Pierwsza część (do niebieskiej linii) to wprowadzenie do terapii genowej, w zasadzie po to, aby lepiej zrozumieć same metody i tylko trochę, aby nie dać się złapać nauczycielowi. Jeśli nie masz czasu i potrzebujesz SZCZEGÓLNYCH materiałów na ten temat, przewiń w prawo obok niebieskiej linii.

Terapia genowa pierwotnie miała na celu leczenie jednogenowych chorób dziedzicznych, ale potem jej zakres się poszerzył i stała się potencjalnie uniwersalnym podejściem do leczenia całego spektrum chorób, w tym również chorób zakaźnych, nowotworów, miażdżycy, cukrzycy i kilka innych.

„Leczenie genowe”- korekta defektu w genie (choroby monogenowe) - na poziomie komórek somatycznych i zarodkowych - wymiana zmutowanego genu na prawidłowy.

„Uzdrowienie genów”- korekta wady poprzez wprowadzenie pełnoprawnego genu roboczego (cDNA).

Najpierw trochę ogólnej teorii:

Krytycznym warunkiem skutecznej terapii genowej jest zapewnienie efektywnej dostawy, tj. transfekcja (w najszerszym znaczeniu) lub transdukcja (przy użyciu wektorów wirusowych) obcego genu do komórek docelowych, zapewniając jego długotrwałe funkcjonowanie w tych komórkach i stwarzając warunki do pełnego działania genu (jego ekspresji).

Strategie korekcji wad genetycznych:

Według typu systemu wektorów:

Wirusowy

Korzyści z wektorów wirusowych: transdukcja dużej liczby komórek; tropizm; odporność na degradację lizosomalną.

Wady wektorów wirusowych: immunogenność (ze skutkiem śmiertelnym - adeno- i herpeswirusy); potencjalne działanie rakotwórcze (retrowirusy).

Niewirusowy

Bezpośrednie wstrzyknięcie do komórki, tkanki, narządu (inaczej mikroiniekcja);

Lipofection (za pomocą różnych zmodyfikowanych liposomów (pęcherzyków lipidowych z DNA w środku);

· Elektroporacja;

· Jako część plazmidu;

Skomplikowany DNA (plazmidowy DNA połączony z solami, białkami itp.);

· Działo genowe (DNA przyczepia się do cząsteczek złota wystrzeliwanych w tkankę pacjenta);

Endocytozy za pośrednictwem receptora.

Korzyści z dostarczania niewirusowego: względne bezpieczeństwo; brak odpowiedzi immunologicznej; łatwość użycia.

Wady dostarczania niewirusowego: niska wydajność transfekcji; niski poziom ekspresji.

Teoretycznie najbardziej radykalnym i skutecznym sposobem jest zastąpienie wadliwego genu w komórkach zarodkowych (płodowa terapia genowa), ale istnieją problemy natury etycznej. Obecnie wszystkie podejścia do terapii genowej opierają się na terapii genowej na poziomie komórek somatycznych.

Zgodnie z mechanizmem działania wstawionego genu lub przeniesionej cząsteczki DNA, terapię genową dzieli się na pozytywną (przywrócenie funkcji genu (poprzez przywrócenie jego pracy lub wprowadzenie nowej kopii roboczej) lub negatywną – zahamowanie funkcja genu). Dodatkowo istnieje podejście mające na celu wzmocnienie odpowiedzi immunologicznej, które jest stosowane głównie w terapii genowej raka (więcej na ten temat poniżej).

Ponadto, nowe informacje genowe mogą być wprowadzane do organizmu ludzkiego jako część jego własnych, wstępnie przekształconych komórek in vitro. podejście ex vivo. Podejście, w którym informacja genowa jest wprowadzana bezpośrednio do komórek żywej osoby, nazywa się (nagle) in vivo, lokalne wprowadzanie do pewnych określonych obszarów nazywa się in situ. W tej chwili istnieją udane precedensy dotyczące wprowadzania informacji o genach in utero (do zarodka), w Wielkiej Brytanii ostatnio uratowano dziecko przed chorobą mitochondrialną.

Dodatkowe podejścia do terapii genowej:

· Antysensowny DNA, RNA (+): specyficzność, może być stosowany w dowolnym wektorze, nieimmunogenny; (-): szybka degradacja w komórce);

Rybozymy (+): posiadają właściwości enzymów - nie są konsumowane, są zdolne do katalizowania docelowego cięcia, w przeciwieństwie do białek nie są immunogenne, indukują syntezę interferonu; (-): szybka degradacja;

transdominujące białka ujemne;

Przeciwciała jednołańcuchowe

· Geny samobójcze (zamiast „leczenia” komórki, można ją po prostu zabić, stosuje się ją w systemach przeciwnowotworowych (więcej szczegółów poniżej);

Wprowadzenie limfocytów specyficznych dla antygenu;

Chimeroplastyka (hybrydy DNA/RNA o strukturze spinki do włosów, które wytwarzają homologiczną rekombinację w jądrze);

Oto tylko przykłady metod terapii genowej, patrz opisy chorób w poprzednich numerowanych biletach.

Choroby monogenowe:

Niedobór deaminazy adenozynowej(Syndrom ADA) jest pierwszym stosunkowo udanym przykładem zastosowania terapii genowej. Przeprowadzono ją 14 września 1990 r. Ta data jest uważana za dzień urodzin prawdziwej terapii genowej.

Za pomocą leukoforezy wyizolowano komórki jednojądrzaste z krwi obwodowej, a następnie hodowano je w warunkach proliferacji limfocytów T. Następnie do komórek proliferujących in vitro wprowadzono wektor retrowirusowy zawierający normalny gen ADA. Kilka dni później transdukowane komórki krwi zostały wstrzyknięte pacjentowi z powrotem. Proces powtarzano 7 razy w ciągu 10 miesięcy. Efekt był pozytywny, ¼ limfocytów w organizmie otrzymała działający gen. Co 3-5 miesięcy powtarzano wprowadzanie zmodyfikowanych komórek. Obecnie rozwijana jest terapia genowa tej choroby w kierunku wykorzystania komórek macierzystych pacjenta. Spowoduje to znaczne zmniejszenie liczby iniekcji zmodyfikowanych komórek ze względu na ich wielokrotne podziały już w samym organizmie, a po osiągnięciu selektywnej i ilościowej przewagi zmodyfikowanych komórek macierzystych nad natywnymi wytworzy wystarczający poziom enzymu w organizmie.

Dziedziczna hipercholesterolemia - Wiadomo, że niedzielące się hepatocyty nie mogą być zakażone retrowirusami. Po hepatektomii hepatocyty zaczynają się namnażać i nabywają zdolność do zarażania się retrowirusami. Gen cDNA dla prawidłowego receptora LDL-R wprowadzono do hepatocytów uzyskanych z wątroby pacjenta przy użyciu wektora retrowirusowego. Po reinfuzji rekombinowanych hepatocytów przez żyłę wrotną do wątroby zaobserwowano spadek poziomu lipoprotein o niskiej gęstości we krwi (w szczególności cholesterolu) oraz stosunek lipoprotein o niskiej gęstości do lipoprotein o wysokiej gęstości. Oznacza to, że wprowadzone komórki funkcjonowały in vivo oraz internalizowały i wymieniały cholesterol.

Hemofilia B - Udane próby zostały przeprowadzone na psach przy użyciu strategii ex vivo z:
dostarczenie do hepatocytów cDNA kodującego czynnik IX. Udało się uzyskać syntezę czynnika IX w ilościach stanowiących 0,1% normalnej ilości czynnika IX w osoczu krwi. W próbie zwiększenia stężenia czynnika IX zastosowano wektory adenowirusowe, ale efekt był krótkotrwały. Krew zwierząt uległa koagulacji, ale efekt zniknął całkowicie po 2 miesiącach (typowy niedobór wektorów adenowirusowych).

Hemofilia A - Istnieją doniesienia o udanym wprowadzeniu skróconego genu czynnika VIII do myszy jako części wektora retrowirusowego. W rezultacie osiągany jest terapeutyczny poziom czynnika we krwi.

Mukowiscydoza - Wykazano, że zastąpienie 6-10% komórek nabłonka płuc komórkami transfekowanymi przywróci prawidłowe funkcje transportowe kanałów przezbłonowych zapewniających transport jonów chlorkowych. Retrowirusy nie są odpowiednie, ponieważ nie infekują niedzielących się komórek, adenowirusy są odpowiednie z zastrzeżeniami, ponieważ w doświadczeniach na myszach wywoływały reakcje zapalne. Problem dodatkowo tkwi w barierze glikokaliksu na powierzchni komórki. Jednym ze sposobów rozwiązania tego problemu jest modyfikacja wektora, który zawiera specyficzny ligand receptora na powierzchni komórek nabłonka płuc. Oddziaływanie liganda z receptorem zwykle powoduje internalizację wektora wraz z receptorem do komórki. Jako taki receptor wybrano transbłonowy receptor P2Y2-R. Receptor ten bierze udział w wyzwalaniu kaskady odpowiedzi zapalnych w jamie płucnej. Jako ligand zastosowano albo przeciwciała monoklonalne przeciwko temu receptorowi, albo naturalny ligand, biotynęUTP.

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a - Choroba zaczyna manifestować się już w dzieciństwie, a jednocześnie należy prowadzić terapię genową. Najbardziej obiecujące jest zastosowanie wektorów adenowirusowych. Ze względu na dużą długość genu naukowcy wykorzystują skrócone, ale funkcjonalne kopie białka. Eksperymenty na mysich modelach z wadliwym genem dystrofiny wykazały, że 5 do 50% komórek mięśniowych wyraża skrócone białko dystrofiny. To wystarczyło, aby zminimalizować degenerację mięśni. Istnieją dane dotyczące prób klinicznych konstruktu genetycznego zawierającego gen dystrofiny do leczenia pacjentów z dystrofią mięśniową Duchenne'a. Chore dzieci, po wstrzyknięciu do mięśni tego projektu, nabyły zdolność poruszania się. Jednak efekt był krótkotrwały.

Choroby wieloczynnikowe na przykładzie chorób onkologicznych:

Rak jest zwykle wynikiem wieloetapowych zmian komórkowych. Złożoność związana z zaangażowaniem wielu genów i ich produktów w proces nowotworowy wzbudziła wątpliwości co do skuteczności terapii genowej w przypadku raka. Istnieje jednak wiele eksperymentów pokazujących, że kompensacja pojedynczego genu supresorowego może prowadzić do tłumienia właściwości komórek nowotworowych.

Immunoterapia raka:

Zastosowanie konstruktów terapii genowej stymulujących immunologiczną (głównie komórkową) odpowiedź przeciwnowotworową. Do tworzenia konstruktów genowych wykorzystuje się geny: Antygeny (na które działa układ odpornościowy); kompleks MHCI (główny kompleks zgodności tkankowej); współczynnik B7; Cytokiny; Receptory komórek T. Tłumienie rozwoju nowotworu można osiągnąć poprzez klonowanie genów cytokin: interleukin IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, a także czynnika martwicy nowotworu-α (TNF-α), interferonów (INF-α, INF-ϒ)

Tłumienie wzrostu komórek nowotworowych poprzez wprowadzenie do nich genów, których produkty hamują rozwój nowotworu:

Geny supresorowe nowotworu (RB, P53, mdm2, Cip 1, P16, Cyklina D)

geny samobójcze

inhibitory onkogenów.

