De mechanismen van enzymatische katalyse worden bepaald door de rol van de functionele groepen van het actieve centrum van het enzym in de chemische reactie waarbij het substraat in het product wordt omgezet. Er zijn 2 hoofdmechanismen van enzymatische katalyse: zuur-base-katalyse en covalente katalyse.

1. Zuur-base-katalyse

Het concept van zuur-base-katalyse verklaart de enzymatische activiteit door de deelname van zure groepen (protondonoren) en/of basische groepen (protonacceptoren) aan een chemische reactie. Zuur-base-katalyse is een veel voorkomend verschijnsel. De aminozuurresten waaruit het actieve centrum bestaat, hebben functionele groepen die de eigenschappen van zowel zuren als basen vertonen.

De aminozuren die betrokken zijn bij zuur-base-katalyse omvatten voornamelijk Cys, Tyr, Ser, Lys, Glu, Asp en His. De radicalen van deze aminozuren in de geprotoneerde vorm zijn zuren (protondonoren), in de gedeprotoneerde vorm zijn het basen (protonacceptoren). Deze eigenschap van functionele groepen op de actieve plaats maakt enzymen unieke biologische katalysatoren, in tegenstelling tot niet-biologische katalysatoren die zure of basische eigenschappen kunnen vertonen. Covalente katalyse is gebaseerd op de aanval van nucleofiele (negatief geladen) of elektrofiele (positief geladen) groepen van het actieve centrum van het enzym door substraatmoleculen met de vorming van een covalente binding tussen het substraat en het co-enzym of de functionele groep van het aminozuur. zuurresidu (meestal één) van het actieve centrum van het enzym.

De werking van serineproteasen, zoals trypsine, chymotrypsine en trombine, is een voorbeeld van het mechanisme van covalente katalyse, wanneer een covalente binding wordt gevormd tussen het substraat en de serine-aminozuurrest van de actieve plaats van het enzym.

25. Complementariteit verwijst naar de ruimtelijke en chemische correspondentie van op elkaar inwerkende moleculen. Het ligand moet het vermogen hebben om de conformatie van de actieve plaats binnen te dringen en ruimtelijk samen te vallen. Dit toeval is misschien niet volledig, maar vanwege de conformationele labiliteit van het eiwit is het actieve centrum in staat tot kleine veranderingen en wordt het “aangepast” aan het ligand. Bovendien moeten er tussen de functionele groepen van het ligand en de aminozuurradicalen die het actieve centrum vormen, bindingen ontstaan ​​die het ligand in het actieve centrum houden. De bindingen tussen het ligand en het actieve centrum van het eiwit kunnen niet-covalent (ionisch, waterstof, hydrofoob) of covalent zijn.

Het feit dat enzymen een hoge specificiteit hebben, stelde ons in staat in 1890 een hypothese naar voren te brengen, volgens welke het actieve centrum van het enzym complementair is aan het substraat, d.w.z. komt ermee overeen als een “sleutel van een slot”. Na de interactie van het substraat (“sleutel”) met het actieve centrum (“slot”) vinden chemische transformaties van het substraat in het product plaats. Het actieve centrum werd beschouwd als een stabiele, strikt bepaalde structuur.

Het substraat, dat in wisselwerking staat met het actieve centrum van het enzym, veroorzaakt een verandering in de conformatie ervan, wat leidt tot de vorming van een enzym-substraatcomplex, gunstig voor chemische modificaties van het substraat. Tegelijkertijd verandert het substraatmolecuul ook zijn conformatie, wat zorgt voor een hogere efficiëntie van de enzymatische reactie. Deze ‘geïnduceerde correspondentiehypothese’ werd vervolgens experimenteel bevestigd.

26. Enzymen die dezelfde chemische reactie katalyseren, maar verschillen in de primaire eiwitstructuur, worden genoemd iso-enzymen of iso-enzymen. Ze katalyseren hetzelfde type reactie met een fundamenteel identiek mechanisme, maar verschillen van elkaar wat betreft kinetische parameters, activeringsomstandigheden en kenmerken van de verbinding tussen het apo-enzym en het co-enzym. De aard van het uiterlijk van iso-enzymen is gevarieerd, maar meestal te wijten aan verschillen in de structuur van de genen die voor deze iso-enzymen coderen. Bijgevolg verschillen iso-enzymen in de primaire structuur van het eiwitmolecuul en dienovereenkomstig in fysisch-chemische eigenschappen. Methoden voor het bepalen van iso-enzymen zijn gebaseerd op verschillen in fysisch-chemische eigenschappen. In hun structuur zijn iso-enzymen voornamelijk oligomere eiwitten. Enzym lactaatdehydrogenase(LDH) katalyseert de omkeerbare oxidatiereactie van lactaat (melkzuur) tot pyruvaat (pyrodruivenzuur).

Het bestaat uit 4 subeenheden van 2 typen: M en H. De combinatie van deze subeenheden ligt ten grondslag aan de vorming van 5 isovormen van lactaatdehydrogenase. LDH 1 en LDH 2 zijn het meest actief in de hartspier en de nieren, LDH4 en LDH5 - in de skeletspieren en de lever. Andere weefsels bevatten verschillende vormen van dit enzym. LDH-isovormen verschillen in elektroforetische mobiliteit, wat het mogelijk maakt de weefselidentiteit van LDH-isovormen te bepalen.

Creatinekinase (CK) katalyseert de vorming van creatinefosfaat:

Het KK-molecuul is een dimeer dat bestaat uit twee soorten subeenheden: M en B. Uit deze subeenheden worden 3 iso-enzymen gevormd: BB, MB, MM. Het BB-iso-enzym wordt voornamelijk in de hersenen aangetroffen, MM in skeletspieren en MB in de hartspier. KK-isovormen hebben verschillende elektroforetische mobiliteiten. De CK-activiteit mag normaal gesproken niet hoger zijn dan 90 IE/l. Bepaling van CK-activiteit in bloedplasma heeft diagnostische waarde in geval van een hartinfarct (er is een verhoging van het niveau van de MB-isovorm). De hoeveelheid van de MM-isovorm kan toenemen tijdens trauma en schade aan skeletspieren. De BB-isovorm kan de bloed-hersenbarrière niet doordringen, is daarom zelfs tijdens een beroerte vrijwel niet detecteerbaar in het bloed en heeft geen diagnostische waarde.

27. ENZYMATIEVE KATALYSE (biokatalyse), versnelling van biochemische stoffen. r-ties met de deelname van eiwitmacromoleculen genoemd enzymen(enzymen). F.k. - variëteit katalyse.

Michaelis-Menten-vergelijking: - de basisvergelijking van de enzymkinetiek, beschrijft de afhankelijkheid van de reactiesnelheid die door een enzym wordt gekatalyseerd, van de concentratie van het substraat en het enzym. Het eenvoudigste kinetische schema waarvoor de Michaelis-vergelijking geldig is:

De vergelijking ziet er als volgt uit:

,

Waarbij: - maximale reactiesnelheid, gelijk aan ; - Michaelis constant, gelijk aan de substraatconcentratie waarbij de reactiesnelheid de helft van het maximum is; - substraatconcentratie.

Michaelisconstante: Relatie tussen snelheidsconstanten

is ook een constante ( K m).

