Ang mga mekanismo ng enzymatic catalysis ay tinutukoy ng papel ng mga functional na grupo ng aktibong sentro ng enzyme sa kemikal na reaksyon ng pag-convert ng substrate sa produkto. Mayroong 2 pangunahing mekanismo ng enzymatic catalysis: acid-base catalysis at covalent catalysis.

1. Acid-base catalysis

Ang konsepto ng acid-base catalysis ay nagpapaliwanag ng aktibidad ng enzymatic sa pamamagitan ng partisipasyon ng mga acidic na grupo (proton donor) at/o basic group (proton acceptors) sa isang kemikal na reaksyon. Ang acid-base catalysis ay isang pangkaraniwang pangyayari. Ang mga residue ng amino acid na bumubuo sa aktibong sentro ay may mga functional na grupo na nagpapakita ng mga katangian ng parehong mga acid at base.

Ang mga amino acid na kasangkot sa acid-base catalysis ay pangunahing kinabibilangan ng Cys, Tyr, Ser, Lys, Glu, Asp at His. Ang mga radikal ng mga amino acid na ito sa protonated form ay mga acid (proton donors), sa deprotonated form sila ay mga base (proton acceptors). Ang pag-aari na ito ng mga aktibong pangkat na gumagana sa site ay gumagawa ng mga enzyme na kakaibang biological catalyst, kabaligtaran sa mga nonbiological catalyst na maaaring magpakita ng acidic o basic na katangian. Ang covalent catalysis ay batay sa pag-atake ng nucleophilic (negatively charged) o electrophilic (positively charged) na mga grupo ng aktibong sentro ng enzyme ng mga substrate molecule na may pagbuo ng isang covalent bond sa pagitan ng substrate at ng coenzyme o ang functional group ng amino acid residue (karaniwan ay isa) ng aktibong sentro ng enzyme.

Ang pagkilos ng serine protease, tulad ng trypsin, chymotrypsin at thrombin, ay isang halimbawa ng mekanismo ng covalent catalysis, kapag ang isang covalent bond ay nabuo sa pagitan ng substrate at ng serine amino acid na nalalabi ng aktibong site ng enzyme.

25. Ang complementarity ay tumutukoy sa spatial at kemikal na pagsusulatan ng mga nakikipag-ugnayang molekula. Ang ligand ay dapat magkaroon ng kakayahang pumasok at spatially na tumutugma sa conformation ng aktibong site. Maaaring hindi kumpleto ang pagkakataong ito, ngunit dahil sa conformational lability ng protina, ang aktibong sentro ay may kakayahang maliit na pagbabago at "nababagay" sa ligand. Bilang karagdagan, sa pagitan ng mga functional na grupo ng ligand at mga amino acid radical na bumubuo sa aktibong sentro, ang mga bono ay dapat lumitaw na humahawak sa ligand sa aktibong sentro. Ang mga bono sa pagitan ng ligand at ang aktibong sentro ng protina ay maaaring alinman sa non-covalent (ionic, hydrogen, hydrophobic) o covalent.

Ang katotohanan na ang mga enzyme ay may mataas na pagtitiyak ay nagpapahintulot sa amin na maglagay ng isang hypothesis noong 1890, ayon sa kung saan ang aktibong sentro ng enzyme ay pantulong sa substrate, i.e. tumutugma dito tulad ng isang "susi sa isang kandado". Pagkatapos ng pakikipag-ugnayan ng substrate ("key") sa aktibong sentro ("lock"), nangyayari ang mga pagbabagong kemikal ng substrate sa produkto. Ang aktibong sentro ay itinuturing na isang matatag, mahigpit na tinutukoy na istraktura.

Ang substrate, na nakikipag-ugnayan sa aktibong sentro ng enzyme, ay nagdudulot ng pagbabago sa conform nito, na humahantong sa pagbuo ng isang enzyme-substrate complex, na kanais-nais para sa mga pagbabago sa kemikal ng substrate. Kasabay nito, binabago din ng molekula ng substrate ang conformation nito, na nagsisiguro ng mas mataas na kahusayan ng reaksyon ng enzymatic. Ang "induced correspondence hypothesis" na ito ay kasunod na nakumpirma sa eksperimento.

26. Ang mga enzyme na nag-catalyze sa parehong kemikal na reaksyon, ngunit naiiba sa pangunahing istraktura ng protina, ay tinatawag na isoenzymes, o isoenzymes. Pinagsasama nila ang parehong uri ng reaksyon na may pangunahing magkaparehong mekanismo, ngunit naiiba sa bawat isa sa mga kinetic na parameter, mga kondisyon ng pag-activate, at mga tampok ng koneksyon sa pagitan ng apoenzyme at ng coenzyme. Ang likas na katangian ng hitsura ng mga isoenzymes ay iba-iba, ngunit kadalasan dahil sa mga pagkakaiba sa istruktura ng mga gene na naka-encode sa mga isoenzyme na ito. Dahil dito, ang mga isoenzyme ay naiiba sa pangunahing istraktura ng molekula ng protina at, nang naaayon, sa mga katangian ng physicochemical. Ang mga pamamaraan para sa pagtukoy ng mga isoenzyme ay batay sa mga pagkakaiba sa mga katangian ng physicochemical. Sa kanilang istraktura, ang mga isoenzyme ay pangunahing mga oligomeric na protina. Enzyme lactate dehydrogenase(LDH) catalyzes ang reversible oxidation reaction ng lactate (lactic acid) sa pyruvate (pyruvic acid).

Binubuo ito ng 4 na subunit ng 2 uri: M at H. Ang kumbinasyon ng mga subunit na ito ay sumasailalim sa pagbuo ng 5 isoform ng lactate dehydrogenase. Ang LDH 1 at LDH 2 ay pinaka-aktibo sa kalamnan ng puso at bato, LDH4 at LDH5 - sa mga kalamnan ng kalansay at atay. Ang iba pang mga tisyu ay naglalaman ng iba't ibang anyo ng enzyme na ito. Ang mga LDH isoform ay naiiba sa electrophoretic mobility, na ginagawang posible upang matukoy ang tissue identity ng LDH isoforms.

Creatine kinase (CK) catalyzes ang pagbuo ng creatine phosphate:

Ang molekula ng KK ay isang dimer na binubuo ng dalawang uri ng mga subunit: M at B. Mula sa mga subunit na ito, 3 isoenzymes ang nabuo - BB, MB, MM. Ang BB isoenzyme ay pangunahing matatagpuan sa utak, MM sa skeletal muscles, at MB sa cardiac muscle. Ang mga isoform ng KK ay may iba't ibang electrophoretic mobility. Ang aktibidad ng CK ay karaniwang hindi dapat lumampas sa 90 IU/l. Ang pagpapasiya ng aktibidad ng CK sa plasma ng dugo ay may diagnostic na halaga sa kaso ng myocardial infarction (mayroong pagtaas sa antas ng MB isoform). Ang dami ng MM isoform ay maaaring tumaas sa panahon ng trauma at pinsala sa mga kalamnan ng kalansay. Ang BB isoform ay hindi maaaring tumagos sa blood-brain barrier, samakatuwid ito ay halos hindi matukoy sa dugo kahit na sa panahon ng mga stroke at walang diagnostic value.

27. ENZYMATIVE CATALYSIS (biocatalysis), pagpapabilis ng biochemical. r-tions na may partisipasyon ng protina macromolecules tinatawag mga enzyme(mga enzyme). F.k. - iba't-ibang catalysis.

Michaelis-Menten equation: - ang pangunahing equation ng enzyme kinetics, ay naglalarawan ng dependence ng rate ng reaksyon na na-catalyze ng isang enzyme sa konsentrasyon ng substrate at enzyme. Ang pinakasimpleng kinetic scheme kung saan wasto ang Michaelis equation:

Ang equation ay mukhang:

,

Kung saan: - maximum na rate ng reaksyon, katumbas ng ; - Michaelis constant, katumbas ng konsentrasyon ng substrate kung saan ang rate ng reaksyon ay kalahati ng maximum; - konsentrasyon ng substrate.

Michaelis constant: Relasyon sa pagitan ng rate constants

ay pare-pareho din ( K m).

28. "pagbabawal ng aktibidad ng enzymatic" - isang pagbaba sa catalytic na aktibidad sa pagkakaroon ng ilang mga sangkap - mga inhibitor. Ang mga inhibitor ay dapat magsama ng mga sangkap na nagdudulot ng pagbaba sa aktibidad ng enzyme. Nababaligtad na mga inhibitor magbigkis sa enzyme na may mahinang non-covalent bond at, sa ilalim ng ilang kundisyon, ay madaling mahihiwalay sa enzyme. May mga reversible inhibitors mapagkumpitensya at hindi mapagkumpitensya. Patungo sa mapagkumpitensyang pagsugpo isama ang isang nababaligtad na pagbaba sa rate ng isang reaksyong enzymatic na dulot ng isang inhibitor na nagbubuklod sa aktibong site ng enzyme at pinipigilan ang pagbuo ng isang enzyme-substrate complex. Ang ganitong uri ng pagsugpo ay sinusunod kapag ang inhibitor ay isang structural analogue ng substrate, na nagreresulta sa kompetisyon sa pagitan ng substrate at inhibitor molecules para sa isang lugar sa aktibong sentro ng enzyme. Hindi mapagkumpitensya tinatawag na pagsugpo sa isang reaksyong enzymatic kung saan nakikipag-ugnayan ang inhibitor sa enzyme sa isang site maliban sa aktibong site. Ang mga noncompetitive inhibitors ay hindi mga structural analogues ng substrate. Hindi maibabalik na pagsugpo naobserbahan sa kaso ng pagbuo ng covalent stable bonds sa pagitan ng inhibitor molecule at ng enzyme. Kadalasan, binago ang aktibong sentro ng enzyme. Bilang resulta, hindi maaaring gumanap ang enzyme ng catalytic function. Kabilang sa mga hindi maibabalik na inhibitor ang mga heavy metal ions, tulad ng mercury (Hg 2+), silver (Ag +) at arsenic (As 3+). Mga sangkap na humaharang sa ilang mga grupo ng aktibong sentro ng mga enzyme - tiyak At. Diisopropyl fluorophosphate (DFP). Ang Iodine acetate at p-chloromercuribenzoate ay madaling tumugon sa mga pangkat ng SH ng mga labi ng cysteine ​​sa mga protina. Ang mga inhibitor na ito ay inuri bilang hindi tiyak. Sa hindi mapagkumpitensya Sa pagsugpo, ang inhibitor ay nagbubuklod lamang sa enzyme-substrate complex at hindi sa libreng enzyme.