Czynniki antyangiogenezy

inhibitory cykliny

Geny zwiększające wrażliwość komórek nowotworowych na związki lecznicze

Geny transportujące leki (wprowadzenie np. do komórek szpiku kostnego)

Ogromne znaczenie w supresji onkogenów ma gen p53 (odpowiedzialny za apoptozę i jest w stanie zatrzymać cykl komórkowy, zapobiegając niekontrolowanemu podziałowi), więc jego mutacja prawie zawsze prowadzi do złośliwej transformacji komórki. Wektory adenowirusowe służą do wprowadzenia do organizmu roboczej kopii genu p53. Po rozpoczęciu ekspresji genu p53 w jądrze komórki rakowej indukuje jej apoptozę.

Innym podejściem jest tłumienie onkogenów. Mutacja w genie RAS może prowadzić do konstytutywnego działania układu sygnalizacyjnego wyzwalającego podział (kaskada kinazy MAP, pamiętaj Nikolaichik J). Aby zablokować ten gen, można 1) zahamować ekspresję RAS przez wprowadzenie nienaruszonego genu; 2) hamowanie RAS przez rybozymy; 3) hamowanie podstawowych genów w szlaku sygnalizacyjnym; 4) zapobieganie wbudowywaniu białka RAS do błony.

Wykorzystanie wirusów onkolitycznych. Onkoliza wirusowa to całkowicie nowe podejście do leczenia raka, oparte na naturalnej zdolności wirusów do zabijania (lizy) komórek, w których się namnażają. W tym celu stosuje się reowirusy, poliowirusy, echowirusy i wirusy Coxsackie + niektóre zmodyfikowane adenowirusy, które głównie namnażają się w komórkach nowotworowych i prowadzą je do apoptozy. REOLYSIN, produkowany przez Oncolytic Biotech, jest obecnie w fazie badań klinicznych. Adenowirusy, w których dochodzi do ekspresji białek antyangiogennych, są uważane za bardzo obiecujące.

Wstęp

Z roku na rok w czasopismach naukowych pojawia się coraz więcej artykułów o medycznych badaniach klinicznych, w których w taki czy inny sposób zastosowano leczenie oparte na wprowadzaniu różnych genów – terapię genową. Ten kierunek wyrósł z tak rozwiniętych gałęzi biologii, jak genetyka molekularna i biotechnologia.

Często, gdy wypróbowano już konwencjonalne (konserwatywne) metody, to właśnie terapia genowa może pomóc pacjentom przetrwać, a nawet w pełni wyzdrowieć. Dotyczy to na przykład dziedzicznych chorób monogenowych, czyli spowodowanych defektem jednego genu, a także wielu innych. Lub, na przykład, terapia genowa może pomóc i uratować kończynę dla tych pacjentów, którzy zwężają światło naczyń kończyn dolnych, w wyniku czego rozwinęło się uporczywe niedokrwienie otaczających tkanek, to znaczy te tkanki doświadczają poważny brak składników odżywczych i tlenu, które normalnie są przenoszone przez krew przez organizm. Często niemożliwe jest leczenie takich pacjentów manipulacjami chirurgicznymi i lekami, ale jeśli komórki są lokalnie zmuszone do wyrzucania większej liczby czynników białkowych, które wpłynęłyby na proces tworzenia i kiełkowania nowych naczyń, wówczas niedokrwienie stałoby się znacznie mniej wyraźne i stałoby się znacznie łatwiej żyć pacjentom.

Terapia genowa dziś można zdefiniować jako leczenie chorób poprzez wprowadzanie genów do komórek pacjentów w celu ukierunkowania na defekty genów lub nadanie komórkom nowych funkcji. Pierwsze próby kliniczne metod terapii genowej podjęto dopiero 22 maja 1989 w celu zdiagnozowania raka. Pierwszą dziedziczną chorobą, w przypadku której zastosowano metody terapii genowej, był dziedziczny niedobór odporności.

Z roku na rok rośnie liczba pomyślnie przeprowadzonych badań klinicznych dotyczących leczenia różnych chorób z wykorzystaniem terapii genowej i do stycznia 2014 roku osiągnęła 2 tys.

Jednocześnie we współczesnych badaniach nad terapią genową należy wziąć pod uwagę, że konsekwencje manipulacji genami lub „przetasowanego” (rekombinowanego) DNA in vivo(łac. dosłownie „żywy”) nie zostały wystarczająco zbadane. W krajach o najbardziej zaawansowanym poziomie badań w tym zakresie, zwłaszcza w Stanach Zjednoczonych, protokoły medyczne wykorzystujące sekwencje sensownego DNA podlegają obowiązkowemu badaniu w odpowiednich komisjach i komisjach. W Stanach Zjednoczonych są to Komitet Doradczy ds. Rekombinacji DNA (RAC) oraz Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) z obowiązkowym zatwierdzeniem projektu przez dyrektora National Institutes of Health (National Institutes of Health).

Uznaliśmy więc, że to leczenie polega na tym, że jeśli w niektórych tkankach organizmu brakuje niektórych indywidualnych czynników białkowych, to można to skorygować wprowadzając do tych tkanek odpowiednie geny kodujące białka i wszystko będzie mniej lub bardziej cudowne . Samych białek nie da się wstrzyknąć, ponieważ nasz organizm natychmiast zareaguje niesłabą odpowiedzią immunologiczną, a czas działania byłby niewystarczający. Teraz musimy zdecydować o sposobie dostarczenia genu do komórek.

Transfekcja komórki

Na początek warto wprowadzić definicje niektórych terminów.

Transport genów realizowany jest przez wektor to cząsteczka DNA wykorzystywana jako „nośnik” do sztucznego przenoszenia informacji genetycznej do komórki. Istnieje wiele rodzajów wektorów: plazmidowe, wirusowe, a także kosmidy, straszyki, sztuczne chromosomy itp. Podstawowe znaczenie ma to, aby wektory (w szczególności wektory plazmidowe) posiadały swoje charakterystyczne właściwości:

1. Pochodzenie replikacji (ori)- sekwencja nukleotydów, od której rozpoczyna się duplikacja DNA. Jeśli DNA wektora nie może zostać zduplikowane (replikowane), wówczas niezbędny efekt terapeutyczny nie zostanie osiągnięty, ponieważ zostanie on po prostu szybko rozszczepiony przez wewnątrzkomórkowe enzymy nukleazy, a ze względu na brak szablonów ostatecznie powstanie znacznie mniej cząsteczek białka. Należy zauważyć, że punkty te są specyficzne dla każdego gatunku biologicznego, to znaczy, jeśli wektor DNA ma być uzyskiwany przez jego reprodukcję w kulturze bakteryjnej (a nie tylko przez syntezę chemiczną, która zwykle jest znacznie droższa), to dwa punkty pochodzenia replikacji będą wymagane osobno - dla ludzi i dla bakterii;

2. Witryny z ograniczeniami- specyficzne krótkie sekwencje (zwykle palindromiczne), które są rozpoznawane przez specjalne enzymy (endonukleazy restrykcyjne) i są przez nie cięte w określony sposób - z utworzeniem „lepkich końców” (ryc. 1).

Rys.1 Powstawanie „lepkich końcówek” z udziałem restryktaz

Miejsca te są niezbędne do usieciowania wektora DNA (który w rzeczywistości jest „pustą próbą”) z pożądanymi genami terapeutycznymi w pojedynczą cząsteczkę. Taka cząsteczka usieciowana z dwóch lub więcej części jest nazywana „rekombinowaną”;

3. Oczywiste jest, że chcielibyśmy uzyskać miliony kopii rekombinowanej cząsteczki DNA. Ponownie, jeśli mamy do czynienia z hodowlą komórek bakteryjnych, to DNA musi być dalej izolowane. Problem polega na tym, że nie wszystkie bakterie połkną potrzebną nam cząsteczkę, niektóre nie. Aby odróżnić te dwie grupy, wstawia się je do DNA wektora markery selektywne- obszary odporności na niektóre chemikalia; teraz, jeśli te same substancje doda się do środowiska, przeżyją tylko te, które są na nie odporne, a reszta zginie.

Wszystkie te trzy składniki można zaobserwować w pierwszym sztucznie zsyntetyzowanym plazmidzie (ryc. 2).

Rys.2

Sam proces wprowadzania wektora plazmidowego do pewnych komórek nazywa się transfekcja. Plazmid to dość krótka i zwykle kolista cząsteczka DNA, która znajduje się w cytoplazmie komórki bakteryjnej. Plazmidy nie są związane z chromosomem bakteryjnym, mogą replikować się niezależnie od niego, mogą być uwalniane przez bakterię do środowiska lub odwrotnie wchłaniane (proces absorpcji jest transformacja). Za pomocą plazmidów bakterie mogą wymieniać informacje genetyczne, na przykład przenosić oporność na niektóre antybiotyki.

Plazmidy występują w bakteriach in vivo. Ale nikt nie może przeszkodzić badaczowi w sztucznym zsyntetyzowaniu plazmidu, który będzie miał potrzebne mu właściwości, zaszyciu w niego genu insertowego i wprowadzeniu go do komórki. Do tego samego plazmidu można wstawić różne inserty .

Metody terapii genowej

Istnieją dwa główne podejścia, które różnią się charakterem komórek docelowych:

1. Płód, w którym obce DNA jest wprowadzane do zygoty (zapłodnionego jaja) lub zarodka na wczesnym etapie rozwoju; w takim przypadku oczekuje się, że wprowadzony materiał wejdzie do wszystkich komórek biorcy (a nawet komórek zarodkowych, zapewniając tym samym transmisję do następnego pokolenia). W naszym kraju jest to właściwie zakazane;

2. Somatyczny, w którym materiał genetyczny jest wprowadzany do komórek niepłciowych już urodzonych i nie jest przekazywany do komórek zarodkowych.

Terapia genowa in vivo opiera się na bezpośrednim wprowadzeniu sklonowanych (zwielokrotnionych) i specjalnie upakowanych sekwencji DNA do określonych tkanek pacjenta. Szczególnie obiecujące w leczeniu chorób genowych in vivo jest wprowadzanie genów za pomocą szczepionek w aerozolu lub wstrzykiwania. Terapia genowa aerozolem jest z reguły opracowywana do leczenia chorób płuc (mukowiscydoza, rak płuc).

