Оборудване и реагент: хроматографска хартия; хроматографска камера; фотоелектрически колориметър; ножици; стъклени чинии (3х32 см) - 3 бр.; държач за хроматограми; сушилен шкаф; микропипети; епруветки с шлифовани запушалки; бюрета 25 ml; стандартна смес от аминокиселини; тестова смес от аминокиселини; бутанол, оцетна киселина, вода в съотношение 15:3:7; 1% разтвор на нинхидрин в 95% ацетон; етилов алкохол (75%), наситен с меден сулфат.

Завършване на работата

Вземете лист хроматографска хартия с размери 18x28 cm и начертайте хоризонтална линия с обикновен молив на разстояние 3 cm от късия му край. След това се разделя на неравни сегменти в съответствие с приложената схема и със стрелки се отбелязват границите на приложение на стандартните и тестовите смеси и се правят съответните надписи с обикновен молив.

Хартията се фиксира над повърхността на масата и на стартовата линия, ограничена със стрелки, стандартната смес първо се нанася със специална микропипета в тънка линия, докато целият разтвор от микропипетата се прехвърли на стартовата линия (микропипетата е пълна 2-3 см). Масата на приложения разтвор се измерва чрез претегляне на пипетата, пълна със стандартната смес (преди прилагане на разтвора) и празна (след прилагане на разтвора). Обикновено върху хартията се нанасят 0,02-0,03 g от стандартния разтвор. След това напълнете чиста пипета с аминокиселинната смес за тестване (дадена от учителя за изследването), претеглете я и нанесете сместа върху началната линия със съответния знак.

Приготвената хроматограма се поставя в хроматографска камера със система от разтворители, предварително изляти в нея, за да се раздели смес от аминокиселини, например смес от бутанол, оцетна киселина и вода в съотношение 15:3:7. Разделянето се извършва чрез възходяща хроматография, докато предната линия достигне 2-3 cm до горния ръб на хроматографската хартия (финалната линия). След това хроматограмата се изважда от камерата и горният край на хартията веднага се вкарва в държач, направен от три стъклени пръчки, закрепени с гумен пръстен, и се поставя в абсорбатор за 20 минути, за да се отстранят разтворителите от хартията.

Ориз. 8. Схема на подреждането на аминокиселините върху хроматограмата:

А - точка на прилагане на смес от аминокиселини; I - цистин и цистеин;

2 - лизин; 3 - хистидин; 4 - аргинин; 5 - аспарагинова киселина,

серия и глицин; 6 - глутаминова киселина и треонин; 7 - аланин;

8 - пролин; 9 - тирозин; 10 - валин и метионин; II - триптофан;

12 - фенилаланин; 13 - левцин и изолевцин

Изсушената хроматограма се потапя в 1% разтвор на нинхидрин в ацетон, за да се открият позициите на аминокиселинните петна върху нея. След това хроматограмата се поставя за 10 минути в абсорбатор за отстраняване на ацетона и се прехвърля в пещ, където се оставя за 15 минути при 70°C. Аминокиселините на стандартните и тестовите смеси се откриват като синьо-виолетови петна, подредени във верига по посока на системата от разтворители от началната линия до горния край на хроматограмата.

Идентифицирането на аминокиселините, съдържащи се в тестовата смес, се извършва чрез съвпадение върху хроматограмата на позициите, заети от аминокиселините на стандартната и тестовата смес (фиг. 8).

За да се определи количественото съдържание на аминокиселини в тестовите смеси, хроматограмата се начертава с обикновен молив, така че цветните зони, разположени на едно и също ниво, съответстващи на една и съща аминокиселина, са затворени в приблизително еднакви правоъгълници (фиг. 9) .

I II III IV

Ориз. 9. Схема на подреждането на аминокиселините върху хроматограмата:

I - смес No I; II - смес № 2; 1U - смес No3; Ш - стандарт

смес от аминокиселини

Очертаните парчета хартия се изрязват и поставят в епруветки, чиито номера трябва да съответстват на броя на петната върху хроматограмите. Във всяка епруветка от бюрета се изсипват 10 ml 75% разтвор на етилов алкохол, наситен с меден сулфат (към 500 ml етилов алкохол се добавят 0,2 ml наситен разтвор на меден сулфат). Епруветката се затваря с тапа и при периодично разбъркване се постига пълен преход на керемиденочервения цвят (медна сол на синьо-виолетовото на Руман) от хартията в разтвора. Това отнема 15-20 минути. Абсорбцията (оптичната плътност) на стандартния и тестовия разтвор се измерва на фотоелектрокалориметър с филтър за зелена светлина (540 nm). В референтния поток се монтира кювета със 75% разтвор на етилов алкохол с меден сулфат.