Sukat KI= [E]. [I]/, na siyang dissociation constant ng enzyme-inhibitor complex, ay tinatawag na inhibition constant.

Ang mga base ng quaternary ammonium ay pumipigil sa acetylcholinesterase, na nag-catalyze sa hydrolysis ng acetylcholine sa choline at acetic acid.

Mga sangkap na tinatawag mga antimetabolite. Ang mga compound na ito, bilang structural analogs ng mga natural na substrate, ay nagdudulot ng mapagkumpitensyang pagsugpo ng mga enzyme, sa isang banda, at, sa kabilang banda, ay maaaring gamitin ng parehong mga enzyme bilang pseudosubstrates. Mga gamot na sulfonamide (mga analogue ng para-aminobenzoic acid) na ginagamit upang gamutin ang mga nakakahawang sakit.

Ang isang halimbawa ng isang gamot na ang pagkilos ay batay sa hindi maibabalik na pagsugpo sa enzyme ay ang gamot aspirin.

Ang pagsugpo sa enzyme cyclooxygenase, na nag-catalyze sa pagbuo ng mga prostaglandin mula sa arachidonic acid.

29. Ang regulasyon ng rate ng mga reaksyon ng enzymatic ay isinasagawa sa 3 independyenteng antas:

1. pagbabago ng bilang ng mga molekula ng enzyme;

1. pagkakaroon ng substrate at coenzyme molecule;
2. isang pagbabago sa catalytic na aktibidad ng molekula ng enzyme.

1. Ang bilang ng mga molekula ng enzyme sa isang cell ay tinutukoy ng ratio ng 2 proseso - synthesis at pagkasira ng molekula ng protina ng enzyme.

2. Kung mas mataas ang konsentrasyon ng paunang substrate, mas mataas ang bilis ng metabolic pathway. Ang isa pang parameter na naglilimita sa kurso ng metabolic pathway ay ang presensya regenerated coenzymes. Ang pinakamahalagang papel sa pagbabago ng bilis ng mga metabolic pathway ay ang regulasyon ng catalytic na aktibidad ng isa o higit pang mga pangunahing enzyme ng isang naibigay na metabolic pathway. Ito ay isang napaka-epektibo at mabilis na paraan upang ayusin ang metabolismo. Ang mga pangunahing paraan upang makontrol ang aktibidad ng enzyme ay: allosteric regulation; regulasyon sa pamamagitan ng pakikipag-ugnayan ng protina-protina; regulasyon sa pamamagitan ng phosphorylation/dephosphorylation ng molekula ng enzyme; regulasyon sa pamamagitan ng bahagyang (limitadong) proteolysis.

Ang pagtaas ng temperatura sa ilang mga limitasyon ay nakakaapekto sa rate ng enzymatic

reaksyon, katulad ng epekto ng temperatura sa anumang kemikal na reaksyon. Habang tumataas ang temperatura, bumibilis ang paggalaw ng mga molekula, na humahantong sa pagtaas ng posibilidad ng pakikipag-ugnayan sa pagitan ng mga reactant. Bilang karagdagan, ang temperatura ay maaaring tumaas ang enerhiya ng mga molecule na tumutugon, na nagpapabilis din sa reaksyon. Gayunpaman, ang rate ng isang kemikal na reaksyon na na-catalyze ng mga enzyme ay may sarili nitong pinakamainam na temperatura, na lumalampas sa kung saan ay sinamahan ng pagbaba sa aktibidad ng enzymatic.

Para sa karamihan ng mga enzyme ng tao, ang pinakamainam na temperatura ay 37-38 °C.

Ang aktibidad ng mga enzyme ay nakasalalay sa pH ng solusyon kung saan nangyayari ang reaksyon ng enzymatic. Para sa bawat enzyme mayroong isang halaga ng pH kung saan ang pinakamataas na aktibidad nito ay sinusunod. Ang paglihis mula sa pinakamainam na halaga ng pH ay humahantong sa pagbawas sa aktibidad ng enzymatic.

Ang epekto ng pH sa aktibidad ng enzyme ay nauugnay sa ionization ng mga functional na grupo ng mga residue ng amino acid ng isang naibigay na protina, na tinitiyak ang pinakamainam na conformation ng aktibong sentro ng enzyme. Kapag nagbago ang pH mula sa pinakamainam na halaga, nagbabago ang ionization ng mga functional na grupo ng molekula ng protina. Karamihan sa mga enzyme sa katawan ng tao ay may pinakamainam na pH na malapit sa neutral, na tumutugma sa halaga ng physiological pH.

30. Allosteric Ang mga enzyme ay mga enzyme na ang aktibidad ay kinokontrol hindi lamang ng bilang ng mga molekula ng substrate, kundi pati na rin ng iba pang mga sangkap na tinatawag na mga effectors. Ang mga effector na kasangkot sa allosteric regulation ay mga cellular metabolites na madalas sa mismong pathway na kanilang kinokontrol.

Ang mga allosteric enzyme ay gumaganap ng isang mahalagang papel sa metabolismo, dahil ang mga ito ay mabilis na tumutugon sa pinakamaliit na pagbabago sa panloob na estado ng cell. Malaki ang kahalagahan ng mga ito sa mga sumusunod na sitwasyon: sa panahon ng mga anabolic na proseso, sa panahon ng mga proseso ng catabolic, para sa koordinasyon ng mga anabolic at catabolic pathway. Ang ATP at ADP ay mga allosteric effector na kumikilos bilang mga antagonist; upang i-coordinate ang parallel at interconnected metabolic pathways (halimbawa, ang synthesis ng purine at pyrimidine nucleotides na ginagamit para sa synthesis ng mga nucleic acid).

Ang isang effector na nagdudulot ng pagbaba (inhibition) ng aktibidad ng enzyme ay tinatawag negatibo effector o inhibitor. Ang isang effector na nagdudulot ng pagtaas (pag-activate) ng aktibidad ng enzyme ay tinatawag positibo effector o activator. Ang iba't ibang mga metabolite ay madalas na nagsisilbing allosteric effectors.

Mga tampok ng istraktura at paggana ng allosteric enzymes: kadalasan ang mga ito ay mga oligomeric na protina na binubuo ng ilang mga protomer o may istraktura ng domain; mayroon silang isang allosteric center, spatially na malayo sa catalytic active center; ang mga effector ay nakakabit sa enzyme na non-covalently sa allosteric (regulatory) center; allosteric center, tulad ng mga catalytic. , ay maaaring magpakita ng iba't ibang pagtitiyak na may kaugnayan sa mga ligand: maaari itong maging ganap at pangkat. ang protomer kung saan matatagpuan ang allosteric center ay isang regulatory protomer.Ang allosteric enzymes ay may pag-aari ng cooperativity; allosteric enzymes catalyze key reaksyon sa metabolic pathway na ito.

ang pangwakas na produkto ay maaaring kumilos bilang isang allosteric inhibitor ng enzyme na kadalasang nag-catalyze sa paunang yugto ng metabolic pathway na ito:

Sa mga gitnang metabolic pathway, ang mga precursor ay maaaring maging activator ng mga pangunahing enzyme sa metabolic pathway.

Ang pagkakasunud-sunod ng mga kaganapan sa enzymatic catalysis ay maaaring ilarawan sa pamamagitan ng sumusunod na diagram. Una, nabuo ang isang substrate-enzyme complex. Sa kasong ito, ang isang pagbabago sa mga conformation ng molekula ng enzyme at ang molekula ng substrate ay nangyayari, ang huli ay naayos sa aktibong sentro sa isang panahunan na pagsasaayos. Ito ay kung paano nabuo ang activated complex, o estado ng paglipat, ay isang high-energy intermediate na istraktura na masigasig na hindi gaanong matatag kaysa sa mga pangunahing compound at produkto. Ang pinakamahalagang kontribusyon sa pangkalahatang catalytic effect ay ginawa ng proseso ng pagpapapanatag ng estado ng paglipat - ang pakikipag-ugnayan sa pagitan ng mga residue ng amino acid ng protina at substrate, na nasa isang panahunan na pagsasaayos. Ang pagkakaiba sa pagitan ng mga libreng halaga ng enerhiya para sa mga paunang reaksyon at estado ng paglipat ay tumutugma sa libreng enerhiya ng pag-activate (ΔG #). Ang rate ng reaksyon ay nakasalalay sa halaga (ΔG #): mas maliit ito, mas malaki ang rate ng reaksyon, at kabaliktaran. Sa esensya, ang DG ay kumakatawan sa isang "harang sa enerhiya" na dapat lampasan para maganap ang isang reaksyon. Ang pagpapatatag sa estado ng paglipat ay nagpapababa sa "barrier" o activation energy na ito. Sa susunod na yugto, ang reaksyon ng kemikal mismo ay nangyayari, pagkatapos kung saan ang mga nagresultang produkto ay inilabas mula sa enzyme-product complex.