Opracowanie programu terapii genowej poprzedza wiele etapów. Obejmuje to dokładną analizę tkankowo-specyficznej ekspresji odpowiedniego genu (tj. syntezę na macierzy genu pewnego białka w określonej tkance) oraz identyfikację pierwotnego defektu biochemicznego, a także badanie struktury, funkcji i wewnątrzkomórkowa dystrybucja jego produktu białkowego, a także analiza biochemiczna procesu patologicznego. Wszystkie te dane są brane pod uwagę przy sporządzaniu odpowiedniego protokołu medycznego.

Ważne jest, aby przy opracowywaniu schematów korekcji genów wydajność transfekcji, stopień korekcji pierwotnego defektu biochemicznego w warunkach hodowli komórkowej ( in vitro,„in vitro”) i, co najważniejsze, in vivo na zwierzęcych modelach biologicznych. Dopiero wtedy można rozpocząć program badań klinicznych. .

Bezpośrednie dostarczanie i komórkowe nośniki genów terapeutycznych

Istnieje wiele metod wprowadzania obcego DNA do komórki eukariotycznej: niektóre polegają na obróbce fizycznej (elektroporacja, magnetofekcja itp.), inne na wykorzystaniu materiałów chemicznych lub cząstek biologicznych (np. wirusów), które są używane jako nośniki. Warto od razu wspomnieć, że metody chemiczne i fizyczne są zazwyczaj łączone (np. elektroporacja + owijanie DNA liposomami)

Metody bezpośrednie

1. Transfekcję chemiczną można podzielić na kilka typów: przy użyciu substancji cyklodekstrynowej, polimerów, liposomów lub nanocząstek (z lub bez funkcjonalizacji chemicznej lub wirusowej, tj. modyfikacji powierzchni).
a) Jedną z najtańszych metod jest użycie fosforanu wapnia. Zwiększa wydajność wbudowywania DNA do komórek od 10 do 100 razy. DNA tworzy silny kompleks z wapniem, co zapewnia jego sprawne wchłanianie. Wadą jest to, że tylko około 1 - 10% DNA dociera do jądra. Zastosowana metoda in vitro przenieść DNA do komórek ludzkich (ryc. 3);

Rys.3

b) Zastosowanie silnie rozgałęzionych cząsteczek organicznych – dendrymerów do wiązania DNA i przenoszenia go do komórki (ryc. 4);

Rys.4

c) Bardzo skuteczną metodą transfekcji DNA jest jego wprowadzenie przez liposomy - małe, otoczone błoną ciała, które mogą łączyć się z komórkową błoną cytoplazmatyczną (CPM), która jest podwójną warstwą lipidów. W przypadku komórek eukariotycznych transfekcja jest bardziej wydajna w przypadku liposomów kationowych, ponieważ komórki są na nie bardziej wrażliwe. Proces ma swoją nazwę - lipofekcja. Ta metoda jest dziś uważana za jedną z najbezpieczniejszych. Liposomy są nietoksyczne i nieimmunogenne. Jednak skuteczność transferu genów za pomocą liposomów jest ograniczona, ponieważ DNA wprowadzane przez nie do komórek jest zwykle natychmiast wychwytywane przez lizosomy i niszczone. Wprowadzenie DNA do komórek ludzkich za pomocą liposomów jest dziś podstawą terapii. in vivo(rys.5);

Rys.5

d) Inną metodą jest zastosowanie polimerów kationowych, takich jak dietyloaminoetylodekstran lub polietylenoimina. Ujemnie naładowane cząsteczki DNA wiążą się z dodatnio naładowanymi polikationami, a kompleks ten wnika następnie do komórki na drodze endocytozy. DEAE-dekstran zmienia właściwości fizyczne błony komórkowej i stymuluje wychwyt tego kompleksu przez komórkę. Główną wadą metody jest to, że DEAE-dekstran jest toksyczny w wysokich stężeniach. Metoda nie została rozpowszechniona w terapii genowej;

e) Za pomocą histonów i innych białek jądrowych. Białka te, zawierające wiele dodatnio naładowanych aminokwasów (Lys, Arg), w naturalnych warunkach pomagają upakować długi łańcuch DNA w stosunkowo małym jądrze komórkowym.

2. Metody fizyczne:

a) Elektroporacja jest bardzo popularną metodą; natychmiastowy wzrost przepuszczalności błony uzyskuje się dzięki temu, że komórki poddawane są krótkiej ekspozycji na intensywne pole elektryczne. Wykazano, że w optymalnych warunkach liczba transformantów może sięgać 80% komórek, które przeżyły. Obecnie nie jest stosowany u ludzi (ryc. 6).

Rys.6

b) „Cell Squeezing” – metoda wynaleziona w 2013 roku. Pozwala na dostarczanie cząsteczek do komórek poprzez „miękkie wyciskanie” błony komórkowej. Metoda eliminuje możliwość wystąpienia toksyczności lub nieprawidłowego trafienia w cel, ponieważ nie zależy od materiałów zewnętrznych lub pól elektrycznych;

c) Sonoporacja – metoda sztucznego przenoszenia obcego DNA do komórek poprzez poddanie ich działaniu ultradźwięków, co powoduje otwarcie porów w błonie komórkowej;
d) Transfekcja optyczna – metoda polegająca na wykonaniu małego otworu w membranie (o średnicy około 1 µm) za pomocą silnie skupionego lasera;
e) Transfekcja hydrodynamiczna – metoda dostarczania konstruktów genetycznych, białek itp. poprzez kontrolowany wzrost ciśnienia w naczyniach włosowatych i płynie śródmiąższowym, co powoduje krótkotrwały wzrost przepuszczalności błon komórkowych i powstawanie w nich przejściowych porów. Odbywa się przez szybkie wstrzyknięcie do tkanki, podczas gdy dostawa jest niespecyficzna. Efektywność dostarczania dla mięśni szkieletowych - 22 do 60% ;

f) Mikroiniekcja DNA - wprowadzenie do jądra komórek zwierzęcych za pomocą cienkich szklanych mikrotubul (d=0,1-0,5 µm). Wadą jest złożoność metody, prawdopodobieństwo zniszczenia jądra lub DNA jest wysokie; możliwa jest transformacja ograniczonej liczby komórek. Nie używane dla ludzi.

3. Metody oparte na cząstkach.

a) Bezpośrednim podejściem do transfekcji jest pistolet genowy, w którym DNA jest sprzęgane w nanocząstkę z obojętnymi ciałami stałymi (zwykle złoto, wolfram), które następnie „strzelają” skierowane w jądra komórek docelowych. Ta metoda jest stosowana in vitro oraz in vivo do wprowadzania genów, w szczególności do komórek tkanki mięśniowej, na przykład w chorobie takiej jak dystrofia mięśniowa Duchenne'a. Wielkość drobinek złota wynosi 1-3 mikrony (ryc. 7).

Rys.7

b) Magnetofekcja – metoda wykorzystująca siły magnetyzmu do dostarczania DNA do komórek docelowych. Najpierw kwasy nukleinowe (NA) są związane z nanocząstkami magnetycznymi, a następnie pod wpływem pola magnetycznego cząstki są wprowadzane do komórki. Wydajność wynosi prawie 100%, zauważono oczywistą nietoksyczność. Już po 10-15 minutach cząsteczki są rejestrowane w komórce - to znacznie szybciej niż w przypadku innych metod.
c) Impalefection (wbijanie; „wbijanie”, dosł. „wbijanie” + „infekcja”) – metoda dostarczania z wykorzystaniem nanomateriałów, takich jak nanorurki węglowe i nanowłókien. W tym przypadku komórki są dosłownie przebijane przez złoże nanofibryli. Przedrostek „nano” służy do oznaczenia ich bardzo małych rozmiarów (w granicach miliardowych części metra) (ryc. 8).

Rys.8

Osobno warto podkreślić taką metodę, jak transfekcja RNA: nie DNA jest dostarczane do komórki, ale cząsteczki RNA - ich „następcy” w łańcuchu biosyntezy białek; jednocześnie aktywowane są specjalne białka, które tną RNA na krótkie fragmenty – tzw. małe interferujące RNA (siRNA). Fragmenty te wiążą się z innymi białkami, co ostatecznie prowadzi do zahamowania ekspresji odpowiednich genów przez komórkę. W ten sposób możliwe jest zablokowanie w komórce działania tych genów, które w danej chwili potencjalnie wyrządzają więcej szkody niż pożytku. Transfekcja RNA znalazła szerokie zastosowanie, w szczególności w onkologii.

Rozważono podstawowe zasady dostarczania genów przy użyciu wektorów plazmidowych. Teraz możemy przejść do rozważenia metod wirusowych. Wirusy to niekomórkowe formy życia, najczęściej cząsteczka kwasu nukleinowego (DNA lub RNA) owinięta otoczką białkową. Jeśli wytniemy z materiału genetycznego wirusa wszystkie te sekwencje, które powodują występowanie chorób, to cały wirus można z powodzeniem przekształcić w „wehikuł” dla naszego genu.

Nazywa się proces wprowadzania DNA do komórki za pośrednictwem wirusa transdukcja.
W praktyce najczęściej stosuje się retrowirusy, adenowirusy i wirusy związane z adenowirusami (AAV). Na początek warto zastanowić się, jaki powinien być idealny kandydat do transdukcji wśród wirusów. Kryteria są takie, że musi to być:

stabilny;
. zdolność, czyli zawieranie wystarczającej ilości DNA;
. obojętny w stosunku do szlaków metabolicznych komórki;
. dokładny - najlepiej, aby zintegrował swój genom z określonym locus genomu jądra gospodarza itp.

W rzeczywistości bardzo trudno jest połączyć co najmniej kilka punktów, tak że zwykle wybór następuje przy rozpatrywaniu każdego indywidualnego przypadku z osobna (rys. 9).

Rys.9

Spośród trzech najczęściej używanych wirusów na liście AAV jest najbezpieczniejszym i jednocześnie najdokładniejszym. Prawie jedyną ich wadą jest ich stosunkowo niewielka pojemność (około 4800 pz), która jednak okazuje się wystarczająca dla wielu genów .

Oprócz powyższych metod, terapia genowa jest często stosowana w połączeniu z terapią komórkową: najpierw hodowlę niektórych ludzkich komórek sadzi się w pożywce, a następnie niezbędne geny są wprowadzane do komórek w taki czy inny sposób, hodowane dla jakiś czas i ponownie przeszczepione do organizmu gospodarza. Dzięki temu komórki mogą powrócić do swoich normalnych właściwości. Na przykład ludzkie białe krwinki (leukocyty) zostały zmodyfikowane w białaczce (ryc. 10).

Rys.10

Losy genu po dostaniu się do komórki

Ponieważ w przypadku wektorów wirusowych wszystko jest mniej lub bardziej jasne ze względu na ich zdolność do bardziej efektywnego dostarczania genów do ostatecznego celu - jądra, zajmiemy się losem wektora plazmidowego.

Na tym etapie osiągnęliśmy, że DNA przekroczyło pierwszą dużą barierę – błonę cytoplazmatyczną komórki.