28. "remming van enzymatische activiteit" - een afname van de katalytische activiteit in de aanwezigheid van bepaalde stoffen - remmers. Tot de remmers behoren stoffen die een afname van de enzymactiviteit veroorzaken. Omkeerbare remmers binden zich aan het enzym met zwakke niet-covalente bindingen en worden onder bepaalde omstandigheden gemakkelijk van het enzym gescheiden. Er zijn omkeerbare remmers competitief en niet-competitief. Op weg naar competitieve remming omvatten een omkeerbare afname van de snelheid van een enzymatische reactie veroorzaakt door een remmer die zich bindt aan de actieve plaats van het enzym en de vorming van een enzym-substraatcomplex voorkomt. Dit type remming wordt waargenomen wanneer de remmer een structureel analoog is van het substraat, wat resulteert in concurrentie tussen substraat- en remmermoleculen om een ​​plaats in het actieve centrum van het enzym. Niet competitief Dit wordt remming van een enzymatische reactie genoemd, waarbij de remmer een interactie aangaat met het enzym op een andere plaats dan de actieve plaats. Niet-competitieve remmers zijn geen structurele analogen van het substraat. Onomkeerbare remming waargenomen in het geval van de vorming van covalente stabiele bindingen tussen het remmermolecuul en het enzym. Meestal wordt het actieve centrum van het enzym gewijzigd, waardoor het enzym geen katalytische functie kan uitoefenen. Onomkeerbare remmers zijn onder meer ionen van zware metalen, zoals kwik (Hg 2+), zilver (Ag +) en arseen (As 3+). Stoffen die bepaalde groepen van het actieve centrum van enzymen blokkeren - specifiek En. Diisopropylfluorfosfaat (DFP). Jodiumacetaat en p-chloormercuribenzoaat reageren gemakkelijk met de SH-groepen van cysteïneresiduen in eiwitten. Deze remmers zijn geclassificeerd als niet-specifiek. Bij niet competitief Bij remming bindt de remmer alleen aan het enzym-substraatcomplex en niet aan het vrije enzym.

Maat KI= [E]. [I]/, de dissociatieconstante van het enzym-remmercomplex, wordt de remmingsconstante genoemd.

Quaternaire ammoniumbasen remmen acetylcholinesterase, dat de hydrolyse van acetylcholine in choline en azijnzuur katalyseert.

Stoffen genoemd antimetabolieten. Deze verbindingen, die structurele analogen zijn van natuurlijke substraten, veroorzaken enerzijds competitieve remming van enzymen en kunnen anderzijds door dezelfde enzymen worden gebruikt als pseudosubstraten. Sulfonamidegeneesmiddelen (analogen van para-aminobenzoëzuur) gebruikt voor de behandeling van infectieziekten.

Een voorbeeld van een medicijn waarvan de werking gebaseerd is op onomkeerbare enzymremming is het medicijn aspirine.

Remming van het enzym cyclo-oxygenase, dat de vorming van prostaglandinen uit arachidonzuur katalyseert.

29. De regeling van de snelheid van enzymatische reacties vindt plaats op 3 onafhankelijke niveaus:

1. het aantal enzymmoleculen veranderen;

1. beschikbaarheid van substraat- en co-enzymmoleculen;
2. een verandering in de katalytische activiteit van het enzymmolecuul.

1. Het aantal enzymmoleculen in een cel wordt bepaald door de verhouding van 2 processen: synthese en afbraak van het enzymeiwitmolecuul.

2. Hoe hoger de concentratie van het initiële substraat, hoe hoger de snelheid van de metabolische route. Een andere parameter die het verloop van de metabolische route beperkt, is de aanwezigheid geregenereerde co-enzymen. De belangrijkste rol bij het veranderen van de snelheid van metabolische routes is de regulering van de katalytische activiteit van een of meer sleutelenzymen van een bepaalde metabolische route. Dit is een zeer effectieve en snelle manier om de stofwisseling te reguleren. De belangrijkste manieren om de enzymactiviteit te reguleren zijn: allosterische regulatie; regulering door eiwit-eiwitinteracties; regulering door fosforylering/defosforylering van het enzymmolecuul; regulatie door gedeeltelijke (beperkte) proteolyse.

Het verhogen van de temperatuur tot bepaalde grenzen beïnvloedt de snelheid van enzymatisch

reactie, vergelijkbaar met het effect van temperatuur op een chemische reactie. Naarmate de temperatuur stijgt, versnelt de beweging van moleculen, wat leidt tot een grotere kans op interactie tussen reactanten. Bovendien kan temperatuur de energie van reagerende moleculen verhogen, wat ook de reactie versnelt. De snelheid van een door enzymen gekatalyseerde chemische reactie heeft echter zijn eigen temperatuuroptimum, waarbij een overschrijding gepaard gaat met een afname van de enzymatische activiteit.

Voor de meeste menselijke enzymen is de optimale temperatuur 37-38 °C.

De activiteit van enzymen hangt af van de pH van de oplossing waarin de enzymatische reactie plaatsvindt. Voor elk enzym is er een pH-waarde waarbij de maximale activiteit ervan wordt waargenomen. Afwijking van de optimale pH-waarde leidt tot een afname van de enzymatische activiteit.

Het effect van de pH op de enzymactiviteit houdt verband met de ionisatie van functionele groepen aminozuurresiduen van een bepaald eiwit, die zorgen voor de optimale conformatie van het actieve centrum van het enzym. Wanneer de pH verandert van optimale waarden, verandert de ionisatie van de functionele groepen van het eiwitmolecuul. De meeste enzymen in het menselijk lichaam hebben een optimale pH-waarde die bijna neutraal is, wat samenvalt met de fysiologische pH-waarde

30. Allosterisch enzymen zijn enzymen waarvan de activiteit niet alleen wordt gereguleerd door het aantal substraatmoleculen, maar ook door andere zogenaamde stoffen effectoren. De effectoren die betrokken zijn bij allosterische regulatie zijn cellulaire metabolieten, vaak van de route die ze reguleren.

Allosterische enzymen spelen een belangrijke rol in de stofwisseling, omdat ze extreem snel reageren op de kleinste veranderingen in de interne toestand van de cel. Ze zijn van groot belang in de volgende situaties: tijdens anabole processen, tijdens katabole processen, voor de coördinatie van anabole en katabole routes. ATP en ADP zijn allosterische effectoren die als antagonisten werken; om parallelle en onderling verbonden metabolische routes te coördineren (bijvoorbeeld de synthese van purine- en pyrimidine-nucleotiden die worden gebruikt voor de synthese van nucleïnezuren).

Een effector die een afname (remming) van de enzymactiviteit veroorzaakt, wordt genoemd negatief effector of remmer. Een effector die een toename (activatie) van de enzymactiviteit veroorzaakt, wordt genoemd positief effector of activator. Verschillende metabolieten dienen vaak als allosterische effectoren.

Kenmerken van de structuur en werking van allosterische enzymen: meestal zijn dit oligomere eiwitten die uit meerdere protomeren bestaan ​​of een domeinstructuur hebben; ze hebben een allosterisch centrum, ruimtelijk ver verwijderd van het katalytisch actieve centrum; effectoren hechten zich niet-covalent aan het enzym in allosterische (regulerende) centra; allosterische centra, zoals katalytische centra , kan verschillende specificiteit vertonen met betrekking tot liganden: het kan absoluut en groepsgewijs zijn. het protomeer waarop het allosterische centrum zich bevindt, is een regulerend protomeer. Allosterische enzymen hebben de eigenschap van coöperativiteit; allosterische enzymen katalyseren belangrijke reacties in deze metabolische route.

het eindproduct kan fungeren als een allosterische remmer van het enzym dat meestal de beginfase van deze metabolische route katalyseert:

In centrale metabolische routes kunnen voorlopers activatoren zijn van sleutelenzymen in de metabolische route.

De volgorde van gebeurtenissen bij enzymatische katalyse kan worden beschreven door het volgende diagram. Eerst wordt een substraat-enzymcomplex gevormd. In dit geval vindt er een verandering plaats in de conformaties van het enzymmolecuul en het substraatmolecuul, waarbij de laatste in een gespannen configuratie in het actieve centrum wordt gefixeerd. Dit is hoe het geactiveerde complex wordt gevormd, of overgangstoestand, is een hoogenergetische tussenstructuur die energetisch minder stabiel is dan de oorspronkelijke verbindingen en producten. De belangrijkste bijdrage aan het algehele katalytische effect wordt geleverd door het proces van stabilisatie van de overgangstoestand - de interactie tussen aminozuurresiduen van het eiwit en het substraat, dat zich in een gespannen configuratie bevindt. Het verschil tussen de vrije energiewaarden voor de initiële reactanten en de overgangstoestand komt overeen met de vrije activeringsenergie (ΔG #). De reactiesnelheid is afhankelijk van de waarde (ΔG #): hoe kleiner deze is, hoe groter de reactiesnelheid, en omgekeerd. In wezen vertegenwoordigt de DG een ‘energiebarrière’ die moet worden overwonnen voordat er een reactie kan optreden. Het stabiliseren van de overgangstoestand verlaagt deze ‘barrière’ of activeringsenergie. In de volgende fase vindt de chemische reactie zelf plaats, waarna de resulterende producten vrijkomen uit het enzym-productcomplex.