Количественото съдържание на аминокиселини в тестовия разтвор се изчислява от съотношението на екстинкциите на тестовата и стандартната проба.

Пример за изчисление. Да приемем, че стандартната смес съдържа 1,8 mg глицин в 1 ml, 0,02 g от този стандартен разтвор се прилага към началната лента. Следователно получената хроматограма (1,8 × 0,02) = 0,036 mg глицин. Нека освен това се съгласим, че абсорбцията на оцветените разтвори е 0,288 за стандарта и 0,336 за неизвестната смес. Тогава съдържанието на глицин в тестовата смес, приложено към хроматограмата, ще бъде (36´0,336): 0,288=42 µg. Ако освен това приемем, че тестовата смес се прилага към хроматограмата в количество от например 0,0250 g, тогава съдържанието на глицин в 1 ml от тестовия разтвор ще бъде (42: 0,0250) = 1680 μg или 1,68 mg / мл.

Изгответе резултатите от собствения си експеримент, направете изводи от тях.

Лаборатория #15

Разделяне на йониFe 3+ , ко 2+ , Ni 2+

Аминокиселините могат да бъдат открити с помощта на цветни реакции: нинхидрин, ксантопротеин, Фол, Милон, биуретови тестове и др. Тези реакции са неспецифични, т.к. се основават на откриването на отделни фрагменти в структурата на аминокиселините, които могат да се появят и в други съединения.

Нинхидринова реакция, цветна реакция, използвана за качествено и количествено определяне на аминокиселини, иминокиселини и амини. При нагряване в алкална среда на нинхидрин (трикетохидринденхидрат, C 9 H b O 4) с вещества с първични аминогрупи (-NH 2) се образува продукт, който има стабилен интензивен синьо-виолетов цвят с максимална абсорбция от около 570 nm. Тъй като абсорбцията при тази дължина на вълната зависи линейно от броя на свободните аминогрупи, нинхидриновата реакция послужи като основа за тяхното количествено определяне чрез колориметрия или спектрофотометрия. Тази реакция се използва и за определяне на вторични аминогрупи (>NH) в иминокиселини - пролин и хидроксипролин; в този случай се образува ярко жълт продукт. Чувствителност - до 0,01%. Съвременният автоматичен аминокиселинен анализ се извършва чрез комбиниране на йонообменно разделяне на аминокиселини и тяхното количествено определяне с помощта на нинхидринова реакция. При разделяне на смеси от аминокиселини чрез хартиена хроматография, всяка аминокиселина може да се определи в количество най-малко 2-5 μg.

Количеството аминокиселини може да се прецени по интензитета на цвета.

Тази реакция е положителна не само със свободни аминокиселини, но и с пептиди, протеини и др.

ксантопротеинова реакцияви позволява да откриете ароматни аминокиселини (фенилаланин, тирозин, хистидин, триптофан), въз основа на реакцията на електрофилно заместване в ароматното ядро ​​(нитриране).

Под действието на концентрирана азотна киселина, например върху тирозин, се образува жълт продукт.

Реакцията на Фол.Това е реакция към цистеин и цистин. По време на алкална хидролиза "слабо свързаната сяра" в цистеина и цистина се разделя доста лесно, което води до образуването на сероводород, който, реагирайки с алкали, дава натриеви или калиеви сулфиди. Когато се добави оловен (II) ацетат, се образува сиво-черна утайка от оловен (II) сулфид.

Описание на опита. Изсипете 1 ml разтвор на цистин в епруветка, добавете 0,5 ml 20% разтвор на натриев хидроксид. Сместа се загрява до кипене и след това се добавят 0,5 ml разтвор на оловен (II) ацетат. Наблюдава се сиво-черна утайка от оловен (II) сулфид:

Реакция на Цимерман.Това е реакция към аминокиселината глицин.