Ponadto, w połączeniu z innymi substancjami, z otoczką lub bez, musi dotrzeć do jądra komórkowego, aby specjalny enzym - polimeraza RNA - zsyntetyzował cząsteczkę informacyjnego RNA (mRNA) na szablonie DNA (proces ten nazywa się transkrypcja). Dopiero potem mRNA wejdzie do cytoplazmy, utworzy kompleks z rybosomami i, zgodnie z kodem genetycznym, syntetyzowany jest polipeptyd - na przykład czynnik wzrostu naczyń (VEGF), który zacznie pełnić określoną funkcję terapeutyczną ( w tym przypadku rozpocznie tworzenie rozgałęzień naczyń w tkance podatnej na niedokrwienie) .

Jeśli chodzi o ekspresję wprowadzonych genów w pożądanym typie komórek, problem ten rozwiązuje się za pomocą elementów regulatorowych transkrypcji. Tkanka, w której zachodzi ekspresja, jest często określana przez połączenie specyficznego tkankowo wzmacniacza (sekwencja „wzmacniająca”) z określonym promotorem (sekwencją nukleotydową, od której rozpoczyna się synteza polimerazy RNA), który może być indukowany. . Wiadomo, że aktywność genów można modulować in vivo sygnały zewnętrzne, a ponieważ wzmacniacze mogą działać z dowolnym genem, do wektorów można również wprowadzać izolatory, które pomagają wzmacniaczowi działać niezależnie od jego położenia i mogą zachowywać się jak funkcjonalne bariery między genami. Każdy wzmacniacz zawiera zestaw miejsc wiążących do aktywacji lub tłumienia czynników białkowych. Promotory mogą również regulować poziom ekspresji genów. Na przykład istnieją promotory metalotioneiny lub wrażliwe na temperaturę; promotory sterowane hormonami.

Ekspresja genu zależy od jego pozycji w genomie. W większości przypadków istniejące metody wirusowe prowadzą jedynie do losowego wstawienia genu do genomu. Aby wyeliminować taką zależność, podczas konstruowania wektorów gen jest wyposażony w znane sekwencje nukleotydowe, które umożliwiają ekspresję genu niezależnie od miejsca jego insercji do genomu.

Najprostszym sposobem regulacji ekspresji transgenu jest dostarczenie mu promotora wskaźnikowego, który jest wrażliwy na sygnał fizjologiczny, taki jak uwalnianie glukozy lub hipoksja. Takie „endogenne” systemy kontroli mogą być przydatne w niektórych sytuacjach, takich jak kontrola produkcji insuliny zależna od glukozy. Bardziej niezawodne i wszechstronne są „egzogenne” systemy kontroli, w których ekspresja genów jest kontrolowana farmakologicznie przez wprowadzenie małej cząsteczki leku. Obecnie znane są 4 główne systemy kontroli – regulowane przez tetracyklinę (Tet), steryd owadzi, ekdyzon lub jego analogi, lek antyprogestynowy maifpriston (RU486) oraz chemiczne dimeryzatory, takie jak rapamycyna i jej analogi. Wszystkie obejmują zależną od leku rekrutację domeny aktywacji transkrypcji do głównego promotora prowadzącego pożądany gen, ale różnią się mechanizmami tej rekrutacji. .

Wniosek

Przegląd danych prowadzi do wniosku, że pomimo wysiłków wielu laboratoriów na świecie, wszystkie już znane i przetestowane in vivo oraz in vitro systemy wektorowe są dalekie od ideału . Jeśli problem z dostarczeniem obcego DNA in vitro praktycznie rozwiązany, a jego dostarczenie do komórek docelowych różnych tkanek in vivo pomyślnie rozwiązane (głównie poprzez tworzenie konstruktów przenoszących białka receptorowe, w tym antygeny specyficzne dla określonych tkanek), to inne cechy istniejących systemów wektorowych – stabilność integracji, regulowana ekspresja, bezpieczeństwo – wciąż wymagają poważnych usprawnień.

Przede wszystkim dotyczy stabilności integracji. Jak dotąd integrację z genomem osiągnięto jedynie przy użyciu wektorów retrowirusowych lub adeno-skojarzonych. Wydajność stabilnej integracji można zwiększyć poprzez ulepszenie konstruktów genowych, takich jak systemy za pośrednictwem receptora lub przez stworzenie wystarczająco stabilnych wektorów episomalnych (tj. struktur DNA zdolnych do długotrwałego przebywania w jądrach). Ostatnio szczególną uwagę zwrócono na tworzenie wektorów opartych na sztucznych chromosomach ssaków. Ze względu na obecność podstawowych elementów strukturalnych zwykłych chromosomów, takie minichromosomy długo utrzymują się w komórkach i są w stanie przenosić pełnowymiarowe (genomowe) geny i ich naturalne elementy regulatorowe, które są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania genu we właściwej tkance i we właściwym czasie.

Terapia genowa i komórkowa otwiera wspaniałe perspektywy odbudowy utraconych komórek i tkanek oraz inżynierii genetycznej narządów, co niewątpliwie znacząco rozszerzy arsenał metod badań biomedycznych i stworzy nowe możliwości zachowania i przedłużenia ludzkiego życia.

Dziś terapia genowa wreszcie zaczyna usprawiedliwiać nadzieje, które kiedyś na nią pokładano. W ciągu ostatnich sześciu lat, w wyniku wprowadzenia określonych funkcjonalnych genów do części ciała pacjenta, udało się przywrócić wzrok u 40 pacjentów z dziedziczną ślepotą. W walce z różnymi postaciami białaczki osiągnięto wspaniałe rezultaty: na 120 pacjentów kilku pacjentów osiągnęło remisję trwającą trzy lata. Terapia genowa wykazała swoją skuteczność w walce z hemofilią – chorobą dziedziczną, prowadzącą niekiedy do śmierci pacjenta. Teraz pacjent nie musi przyjmować leków w dużych dawkach, które zwiększają krzepliwość krwi i mają niebezpieczne skutki uboczne.

Pozytywne wyniki zostały przyjęte z wielkim entuzjazmem również dlatego, że terapia genowa została przerwana 15 lat temu po przedwczesnej śmierci Jessego Gelsingera, nastolatka z rzadkim zaburzeniem trawienia. Układ odpornościowy młodego człowieka zareagował na wprowadzenie obcego genu tak gwałtownie, że organizm nie mógł tego znieść. Sukces terapii genowej w latach 90. nie był tak imponujący, jak oczekiwano.

Wszystko to skłoniło nas do ponownego rozważenia niektórych stosowanych metod i bardziej trzeźwej oceny możliwości wykorzystania terapii genowej do eliminacji różnych patologii. Musiałem rozstać się ze złudzeniami i wrócić do badań podstawowych. Przede wszystkim trzeba było ustalić przyczynę możliwych skutków ubocznych (takich jak te, które doprowadziły do ​​śmierci Gelsingera) i nauczyć się ich unikać. Należy zwrócić większą uwagę na komunikację z pacjentami i ich bliskimi, aby podejmowana przez nich decyzja była świadoma.

Punkt zwrotny nastąpił sześć lat temu, gdy terapia genowa wyleczyła ośmioletniego chłopca o imieniu Corey Haas, który cierpiał na zwyrodnieniową chorobę oczu. Początkowo, w wyniku manipulacji genami, brakujące białko zaczęło być produkowane w dotkniętej chorobą siatkówce lewego oka, a cztery dni po operacji chłopiec odwiedził zoo i ku swojej nieopisanej radości zdał sobie sprawę, że widzi błękitne niebo i kolorowe balony. Trzy lata później podobne manipulacje wykonano na prawym oku. Teraz Corey widzi tak dobrze, że może iść na polowanie ze swoim dziadkiem.

Jak dotąd terapia genowa nie weszła do arsenału praktyków, ale jest nadzieja, że ​​stanie się to w ciągu najbliższych dziesięciu lat. W 2012 roku podjęto w Europie próbę wykorzystania jej do wyeliminowania rzadkiej, ale niezwykle bolesnej patologii, tzw. rodzinnego niedoboru lipazy lipoproteinowej. Oczekuje się, że Stany Zjednoczone uzyskają zgodę na stosowanie terapii genowej w medycynie w 2016 roku, a potem będą musiały nadrobić to, co zostało utracone w ciągu dziesięciu lat bezczynności.

Okrutne rozczarowanie

Niepowodzenia, jakie spotkały badaczy na wczesnych etapach stosowania terapii genowej w praktyce, wyraźnie pokazały, jak trudno jest przewidzieć wszystkie konsekwencje wprowadzenia obcych genów do organizmu. Zbyt często najbezpieczniejsze systemy dostarczania nie są wystarczająco skuteczne, a niektóre z najskuteczniejszych systemów dostarczania są niebezpieczne: rozwija się nadaktywna odpowiedź immunologiczna, jak w przypadku Gelsingera, lub rozwija się białaczka.

Aby zrozumieć, co wywołuje skutki uboczne i jak zmniejszyć ich ryzyko, genetycy skupili się na dokładnym przestudiowaniu najpowszechniejszego systemu dostarczania genów: inżynierii wirusów, które działają jak mikroskopijna strzykawka do wstrzykiwań.

Przede wszystkim usunięto znaczną część wirusowego DNA, aby zrobić miejsce dla genów, które miały zostać wprowadzone do organizmu pacjenta. (Procedura ta jednocześnie uniemożliwiła wirusowi replikację.) Stransformowany wirus niosący docelowe geny wstrzykiwano do właściwej części ciała, gdzie wprowadzał je do odpowiednich regionów DNA komórkowego, w zależności od typu wirusa.

W okresie, w którym Gelsinger zgłosił się na ochotnika w badaniach klinicznych terapii genowej, najczęstszym systemem dostarczania obcych genów u ludzi były adenowirusy, które zwykle powodują łagodne infekcje górnych dróg oddechowych. Według naukowców z University of Pennsylvania najlepszy wynik to wstrzyknięcie wirusa do wątroby; to tam znajdują się komórki wytwarzające enzym trawienny, którego brakowało Gelsingerowi. Funkcjonalna kopia genu tego enzymu została wstawiona do inaktywowanej cząstki wirusa, a bilion takich cząstek wstrzyknięto do wątroby pacjenta.

Niestety, część cząsteczek dostała się nie tylko do komórek wątroby, tak jak miały, ale także do ogromnej ilości makrofagów – dużych komórek, „wartowników” układu odpornościowego, a także do komórek dendrytycznych, powiadamiając o tym te ostatnie. inwazji obcych agentów. Układ odpornościowy natychmiast zaczął niszczyć wszystkie zainfekowane komórki, a ten gwałtowny proces ostatecznie zabił pacjenta.

