Przewodniczący: TV Ovchinnikova, N.F. Miasojedow

Sesja 1
Przewodniczący: N.F. Myasojedow, TV Owczinnikowa
Duża sala
19 września, 9:30 - 11:30

25 minut N.F. Miasojedow

Leki na bazie peptydów

20 minut S.A. Limbor Instytut Genetyki Molekularnej RAS, Moskwa, Rosja

Molekularne mechanizmy genetyczne regulacji peptydów

15 minut RU. Ostrowskaja

Noopept - nowe mechanizmy działania i perspektywy zastosowania

15 minut T.N. Sollertinskaja 1, śr. Szorochow 1 , N.F. Myasoedov 2 , L.A. Andrzeja 2 1 Instytut Fizjologii Ewolucyjnej i Biochemii. ICH. Rosyjska Akademia Nauk Sechenowa, St. Petersburg; 2 Instytut Genetyki Molekularnej RAS, Moskwa, Rosja

Cechy korekcji neuropeptydowej zaburzeń poznawczych i psycho-emocjonalnych w zespole przewlekłego zmęczenia u ssaków (ewolucyjne aspekty badania)

15 minut I.I. Bobyncew, O.I. Sorokoletova, A.E. Biały Kursk Państwowy Uniwersytet Medyczny, Kursk, Rosja

Badanie działania przeciwlękowego i przeciwbólowego peptydu Gly-His-Lys (GHK) i jego strukturalnych analogów

Sesja 2
Przewodniczący: S.N. Kochetkov, TV Owczinnikowa
Duża sala
19 września, 16:00 - 18:00

25 minut S.N. Kochetkov

Nowe inhibitory rozwoju społecznie istotnych infekcji

20 minut TELEWIZJA. Owczinnikowa Instytut Chemii Bioorganicznej. MM.

Potencjał terapeutyczny peptydów przeciwdrobnoustrojowych

15 minut V.N. Kokryakow 1.2 , O.V. Szamova 1,2, G.M. Aleshina 1 , M.N. Berłow 1,2 , TV Owczinnikowa 3 1 Instytut Medycyny Doświadczalnej w Petersburgu; 2 Petersburski Uniwersytet Państwowy w Petersburgu; 3 Instytut Chemii Bioorganicznej

Osiągnięcia krajowej szkoły biochemików w badaniu struktury i funkcji peptydów antybiotykowych pochodzenia zwierzęcego

15 minut O.V. Szamowa 1 , 2 , MS Żarkowa 1 , P.M. Kopeikin 1 , T.A. Lukyanova 1 , A.Yu. Artamonow 1 , S.V. Balandin 3 , T.A. Filatenkowa 1 , A.S. Nazarow 1,2, K.E. Safiullina 1 , MS Suchariew 1 , T.Ju. Pazina 1, T.M. Grinchuk 4 , V.N. Kokryakow 1,2 , TV Ovchinnikova 3 , D.S. Orłow 1.2 1 Instytut Medycyny Doświadczalnej w Petersburgu; 2 Petersburski Uniwersytet Państwowy w Petersburgu; 3 Instytut Chemii Bioorganicznej MM. Shemyakin i Yu.A. Ovchinnikov RAS, Moskwa; 4 Instytut Cytologii RAS, St. Petersburg, Rosja

Bogate w prolinę peptydy odporności wrodzonej jako prototypy nowych leków przeciwdrobnoustrojowych i przeciwnowotworowych

15 minut TJ. Eliseev 1 W. Terterov 1 , O.V. Shamova 2 , M.V. Maczuga 1 1 Uniwersytet Akademicki w Petersburgu; 2 Instytut Medycyny Doświadczalnej, Petersburg, Rosja

Wykorzystanie wzorców sekwencji aminokwasów do projektowania alfa-helikalnych peptydów przeciwdrobnoustrojowych

15 minutM.N. Berłow 1,2, E.S. Umniakowa 1 , A.V. Sokołow 1 , TV. Ovchinnikova 3 , V.N. Kokryakow 1.2 1 Instytut Medycyny Doświadczalnej w Petersburgu; 2 Petersburski Uniwersytet Państwowy w Petersburgu; 3 Instytut Chemii Bioorganicznej MM. Shemyakin i Yu.A. Ovchinnikov RAS, Moskwa, Rosja

Oddziaływanie kationowych peptydów przeciwdrobnoustrojowych z białkiem C1q i ich wpływ na aktywację dopełniacza

Sesja 3
Przewodniczący: N.F. Myasoedov, L.P. Owczinnikow
Duża sala
20 września, 9:30 - 11:30

25 minut L.P. Owczinnikow 1, N.V. Bobkowa 2 1 Instytut Białka RAS, Pushchino; 2 Instytut Biofizyki Komórki RAS, Pushchino, Rosja

Opracowanie innowacyjnego leku na chorobę Alzheimera opartego na białku YB-1

20 minut O.M. Wołpina 1, DO Korojew 1 , T.D. Volkova 1 , A.V. Kamynina 1 , M.P. Filatova 1 , S.M. Balasanyants 1 , N.I. Medvinskaya 2, P.V. Niekrasow 2 , IV. Nesterova 2 , A.N. Samokhin 2 , N.V. Bobkowa 2 1 MM. Shemyakin i Yu.A. Ovchinnikov RAS, Moskwa; 2 Instytut Biofizyki Komórki RAS, Pushchino, region moskiewski, Rosja

Ochronne działanie peptydów w procesach neurodegeneracyjnych typu Alzheimera

15 minutAV Tallerowa Instytut Farmakologii. W.W. Zakusowa, Moskwa, Rosja

Mimetyk dipeptydowy neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego GSB-106 jest obiecującym lekiem przeciwdepresyjnym nowej generacji

15 minut K.N. Kolasnikowa, T.A. Gudaszewa S.B. Seredenin Instytut Farmakologii. W.W. Zakusowa, Moskwa, Rosja

Podstawiona gliprolina GZK-111 – nowy dipeptyd o działaniu przeciwlękowym i neuroprotekcyjnym

15 minut AV Awetisjan 1, RA. Zinovkin 1 , R.A. Simonyan 1, P.V. Niekrasow 2 , A.N. Samokhin 2 , DO. Korojewa 3, O.M. Volpina 3 , N.V. Bobkowa 2 1 Instytut Biologii Fizykochemicznej. JAKIŚ. Belozersky Moskiewski Uniwersytet Państwowy, Moskwa; 2 Instytut Biofizyki Komórki RAS, Pushchino; 3 Instytut Chemii Bioorganicznej MM. Shemyakin i Yu.A. Ovchinnikov RAS, Moskwa, Rosja

Syntetyczne peptydy do zewnątrzkomórkowej domeny RAGE odbudowują mitochondria w mózgu myszy po bulwektomii

15 minutPIEKŁO. Słobodina 1,2 , O.I. Bolszakowa 1 , A.L. Shvartsman 1 , S.V. Sarantseva 1 1 Narodowe Centrum Badawcze „Instytut Kurczatowa”, Instytut Fizyki Jądrowej w Petersburgu. B.P. Konstantinow, Gatczyna; 2 Peter the Great St. Petersburg Polytechnic University, St. Petersburg, Rosja

Połączone peptydy jako obiecujące związki w leczeniu choroby Alzheimera

Sesja 4
Przewodniczący: E.D. Swierdłow
Duża sala
20 września, 16:50 - 18:50

15 minut V.A. Mitkiewicz, AA Makarowa Instytut Biologii Molekularnej. V.A. Engelhardt RAS, Moskwa, Rosja

Opracowanie leku przeciwnowotworowego na bazie binazy rybonukleazy

15 minutAV Stiepanow 1,2 , AA Biełogurow 1,2 , A.G. Gabibow 1,2 1 Instytut Chemii Bioorganicznej. MM. Shemyakin i Yu.A. Ovchinnikov RAS, Moskwa; 2 Kazański (Wołga) Uniwersytet Federalny, Kazań, Rosja

Zastosowanie chimerycznych receptorów antygenowych komórek T połączonych z ligandem receptora komórek B w leczeniu chłoniaków nieziarniczych

15 minut V.A. Richter 1, E.V. Kuligina 1 , O.V. Koval 1 , G.V. Kochneva 2 , A.A. Newise 1, AA Makartsova 1 , OS. Troicka 1 1 Instytut Biologii Chemicznej i Medycyny Podstawowej SB RAS, Nowosybirsk, Rosja 2 Państwowe Centrum Badawcze Wirusologii i Biotechnologii, Kolcowo, obwód nowosybirski, Rosja

Sposoby zwiększenia skuteczności przeciwnowotworowej Laktaptyny

15 minut AA Rosenkrants, T.A. Slastnikova, A.V. Ułasow, JAK. SobolewInstytut Biologii Genowej RAS; Uniwersytet Państwowy w Moskwie Śr. Łomonosow, Moskwa, Rosja

Ukierunkowane wewnątrzkomórkowe dostarczanie środków przeciwnowotworowych za pomocą modułowych nanotransporterów

15 minut IV. Alekseenko Instytut Genetyki Molekularnej RAS; Instytut Chemii Bioorganicznej. MM. Shemyakin i Yu.A. Ovchinnikov RAS, Moskwa, Rosja

Problemy i perspektywy leków terapii genowej w leczeniu raka

15 minutD.V. Swierczynski, W.F. Łazariew, I.V. Gużowa, BA Margulis Instytut Cytologii RAS, St. Petersburg, Rosja

Modulatory aktywności opiekuńczej Hsp70 i ich potencjał przeciwnowotworowy

15 minutSS. Larin, MI Łukaszina, A.V. Kibardin, A.V. Posvyatenko, E.Yu. Lysyuk, GP Georgijew Instytut Biologii Genowej RAS, Moskwa, Rosja

Związane z błoną i rozpuszczalne formy indukowanych stresem cząsteczek podobnych do MHC jako obiecujące markery w diagnostyce i terapii nowotworów złośliwych

Sesja 5
Przewodniczący: N.F. Myasoedov, V.A. stonik
Duża sala
21 września, 9.30 - 11.30

25 minut V.A. stonik Pacyficzny Instytut Chemii Bioorganicznej. G.V. Elyakova, Dalekowschodni Oddział Rosyjskiej Akademii Nauk, Władywostok, Rosja

Od badań nad naturalnymi związkami morskimi do nowych pomysłów i biologii

20 minut P.V. Siergijew 1.2, I.A. Osterman 1,2, E.S. Komarowa 1,2 , A.A. Bogdanov 1 , O.A. Doncowa 1,2 1 Uniwersytet Państwowy w Moskwie Śr. Lomonosova, 2 Skolkovo Institute of Science and Technology, Moskwa, Rosja

Poszukiwanie nowych antybiotyków i badanie ich mechanizmu działania

15 minut Ya.R. Panikratowa 1 , JEST. Łebiediewa 1, O.Yu. Sokołow 1 , D.A. Kupriyanov 2 , AD Rumshiskaya 3, N.V. Wybrzeże 1 , N.F. Myasoedov 1 1 FGBNU NTSPZ; - 2 OO Philips; 3 FGAU „LRTS” Ministerstwa Zdrowia Federacji Rosyjskiej, Moskwa, Rosja

Badanie wpływu Semaxu na aktywność sieci neuronowych ludzkiego mózgu za pomocą funkcjonalnego rezonansu magnetycznego (fMRI)

15 minutE.F. Kolesanova, E.A. Egorova, V.N. Prozorowski, O.M. Ipatowa Instytut Chemii Biomedycznej. V.N. Orekhovich, Moskwa, Rosja

Syntetyczne peptydy w innowacyjnych lekach: immunogeny peptydowe i peptydy transporterowe

15 minut B.P. Chelobanov 1,2 , A.A. Fokina 1, rano Ilyina 2 , K.V. Klabenkova 2 , E.A. Burakova 1 , M. Fujii 3 , TAK. Stetsenko 1,2 1 Instytut Biologii Chemicznej i Medycyny Podstawowej SB RAS, Nowosybirsk; 2 Nowosybirski Państwowy Uniwersytet, Nowosybirsk, Rosja; Uniwersytet 3 Kindai, Fukuoka, Japonia

Koniugaty peptydowe analogów oligonukleotydów jako potencjalne środki terapeutyczne

15 minutAA Zamiatnin(ml) 1.2, A.V. Balakireva 1 , N.V. Gorokhovets 1 , E.Yu. Zerniy 2 , N.V. Kuzniecowa 1 , V.A. Makarow 1 , A.I. Petushkova 3 , L.V. Savvateeva 1 1 Instytut Medycyny Molekularnej, Pierwszy Moskiewski Państwowy Uniwersytet Medyczny. ICH. Sieczenow, Moskwa; Instytut Biologii Fizykochemicznej. JAKIŚ. Belozersky Moskiewski Uniwersytet Państwowy, Moskwa; 3 Wydział Biologii, Moskiewski Uniwersytet Państwowy Łomonosowa Śr. Łomonosow, Moskwa, Rosja

Stworzenie środka enzymatycznego do skutecznej detoksykacji glutenu

Sesja 6
Przewodniczący: W.M. Lipkin, telewizja Owczinnikowa
Duża sala
21 września 16.15 - 18.15

15 minut IA Grivennikov 1, E.V. Novosadova 1 , S.A. Antonow 1 , E.S. Manuilova 1 , E.L. Arsen'eva 1 , mgr. Grefenshtein 1 , AM Zykova 1 , Kobylyansky A.G . 1, W.W. Simonova 3 , L.G. Chaspekov 3 , OS. Lebiediewa 2 , mgr. Lagarkova 2 , S.N. Illarioskin 3 , V.Z. Tarantula 1 , N.F. Miasojedow 1 1 Instytut Genetyki Molekularnej RAS; 2 Federalne Centrum Naukowo-Praktyczne Medycyny Fizycznej i Chemicznej Federalnej Agencji Medycznej i Biologicznej Rosji; 3 Centrum Naukowe Neurologii Rosyjskiej Akademii Nauk Medycznych, Moskwa