Описание на опита. Към 2 ml 0,1% разтвор на глицин, регулиран чрез добавяне на 10% разтвор на основа до рН = 8, се изсипват 0,5 ml воден разтвор на о-фталов диалдехид. Реакционната смес започва бавно да става ярко зелена. След няколко минути се появява зелена утайка.

реакция към триптофан.Триптофанът, реагирайки в кисела среда с алдехиди, образува цветни кондензационни продукти. Например, с глиоксилова киселина (която е примес към концентрирана оцетна киселина), реакцията протича съгласно уравнението:

Реакцията на триптофан с формалдехид протича по подобна схема.

Реакцията на Сакагучи.Тази реакция към аминокиселината аргинин се основава на взаимодействието на аргинин с α-нафтол в присъствието на окислител. Механизмът му все още не е напълно изяснен. Очевидно реакцията се извършва съгласно следното уравнение:

Тъй като производните на хинонимините (в този случай нафтохинон), в които водородът на иминогрупата –NH– е заменен с алкилов или арилов радикал, винаги са оцветени в жълто-червени тонове, тогава, очевидно, оранжево-червеното Цветът на разтвора по време на реакцията на Сакагучи се дължи на появата точно на нафтохинониминово производно. Въпреки това не се изключва възможността за образуване на още по-сложно съединение поради по-нататъшно окисление на останалите NH групи на аргининовия остатък и бензеновия пръстен на α-нафтола:

Описание на опита. Изсипете 2 ml 0,01% разтвор на аргинин в епруветка, след това добавете 2 ml 10% разтвор на натриев хидроксид и няколко капки 0,2% алкохолен разтвор на α-нафтол. Съдържанието на епруветката се разбърква добре, добавят се 0,5 ml разтвор на хипобромит и се разбърква отново. Веднага се добавя 1 ml 40% разтвор на урея за стабилизиране на бързо развиващия се оранжево-червен цвят.

Биуретова реакция- използва се като цветна реакция за протеини. В алкална среда в присъствието на медни (II) соли те дават виолетов цвят. Цветът се дължи на образуването на медно (II) комплексно съединение, дължащо се на пептидната група -CO-NH-което е характерно за протеините. Тази реакция получи името си от производното на уреята - биурет, което се образува чрез нагряване на урея с елиминиране на амоняк:

В допълнение към протеините и биурета, други съединения, съдържащи тази група, също дават същото оцветяване: амиди, имиди на карбоксилни киселини, както и съединения, съдържащи групи -CS-NH- или \u003d CH-NH- в молекулата. Протеини, някои аминокиселини, пептиди, биурет и средни пептони също дават реакцията.

Цветът на комплекса, получен чрез биуретова реакция с различни пептиди, е малко по-различен и зависи от дължината на пептидната верига. Пептидите с дължина на веригата от четири аминокиселинни остатъка и повече образуват червен комплекс, трипептидите - лилав, а дипептидите - син.

кетонна форма на полипептид

енолна форма на полипептид

Когато полипептидът взаимодейства с Cu (OH) 2, се образува комплекс, чиято структура може да бъде показана по следния начин.

Методи за определяне на аминокиселини

Аминокиселините са биологично активни вещества, играят важна роля в живота на човешкото тяло, широко се използват като лекарства. Някои от тях са незаменими и влизат в организма с храната. Понастоящем съществуват редица методи за количествено определяне на аминокиселини в лекарствени растителни материали, в лекарства и биологични течности и в хранителни продукти.

От цялото разнообразие от методи за количествено определяне на аминокиселини в различни обекти могат да се разграничат четири основни групи: хроматографски, спектрофотометрични, титриметрични и електрохимични методи за анализ.

Хроматографски методи

През последните десетилетия беше постигнат значителен напредък в областта на газо-течната хроматография на аминокиселини. Предложен е метод, използващ микроопаковани колони, който прави възможно отделянето на почти напълно 17 биологично важни α-аминокиселини за относително кратко време.

Разработен е метод за определяне на аминокиселини с помощта на газово-течна хроматография в проби от серум, плазма, урина и цереброспинална течност, базиран на получаването на 2,3,4,5,6-пентафлуоробензоил-изобутилови етери, последвани от разделяне на колона от полидиметилсилоксан в режим на програмиране на температурата от 140°C до 250°C с пламъчно-йонизационен детектор. Времето за хроматографско разделяне е 28 минути. В резултат на изследването е възможно да се отделят 27 аминокиселини.