Nasilenie odpowiedzi immunologicznej zaskoczyło naukowców. Żaden z 17 innych wolontariuszy nie miał czegoś takiego. Wiadomo było, że adenowirus może wywołać odpowiedź immunologiczną, ale poza incydentem z jedną małpą, której wstrzyknięto adenowirus nieco inny niż opisany powyżej, przypadek Gelsingera był wyjątkowy. „Populacja ludzka jest znacznie bardziej heterogeniczna niż populacja zwierząt” – mówi James Wilson z University of Pennsylvania, który opracował system ukierunkowanego dostarczania genów, który był używany w badaniach klinicznych z udziałem Gelsingera. różni się od pozostałych”. Być może tragedia nie wydarzyłaby się, gdyby dawka wirusa była mniejsza - nie bilion cząstek, ale kilka miliardów. Inną wadą było to, że ani sam pacjent, ani jego krewni nie zostali poinformowani o śmierci małpy w podobnych testach i nikt nie wiedział, jaką decyzję by podjęli, gdyby dowiedzieli się o incydencie.

Tragedia, jaka spotkała Gelsingera, nie była ostatnią. Wkrótce podjęto próbę wyeliminowania innej patologii za pomocą terapii genowej - ciężkiego złożonego niedoboru odporności XI (SCID-X1). W testach wzięło udział 20 dzieci; pięciu z nich zachorowało na białaczkę, a jedno dziecko zmarło. I znowu winny był system dostarczania, chociaż w tym przypadku zastosowano inny wektor - retrowirus, który wstawia docelowe geny bezpośrednio do DNA komórki. Ich dokładna pozycja w genomie jest nieco zróżnicowana i czasami włączają się w pobliżu onkogenu, co w pewnych warunkach prowadzi do raka.

Przegląd technologii

Tragiczne konsekwencje wykorzystania retro- i adenowirusów jako wektorów zmusiły nas do zwrócenia się ku innym nosicielom. W rezultacie wybrano dwa wirusy.

Pierwszy z nich, wirus związany z adenowirusem (AAV), nie powoduje żadnych infekcji u ludzi. Większość z nas w pewnym momencie życia staje się jej nosicielem i właśnie z tego powodu układ odpornościowy prawdopodobnie nie zareaguje na to, gdy działa jako wektor. AAV ma jeszcze jedną cechę, która pomaga zminimalizować ryzyko skutków ubocznych: jest reprezentowany przez wiele odmian (serotypów), z których każda woli infekować komórki „własnego” narządu lub tkanki. Tak więc dla AAV2 są to oczy, dla AAV8 wątroba, dla AAV9 mięsień sercowy i mózg. Możliwe jest wybranie szczepu wirusa, który jest optymalny dla docelowej części ciała i zminimalizowanie odpowiedzi immunologicznej oraz innych niepożądanych efektów. Ponadto AAVue włącza swój materiał genetyczny do genomu komórki gospodarza i dlatego nie może powodować raka poprzez losową aktywację onkogenów.

Wirus związany z adenowirusem został po raz pierwszy przetestowany pod kątem zdolności dostarczania materiału genetycznego do tkanek docelowych w 1996 roku. Testy przeprowadzono na ochotnikach cierpiących na mukowiscydozę. Od tego czasu zidentyfikowano 11 serotypów wirusa, az ich składników zbudowano setki bezpiecznych, selektywnych wektorów. Wektory oparte na AAV są obecnie testowane pod kątem terapii genowej w patologiach, takich jak choroba Parkinsona i Alzheimera, a także hemofilia, dystrofia mięśniowa, niewydolność serca i ślepota.

Zaskakująco, drugi wirus jest osłabioną wersją ludzkiego wirusa niedoboru odporności, czynnika wywołującego AIDS. Zapomnijmy na chwilę o jego złej reputacji i zajmijmy się jego zaletami jako wektorem. HIV jest członkiem rodzaju Lentivirus z rodziny rstrowirusów. Oddziałuje na komórki układu odpornościowego i - co bardzo ważne - nie aktywuje onkogenów.

Jeśli usuniemy geny odpowiedzialne za śmiertelne działanie wirusa HIV, otrzymamy doskonały wektor o szerokim wachlarzu możliwości. Tak mówi Stuart Naylor, były dyrektor naukowy angielskiej firmy Oxford Biomedica. W przeciwieństwie do mniejszych AAV, „neutralizowany” HIV nadaje się do przenoszenia kilku genów jednocześnie. Jest nietoksyczny i nie wywołuje odpowiedzi immunologicznej. Pozbawione zdolności do wywoływania infekcji lentiwirusy są testowane pod kątem możliwości wykorzystania ich do eliminacji różnych patologii, w szczególności adenoleukodystrofii. Do tej pory kilku chłopców z tą diagnozą mogło wrócić do szkoły dzięki terapii genowej.

Równolegle z próbami klinicznymi z użyciem HIV AAVn trwają prace nad modyfikacją starych wektorów wirusowych, tak aby można je było wykorzystać w określonych okolicznościach. Tak więc retrowirusy (z wyjątkiem HIV) są modyfikowane genetycznie, aby nie powodowały białaczki.

Nawet adenowirus, którego użycie doprowadziło do śmierci Gelsingera, nie zostanie całkowicie odrzucony. Obecnie jest wstrzykiwany tylko w te części ciała, w których jest mało prawdopodobne, aby wywołał odpowiedź immunologiczną. Jednym z potencjalnych zastosowań jest terapia genowa w przypadku kserotomii (suchości w ustach) u pacjentów, którzy byli narażeni na promieniowanie z powodu raka głowy i szyi. w którym uszkodzone są gruczoły ślinowe.

National Institutes of Health prowadzi badanie kliniczne (z udziałem niewielkiej liczby ochotników) podejścia polegającego na wprowadzeniu do odpowiednich komórek genów pośredniczących w tworzeniu kanałów przepuszczania wody do gruczołów ślinowych. Ponieważ te ostatnie są małe i mniej lub bardziej izolowane, a dawka wirusa jest 1000 razy mniejsza od tej, którą otrzymał kiedyś Gelsinger, prawdopodobieństwo nadmiernie silnej reakcji immunologicznej jest zminimalizowane. Cząsteczki wirusa, które według twórców nie dotarły do ​​komórek docelowych, powinny zostać zniszczone w ślinie, wypluwane z nią lub połknięte, co ponownie zmniejsza ryzyko rozwoju odpowiedzi immunologicznej. Od 2006 roku ta metoda znacząco poprawiła stan 11 pacjentów.

Nowe cele

Zachęceni sukcesem genetycy medyczni rozszerzyli zakres terapii genowej i starali się z jej pomocą wyeliminować niedziedziczne wady genetyczne.

Na przykład University of Pennsylvania już stosuje to podejście w walce z jednym z najczęstszych nowotworów wieku dziecięcego – ostrą białaczką limfoblastyczną (ALL). Około 20% dzieci z tą diagnozą nie otrzymuje tradycyjnej chemioterapii.

Terapia genowa w takich przypadkach jest szczególnie złożona i polega na wykorzystaniu chimerycznych receptorów antygenowych (CAR). Podobnie jak chimery ze starożytnej mitologii greckiej, składające się z części ciała różnych zwierząt, te receptory są kompleksem dwóch składników układu odpornościowego, które normalnie nie występują w ciele. Limfocyty T, do których jest przyczepiony, nabywają zdolność wyszukiwania określonych białek występujących w komórkach białaczkowych w większych ilościach niż normalne komórki i niszczą nieprawidłowe komórki. Pierwszymi badanymi byli dorośli pacjenci z przewlekłą białaczką: wyniki były zachęcające. Wyniki prób na chorych dzieciach przekroczyły wszelkie oczekiwania.

Kiedy Emily Whitehead zdiagnozowano białaczkę w maju 2010 roku, miała dziewięć lat. Dwa cykle chemioterapii nie powiodły się. Wiosną 2012 r. podano trzeci kurs, który mógł zabić osobę dorosłą, ale dziewczynka przeżyła, chociaż miała problemy z nerkami, wątrobą i śledzioną. Według lekarza prowadzącego Bruce'a Levine'a. „Emily była na skraju śmierci”.

Następnie pobrali od niej krew, wyizolowali komórki T i wstrzyknęli im lentiwirusa. w genomie, którego geny docelowe były wcześniej zawarte. Po wstrzyknięciu chimerycznych limfocytów T z powrotem do organizmu pacjentki, jej stan zaczął szybko się poprawiać. Trzy tygodnie później 25% komórek T w jej szpiku kostnym zostało genetycznie zmodyfikowanych i zaczęło „polować” na komórki rakowe. „W kwietniu dziewczynka całkowicie wyłysiała. - wspomina Levin - i do sierpnia odzyskał swój dawny wygląd i był gotowy do szkoły.

Zmodyfikowane limfocyty T prawdopodobnie nie będą działać przez resztę jej życia, ale procedurę można zawsze powtórzyć. W międzyczasie ta ładna dziewczyna o gęstych brązowych włosach jest wolna od komórek rakowych. Jesienią 2013 roku kilka grup genetyków medycznych jednocześnie zgłosiło zastosowanie techniki CAR do leczenia 120 pacjentów z tą samą postacią białaczki co Emily Whitehead, a także innymi postaciami. Pięciu dorosłych i 19 z 22 dzieci przeszło w stan remisji.

horyzont

Teraz specjaliści od terapii genowej stają przed kolejnym wyzwaniem: muszą uzyskać zgodę Agencji ds. Żywności i Leków (FDA), aby używać ich bezpieczniejszego niż każdy system wektorowy w klinice. Niezbędne jest zorganizowanie III fazy badania klinicznego z udziałem dużej grupy ochotników. Zwykle zajmuje to od jednego do pięciu lat. Na koniec 2013 r. około 5% z 2000 badań osiągnęło tę fazę. Twórcy metody leczenia pacjentów cierpiących na chorobę Lebera (obustronna utrata wzroku spowodowana mutacją w mitochondrialnym DNA: ośmioletni Haas miał tę patologię) posunęli się dalej niż inni. Kilkudziesięciu pacjentom udało się już przywrócić wzrok za pomocą terapii genowej.

Artykuł na konkurs "bio/mol/text": « Misha urodziła się 12 lutego jako zdrowe dziecko. Ale w wieku 1,5 miesiąca zacząłem zauważać, że na wszystkich zdjęciach dziecko zajmuje tę samą pozycję, jakby jego nogi były nieruchome. W ciągu kilku tygodni zostaliśmy zdiagnozowani, wyrozumiali i zalecono nam rozpoczęcie planowania drugiego, zdrowego dziecka.". Ze względu na fatalną kombinację genów Misha, podobnie jak inne dzieci z tą chorobą, przez całe swoje krótkie życie zmuszony był walczyć o każdy ruch. Walcz rozpaczliwie, z całych sił, ale w końcu przegraj. Rdzeniowy zanik mięśni (SMA) jest jedną z anomalii genetycznych, wobec której ludzkość jest wciąż bezsilna. Jednak postępy w terapii genowej, które obserwuje obecnie świat medyczny, mogą sprawić, że zarówno SMA, jak i inne poważne patologie dziedziczne będą uleczalne. Co więcej, są nadal uleczalne w macicy.

Sponsorem generalnym konkursu jest firma Diaem: największy dostawca sprzętu, odczynników i materiałów eksploatacyjnych do badań biologicznych i produkcji.