Er zijn verschillende redenen voor de hoge katalytische activiteit van enzymen, die de energiebarrière voor de reactie verminderen.

1. Een enzym kan moleculen van reagerende substraten zo binden dat hun reactieve groepen zich dicht bij elkaar en van de katalytische groepen van het enzym bevinden (effect toenadering).

2. Met de vorming van een substraat-enzymcomplex wordt fixatie van het substraat en de optimale oriëntatie ervan voor het verbreken en vormen van chemische bindingen bereikt (effect oriëntatie).

3. Het binden van het substraat leidt tot het verwijderen van de hydratatieschil (bestaat op stoffen opgelost in water).

4. Effect van geïnduceerde correspondentie tussen substraat en enzym.

5. Stabilisatie van de overgangstoestand.

6. Bepaalde groepen in het enzymmolecuul kunnen hiervoor zorgen zuur-base katalyse(overdracht van protonen in het substraat) en nucleofiele katalyse(vorming van covalente bindingen met het substraat, wat leidt tot de vorming van structuren die reactiever zijn dan het substraat).

Een voorbeeld van zuur-base-katalyse is de hydrolyse van glycosidische bindingen in het mureïnemolecuul door lysozym. Lysozym is een enzym dat aanwezig is in de cellen van verschillende dieren en planten: in traanvocht, speeksel, kippeneiwit, melk. Lysozym uit kippeneieren heeft een molecuulgewicht van 14.600 Da, bestaat uit één polypeptideketen (129 aminozuurresten) en beschikt over 4 disulfidebruggen, wat zorgt voor een hoge stabiliteit van het enzym. Structurele röntgenanalyse van het lysozymmolecuul toonde aan dat het uit twee domeinen bestaat die een ‘opening’ vormen waarin het actieve centrum zich bevindt. Langs deze ‘opening’ bindt de hexosaccharide, en het enzym heeft zijn eigen plaats voor binding aan elk van de zes suikerringen van mureïne (A, B, C, D, E en F) (Fig. 6.4).

Het mureïnemolecuul wordt vastgehouden op de actieve plaats van lysozym, voornamelijk als gevolg van waterstofbruggen en hydrofobe interacties. In de directe nabijheid van de plaats van hydrolyse van de glycosidebinding bevinden zich 2 aminozuurresiduen van het actieve centrum: glutaminezuur, dat de 35e positie in het polypeptide inneemt, en asparaginezuur, de 52e positie in het polypeptide (Fig. 6.5). .

De zijketens van deze residuen bevinden zich op tegenoverliggende oppervlakken van de “spleet” in de directe nabijheid van de aangevallen glycosidische binding – op een afstand van ongeveer 0,3 nm. Het glutamaatresidu bevindt zich in een niet-polaire omgeving en is niet geïoniseerd, en het aspartaatresidu bevindt zich in een polaire omgeving; de carboxylgroep is gedeprotoneerd en neemt als waterstofacceptor deel aan een complex netwerk van waterstofbruggen.

Het hydrolyseproces wordt als volgt uitgevoerd. De geprotoneerde carboxylgroep van het Glu-35-residu levert zijn proton aan het glycosidische zuurstofatoom, wat leidt tot het verbreken van de binding tussen dit zuurstofatoom en het C 1-atoom van de suikerring op locatie D (stadium van algemene zure katalyse). ). Als gevolg hiervan wordt een product gevormd dat de suikerringen in de regio's E en F omvat, die uit het complex met het enzym kunnen worden vrijgegeven. De conformatie van de suikerring in gebied D is vervormd en neemt de conformatie aan halve stoelen, waarin vijf van de zes atomen die de suikerring vormen praktisch in hetzelfde vlak liggen. Deze structuur komt overeen met de conformatie van de overgangstoestand. In dit geval blijkt het C 1-atoom positief geladen te zijn en wordt het tussenproduct een carboniumion genoemd (carbokation). De vrije energie van de overgangstoestand neemt af als gevolg van de stabilisatie van het carboniumion door de gedeprotoneerde carboxylgroep van het Asp-52-residu (Fig. 6.5).

In de volgende fase komt een watermolecuul in de reactie terecht en vervangt het disacharideresidu dat uit het gebied van het actieve centrum diffundeert. Het proton van het watermolecuul gaat naar Glu-35, en het hydroxylion (OH -) naar het C 1-atoom van het carboniumion (stadium van algemene basische katalyse). Als gevolg hiervan wordt het tweede fragment van het gesplitste polysacharide een reactieproduct (stoelconformatie) en verlaat het het actieve centrumgebied, en keert het enzym terug naar zijn oorspronkelijke staat en is klaar om de volgende disacharidesplitsingsreactie uit te voeren (Fig. 6.5). .

Het werkingsmechanisme van enzymen kan vanuit twee posities worden bekeken: vanuit het oogpunt van veranderingen in de energie van chemische reacties en vanuit het oogpunt van gebeurtenissen in het actieve centrum.

A. Energieveranderingen tijdens chemische reacties

Alle chemische reacties verlopen in overeenstemming met twee basiswetten van de thermodynamica: de wet van behoud van energie en de wet van entropie. Volgens deze wetten blijft de totale energie van een chemisch systeem en zijn omgeving constant, terwijl het chemische systeem de neiging heeft de orde te verkleinen (de entropie te vergroten). Om de energie van een chemische reactie te begrijpen, is het niet voldoende om de energiebalans te kennen van de reagentia die de reactie binnenkomen en verlaten; het is noodzakelijk om rekening te houden met energieveranderingen tijdens het proces van een bepaalde chemische reactie en de rol van enzymen daarin. de dynamiek van dit proces. Beschouw de ontledingsreactie van koolzuur:

H2CO3 → H20 + CO2.

Koolzuur is zwak; de reactie van de ontbinding ervan zal onder normale omstandigheden plaatsvinden als de koolzuurmoleculen een energie hebben die een bepaald niveau overschrijdt, de activeringsenergie Ea genoemd (Fig. 2-10).

Activeringsenergie is de extra hoeveelheid kinetische energie die nodig is om de moleculen van een stof te laten reageren.

Wanneer deze energiebarrière wordt bereikt, vinden er veranderingen plaats in het molecuul, waardoor een herverdeling van chemische bindingen en de vorming van nieuwe verbindingen ontstaat. Van moleculen die Ea bezitten, wordt gezegd dat ze zich in een overgangstoestand bevinden. Het energieverschil tussen de initiële reactant H2CO3 en de uiteindelijke verbindingen H2O en CO2 wordt de vrije energieverandering van de reactie DG genoemd. H2O- en CO2-moleculen zijn stabielere stoffen dan H2CO3, d.w.z. hebben minder energie en reageren vrijwel niet onder normale omstandigheden. De energie die vrijkomt als gevolg van deze reactie wordt in de vorm van warmte afgevoerd naar de omgeving.

Hoe meer moleculen energie hebben die het niveau Ea overschrijdt, hoe hoger de snelheid van de chemische reactie. Je kunt de snelheid van een chemische reactie verhogen door te verwarmen. Dit verhoogt de energie van de reagerende moleculen. Hoge temperaturen zijn echter destructief voor levende organismen, dus worden enzymen in cellen gebruikt om chemische reacties te versnellen. Enzymen zorgen voor een hoge reactiesnelheid onder optimale omstandigheden in de cel door het niveau van Ea te verlagen. Enzymen verminderen dus de hoogte van de energiebarrière, waardoor het aantal reactieve moleculen toeneemt en daardoor de reactiesnelheid toeneemt.