System testowy oparty na indukowanych ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

15 minut W.W. Nowosadowa, E.L. Arseniewa, E.S. mgr Manuilova Grefenstein, N.F. Myasojedow, I.A. Grivennikov Instytut Genetyki Molekularnej RAS, Moskwa, Rosja

Peptydy z rodziny melanokortyn są zdolne do modulowania ekspresji genów swoistych dla neuronów podczas różnicowania neuronów indukowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

15 minutAP Bogaczuk 1, Z.I. Storozheva 2 , Yu.A. Zolotarev 3 , G.I. Kovalev 4 , V.N. Azew 5, A.N. Murashev 5, D.I. Rżewskiego 5 , G.B. Telegin 5, V.M. Lipkin 1 1 Instytut Chemii Bioorganicznej. MM. Shemyakin i Yu.A. Owczinnikow RAS; 2 Federalne Centrum Badań Medycznych dla Psychiatrii i Narkologii. wiceprezes Serbski; 3 Instytut Genetyki Molekularnej RAS; 4 Instytut Farmakologii RAS, Moskwa, Rosja; 5 Oddział Instytutu Chemii Bioorganicznej. MM. Shemyakin i Yu.A. Ovchinnikov RAS, Pushchino, obwód moskiewski, Rosja

Badania przedkliniczne nowego leku neuroprotekcyjnego na bazie peptydów

15 minutYu.A. Zołotariew 1, GI Kovalev 2 , N.V. Kost 3 , O.Yu. Sokolov 3 , A.K. Dadayan 1 , V.S. Kozik 1 , S.I. Blizna 1, EV Vasil'eva 2 , A.P. Bogachuk 4 , V.M. Lipkin 4 , N.F. Miasojedow 1 1 Instytut Genetyki Molekularnej RAS; 2 Instytut Farmakologii im W.W. Zakusowa; 3 Centrum Badań Zdrowia Psychicznego; 4 Instytut Chemii Bioorganicznej MM. Shemyakin i Yu.A. Ovchinnikov RAS, Moskwa, Rosja

Aktywność przeciwlękowa i neuroprotekcyjna peptydu regulatorowego HLDF-6 w modelach choroby Parkinsona i zaburzeń lękowych

15 minut A.K. Dadayan 1 , Yu.A. Zolotarev 1 , V.S. Kozik 1 , S.I. Blizna 1, I.Yu. Nagaev 1 , V.N. Azev 2 , A.P. Bogachuk 3 , V.M. Lipkin 3 , N.F. Miasojedow 1 1 Instytut Genetyki Molekularnej RAS, Moskwa; 2 Oddział Instytutu Chemii Bioorganicznej. MM. Shemyakin i Yu.A. Ovchinnikov RAS, Pushchino; 3 Instytut Chemii Bioorganicznej MM. Shemyakin i Yu.A. Ovchinnikov RAS, Moskwa, Rosja

Farmakokinetyka postaci acetamidowej peptydu HLDF-6 w tkankach zwierząt laboratoryjnych z użyciem pochodnych znakowanych trytem i deuterem.

Większość metod terapii genowej ex vivo i in vivo wykorzystuje sklonowane konstrukty genetyczne, które zastępują funkcjonalną formę białka, które nie jest syntetyzowane w organizmie pacjenta lub jest syntetyzowane w formie wadliwej. Jednak wiele ludzkich chorób (rak, stany zapalne, infekcje wirusowe i pasożytnicze) jest związanych z nadprodukcją normalnego białka. W celu leczenia tych schorzeń opracowano terapie.

systemy wykorzystujące specyficzne oligonukleotydy. Taki mały oligonukleotyd może hybrydyzować z określonym genem lub mRNA i obniżać poziom transkrypcji lub translacji, zmniejszając w ten sposób ilość białka odpowiedzialnego za syntetyzowane patologie. Oligonukleotyd, który hybrydyzuje z samym genem i blokuje jego transkrypcję, nazywany jest „antygenowym”, a taki, który hybrydyzuje z odpowiednim mRNA, nazywany jest „antysensownym” (antysensowny RNA). Aby zapobiec aktywacji transkrypcji określonych genów, można również zastosować dwuniciowe oligonukleotydy, które wiążą się specyficznie z białkami wiążącymi DNA (białka aktywatorowe). Wreszcie, aby zmniejszyć ilość określonego mRNA i syntetyzowanego na nim białka, można zastosować rybozymy - naturalne sekwencje RNA, które wiążą się z określonymi cząsteczkami RNA i tną je.

W przyszłości leki na bazie kwasów nukleinowych prawdopodobnie znajdą szerokie zastosowanie, a głównym obiektem badań naukowych i prób klinicznych będą różne „antysensowne” oligonukleotydy.

3.1 Antysensowne oligonukleotydy jako leki

„Antysensowny” RNA (Antisense RNA), który ma być stosowany jako lek, to krótki (15-20 nukleotydów) oligonukleotyd, który może wiązać się z pewnym komplementarnym do niego miejscem mRNA i hamować translację kodowanego przez siebie białka, w ten sposób tłumiąc proces patologiczny (ryc. 2).

Efekt terapeutyczny syntetycznych „antysensownych” oligonukleotydów zależy od specyficzności ich hybrydyzacji z dostępnym docelowym miejscem mRNA, odporności na działanie nukleaz komórkowych i obecności układu dostarczania do komórki. Sekwencje 15-20-nukleotydowe hybrydyzują z unikalnymi mRNA o dość wysokiej specyficzności. Potencjalne miejsca docelowe są określane przez testowanie zestawu „antysensownych” oligonukleotydów przy użyciu hodowli komórkowej, która syntetyzuje docelowy mRNA. W tym celu przeprowadza się elektroforetyczny rozdział białek komórkowych, do którego podczas translacji włączany jest znacznik radioaktywny, a za pomocą radioautografii określa się, w obecności którego z „antysensownych” oligonukleotydów synteza danego białka jest zmniejszona. Nie ma ogólnych kryteriów wyboru najlepszych miejsc docelowych w różnych transkryptach RNA. Skuteczne mogą być oligonukleotydy, które są komplementarne do końców 5' lub 3' mRNA, granic egzonów i intronów, a nawet regiony dwuniciowe. Oligonukleotydy antysensowne mogą być degradowane przez nukleazy wewnątrzkomórkowe, dlatego ważne jest, aby chronić je przed działaniem tych ostatnich, aby nie utraciły zdolności do hybrydyzacji z celem. W tym celu można w pewien sposób modyfikować zasady pirymidynowe, rybozę lub dezoksyrybozę (ryc. 3). Tak więc w obecnie najszerzej stosowanych oligonukleotydach „antysensownych” wolny atom tlenu wiązania fosfodiestrowego jest zastąpiony grupą SH (rys. 3B ), w wyniku czego powstaje wiązanie tiofosforanowe. Zmodyfikowane w ten sposób oligonukleotydy rozpuszczają się w wodzie, niosą ładunek ujemny i nie są rozcinane przez endonukleazy. Po hybrydyzacji z miejscem docelowym tworzą dupleksy, które aktywują rybonukleazę (RNazę), endogenny enzym, który tnie mRNA w takiej hybrydowej cząsteczce. Przeprowadzono pierwsze badania kliniczne takich oligonukleotydów – leków „pierwszej generacji”. Celem jest RNA cytomegalowirusa, ludzkiego wirusa niedoboru odporności, a także mRNA genów odpowiedzialnych za rozwój nowotworów, chorób jelit i innych chorób.

Zsyntetyzowane „antysensowne” oligonukleotydy z wiązaniami amidofosforynowymi i poliamidowymi (peptydowymi) - kwasy peptydonukleinowe (peptydowe kwasy nukleinowe, PNA) (ryc. 3 V i D ). Takie cząsteczki są bardzo odporne na działanie nukleaz. Grupy chemiczne przyłączone do atomu węgla 2' reszty cukru i atomu C-5 pirymidyn również chronią oligonukleotydy antysensowne i ułatwiają ich wiązanie z miejscem docelowym (ryc. 3 2D oraz mi ). Wszystkie zalety tych i innych modyfikacji są obecnie intensywnie badane.

Penetrację „antysensownych” oligonukleotydów do komórki można znacznie ułatwić umieszczając je w liposomach. Ten wysoce wydajny system dostarczania umożliwia stosowanie „antysensownych” oligonukleotydów w niskich stężeniach. Jeśli jednak liposomy skoniugują się z przeciwciałami specyficznymi dla epitopów niektórych komórek określonych narządów, wówczas możliwe będzie ukierunkowane dostarczanie „antysensownych” oligonukleotydów.

Przeprowadzone badania przedkliniczne wykazały, że „antysensowne” oligonukleotydy są bardzo skutecznymi lekami. Zbadano możliwość ich zastosowania w leczeniu zwężeń tętnic wieńcowych i szyjnych, które prowadzą do zawałów serca i udarów. W tych przypadkach często uciekają się do angioplastyki, rozszerzania tętnic za pomocą cewnika balonowego, ale u około 40% pacjentów zwężenia pojawiają się ponownie po 6 miesiącach, ponieważ angioplastyka stymuluje proliferację komórek mięśni gładkich i wydzielanie substancji międzykomórkowej do wnętrza warstwa tętnicy w miejscu jej ekspansji. W jednym z eksperymentów antysensowne oligonukleotydy z wiązaniami tiofosforanowymi, komplementarne do mRNA, które kodują białka ważne dla cyklu komórkowego ssaków, wstrzyknięto do tętnic szyjnych szczurów po angioplastyce; w rezultacie częstość nawracających zwężeń zmniejszyła się o 90%. Proliferacja komórek mięśni gładkich występuje również w miażdżycy, cukrzycy, powikłaniach po pomostowaniu aortalno-wieńcowym. Prawdopodobnie wszystkie te stany można kontrolować w podobny sposób.

Oligonukleotydy antysensowne można również stosować do leczenia infekcji wirusowych i malarii. Ponadto, wyniki badań klinicznych fazy I leczenia choroby Crohna z zastosowaniem doustnego podawania „antysensownego” oligonukleotydu wykazały wyraźny efekt terapeutyczny bez zauważalnych skutków ubocznych. W tym przypadku docelowy mRNA koduje adhezję międzykomórkową typu 1, która jest wytwarzana w nadmiarze u pacjentów z chorobą Leśniowskiego-Crohna. Planowane jest zbadanie skuteczności tego samego oligonukleotydu w leczeniu innych chorób zapalnych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, łuszczyca i wrzodziejące zapalenie jelita grubego.

W zasadzie „antysensowne” oligonukleotydy mogą tworzyć potrójną helisę z chromosomalnym docelowym DNA i blokować transkrypcję. Jednak specyfika „antygenowych” oligonukleotydów nie spełnia jeszcze standardów przyjętych dla leków.

Streszczenie

Przegląd uwzględnia właściwości farmakokinetyczne różnych preparatów antysensownych oligonukleotydów. Porównano farmakokinetykę leków pierwszej i drugiej generacji. Rozważono także wpływ na farmakokinetykę chemicznej modyfikacji cząsteczki.

Słowa kluczowe Słowa kluczowe: oligonukleotydy antysensowne, oligodeoksynukleotydy tiofosforanowe, farmakokinetyka

Wstęp

Właściwości farmakokinetyczne oligonukleotydów antysensownych (ASO) najlepiej zrozumieć, gdy weźmie się pod uwagę ich właściwości fizyczne i chemiczne. Parametry takie jak ładunek, masa cząsteczkowa i amfipatyczny charakter ACO fosforanowych mają wyraźny wpływ na ich farmakokinetykę. Szczególnie istotny wpływ na właściwości farmakokinetyczne ASO ma budowa chemiczna, w szczególności grupa fosforanowa i 2'-metoksyetyl ​​(MOE).

Wchłanianie, dystrybucja, metabolizm i wydalanie pierwszej generacji oligodeoksynukleotydów tiofosforanowych (ODN) były szeroko badane na zwierzętach laboratoryjnych oraz w badaniach klinicznych. Właściwości farmakokinetyczne preparatów fosforanowych ASO są następujące: podawane pozajelitowo fosforanotionianowe ODN szybko odnajdują się w osoczu krwi, gdzie wiążą się z hydrofilowymi obszarami białek osocza i dzięki temu unikają filtracji kłębuszkowej. Te regiony hydrofilowe różnią się od innych regionów hydrofilowych, z którymi wiążą się leki lipofilowe, a zatem istnieje niewielka konkurencja o wiązanie białek osocza z ASO. Kinetyka w osoczu charakteryzuje się krótką fazą dystrybucji (rzędu kilku godzin), po której następuje faza eliminacji z okresem półtrwania wynoszącym dni lub tygodnie. Początkowa faza dystrybucji koniecznie obejmuje wiązanie ASO z białkami i rozmieszczenie tych kompleksów w tkankach wątroby, nerek, węzłów chłonnych, szpiku kostnym i śledzionie, które są miejscami najbardziej aktywnego wiązania i akumulacji ASO . Oczywiste jest, że faza eliminacji ASO na skutek początkowego wiązania białka jest determinowana przez początkowy etap jego dystrybucji. Ze względu na możliwe nasycenie białkami , pole pod krzywą farmakokinetyczną (AUC) zwiększa się wraz ze wzrostem dawki, ponieważ ASO nie wiąże się już z białkami po ich nasyceniu, ale dostaje się do krwioobiegu w postaci wolnej. Po związaniu ASO wnika do komórek wzdłuż gradientu stężenia z przestrzeni zewnątrzkomórkowej przez błonę komórkową do przestrzeni wewnątrzkomórkowej, prawdopodobnie za pomocą białka nośnikowego. ASO w komórkach wiążą się z dostępnymi celami, ale głównie ASO w komórkach najprawdopodobniej wiążą się z białkami wewnątrzkomórkowymi. W komórce wszechobecne nukleazy, ale nie enzymy cytochromu P450, metabolizują preparaty ASO. Ponieważ enzymy cytochromu P450 zwykle metabolizują leki małocząsteczkowe, ASO nie konkurują w procesach metabolicznych z konwencjonalnymi związkami małocząsteczkowymi, co zmniejsza ryzyko interakcji leków. Wydalanie ASO z moczem jest ostatecznie wynikiem metabolizmu w tkankach i ustalenia równowagi metabolitów i substancji natywnych poza tkankami iw krążeniu ogólnoustrojowym. Te procesy u zwierząt laboratoryjnych i ludzi są bardzo podobne, dlatego nie jest możliwe zidentyfikowanie korelacji międzygatunkowej między zwierzętami laboratoryjnymi a ludźmi.