Mayroong ilang mga kadahilanan para sa mataas na aktibidad ng catalytic ng mga enzyme, na nagpapababa sa hadlang ng enerhiya sa reaksyon.

1. Ang isang enzyme ay maaaring magbigkis ng mga molekula ng mga substrate na tumutugon sa paraang ang kanilang mga reaktibong grupo ay matatagpuan malapit sa isa't isa at mula sa mga catalytic na grupo ng enzyme (epekto rapprochement).

2. Sa pagbuo ng isang substrate-enzyme complex, ang pag-aayos ng substrate at ang pinakamainam na oryentasyon nito para sa pagsira at pagbuo ng mga bono ng kemikal ay nakakamit (epekto oryentasyon).

3. Ang pagbubuklod ng substrate ay humahantong sa pag-alis ng hydration shell nito (umiiral sa mga sangkap na natunaw sa tubig).

4. Epekto ng sapilitan na pagsusulatan sa pagitan ng substrate at enzyme.

5. Pagpapatatag ng estado ng paglipat.

6. Ang ilang mga grupo sa molekula ng enzyme ay maaaring magbigay acid-base catalysis(paglipat ng mga proton sa substrate) at nucleophilic catalysis(pagbubuo ng mga covalent bond na may substrate, na humahantong sa pagbuo ng mga istruktura na mas reaktibo kaysa sa substrate).

Ang isang halimbawa ng acid-base catalysis ay ang hydrolysis ng glycosidic bonds sa murein molecule sa pamamagitan ng lysozyme. Lysozyme ay isang enzyme na nasa mga selula ng iba't ibang hayop at halaman: sa luhang likido, laway, protina ng manok, gatas. Ang lysozyme mula sa mga itlog ng manok ay may molekular na timbang na 14,600 Da, binubuo ng isang polypeptide chain (129 amino acid residues) at may 4 na disulfide bridge, na nagsisiguro ng mataas na katatagan ng enzyme. Ang pagsusuri sa istruktura ng X-ray ng molekula ng lysozyme ay nagpakita na ito ay binubuo ng dalawang domain na bumubuo ng isang "puwang" kung saan matatagpuan ang aktibong sentro. Kasama ng "puwang" na ito ang hexosaccharide ay nagbubuklod, at ang enzyme ay may sariling site para sa pagbubuklod sa bawat isa sa anim na singsing ng asukal ng murein (A, B, C, D, E at F) (Fig. 6.4).

Ang murein molecule ay hawak sa aktibong site ng lysozyme pangunahin dahil sa hydrogen bond at hydrophobic interaction. Sa malapit sa site ng hydrolysis ng glycosidic bond, mayroong 2 residue ng amino acid ng aktibong sentro: glutamic acid, na sumasakop sa ika-35 na posisyon sa polypeptide, at aspartic acid, ang ika-52 na posisyon sa polypeptide (Fig. 6.5) .

Ang mga side chain ng mga residue na ito ay matatagpuan sa magkabilang ibabaw ng "cleft" na malapit sa inatake na glycosidic bond-sa layo na humigit-kumulang 0.3 nm. Ang glutamate residue ay nasa isang non-polar na kapaligiran at hindi ionized, at ang aspartate residue ay nasa isang polar na kapaligiran; ang carboxyl group nito ay deprotonated at nakikilahok bilang hydrogen acceptor sa isang komplikadong network ng hydrogen bonds.

Ang proseso ng hydrolysis ay isinasagawa bilang mga sumusunod. Ang protonated carboxyl group ng Glu-35 residue ay nagbibigay ng proton nito sa glycosidic oxygen atom, na humahantong sa pagkaputol ng bond sa pagitan ng oxygen atom na ito at ng C 1 atom ng sugar ring na matatagpuan sa site D (yugto ng pangkalahatang acid catalysis ). Bilang resulta, nabuo ang isang produkto na kinabibilangan ng mga singsing ng asukal na matatagpuan sa mga rehiyon E at F, na maaaring ilabas mula sa complex na may enzyme. Ang conformation ng sugar ring na matatagpuan sa rehiyon D ay distorted, na kumukuha sa conformation kalahating upuan, kung saan ang lima sa anim na atomo na bumubuo sa singsing ng asukal ay halos nasa parehong eroplano. Ang istrukturang ito ay tumutugma sa pagbabago ng estado ng paglipat. Sa kasong ito, ang C 1 atom ay lumalabas na positibong sisingilin at ang intermediate na produkto ay tinatawag na carbonium ion (carbocation). Ang libreng enerhiya ng estado ng paglipat ay bumababa dahil sa pag-stabilize ng carbonium ion ng deprotonated carboxyl group ng Asp-52 residue (Fig. 6.5).

Sa susunod na yugto, ang isang molekula ng tubig ay pumapasok sa reaksyon at pinapalitan ang nalalabi ng disaccharide na nagkakalat mula sa rehiyon ng aktibong sentro. Ang proton ng molekula ng tubig ay napupunta sa Glu-35, at ang hydroxyl ion (OH -) sa C 1 atom ng carbonium ion (yugto ng pangkalahatang pangunahing catalysis). Bilang isang resulta, ang pangalawang fragment ng cleaved polysaccharide ay nagiging isang produkto ng reaksyon (conformation ng upuan) at umalis sa aktibong rehiyon ng sentro, at ang enzyme ay bumalik sa orihinal na estado nito at handang isagawa ang susunod na reaksyon ng cleavage ng disaccharide (Fig. 6.5). .

Ang mekanismo ng pagkilos ng mga enzyme ay maaaring isaalang-alang mula sa dalawang posisyon: mula sa punto ng view ng mga pagbabago sa enerhiya ng mga reaksiyong kemikal at mula sa punto ng view ng mga kaganapan sa aktibong sentro.

A. Nagbabago ang enerhiya sa panahon ng mga reaksiyong kemikal

Ang anumang reaksiyong kemikal ay nagpapatuloy alinsunod sa dalawang pangunahing batas ng thermodynamics: ang batas ng konserbasyon ng enerhiya at ang batas ng entropy. Ayon sa mga batas na ito, ang kabuuang enerhiya ng isang sistema ng kemikal at ang kapaligiran nito ay nananatiling pare-pareho, habang ang sistema ng kemikal ay may posibilidad na bawasan ang pagkakasunud-sunod (pagtaas ng entropy). Upang maunawaan ang enerhiya ng isang reaksiyong kemikal, hindi sapat na malaman ang balanse ng enerhiya ng mga reagent na pumapasok at lumalabas sa reaksyon; kinakailangang isaalang-alang ang mga pagbabago sa enerhiya sa panahon ng proseso ng isang naibigay na reaksyong kemikal at ang papel ng mga enzyme sa ang dynamics ng prosesong ito. Isaalang-alang ang reaksyon ng agnas ng carbonic acid:

H2CO3 → H20 + CO2.

Ang carbonic acid ay mahina; ang reaksyon ng agnas nito ay magpapatuloy sa ilalim ng normal na mga kondisyon kung ang mga molekula ng carbonic acid ay may enerhiya na lumalampas sa isang tiyak na antas, na tinatawag na activation energy Ea (Fig. 2-10).

Ang activation energy ay ang karagdagang halaga ng kinetic energy na kinakailangan para sa mga molecule ng isang substance upang mag-react.

Kapag naabot ang energy barrier na ito, ang mga pagbabago ay nagaganap sa molekula, na nagiging sanhi ng muling pamamahagi ng mga kemikal na bono at ang pagbuo ng mga bagong compound. Ang mga molekula na nagtataglay ng Ea ay sinasabing nasa transition state. Ang pagkakaiba ng enerhiya sa pagitan ng unang reactant na H2CO3 at ang huling mga compound na H2O at CO2 ay tinatawag na libreng pagbabago ng enerhiya ng reaksyong DG. Ang mga molekula ng H2O at CO2 ay mas matatag na mga sangkap kaysa sa H2CO3, i.e. may mas kaunting enerhiya at halos hindi tumutugon sa ilalim ng normal na mga kondisyon. Ang enerhiya na inilabas bilang isang resulta ng reaksyong ito ay nawawala sa anyo ng init sa kapaligiran.

Ang mas maraming mga molekula ay may enerhiya na lumalampas sa antas ng Ea, mas mataas ang rate ng reaksyong kemikal. Maaari mong taasan ang rate ng isang kemikal na reaksyon sa pamamagitan ng pag-init. Pinatataas nito ang enerhiya ng mga reacting molecule. Gayunpaman, ang mataas na temperatura ay nakakasira para sa mga buhay na organismo, kaya ang mga enzyme ay ginagamit sa mga selula upang pabilisin ang mga reaksiyong kemikal. Ang mga enzyme ay nagbibigay ng mataas na rate ng mga reaksyon sa ilalim ng pinakamainam na kondisyon na umiiral sa cell sa pamamagitan ng pagpapababa ng antas ng Ea. Kaya, binabawasan ng mga enzyme ang taas ng hadlang ng enerhiya, bilang isang resulta ang bilang ng mga reaktibong molekula ay tumataas, at samakatuwid ay tumataas ang rate ng reaksyon.