In het mechanisme van enzymatische katalyse is de vorming van onstabiele tussenverbindingen van doorslaggevend belang: het enzym-substraatcomplex ES, dat transformatie ondergaat in een onstabiel overgangscomplex EP, dat vrijwel onmiddellijk uiteenvalt in een vrij enzym en het reactieproduct.

Biologische katalysatoren (enzymen) veranderen dus de vrije energie niet.

Een enzym dat de functie vervult van een katalysator voor een chemische reactie, gehoorzaamt aan de algemene wetten van de katalyse en heeft alle eigenschappen die kenmerkend zijn voor niet-biologische katalysatoren, maar heeft ook onderscheidende eigenschappen die verband houden met de structurele kenmerken van enzymen.

De overeenkomst tussen enzymen en niet-biologische katalysatoren is dat:

Enzymen katalyseren energetisch mogelijke reacties;

· de energie van het chemische systeem blijft constant;

·tijdens de katalyse verandert de richting van de reactie niet;

Enzymen worden tijdens de reactie niet verbruikt.

De verschillen tussen enzymen en niet-biologische katalysatoren zijn dat:

· de snelheid van enzymatische reacties is hoger dan die van reacties die worden gekatalyseerd door niet-eiwitkatalysatoren;

Enzymen zijn zeer specifiek;

· de enzymatische reactie vindt plaats in de cel, d.w.z. bij een temperatuur van 37 °C, constante atmosferische druk en fysiologische pH;

De snelheid van de enzymatische reactie kan worden aangepast.

Mechanismen van enzymactie

In algemene termen komt het allemaal neer op de complementaire interactie van enzym en substraat. In dit geval gaan de functionele groepen van het substraat een interactie aan met hun overeenkomstige functionele groepen van het enzym. De aanwezigheid van substraatspecificiteit wordt verklaard door twee hypothesen:

1. Vissers theorie(model van “rigide matrix”, “key-lock”) – het actieve centrum van het enzym komt strikt overeen met de configuratie van het substraat en verandert niet wanneer het wordt bevestigd. Dit model verklaart de absolute specificiteit goed, maar niet de groepsspecificiteit.

2. In 1958 stelde Daniel Koshland een wijziging van het “sleutelslot”-model voor. Enzymen zijn over het algemeen geen stijve, maar flexibele moleculen. De actieve plaats van een enzym kan van conformatie veranderen na binding aan een substraat. De aminozuurzijgroepen van de actieve plaats nemen een positie in die het enzym in staat stelt zijn katalytische functie uit te voeren. In sommige gevallen verandert het substraatmolecuul ook van conformatie na binding aan de actieve plaats. In tegenstelling tot het key-lock-model verklaart het geïnduceerde-fit-model niet alleen de specificiteit van enzymen, maar ook de stabilisatie van de overgangstoestand. Dit model wordt de “handschoenhand” genoemd.

Kinetiek van enzymatische reacties. Afhankelijkheid van de snelheid van enzymatische reacties op temperatuur, pH van de omgeving, enzymconcentraties en substraat. Het concept van optimale pH en temperatuur, fysiologische en klinische diagnostische betekenis. Bepaling van de Michaelis-constante en de klinische en diagnostische betekenis ervan.

De kinetiek van een enzymatische reactie (dat wil zeggen de afhankelijkheid van de reactiesnelheid van de omstandigheden ervan) wordt voornamelijk bepaald katalysator eigenschappen.

Enzymkinetiek bestudeert de invloedspatronen van de chemische aard van reagerende stoffen (enzymen, substraten) en de omstandigheden van hun interactie (concentratie, pH, temperatuur, aanwezigheid van activatoren of remmers) op de snelheid van enzymatische reacties. Het belangrijkste doel van het bestuderen van de kinetiek van enzymatische reacties is het verkrijgen van informatie die kan helpen het moleculaire mechanisme van de enzymwerking op te helderen.

Afhankelijkheid van de snelheid van de enzymatische reactie van de hoeveelheid enzymen:

Wanneer een enzymatische reactie wordt uitgevoerd onder omstandigheden van overmaat substraat, zal de reactiesnelheid afhangen van de concentratie van het enzym. De grafische afhankelijkheid van zo'n reactie heeft de vorm van een rechte lijn. De hoeveelheid enzym is echter vaak onmogelijk in absolute termen te bepalen, daarom gebruiken ze in de praktijk voorwaardelijke waarden die de activiteit van het enzym karakteriseren: één internationale eenheid van activiteit (IE) komt overeen met de hoeveelheid enzym die de omzetting van 1 µmol substraat in 1 minuut katalyseert onder optimale omstandigheden voor de enzymatische reactie. Optimale omstandigheden zijn individueel voor elk enzym en zijn afhankelijk van de temperatuur van de omgeving, de pH van de oplossing, bij afwezigheid van activatoren en remmers.

Rijst. Afhankelijkheid van productaccumulatie (A) en substraatverlies (B) van de tijd (duur) van de reactie. De snelheid van een enzymatische reactie wordt bepaald door de verandering in de concentratie van het product of substraat per tijdseenheid.

De periode van een enzymatische reactie wordt gekenmerkt door een niet-lineaire accumulatie van product (of verlies van substraat), afhankelijk van de reactietijd.

eenheid enzymactiviteit: 1 katal (kat), overeenkomend met de hoeveelheid katalysator die 1 mol substraat in 1 seconde omzet. Het aantal katalysatoren wordt bepaald door de formule:

De internationale eenheid van enzymatische activiteit ME is gerelateerd aan de cathal door de volgende gelijkheden:

1 kat = 1 mol S/c = 60 mol S/min = 60x10 6 µmol/min = 6x10 7 ME,

1 ME = 1 µmol/min = 1/60 µmol/s = 1/60 µkat = 16,67 nkat.

In de medische praktijk worden vaak internationale activiteitseenheden – ME – gebruikt om de enzymactiviteit te beoordelen. Om het aantal enzymmoleculen onder andere eiwitten van een bepaald weefsel te schatten, wordt de specifieke activiteit (sp. ac.) van het enzym bepaald, numeriek gelijk aan het aantal enzymactiviteitseenheden (pME) in het weefselmonster gedeeld door de massa. (mg) van het eiwit in dit weefsel:

Om de zuivering van het enzym te beoordelen wordt de specifieke activiteit gebruikt: hoe minder vreemde eiwitten, hoe hoger de specifieke activiteit.

Afhankelijkheid van de snelheid van de enzymatische reactie van de temperatuur van het medium

Het verhogen van de temperatuur tot bepaalde grenzen beïnvloedt de snelheid van de enzymatische reactie, vergelijkbaar met het effect van temperatuur op elke chemische reactie. Naarmate de temperatuur stijgt, versnelt de beweging van moleculen, wat leidt tot een grotere kans op interactie tussen reactanten. Bovendien kan temperatuur de energie van reagerende moleculen verhogen, wat ook de reactie versnelt. De snelheid van een door enzymen gekatalyseerde chemische reactie heeft echter zijn eigen temperatuuroptimum, waarvan de overmaat gepaard gaat met een afname van de enzymatische activiteit als gevolg van thermische denaturatie van het eiwitmolecuul.

Voor de meeste menselijke enzymen is de optimale temperatuur 37-38 °C. Thermostabiele enzymen bestaan ​​echter ook in de natuur. Taq-polymerase geïsoleerd uit micro-organismen die in warmwaterbronnen leven, wordt bijvoorbeeld niet geïnactiveerd wanneer de temperatuur stijgt tot 95 °C. Dit enzym wordt in de wetenschappelijke en praktische geneeskunde gebruikt voor de moleculaire diagnose van ziekten met behulp van de polymerasekettingreactie (PCR)-methode.

Rijst. Afhankelijkheid van de enzymatische reactiesnelheid (V) van de temperatuur.