Sponsorem Nagrody Publiczności było Centrum Genetyki Medycznej.

Sponsor konkursu "Książka" - "Alpina non-fiction"

Natura popełnia błędy, człowiek poprawia

Koncepcja terapii genowej jest elegancka i piękna, jak każdy geniusz. Polega na dostarczeniu zdrowego materiału genetycznego do komórki za pomocą systemów wektorowych w celu zastąpienia „błędnych” genów, które są związane z różnymi chorobami (ryc. 1).

„Biomolecule” już szczegółowo pisała o możliwościach, jakie otwiera terapia genowa w leczeniu raka i dziedzicznych anomalii, w szczególności barwnikowego zwyrodnienia siatkówki.

A jeśli w latach 80. ubiegłego wieku, kiedy dość głośno mówiono o terapii genowej, jej teoria wydawała się wielu kontynuacją scenariusza na taśmę „Powrót do przyszłości”, dziś stała się rzeczywistością, która się otwiera. nowe, naprawdę nieograniczone perspektywy.

Oczywiste jest jednak, że terapia genowa ma szereg ograniczeń, zwłaszcza jeśli chodzi o choroby dziedziczne. Przede wszystkim proces patologiczny w takich przypadkach może rozpocząć się nawet w macicy. Do czasu ostatecznego zdiagnozowania choroby – a zdarza się to po latach po urodzeniu dziecka – mogą rozwinąć się nieodwracalne uszkodzenia komórek i narządów, co znacznie zawęża możliwości terapeutyczne, a nawet je unieważnia.

Szansa na rozwiązanie tego problemu pojawiła się dzięki nowoczesnej diagnostyce prenatalnej, która pozwala wykryć wady chromosomalne już we wczesnych stadiach ciąży. Po otrzymaniu dowolnego materiału płodowego technikami inwazyjnymi można szybko i wiarygodnie zdiagnozować choroby genetyczne. A w przypadku hemoglobinopatii potrzeba inwazyjnych manipulacji całkowicie znika: aby je zidentyfikować, wystarczy zbadać DNA płodu uzyskane z komórek krwi matki.

Nowoczesne techniki diagnostyki prenatalnej w połączeniu z postępami w terapii genowej dają unikalną możliwość skorygowania „pomyłki” natury i ingerowania w proces patologiczny jeszcze przed nieodwracalnym uszkodzeniem komórek. Zapewnienie leczenia różnych chorób dziecka w łonie matki lub przynajmniej powstrzymanie progresji choroby, według wszelkiego prawdopodobieństwa, terapia genowa płodu, lub terapia genowa płodu.

Idea płodowej terapii genowej nie jest nowa: zaledwie kilka lat po pierwszej próbie terapii genowej u dorosłych, w 1994 roku naukowcy zaczęli poważnie dyskutować o zastosowaniu innowacyjnej techniki in utero. Dziś, kiedy leczenie chorób genetycznych w macicy niemal z fantastycznej perspektywy stało się rzeczywistością, opublikowano wiele artykułów, w których szczegółowo zbadano terapię genową płodu i jej zalety w porównaniu z terapią genową dorosłych.

prenatalnie przeciw po urodzeniu

Przewidując pytania dotyczące celowości wewnątrzmacicznej korekcji anomalii genetycznej, od razu przyjrzyjmy się zaletom płodowej terapii genowej w porównaniu z poporodową terapią genową.

Szerokie możliwości wpływania na narządy i układy

Wiadomo, że w przypadku wielu chorób genetycznych (na przykład pęcherzowego naskórka lub mukowiscydozy) wpływ na główne ogniwa procesu patologicznego może być dość trudny niemal natychmiast po urodzeniu. Korekta zmutowanych genów u rozwijającego się płodu pozwala na szybki wzrost populacji komórek macierzystych, zapewniając dużą pulę transfekowanych komórek i w efekcie wyraźny efekt terapeutyczny.

Uproszczona produkcja wektora klinicznego zawierającego materiał genetyczny

Dawka wektora wirusowego, przez który przenoszony jest materiał genetyczny, zależy od masy ciała. Ze względu na małe rozmiary płodu możliwe jest osiągnięcie znacznie większej biodystrybucji wektora przy takiej samej dawce jak w terapii genowej dorosłych. Oszczędza to zarówno czas, jak i pieniądze. Proste dane porównawcze pozwalają wyobrazić sobie, jak duże są oszczędności: np. płód w 14-16 tygodniu ciąży (optymalny czas indukcji wektorów) waży ok. 100 g, podczas gdy średnia masa ciała osoby dorosłej to ok. 60 kg.

Zwiększenie skuteczności terapii ze względu na gorszą odpowiedź immunologiczną

Szereg badań wykazało, że humoralna odporność na adenowirusy i wirusy adeno-związane (AAV) (fig. 2) pewnych serotypów, które są powszechnie stosowane jako wektory, może prowadzić do niepowodzenia ekspresji transgenu. Może to stać się jedną z krytycznych barier udanego przeszczepu.

Około 50% dorosłych z nabytą odpowiedzią immunologiczną na te wektory wirusowe jest zagrożonych. Ale nawet przy braku wrażliwości, wprowadzenie wektora u dorosłych często prowadzi do rozwoju odpowiedzi immunologicznej, która skraca czas trwania i poziom ekspresji transgenu. Tak więc po wstrzyknięciu domięśniowym wektora adenowirusowego z genem białkowym dystrofina dorosłe myszy z dystrofią mięśniową Duchenne'a wytwarzają przeciwciała przeciwko dystrofinie, co wiąże się ze znacznym spadkiem wydajności ekspresji. Jednocześnie płód w macicy jest immunologicznie niedojrzały, co umożliwia dostarczenie wektora wirusowego i produktu transgenicznego bez ograniczeń wynikających z odpowiedzi immunologicznej.

Oczywiste zalety terapii płodowej w porównaniu z korekcją poporodową zapewniają jej wyższą skuteczność i celowość, zwłaszcza w ciężkich, zagrażających życiu schorzeniach. Nawet w przypadkach, gdy nie można osiągnąć całkowitego wyleczenia, płodowa terapia genowa może wpływać na patologiczne powiązania choroby, ułatwiając jej przebieg i poprawiając rokowanie. I dlatego to ona może stać się jedyną terapeutyczną alternatywą dla przerwania ciąży dla tysięcy rodzin. Co więcej, liczba chorób, które potencjalnie można kontrolować poprzez wprowadzenie płodowej terapii genowej do praktyki klinicznej, jest naprawdę ogromna.

Perspektywy i możliwości

Uważa się, że terapia genowa płodu jest w stanie kontrolować wiele niebezpiecznych patologii. Tylko niewielki ich ułamek przedstawia tabela 1.

Tabela 1. Choroby, które można kontrolować za pomocą płodowej terapii genowej .

Choroba	Lek terapii genowej	Komórki docelowe i/lub narząd	Wiek manifestacji choroby	Rozpowszechnienie	Długość życia
mukowiscydoza	CFTR (regulator transmembranowy)	Komórki nabłonkowe dróg oddechowych i jelit	Trzeci trymestr ciąży	1:4000	Około 35 lat
Dystrofia mięśniowa Duchenne'a	Dystrofina	miocyty	2 lata	1:4500	25 lat
Rdzeniowy zanik mięśni	Białko SMN	Motoneurony	6 miesięcy (typ I)	1:10 000	2 lata
Hemofilia	Czynnik krzepnięcia VIII lub IX	Hepatocyty	1 rok	1:6000
talasemia beta	Globin	Prekursory RBC	Do roku	1:2700	Do 20 lat
choroba Gauchera	glukocerebrozydaza	Hepatocyty	9,5 roku	1:59 000	Mniej niż 2 lata
Defekty cyklu mocznikowego	Transkarbamylaza ornityny	Hepatocyty	2 dni	1:30 000	2 dni
Pęcherzowe oddzielanie się naskórka	kolagen typu VII	Keratynocyty	Narodziny	1:40 000	Przy prawidłowej terapii normalna długość życia
Encefalopatia niedotlenieniowo-niedokrwienna	Czynniki neurotroficzne	Neurony korowe	Narodziny	1:1000	Przy prawidłowej terapii normalna długość życia
Poważne opóźnienie wzrostu wewnątrzmacicznego	łożyskowe czynniki wzrostu	trofoblast	Płód	1:500	Kilka dni

Ponadto niektóre patologie, które można kontrolować za pomocą terapii płodowej, obejmują:

• Zaburzenia niedoboru odporności- Zespół nagich limfocytów, hipoplazja chrząstki, zespół Chediaka-Higashi, przewlekła choroba ziarniniakowa, zespół Kostmana, niedobór adhezji leukocytów, zespół Omenna, zespół Wiskotta-Aldricha.
• Hemoglobinopatie- choroba Rh, wrodzona porfiria erytropoetyczna.
• Choroby związane z niedoborem aktywności enzymatycznej, - choroba Gauchera, choroba Krabbego, leukodystrofia metachromatyczna, mukopolisacharydozy, choroba Volmana, choroba Niemanna-Picka.
• Inny- wrodzona dyskeratoza, rodzinna limfohistiocystoza hemafagocytarna, osteopetroza dziecięca, zespół Shwachmana-Diamonda itp.

Lista chorób, które mogą znajdować się „na ramieniu” płodowej terapii genowej, jest niesamowita: przypuszczalnie ta technika pozwoli ingerować w procesy patologiczne wcześniej poza kontrolą osoby spowodowane chorobami monogenowymi. Ich liczba, według Światowej Organizacji Zdrowia, sięga dziesięciu tysięcy. Niemniej jednak należy wziąć pod uwagę istnienie szeregu ograniczeń, a przede wszystkim zagrożeń dla matki i płodu związanych z wewnątrzmaciczną terapią genową.

Obawy i ryzyko

Konkretne ryzyko prenatalnego transferu genów zasadniczo różni się od ryzyka postnatalnej terapii genowej. Obejmują one krótkotrwałe działania niepożądane i długoterminowe skutki poporodowe. Ich znaczenie potęguje fakt, że hipotetycznie ekspresja genów płodu może mieć nieprzewidywalny wpływ zarówno na rozwój prenatalny, jak i postnatalny.

Przede wszystkim sama procedura transferu wiąże się bezpośrednio ze wzrostem prawdopodobieństwa poronienia, zapalenia błon płodowych i przedwczesnego porodu. Badania udokumentowały reakcje zapalne na wektor, w szczególności naciekanie wątroby i martwicę wątroby w terapii genowej płodu owiec.

Powodzenie terapii genowej płodu może być zneutralizowane przez płodową odpowiedź immunologiczną, co niesie ze sobą pewne ryzyko dla wyniku końcowego. Odpowiedzi humoralne i komórkowe na wprowadzenie wektora lub białka transgenicznego przez układy przetworników komórkowych mogą wyeliminować produkty transferu lub wyrównać ekspresję transgeniczną. Jednocześnie badania wykazały zależność siły odpowiedzi immunologicznej od wieku ciążowego. Nie zarejestrowano istotnych odpowiedzi immunologicznych na wprowadzenie wektora lentiwirusowego we wczesnym i środkowym okresie ciąży, natomiast przy wprowadzeniu wektora adenowirusowego w późniejszych stadiach zaobserwowano silną odpowiedź humoralną przeciwko antygenowi kapsydu.

