Ten proces zwanej odwrotną transkrypcją. Gdy nowa cząsteczka DNA zostanie przyłączona do komórki, wszystkie nowe kopie komórki będą zawierały ten zmodyfikowany gen.

Adenowirusy przenoszą informację genetyczną natychmiast w postaci DNA, które jest dostarczane do niedzielącej się komórki. Chociaż wirusy te dostarczają DNA bezpośrednio do jądra komórki docelowej DNA nie pasuje do genomu komórki. Zatem zmodyfikowany gen i informacja genetyczna nie są przekazywane komórkom potomnym. korzyść Terapia genowa przeprowadzona przy pomocy adenowirusów polega na tym, że możliwe jest wprowadzenie genów do komórek system nerwowy i do błony śluzowej dróg oddechowych, ponownie za pośrednictwem wektora. Ponadto istnieje trzecia metoda terapii genowej, prowadzona przez tak zwane wirusy związane z adenowirusami. Wirusy te zawierają stosunkowo niewielka ilość informacji genetycznej i są znacznie trudniejsze do wyeliminowania niż retrowirusy i adenowirusy. Jednak zaletą wirusów związanych z adenowirusami jest to, że nie powodują one reakcji układu odpornościowego człowieka.

Genealogiczna metoda antropogenetyki

Podstawą tej metody jest kompilacja i analiza rodowodów. Metoda ta jest szeroko stosowana od czasów starożytnych do współczesności w hodowli koni, selekcji cennych linii dużych bydło i świń, po otrzymaniu psy rasowe, a także przy hodowli nowych ras zwierząt futerkowych.

Jako metoda badania genetyki człowieka, metoda genealogiczna zaczęła być stosowana dopiero od początku XX wieku, kiedy stało się jasne, że analiza rodowodów, w których można zastąpić przekazywanie jakiejś cechy (choroby) z pokolenia na pokolenie metodą hybrydologiczną, której właściwie nie da się zastosować u ludzi.

Podczas sporządzania rodowodów źródłem jest osoba - probant, którego rodowód jest badany. Zwykle jest to albo pacjent, albo nosiciel określonej cechy, której dziedziczenie należy zbadać. Podczas kompilowania tabel rodowodowych użyj konwencje, zaproponowany przez G. Yusta w 1931 r. (ryc. 6.24). Pokolenia są oznaczane cyframi rzymskimi, jednostki w danym pokoleniu są oznaczane cyframi arabskimi.

Za pomocą metody genealogicznej można ustalić uwarunkowania dziedziczne badanej cechy, a także rodzaj jej dziedziczenia (autosomalny dominujący, autosomalny recesywny, dominujący lub recesywny sprzężony z X, sprzężony z Y). Analizując rodowody dla kilku cech, można ujawnić powiązany charakter ich dziedziczenia, co jest wykorzystywane przy opracowywaniu map chromosomów. Metoda ta pozwala na badanie intensywności procesu mutacji, ocenę ekspresji i penetracji allelu. Jest szeroko stosowany w medycznym poradnictwie genetycznym do przewidywania potomstwa. Należy jednak zauważyć, że analiza genealogiczna staje się znacznie bardziej skomplikowana, gdy rodziny mają mało dzieci.

Proces wprowadzania rekombinowanego DNA do komórki bakteryjnej nazywa się transformacja. Efektem transformacji jest nabycie przez komórkę gospodarza nowych sekwencji DNA, a co za tym idzie nowych cech fenotypowych, np. oporności na niektóre antybiotyki. Komórka gospodarza wykorzystywana w takich eksperymentach musi mieć w szczególności określony fenotyp R-, tj. nie powinien zawierać enzymów restrykcyjnych; musi być niezdolny do ogólnej rekombinacji ( recA-) tak, że egzogenny DNA nie jest modyfikowany przez rekombinację homologiczną. Jedną z najczęściej stosowanych kultur do tego celu jest laboratoryjny szczep bakterii. E coli- szczep K12.

Komórki zdolne do wchłaniania obcego DNA to tzw kompetentny. Kompetencja E coli konieczne jest indukowanie, a niektóre inne bakterie mają tę właściwość początkowo. Proporcję komórek kompetentnych można zwiększyć stosując specjalną pożywkę lub warunki hodowli. W przypadku bakterii opornych na chemiczne induktory kompetencji lub pozbawionych naturalnych kompetencji stosuje się inne systemy dostarczania DNA.

Do najczęściej stosowanych metod transformacji komórek bakteryjnych w praktyce laboratoryjnej należą:

Transformacja E coli przez traktowanie chlorkiem wapnia;

elektroporacja– wzrost przepuszczalności komórek pod wpływem impulsu prądu o czasie trwania ~4,5 ms;

Wyniki transformacji można określić ilościowo: określając jedno lub drugie częstotliwość, Lub efektywność transformacje.