Obecnie w badaniach klinicznych najszerzej stosowana jest konfiguracja ASO „drugiej generacji”, w której grupy MOE znajdują się w pozycji 2” nukleotydów na końcach 3” i 5”. Ta konfiguracja jest bardziej zaawansowaną strukturą w porównaniu do niezmodyfikowanych ODN fosforanowych , które są lekami antysensownymi pierwszej generacji.Wynika to z ich zwiększonej skuteczności, zmniejszonej toksyczności i wydłużonego okresu półtrwania.Wiele czynników związanych z przejściem z pierwszej do drugiej generacji ASO jest bezpośrednio związanych z poprawą ich farmakokinetyki.

Cechy budowy chemicznej ASO

Szkielet fosforanowy

Najwcześniejsze próby stworzenia leków o działaniu antysensownym wiązały się z wykorzystaniem niezmodyfikowanego DNA, które niestety było bardzo podatne na degradację przez nukleazę. Jak się okazało, wszechobecne nukleazy rozszczepiają wiązania fosfodiesterazowe natywnego DNA, w wyniku czego okres półtrwania niezmodyfikowanych ASO wynosi kilka minut. Ta szybka degradacja była główną cechą profilu farmakokinetycznego niezmodyfikowanych antysensownych DNA. Zmiana szkieletu fosfodiestrowego DNA na tiofosforan drastycznie zmieniła profil farmakokinetyczny ASO. W tych preparatach struktura tiofosforanowa zastępuje jeden atom siarki w wiązaniach fosfodiestrowych jednym niemostkowym atomem tlenu. Struktura ta zwiększa odporność ASO na nukleazy iw efekcie poprawia ich właściwości kinetyczne.

Chiralność fosforanowa

Badania wykazały, że tiacja szkieletu diestrowego ACO nie tylko zwiększa jego odporność na nukleazy, ale także przyczynia się do powstania chiralności, czyli możliwości istnienia stereoizomerów przy każdym wiązaniu fosforanowym, co prowadzi do tego, że w każdym 20-merowym ACO znajduje się 219 stereoizomerów Sp lub Rp. Połączenie oporności na nukleazy i zwiększonego wiązania z białkami silnie wpływa na farmakokinetykę ASO. Zwiększenie stabilności fosforanotionianu ASO prowadzi do tego, że okres półtrwania leku z osocza wzrasta do 30-60 minut w porównaniu z okresem półtrwania fosfodiestrowego ASO, który wynosi 1-2 minuty.

Warto omówić oporność na nukleazy i chiralność dzięki zastąpieniu fosfodiestrów wiązaniami tiofosforanowymi, ponieważ właściwości fizyczne związane z tą cechą strukturalną są ważne zarówno dla ASO pierwszej, jak i drugiej generacji. Oporność na nukleazy fosfotionianu ASO wynika z bliskości siarki na niemostkującym tlenie w miejscu aktywnym egzonukleazy do jonu metalu. Ta bliskość może spowodować przemieszczenie jonu metalu z miejsca aktywnego. Efekt ten wykazano w modelu egzonukleazy polimerazy DNA 3'-5'. Dane krystalograficzne rentgenowskie potwierdzają tę hipotezę o przemieszczeniu jonu metalu. Widoczne różnice we wrażliwości stereoizomerów na aktywność egzonukleazy polimerazy DNA są zgodne z proponowaną konformacją stereoizomerów ODN tiofosforanowych w miejscu aktywnym. Jest prawdopodobne, że chiralność wiązań tiofosforanowych może wpływać na inne nukleazy w ten sam sposób, tj. przez wypieranie jonów metali, chociaż różne egzonukleazy mogą wykazywać różne preferencje dla wiązań Rp i Sp w zależności od natury miejsca aktywnego enzymu.

Alternatywnie siarka może po prostu zająć miejsce tlenu w wiązaniach diestrowych. Różnice w zdolności siarki do przyjmowania ładunku ujemnego w porównaniu z tlenem umożliwiają przewidywanie zmian w centrum aktywnym. Ta zmiana jest najprawdopodobniej spowodowana hydrolizą wiązań fosfodiestrowych i może wynikać z tworzenia przejściowego pięciowartościowego fosforu z dwoma ujemnie naładowanymi atomami tlenu. Zastąpienie jednego z równikowych atomów tlenu siarką będzie miało negatywny wpływ na aktywność enzymu: (1) zmniejsza się wiązanie wody, co stabilizuje lokalny ładunek ujemny na atomach, utrudniając uzyskanie drugiego ujemnego ładunku na siarce; oraz (2) zmniejszone wiązanie Mg2+ do siarki. Istnieją dowody na ten ostatni efekt w badaniach poziomu rozszczepienia rybozymu w diastereomerycznych wtrąceniach tiofosforanowych, gdy dodatek Mg 2+ hamuje rozszczepianie rybozymów tiofosforanowych. Ponadto wykazano, że istnieje pewien spadek aktywności nukleazy w regionach szkieletowych oddalonych od wiązań tiofosforanowych, co sugeruje przenoszenie efektu chiralności. Zjawisko to najlepiej wyjaśniają zmiany w rozmieszczeniu cząsteczek wody wokół szkieletu fosfotionianowego w porównaniu ze szkieletem fosfodiestrowym.

Stereospecyficzny wpływ na aktywność nukleaz istotnie wpływa na farmakokinetykę ASO tiofosforanowych, co najwyraźniej przejawia się w szybkości metabolizmu ASO tiofosforanowych I generacji w osoczu krwi. Zmniejsza się tempo całkowitej eliminacji ASO z osocza, co sugeruje spowolnienie metabolizmu. Tych zmian szybkości nie można wyjaśnić wyłącznie kinetykami pierwszego rzędu, ale można je wyjaśnić różnicami w podatności wiązań Rp i Sp.

Różnice stereospecyficzne w aktywności egzonukleazy są mniej ważne dla ASO drugiej generacji. Wynika to z faktu, że ASO drugiej generacji mają modyfikacje 2" na końcach 3" i 5", które zapobiegają ich rozszczepieniu przez egzonukleazy. Za pomocą endonukleazy wyizolowanej z patogenu Serratia marcescens, efekty chiralności wiązań fosforotionianowych, podobnie jak egzonukleazy, jest to jeden z niemostkujących tlenu do hydrolizy wiązań fosfodiestrowych. z czego aktywność enzymu spada, podczas gdy w diastereomerze Rp nie.Ponieważ endonukleaza Serratia wykazuje istotne podobieństwa z niektórymi endonukleazami ssaków, należy przypuszczać, że mechanizm ten może mieć szerokie zastosowanie.Jak wpływają na stereochemiczne cechy wiązań tiofosforanowych działanie innych endonukleaz nie jest znane, jednak jeśli założymy, że reakcja przebiega według schematu podobnego do endonukleazy Serratia, możemy założyć, że miejsce aktywne będzie zawierało i jest metalem (prawdopodobnie Mg 2+) a siarka będzie wpływać na działanie nukleaz , gdy jest zorientowany na jon metalu. Jeżeli endonukleazy są wrażliwe na chiralność, może to mieć ważne implikacje dla rozwoju problemu tworzenia skutecznych leków drugiej generacji. Oprócz wpływu chiralności na leki pierwszej generacji, chiralny wpływ na metabolizm leków drugiej generacji może prowadzić do spowolnienia ich metabolizmu. Tak więc, na przykład, można założyć, że stereoizomery szybko metabolizowane zostaną selektywnie zniszczone, pozostawiając jedynie wolno metabolizowane izomery.

Wiązanie ASO z białkami

Stwierdzono, że w porównaniu z ASO ze szkieletem fosfodiestrowym na farmakokinetykę struktur tiofosforanowych istotny wpływ ma ich wiązanie z białkami. Chemiczną podstawą zwiększonego wiązania białek jest zwiększona lipofilność wiązań fosforanowych w porównaniu z wiązaniami fosfodiestrowymi. Ponieważ oddziaływania molekularne z wodą są determinowane przez postać i funkcję makrocząsteczek w roztworze wodnym, nawet niewielkie zmiany lipofilności szkieletu na całej długości ASO mogą mieć konsekwencje dla oddziaływania oligomeru z wodą i makrocząsteczkami, takimi jak białka.

Według pierwszego przybliżenia, ODN fosfotionianowe wiążą się z białkami komórkowymi bardziej losowo niż ODN fosfodiestrowe. Dlaczego ASO fosfotionianowe lepiej wiążą się z białkami, nie jest w pełni zrozumiałe. Możliwe wyjaśnienia sugerują zwiększoną lipofilność i kompleksowanie jonami metali.

Nie można przecenić znaczenia wiązania z białkami osocza dla farmakologii, farmakokinetyki i toksykologii ASO fosforanowych (zarówno pierwszej, jak i drugiej generacji). Na poziomie stężenia mikromolowego, ponad 90% ODN fosforanowych wiąże się w osoczu. Istnieją specyficzne różnice w odsetku i sile wiązania białek, jak również różnice jakościowe w wiązaniu ASO z określonymi białkami u różnych gatunków. Wiązanie fosforanowych ASO z krążącymi białkami zapobiega filtrowaniu tych związków przez kłębuszki nerkowe i wydalaniu ich z moczem. W przypadku nasycenia, na przykład, gdy podaje się dużą dawkę ASO, zwiększa się wydalanie z moczem ASO o pełnej długości. Ze względu na różnice gatunkowe o saturacji różnych gatunków decydują różne stężenia ASO. Na przykład, mysie białka osocza mają niższe powinowactwo do ASO niż białka szczurów lub ludzi. Dlatego efekt wysycenia procesu wiązania ASO z białkami osocza u myszy występuje przy niższych stężeniach w porównaniu z innymi gatunkami. Różnice gatunkowe w wiązaniu białek osocza są istotnym czynnikiem różnic w farmakokinetyce międzygatunkowej.

Oporność na nukleazy i wiązanie białek, które są charakterystyczne dla ASO z wiązaniami fosforanowymi, również zmieniają farmakokinetykę terapii ASO. Dodatkowe struktury chemiczne, charakterystyczne dla drugiej generacji tworzonych leków, wprowadzają inne zmiany w ich farmakokinetyce.

Pochodne metoksyetylowe ACO

ASO drugiej generacji zostały opracowane w celu poprawy niektórych właściwości ODN pierwszej generacji. Tak więc struktury fosfotionianowe dodane do grup MOE w pozycjach 2" zwiększają ich odporność na nukleazy i zmieniają wydajność wiązania białek.

Odporność MOE na nukleazy

Wykazano, że struktura MOE wpływa na odporność ASO na nukleazy. Podczas gdy struktury fosfotionianowe zmniejszają aktywność egzonukleazy, struktura w pozycji 2" praktycznie eliminuje aktywność egzonukleazy. Odporność na nukleazy może być wynikiem (1) podstawienia atomu wodoru 2" za MOE, (2) efektów sterycznych MOE lub (3) tworzenie sztywnej powłoki wodnej wokół szkieletu ASO. Bez względu na przyczyny oporności na nukleazy, obecność grupy MOE sprawia, że ​​ASO zmienione w pozycji 2" są praktycznie odporne na działanie krążących i większości nukleaz komórkowych. Centralny region szkieletu ASO, składający się z deoksyfosfotionianów, nie jest prawie jako oporne na rozszczepienia za pośrednictwem nukleaz.Różnice w ASO pierwszego i drugiego pokolenia w miejscach podlegających metabolizmowi, określają również różnice we wzorcach metabolicznych.

Podczas oceny wzorców metabolicznych za pomocą kapilarnej elektroforezy żelowej (CGE) lub chromatografii cieczowej/spektrometrii masowej (LC/MS) nie znaleziono metabolitów krótszych o jeden nukleotyd. Przede wszystkim znaleziono metabolity rozszczepione w miejscu deoksy (przypuszczalnie przez endonukleazy), dalszą drogą metabolizmu jest zmniejszenie rozmiarów produktów rozszczepienia. Odporność na egzonukleazy i powolny metabolizm pod wpływem aktywnych endonukleaz prowadzi do powstania związków charakteryzujących się długim okresem półtrwania .

Wiązanie MOE z białkami

Badania eksperymentalne wykazały, że ASO fosfotionianowe ze strukturami 2'-MOE mają niższe powinowactwo do białek osocza w porównaniu z niezmodyfikowanymi ASO fosfotionianowymi około 18 do około 40 µM. Jednocześnie w całkowicie podstawionej strukturze MOE ASO powinowactwo do białek osocza tylko nieznacznie spada. Dlaczego wzrost liczby struktur MOE w oligonukleotydzie nie wpływa na dalszy spadek powinowactwa do białek osocza, nie jest jasne, ale może to wynikać z cech struktury drugorzędowej ASO.

Spadek powinowactwa białek związanego ze strukturami MOE można uzasadnić pewnymi właściwościami fizycznymi. Prawdopodobnie najważniejszym fizycznym czynnikiem odróżniającym zmodyfikowane ASO MOE od niezmodyfikowanych jest obecność wodnej powłoki molekularnej, która powstaje z łańcucha bocznego MOE. Podstawniki MOE w łańcuchu węglowodorowym „chelatują” cząsteczki wody (i prawdopodobnie jony metali), tworząc wodną powłokę i zmniejszając potencjalny kontakt między „lepkimi” cząsteczkami siarki a białkami osocza lub komórek. Stopień wiązania ASO z białkami jest odwrotnie skorelowany z ich wydalaniem z moczem. Wprowadzenie wiązań fosforanowych i podstawników 2'-MOE zmienia wiązanie z białkami iw efekcie zmienia właściwości ASO.