Jednym z niezwykle ważnych problemów płodowej terapii genowej jest potencjalne ryzyko, które powstaje, gdy sekwencje DNA dawcy są przenoszone na płód. Ponieważ integracja wektora do komórek rozrodczych jest prawdopodobnie losowa, teoretycznie może mieć katastrofalne skutki dla płodu. W rzeczywistości dziecko, które otrzymuje materiał genetyczny dawcy w macicy, rodzi się mutantem. Etyczny komponent terapii genowej zaburza umysły naukowców i teologów. Od narodzin najsłynniejszej owcy w historii nauki ostatnie owce ostrzegają przed niebezpieczeństwami, jakie sprowadza na ludzkość ingerencja w Boży plan.

Innym ważnym aspektem jest możliwość mutagenezy w komórkach płodu, prowadzącej do defektu pewnego funkcjonalnego genu, który ostatecznie może stać się przyczyną nowej, nabytej choroby genetycznej lub nowotworu złośliwego. Jego prawdopodobieństwo wydaje się jeszcze bardziej realne, biorąc pod uwagę dane z badania na myszach, podczas którego ekspresja genów u myszy embrionalnych dała impuls do rozwoju guza wątroby.

W tym kontekście wyniki dwóch badań wykazujących rozwój poważnych skutków ubocznych po skutecznej terapii genowej złożonego niedoboru odporności sprzężonego z chromosomem X mogą nie być przypadkowe: w pierwszym przypadku zarejestrowano manifestację monoklonalnej choroby limfoproliferacyjnej, a w drugim , proliferacja limfocytów T alfa / beta. Zarówno w pierwszym, jak i drugim przypadku wektor retrowirusowy zintegrowany w bliskim sąsiedztwie genu LMO2 w proliferujących limfocytach T.

Teoretycznie terapia genowa ex vivo może być bezpieczniejszy niż in vivo wektor wprowadzenia płodu. Chociaż nie wyklucza to możliwości mutagenezy w komórkach poddanych transdukcji retrowirusowej in vitro, wprowadzenie mutagenu można łatwiej określić i kontrolować. Nie można jednak całkowicie wykluczyć tych komplikacji.

Wreszcie terapia genowa płodu zwiększa podatność komórek płodowych na transdukcję. Po dootrzewnowym podaniu wektora zarodkom owcy i małpy w gonadach męskich i żeńskich obserwowano niski poziom retrowirusowej transdukcji do progenitorów komórek zarodkowych . Analiza czynników prowadzących do niezamierzonej transdukcji wykazała, że ​​podatność tkanki płodu na nią zależy od wieku ciążowego, przy czym odsetek transdukcji jest wyższy we wczesnym okresie ciąży.

Z punktu widzenia potencjalnych zagrożeń oczywiste jest, że płodowa terapia genowa może być rozsądnym leczeniem tylko w przypadku ciężkich chorób genetycznych, w przypadku których nie ma innych możliwości ich skorygowania. A wśród nich, oczywiście, choroba Gauchera, możliwość wewnątrzmacicznej terapii genowej została wykazana w niedawno opublikowanym badaniu.

Najpierw poszedł: choroba Gauchera

W lipcu 2018 magazyn medycyna przyrodnicza opublikował wyniki badania na myszach prowadzonego przez Simona Waddingtona ( Simon Waddington) z Londyńskiego Instytutu Zdrowia Kobiet. Wyniki pracy wykazały skuteczność płodowej terapii genowej w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych, a w szczególności choroby Gauchera. Jest to najczęstsza postać wśród rzadkich dziedzicznych fermentopatii, która opiera się na niedoborze aktywności enzymu lizosomalnego. cerebrozydaza glukozowa(ryc. 3), spowodowane mutacjami w genie glukozyloceramidaza. W zależności od charakteru mutacji może rozwinąć się ciężka neuropatyczna postać choroby, objawiająca się od niemowlęctwa lub postać o bardziej stopniowym początku i łagodniejszych objawach. Podczas gdy łagodniejsze formy choroby Gauchera dobrze reagują na terapię zastępczą, ciężka postać nadal jest śmiertelna. Objawy nieuleczalnej postaci choroby Gauchera pojawiają się w pierwszych miesiącach życia i obejmują postępujące niedociśnienie mięśniowe, opóźniony i cofnięty rozwój psychomotoryczny oraz inne objawy neurologiczne.

W swoim badaniu Waddington i wsp. wykazali, że wewnątrzczaszkowe podanie wektora 9 wirusa związanego z adenowirusami (AAV9) zarodkowi myszy w 16 dniu ciąży spowodowało zwiększoną ekspresję cerebrozydazy glukozowej, która zatrzymała neurodegenerację. Jednocześnie aktywność enzymu w mózgu była porównywalna z aktywnością u zdrowych myszy. Pomimo tego, że chore gryzonie nadal diagnozowano proces zapalny w mózgu, rozwinęły się one znacznie lepiej niż myszy z grupy kontrolnej, które ze względu na ciężkość choroby musiały zostać uśpione dwa tygodnie po leczeniu.

Myszy leczone płodową terapią genową żyły co najmniej 18 tygodni, były płodne i ruchliwe. Co ciekawe, wprowadzenie wektora po urodzeniu również ułatwiło przebieg choroby, ale było mniej skuteczne niż ekspresja prenatalna.

Ponieważ AAV9 mógł dostać się do mózgu z krwiobiegu, zespół Waddington przeprowadził kolejny eksperyment, w którym wstrzyknęli znacznie wyższą dawkę wektora nie do mózgu, ale bezpośrednio do krwi płodów myszy. Myszy były w dużej mierze nie do odróżnienia od zdrowych myszy po ekspresji, ale ponieważ ich długość życia w warunkach eksperymentalnych wynosiła tylko 55 dni, naukowcy nie byli w stanie wyciągnąć wniosków na temat długoterminowej skuteczności dożylnej terapii genowej.

Eksperyment Waddingtona był jak dotąd najbardziej złożony, podczas którego przeprowadzono terapię genową płodu na zwierzętach. Dziś zespół współpracuje z korporacją Terapeutyka Apollo, który zgromadził trzy brytyjskie uniwersytety i trzy duże firmy farmaceutyczne. Waddington i współpracownicy dążą do nowego celu: tym razem stają przed wyzwaniem uzyskania danych przedklinicznych i potencjalnego testowania terapii na ludziach. I podczas gdy sceptycy zastanawiają się nad zakresem płodowej terapii genowej u ludzi, który może zostać znacznie zawężony przez fakt, że choroba Gauchera nie jest uwzględniona w badaniach prenatalnych, zespół Waddington jest gotowy do wkroczenia w przyszłość. Przyszłość, w której dzieci z chorobą Gauchera, Duchenne'a, SMA i wieloma innymi rzadkimi, ale niestety nieuleczalnymi chorobami, mogą wyzdrowieć.

Literatura

1. 12 metod na zdjęciach: inżynieria genetyczna. Część II: narzędzia i techniki;
Odpowiedzi immunologiczne na wektory terapii genowej: wpływ na funkcję wektora i mechanizmy efektorowe. Gene Ther. 11 , S10-S17;
2. Soyoung C. Gilchrist, Martin P. Ontell, Stefan Kochanek, Paula R. Clemens. (2002). Odpowiedź immunologiczna na dystrofinę pełnej długości dostarczoną do mięśnia Dmd przez wektor adenowirusowy o dużej pojemności . Terapia molekularna. 6 , 359-368;
3. Heather A. Hartman, Avery C. Rossidis, William H. Peranteau. (2018). W terapii genowej macicy i edycji genomu. Aktualny przedstawiciel komórek macierzystych. 4 , 52-60;
4. Anna L. David, Donald Peebles. (2008). . Najlepsza praktyka i badania kliniczne Położnictwo i ginekologia. 22 , 203-218;
5. Podsumowanie z frontów terapii genowej. Nowa strategia neutralizacji hemofilii;
6. Charlesa Coutelle'a. (2008). Po co zawracać sobie głowę?: Czy terapia genowa w macicy jest warta wysiłku? . Terapia molekularna. 16 , 219-220;
7. Mike Themis, Simon N. Waddington, Manfred Schmidt, Christof von Kalle, Yoahe Wang i in. al. (2005). Onkogeneza po dostarczeniu nienaczelnego wektora terapii genowej lentiwirusowej myszom płodowym i noworodkowym . Terapia molekularna. 12 , 763-771;
8. Komunikat prasowy Europejskiego Towarzystwa Terapii Genowej (ESGT), Bernd Gansbacher. (2003). Raport o drugim poważnym zdarzeniu niepożądanym w badaniu klinicznym terapii genowej ciężkiego złożonego niedoboru odporności sprzężonego z chromosomem X (X-SCID). J. Gene Med.. 5 , 261-262;
9. Giulia Massaro, Citra N. Z. Mattar, Andrew M. S. Wong, Ernestas Sirka, Suzanne M. K. Buckley, et. al. (2018). Terapia genowa płodu w chorobie neurodegeneracyjnej niemowląt. Nat Med. 24 , 1317-1323.

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a jest jedną z rzadkich, ale wciąż stosunkowo powszechnych chorób genetycznych. Choroba rozpoznawana jest w wieku od trzech do pięciu lat, zwykle u chłopców, objawiająca się początkowo jedynie trudnymi ruchami, w wieku dziesięciu lat osoba cierpiąca na taką miodystrofię nie może już chodzić, w wieku 20-22 lat życie się kończy. Jest to spowodowane mutacją w genie dystrofiny, który znajduje się na chromosomie X. Koduje białko, które łączy błonę komórkową mięśnia z włóknami kurczliwymi. Funkcjonalnie jest to rodzaj sprężyny, która zapewnia płynny skurcz i integralność błony komórkowej. Mutacje w genie prowadzą do dystrofii tkanki mięśni szkieletowych, przepony i serca. Leczenie choroby ma charakter paliatywny i może tylko nieznacznie złagodzić cierpienie. Jednak wraz z rozwojem inżynierii genetycznej na końcu tunelu pojawia się światełko.

O wojnie i pokoju

Terapia genowa to dostarczanie konstruktów opartych na kwasach nukleinowych do komórek w celu leczenia chorób genetycznych. Przy pomocy takiej terapii możliwe jest skorygowanie problemu genetycznego na poziomie DNA i RNA poprzez zmianę procesu ekspresji pożądanego białka. Na przykład DNA z poprawioną sekwencją można dostarczyć do komórki, z której syntetyzowane jest funkcjonalne białko. Lub odwrotnie, możliwe są delecje niektórych sekwencji genetycznych, co również pomoże zmniejszyć szkodliwe skutki mutacji. W teorii jest to proste, ale w praktyce terapia genowa opiera się na najbardziej złożonych technologiach pracy z mikroskopijnymi obiektami i stanowi zestaw zaawansowanej wiedzy w dziedzinie biologii molekularnej.