Afhankelijkheid van de snelheid van de enzymatische reactie van de pH van het medium

Voor elk enzym is er een pH-waarde waarbij de maximale activiteit ervan wordt waargenomen. Afwijking van de optimale pH-waarde leidt tot een afname van de enzymatische activiteit.

Het effect van de pH op de enzymactiviteit houdt verband met de ionisatie van functionele groepen aminozuurresiduen van een bepaald eiwit, die zorgen voor de optimale conformatie van het actieve centrum van het enzym. Wanneer de pH verandert van optimale waarden, verandert de ionisatie van de functionele groepen van het eiwitmolecuul. Wanneer de omgeving bijvoorbeeld verzuurd wordt, worden vrije aminogroepen (NH 3 +) geprotoneerd, en wanneer alkalisatie plaatsvindt, wordt een proton verwijderd uit carboxylgroepen (COO -). Dit leidt tot een verandering in de conformatie van het enzymmolecuul en de conformatie van het actieve centrum; bijgevolg wordt de hechting van het substraat, cofactoren en co-enzymen aan het actieve centrum verstoord. Bovendien kan de pH van de omgeving de mate van ionisatie of ruimtelijke organisatie van het substraat beïnvloeden, wat ook de affiniteit van het substraat voor de actieve plaats beïnvloedt. Bij een significante afwijking van de optimale pH-waarde kan denaturatie van het eiwitmolecuul optreden met een volledig verlies van enzymatische activiteit.

De optimale pH-waarde is voor verschillende enzymen verschillend. Enzymen die werken onder zure omgevingsomstandigheden (bijvoorbeeld pepsine in de maag of lysosomale enzymen) verwerven een conformatie die ervoor zorgt dat het enzym bij zure pH-waarden werkt. De meeste enzymen in het menselijk lichaam hebben echter een optimale pH-waarde die bijna neutraal is, wat samenvalt met de fysiologische pH-waarde.

Afhankelijkheid van de snelheid van de enzymatische reactie van de hoeveelheid substraat

Als de concentratie van enzymen constant blijft en alleen de hoeveelheid substraat verandert, wordt de grafiek van de snelheid van de enzymatische reactie beschreven door een hyperbool.

Naarmate de hoeveelheid substraat toeneemt, neemt de initiële snelheid toe. Wanneer het enzym volledig verzadigd raakt met substraat, d.w.z. de maximaal mogelijke vorming van een enzym-substraatcomplex vindt plaats bij een gegeven enzymconcentratie, en de hoogste snelheid van productvorming wordt waargenomen. Een verdere verhoging van de substraatconcentratie leidt niet tot een verhoging van de productvorming, d.w.z. de reactiesnelheid neemt niet toe. Deze toestand komt overeen met de maximale reactiesnelheid Vmax.

De enzymconcentratie is dus de beperkende factor bij de vorming van het product. Deze waarneming vormde de basis van de enzymkinetiek, ontwikkeld door wetenschappers L. Michaelis en M. Menten in 1913.

Het enzymatische proces kan worden uitgedrukt door de volgende vergelijking:

waarbij k1 de snelheidsconstante is voor de vorming van het enzym-substraatcomplex; k -1 is de snelheidsconstante van de omgekeerde reactie, de ontleding van het enzym-substraatcomplex; k2 is de snelheidsconstante voor de vorming van het reactieproduct.

De volgende verhouding van snelheidsconstanten (k -1 + k 2)/k 1 wordt de Michaelis-constante genoemd en aangeduid met K m.

De reactiesnelheid is evenredig met de concentratie van het enzym-substraat ES-complex, en de snelheid van ES-vorming hangt af van de substraatconcentratie en de concentratie van vrij enzym. De concentratie van ES wordt beïnvloed door de snelheid van vorming en verval van ES.

De hoogste reactiesnelheid wordt waargenomen wanneer alle enzymmoleculen een complex vormen met het substraat, d.w.z. in het enzym-substraatcomplex ES, d.w.z. [E] = .

De afhankelijkheid van de snelheid van een enzymatische reactie van de substraatconcentratie wordt uitgedrukt door de volgende vergelijking

Vmax [S]

Km + [S]

Deze vergelijking wordt de Michaelis-Menten-vergelijking genoemd.

In het geval dat de reactiesnelheid de helft van de maximale snelheid bedraagt, is Km = [S] De Michaelis-constante is dus numeriek gelijk aan de substraatconcentratie waarbij de helft van de maximale snelheid wordt bereikt.

De Michaelis-Menten-vergelijking is de basisvergelijking van de enzymkinetiek en beschrijft de afhankelijkheid van de snelheid van een enzymatische reactie van de concentratie van het substraat.

Als de substraatconcentratie aanzienlijk groter is dan K m (S >> K m), dan heeft een verhoging van de substraatconcentratie met K m vrijwel geen effect op de som (K m + S) en kan deze als gelijk aan het substraat worden beschouwd concentratie. Bijgevolg wordt de reactiesnelheid gelijk aan de maximale snelheid: V = Vmax. Onder deze omstandigheden heeft de reactie een nulde orde, d.w.z. is niet afhankelijk van de substraatconcentratie. We kunnen concluderen dat Vmax een constante waarde is voor een gegeven enzymconcentratie, onafhankelijk van de substraatconcentratie.

Als de substraatconcentratie aanzienlijk lager is dan K m (S<< K m), то сумма (K m + S) примерно равна К m , следовательно, V = V max [S]/K m , т.е. в данном случае скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата (реакция имеет первый порядок).

Rijst. Afhankelijkheid van de reactiesnelheid (V) van de substraatconcentratie S.

Vmax en Km zijn de kinetische kenmerken van de enzymefficiëntie.

· Vmax karakteriseert de katalytische activiteit van het enzym en heeft de dimensie van de snelheid van de enzymatische reactie mol/l, d.w.z. bepaalt de maximale mogelijkheid van productvorming bij een gegeven enzymconcentratie en onder omstandigheden van overtollig substraat. Km karakteriseert de affiniteit van een bepaald enzym voor een bepaald substraat en is een constante waarde die niet afhankelijk is van de concentratie van het enzym. Hoe minder

· Km, hoe groter de affiniteit van het enzym voor een bepaald substraat, hoe hoger de initiële reactiesnelheid en omgekeerd, hoe groter Km, hoe lager de initiële reactiesnelheid, hoe lager de affiniteit van het enzym voor het substraat.

Om een ​​reactie te laten plaatsvinden, moeten de reagerende moleculen met elkaar in contact komen. Niet elke botsing van moleculen gaat echter gepaard met hun interactie; de ​​reactie vindt alleen plaats als de moleculen voldoende kinetische energie hebben. De verzameling moleculen van elke stof is een statistische verzameling moleculen met verschillende kinetische energieën. De energie die nodig is om de geactiveerde (overgangs)toestand te bereiken, of de overtollige energie vergeleken met de gemiddelde energie van moleculen bij een bepaalde temperatuur die ze moeten bezitten om te kunnen reageren, wordt activeringsenergie (Ea) genoemd. In het geval van enzymatische reacties wordt de energiebarrière verminderd als gevolg van de vorming van een enzym-substraatcomplex, en hoe lager de activeringsenergie, hoe sneller de reacties verlopen, aangezien moleculen met minder energie kunnen interageren.

Bij enzymatische en niet-enzymatische reacties worden, om een ​​overgangstoestand te bereiken, de moleculen van de uitgangsstoffen geactiveerd, krijgen ze een hogere energiereserve, pas daarna kunnen ze worden omgezet in reactieproducten, maar (Ea) in het geval van een enzymatische reactie reactie is lager.

Hoge snelheden van enzymatische reacties zijn dus uiteindelijk het resultaat van een afname van de activeringsenergie van de gekatalyseerde reacties. Juist omdat biologische katalysatoren de activeringsenergie verminderen, verlopen enzymatische reacties met hoge snelheden en bij relatief lage temperaturen.