Wchłanianie, dystrybucja, metabolizm i wydalanie ASO

Ssanie

Pozajelitowa droga podawania ASO

Badania wykazały, że ze względu na masę cząsteczkową (około 7000 D) i ujemne ładunki ASO wchłanianie tych leków z przewodu pokarmowego jest ograniczone. Dlatego zwykle stosuje się pozajelitową drogę ich podawania. Do podawania leków pierwszej generacji stosuje się wlew podskórny, dożylny lub wstrzyknięcie do ciała szklistego. Mniejsza aktywność prozapalna ASO drugiej generacji sprawia, że ​​są one bardziej odpowiednie do podawania podskórnego. Farmakokinetyka tych leków w osoczu po wstrzyknięciach podskórnych i wlewach dożylnych jest porównywalna. Badania na zwierzętach laboratoryjnych pokazują, że ostatecznie dystrybucja ASO jest również porównywalna w różnych narządach, z wyjątkiem miejsca wstrzyknięcia i węzłów chłonnych.

Po podaniu podskórnym ASO zarówno pierwszej, jak i drugiej generacji są szybko wchłaniane z miejsca wstrzyknięcia do krążenia ogólnego. W badaniach klinicznych po podskórnym podaniu ASO drugiej generacji czas do osiągnięcia maksymalnego stężenia (Tmax) waha się od 1,5 do 4,7 godziny w zakresie dawek od 25 do 200 mg przy stałej objętości 1 ml. Biodostępność dawki podskórnej wynosi od 36 do 82% podanej dawki. Badania przedkliniczne i kliniczne sugerują, że biodostępność ASO wzrasta wraz ze stężeniem.

Kinetyka ASOs w miejscu wstrzyknięcia może wpływać na odpowiedź miejscową, jak również na ich kinetykę ogólnoustrojową i dystrybucję. Zmniejszenie stężenia ASO w miejscu wstrzyknięcia hipotetycznie zmniejsza lokalną odpowiedź na wstrzyknięcie. Jednym ze sposobów zmniejszenia stężenia ASO w miejscu wstrzyknięcia jest rozcieńczenie roztworu i w efekcie zwiększenie powierzchni wchłaniania z podskórnej depot. Teoretycznie rozcieńczenie roztworów i duża powierzchnia ssania powinny zmniejszać lokalne stężenie i zmniejszać lokalne reakcje. Takich samych efektów można by oczekiwać przy zwiększeniu wchłaniania ogólnoustrojowego. Dlatego zmiany dawki i objętości można uznać za potencjalne zmienne. Jednak już dziś iniekcje podskórne o małych objętościach i stosunkowo wysokich stężeniach wykazują wysoką biodostępność zastosowanego materiału.

Lokalna administracja ASO

Badanie różnych sposobów podawania ASO pokazuje, że ich formy aerozolowe, podawanie doodbytnicze i iniekcje do ciała szklistego są stosowane jako środki do podawania miejscowego. W leczeniu chorób płuc możliwe jest wytworzenie stosunkowo wysokich stężeń ASO w płucach za pomocą aerozoli.

Kinetykę ODN pierwszej generacji badano na myszach. Ustalono, że kinetyka takich leków jest zależna od dawki, klirens płucny z okresem półtrwania około 2 godzin. W przeciwieństwie do tego, badania zmodyfikowanych MOE ASO drugiej generacji wykazują okres półtrwania dłuższy niż 4 dni. Podobnie jak w przypadku innych zabiegów miejscowych, zaletą inhalacji jest możliwość wytworzenia wysokich miejscowych stężeń w tkankach, które normalnie nie gromadzą aplikowanych substancji. W płucach ASO zwykle nie kumuluje się po podaniu pozajelitowym. Administracja lokalna również rzadko powoduje skutki systemowe. Na przykład, gdy ASO podawano małpom w dawce 0,1 mg/kg przez inhalację (trzy dawki w ciągu 1 tygodnia), stężenie leku w płucach wynosiło około 1 μg/g. Ale u tych samych małp stężenie w wątrobie i nerkach wynosiło około 5% stężenia w płucach, co wskazuje na znacznie mniejszy efekt ogólnoustrojowy.

Dane literaturowe wskazują, że podawanie doodbytnicze ASO jest z powodzeniem stosowane w leczeniu wrzodziejącego zapalenia jelita grubego. W przeciwieństwie do inhalacji, gdzie można stosować niewielkie ilości wstrzykiwanej substancji, lewatywa stosowana do leczenia może zawierać do 240 mg substancji (alicaforsen) pierwszej generacji. W tym przypadku nabłonek odbytnicy jest narażony na wstrzykiwaną substancję, jednak ze względu na słabą przepuszczalność wysoko naładowanego ODN, wchłanianie leku jest minimalne, a także ogólny efekt ogólnoustrojowy. Obliczenia pokazują, że stężenie ASO w nabłonku jelitowym 12 godzin po podaniu wynosi 20 µg/g. Biodostępność u ludzi waha się od 0,03 do 2,14%, a maksymalne stężenie ASO oznaczane w osoczu wynosi tylko 0,126 µg/ml. Brak znaczącego wchłaniania ogólnoustrojowego i wysokie stężenie miejscowe leku mają pozytywny wpływ na leczenie.

Przeprowadzono badania doszklistkowych iniekcji preparatów ASO zarówno pierwszej, jak i drugiej generacji. W tym przypadku substancje są wstrzykiwane do oka w bardzo małych ilościach. Ze względu na izolację miejsca wstrzyknięcia działanie ogólnoustrojowe leku jest jeszcze bardziej ograniczone. Do oka, ciała szklistego i siatkówki ASO wchodzi z różną szybkością: wchodzi do ciała szklistego szybciej niż do siatkówki. Zarówno metabolizm lokalny, jak i dyfuzja z oka przyczyniają się do eliminacji leku. Jak już wspomniano, ze względu na niewielkie ilości działanie ogólnoustrojowe podawanego leku jest minimalne. Jednak mechanizm dystrybucji ogólnoustrojowej jest podobny do większości innych leków.

Dojelitowe podawanie ASO

Odnotowana stabilność ASO drugiej generacji na nukleazy zapewnia stabilność leku w jelicie, co umożliwia dalszą absorpcję. Jednak wielkość cząsteczki i ładunki ACO ograniczają wchłanianie leku. Po wchłonięciu z jelita kinetyka ASO jest podobna do kinetyki podawania pozajelitowego. Chociaż wątroba jest jednym z głównych miejsc akumulacji ASO, efekt pierwszego przejścia przez wątrobę nie jest istotnym czynnikiem wpływającym na kinetykę leku ASO.

Dystrybucja ASO w organizmie

Rola perfuzji i powinowactwa tkankowego

Dystrybucja ASO i innych leków zależy od przepuszczalności, intensywności ukrwienia, wiązania z białkami osocza, tkankami i komórkami. Wykazano, że dystrybucja ASO fosforanowych I i II generacji w tkankach z ich wieloma ładunkami ujemnymi i ich wiązaniem z białkami jest najmniej zależna od ukrwienia, a znacznie bardziej zależna od czynników wpływających na ich transport do komórki.

Dystrybucja wewnętrzna z osocza do tkanek jest stosunkowo szybka, okres półtrwania eliminacji wynosi 30-90 minut po podaniu dożylnym. Okres półtrwania ASO po podaniu podskórnym jest dłuższy niż po podaniu dożylnym. Ta różnica wynika z czasu wymaganego do wchłaniania, a nie z innych różnic w farmakokinetyce.

Badanie kinetyki leków pierwszej i drugiej generacji wykazało niewielkie różnice. Większa stabilność względem nukleaz ASO drugiej generacji jest kompensowana przez ich mniejsze wiązanie z białkami. Wraz z tym profile farmakokinetyczne leków pierwszej i drugiej generacji są podobne lub prawie nie do odróżnienia, gdy suma natywnego ASO i jego metabolitów (całkowity ASO) pierwszej generacji jest porównywana z nienaruszonym lekiem drugiej generacji (ISIS 13650). W przeciwnym razie szybsze niszczenie ASO przez egzonukleazy skróciłoby okres półtrwania leków pierwszej generacji w porównaniu z lekami drugiej generacji. Dystrybucja leków obu pokoleń jest zależna od dawki.

Jak zauważono powyżej, po wchłonięciu z miejsca wstrzyknięcia lub jelit, ASO wiążą się z białkami osocza. Dwa białka osocza, które specyficznie wiążą się z ASO fosfotionianowymi, to albumina i alfa-2-makroglobulina. Inne popularne białko, kwaśna glikoproteina, nie wiąże ASO. Wiązanie z białkami jest bardzo ważne dla dystrybucji ASO w tkance docelowej. Struktury chemiczne zmniejszające wiązanie prowadzą do wyraźnego obniżenia stężenia leku w tkankach, zwiększają stopień jego filtracji przez kłębuszki nerkowe i wydalanie z moczem. Zjawisko to można zaobserwować przy zastosowaniu ASO z wiązaniami diestrowymi w szkielecie preparatu lub w obecności struktury MOE. Zmniejszenie powinowactwa diestrów i struktur MOE (lub obu) do białek pozwala ASO na swobodniejsze krążenie w krwiobiegu, co prowadzi do nasilenia jego wydalania z moczem.

We wszystkich badaniach z pozajelitowymi ASO pierwszej i drugiej generacji nie zaobserwowaliśmy liniowego klirensu ASO z osocza. Klirens zmniejszał się wraz ze wzrostem dawki leku, a zatem jego biodostępność była większa niż można by oczekiwać po podanej dawce. Ponieważ początkowy klirens wynika z rozmieszczenia ASO w tkankach i jednocześnie zaobserwowano wchłanianie leku przez tkanki, można przypuszczać, że istnieje możliwość ich wysycenia ASO. Badanie procesu saturacji w wyniku wprowadzenia ASO można przeprowadzić za pomocą fagocytów wątrobowych. Gdy wiązanie ASO z komórkami Kupffera osiągnie nasycenie, rozpocznie się spadek powinowactwa. Późniejsze podanie ASO myszom poprawia dystrybucję ASO do niefagocytujących komórek wątroby, w wyniku czego aktywność farmakologiczna w hepatocytach jest poprawiona w porównaniu z kontrolą. Odwrotnie, przy stężeniach w osoczu poniżej 1 µg/ml, ASO silniej wiąże się z komórkami Kupffera i mniej gromadzi się w hepatocytach.

Badanie procesu wiązania ASO z białkami osocza wykazało, że efektowi temu towarzyszy szybka dystrybucja kompleksu w tkankach na powierzchni komórki. Chociaż dokładne mechanizmy wiązania komórkowego nie zostały ustalone, można założyć, że ASO wiążą się z białkami osocza lub białkami komórkowymi, o ile istnieją wolne miejsca wiązania. Związane ASO są następnie rozprowadzane wzdłuż gradientu stężenia w błonie komórkowej przez wymianę białka zewnątrzkomórkowego na białko wewnątrzkomórkowe.

Zatem siłą napędową wchodzenia ASO do komórek jest gradient stężenia. Opisano ruch wahadłowy ASO między cytoplazmą a jądrem. Ogólnie rzecz biorąc, jasne jest, że wiązanie białek ułatwia przemieszczanie się ACO przez bariery, które normalnie hamują ruch silnie naładowanych cząsteczek hydrofilowych. Ten mechanizm wahadłowy membrany pozostaje hipotezą dla ASO, ale został wcześniej opisany dla związków metaloorganicznych. Transport ASO z macierzy zewnątrzkomórkowej do przestrzeni wewnątrzkomórkowej uwidoczniono w wątrobie myszy metodami immunohistochemicznymi oraz w nerkach szczurów za pomocą mikroskopii żywotnej ze znacznikiem fluorescencyjnym dla ASO drugiej generacji (S. Henry, B. Molitoris).

Tożsamość białek kontrolujących transport ASO z przestrzeni zewnątrzkomórkowej do przestrzeni wewnątrzkomórkowej nie jest znana, ale uważa się, że wiązanie kompleksu białko-ASO z komórką odbywa się przy użyciu receptora fagocytarnego. Ponieważ fagocyty, takie jak komórki Kupffera, makrofagi tkankowe i komórki kanalików proksymalnych, wykazują duże powinowactwo do ASO, można pomyśleć o możliwości znalezienia takich receptorów na ich powierzchni komórkowej.

Jednak dystrybucja komórkowa i farmakodynamika ASO u myszy transgenicznych pozbawionych receptora fagocytarnego SR-A I/II nie różniły się od tych u kontrolnych zwierząt syngenicznych. Tak więc receptor ten, znany jako receptor Scavenger, nie wydaje się być odpowiedzialny za wychwyt kompleksu przez wątrobę i nerki. Nie badano roli innych struktur akceptorowych biorących udział w procesach endocytozy kompleksu ACO-białko.

Białka błonowe pełniące funkcję nośników , są obecne we wszystkich organizmach. Głównymi nośnikami leków są: ABC ( transportery kasetowe wiążące ATP) i SLC (rodzina nośników rozpuszczonych). Wiadomo, że szybkość przenoszenia substancji przez błony biologiczne w procesach, w których pośredniczą transportery, charakteryzuje się nasyceniem. Opisano kilku członków rodziny SLC o znanych cechach , głównie do transportu nukleozydów, cukrów nukleozydowych i cukrów fosforanowych. Istnieje opinia, że ​​przyszłe badania będą najprawdopodobniej dotyczyły procesów transportu międzybłonowego ASO.