Częstotliwość transformacji jest proporcją komórek w populacji komórek, które otrzymały obcy DNA; wyrażona liczbą transformantów do Łączna komórki.

Wydajność transformacji- liczba transformantów na 1 µg DNA pobranego do transformacji.

Informacje na temat klonowania rekombinowanego DNA przy użyciu wektora plazmidowego pBR322 przedstawione w tej sekcji podsumowano w postaci schematu eksperymentalnego i przedstawiono na rycinie 20.

Ryż. 20. Klonowanie DNA w wektorze plazmidowym pBR322

1, 2, 3, 4 i 5 - etapy procedury klonowania (patrz tekst).

1. DNA pBR322 przecina się endonukleazą restrykcyjną PstI w miejscu oporności na ampicylinę.

2. Fragmenty DNA dawcy, również otrzymane przy użyciu PstI i posiadające lepkie końce, takie jak linearyzowany wektor pBR322, poddaje się ligacji z DNA wektora przy użyciu ligazy DNA. Konsekwencją powstania takiego konstruktu jest destrukcja genu odpowiedzialnego za oporność na ampicylinę. W ten sposób powstaje rekombinowany DNA po wprowadzeniu do komórek E coli nie będą w stanie zapewnić sobie przeżycia na podłożu z ampicyliną.

3. Komórki E coli transformować rekombinowanym DNA.

4. Po procedurze transformacji zawiesinę komórek wysiewa się na płytki agarowe i pożywkę zawierającą antybiotyk tetracyklinę. Na tym etapie następuje selekcja, tj. wybór komórek zdolnych do wzrostu na podłożu z tetracykliną. Komórki hodowane na tym agarze zawierają rekombinowany DNA i DNA pBR322, który nie zawiera wstawki DNA dawcy; przywrócił pierwotną strukturę wektora.

5. Pojedyncze kolonie komórkowe E coli uprawiane na kubku z subkulturą tetracyklinową dwa kubki na kubkach, z których jeden zawiera agar z ampicyliną, a drugi z tetracykliną. Komórki zawierające zrekombinowany plazmidowy DNA rosną tylko na agarze z tetracykliną, ponieważ gen, który zapewnia oporność na ampicylinę, ulega zniszczeniu w wyniku wstawienia DNA dawcy. O ile komórki z oryginału, tj. odzyskanego DNA wektora pBR322 rośnie na obu płytkach, ponieważ geny oporności na oba antybiotyki są natywne, tj. w oryginalnym stanie.

Z komórek wybranych klonów E coli wyodrębnić DNA plazmidu i przeanalizować jego strukturę.

Inne wektory plazmidowe

Era wektora pBR322, zapoczątkowana przez Bolivara i Rodrigueza na samym początku lat 80., trwa do dziś. Jednak pomimo całej swojej niezawodności i klasycznej zgodności ze wszystkimi wymaganiami dotyczącymi wektorów, ten wektor ma tylko kilka dogodnych miejsc do klonowania. Ponadto selekcja transformowanych komórek w eksperymentach z opartym na nim rekombinowanym DNA zajmuje dużo czasu. Zaistniała potrzeba opracowania alternatywnych, bardziej zaawansowanych systemów klonowania. W ten sposób powstała grupa wektorów z rodziny pUC. W nazwie wektorów tej rodziny litery „U” i „C” są pierwszymi literami słów Uniwersytet Kalifornijski. Naukowcy z tej uczelni stworzyli serię wektorów, które mają ważną cechę - obecność w strukturze DNA zintegrowanego syntetycznego polilinker, która jest sekwencją nukleotydową złożoną z miejsc rozpoznawanych przez szereg endonukleaz restrykcyjnych unikalnych dla tego wektora - MCS (Multiple Cloning Sites). Nazwy poszczególnych wektorów z rodziny pUC są różne dwucyfrowy, a struktura pierwszorzędowa różnych wektorów różni się składem miejsc MCS MCS - Multiple Cloning Sites w polilinkerze.

Rozważmy bardziej szczegółowo cechy wektorów należących do tej grupy na przykładzie wektora pUC19 (ryc. 21).

Plazmid pUC19 ma długość 2686 bp. i zawiera: gen oporności na ampicylinę; regulowany odcinek genu β-galaktozydazy (lacZ") operon laktozowy E coli gen lacI, represor kodujący, który kontroluje ekspresję genów lacZ"; polilinker – krótka sekwencja z wieloma unikalnymi miejscami rozpoznawanymi przez endonukleazy (EcoRI, SacI, KrpI, XmaI, SmaI, BamHI, XbaI, SalI, HincII, AccI, BspMI, PstI, SphI i HindIII); początek replikacji plazmidu ColE1.