Sa mekanismo ng enzymatic catalysis, ang pagbuo ng hindi matatag na intermediate compound ay napakahalaga - ang enzyme-substrate complex na ES, na sumasailalim sa pagbabagong-anyo sa isang hindi matatag na transition complex EP, na halos agad na nawasak sa isang libreng enzyme at produkto ng reaksyon.

Kaya, ang mga biological catalysts (enzymes) ay hindi nagbabago ng libreng enerhiya.

Ang isang enzyme, na gumaganap ng function ng isang catalyst para sa isang kemikal na reaksyon, ay sumusunod sa mga pangkalahatang batas ng catalysis at may lahat ng mga katangian na katangian ng mga non-biological catalyst, ngunit mayroon ding mga natatanging katangian na nauugnay sa mga istrukturang tampok ng mga enzyme.

Ang pagkakatulad sa pagitan ng mga enzyme at non-biological catalyst ay:

Enzymes catalyze energetically posibleng reaksyon;

· ang enerhiya ng sistema ng kemikal ay nananatiling pare-pareho;

·sa panahon ng catalysis, ang direksyon ng reaksyon ay hindi nagbabago;

Ang mga enzyme ay hindi natupok sa panahon ng reaksyon.

Ang mga pagkakaiba sa pagitan ng mga enzyme at non-biological catalyst ay:

· ang rate ng mga reaksyong enzymatic ay mas mataas kaysa sa mga reaksyon na na-catalyze ng mga non-protein catalysts;

Ang mga enzyme ay lubos na tiyak;

· nagaganap ang reaksyong enzymatic sa cell, i.e. sa temperatura na 37 °C, pare-pareho ang presyon ng atmospera at pisyolohikal na pH;

Ang bilis ng reaksyon ng enzymatic ay maaaring iakma.

Mga mekanismo ng pagkilos ng enzyme

Sa pangkalahatang mga termino, ang lahat ay bumaba sa komplementaryong pakikipag-ugnayan ng enzyme at substrate. Sa kasong ito, ang mga functional na grupo ng substrate ay nakikipag-ugnayan sa kanilang kaukulang mga functional na grupo ng enzyme. Ang pagkakaroon ng pagtitiyak ng substrate ay ipinaliwanag ng dalawang hypotheses:

1. Teorya ni Fisher(modelo ng "matibay na matrix", "key-lock") - ang aktibong sentro ng enzyme ay mahigpit na tumutugma sa pagsasaayos ng substrate at hindi nagbabago kapag ito ay nakakabit. Ipinapaliwanag ng modelong ito ang ganap na pagtitiyak, ngunit hindi ang pagtitiyak ng grupo.

2. Noong 1958, iminungkahi ni Daniel Koshland ang pagbabago ng "key-lock" na modelo. Ang mga enzyme ay karaniwang hindi matibay, ngunit nababaluktot na mga molekula. Ang aktibong site ng isang enzyme ay maaaring magbago ng conformation pagkatapos magbuklod ng substrate. Ang mga pangkat sa gilid ng amino acid ng aktibong site ay nagpapalagay ng posisyon na nagpapahintulot sa enzyme na gawin ang catalytic function nito. Sa ilang mga kaso, ang molekula ng substrate ay nagbabago rin ng conform pagkatapos magbuklod sa aktibong site. Hindi tulad ng modelo ng key-lock, ipinapaliwanag ng induced-fit na modelo hindi lamang ang pagtitiyak ng mga enzyme, kundi pati na rin ang pagpapapanatag ng estado ng paglipat. Ang modelong ito ay tinatawag na "glove hand".

Kinetics ng mga reaksyong enzymatic. Depende sa rate ng mga reaksyon ng enzymatic sa temperatura, pH ng kapaligiran, mga konsentrasyon ng enzyme, at substrate. Ang konsepto ng pinakamainam na pH at temperatura, physiological at clinical diagnostic significance. Pagpapasiya ng Michaelis constant at ang klinikal at diagnostic na kahalagahan nito.

Ang kinetics ng isang enzymatic na reaksyon (ibig sabihin, ang pag-asa ng rate ng reaksyon sa mga kondisyon nito) ay pangunahing tinutukoy mga katangian ng katalista.

Pinag-aaralan ng enzyme kinetics ang mga pattern ng impluwensya ng kemikal na likas na reaksyon ng mga sangkap (enzymes, substrates) at ang mga kondisyon ng kanilang pakikipag-ugnayan (konsentrasyon, pH, temperatura, pagkakaroon ng mga activator o inhibitor) sa rate ng mga reaksyon ng enzymatic. Ang pangunahing layunin ng pag-aaral ng mga kinetika ng mga reaksyong enzymatic ay upang makakuha ng impormasyon na makakatulong sa pagpapaliwanag ng mekanismo ng molekular ng pagkilos ng enzyme.

Depende sa rate ng reaksyon ng enzymatic sa dami ng mga enzyme:

Kapag ang isang reaksyon ng enzymatic ay isinasagawa sa ilalim ng mga kondisyon ng labis na substrate, ang rate ng reaksyon ay depende sa konsentrasyon ng enzyme. Ang graphical na pag-asa ng naturang reaksyon ay may anyo ng isang tuwid na linya. Gayunpaman, ang dami ng enzyme ay kadalasang imposibleng matukoy sa ganap na mga termino, kaya sa pagsasanay ay gumagamit sila ng mga kondisyon na halaga na nagpapakilala sa aktibidad ng enzyme: isang internasyonal na yunit ng Ang aktibidad (IU) ay tumutugma sa dami ng enzyme na nag-catalyze sa conversion ng 1 µmol ng substrate sa loob ng 1 min sa ilalim ng pinakamainam na kondisyon para sa reaksyon ng enzymatic. Ang pinakamainam na kondisyon ay indibidwal para sa bawat enzyme at nakasalalay sa temperatura ng kapaligiran, ang pH ng solusyon, sa kawalan ng mga activator at inhibitor.

kanin. Depende sa akumulasyon ng produkto (A) at pagkawala ng substrate (B) sa oras (tagal) ng reaksyon. Ang rate ng isang reaksyon ng enzymatic ay tinutukoy ng pagbabago sa konsentrasyon ng produkto o substrate bawat yunit ng oras.

Ang panahon ng isang reaksyong enzymatic ay nailalarawan sa pamamagitan ng isang hindi linear na akumulasyon ng produkto (o pagkawala ng substrate) depende sa oras ng reaksyon.

yunit ng aktibidad ng enzyme: 1 katal (kat), na tumutugma sa dami ng catalyst na nagko-convert ng 1 mole ng substrate sa 1 s. Ang bilang ng mga catalyses ay tinutukoy ng formula:

Ang internasyonal na yunit ng aktibidad ng enzymatic ME ay nauugnay sa cathal sa pamamagitan ng mga sumusunod na pagkakapantay-pantay:

1 pusa = 1 mol S/c = 60 mol S/min = 60x10 6 µmol/min = 6x10 7 ME,

1 ME = 1 µmol/min = 1/60 µmol/s = 1/60 µkat = 16.67 nkat.

Sa medikal na kasanayan, ang mga internasyonal na yunit ng aktibidad - ME - ay kadalasang ginagamit upang masuri ang aktibidad ng enzyme. Upang matantya ang bilang ng mga molekula ng enzyme sa iba pang mga protina ng isang partikular na tissue, ang partikular na aktibidad (sp. ac.) ng enzyme ay tinutukoy, ayon sa bilang na katumbas ng bilang ng mga yunit ng aktibidad ng enzyme (pME) sa sample ng tissue na hinati sa masa. (mg) ng protina sa tissue na ito:

Ang partikular na aktibidad ay ginagamit upang hatulan ang paglilinis ng enzyme: ang mas kaunting mga dayuhang protina, mas mataas ang partikular na aktibidad.

Depende sa rate ng reaksyon ng enzymatic sa temperatura ng daluyan

Ang pagtaas ng temperatura sa ilang mga limitasyon ay nakakaapekto sa rate ng enzymatic reaction, katulad ng epekto ng temperatura sa anumang kemikal na reaksyon. Habang tumataas ang temperatura, bumibilis ang paggalaw ng mga molekula, na humahantong sa pagtaas ng posibilidad ng pakikipag-ugnayan sa pagitan ng mga reactant. Bilang karagdagan, ang temperatura ay maaaring tumaas ang enerhiya ng mga molecule na tumutugon, na nagpapabilis din sa reaksyon. Gayunpaman, ang rate ng isang kemikal na reaksyon na na-catalyze ng mga enzyme ay may sariling temperatura na pinakamabuting kalagayan, ang labis nito ay sinamahan ng pagbawas sa aktibidad ng enzymatic na nagreresulta mula sa thermal denaturation ng molekula ng protina.

Para sa karamihan ng mga enzyme ng tao, ang pinakamainam na temperatura ay 37-38 °C. Gayunpaman, ang mga thermostable na enzyme ay umiiral din sa kalikasan. Halimbawa, ang Taq polymerase na nakahiwalay sa mga microorganism na naninirahan sa mga hot spring ay hindi inactivate kapag tumaas ang temperatura sa 95 °C. Ang enzyme na ito ay ginagamit sa siyentipiko at praktikal na gamot para sa molecular diagnosis ng mga sakit gamit ang polymerase chain reaction (PCR) na paraan.

kanin. Pag-asa ng enzymatic reaction rate (V) sa temperatura.