De afname van de activeringsenergie tijdens enzymatische katalyse houdt enig verband met de meertrapsaard van deze reacties. Ze vinden niet in één fase plaats, maar stapsgewijs, via verschillende tussenreacties. In dit geval wordt de activeringsbarrière van de reactie voor elke tussenreactie verdeeld in verschillende lagere barrières, die voor de reagerende moleculen gemakkelijker te overwinnen zijn dan één grote barrière.

Enzymatische katalyse heeft kenmerken van zowel homogene als heterogene katalyse, die plaatsvindt op het grensvlak tussen twee fasen. In de katalytische werking van enzymen kunnen 3 fasen worden onderscheiden: 1) hechting van een substraatmolecuul (S) aan het enzym (E), 2) transformatie van het substraat, 3) scheiding van de uiteindelijke reactieproducten (P) van de enzym. Het eenvoudigste schema van een enzymatische reactie is als volgt geschreven.

E + S ⇆ ES → E + P

De snelste is meestal de eerste fase van de reactie, de langzaamste is de tweede. In de eerste fase van de reactie wordt een enzym-substraatcomplex (ЈS, FSK) gevormd, waardoor de structuur en eigenschappen van het substraatmolecuul veranderen en de overgangsvormen ervan worden gevormd. Dit is de belangrijkste voorwaarde voor het versnellen van het transformatieproces in een gekatalyseerde reactie.

De vorming van FSC schept de voorwaarden voor een hoge katalytische activiteit. Vastgesteld is dat bij de vorming van FSC de moleculen van het enzym en het substraat niet alleen dichter bij elkaar komen, maar ook op een bepaalde manier ten opzichte van elkaar georiënteerd zijn. Tussen de structuur van het substraat en het actieve centrum van het enzym bestaat er naast de sterische correspondentie ook een topochemische correspondentie, die zorgt voor de interactie tussen de herkenningsgroepen van het enzym (bindingszone) en de herkenningsgroepen van het substraat. De binding van enzym en substraat vindt doorgaans plaats op meerdere punten, en hoe hoger de specificiteit van het enzym, hoe meer herkenningspunten.

Een belangrijke factor die een zekere bijdrage levert aan de toename van de snelheid van enzymatische reacties is een toename van de contacttijd van reagerende moleculen met verschillende ordes van grootte als gevolg van meerpuntsbinding van het substraat (de substraten) door het enzym. De tijd gedurende welke het contact van moleculen tijdens een botsing duurt bij een puur chemische reactie is ongeveer gelijk aan de periode van thermische trillingen van de moleculen (10 13 -10 12 s). Gedurende deze tijd heeft een chemische reactie niet altijd de tijd om plaats te vinden.

Bij optimale binding van het substraat aan het enzym wordt een productief enzym-substraatcomplex gevormd, d.w.z. een complex dat, via een reeks tussenstappen, het/de reactieproduct(en) produceert. Deze processen vinden plaats in de tweede fase van de enzymatische reactie. Het snelle optreden van de enzymatische reactie wordt vergemakkelijkt door het feit dat tijdens de interactie van het substraat met het enzym spanning wordt geïnduceerd in de verbroken bindingen in het substraat (vervorming of destabilisatie), d.w.z. de verbroken bindingen worden minder stabiel dan in de gratis substraat.

Een toename van de reactiesnelheid onder invloed van enzymen treedt ook op als gevolg van de grotere hydrofobiciteit van de actieve centrumomgeving vergeleken met de omringende oplossing; in een dergelijke omgeving wordt desolvatie van het geladen substraat waargenomen, wat leidt tot destabilisatie van de verbroken binding. .

Een belangrijk kenmerk van enzymatische reacties is dat de transformatie van het substraat verloopt als polyfunctionele katalyse. Polyfunctionaliteit wordt verzekerd door de diversiteit aan aminozuurresiduen van het eiwitgedeelte van het enzym en groepen cofactoren in het actieve centrum; de transformerende chemische binding van het substraat wordt gelijktijdig of als resultaat van een reeks opeenvolgende aanvallen door verschillende groepen van het enzym beïnvloed. Als gevolg hiervan vindt polarisatie van de transformerende binding plaats en vervolgens de breuk ervan.

Veel groepen op de actieve plaatsen van enzymen functioneren als gegeneraliseerde zuren of basen, die op het substraat inwerken, dit activeren en daardoor de katalysesnelheid verhogen. Volgens Brønsted zijn gegeneraliseerde zuren alle protondonoren, en basen zijn protonacceptoren. Gegeneraliseerde zuur-base-katalyse is bijzonder effectief. Het geeft een snelheidsverhoging van 10-100 keer. De zijradicalen van aminozuren zoals glutamine, aspargan, histidine, lysine, tyrosine enz. functioneren in het actieve centrum als gegeneraliseerde zuur-base-katalysatoren.In de geprotoneerde vorm zijn het zure katalysatoren, in de niet-geprotoneerde vorm zijn ze basisch.

De nucleofiele groepen enzymen ondergaan nucleofiele substitutiereacties, wat leidt tot de vorming van covalente tussenproducten - covalente katalyse. De nucleofiele groep vervangt de gesubstitueerde groep en er wordt een covalent tussenproduct gevormd; het is onstabiel en valt gemakkelijk uiteen in reactieproducten. De imidazolgroep van histidine is een sterk nucleofiel, dus chemische modificatie van histidine op de actieve plaats leidt tot inactivatie van enzymen. Nucleofiele groepen omvatten ook de OH-groep serine en de SH-groep cysteïne. Voorbeelden van elektrofiele groepen zijn metaalionen, bijvoorbeeld Zn 2+

Een van de functies die metalen in enzymen vervullen, is dat ze werken als elektrofiele middelen. In het actieve centrum van carboxypeptidase A, dat het Zn2+-ion bevat, is dit laatste dus een elektrofiel middel dat elektronen onttrekt aan de peptidebinding van het substraat, waardoor de hydrolyse ervan wordt vergemakkelijkt.

3.5. Soorten enzymatische reacties. Op basis van het aantal deelnemers worden enzymatische reacties onderverdeeld in reacties met één substraat en reacties met twee substraten. Reacties met een groot aantal substraten zijn vrij zeldzaam. Het meest voorkomende type enzymatische reactie is een tweesubstraatreactie met de vorming van twee producten: A + B ⇆ C + D. Ongeveer 60% van alle bekende reacties, vooral groepsoverdrachtsreacties, behoort tot dit type.

Reacties met één substraat en één product zijn zeldzaam; voorbeelden hiervan zijn isomerisatiereacties, in het bijzonder glucose-1-fosfaat ⇆ glucose-6-fosfaat. Veel reacties liggen echter qua eigenschappen dicht bij reacties met één substraat. Dit wordt waargenomen in gevallen waarin de concentratie van slechts één van de twee substraten varieert. Hydrolytische reacties kunnen bijvoorbeeld als een enkel substraat worden beschouwd, omdat de concentratie van het tweede substraat - water - als constant kan worden beschouwd; tijdens de reactie neemt deze onbeduidend af.

Enkelvoudige substraatreacties zijn in wezen unimoleculaire chemische reacties (A-P). De meeste behoren tot reacties van de eerste orde, omdat de reactiesnelheid evenredig is met de concentratie van slechts één reactant. De volgorde van de reactie wordt bepaald door de aard van de afhankelijkheid van de concentratie van het substraat. De snelheid van een monomoleculaire reactie hoeft niet afhankelijk te zijn van de concentratie van het substraat (als deze in overmaat is), dan zal de reactievolgorde nul zijn (V=ko, waarbij k 0 de snelheidsconstante is van de nulde orde reactie).

Eerste-ordereacties omvatten ook bimoleculaire (twee-substraat)reacties. Dit gebeurt wanneer de concentratie van een van de substraten erg hoog is in vergelijking met de concentratie van de andere, zoals in het geval van hydrolysereacties. De meeste bimoleculaire reacties zijn reacties van de tweede orde omdat hun snelheid evenredig is met de concentratie van de twee reactanten of, minder vaak, met het kwadraat van de substraatconcentratie.