Ryż. 21. Wektor plazmidowy pUC19

Mapa jest wyjaśniona w tekście.

Obecność w plazmidzie pUC19 genu zapewniającego oporność na ampicylinę umożliwia wyselekcjonowanie klonów E. coli zawierających ten wektor lub oparty na nim rekombinowany DNA na pożywce z tym antybiotykiem. Takie modułowe elementy struktury rozważanego wektora jak lacZ", lacI i MCS umożliwiają przyspieszenie i zintensyfikowanie selekcji klonów z rekombinowanym DNA.

Jeżeli komórki zawierające niezmodyfikowany plazmid pUC19 hoduje się w obecności izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG), który jest induktorem gumilaka- operon, a następnie produkt genu lacI, tak zwana represor, nie będzie w stanie związać się z regionem promotor-operator genu lacZ", w wyniku czego nastąpi transkrypcja i translacja fragmentu plazmidu genu lacZ”. Produkt tego fragmentu zwiąże się z białkiem kodowanym przez chromosomalny DNA ( α-komplementacja), w wyniku czego powstaje aktywna ß-galaktozydaza. Sekwencja z wieloma miejscami restrykcyjnymi (polilinker) jest wstawiana do genu lacZ" tak, że nie wpływa na produkcję funkcjonalnej β-galaktozydazy, a jeśli jej substrat 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopiranozyd (X-Gal) jest obecny w pożywce, to będzie ulega hydrolizie pod działaniem tego enzymu do postaci niebieskiego produktu barwiącego kolonie komórek zawierających niezmodyfikowane, tj. bez insercji obcego DNA, plazmidu pUC19 (ryc. 22).

Ryż. 22. Sekwencja procedur klonowania DNA w wektorze pUC19.

1, 2, 3 i 4 - etapy klonowania (patrz tekst)

1. DNA dawcy jest traktowane jedną z endonukleaz restrykcyjnych, dla których istnieje miejsce w polilinkerze. DNA wektora pUC19 traktuje się tym samym enzymem

2. Ligacja linearyzowanego wektora i wstawki z ligazą DNA T4.

3. Po procedurze ligacji z mieszaniną inkubacyjną transformuje się komórki zdolne do komplementacji α, które mogą syntetyzować tę część ß-galaktozydazy (LacZa), która jest połączona z produktem genu lacZ" z tworzeniem aktywnego enzymu.

4. Traktowane komórki wysiewa się na pożywkę z ampicyliną, IPTG i substratem dla ß-galaktozydazy. Nietransformowane komórki nie mogą rosnąć w obecności ampicyliny, a komórki zawierające nienaruszony plazmid tworzą niebieskie kolonie na pożywce z ampicyliną. Komórki gospodarza niosące hybrydę, tj. rekombinowany, plazmid, tworzą białe kolonie na tej samej pożywce. Wynika to z faktu, że zwykle po wstawieniu obcego DNA do polilinkera nie można utworzyć kompletnego produktu genu. lacZ", a co za tym idzie, w procesie α-komplementacji nie powstaje aktywna ß-galaktozydaza, która rozszczepia substrat X-Gal do produktu, który zapewnia niebieskie zabarwienie komórek kolonii.

Wektory oparte na bakteriofagach λ

Wektory plazmidowe umożliwiają klonowanie fragmentów DNA, których wielkość nie przekracza 10 kb. Aby jednak rozwiązać problem klonowania chromosomalnego DNA nawet małego organizmu, na przykład bakterii, konieczne jest stworzenie kompletne kolekcje fragmentów tego DNA, więc często trzeba pracować z większymi fragmentami. W tym celu wektory oparte na bakteriofagach λ MI. coli.

Kiedy fag λ wnika do komórek E. coli. Istnieją dwie alternatywne ścieżki rozwoju wydarzeń:

1. cykl lityczny- fag zaczyna się aktywnie namnażać i po około 20 minutach komórka zostaje zniszczona z uwolnieniem do 100 nowych cząsteczek faga.