Depende sa rate ng reaksyon ng enzymatic sa pH ng medium

Para sa bawat enzyme mayroong isang halaga ng pH kung saan ang pinakamataas na aktibidad nito ay sinusunod. Ang paglihis mula sa pinakamainam na halaga ng pH ay humahantong sa pagbawas sa aktibidad ng enzymatic.

Ang epekto ng pH sa aktibidad ng enzyme ay nauugnay sa ionization ng mga functional na grupo ng mga residue ng amino acid ng isang naibigay na protina, na tinitiyak ang pinakamainam na conformation ng aktibong sentro ng enzyme. Kapag nagbago ang pH mula sa pinakamainam na halaga, nagbabago ang ionization ng mga functional na grupo ng molekula ng protina. Halimbawa, kapag ang kapaligiran ay acidified, ang mga libreng amino group (NH 3 +) ay na-protonate, at kapag naganap ang alkalization, ang isang proton ay tinanggal mula sa mga carboxyl group (COO -). Ito ay humahantong sa isang pagbabago sa conformation ng enzyme molecule at ang conformation ng active center; dahil dito, ang attachment ng substrate, cofactor at coenzymes sa aktibong sentro ay nagambala. Bilang karagdagan, ang pH ng kapaligiran ay maaaring makaapekto sa antas ng ionization o spatial na organisasyon ng substrate, na nakakaapekto rin sa affinity ng substrate para sa aktibong site. Sa isang makabuluhang paglihis mula sa pinakamainam na halaga ng pH, ang denaturation ng molekula ng protina ay maaaring mangyari na may kumpletong pagkawala ng aktibidad ng enzymatic.

Ang pinakamainam na halaga ng pH ay iba para sa iba't ibang mga enzyme. Ang mga enzyme na gumagana sa ilalim ng acidic na mga kondisyon sa kapaligiran (halimbawa, pepsin sa tiyan o lysosomal enzymes) ay nakakakuha ng conformation na nagsisiguro na ang enzyme ay gumagana sa acidic na pH value. Gayunpaman, karamihan sa mga enzyme sa katawan ng tao ay may pinakamainam na pH na malapit sa neutral, na kasabay ng halaga ng physiological pH.

Depende sa rate ng reaksyon ng enzymatic sa dami ng substrate

Kung ang konsentrasyon ng mga enzyme ay pinananatiling pare-pareho, binabago lamang ang dami ng substrate, kung gayon ang graph ng rate ng reaksyon ng enzymatic ay inilalarawan ng isang hyperbola.

Habang tumataas ang dami ng substrate, tumataas ang paunang bilis. Kapag ang enzyme ay naging ganap na puspos ng substrate, i.e. ang pinakamataas na posibleng pagbuo ng isang enzyme-substrate complex ay nangyayari sa isang ibinigay na konsentrasyon ng enzyme, at ang pinakamataas na rate ng pagbuo ng produkto ay sinusunod. Ang isang karagdagang pagtaas sa konsentrasyon ng substrate ay hindi humantong sa isang pagtaas sa pagbuo ng produkto, i.e. ang rate ng reaksyon ay hindi tumataas. Ang estado na ito ay tumutugma sa pinakamataas na bilis ng reaksyon na Vmax.

Kaya, ang konsentrasyon ng enzyme ay ang naglilimita na kadahilanan sa pagbuo ng produkto. Ang pagmamasid na ito ay naging batayan ng enzyme kinetics na binuo ng mga siyentipiko na sina L. Michaelis at M. Menten noong 1913.

Ang proseso ng enzymatic ay maaaring ipahayag sa pamamagitan ng sumusunod na equation:

kung saan ang k 1 ay ang rate constant para sa pagbuo ng enzyme-substrate complex; Ang k -1 ay ang rate ng pare-pareho ng reverse reaction, ang agnas ng enzyme-substrate complex; Ang k 2 ay ang rate na pare-pareho para sa pagbuo ng produkto ng reaksyon.

Ang sumusunod na ratio ng mga rate constants (k -1 + k 2)/k 1 ay tinatawag na Michaelis constant at denoted K m.

Ang rate ng reaksyon ay proporsyonal sa konsentrasyon ng enzyme-substrate ES complex, at ang rate ng pagbuo ng ES ay nakasalalay sa konsentrasyon ng substrate at ang konsentrasyon ng libreng enzyme. Ang konsentrasyon ng ES ay apektado ng rate ng pagbuo at pagkabulok ng ES.

Ang pinakamataas na rate ng reaksyon ay sinusunod kapag ang lahat ng mga molekula ng enzyme ay nasa kumplikado sa substrate, i.e. sa enzyme-substrate complex ES, i.e. [E] = .

Ang pag-asa ng rate ng isang reaksyon ng enzymatic sa konsentrasyon ng substrate ay ipinahayag ng sumusunod na equation

V max [S]

K m + [S]

Ang equation na ito ay tinatawag na Michaelis-Menten equation.

Sa kaso kung saan ang rate ng reaksyon ay kalahati ng maximum, K m = [S] Kaya, ang Michaelis constant ay numerong katumbas ng substrate concentration kung saan kalahati ng maximum na rate ay nakakamit.

Ang Michaelis-Menten equation ay ang pangunahing equation ng enzyme kinetics, na naglalarawan ng dependence ng rate ng isang enzymatic reaction sa konsentrasyon ng substrate.

Kung ang konsentrasyon ng substrate ay makabuluhang mas malaki kaysa sa K m (S >> K m), kung gayon ang pagtaas sa konsentrasyon ng substrate ng K m ay halos walang epekto sa kabuuan (K m + S) at maaari itong ituring na katumbas ng substrate konsentrasyon. Dahil dito, ang bilis ng reaksyon ay nagiging katumbas ng pinakamataas na bilis: V = V max. Sa ilalim ng mga kondisyong ito, ang reaksyon ay may zero order, i.e. ay hindi nakasalalay sa konsentrasyon ng substrate. Maaari nating tapusin na ang V max ay isang pare-parehong halaga para sa isang ibinigay na konsentrasyon ng enzyme, na independiyente sa konsentrasyon ng substrate.

Kung ang konsentrasyon ng substrate ay makabuluhang mas mababa sa K m (S<< K m), то сумма (K m + S) примерно равна К m , следовательно, V = V max [S]/K m , т.е. в данном случае скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата (реакция имеет первый порядок).

kanin. Pagdepende sa rate ng reaksyon (V) sa konsentrasyon ng substrate S.

Ang V max at K m ay ang mga kinetic na katangian ng kahusayan ng enzyme.

· Ang V max ay nagpapakilala sa catalytic na aktibidad ng enzyme at may sukat ng rate ng enzymatic reaction mol/l, i.e. tinutukoy ang pinakamataas na posibilidad ng pagbuo ng produkto sa isang ibinigay na konsentrasyon ng enzyme at sa ilalim ng mga kondisyon ng labis na substrate. Tinutukoy ng K m ang affinity ng isang binigay na enzyme para sa isang ibinigay na substrate at ito ay isang pare-parehong halaga na hindi nakadepende sa konsentrasyon ng enzyme. Ang mas kaunti

· Km, mas malaki ang affinity ng enzyme para sa isang partikular na substrate, mas mataas ang initial reaction rate at vice versa, mas malaki Km, mas mababa ang initial reaction rate, mas mababa ang affinity ng enzyme para sa substrate.

Para sa anumang reaksyon na mangyari, ang mga reacting molecule ay dapat makipag-ugnayan sa isa't isa. Gayunpaman, hindi lahat ng banggaan ng mga molekula ay sinamahan ng kanilang pakikipag-ugnayan; ang reaksyon ay nangyayari lamang kung ang mga molekula ay may sapat na supply ng kinetic energy. Ang hanay ng mga molekula ng anumang sangkap ay isang istatistikal na hanay ng mga molekula na may iba't ibang kinetic energies. Ang enerhiya na kinakailangan upang makamit ang activated (transition) na estado, o ang labis na enerhiya kumpara sa average na enerhiya ng mga molekula sa isang ibinigay na temperatura na dapat nilang taglayin upang makapag-react, ay tinatawag na activation energy (Ea). Sa kaso ng mga reaksyon ng enzymatic, ang hadlang ng enerhiya ay nabawasan dahil sa pagbuo ng isang enzyme-substrate complex, at mas mababa ang enerhiya ng pag-activate, mas mabilis ang mga reaksyon, dahil ang mga molekula na may mas kaunting enerhiya ay maaaring makipag-ugnayan.

sa mga reaksyong enzymatic at non-enzymatic, upang makamit ang isang estado ng paglipat, ang mga molekula ng mga panimulang sangkap ay isinaaktibo, nakakakuha ng isang mas mataas na reserba ng enerhiya, pagkatapos lamang na maaari silang sumailalim sa pagbabagong-anyo sa mga produkto ng reaksyon, ngunit (Ea) sa kaso ng isang enzymatic mas mababa ang reaksyon.

Kaya, ang mataas na rate ng mga reaksyong enzymatic ay sa huli ay resulta ng pagbaba sa activation energy ng mga catalyzed na reaksyon. Ito ay tiyak dahil binabawasan ng mga biological catalyst ang activation energy na ang mga reaksyong enzymatic ay nagpapatuloy sa mataas na bilis sa medyo mababang temperatura.