Oczywiste jest, że oprócz powyższych różnic w akumulacji struktur tworzonych przez różne narządy i tkanki oraz zależności klirensu i dystrybucji takich związków od ich dawki, na dystrybucję ASO w tkankach mają wpływ systemy transportowe, charakterystyka przepływu krwi u osobników, możliwy czas przebywania leku w organizmie i wreszcie wysycenie tkanek ASO. Pomimo istotnej roli tych czynników w procesach dystrybucji tkankowej ASO uważa się, że początkowe wiązanie ASO z powierzchnią komórki jest jednym z czynników determinujących analizowane mechanizmy. Wniosek ten opiera się na fakcie, że wątroba i nerki są początkowymi miejscami wiązania ASO z pewną dodatkową akumulacją w ciągu pierwszych 24 godzin po podaniu ASO. Podczas badania parametrów dystrybucji ASO w wątrobie i nerkach wykazano ułamkowy wzrost stężenia leku w narządach w ciągu pierwszych 24 godzin. Dzieje się tak w okresie komórkowej i subkomórkowej redystrybucji ASO, ale przypuszczalnie narządy pierwotnej dystrybucji powinny z czasem gromadzić więcej materiału ze względu na większe powinowactwo tych narządów do ASO. Białka odpowiedzialne za to powinowactwo mogą zawierać heparynopodobne miejsca wiązania lamininy i fibrynogenu oraz czynnik wzrostu fibroblastów (FGF). Wczesna interakcja ASO z komórką może być spowodowana wiązaniem się tych białek, ale natura tych białek, jak wspomniano powyżej, została słabo zbadana.

Biorąc pod uwagę znaczenie połączenia swoistych miejsc wiązania ASO z komórkami w dystrybucji leku w organizmie, należy również zwrócić uwagę na tak ważny czynnik, jak różny dopływ krwi do różnych narządów, którego możliwość wpływania na różną dystrybucję tiofosforanu ASO jest oczywiste. Według różnych autorów praca z dziesiątkami serii substancji zarówno pierwszej, jak i drugiej generacji wskazuje na ich zbliżone rozmieszczenie i zauważalnie podobne rozmieszczenie u osobników różnych gatunków. Nerki, wątroba, węzły chłonne, śledziona i szpik kostny to narządy, które gromadzą największą ilość ASO i ich metabolitów. Fakt, że płuca i serce nie gromadzą ASO wskazuje, że dla wyjaśnienia wyraźnego nagromadzenia ASO w wątrobie i nerkach nie wystarczy tylko jedno wyjaśnienie ich dobrego ukrwienia. Na przykład obszary o najlepszym krążeniu krwi w nerkach to kłębuszki i nie są to obszary zawierające więcej ASO. Przeciwnie, w kanalikach proksymalnych krążenie krwi jest mniej aktywne. Jednak komórki kanalików proksymalnych charakteryzują się dużą liczbą komórek aktywnie fagocytujących, gromadzą wolne ASO, a także ASO związane z białkami, które zwykle są reabsorbowane w kanalikach proksymalnych. W rezultacie kora nerkowa i nabłonek kanalików bliższych zawierają najwyższe stężenie ASO fosforanowych zarówno pierwszej, jak i drugiej generacji.

Należy również zauważyć, że dopływ krwi (ml/g tkanki) wątroby wynosi około 20% tego, co nerki. 4-5-krotne różnice w perfuzji między nerkami a wątrobą nie prowadzą do 4-5-krotnych różnic w stężeniu ASO w tych narządach. Kapilary z okienkami zwiększają obszar kontaktu ASO z przepływem krwi, co może kompensować niedostateczną perfuzję wątroby w stosunku do nerek.

Wiązanie ASO z białkami osocza podczas dystrybucji

Chociaż wysycenie komórek ASO ostatecznie wpływa na ich dystrybucję w narządach, wiązanie ASO z białkami osocza może zmieniać dystrybucję w nerkach i wątrobie w różnych seriach. Istnieją seryjne różnice w wiązaniu białek. Wraz ze spadkiem wiązania ASO z białkami osocza zmniejsza się ich akumulacja w wątrobie i wzrasta ich akumulacja w nerkach. Odwrotnie, przy wyższym wiązaniu, stężenie ASO w postaci wolnej w krwiobiegu będzie w mniejszej ilości, będzie się mniej gromadziło w nerkach, a więcej w innych narządach. Istnieje odwrotna zależność między stopniem wiązania ASO z białkami a ich akumulacją w nerkach szczurów i małp po wielokrotnym podaniu dożylnym i podskórnym.

Wiązanie z białkami może być stosowane jako kryterium selekcji dla ASO do badań klinicznych. Do tej pory określenie wiązania białek jest procesem empirycznym, w którym nie ma możliwości przewidzenia, które serie będą wiązać się mniej lub bardziej z białkami.

Dystrybucja ASO do innych narządów

Niezależnie od kolejności rozmieszczenia ASO fosforanowych I i II generacji obserwuje się charakterystyczny wzorzec lokalizacji tych leków w nerkach i wątrobie, a także w śledzionie i węzłach chłonnych, kościach oraz w cytoplazmie adipocytów. Akumulację ASO w tkance limfoidalnej można częściowo wytłumaczyć aktywnością fagocytarną histiocytów i innych komórek jednojądrzastych. Możliwa jest wizualizacja ASO w fagolizosomach histiocytów i tkankach makrofagów za pomocą barwienia hematoksyliną. Wykazano, że ASO ulegają endocytozie, lokalizują się w endosomach i pozostają w tych strukturach. Stężenie ASO w fagolizosomach jest często takie, że można je określić za pomocą barwienia hematoksyliną (prawie jak jądrowy DNA). ASO w fagolizosomach prawdopodobnie stanowi większość ASO zgromadzonego w śledzionie i narządach limfatycznych. Ponadto w tych tkankach gromadzą się fagocytarnie aktywne komórki kości i szpiku kostnego, co potwierdza obecność w ich komórkach ziarnistości zasadochłonnych.

Mięśnie (zarówno szkieletowe, jak i sercowe) nie zawierają znacznych ilości ASO. Jednak dokładne badanie mięśni metodami immunohistochemicznymi lub autoradiograficznymi ujawnia zawartość ASO w fagolizosomach makrofagów podścieliska mięśniowego, a ta akumulacja może częściowo wpływać na pomiar stężenia ASO w mięśniach i sercu.

Akumulacja ASO w cytoplazmie adipocytów jest istotna z terapeutycznego punktu widzenia. Zwłaszcza, że ​​w przeciwieństwie do większości substancji gromadzonych w adipocytach, ASO są hydrofilowe. Metody immunohistochemiczne wyraźnie pokazują, że ASO znajduje się we frakcji cytoplazmatycznej adipocytów, podczas gdy ASO prawie nie występuje w wakuoli tłuszczu. Intensywność barwienia wskazuje na znaczną akumulację substancji w cytoplazmie. Na przykład u małp po 13 tygodniach leczenia ISIS 113715 w dawce 10 mg/kg/tydzień, stężenie w wątrobie wynosiło 301 ± 88,1 μg/g, ale tylko 37,3 ± 14,4 μg/g w tkance tłuszczowej w te same zwierzęta.

Biorąc pod uwagę, że składnik beztłuszczowy stanowi 10% całkowitej masy tłuszczu, korekta stężenia ASO uwzględniająca ten wskaźnik wskazuje na porównywalność jego stężenia z wątrobą. Znaczące stężenia ASO w adipocytach wskazują, że mogą one być stosowane w leczeniu chorób genetycznych tego typu komórek: źródeł hormonów i cytokin. Stwierdzono zatem, że farmakologicznie aktywne stężenia ASO są rejestrowane w adipocytach myszy, gdy ISIS 113715 jest podawany w dawce 25 mg/kg dwa razy w tygodniu i zmniejszają ekspresję docelowego genu PTP-1B zarówno w wątrobie, jak i w adipocyty. Podobne obserwacje poczyniono u małp leczonych ASO ISIS 113715. Ponieważ biopsję tłuszczu podskórnego można przeprowadzić klinicznie, a aktywny ASO gromadzi się w tłuszczu, tłuszcz można wykorzystać do biopsji i bezpośrednio mierzyć efekty farmakologiczne (redukcja mRNA) i stężenie leku w tkankach. tkanki ludzkie.

ASO fosforanowe są również rozprowadzane do innych tkanek. Badania immunohistochemiczne pokazują, że komórki śródbłonka gromadzą ASO w stężeniach wystarczających do obniżenia poziomu mRNA, co czyni je potencjalnym celem interwencji farmakologicznej. W niektórych tkankach ich stężenia nie są wystarczająco wysokie, aby uzyskać efekt farmakologiczny. Na przykład dojrzałe limfocyty nie gromadzą ASO, a aktywność antysensowna jest ograniczana przez limfocyty T.

Komórki kostne, zwłaszcza osteoblasty aktywne fagocytarnie, mogą akumulować ASO i efekt ten może być wykorzystany do celów terapeutycznych. Ponadto komórki wysp trzustkowych również gromadzą ASO. Zarówno ASO pierwszej, jak i drugiej generacji są wysoce naładowanymi, hydrofilowymi cząsteczkami, które nie przekraczają barier krew-mózg ani krew-jądra. Jednak, podobnie jak w mięśniach, makrofagi zawierające wykrywalne ASO są zlokalizowane w obszarze śródmiąższowym jąder. Jajniki nie są oddzielone barierą, więc ASO można ilościowo mierzyć w jajnikach i wizualizować immunohistochemicznie w zrębie.

Ograniczona dystrybucja ASO z osocza do komórek mózgowych i kardiomiocytów czyni te tkanki mało prawdopodobnymi celami interferencji antysensownej, chociaż selektywne hamowanie lub ekspresja niektórych białek kanałów jonowych w mózgu i mięśniach może być terapeutycznie korzystne. Jednak ograniczoną dystrybucję ASO w tych tkankach można uznać za zaletę. Brak znacznych stężeń ASO w mózgu i sercu zmniejsza ryzyko uszkodzenia ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i zmniejsza objawy niepożądanego wpływu na serce. Jak zauważono wcześniej, bezpośrednie podawanie do struktur OUN, w szczególności mózgu, przez dooponowy, dokomorowy wlew lub wstrzyknięcie powoduje dystrybucję ASO w obrębie ośrodkowego układu nerwowego i może być użyteczne terapeutycznie.

W czasie ciąży płód jest dość dobrze chroniony przed działaniem leków antysensownych. Badanie kinetyki przezłożyskowej ASO nie wykazało jego akumulacji u płodu, u gryzoni odnotowano niski poziom ASO w łożysku. Wyniki te zostały konsekwentnie powtórzone w badaniach teratogenności różnych ASO drugiej generacji u myszy, szczurów i królików. Łożysko, pomimo wysokiej perfuzji, nie jest narządem o dużej akumulacji ASO.

Generalnie przedstawione fakty pokazują, że rozkład ASO jest jednym z kluczowych czynników determinujących nasilenie aktywności ASO. Wydaje się, że różnice w rozmieszczeniu ASO są w dużej mierze związane z tropizmem tkankowym dla tych leków oraz, w mniejszym stopniu, z perfuzją.

Metabolizm

Leki antysensowne pierwszej i drugiej generacji są metabolizowane przez nukleazy, a nie przez układy oksydazy typu cytochromu P450, które są wykorzystywane do metabolizowania konwencjonalnych lipofilowych leków drobnocząsteczkowych. ASO nie jest substratem izoenzymów cytochromu P450 ani nie indukuje ani nie hamuje jego aktywności w klinicznie istotnych stężeniach. Rozszczepianie ASO za pośrednictwem egzonukleazy, które jest głównym szlakiem metabolizmu i usuwania ODN fosforanowych pierwszej generacji, jest wtórne do ASO drugiej generacji. Aktywność egzonukleazy jest ograniczona przez dwa fragmenty: jeden MOE na końcu 3' i drugi MOE na końcu 5'.

Enzymy odpowiedzialne za metabolizm ASO

Specyficzne enzymy metabolizujące ASO drugiej generacji nie są znane. Nukleazy są wszechobecne i możliwe jest wykrycie zdegradowanych metabolitów ASO w większości tkanek. Homogenaty wątroby i nerek są zdolne do metabolizowania ASO drugiej generacji in vitro bez dodawania egzogennych źródeł energii, takich jak fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADPH) lub 5-trifosforan adenozyny (ATP). Początkowe rozszczepienie daje dwa produkty, z których każdy charakteryzuje się 5" i 3" chronionym końcem MOE. Te metabolity nie wiążą się z białkami i dlatego są wydalane z tkanek. Ponieważ metabolity są usuwane szybciej niż powstają, praktycznie nie dochodzi do akumulacji metabolitów w tkankach. Tym samym nie jest możliwe wykorzystanie oznaczenia ilości metabolitów w tkankach jako wskaźnika metabolizmu ASO w tkankach.

Ponieważ szybkość eliminacji ASO z tkanek zależy od ich metabolizmu, różnice w metabolizmie ASO w różnych tkankach można oszacować na podstawie okresu półtrwania tych leków z charakteryzowanych tkanek. Na podstawie danych dla czterech ASO drugiej generacji można stwierdzić, że zachowanie przedstawicieli tej klasy jest podobne, jednak istnieją niewielkie różnice w ich okresie półtrwania w wątrobie i nerkach małp leczonych lekiem przez 4-13 lat. tygodni. Wykazano, że okres półtrwania preparatów ACO ISIS 104838 i 112989 z wątroby i nerek jest bardzo podobny. Dane te sugerują, że dla niektórych serii ASO nie ma znaczących różnic w tempie metabolizmu w różnych narządach. Jednak różnice w okresie półtrwania w tkankach zidentyfikowano dla ISIS 107248, 113715 i 301012. Zaobserwowane różnice w szybkości metabolizmu leków ASO w wątrobie i nerkach wskazują, że mogą występować różnice w szybkości metabolizmu w różnych tkankach lub istnieje bardziej złożona kinetyka dla niektórych serii produktów lub wyniki po prostu odzwierciedlają niewielką liczbę próbek pobranych w ograniczonym przedziale czasowym.