3.6. Meerdere moleculaire vormen van enzymen en iso-enzymen.

Onder meerdere moleculaire vormen van enzymen (MMEF) wordt verstaan ​​een groep enzymen die een identieke katalytische functie vervullen in één biologische soort, maar verschillen in structuur en een aantal fysisch-chemische eigenschappen. Om MMFF te scheiden worden meestal verschillende varianten van de elektroforesemethode gebruikt, gevolgd door specifieke identificatie van zones die dezelfde enzymatische activiteit hebben. In elektroferogrammen worden de zones van MMFF-activiteit aangegeven met Arabische cijfers in volgorde van afnemende anodische mobiliteit.

Alle MMFF's zijn onderverdeeld in zes klassen.

1. Genetisch onafhankelijke eiwitten. Dit zijn enzymen die op verschillende genen worden gesynthetiseerd. In meercellige organismen worden ze vaak gekenmerkt door verschillende intracellulaire weefsellokalisatie: bijvoorbeeld pyruvaatkinase, enolase, fructosedifosfaataldolase in spier- en leverweefsels, malaatdehydrogenase en een aantal aminotransferasen in mitochondriën en cytosol.

2. Heteropolymeren(hybriden) van twee of meer polypeptideketens die niet-covalent zijn verbonden. Voorbeelden van moleculaire vormen van enzymen van deze klasse zijn LDH, alcoholdehydrogenase en creatinekinase.

3. Genetische varianten(allelozymen). Allelozymen worden aangetroffen in organismen die heterozygoot zijn voor de genen die voor dit enzym coderen. Deze klasse omvat mutante vormen van enzymen. Dit is een zeer grote klasse van moleculaire vormen van enzymen, waaronder bijvoorbeeld glucose-6-fosfaat - menselijke dehydrogenase, adenosinedeaminase en vele andere.

4. Geconjugeerde of afgeleide eiwitten. Deze klasse van MMFF's omvat vormen van enzymen die worden gevormd als gevolg van de covalente toevoeging of verwijdering van specifieke groepen aan (uit) een eiwit. Dergelijke modificaties gaan gewoonlijk gepaard met veranderingen in de enzymatische activiteit en enkele fysisch-chemische eigenschappen van het enzym. De modificatie kan bestaan ​​uit fosforylatie - defosforylering (glycogeenfosforylase, glycogeensynthase, fructosedifosfatase), adenylatie - deadenylatie (glutaminesynthetase uit E coli), oxidatie van sulfhydrylgroepen (xanthineoxidase, lipoyldehydrogenase), glycosylatie (variatie in het aantal koolhydraatresiduen wordt aangetoond voor β-glucuronidase uit runderlever, glucoseoxidase uit Penicilliumvitale, DNase en RNase uit runderpancreas), amidatie van aspargine en glutamineresiduen (ongelijke mate van amidering werd gevonden in alkalisch protease van Streptomyces rectus), splitsing van peptidebindingen door proteasen (aldolase).

5. Oligomeren met enkele subeenheid. Als een enzym een ​​quaternaire structuur heeft, kunnen verschillende moleculaire vormen ontstaan ​​als gevolg van de combinatie van een verschillend aantal identieke polypeptideketens in de quaternaire structuur. B-glucosidase is dus actief in de vorm van een mono-, di-, tetra- en octameer. Voor glutamaatdehydrogenase, cholinesterase en een aantal andere enzymen zijn verschillende graden van oligomericiteit geïdentificeerd als de oorzaak van het optreden van MMFF.

6. Conformationeel verschillende vormen(conformeerders). Conformers zijn eiwitten die qua conformatie verschillen met dezelfde aminozuursequentie. Verschillen in de ruimtelijke structuur van het eiwit, geassocieerd met het aantal geladen groepen op het oppervlak van het molecuul, leiden tot ongelijke elektroforetische mobiliteit. Klasse 6 omvat ook alle allosterisch gemodificeerde enzymen.

De term MMFF kan dus worden gebruikt als de meest algemene term voor een groep enzymen die in één biologische soort voorkomen en dezelfde specificiteit van werking hebben. Het moet worden gebruikt ongeacht de reden voor hun uiterlijk. De term iso-enzym of iso-enzym is alleen van toepassing op die MMFF's waarvan het uiterlijk verband houdt met genetisch bepaalde verschillen in de primaire structuur (klassen 1-3), en niet met die die om andere redenen te wijten zijn aan dezelfde primaire structuur (klassen 4-6).

Denaturatie, oorzaken en symptomen, gebruik in de geneeskunde.

Eiwitten zijn gevoelig voor invloeden van buitenaf. Schending van de ruimtelijke structuur van eiwitten wordt denaturatie genoemd. In dit geval verliest het eiwit al zijn biologische en fysisch-chemische eigenschappen. Denaturatie gaat gepaard met het verbreken van bindingen die de ‘natieve’ structuur van het eiwit stabiliseren. Zoals hierboven opgemerkt, speelt zwakke interactie de hoofdrol bij het stabiliseren van de structuur van eiwitten, dus denaturatie kan door verschillende factoren worden veroorzaakt: verwarming, bestraling, mechanisch schudden, afkoeling, blootstelling aan chemicaliën. Tijdens denaturatie wordt in de regel ook de oplosbaarheid van eiwitten aangetast, omdat een schending van de structuur leidt tot het verschijnen op het oppervlak van een groot aantal hydrofobe groepen, meestal verborgen in het midden van het eiwitmolecuul.

De primaire structuur van een eiwit verandert niet tijdens denaturatie, wat het mogelijk maakte om de mogelijkheid aan te tonen om de functies en structuur van een gedenatureerd eiwit te herstellen, hoewel denaturatie in de meeste gevallen een onomkeerbaar proces is. In de laboratoriumpraktijk wordt denaturatie gebruikt om biologische vloeistoffen te deproteïnen. Factoren die denaturatie veroorzaken, worden denaturerende middelen genoemd. Deze omvatten:

1. Verwarming en bestraling met hoge energie (ultraviolet, röntgenstraling, neutronen, enz.). Het is gebaseerd op de excitatie van atomaire trillingen, vergezeld van het verbreken van bindingen.

2. Werking van zuren en logen; verander de dissociatie van groepen, verminder het aantal ionische bindingen.

3. Zware metaalionen. Ze vormen complexe verbindingen met eiwitgroepen, wat gepaard gaat met het verbreken van zwakke interacties.

4. Reductiemiddelen - veroorzaken het scheuren van disulfidebruggen.

5. Ureum, guanidiniumchloride - vormen nieuwe waterstofbruggen en verbreken oude. Het fenomeen denaturatie kan ook worden gebruikt voor kwalitatieve analyse van de aanwezigheid van eiwitten in oplossingen. Gebruik hiervoor een monster waarbij de te testen vloeistof kookt nadat deze is aangezuurd. De resulterende troebelheid is te wijten aan denaturatie van eiwitten. Ook wordt vaak gebruik gemaakt van neerslag met organische zuren: sulfosalicylzuur of trichloorazijnzuur.

Een korte geschiedenis van de enzymologie.

De toekenning van de Nobelprijs aan J. Sumner, J. Northrop en Stanley in 1946 markeerde het einde van een lange periode van ontwikkeling van de enzymologie – de wetenschap van enzymen. Het begin van deze wetenschap gaat terug tot het begin van de geschiedenis van de ontwikkeling van de mensheid, die in haar leven een aantal technologische enzymatische processen gebruikt: brood bakken, wijnmaken, verwerking van dierenhuiden, enz. De noodzaak om deze processen te verbeteren werd de aanzet voor hun diepgaande studie. De eerste wetenschappelijke beschrijvingen van enzymatische processen omvatten de beschrijving van de vertering bij dieren. René Antoine Reaumur (1683-1757) ging bij het opzetten van zijn experimenten uit van de aanname van Faulkner dat roofvogels onverteerde voedselresten uitbraken. Reaumur maakte een kleine draadcapsule waarin hij een stuk vlees plaatste en dat aan een buizerd gaf om in te pikken. Na 24 uur spuugde de vogel deze capsule uit. Er bleef een zacht stukje voedsel in zitten, dat echter niet bederfde. “Dit proces kan alleen het resultaat zijn van de werking van een soort oplosmiddel”, concludeerde Reaumur. Lazzaro Spallanzani (1729-1799), hoogleraar natuurlijke historie aan de Universiteit van Padua, rapporteerde soortgelijke experimenten. Hij beschouwde de vertering echter niet als een fermentatieproces, om de eenvoudige reden dat er geen gasbellen gevormd werden.