Ang pagbaba sa activation energy sa panahon ng enzymatic catalysis ay may ilang koneksyon sa multistage na kalikasan ng mga reaksyong ito. Hindi sila nangyayari sa isang yugto, ngunit sunud-sunod, sa pamamagitan ng ilang mga intermediate na reaksyon. Sa kasong ito, ang activation barrier ng reaksyon ay nahahati sa ilang mas mababang barrier para sa bawat intermediate na reaksyon, na mas madali para sa mga reacting molecule na malampasan kaysa sa isang malaking barrier.

Ang enzymatic catalysis ay may mga tampok ng parehong homogenous at heterogenous catalysis, na nagaganap sa interface sa pagitan ng dalawang phase. Sa catalytic action ng mga enzyme, 3 yugto ang maaaring makilala: 1) attachment ng substrate molecule (S) sa enzyme (E), 2) transformation ng substrate, 3) paghihiwalay ng mga final reaction products (P) mula sa enzyme. Ang pinakasimpleng pamamaraan ng isang reaksyong enzymatic ay nakasulat bilang mga sumusunod.

E + S ⇆ ES → E + P

Ang pinakamabilis ay karaniwang ang unang yugto ng reaksyon, ang pinakamabagal ay ang pangalawa. Sa unang yugto ng reaksyon, nabuo ang isang enzyme-substrate complex (ЈS, FSK), bilang isang resulta kung saan ang istraktura at mga katangian ng molekula ng substrate ay nagbabago at ang mga form ng paglipat nito ay nabuo. Ito ang pangunahing kinakailangan para sa pagpapabilis ng proseso ng pagbabago nito sa isang catalyzed na reaksyon.

Ang pagbuo ng FSC ay lumilikha ng mga paunang kondisyon para sa mataas na aktibidad ng catalytic. Naitatag na sa panahon ng pagbuo ng FSC, ang mga molekula ng enzyme at substrate ay hindi lamang magkakalapit, ngunit nakatuon din sa bawat isa sa isang tiyak na paraan. Sa pagitan ng istraktura ng substrate at ang aktibong sentro ng enzyme, bilang karagdagan sa steric na sulat, mayroon ding isang topochemical na sulat, na nagsisiguro sa pakikipag-ugnayan ng mga grupo ng pagkilala ng enzyme (binding zone) at ang mga grupo ng pagkilala ng substrate. Ang pagbubuklod ng enzyme at substrate ay karaniwang multipoint, at kung mas mataas ang pagtitiyak ng enzyme, mas maraming mga punto ng pagkilala.

Ang isang mahalagang kadahilanan na gumagawa ng isang tiyak na kontribusyon sa pagtaas sa rate ng mga reaksyon ng enzymatic ay isang pagtaas sa oras ng pakikipag-ugnay ng mga molecule ng reaksyon sa pamamagitan ng ilang mga order ng magnitude bilang isang resulta ng multipoint binding ng substrate (s) ng enzyme. Ang oras kung saan ang pakikipag-ugnay ng mga molekula sa panahon ng isang banggaan ay tumatagal sa kaso ng isang purong kemikal na reaksyon ay humigit-kumulang katumbas ng panahon ng thermal vibrations ng mga molekula (10 13 -10 12 s). Sa panahong ito, ang isang kemikal na reaksyon ay hindi palaging may oras na mangyari.

Sa pinakamainam na pagbubuklod ng substrate sa enzyme, ang isang produktibong enzyme-substrate complex ay nabuo, ibig sabihin, isang complex na, sa pamamagitan ng isang serye ng mga intermediate na yugto, ay gumagawa ng (mga) produkto ng reaksyon. Ang mga prosesong ito ay nangyayari sa ika-2 yugto ng reaksyon ng enzymatic. Ang mabilis na paglitaw ng reaksyon ng enzymatic ay pinadali ng katotohanan na sa panahon ng pakikipag-ugnayan ng substrate sa enzyme, ang pag-igting ay sapilitan sa sirang mga bono sa substrate (deformation o destabilization), ibig sabihin, ang mga nasirang bono ay nagiging hindi gaanong matatag kaysa sa libreng substrate.

Ang pagtaas sa rate ng reaksyon sa ilalim ng impluwensya ng mga enzyme ay nangyayari din dahil sa mas malaking hydrophobicity ng aktibong sentrong kapaligiran kumpara sa nakapalibot na solusyon; sa gayong kapaligiran, ang pagkawasak ng sisingilin na substrate ay sinusunod, na humahantong sa destabilization ng bond na nasira. .

Ang isang mahalagang tampok ng mga reaksyon ng enzymatic ay ang pagbabagong-anyo ng substrate ay nagpapatuloy bilang polyfunctional catalysis. Ang polyfunctionality ay sinisiguro ng pagkakaiba-iba ng mga residue ng amino acid ng bahagi ng protina ng enzyme at mga grupo ng mga cofactor sa aktibong sentro; ang nagbabagong kemikal na bono ng substrate ay apektado nang sabay-sabay o bilang resulta ng isang serye ng sunud-sunod na pag-atake ng ilang grupo ng enzyme. Bilang resulta, ang polariseysyon ng nagbabagong bono ay nangyayari at pagkatapos ay ang pagkalagot nito.

Maraming mga grupo sa mga aktibong site ng mga enzyme ang gumaganap bilang mga pangkalahatang acid o base, na kumikilos sa substrate, pinapagana ito at sa gayon ay pinapataas ang rate ng catalysis. Ang mga pangkalahatang acid, ayon kay Brønsted, ay anumang mga donor ng proton, at ang mga base ay mga tumatanggap ng proton. Ang pangkalahatang acid-base catalysis ay lalong epektibo. Nagbibigay ito ng pagtaas sa bilis ng 10-100 beses. Ang mga side radical ng amino acids tulad ng glutamine, aspargan, histidine, lysine, tyrosine, atbp. ay gumagana sa aktibong sentro bilang pangkalahatang acid-base catalysts. Sa protonated form sila ay acid catalysts, sa unprotonated form sila ay basic.

Ang mga nucleophilic na grupo ng mga enzyme ay sumasailalim sa nucleophilic substitution reactions, na humahantong sa pagbuo ng covalent intermediates - covalent catalysis. Pinapalitan ng pangkat na nucleophilic ang pinalit na grupo, at nabuo ang isang covalent intermediate; ito ay hindi matatag at madaling masira sa mga produkto ng reaksyon. Ang imidazole group ng histidine ay isang malakas na nucleophile, kaya ang kemikal na pagbabago ng histidine sa aktibong site ay humahantong sa hindi aktibo na mga enzyme. Kasama rin sa mga grupong nucleophilic ang OH group serine at ang SH group cysteine. Ang mga halimbawa ng mga electrophilic na grupo ay mga metal ions, halimbawa Zn 2+

Ang isa sa mga pag-andar na ginagawa ng mga metal sa mga enzyme ay ang pagkilos nila bilang mga electrophilic agent. Kaya, sa aktibong sentro ng carboxypeptidase A, na naglalaman ng Zn 2+ ion, ang huli ay isang electrophilic agent na nag-withdraw ng mga electron mula sa peptide bond ng substrate, na nagpapadali sa hydrolysis nito.

3.5. Mga uri ng mga reaksyong enzymatic. Batay sa bilang ng mga kalahok, ang mga reaksyong enzymatic ay nahahati sa mga reaksyong single-substrate at dual-substrate. Ang mga reaksyon na may malaking bilang ng mga substrate ay medyo bihira. Ang pinakakaraniwang uri ng reaksyong enzymatic ay isang reaksyong may dalawang substrate na may pagbuo ng dalawang produkto: A + B ⇆ C + D. Humigit-kumulang 60% ng lahat ng kilalang reaksyon, lalo na ang mga reaksyon ng paglipat ng grupo, ay nabibilang sa ganitong uri.

Single-substrate - bihira ang mga reaksyon ng solong produkto; ang mga halimbawa nito ay mga reaksyon ng isomerization, lalo na ang glucose-1-phosphate ⇆ glucose-6-phosphate. Gayunpaman, maraming mga reaksyon ang malapit sa mga reaksyon ng solong substrate sa kanilang mga katangian. Ito ay sinusunod sa mga kaso kung saan ang konsentrasyon ng isa lamang sa dalawang substrate ay nag-iiba. Halimbawa, ang mga reaksyon ng hydrolytic ay maaaring ituring bilang solong substrate, dahil ang konsentrasyon ng 2nd substrate - tubig - ay maaaring ituring na pare-pareho; sa panahon ng reaksyon ay bumababa ito nang hindi gaanong mahalaga.

Ang mga solong reaksyon ng substrate ay mahalagang unimolecular chemical reactions (A-P). Karamihan sa kanila ay nabibilang sa mga reaksyon ng 1st order, dahil ang rate ng reaksyon ay proporsyonal sa konsentrasyon ng isang reactant lamang. Ang pagkakasunud-sunod ng reaksyon ay tinutukoy ng likas na katangian ng pag-asa nito sa konsentrasyon ng substrate. Ang rate ng isang monomolecular na reaksyon ay maaaring hindi nakasalalay sa konsentrasyon ng substrate (kung ito ay labis), kung gayon ang pagkakasunud-sunod ng reaksyon ay magiging zero (V=ko, kung saan ang k 0 ay ang rate ng pare-pareho ng zero-order na reaksyon).

Kasama rin sa mga first-order na reaksyon ang mga reaksyong bimolecular (two-substrate). Nangyayari ito kapag ang konsentrasyon ng isa sa mga substrate ay napakataas kumpara sa konsentrasyon ng isa, tulad ng sa kaso ng mga reaksyon ng hydrolysis. Karamihan sa mga reaksyong bimolecular ay mga reaksyon sa pangalawang pagkakasunud-sunod dahil ang kanilang rate ay proporsyonal sa konsentrasyon ng dalawang reactant o, hindi gaanong karaniwan, sa parisukat ng konsentrasyon ng substrate.