2. Stan lizogenezy– DNA faga jest zawarte w chromosomie E. coli jako profag i replikuje się w komórce wraz z normalnymi komórkami bakteryjnymi. Jednak kiedy niekorzystne warunki(brak odżywiania) rozpoczyna się cykl lityczny (ryc. 23):

1. Podczas replikacji cDNA bakteriofaga λ powstaje liniowa cząsteczka, składająca się z powtarzających się odcinków o długości około 50 kb. Każdy z tych segmentów to pełnej długości DNA faga otoczone lepkimi bokami sałata-miejsca - jednoniciowe 5"-"ogony" o długości 12 nukleotydów. Nazywa się je lepkimi ( sałata) kończy się, ponieważ wzajemnie się uzupełniają i mogą łączyć się w pary jak lepkie końce fragmentów restrykcyjnych.

2. Głowica faga zawiera jeden taki segment, następnie do głowicy dołączany jest już zmontowany wyrostek.

Ryż. 23. Szlak lityczny rozwoju bakteriofaga λ

1 - upakowanie w głowie faga jednego segmentu DNA faga pełnej długości; 2 - montaż pełnoprawnej cząstki faga.

Rozmiar DNA faga λ wynosi około 50 kb, a znaczna jego część (około 20 kb) nie jest niezbędna do rozmnażania faga i odpowiada za jego wbudowanie do DNA gospodarza. W związku z tym pojawił się pomysł, aby można go było zastąpić fragmentem innego DNA o równoważnej wielkości. Powstała zrekombinowana cząsteczka będzie replikować się w komórce jako DNA „zrekombinowanego” faga, który „wszedł” na lityczną ścieżkę rozwoju. Zrekombinowane cząsteczki są pakowane w główki bakteriofagów λ in vitro a po dodaniu procesów otrzymuje się zakaźne cząstki faga (ryc. 24).

Ryż. 24. Zastosowanie wektorów fagowych λ do klonowania fragmentów DHA w komórkach MI. coli.

Przygotowanie ekstraktów do pakowania in vitro DNA faga λ odbywa się przy użyciu dwóch szczepów E coli, z których każdy jest lizogenny wobec pewnego zmutowanego szczepu faga λ (ryc. 25). Jeden z mutantów nie jest w stanie syntetyzować białka A (jednego z polipeptydów terminazy faga), drugi nie jest w stanie syntetyzować białka E (białka głowy faga). Oba te białka są wymagane do pakowania DNA faga λ. Ekstrakty „A” i „E” miesza się i dodaje konkatameryczny (segmenty pełnej długości DNA faga spolimeryzowane zgodnie z sałata-sites) DNA faga, które wiąże się z terminazą, zanim zostanie przecięte sałata miejsca i pakowane w główki fagów.

Ryż. 25. Pakowanie in vitro DNA faga λ

Podczas pakowania cząsteczki DNA o długości mniejszej niż 38 kb. otrzymuje się niezakaźną cząsteczkę faga i fragmenty o długości ponad 52 ton, b.p. nie mieszczą się w głowie. Segmenty o długości 50 kb. w liniowej cząsteczce DNA są one oddzielone miejscami cos i to właśnie w tych miejscach cząsteczka jest cięta, gdy następny segment wypełnia głowę. Cięcie odbywa się za pomocą enzymu znajdującego się przy wejściu do głowy.

Proces wprowadzania rekombinowanego DNA faga z osadzonym fragmentem obcej informacji genetycznej do komórek biorcy opiera się na naturalnym zjawisku – transdukcji fagowego DNA.

transdukcja(łac. transdukcja- ruch) to proces przenoszenia bakteryjnego DNA z jednej komórki do drugiej przez bakteriofaga. Tak więc transformacja komórek bakteryjnych przy użyciu rekombinowanego DNA na bazie fagowego DNA nie wymaga specjalnego przygotowania komórek biorcy ani specjalnego oprzyrządowania.

Hybrydyzacja molekularna i metody skriningu immunologicznego są wykorzystywane do poszukiwania komórek zawierających fagi z rekombinowanym DNA, co zostanie omówione w następnym rozdziale.

8860 0

Obecnie znanych jest około 40 różnych sposobów dostarczania rekombinowanego DNA do komórek, na różne sposoby. rozwiązywanie problemów przez błonę plazmatyczną. Jak dotąd nie ma jednolitej klasyfikacji metod dostarczania rekombinowanego DNA do komórek. Każdy autor recenzji klasyfikuje na swój sposób, być może dlatego, że dla wielu znalezionych empirycznie metod mechanizm pokonywania błony wciąż nie jest jasny, na przykład dla transformacji. Istnieje również niepewność terminologiczna, co nie jest zaskakujące w przypadku szybko rozwijającej się nowej dziedziny nauki i praktyki.