Wstrzyknięcie DNA do przedjądrza zygoty jest jedną z najwcześniejszych i najbardziej tradycyjnych technologii tworzenia transgenów. Wstrzyknięcie wykonuje się ręcznie za pomocą ultracienkich igieł pod mikroskopem przy powiększeniu 400x.

„Gen dystrofiny, którego mutacje prowadzą do dystrofii mięśniowej Duchenne’a, jest ogromny” – mówi Vadim Zhernovkov, dyrektor ds. rozwoju w firmie biotechnologicznej Marlin Biotech, kandydat nauk biologicznych. - Zawiera 2,5 miliona par zasad, co można porównać z liczbą liter w powieści Wojna i pokój. A teraz wyobraź sobie, że wyrwaliśmy kilka ważnych stron z eposu. Jeśli na tych stronach zostaną opisane ważne wydarzenia, zrozumienie książki byłoby już trudne. Ale z genem wszystko jest bardziej skomplikowane. Nietrudno znaleźć kolejny egzemplarz „Wojny i pokoju”, a wtedy można by przeczytać brakujące strony. Ale gen dystrofiny znajduje się na chromosomie X, a mężczyźni mają tylko jeden. Tak więc tylko jedna kopia genu jest przechowywana w chromosomach płci chłopców po urodzeniu. Nie ma innego miejsca na to.

Wreszcie, w syntezie białek z RNA ważne jest zachowanie ramki odczytu. Ramka odczytu określa, która grupa trzech nukleotydów jest odczytywana jako kodon, który odpowiada jednemu aminokwasowi w białku. Jeśli w genie występuje delecja fragmentu DNA, który nie jest wielokrotnością trzech nukleotydów, następuje przesunięcie ramki odczytu – zmiany kodowania. Można to porównać do sytuacji, w której po wyrwanych stronach w całej pozostałej księdze wszystkie litery zostaną zastąpione kolejnymi w kolejności alfabetycznej. Zdobądź abrakadabrę. To samo dzieje się z białkiem, które nie jest prawidłowo syntetyzowane”.

Plaster biomolekularny

Jedną ze skutecznych metod terapii genowej w celu przywrócenia prawidłowej syntezy białek jest pomijanie eksonów przy użyciu krótkich sekwencji nukleotydowych. Marlin Biotech opracował już technologię pracy z genem dystrofiny tą metodą. Jak wiadomo, w procesie transkrypcji (syntezy RNA) najpierw powstaje tak zwany prematrycowy RNA, który obejmuje zarówno regiony kodujące białka (egzony), jak i regiony niekodujące (introny). Następnie rozpoczyna się proces splicingu, podczas którego introny i egzony zostają rozdzielone i powstaje „dojrzałe” RNA, składające się wyłącznie z eksonów. W tym momencie niektóre egzony można zablokować, „skleić” za pomocą specjalnych molekuł. W rezultacie dojrzały RNA nie będzie miał tych regionów kodujących, których wolelibyśmy się pozbyć, a tym samym ramka odczytu zostanie przywrócona, białko zostanie zsyntetyzowane.

„Odpluskwiliśmy tę technologię in vitro”, mówi Vadim Zhernovkov, czyli na kulturach komórkowych wyhodowanych z komórek pacjentów z miodystrofią Duchenne'a. Ale pojedyncze komórki nie są organizmem. Wdzierając się w procesy komórki, musimy obserwować konsekwencje na żywo, ale nie jest możliwe zaangażowanie ludzi w testy z różnych powodów – od etycznych po organizacyjne. Dlatego konieczne stało się uzyskanie modelu dystrofii mięśniowej Duchenne'a z pewnymi mutacjami w oparciu o zwierzę laboratoryjne”.

Jak nakłuć mikrokosmos?

Zwierzęta transgeniczne to zwierzęta uzyskane w laboratorium, w których genomie dokonuje się celowo, świadomie zmian. W latach 70. stało się jasne, że tworzenie transgenów jest najważniejszą metodą badania funkcji genów i białek. Jedną z najwcześniejszych metod uzyskania w pełni zmodyfikowanego genetycznie organizmu było wstrzyknięcie DNA do przedjądrza („prekursor jądra”) zygot zapłodnionych jaj. Jest to logiczne, ponieważ najłatwiej jest zmodyfikować genom zwierzęcia na samym początku jego rozwoju.

Schemat przedstawia proces CRISPR/Cas9, który obejmuje subgenomowy RNA (sgRNA), jego region działający jako kierujący RNA oraz białko nukleazy Cas9, które przecina obie nici genomowego DNA w miejscu wskazanym przez kierujący RNA.

Wstrzyknięcie do jądra zygoty to bardzo nietrywialna procedura, ponieważ mówimy o mikroskali. Jajo myszy ma średnicę 100 µm, a przedjądro 20 µm. Operacja odbywa się pod mikroskopem z powiększeniem 400x, ale wtrysk to praca jak najbardziej ręczna. Oczywiście do „wstrzyknięcia” nie używa się tradycyjnej strzykawki, ale specjalnej szklanej igły z wydrążonym wewnątrz kanałem, w którym gromadzony jest materiał genowy. Jeden koniec można trzymać w dłoni, a drugi jest ultracienki i ostry – praktycznie niewidoczny gołym okiem. Oczywiście tak krucha konstrukcja ze szkła borokrzemianowego nie może być długo przechowywana, dlatego laboratorium ma do dyspozycji zestaw półfabrykatów, które są rysowane na specjalnej maszynie bezpośrednio przed pracą. Stosuje się specjalny system obrazowania kontrastowego komórek bez barwienia - interwencja w przedjądrze jest sama w sobie traumatyczna i stanowi czynnik ryzyka przeżycia komórek. Kolejnym takim czynnikiem byłaby farba. Na szczęście jaja są dość odporne, ale liczba zygot, z których powstają zwierzęta transgeniczne, stanowi zaledwie kilka procent całkowitej liczby jaj, którym wstrzyknięto DNA.

Następny krok to zabieg chirurgiczny. Trwa operacja przeszczepienia mikroiniekcji zygot do lejka jajowodu myszy biorcy, która stanie się matką zastępczą dla przyszłych transgenów. Następnie zwierzę laboratoryjne w naturalny sposób przechodzi przez cykl ciążowy i rodzi się potomstwo. Zwykle w miocie jest około 20% myszy transgenicznych, co również wskazuje na niedoskonałość metody, ponieważ zawiera ona duży element przypadku. Po wstrzyknięciu badacz nie może dokładnie kontrolować, w jaki sposób wstawione fragmenty DNA zostaną zintegrowane z genomem przyszłego organizmu. Istnieje duże prawdopodobieństwo, że takie kombinacje doprowadzą do śmierci zwierzęcia na etapie embrionalnym. Niemniej jednak metoda działa i jest odpowiednia do wielu celów naukowych.

Rozwój technologii transgenicznych umożliwia produkcję białek zwierzęcych, na które zapotrzebowanie przemysłu farmaceutycznego. Białka te są pozyskiwane z mleka transgenicznych kóz i krów. Istnieją również technologie pozyskiwania określonych białek z jaj kurzych.

Nożyczki DNA

Istnieje jednak bardziej wydajny sposób oparty na ukierunkowanej edycji genomu przy użyciu technologii CRISPR/Cas9. „Dziś biologia molekularna przypomina nieco epokę długodystansowych wypraw morskich pod żaglami” – mówi Vadim Zhernovkov. — Niemal co roku w tej nauce dokonuje się znaczących odkryć, które mogą zmienić nasze życie. Na przykład kilka lat temu mikrobiolodzy odkryli odporność na infekcje wirusowe u pozornie od dawna badanego gatunku bakterii. W wyniku dalszych badań okazało się, że DNA bakterii zawiera specjalne loci (CRISPR), z których syntetyzowane są fragmenty RNA, które mogą komplementarnie wiązać się z kwasami nukleinowymi obcych elementów, np. DNA lub RNA wirusów. Białko Cas9, które jest enzymem nukleazy, wiąże się z takim RNA. RNA służy jako przewodnik dla Cas9, oznaczając określony odcinek DNA, w którym nukleaza wykonuje cięcie. Około trzy do pięciu lat temu pojawiły się pierwsze artykuły naukowe, w których opracowano technologię CRISPR/Cas9 do edycji genomu”.

Myszy transgeniczne umożliwiają tworzenie żywych modeli ciężkich chorób genetycznych człowieka. Ludzie powinni być wdzięczni tym maleńkim stworzeniom.

W porównaniu z metodą losowej insercji konstruktów, nowa metoda umożliwia selekcję elementów systemu CRISPR/Cas9 w taki sposób, aby precyzyjnie kierować prowadnice RNA do pożądanych regionów genomu i osiągnąć celowaną delecję lub insercję pożądanego DNA sekwencja. Błędy są również możliwe w tej metodzie (przewodnik RNA czasami łączy się z niewłaściwym miejscem, do którego jest skierowany), ale przy użyciu CRISPR/Cas9 wydajność tworzenia transgenów wynosi już około 80%. „Ta metoda ma szerokie perspektywy, nie tylko w zakresie tworzenia transgenów, ale także w innych obszarach, w szczególności w terapii genowej”, mówi Vadim Zhernovkov. „Jednak technologia jest dopiero na początku swojej drogi i raczej trudno sobie wyobrazić, że w niedalekiej przyszłości ludzie będą w stanie skorygować kod genowy osób korzystających z CRISPR/Cas9. Dopóki istnieje możliwość pomyłki, istnieje również niebezpieczeństwo, że dana osoba straci jakąś ważną, kodującą część genomu”.

Medycyna mleczna

Rosyjskiej firmie Marlin Biotech udało się stworzyć transgeniczną mysz, w której mutacja prowadząca do dystrofii mięśniowej Duchenne'a jest całkowicie odtworzona, a kolejnym etapem będzie testowanie technologii terapii genowej. Jednak tworzenie modeli chorób genetycznych człowieka w oparciu o zwierzęta laboratoryjne nie jest jedynym możliwym zastosowaniem transgenów. Tak więc w Rosji i laboratoriach zachodnich trwają prace w dziedzinie biotechnologii, która umożliwia uzyskanie białek leczniczych pochodzenia zwierzęcego, które są ważne dla przemysłu farmaceutycznego. Krowy lub kozy mogą pełnić rolę producentów, w których możliwa jest zmiana aparatu komórkowego do produkcji białek zawartych w mleku. Możliwe jest wyodrębnienie białka leczniczego z mleka, które uzyskuje się nie metodą chemiczną, ale naturalnym mechanizmem, który zwiększy skuteczność leku. Obecnie opracowano technologie otrzymywania takich białek leczniczych jak ludzka laktoferyna, prourokinaza, lizozym, atryna, antytrombina i inne.