Szczegółowe badanie procesu wydalania ASO drugiej generacji wskazuje na występowanie różnych szybkości ich wydalania z różnych typów komórek wątroby. Ponieważ niektóre typy komórek, takie jak komórki kanalików proksymalnych kory nerkowej, mają tendencję do zawierania ASO w fagolizosomach, ten typ wychwytu prawdopodobnie odpowiada za różnice w szybkości metabolizmu leków w różnych tkankach. Ponadto prawdopodobne jest, że określone sekwencje w strukturze szkieletu ASO mogą charakteryzować się różną wrażliwością na cięcie przez endonukleazy.

Egzonukleazy bakteryjne wykazują wysoki stopień specyficzności względem sekwencji nukleotydowej w szkielecie ASO, przypuszczalnie w celu ochrony przed wirusami. Znaczna część aktywności nukleaz w komórkach ssaków jest związana z mechanizmami transkrypcji i naprawy DNA, a zatem specyficzność gatunkowa ssaków może różnić się od endonukleaz bakteryjnych. Nie wiadomo, czy procesy replikacji i działanie enzymów związanych ze zjawiskiem naprawy są w równym stopniu odpowiedzialne za katabolizm tych syntetycznych ASO. Przy wysokich stężeniach ssDNA ASO mogą skutecznie konkurować z naturalnym substratem. Wiele enzymów z rodziny nukleaz jest zdolnych do katabolizowania ASO. Określenie konkretnych enzymów biorących udział w metabolizmie ASO nie ma kluczowego znaczenia dla opracowania leków antysensownych, ale lepsze zrozumienie szlaków metabolicznych będzie przydatne w opracowywaniu nowych technologii.

Metabolity ASO

Różnice w metabolizmie ASO pierwszej i drugiej generacji są dość oczywiste, gdy porównamy profil metaboliczny z CGE. Kiedy próbki tkanek lub moczu są analizowane w detektorze LC/MS, natura procesów metabolicznych staje się wyraźniejsza. Z reguły ODN tiofosforanowe pierwszej generacji są metabolizowane do kaskady metabolitów ASO, z których każdy różni się jednym nukleotydem w wyniku rozszczepienia pojedynczego nukleotydu przez egzonukleazę. Tak więc po wprowadzeniu 20-meru, to znaczy składającego się z 20 nukleotydów, ODN pierwszej generacji, osocze i tkanki zawierają rodziny kolejno skracanych ASO, zaczynając od 19-meru i dalej, aż do krótkiego ASO.

Początkowy rozkład w metabolizmie ASO drugiej generacji za pośrednictwem
endonukleazy, prowadzi do powstania dwóch ASO, jednego z końcem 3' MOE, a drugiego z końcem 5' MOE. Rozszczepienie produktów z niezabezpieczonymi końcami można przeprowadzić za pomocą 5'-egzonukleazy lub 3'-egzonukleazy. Wyniki połączonej aktywności endo- i egzonukleazy są kaskadą produktów rozszczepienia o skróconych łańcuchach, z których wiele, jeśli nie wszystkie, można wykryć w moczu pobranym od badanych zwierząt lub ludzi. Mocz leczonych zwierząt lub pacjentów leczonych ASO drugiej generacji może zawierać metabolity w zakresie od dwóch możliwych 15-merowych do dwóch możliwych 5-merowych MOE oraz wiele kombinacji każdego z metabolitów pośrednich.

Metabolity krótsze niż długość końców MOE będą obecne w tkankach, jeśli końce MOE same są substratami dla nukleaz. Te metabolity zwykle nie są wykrywane za pomocą analizy widma masowego, co sugeruje, że z reguły nie ma mononukleotydów MOE uwalnianych podczas metabolizmu. Istnieją jednak pewne wyjątki od tego uogólnienia. Dla ograniczonej liczby sekwencji nukleotydowych , przycięcia pojedynczych nukleotydów ASO drugiej generacji obserwowane w tkankach i osoczu – albo CGE albo LC/MS: metabolity wydają się być wynikiem trawienia egzonukleazy. Te metabolity można zaobserwować w początkowej dystrybucji. Zakłada się, że szybko pojawiają się w osoczu krwi. Mononukleotydy MOE, które powstają podczas metabolizmu, nie są substratami do fosforylacji, a zatem jest mało prawdopodobne, aby zostały włączone do trifosforanów nukleotydów, a ostatecznie do nukleotydów endogennych. Mononukleotydy MOE nie hamują enzymów odpowiedzialnych za syntezę DNA. Zatem mononukleotydy MOE, jeśli są utworzone, nie powinny być włączane do endogennych nukleotydów.

Centralna część deoksynukleotydów ASO drugiej generacji podlega rozszczepieniu egzonukleazy, co prowadzi do uwolnienia jednego nukleotydu. Monodeoksynukleotydy, które są wytwarzane przez rozszczepienie egzonukleazą, są identyczne z nukleotydami endogennymi, z wyjątkiem grupy tiofosforanowej, która teoretycznie może być obecna. Jednak grupa tiofosforanowa jest niestabilna na utlenianie i utratę siarki, dzięki czemu końcowa grupa fosforanowa jest identyczna z endogennymi nukleotydami. Dlatego, w przeciwieństwie do mononukleotydów MOE, każdy uwolniony deoksynukleotyd zostanie naturalnie włączony do wewnątrzkomórkowego depozytu endogennych nukleotydów. Nukleotydy, które zachowują grupy tiofosforanowe, będą substratami dla dodania jednej lub dwóch grup fosforanowych, co skutkuje mieszanymi di- lub trifosforanami tiofosforanów nukleotydów. Fosforylacja jest możliwa, ale obecność alfa tiofosforanu powoduje, że reakcje są termodynamicznie niekorzystne.

Wniosek

Znaczenie badania farmakokinetyki danych i leków podobnych do opisanych jest oczywiste, podobnie jak stworzenie modeli na różnych gatunkach zwierząt dla pełnego zrozumienia procesów zachodzących w organizmie po zażyciu leków. W Rosji trwają również badania takich leków.

Literatura

1. Adjei A.A., Dy G.K., Erlichman C. i in. Badanie fazy I ISIS 2503, antysensownego inhibitora H-ras, w połączeniu z gemcytabiną u pacjentów z zaawansowanym rakiem. // klinika. Cancer Res. 2003 tom. 9, #1. str. 115.

2. Benimetskaya L., Loike J.D., Loike G. et al. Mac-1 (CD11b/CD18) jest białkiem wiążącym ODN. // Narod. Med. 1997 tom. 3, nr 4. s. 414.

3. Benimetskaya L., Tonkinson J.L., Koziołkiewicz M. et al. Wiązanie ODN tiofosforanowych z podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów, rekombinowanym rozpuszczalnym CD4, lamininą i fibronektyną niezależnie od chiralności P. // Nukl. Kwasy Res. 1995 tom. 23, nr 21. str. 4239.

4. Bijsterbosch M.K., Manoharan M., Rump E.T. i in. Losy ODN antysensownych tiofosforanowych in vitro: dominujący wychwyt przez receptory zmiatające na komórkach śródbłonka. // Nukl. Kwasy Res. 1997 tom. 25, nr 16. str. 3290.

5. Bijsterbosch M.K., Rump E.T., De Vrueh R.L. i in. Modulacja wiązania białek osocza i wychwytu in vitro ODN tiofosforanowych przez komórki wątroby przez sprzęganie z cholesterolem. // Nukl. Kwasy Res. 2000 obj. 28, nr 14. str. 2717.

6. Brown D.A., Kang S.H., Gryaznov S.M. i in. Wpływ modyfikacji tiofosforanowej ODN na specyficzne wiązanie białek. // J. Biol. Chem. 1994 tom. 269, nr 43. R. 26801.

7. Butler M., Crooke R.M., Graham M.J. i in. ODN fosforotionianowe rozkładają się podobnie u myszy z nokautem receptora zmiatacza klasy A i myszy typu dzikiego. // J. Pharmacol. Do potęgi. Tam. 2000 obj. 292, nr 2. s. 489.

8. Butler M., Hayes C.S., Chappell A., Murray S.F., Yaksh T.L., Hua X.Y. Dystrybucja w kręgosłupie i metabolizm 2_-O-(2-metoksyetylo)-modyfikowanych ASO po podaniu dokanałowym u szczurów. // Neuronauka. 2005 tom. 131, nr 3. str. 705.

9. Butler M., Stecker K., Bennett C.F. Komórkowa dystrybucja ODN tiofosforanowych w normalnych tkankach gryzoni. //Laboratorium. Inwestować. 1997 tom. 77, nr 4. s. 379.

10. Cossum PA, Sasmor H., Dellinger D. i in. Usuwanie znakowanego 14C tiofosforanu ASO ISIS 2105 po podaniu dożylnym szczurom. // J. Pharmacol. Do potęgi. Tam. 1993 tom. 267, nr 3. s. 1181.

11. Cossum P.A., Troung L., Owens S.R. i in. Farmakokinetyka znakowanego 14C fosforotionianu ASO, ISIS 2105, po podaniu śródskórnym szczurom. // J. Pharmacol. Do potęgi. Tam. 1994 tom. 269, nr 1. str. 89.

12. Crooke ST, Graham M.J., Zuckerman J.E. i in. Właściwości farmakokinetyczne kilku nowych analogów ASO u myszy. // J. Pharmacol. Do potęgi. Tam. 1996 tom. 277, nr 2. s. 923.

13. Kierowca S.E., Robinson G.S., Flanagan J., Shen W., Smith L.E.H., Thomas D.W., Roberts P.C. Hamowanie embrionalnej ekspresji genów oparte na ASO. // Narod. Biotechnologia. 1999 tom. 17. S. 1184.

14. Eckstein F. Phosphorothioate ODN: jakie jest ich pochodzenie i co jest w nich wyjątkowego? // Nukl antysensowny. Acid Drug Dev. 2000 obj. 10, #2. R. 117.

15. Gaus H.J., Owens S.R., Winniman M., Cooper S., Cummins L.L. Spektrometria masowa z elektrorozpylaniem HPLC on-line tiofosforanowych metabolitów ASO. // Analny. Chem. 1997 tom. 69, nr 3. s. 313.

16. Geary R.S. Aktualna ocena zależności PK/PD dla terapii antysensownych. // Światowy Kongres Farmacji i Nauk Farmaceutycznych, Nicea, Francja, 2002.

17. Geary R.S., Bradley J.D., Watanabe T. i in. Brak interakcji farmakokinetycznych dla ISIS 113715, zmodyfikowanego 2_-O-metoksyetylem antysensownego oligonukleotydu skierowanego do informacyjnego RNA białkowej fosfatazy tyrozynowej 1B z doustnymi związkami przeciwcukrzycowymi metforminą, glipizydem lub rozyglitazonem. // klinika. Farmakokinet. 2006 obj. 45, nr 8. str. 789.

18. Geary R.S., Leeds J.M., Fitchett J. et al. Farmakokinetyka i metabolizm u myszy tiofosforanowego inhibitora antysensownego ASO ekspresji kinazy C-raf-1.// Metab. Dys. 1997 tom. 25, nr 11. R. 1272.

19. Geary R.S., Leeds J.M., Henry S.P., Monteith D.K., Levin A.A. Inhibitory oligonukleotydów antysensownych do leczenia raka: 1. Właściwości farmakokinetyczne ODN tiofosforanowych. // Lek przeciwnowotworowy Des. 1997 tom. 12, nr 5. R. 383.

20. Geary R.S., Leeds J.M., Shanahan W. et al. Niezależna od sekwencji farmakokinetyka w osoczu i tkankach dla 3 antysensownych ASO tiofosforanowych: od myszy do człowieka. // w Amerykańskim Stowarzyszeniu Naukowców Farmaceutycznych, Pharm. Badania, Plenum Press, Seattle, Waszyngton. 1996. R.S.

21. Geary R.S., Teng C.L., Truong L. i in. Ekstrakcja wątrobowa pierwszego przejścia częściowo zmodyfikowanych chimerycznych oligonukleotydów antysensownych u psów rasy Beagle. // w Annual Meeting of the American Association of Pharmaceutical Scientists, Indianapolis, IN, 2000. P. 216.

22. Geary R.S., Ushiro-Watanabe T., Truong L i in. Właściwości farmakokinetyczne zmodyfikowanych 2_-O-(2-metoksyetylo) analogów ASO u szczurów. // J. Pharmacol. Do potęgi. Tam. 2001 tom. 296, nr 3. R. 890.

23. Geary R.S., Yu R.Z., Levin A.A. Farmakokinetyka antysensownych ODN tiofosforanowych. // Aktualn. Opinia. Inwestować. leki. 2001 tom. 2, #4. R. 562.

24. Geary R.S., Yu R.Z., Watanabe T. i in. Farmakokinetyka czynnika martwicy nowotworu alfa tiofosforanowego oligonukleotydów antysensownych modyfikowanych 2-O-(2-metoksyetylem): porównanie między gatunkami. // Metab. Dys. 2003 tom. 31, nr 11. s. 1419.

25. Giacomini K.M., Sugiyama Y. Membrane transporters and drug response, w Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, wyd. 11, wyd. Brunton, L.L., McGraw-Hill, New York, 2006. str. 41.

26. Gleave M., Chi K.N. Stłumienie genu cytoprotekcyjnego, klusteryny, w celu zwiększenia hormonowrażliwości i chemowrażliwości w nowotworach prostaty i innych. // Ann. Akademia Nowego Jorku. nauka. 2005. Vol.1058. P.1.

27. Gleave M., Miyake H. Zastosowanie antysensownych oligonukleotydów ukierunkowanych na gen cytoochronny, klusterynę, w celu zwiększenia wrażliwości na androgen i chemioterapię w raku prostaty. // Świat J. Urol. 23. 2005. Nr 1. str. 38.

28. Glover J.M., Leeds J.M., Mant T.G. i in. Faza I bezpieczeństwa i profil farmakokinetyczny międzykomórkowej cząsteczki adhezyjnej-1 antysensownego ODN (ISIS 2302). // J. Pharmacol. Do potęgi. Tam. 1997 tom. 282, nr 3. R. 1173.