3.6. Maramihang mga molekular na anyo ng mga enzyme at isoenzymes.

Ang maramihang mga molekular na anyo ng mga enzyme (MMEF) ay nauunawaan bilang isang pangkat ng mga enzyme na gumaganap ng magkaparehong catalytic function sa isang biological species, ngunit naiiba sa istraktura at isang bilang ng mga katangian ng physicochemical. Upang paghiwalayin ang MMFF, ang iba't ibang variant ng pamamaraan ng electrophoresis ay kadalasang ginagamit, na sinusundan ng tiyak na pagkakakilanlan ng mga zone na may parehong aktibidad ng enzymatic. Sa electropherograms, ang mga zone ng aktibidad ng MMFF ay itinalaga ng Arabic numerals sa pagkakasunud-sunod ng pagbaba ng anodic mobility.

Lahat ng MMFF ay nahahati sa anim na klase.

1. Mga genetically independent na protina. Ito ay mga enzyme na na-synthesize sa iba't ibang mga gene. Sa mga multicellular na organismo, madalas silang nailalarawan sa pamamagitan ng iba't ibang intracellular, lokalisasyon ng tissue: halimbawa, pyruvate kinase, enolase, fructose diphosphate aldolase sa mga tisyu ng kalamnan at atay, malate dehydrogenase at isang bilang ng mga aminotransferases sa mitochondria at cytosol.

2. Heteropolymer(hybrids) ng dalawa o higit pang polypeptide chain na naka-link nang hindi covalent. Ang mga halimbawa ng molekular na anyo ng mga enzyme ng klase na ito ay LDH, alcohol dehydrogenase, at creatine kinase.

3. Mga variant ng genetic(allelozymes). Ang mga allelozymes ay matatagpuan sa mga organismo na heterozygous para sa mga gene na naka-encode sa enzyme na ito. Kasama sa klase na ito ang mga mutant na anyo ng mga enzyme. Ito ay isang napakalaking klase ng mga molekular na anyo ng mga enzyme, kabilang ang, halimbawa, glucose-6-phosphate - human dehydrogenase, adenosine deaminase at marami pang iba.

4. Conjugated o nagmula na mga protina. Kasama sa klase ng MMFF na ito ang mga anyo ng mga enzyme na nabuo bilang resulta ng covalent na pagdaragdag o pagtanggal ng mga partikular na grupo sa (mula) sa isang protina. Ang ganitong mga pagbabago ay kadalasang sinasamahan ng mga pagbabago sa aktibidad ng enzymatic at ilang mga katangian ng physicochemical ng enzyme. Ang pagbabago ay maaaring binubuo ng phosphorylation - dephosphorylation (glycogen phosphorylase, glycogen synthase, fructose diphosphatase), adenylation - deadenylation (glutamine synthetase mula sa E. coli), oksihenasyon ng mga pangkat ng sulfhydryl (xanthine oxidase, lipoyl dehydrogenase), glycosylation (pagbabago sa bilang ng mga residu ng carbohydrate ay ipinapakita para sa β-glucuronidase mula sa bovine liver, glucose oxidase mula sa Penicilliumvitale, DNase at RNase mula sa bovine pancreas), amidation ng aspargine at glutamine residues (hindi pantay na antas ng amidation ay natagpuan sa alkaline protease mula sa Streptomyces rectus), cleavage ng peptide bond sa pamamagitan ng protease (aldolase).

5. Mga solong subunit oligomer. Kung ang isang enzyme ay may quaternary na istraktura, ang iba't ibang mga molecular form ay maaaring lumitaw dahil sa kumbinasyon ng ibang bilang ng magkaparehong polypeptide chain sa quaternary na istraktura. Kaya, ang β-glucosidase ay aktibo sa anyo ng isang mono-, di-, tetra- at octamer. Ang iba't ibang antas ng oligomeridad bilang sanhi ng paglitaw ng MMFF ay natukoy para sa glutamate dehydrogenase, cholinesterase, at ilang iba pang mga enzyme.

6. Conformationally iba't ibang anyo(mga conformer). Ang mga conformer ay mga protina na naiiba sa conformation na may parehong pagkakasunud-sunod ng amino acid. Ang mga pagkakaiba sa spatial na istraktura ng protina, na nauugnay sa bilang ng mga sisingilin na grupo sa ibabaw ng molekula, ay humantong sa hindi pantay na electrophoretic mobility. Kasama rin sa Class 6 ang lahat ng allosterically modified enzymes.

Kaya, ang terminong MMFF ay maaaring gamitin bilang ang pinaka-pangkalahatan para sa isang pangkat ng mga enzyme na matatagpuan sa isang biological species at may parehong specificity ng pagkilos. Dapat itong gamitin anuman ang dahilan ng kanilang hitsura. Ang terminong isoenzyme, o isoenzyme, ay naaangkop lamang sa mga MMFF na iyon, na ang hitsura nito ay nauugnay sa genetically determined na mga pagkakaiba sa pangunahing istraktura (mga klase 1-3), at hindi sa mga dahil sa iba pang mga kadahilanan na may parehong pangunahing istraktura (mga klase 4-6).

Denaturasyon, sanhi at sintomas, gamit sa gamot.

Ang mga protina ay sensitibo sa mga panlabas na impluwensya. Ang paglabag sa spatial na istraktura ng mga protina ay tinatawag na denaturation. Sa kasong ito, ang protina ay nawawala ang lahat ng biological at physicochemical properties nito. Ang denaturation ay sinamahan ng pagkalagot ng mga bono na nagpapatatag sa "katutubong" istraktura ng protina. Tulad ng nabanggit sa itaas, ang mahinang pakikipag-ugnayan ay gumaganap ng pangunahing papel sa pag-stabilize ng istraktura ng mga protina, kaya ang denaturation ay maaaring sanhi ng iba't ibang mga kadahilanan: pag-init, pag-iilaw, mekanikal na pag-alog, paglamig, pagkakalantad sa kemikal. Sa panahon ng denaturation, bilang isang panuntunan, ang solubility ng mga protina ay may kapansanan din, dahil ang isang paglabag sa istraktura ay humahantong sa hitsura sa ibabaw ng isang malaking bilang ng mga hydrophobic group, kadalasang nakatago sa gitna ng molekula ng protina.

Ang pangunahing istraktura ng isang protina ay hindi nagbabago sa panahon ng denaturation, na naging posible upang ipakita ang posibilidad ng pagpapanumbalik ng mga pag-andar at istraktura ng isang denatured na protina, bagaman sa karamihan ng mga kaso ang denaturation ay isang hindi maibabalik na proseso. Sa pagsasanay sa laboratoryo, ang denaturation ay ginagamit upang ma-deproteinize ang mga biological fluid. Ang mga salik na nagdudulot ng denaturation ay tinatawag na denaturing agent. Kabilang dito ang:

1. Pag-init at mataas na enerhiya na pag-iilaw (ultraviolet, x-ray, neutron, atbp.). Ito ay batay sa paggulo ng atomic vibrations, sinamahan ng pagsira ng mga bono.

2. Pagkilos ng mga acid at alkalis; baguhin ang dissociation ng mga grupo, bawasan ang bilang ng mga ionic bond.

3. Heavy metal ions. Bumubuo sila ng mga kumplikadong compound na may mga grupo ng protina, na sinamahan ng pagkalagot ng mahina na pakikipag-ugnayan.

4. Reducing agents - sanhi ng pagkalagot ng disulfide bridges.

5. Urea, guanidinium chloride - bumuo ng mga bagong hydrogen bond at masira ang mga luma. Ang phenomenon ng denaturation ay maaari ding gamitin para sa qualitative analysis ng presensya ng mga protina sa mga solusyon. Upang gawin ito, gumamit ng sample na may kumukulo ng likidong sinusuri pagkatapos itong ma-acid. Ang nagreresultang labo ay dahil sa denaturation ng protina. Ang pag-ulan na may mga organikong acid ay madalas ding ginagamit: sulfosalicylic o trichloroacetic.

Isang maikling kasaysayan ng enzymology.

Ang paggawad ng Nobel Prize kay J. Sumner, J. Northrop at Stanley noong 1946 ay minarkahan ang pagtatapos ng mahabang panahon ng pag-unlad ng enzymology - ang agham ng mga enzyme. Ang simula ng agham na ito ay bumalik sa bukang-liwayway ng kasaysayan ng pag-unlad ng sangkatauhan, na gumagamit ng isang bilang ng mga teknolohikal na proseso ng enzymatic sa buhay nito: pagluluto ng tinapay, paggawa ng alak, pagproseso ng mga balat ng hayop, atbp. Ang pangangailangang pahusayin ang mga prosesong ito ang naging impetus para sa kanilang malalim na pag-aaral. Ang mga unang siyentipikong paglalarawan ng mga prosesong enzymatic ay kinabibilangan ng paglalarawan ng panunaw sa mga hayop. Nang i-set up ang kanyang mga eksperimento, si René Antoine Reaumur (1683-1757) ay nagpatuloy mula sa pagpapalagay na ginawa ni Faulkner na ang mga ibong mandaragit ay nagre-regurgitate ng hindi natutunaw na pagkain ay nananatili. Gumawa si Reaumur ng isang maliit na kapsula ng alambre kung saan nilagyan niya ng isang piraso ng karne at ibinigay ito sa isang buzzard upang tusukin. Pagkatapos ng 24 na oras, iniluwa ng ibon ang kapsula na ito. Ang isang pinalambot na piraso ng pagkain ay nanatili sa loob nito, na, gayunpaman, ay hindi nasisira. "Ang prosesong ito ay maaari lamang maging resulta ng pagkilos ng ilang uri ng solvent," pagtatapos ni Reaumur. Si Lazzaro Spallanzani (1729-1799), propesor ng natural na kasaysayan sa Unibersidad ng Padua, ay nag-ulat ng mga katulad na eksperimento. Gayunpaman, hindi niya itinuring ang panunaw bilang isang proseso ng pagbuburo sa simpleng dahilan na hindi nabuo ang mga bula ng gas.