Każda z metod dostarczania obcego DNA do komórek ma swoją własną charakterystykę, zalety i wady pod względem przeżywalności komórek, skuteczności podawania, wszechstronności i technicznych możliwości implementacji. Wybór metody zależy od rodzaju komórek gospodarza i rodzaju użytego wektora, a także osobistych preferencji i możliwości eksperymentatora. Niektóre z najbardziej znanych metod dostarczania DNA do komórek docelowych omówiono szczegółowo poniżej.

Transformacja w najbardziej ogólnym sensie to proces wprowadzania wolnego DNA do komórki. W węższym znaczeniu termin ten używany jest głównie w odniesieniu do bakterii, oznaczając proces wchłaniania rekombinowanego DNA przez komórki kompetentne, wywołany przemianą fazową temperatury błony komórkowej. E. coli jest najczęstszym organizmem podczas pracy z rekombinowanym DNA, a aby zapewnić wprowadzenie plazmidowego DNA do komórek, komórki przetrzymuje się w lodowatym roztworze CaCl2 i DNA, a następnie poddaje szok termiczny w 42°C przez ~1 min.

Najwyraźniej w wyniku takiego leczenia dochodzi do miejscowego zniszczenia ściany komórkowej. wydajność transformacji, którą określa się jako liczbę transformantów na 1 µg dodanego DNA,
podczas gdy jest to około 10000 - 10000000 . Skuteczność tej metody jest niska, w przybliżeniu mniej niż 0,1% komórek ulega transformacji, ale tę wadę rekompensuje zastosowanie schematów selekcji, które pozwalają na szybką identyfikację pożądanych klonów.

Komórki zdolne do wchłaniania obcego DNA nazywane są kompetentnymi. Odsetek tych komórek w populacji jest zwykle bardzo mały, ale można go zwiększyć stosując specjalną pożywkę, warunki hodowli oraz induktory kompetencji chemicznych (dobierane z reguły empirycznie). Często stosowanym etapem preparacji komórek kompetentnych jest wytwarzanie sferoplastów - komórek częściowo lub całkowicie (protoplasty) pozbawionych zewnętrznej sztywnej ściany komórkowej.

Na przykład jest to jedyny sposób skutecznej transformacji wielu bakterii Gram-dodatnich z rodzajów Bacillus, Listeria, Streptommyces itp. Niektóre techniki transformacji drożdży obejmują również etapy enzymatycznego usuwania ściany komórkowej drożdży przy użyciu glukozydaz. W przypadku organizmów odpornych na chemiczne induktory kompetencji lub pozbawionych naturalnych kompetencji stosuje się inne systemy dostarczania DNA.

Koniugacja. Istnieją plazmidy bakteryjne (plazmidy koniugacyjne), które mają zdolność tworzenia kontaktów międzykomórkowych, przez które przechodzą z jednej komórki do drugiej. Tworzenie kontaktów między komórkami dawcy i biorcy zapewniają właściwości koniugacyjne plazmidów, a sam transfer DNA zapewniają właściwości mobilizacyjne. W tym przypadku plazmid koniugacyjny może przenosić zwykły wektor plazmidowy znajdujący się w tej samej komórce.

W ten sposób możliwe jest transformowanie komórek biorców, które są trudne do transformacji innymi sposobami. Na przykład wykazano transfer mobilizacji wektora wahadłowego pAT187 o szerokim zakresie żywicieli z E. coli do różnych bakterii Gram-dodatnich (rodzaje Bacillus, Enterococcus, Staphylococcus itp.), chociaż ze znacznie mniejszą wydajnością niż w przypadku przenoszenia między różnymi szczepy E. coli.

Ponadto ostatnio wykazano możliwość koniugacyjnego transferu DNA z komórek bakteryjnych do hodowanych komórek zwierzęcych. Podczas koniugacji przenoszona jest tylko jedna nić plazmidu donorowego, na której następnie syntetyzowana jest druga nić. Powoduje to, że plazmid przeniesiony koniugatywnie nie jest atakowany przez enzymy restrykcyjne gospodarza. Skuteczność tej metody dla bakterii jest porównywalna z transformacją.

Infekcja wirusowa. Do wprowadzenia wektorów opartych na wirusach, naturalnych droga zakaźna infekcja komórki gospodarza, która zależy od rodzaju wirusa.

metody perforacji. Jedną z popularnych metod wprowadzania kwasów nukleinowych do komórek docelowych jest elektroporacja - czasowe tworzenie porów w dwuwarstwowej błonie lipidowej pod wpływem krótkotrwałego działania pola elektrycznego. Jest to uniwersalna fizyczna metoda transformacji, której technika została opracowana dla prawie wszystkich typów komórek.