29. Graham MJ, Crooke ST, Monteith D.K. i in. Dystrybucja i metabolizm in vitro ASO tiofosforanowego w wątrobie szczura po podaniu dożylnym. // J. Pharmacol. Do potęgi. Tam. 1998 tom. 286, nr 1. s. 447.

30. Guvakova M.A., Yakubov L.A., Vlodavsky I., Tonkinson J.L., Stein C.A. ODN tiofosforanowe wiążą się z podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów, hamują jego wiązanie z receptorami na powierzchni komórki i usuwają go z miejsc wiązania o niskim powinowactwie na macierzy zewnątrzkomórkowej. // J. Biol. Chem. 1995 tom. 270. P.2620.

31. Henry S.P., Denny K.H., Templin M.V., Yu R.Z., Levin A.A. Wpływ ludzkich i mysich antysensownych oligonukleotydowych inhibitorów ICAM-1 na zdolność rozrodczą, rozwój płodu i rozwój pourodzeniowy myszy. // Wady wrodzone Res. Bodw. reprodukcja. Toksykol. 2004 obj. 71, nr 6. s. 359.

32. Hua X.Y., Moore A., Malkmus S. i in. Hamowanie ekspresji rdzeniowej kinazy białkowej C alfa przez antysensowny oligonukleotyd osłabia tolerancję wywołaną infuzją morfiny. // Neuronauka. 2002 tom. 113, nr 1. str. 99.

33. Jackson J.K., Gleave M.E., Gleave J., Burt H.M. Hamowanie angiogenezy przez antysensowne oligonukleotydy do klusteryny. // Angiogeneza. 2005 tom. 8, nr 3. s. 229.

34. Kastelein J.J.P., Wedel MK, Baker B.F. i in. Silna redukcja apolipoproteiny B i cholesterolu lipoprotein o małej gęstości przez krótkotrwałe podawanie antysensownego inhibitora apolipoproteiny B. // Krążenie. 2006 obj. 114, nr 16. s. 1729.

35. Koziołkiewicz M., Krakowiak A., Kwinkowski M., Boczkowska M., Stec W.J. Stereodyferencja – wpływ chiralności P oligo(nukleozydów tiofosforanowych) na aktywność bakteryjnej RNazy H. // Nucl. Kwasy Res. 1995. Tom 23, nr 24. 5000.

36. Leeds J.M., Geary R.S. Właściwości farmakokinetyczne ASO tiofosforanowych u ludzi, w Antisense Research and Applications, 1 wyd., Crooke, S. T., wyd., Springer, Heidelberg, 1998. str. 217.

37. Leeds J.M., Henry S.P., Geary R.S., Burckin T.A., Levin A.A. Porównanie farmakokinetyki podskórnego i dożylnego podawania oligodeoksynukleotydu tiofosforanowego u małp cynomolgus. // Nukl antysensowny. Acid Drug Dev. 2000. Vol.10, No.6. R. 435.

38. Levin AA Przegląd zagadnień z zakresu farmakokinetyki i toksykologii antysensownych oligonukleotydów tiofosforanowych. // Biochim. Biofizyka. akt. 1999. tom 1489, nr 1. R. 69.

39. Levin AA, Geary R.S., Leeds J.M. i in. Farmakokinetyka i toksyczność ASO tiofosforanowych, w Biotechnology and Safety Assessment, wyd. 2, wyd. Thomas, J.A., Taylor & Francis, Philadelphia, PA, 1998. str. 151.

40. Levin AA, Henry S.P., Bennett C.F. i in. Przedkliniczny rozwój terapii antysensownych, w Novel Therapeutics from Modern Biotechnology: From Laboratory to Human Testing, 1. ed., Oxender D.L. i Post L.E., red., Springer-Verlag, Heidelberg, Niemcy, 1998, s. 131.

41. Levin AA, Henry S.P., Monteith D., Templin M. Toksyczność oligonukleotydów antysensownych. // w Antisense Drug Technology, Crooke, S.T., red., Marcel Dekker, New York, 2001. str. 201.

42. Loke SL, Stein CA, Zhang X.H. i in. Charakterystyka transportu ASO do żywych komórek. //Proc. Natl. Acad. nauka. USA. 1989 obj. 86. S. 3474.

43. Lorenz P., Misteli T., Baker B.F., Bennett C.F., Spector D.L. Transport nukleocytoplazmatyczny: nowa właściwość in vitro antysensownych tiofosforanowych ODN. // Nukl. Kwasy Res. 2000 obj. 28, nr 2. str. 582.

44. Miner P.B., Geary R.S., Matson J. et al. Biodostępność i działanie terapeutyczne alicaforsenu (ISIS 2302) podawano jako wlew retencyjny doodbytniczy pacjentom z aktywnym wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego. // Dolegliwości Pharmacol. Tam. 2006 obj. 23, nr 10. R. 1427.

45. Mou TC, Szary D.M. Wysokie powinowactwo wiązania modyfikowanych tiofosforanami oligomerów z białkiem genu 5 Ff jest moderowane przez dodanie modyfikacji C-5 propynu lub 2_-O-metylu. // Nukl. Kwasy Res. 2002 tom. 30, nr 3. R. 749.

46. ​​​​Nicklin PL, Craig S.J., Phillips J.A. Właściwości farmakokinetyczne tiofosforanów u zwierząt – wchłanianie, dystrybucja, metabolizm i eliminacja, w Antisense Research and Applications, wyd. 1, wyd. Crooke, S. T., Springer, Berlin, 1998. str. 141.

47. Peng B., Andrews J., Nestorov I. et al. Dystrybucja tkankowa i fizjologiczna farmakokinetyka antysensownego tiofosforanu ASO ISIS 1082 u szczura. // Nukl antysensowny. Acid Drug Dev. 2001 tom. 11, #1. Str. 15.

48. Phillips J.A., Craig S.J., Bayley D. i in. Farmakokinetyka, metabolizm i eliminacja 20-merowego tiofosforanowego ODN (CGP 69846A) po podaniu dożylnym i podskórnym. // Biochem. Pharmacol. 1997 tom. 54, nr 6. R. 657.

49. Sawai K., Mahato R.I., Oka Y., Takakura Y., Hashida M. Disposition of ASOs w izolowanej perfundowanej nerce szczura: zaangażowanie receptorów zmiataczy w ich wychwyt przez nerki. // J. Pharmacol. Do potęgi. Tam. 1996 tom. 279, nr 1. s. 284.

50. Sewell L.K., Geary R.S., Baker B.F. i in. Faza I próby ISIS 104838, zmodyfikowanego 2_-metoksyetylem oligonukleotydu antysensownego skierowanego na czynnik martwicy nowotworu alfa. // J. Pharmacol. Do potęgi. Tam. 2002 tom. 303, nr 3. R. 1334.

51 Slim G., Chód M.J. Konfiguracyjnie zdefiniowane oligorybonukleotydy zawierające tiofosforany w badaniach mechanizmu rozszczepiania rybozymów typu hammerhead. // Nukl. Kwasy Res. 1991 tom. 19, nr 6. R. 1183.

52. Snyder R.M., Mirabelli C.K., Crooke S.T. Asocjacja komórkowa, dystrybucja wewnątrzkomórkowa i wypływ auranofiny poprzez sekwencyjne reakcje wymiany ligandów. // Biochem. Pharmacol. 1986 tom. 35, nr 6. s. 923.

53. Soucy N.V., Riley J.P., Templin M.V. i in. Dystrybucja ASO tiofosforanu u matki i płodu u szczurów po infuzji dożylnej. // Wady wrodzone Res. Bodw. reprodukcja. Toksykol. 2006 obj. 77, nr 1. s. 22.

54. Spitzer S., Eckstein F. Hamowanie deoksyrybonukleaz przez grupy tiofosforanowe w oligodeoksyrybonukleotydach. // Nukl. Kwasy Res. 1988 tom. 16, #24. R. 11691.

55. Stavchansky S., Geary R.S., Cho M. Farmakokinetyka i efekt pierwszego przejścia wątrobowego oligonukleotydu antysensownego (ISIS 2302) u szczurów. // w Annual Meeting of the American Association of Pharmaceutical Scientists, Indianapolis, IN, 2000. P. 216.

56. Templin M.V., Levin AA, Graham M.J. i in. Profil farmakokinetyczny i toksyczny ASO tiofosforanowego po podaniu wziewnym do płuc u myszy. // Nukl antysensowny. Acid Drug Dev. 2000 obj. 10, nr 5. R. 359.

57. Teplova M., Minasov G., Tereshko V. et al. Struktura krystaliczna i ulepszone właściwości antysensowne 2_-O-(2-metoksyetylo)-RNA. // Narod. Struktura. Biol. 1999. tom 6, nr 6. R.535.

58. Villalona-Calero M.A., Ritch P., Figueroa J.A. i in. Badanie I/II fazy LY900003, antysensownego inhibitora kinazy białkowej C-alfa, w połączeniu z cisplatyną i gemcytabiną u pacjentów z zaawansowanym niedrobnokomórkowym rakiem płuca. // klinika. Cancer Res. 2004 obj. 10, nr 18 Pt 1. P. 6086.

59. Watanabe T.A., Geary R.S., Levin A.A. Wiązanie białka osocza przez antysensowny oligonukleotyd ukierunkowany na ludzki ICAM-1 (ISIS 2302). // ASO. 2006 obj. 16, nr 2. str. 169.

60. White A.P., Reeves K.K., Snyder E. et al. Hydratacja jednoniciowych fosfodiestrów i tiofosforanowych oligodeoksyrybonukleotydów. // Nukl. Kwasy Res. 1996 tom. 24, nr 16. R. 3261.

61. Wilson D.M. Po trzecie, aktywność endonukleazy bezzasadowej Ape1 jest regulowana przez stężenia magnezu i potasu i jest odporna na alternatywne struktury DNA. // J. Mol. Biol. 2005 tom. 345, nr 5. s. 1003.

62. Yu D., Kandimalla E.R., Roskey A. i in. ODN tiofosforanowe wzbogacone stereo: synteza, właściwości biofizyczne i biologiczne. // Bioorg. Med. Chem. 2000. Tom 8, nr 1. R. 275.

63. Yu R.Z., Baer B., Chappel A. i in. Opracowanie ultraczułego niekonkurencyjnego testu immunosorpcyjnego związanego z hybrydyzacją i ligacją do oznaczania tiofosforanowego ODN w osoczu. // Analny. Biochem. 2002 tom. 304, nr 1. s. 19.

64. Yu R.Z., Geary R.S., Leeds J.M. i in. Porównanie farmakokinetyki i rozmieszczenia tkanek antysensownego tiofosforanowego ASO ukierunkowanego na ludzkie mRNA Haras u myszy i małpy. // J. Pharm. nauka. 2001 tom. 90, nr 2. str. 182.

65. Yu R.Z., Geary R.S., Levin A.A. Zastosowanie nowych ilościowych metod bioanalitycznych do oceny farmakokinetycznej i farmakokinetycznej/farmakodynamicznej oligonukleotydów antysensownych. // Aktualn. Opinia. dyski leków. dev. 2004 obj. 7, #2. R. 195.

66. Yu R.Z., Kim T.W., Hong A. i in. Porównanie farmakokinetyki międzygatunkowej antysensownego oligonukleotydu ISIS 301012 drugiej generacji u myszy i człowieka, skierowanego na ludzką apolipoproteinę B-100. // Metab. Dys. 2007 obj. 35. S. 460.

67. Yu R.Z., Zhang H., Geary R.S. i in. Farmakokinetyka i farmakodynamika antysensownego tiofosforanowego ASO ukierunkowanego na mRNA Fas u myszy. // J. Pharmacol. Do potęgi. Tam. 2001 tom. 296, nr 2. s. 388.

68. Zinker BA, Rondinone CM, Trevillyan J.M. i in. Antysensowny oligonukleotyd PTP1B obniża poziom białka PTP1B, normalizuje poziom glukozy we krwi i poprawia wrażliwość na insulinę u myszy z cukrzycą. //Proc. Natl. Acad. nauka. USA. 2002 tom. 99, #17. s. 1137.

5507 0

Można to osiągnąć na kilka sposobów: hybrydyzacja odpowiedniego oligonukleotydu z określonym genem lub mRNA, zablokowanie czynnika transkrypcji białka, zmniejszenie ilości mRNA w wyniku cięcia przez enzymy RNA itp. Rozważ zasady niektórych z nich.

Rybooligonukleotyd, który wiąże się ze specyficznym mRNA i tym samym hamuje translację kodowanego przez siebie białka, nazywany jest „antysensownym” mRNA. Mechanizm ten jest wykorzystywany przez niektóre bakterie do regulacji genów (ryc. 3.20). W praktyce stosuje się sztucznie zaprojektowane geny, w których wstawka DNA jest w takiej orientacji, że ich transkrypty są antysensowne w stosunku do docelowego mRNA (ryc. 3.21).

Ryż. 3.20. Regulacja genu bakterioferrytyny (bfr) przez antysensowne RNA

Ryż. 3.21. Hamowanie translacji mRNA przez syntetyczny antysensowny oligonukleotyd

Wykazano, że można zastosować syntetyczne oligonukleotydy antysensowne, jednak ich efekt terapeutyczny będzie silnie zależał od ich odporności na działanie nukleaz komórkowych, systemu dostarczania i specyficzności ich hybrydyzacji. Aby określić najskuteczniejsze miejsca docelowe na określonym mRNA, zestaw antysensownych oligonukleotydów o długości 15-20 zasad jest testowany z hodowlą komórek syntetyzujących docelowy mRNA. Skład syntetyzowanych białek jest określany przez elektroforezę i ustala się, które wprowadzenie oligonukleotydów prowadzi do zmniejszenia syntezy białka docelowego.