Later werd het fermentatieproces nader bestudeerd door een van de grondleggers van de moderne chemie, Antoine Laurent Lavoisier (1743-1794). Terwijl hij de alcoholische gisting bestudeerde die plaatsvindt tijdens de productie van wijn, ontdekte hij dat glucose wordt omgezet in alcohol en koolstofdioxide.

Aan het begin van de 19e eeuw. De heersende algemene opvatting was dat fermentatie een chemische verandering was die teweeggebracht werd door bepaalde gespecialiseerde vormen van organisch materiaal, namelijk "enzymen". In 1814 toonde de Russische wetenschapper (Duits van geboorte), academicus van de Academie van Wetenschappen van St. Petersburg Konstantin Gottlieb Sigismund Kirchhoff (1764-1833) aan dat de vorming van suiker uit zetmeel in gekiemde graankorrels het gevolg is van een chemisch proces en niet van de uiterlijk van spruiten. In 1810 isoleerde Yu.Gay-Lussac de belangrijkste eindproducten van gistactiviteit: alcohol en kooldioxide. J. Berzelius, een van de grondleggers van de theorie van chemische katalyse en auteur van de term ‘katalyse’ zelf in 1835, bevestigt deze gegevens en merkt op dat diastase (extract uit mout) de hydrolyse van zetmeel effectiever katalyseert dan mineraal zwavelzuur. . Een belangrijke rol in de ontwikkeling van de enzymologie werd gespeeld door het geschil tussen Yu Liebig en de beroemde microbioloog L. Pasteur, die geloofde dat fermentatieprocessen alleen in een hele levende cel kunnen plaatsvinden. J. Liebig geloofde daarentegen dat biologische processen worden veroorzaakt door de werking van chemicaliën, die later enzymen werden genoemd. De term enzym (Grieks en - in, zyme - gist) werd in 1878 voorgesteld door Friedrich Wilhelm Kühne om te benadrukken dat het proces plaatsvindt in de gist, en niet in de gist zelf, die het fermentatieproces katalyseert. In 1897 verkreeg E. Buchner echter een celvrij gistextract dat ethanol kon produceren en bevestigde de mening van Liebig.

Pogingen om een ​​van de belangrijke eigenschappen van enzymen, specificiteit, te verklaren, leidden er in 1894 toe dat de Duitse scheikundige en biochemicus E. Fischer een model van interactie tussen het enzym en het substraat voorstelde, genaamd het “sleutelslot” – geometrische complementariteit van de vormen van het substraat (sleutel) en het enzym (slot). In 1926 bewees J. Sumner, na bijna negen jaar onderzoek, de eiwitaard van het urease-enzym. In dezelfde jaren wezen J. Northrop en M. Kunitz op een directe correlatie tussen de activiteit van kristallijn pepsine, trypsine en de hoeveelheid eiwit in de bestudeerde monsters, waardoor ze significant bewijs leverden van de eiwitaard van de enzymen, hoewel de uiteindelijke bewijs werd verkregen na het bepalen van de primaire structuur en de kunstmatige synthese van een aantal enzymen. Basisideeën over enzymen werden al in de tweede helft van de twintigste eeuw verkregen. In 1963 werd de aminozuursequentie van RNase uit de pancreas bestudeerd. In 1965 werd de ruimtelijke structuur van lysozym aangetoond. In de daaropvolgende jaren werden duizenden enzymen gezuiverd en werden er veel nieuwe gegevens verkregen over de werkingsmechanismen van enzymen, hun ruimtelijke structuur en de regulatie van door enzymen gekatalyseerde reacties. Katalytische activiteit werd ontdekt in RNA (ribozymen). Er werden antilichamen met enzymatische activiteit – abzymen – verkregen. Dit hoofdstuk introduceert kort moderne ideeën over de structuur, het werkingsmechanisme en de medische aspecten van enzymologie.

Kenmerken van enzymatische katalyse.

1. Eiwitkarakter van de katalysator

2. Uitzonderlijk hoog rendement. De efficiëntie van biologische katalyse overtreft de efficiëntie van anorganische katalyse met 10 9 - 10 12

3. Uitzonderlijk hoge specificiteit:

a) absoluut, wanneer het enzym alleen met zijn substraat werkt (fumarase met trans-isomeren van fumaarzuur en niet met cis-isomeren);

b) groep - specifiek voor een smalle groep verwante substraten (gastro-intestinale enzymen).

4. Werkt onder milde omstandigheden (t=37, pH 7,0, bepaalde osmolariteit en zoutsamenstelling).

5. Regulatie op meerdere niveaus: regulering van activiteit op het niveau van omgevingsomstandigheden, op metabolonniveau, op genetisch niveau, weefsel, cellulair, met behulp van hormonen en mediatoren, evenals met behulp van substraten en producten van de reactie die ze katalyseren.

6. Coöperatie: enzymen zijn in staat associaties te organiseren - het product van het eerste enzym is een substraat voor het tweede; het product van de 2e is een substraat voor de 3e, enz.

Bovendien zijn enzymen aanpasbaar, dat wil zeggen dat ze hun activiteit kunnen veranderen en nieuwe associaties kunnen vormen.

7. In staat om zowel voorwaartse als achterwaartse reacties te katalyseren. De richting van de reactie wordt voor veel enzymen bepaald door de verhouding van de werkende massa's.

8. Katalyse is strikt gepland, dat wil zeggen dat het in fasen plaatsvindt.

Specificiteit van enzymwerking.

De hoge specificiteit van enzymen is te danken aan de conformationele en elektrostatische complementariteit tussen de moleculen van het substraat en het enzym en de unieke structuur van het actieve centrum van het enzym, wat zorgt voor ‘herkenning’, hoge affiniteit en selectiviteit voor het voorkomen van een bepaalde stof. reactie.

Afhankelijk van het werkingsmechanisme worden enzymen met relatieve of groepsspecificiteit en met absolute specificiteit onderscheiden.

Voor de werking van sommige hydrolytische enzymen is het type chemische binding in het substraatmolecuul van het grootste belang. Pepsine breekt bijvoorbeeld eiwitten van dierlijke en plantaardige oorsprong af, hoewel ze qua chemische structuur, samenstelling en fysiologische eigenschappen kunnen verschillen. Pepsine breekt echter geen koolhydraten en vetten af. Dit wordt verklaard door het feit dat de werkingsplaats van pepsine de peptidebinding is. Voor de werking van lipase is een dergelijke plaats de esterbinding van vetten.

Dat wil zeggen dat deze enzymen relatieve specificiteit hebben.

Absolute specificiteit van de werking wordt het vermogen van een enzym genoemd om de transformatie van slechts één enkel substraat te katalyseren, en eventuele veranderingen in de structuur van het substraat maken het ontoegankelijk voor de werking van het enzym. Bijvoorbeeld: arginase, dat arginine afbreekt; urease, dat de afbraak van ureum katalyseert.

Er is bewijs voor het bestaan ​​van stereochemische specificiteit vanwege het bestaan ​​van optisch isomere L- en D-vormen of geometrische (cis- en trans-) isomeren

Zo zijn de oxidasen L en Da/k bekend.

Als er een verbinding bestaat in de vorm van cis- en trans-isomeren, dan is er voor elk van deze vormen zijn eigen enzym. Fumarase katalyseert bijvoorbeeld alleen de omzetting van fumaarzuur (trans), maar werkt niet in op het cis-isomeer, maleïnezuur.