Podczas pracy z E. coli, przygotowaną zawiesinę komórek (~50 µl) i DNA umieszcza się między elektrodami i przykłada pojedynczy impuls prądu o czasie trwania ~4,5 ms przy napięciu 1,8 kV, odległość między elektrodami wynosi 1 mm. Po takiej obróbce wydajność transformacji wzrasta do 109-1011 dla małych plazmidów (~3-6 kb) i do 106 dla dużych (~135 kb). Podobne warunki stosuje się do wprowadzenia wektora BAC do E. coli.

Efekt elektroporacyjny wyładowania wysokiego napięcia na dwuwarstwową błonę lipidową najwyraźniej zależy od promienia jej krzywizny. Dlatego małe komórki bakteryjne skutecznie absorbują DNA przy znacznie wyższym napięciu (12–18 kV/cm) niż duże zwierzęta i komórki roślinne, skutecznie absorbując DNA przy natężeniu pola 1-2 kV/cm. Elektroporacja jest najprostszą, najbardziej wydajną i powtarzalną metodą wprowadzania cząsteczek DNA do komórek, wymagającą jednak specjalne urządzenie elektroporator.

Inne metody perforacji dostarczania DNA do komórki: traktowanie komórek ultradźwiękami, zdrapywanie komórek z podłoża w obecności materiału egzogennego, wirowanie komórek w pożywce z DNA w połączeniu z elektroporacją, osmotyczna perforacja błony plazmatycznej, sonda komórkowa za pomocą mikrowiązki laserowej, użycie tworzącej pory toksyny streptolizyny-O.

Transfekcja. Początkowo termin ten oznaczał wprowadzenie wirusowego DNA do komórek, obecnie jego znaczenie rozszerzyło się na wprowadzenie dowolnego obcego DNA do komórek eukariotycznych. Termin „transformacja”, oznaczający proces wprowadzania DNA do komórki dla prokariontów i drożdży, okazał się niewygodny w użyciu, ponieważ w odniesieniu do komórek zwierzęcych transformacja to transformacja normalnych komórek w komórki rakowe. W wąski sens Transfekcja jest ogólnie rozumiana jako wprowadzenie DNA do komórek eukariotycznych przy użyciu różnych odczynników chemicznych.

Jedną z pierwszych metod opracowanych w celu wydajnej transfekcji była inkubacja DNA z DEAE-dekstranem. Uzyskana wydajność była porównywalna z transformacją bakterii i osiągnęła 106 transfektantów na µg DNA.

Mechanizm działania DEAE-dekstranu nie został do końca poznany, ale wiadomo, że wiąże się on z DNA i błoną komórkową, stymulując pinocytozę (ryc. 2.8), chociaż sam nie jest pobierany przez komórki. Wady metody to toksyczność DEAE-dekstranu dla niektórych typów komórek, zależność wydajności od jakości preparatu oraz bardzo mała częstość uzyskiwania stabilnych transfektantów.

Ryż. 2.8. Schemat wprowadzenia DNA do kompozycji różne kompleksy do komórki przez endocytozę: fagocytozę i pinocytozę (a). Schematyczne przedstawienie cząstki z nielipidowego polikationu w dendroformie ze związanym DNA, którego ładunek ujemny jest kompensowany przez polimer kationowy (b)

Wydajność transfekcji zwiększono 10-100 razy przez inkubację komórek z DNA wytrąconym fosforanem wapnia. Gęste cząstki osadu wapnia DNA są wchłaniane przez komórkę na drodze fagocytozy (ryc. 2.8), ale tylko niewielka część przenikających cząsteczek dociera do jądra i jest integrowana z chromosomalnym DNA. Metoda z fosforanem wapnia jest wydajniejsza i tańsza, ale powoduje pękanie cząsteczek DNA, co powoduje przekształcenie cząsteczek kolistych w formę liniową, czasem niezakaźną w przypadku transfekcji wirusów. Ponadto warunki transfekcji fosforanem wapnia muszą być dobrane indywidualnie dla każdej komórki docelowej.

W trakcie poszukiwań innych odczynników do transfekcji stwierdzono, że cząsteczki polimeru posiadające nadmiar ładunku kationowego mogą znacznie zwiększyć efektywność transfekcji. Polimerowe kationy tworzą z kwasami nukleinowymi stabilne kompleksy ze zobojętnionymi ładunkami, które mogą z dużą wydajnością transportować DNA i RNA do wnętrza komórki, chroniąc przed działaniem endonukleaz na drodze do jądra (ryc. 2.9).