Aby chronić przed nukleazą, syntetyzuje się zmodyfikowane oligonukleotydy, nie tracąc zdolności do hybrydyzacji. Na ryc. 3.22 pokazuje struktury zmodyfikowanych nukleotydów, których skuteczność jest intensywnie badana. Na przykład wykazano, że oligonukleotydy z zastąpieniem wolnego tlenu w wiązaniu fosfodiestrowym siarką (struktura b) skutecznie hybrydyzują z komplementarnym docelowym RNA, a powstałe dupleksy RNA-DNA aktywują wewnątrzkomórkową rybonukleazę H.

Ten endogenny enzym hydrolizuje sekwencję RNA w takich hybrydach. Z takimi oligonukleotydami przeprowadzono już obiecujące badania kliniczne, w których celami były RNA cytomegalowirusa, HIV oraz niektóre RNA odpowiedzialne za rozwój raka.

Ryż. 3.22. Modyfikacje oligonukleotydów: a - normalne wiązanie fosfodiestrowe; b - wiązanie tiofosforanowe; c - wiązanie fosfamidowe; d - 2"-0-metyloryboza; e - C-5-propynylocytozyna

W celu skutecznego dostarczania antysensownych oligonukleotydów są one często pakowane do liposomów, które z kolei są modyfikowane specyficznymi ligandami zapewniającymi ukierunkowane dostarczanie (znaliśmy już tę technikę, gdy rozważaliśmy metody niewirusowego dostarczania genów terapeutycznych). Do chwili obecnej przeprowadzono szereg testów i wykazano, że wysoka skuteczność terapeutyczna antysensownych oligonukleotydów hamuje niepożądaną proliferację komórek mięśni gładkich (powikłania po angioplastyce, pomostowaniu aortalno-wieńcowym, miażdżycy) w leczeniu infekcji wirusowych i malarii .

Zasadę działania i strukturę rybozymów - naturalnego RNA o aktywności nukleazy pokazano na ryc. 3.23.
Stwierdzono, że te krótkoniciowe RNA są zdolne do skutecznego tłumienia ekspresji genów wirusowych, onkogenów, czynników wzrostu i innych terapeutycznie ważnych genów poprzez cięcie ich mRNA. Modyfikując sekwencję wiążącą substrat, możliwe jest otrzymanie rybozymów specyficznych dla określonego mRNA. Rybozymy można syntetyzować bezpośrednio w komórce przez transkrypcję syntetycznego oligodeoksyrybonukleotydu kodującego domenę katalityczną i flankujących ją regionów hybrydyzujących.

Ryż. 3.23. Cięcie mRNA przez rybozymy. Strzałka pokazuje miejsce rozszczepienia.

Taki oligonukleotyd jest wstawiany do eukariotycznego wektora ekspresyjnego i umieszczany w komórce. Powstały RNA spontanicznie nabiera aktywnej konformacji, tzw. kształtu młotka. Zsyntetyzowano chemicznie wiele rybozymów o różnej budowie i aktywności. Na przykład w laboratorium kwasów nukleinowych Instytutu Biologii Chemicznej i Medycyny Doświadczalnej Syberyjskiego Oddziału Rosyjskiej Akademii Nauk (Nowosybirsk) prowadzone są wieloletnie badania nad otrzymaniem rybozymów syntetycznych o zwiększonej aktywności i stabilności.

Aby zwiększyć ochronę przed przedwczesnym rozszczepieniem przez wewnątrzkomórkowe nukleazy, otrzymuje się różne pochodne rybozymów - z metylowanymi grupami 2"-hydroksylowymi (patrz ryc. 3.22, d), struktury binarne itp. Struktura cząsteczki rybozymu znacząco wpływa na jego skuteczność. 3.24 przedstawia kinetykę cięcia mRNA mdr1 za pomocą zsyntetyzowanych rybozymów o różnych strukturach.

Ryż. 3.24. Rozszczepienie 190-pz 5'-końcowego fragmentu mRNA MDR1 zmodyfikowanymi binarnymi (1,3) i pełnej długości (2,4) rybozymami: a - struktura RNA z wyizolowanym miejscem specyficznym, b - akumulacja produktów rozszczepienia ( materiały dostarczone przez A.G. Venyaminova, IBKhiFM, Nowosybirsk)

Szczególne miejsce w terapii molekularnej zajmują tzw. metody aktywacji proleku. Na przykład jedną z metod terapii genowej raka jest niszczenie komórek nowotworowych za pomocą aktywowanej pochodnej gancyklowiru (GCV, pochodna guanozyny), produktu genu kinazy tymidynowej, ze wspomnianego już wirusa opryszczki pospolitej HSVtk.

Komórki nowotworowe transfekuje się in vivo genem HSVtk pod aktywnym promotorem i po kilku dniach podaje się gancyklowir, który jest fosforylowany przez wirusową kinazę tymidynową do monofosforanu, a następnie przez kinazy komórek gospodarza do trifosforanu. Ta pochodna hamuje polimerazę DNA i zatrzymuje syntezę DNA, co prowadzi do śmierci proliferujących komórek. Poprzez kontakty międzykomórkowe trifosforan gancyklowiru przenika do sąsiednich niezmodyfikowanych komórek i w ten sposób niszczy dodatkowe dziesięć komórek nowotworowych.

Gen prowadzący do śmierci własnej komórki nazywany jest genem „samobójstwa” (w naszym przypadku jest to gen kinazy tymidynowej), a termin „prolek” odnosi się do nieaktywnej postaci leku (w tym przypadku jest to gancyklowir). Podejście to zastosowano do stworzenia innych wariantów kombinacji aktywator genowy-prolek, ale skuteczność systemu GCV-HSVtk została już udowodniona w wielu badaniach przedklinicznych.

Terapia genowa to nowa dyscyplina medyczna, której powstawanie dzieje się na naszych oczach. Pomimo pewnych sukcesów i obiecujących perspektyw, wciąż pozostaje wiele wyzwań do przezwyciężenia.

Niektóre problemy leżą daleko poza medycyną i biologią molekularną. To są kwestie etyczne i polityczne. Jak już zauważyłeś, rozważaliśmy metody terapii genetycznej tylko dla komórek somatycznych. Oznacza to, że dokonywane korekty są ograniczone do określonego narządu lub tkanki, „poprawione” geny nie zostaną przekazane następnemu pokoleniu. Zmiany w genotypie komórek rozrodczych (plemniki lub jajeczka) lub zapłodnionych komórek muszą być przekazywane z pokolenia na pokolenie.

Obecnie terapia genowa komórek somatycznych jest klasyfikowana jako standardowa metoda interwencji medycznej. Natomiast terapia genowa komórek zarodkowych jest technologicznie znacznie bardziej złożona, problematyczna i nieprzewidywalna. Dlatego eksperymenty w tej dziedzinie są zabronione w wielu krajach.

Pod koniec lat 80-tych. W Stanach Zjednoczonych ustanowiono przepisy regulujące badania nad terapią genetyczną komórek somatycznych. Gwarantują bezstronny i reprezentatywny dobór pacjentów i ich świadomość (jak niebezpieczne jest leczenie, jakie jest prawdopodobieństwo jego powodzenia itp.), poufność informacji o pacjentach i przeprowadzonych badaniach, właściwe wykonanie wszelkich manipulacji bez powodowania szkody, zarówno dla konkretnych pacjentów, jak i ogólnie dla populacji ludzkiej.

Ponieważ leczenie komórek somatycznych prowadzi do poprawy stanu i znacznego wydłużenia życia pacjentów z chorobami genetycznymi, ale „ulepszony” gen nie jest dziedziczony, uważa się, że doprowadzi to do kumulacji chorób genetycznych w populacja ludzka. Jednak zgodnie z genetyką populacyjną potrzeba tysięcy lat na znaczny wzrost częstości występowania szkodliwego genu w wyniku skutecznego leczenia.

NA. Wojnow, T.G. Wołowa

nukleotydy- Estry fosforowe nukleozydów, fosforany nukleozydów. Wolne nukleotydy, w szczególności ATP, cAMP, ADP, odgrywają ważną rolę w energetycznych i informacyjnych procesach wewnątrzkomórkowych, a także są składnikami kwasów nukleinowych i wielu koenzymów.

Nazywa się związki składające się z dwóch cząsteczek nukleotydów dinukleotydy, z trzech trinukleotydy, od małej liczby - oligonukleotydy i spośród wielu polinukleotydy lub kwasy nukleinowe.

morfolino(Język angielski) Morfolino) to syntetyczne oligonukleotydy stosowane w biologii molekularnej do zmiany ekspresji genów. Antysensowne oligomeryczne morfoliny są stosowane do blokowania dostępu innych cząsteczek do określonych sekwencji kwasu nukleinowego. Oligonukleotydy morfolinowe blokują małe jednoniciowe regiony (około 25 nukleotydów) na powierzchni cząsteczek RNA.

Oligonukleotydy antysensowne to długie sekwencje nukleotydów DNA w chromosomach. Jeśli gen ma ulec ekspresji, wówczas rozpoczyna się proces transkrypcji tego genu, w wyniku którego syntetyzuje się mRNA.

Efekt terapeutyczny syntetycznych antysensownych oligonukleotydów zależy od swoistości ich hybrydyzacji z dostępnym miejscem docelowego mRNA, odporności na działanie nukleaz komórkowych oraz obecności systemu dostarczania do komórki.

Jak dotąd najskuteczniejsze celowane wyłączenie aktywności pewnych regionów genomu jest realizowane przez antysensowne oligonukleotydy (AON). Strategia stosowania AON opiera się na interakcji Watsona-Cricka cząsteczek DNA z docelowym mRNA. Powstawanie heterodupleksu DNA-mRNA prowadzi do inaktywacji M-RNA, a następnie zaprzestania syntezy białek.

Innymi słowy, mechanizm antysensowny odnosi się do wiązania oligonukleotydu z miejscem komplementarnym docelowego RNA i tłumienia wewnątrzkomórkowej funkcji tego RNA.

Jednak ten prosty i atrakcyjny model teoretyczny okazał się w rzeczywistości znacznie bardziej skomplikowany. Znane są trzy typy cząsteczek antysensownych: stosunkowo krótkie syntetyczne oligonukleotydy; antysensowny RNA, ulegający ekspresji w komórce po transfekcji antysensownym genem rybozymu, wykazujący aktywność katalityczną.

Tworzenie leków opartych na antysensownych oligonukleotydach to jeden z najnowszych kierunków rozwoju leków. Technologia ta daje badaczowi możliwość bezpośredniego oddziaływania na niemal każdy proces w komórce z najwyższą specyficznością. Jeśli dane białko promuje wzrost komórki rakowej, to stosując odpowiedni oligonukleotyd antysensowny można mieć pewność, że białko to nigdy nie zostanie ponownie zsyntetyzowane w komórce. Oligonukleotydy antysensowne są tak specyficzne, że praktycznie nie można wpływać na jakiekolwiek inne białko w komórce. Ta specyficzność zmniejszy skutki uboczne często obserwowane w przypadku konwencjonalnych metod leczenia raka.

Mechanizm inaktywacji nadal nie jest do końca jasny. Ale być może wynika to z faktu, że dwuniciowy RNA jest nietypowy dla normalnych komórek. Ponieważ sygnałem do syntezy każdego białka jest pojedynczy mRNA, taki sygnał dla konkretnego białka można wyłączyć lub „znokautować” przy użyciu takiej komplementarnej sekwencji.

Rys.4 Mechanizm działania antysensownego oligonukleotydu

Ważnym problemem leczenia lekami opartymi na antysensownych oligonukleotydach jest niszczenie takich leków przez enzymy komórkowe - nukleazy. Oligodeoksonukleotydy są degradowane przez nukleazy, dlatego bardzo ważne jest, aby chronić je przed działaniem tych ostatnich, aby nie utraciły zdolności do hybrydyzacji z celem. W tym celu przeprowadza się elektroforetyczny rozdział białek komórkowych, do którego podczas translacji włączany jest znacznik radioaktywny, a za pomocą radioautografii określa się, w obecności którego z „antysensownych” oligonukleotydów synteza danego białka jest zmniejszona. Nie ma ogólnych kryteriów wyboru najlepszych miejsc docelowych w różnych transkryptach RNA. Skuteczne mogą być oligonukleotydy, które są komplementarne do 5'- lub 3'-konp mRNA, granic egzonów i intronów, a nawet regiony dwuniciowe. Oligodeoksynukleotydy są degradowane przez wewnątrzkomórkowe nukleazy, dlatego ważne jest, aby chronić je przed działaniem tych ostatnich, aby nie utraciły zdolności do hybrydyzacji z celem. W tym celu można w pewien sposób modyfikować zasady pirymidynowe i dezoksyrybozę.

Tak więc, w obecnie najszerzej stosowanych oligonukleotydach „antysensownych”, wolny atom tlenu w wiązaniu fosfodiestrowym jest zastąpiony grupą sulfo, co skutkuje utworzeniem wiązania tiofosforanowego. Zmodyfikowane w ten sposób oligonukleotydy rozpuszczają się w wodzie, niosą ładunek ujemny i nie są rozcinane przez endonukleazy. Po hybrydyzacji z miejscem docelowym tworzą dupleksy RNA-DNA, które aktywują rybonukleazę (RNazę) H, endogenny enzym, który tnie mRNA w cząsteczce hybrydowej. Przeprowadzono pierwsze próby kliniczne takich oligonukleotydów, leków pierwszej generacji. Celem jest RNA cytomegalowirusa, ludzkiego wirusa niedoboru odporności, a także mRNA genów odpowiedzialnych za rozwój nowotworów, chorób jelit i innych chorób.

Zsyntetyzowane „antysensowne” oligonukleotydy z wiązaniami amidofosforynowymi i poliamidowymi (peptydowymi). Takie cząsteczki są bardzo odporne na działanie nukleaz. Grupy chemiczne przyłączone do atomu węgla 2' reszty cukrowej i atomu C-5 pirymidyn również chronią oligonukleotydy antysensowne i ułatwiają ich wiązanie z miejscem docelowym. ). Wszystkie zalety tych i innych modyfikacji są obecnie intensywnie badane.