Nang maglaon, ang proseso ng pagbuburo ay pinag-aralan nang mas detalyado ng isa sa mga tagapagtatag ng modernong kimika, si Antoine Laurent Lavoisier (1743-1794). Habang pinag-aaralan ang alcoholic fermentation na nangyayari sa panahon ng paggawa ng alak, natuklasan niya na ang glucose ay na-convert sa alkohol at carbon dioxide,

Sa simula ng ika-19 na siglo. Ang nangingibabaw na pangkalahatang pananaw ay ang pagbuburo ay isang kemikal na pagbabago na dulot ng ilang espesyal na anyo ng organikong materyal, katulad ng "mga enzyme". Noong 1814, ipinakita ng Russian scientist (German by birth) academician ng St. Petersburg Academy of Sciences Konstantin Gottlieb Sigismund Kirchhoff (1764-1833) na ang pagbuo ng asukal mula sa starch sa sprouted cereal grains ay dahil sa isang kemikal na proseso at hindi ang hitsura ng sprouts. Noong 1810, ibinukod ni Yu. Gay-Lussac ang mga pangunahing produkto ng lebadura - alkohol at carbon dioxide. Si J. Berzelius, isa sa mga tagapagtatag ng teorya ng chemical catalysis at ang may-akda ng terminong "catalysis" mismo noong 1835, ay nagpapatunay sa mga datos na ito, na binabanggit na ang diastase (extract mula sa malt) ay nagpapang-catalyze ng hydrolysis ng starch nang mas epektibo kaysa sa mineral na sulfuric acid. . Ang isang mahalagang papel sa pagbuo ng enzymology ay nilalaro ng pagtatalo sa pagitan ni Yu Liebig at ng sikat na microbiologist na si L. Pasteur, na naniniwala na ang mga proseso ng pagbuburo ay maaari lamang mangyari sa isang buong buhay na selula. Si J. Liebig, sa kabaligtaran, ay naniniwala na ang mga biological na proseso ay sanhi ng pagkilos ng mga kemikal, na kalaunan ay tinawag na mga enzyme. Ang terminong enzyme (Greek en - in, zyme - yeast) ay iminungkahi noong 1878 ni Friedrich Wilhelm Kühne upang bigyang-diin na ang proseso ay nangyayari sa yeast, kumpara sa yeast mismo, na nagpapagana sa proseso ng pagbuburo. Gayunpaman, noong 1897, si E. Buchner ay nakakuha ng cell-free yeast extract na may kakayahang gumawa ng ethanol at nakumpirma ang opinyon ni Liebig.

Ang mga pagtatangka na ipaliwanag ang isa sa mga mahahalagang katangian ng mga enzyme, pagtitiyak, ay humantong noong 1894 ang German chemist at biochemist na si E. Fischer na magmungkahi ng isang modelo ng pakikipag-ugnayan sa pagitan ng enzyme at substrate, na tinatawag na "key-lock" - geometric complementarity ng mga hugis. ng substrate (key) at ang enzyme (lock). Noong 1926, pinatunayan ni J. Sumner, pagkatapos ng halos 9 na taon ng pananaliksik, ang likas na protina ng urease enzyme. Sa parehong mga taon, itinuro nina J. Northrop at M. Kunitz ang isang direktang ugnayan sa pagitan ng aktibidad ng mala-kristal na pepsin, trypsin at ang dami ng protina sa mga pinag-aralan na mga sample, sa gayon ay nagbibigay ng makabuluhang katibayan ng likas na protina ng mga enzyme, bagaman ang pangwakas nakuha ang ebidensya pagkatapos matukoy ang pangunahing istraktura at artipisyal na synthesis ng isang bilang ng mga enzyme. Ang mga pangunahing ideya tungkol sa mga enzyme ay nakuha na sa ikalawang kalahati ng ikadalawampu siglo. Noong 1963, pinag-aralan ang amino acid sequence ng RNase mula sa pancreas. Noong 1965, ipinakita ang spatial na istraktura ng lysozyme. Sa mga sumunod na taon, libu-libong mga enzyme ang nalinis at maraming bagong data ang nakuha sa mga mekanismo ng pagkilos ng mga enzyme, ang kanilang spatial na istraktura, at ang regulasyon ng mga reaksyon na na-catalyze ng mga enzyme. Ang aktibidad ng catalytic ay natuklasan sa RNA (ribozymes). Ang mga antibodies na may aktibidad na enzymatic—abzymes—ay nakuha. Ang kabanatang ito ay maikling nagpapakilala ng mga modernong ideya tungkol sa istruktura, mekanismo ng pagkilos at mga medikal na aspeto ng enzymology.

Mga tampok ng enzymatic catalysis.

1. Protein na katangian ng katalista

2. Pambihirang mataas na kahusayan. Ang kahusayan ng biological catalysis ay lumampas sa kahusayan ng inorganic catalysis ng 10 9 - 10 12

3. Pambihirang mataas na pagtitiyak:

a) ganap, kapag ang enzyme ay gumagana lamang sa substrate nito (fumarase na may mga trans-isomer ng fumaric acid at hindi sa cis-isomer);

b) pangkat - tiyak para sa isang makitid na pangkat ng mga kaugnay na substrate (gastrointestinal enzymes).

4. Gumagana sa mahinang kondisyon (t=37, pH 7.0, ilang osmolarity at komposisyon ng asin).

5. Multi-level na regulasyon: regulasyon ng aktibidad sa antas ng mga kondisyon sa kapaligiran, sa antas ng metabolon, sa antas ng genetic, tissue, cellular, sa tulong ng mga hormone at mediator, pati na rin sa tulong ng mga substrate at produkto ng ang reaksyon na kanilang pinagkakatali.

6. Pagkakaisa: ang mga enzyme ay may kakayahang mag-organisa ng mga asosasyon - ang produkto ng 1st enzyme ay isang substrate para sa ika-2; ang produkto ng ika-2 ay isang substrate para sa ika-3, atbp.

Bilang karagdagan, ang mga enzyme ay madaling ibagay, ibig sabihin, maaari nilang baguhin ang kanilang aktibidad at bumuo ng mga bagong asosasyon.

7. May kakayahang mag-catalyze ng parehong pasulong at pabalik na mga reaksyon. Ang direksyon ng reaksyon para sa maraming mga enzyme ay tinutukoy ng ratio ng mga kumikilos na masa.

8. Ang catalysis ay mahigpit na naka-iskedyul, iyon ay, ito ay nangyayari sa mga yugto.

Pagtitiyak ng pagkilos ng enzyme.

Ang mataas na pagtitiyak ng mga enzyme ay dahil sa conformational at electrostatic complementarity sa pagitan ng mga molekula ng substrate at ng enzyme at ang natatanging istraktura ng aktibong sentro ng enzyme, na nagsisiguro ng "pagkilala", mataas na pagkakaugnay at selectivity para sa paglitaw ng isang partikular. reaksyon.

Depende sa mekanismo ng pagkilos, ang mga enzyme na may kamag-anak o partikular na grupo at may ganap na pagtitiyak ay nakikilala.

Para sa pagkilos ng ilang hydrolytic enzymes, ang uri ng chemical bond sa substrate molecule ay pinakamahalaga. Halimbawa, sinisira ng pepsin ang mga protina ng pinagmulan ng hayop at halaman, bagama't maaaring magkaiba ang mga ito sa istrukturang kemikal, komposisyon, at mga katangiang pisyolohikal. Gayunpaman, hindi sinisira ng pepsin ang mga karbohidrat at taba. Ito ay ipinaliwanag sa pamamagitan ng katotohanan na ang site ng pagkilos ng pepsin ay ang peptide bond. Para sa pagkilos ng lipase, ang naturang site ay ang ester bond ng mga taba.

Iyon ay, ang mga enzyme na ito ay may relatibong pagtitiyak.

Ang ganap na pagtitiyak ng pagkilos ay tinatawag na kakayahan ng isang enzyme na i-catalyze ang pagbabago ng isang substrate lamang at anumang pagbabago sa istruktura ng substrate ay ginagawa itong hindi naa-access sa pagkilos ng enzyme. Halimbawa: arginase, na sumisira sa arginine; urease, na pinapagana ang pagkasira ng urea.

Mayroong ebidensya para sa pagkakaroon ng stereochemical specificity dahil sa pagkakaroon ng optically isomeric L- at D-forms o geometric (cis- at trans-) isomers

Kaya, kilala ang mga oxidase L at D a/k.

Kung mayroong anumang tambalan sa anyo ng cis- at trans-isomer, kung gayon para sa bawat isa sa mga form na ito ay mayroong sariling enzyme. Halimbawa, ang fumarase ay nag-catalyze ng conversion ng fumaric acid lamang (trans), ngunit hindi kumikilos sa cis isomer, maleic acid.