Ryż. 2. 9. Schemat transportu DNA do jądra komórkowego w ramach kompleksu polikation-DNA związanego z określonym ligandem na drodze endocytozy za pośrednictwem ligandu

Syntetyczne nielipidowe kationy polimeryczne w konformacji liniowej lub rozgałęzionej (postać dendrytyczna) mogą kondensować DNA i RNA do stosunkowo małych cząstek, które następnie wiążą się z błoną komórkową i wchodzą do komórki na drodze niespecyficznej endocytozy. Obecnie do transfekcji z grupy polikationów nielipidowych, głównie polietylenoiminy, poliamidoamin i opartych na nich dendrymerów, stosuje się białka kationowe, takie jak polilizyna, protamina i histony, a także różne produkty handlowe, takie jak PAMAM.

Rewolucją było wprowadzenie do praktyki pierwszego niskotoksycznego lipidu kationowego DOTMA (1,2-dioleylo-3-N,N,N-trimetyloaminopropan) zsyntetyzowanego przez Feignera (Feigner, 1987) i in. Wydajność transfekcji lipidem kationowym (ryc. 2.10) była około 100 razy większa niż w przypadku jakiejkolwiek innej substancji chemicznej, przy dużym udziale stabilnych komórek transgenicznych.

Ryż. 2. 10. Struktura kompleksu z DNA (a) i struktura ogólna kationowy polimer lipidowy (b). Kationowe polimery lipidowe (liniowe i rozgałęzione), podobne w budowie i właściwościach do fosfolipidów błony komórkowej, tworzą kompleksy z DNA w postaci wielowarstwowych kationowych liposomów (a) przy prostym mieszaniu reagentów. Takie kompleksy dostają się do komórki na drodze endocytozy lub fuzji z błoną komórkową przez część lipidową.

Jednocześnie wprowadzono do praktyki nowy termin „lipofekcja”, podkreślający wysoką skuteczność transformacji genetycznej komórek, przybliżającej kompleksy lipidowo-kationowe do zakaźnych cząstek wirusowych.

Opierając się na tym sukcesie, opracowano liczne odmiany tych związków (Lipofectin, Lipofectamine, Cellfectin itp.).

Równolegle opracowano nośniki dostarczające oparte na liposomach fosfolipidowych wypchanych DNA lub RNA.

Małe kulki sztucznych błon mogą łączyć się z błonami plazmatycznymi komórek lub zostać wchłonięte przez endocytozę, uwalniając zawartość do komórki. Niską wydajność transfekcji liposomów zwiększało wprowadzenie do struktury liposomów fosfolipidów, np. kardiolipiny i fosfatydyloetanoloaminy, które wraz z błonami dwuwarstwowymi tworzą również odwrócone struktury micelarne, zwane fazami sześciennymi i heksagonalnymi, zdolne do inicjacji błony połączenie.

Metoda liposomalna jest dość kapryśna i wymaga starannego doboru wszystkich warunków dla skutecznej transfekcji określonych komórek. Ponadto procedura kapsułkowania, zwykle sonikacja, często uszkadza duże cząsteczki DNA.

Nowym etapem w rozwoju odczynników do transfekcji było opracowanie bardziej wydajnego i ukierunkowanego dostarczania kwasów nukleinowych do określonych komórek docelowych poprzez wprowadzenie różnych ligandów do struktury syntetycznych odczynników do transfekcji oraz liposomów do wiązania z białkami receptorów błonowych. Obecność takich grup docelowych (ligandów) rozpoznawanych przez receptory komórkowe umożliwia wykorzystanie mechanizmów endocytozy za pośrednictwem liganda (patrz ryc. 2.9).

Jako takie stosuje się ligandy, białka i peptydy rozpoznawane przez receptory; oligosacharydy, ponieważ na powierzchni wielu komórek zwierzęcych znajdują się lektyny - białka receptorowe, które specyficznie je wiążą; polisacharydy. Procesy interakcji z komórkami takich ukierunkowanych kompleksów odczynników do transfekcji DNA(RNA) są podobne do przenikania cząstek wirusowych do wnętrza komórki.

Obecnie firmy biotechnologiczne oferują szeroką gamę różnych odczynników do transfekcji – od najprostszych i najtańszych do najnowszych, wyspecjalizowanych do różnych typów komórek i zadań. Intensywnie trwają również prace nad tworzeniem nowych, jeszcze skuteczniejszych odczynników do transfekcji.

Mikroiniekcja - Błona komórkowa nakłuwa się mikroigłą i roztwór zawierający DNA wstrzykuje się do cytoplazmy komórki lub bezpośrednio do jądra, jeśli jądro jest wystarczająco duże (na przykład jądro jaja). Mikroiniekcja DNA do komórek ssaków stała się możliwa wraz z pojawieniem się urządzenia do wytwarzania mikropipet o średnicy 0,1-0,5 mikrona oraz mikromanipulatora. Metoda jest bardzo skuteczna, odsetek komórek ze stabilną integracją i ekspresją wstrzykniętych genów może sięgać 50%. Zaletą opisanej metody jest również to, że umożliwia ona wprowadzenie dowolnego DNA do dowolnych komórek i nie jest wymagana presja selekcyjna, aby zachować wprowadzony gen w komórkach.

Transfekcja balistyczna, biobalistyka lub biolistyka (bombardowanie mikrocząstkami), opiera się na bombardowaniu komórek mikrosferami o wielkości około 1-2 mikronów, opłaszczonymi DNA. Stosowane są mikrocząsteczki złota, wolframu (czasem fitotoksycznego), silikonu i różne syntetyczne nanosfery. Mikrocząstki pokryte DNA przechodzą przez warstwy komórek i przenoszą konstrukt genetyczny bezpośrednio do organelli i jąder komórkowych. Stworzony w tym celu „pistolet genowy” (pistolet genowy) lub „pistolet genowy”, który został opracowany przez J. Sanforda w 1987 r. W celu wprowadzenia DNA do ziaren zbóż, jest podobny w swojej konstrukcji do broni pneumatycznej ( ryc. 2.11) .

Ryż. 2.11. Wprowadzenie rekombinowanego DNA do liści roślin za pomocą pistoletu genowego wielokrotnego użytku Bio-Rad (a) i jego ogólny schemat (b). Impuls helowy wyrzuca mikrocząsteczki pokryte DNA lub RNA z kapsułki próbki. Mikrocząstki niosące DNA są przyspieszane i skupiane w celu maksymalnej penetracji do komórek, poruszając się wzdłuż kanału przyspieszającego i wzdłuż lufy pistoletu, podczas gdy przy szerokim wyjściu przepływ helu dyfuzyjnie rozchodzi się na boki. Przekładka filtra utrzymuje optymalną odległość do trafienia w cel przy maksymalnym usuwaniu helu, aby zminimalizować szkodliwy wpływ na powierzchnię komórki.

Głębokość penetracji mikrocząstek z reguły jest niewielka - do 1 mm, jednak w specjalnych warunkach łuskania mikrocząstki mogą penetrować tkankę na głębokość 4-5 mm i przenosić geny, na przykład, do włókien mięśni poprzecznie prążkowanych. Transfekcja balistyczna jest bardzo skuteczna nawet tam, gdzie grube ściany komórkowe (drożdże, rośliny) stanowią przeszkodę dla wielu innych metod dostarczania i jest stosowana do tkanek, narządów, a nawet całych organizmów. Obecnie jest szeroko stosowany w terapii genowej w celu uzyskania transgenicznych zwierząt i roślin.

Taka różnorodność sposobów i metod transfekcji wynika z różnych zadań, szerokiego zakresu komórek docelowych i typów kwasów nukleinowych dostarczanych do komórek, a także z potrzeby społeczeństwa w zakresie pozyskiwania coraz skuteczniejszych sposobów dostarczania informacji genetycznej do komórek , tkanek i całych organizmów. Szczególną uwagę zwraca się na rozwój odczynników i metod transfekcji w związku z uderzającymi perspektywami terapii genowej człowieka, która wymaga ukierunkowanego, wysoce skutecznego i bezpieczne środki dostarczanie genów.

Stabilne i przejściowe wprowadzenie obcego DNA do komórki. Po wprowadzeniu rekombinowanego DNA do komórki eukariotycznej tylko niewielka jego część trafia do jądra, ponieważ błona jądrowa stanowi potężną barierę dla obcego DNA. W jądrze zrekombinowany DNA może być zintegrowany z chromosomem lub istnieć przez pewien czas w stanie pozachromosomalnym.

W związku z tym rozróżnia się transfekcję stabilną, kiedy rekombinowany DNA integruje się z chromosomami komórek biorcy i staje się ich integralną częścią, oraz transfekcję tymczasową lub przejściową, w której cząsteczki rekombinowanego DNA istnieją i są transkrybowane w jądrach pozachromosomalnych stan na krótki czas. Stabilne dziedziczenie wprowadzonego obcego DNA jest głównym warunkiem pozyskiwania organizmów transgenicznych do celów gospodarczych.

Podano zatem opracowanie metod wprowadzania DNA do komórek, prowadzących do większego udziału stabilnych transformantów Specjalna uwaga. Ponadto duży odsetek stabilnych transformantów umożliwia również rezygnację z genów selekcyjnych i markerowych, które są balastem w tworzeniu organizmów transgenicznych.

NA. Wojnow, T.G. Wołowa