Въпреки разнообразието от методи на високоефективна течна хроматография при анализа на аминокиселини, вариантът с обърната фаза със спектрофотометрично откриване е най-изразителен и достъпен. За успешно разделяне и откриване аминокиселините се превръщат в хидрофобни и абсорбиращи светлина производни, т.е. извършва се дериватизация преди колоната. Като реагенти за дериватизация се използват ортофталалдехид, нафтален-2,3-дикарбоксиалдехид, 9-флуоренилметилхлороформат.

Разработен е метод за количествено определяне на L-цистин, L-глутаминова киселина и глицин в лекарството Eltacin, което има антиоксидантна активност в комбинация с антиангинален ефект. Глутаминовата киселина и глицинът се определят чрез високоефективна течна хроматография с обратна фаза след предколонна дериватизация с ортофталалдехид/N-ацетил-L-цистеинов реагент. Дериватизацията на цистеина, според авторите, е трудна поради нестабилността на самата аминокиселина и получените производни. Следователно анализът на цистеина се извършва по метода на броматометрично титруване. Установено е, че наличието на значителни количества цистеин в пробата не пречи на определянето на продуктите от дериватизация на глицин и глутаминова киселина с ортофталалдехид / N-ацетил-L-цистеинов реагент. Методът се характеризира с висока възпроизводимост и точност на определяне.

Възможността за използване на 4,7-фенантролин-5,6-дион (фанхинон) като флуорогенен реагент-маркер за предколонното образуване на неговите производни за разделяне и количествен анализ на аминокиселини чрез високоефективна течна хроматография е била открита изучавани. Тъй като не притежава собствена флуоресценция, фанхинонът реагира с аминогрупи на аминокиселини (при 68 °C за 160 минути), образувайки иминохиноли, чиято флуоресценция се измерва при дължина на вълната 460 nm. Изолираните производни се идентифицират чрез Tm, IR, мас и PMR спектри. Високоефективната течна хроматография се извършва на хроматограф с флуоресцентен детектор и колона с градиентно елуиране със смеси: разтвор на триетиламин - фосфатен буфер (рН 3) - метанол. Като вътрешен стандарт се използва хинидин. Този метод е доста обещаващ в условията на големи лаборатории и може да бъде предложен за анализ на аминокиселини в готови лекарствени форми.

Разработена е техника за високоефективна течна хроматография с потенциометричен биосензор за количествено определяне на лизин. Биосензорът е конструиран чрез прикрепване на мембрана, съдържаща лизиноксидаза, към йон-селективен NH4+ електрод. Амониевите йони, генерирани по време на ензимното разграждане на лизин, се откриват потенциометрично. Разработен е хроматоденситометричен експресен метод за анализ на триптофан в културални течности. Тънкослойна хроматография се провежда върху Sorbfil плаки. Хроматографията се провежда в системата пропанол-2 - 25% разтвор на амониев хидроксид (7:3) в продължение на 25 минути. Хроматограмите се сушат при стайна температура и се държат при 120°С за 15 минути. За откриване на петна върху хроматограмите се използва специфичен реагент - 4-диметиламинобензалдехид, селективен към индоловия пръстен на триптофан, под формата на 0,5% разтвор на етанол с добавяне на 5% концентрирана сярна киселина. След проявяване на хроматограмите чрез потапяне в тефлонова кювета с прясно приготвен разтвор на 4-диметиламинобензалдехид, те се държат за 5-7 минути при температура 110°C. Петната от триптофан бяха сканирани при дължина на вълната 625 nm с помощта на компютърен видео денситометър. Разработеният метод, въпреки високата точност на определяне и производителност, е специфичен за триптофана.

За анализ на α-аминокиселини в биологични течности, лекарства и хранителни продукти широко се използват методи на капилярна електрофореза, основани на разделянето на компонентите на сложна смес в кварцов капиляр под действието на приложено електрическо поле. Тъй като аминокиселините са цвитерионни по природа, те могат да бъдат разделени с помощта на електролитни буфери с подходящо рН, като най-често се използват неутрални и основни буфери за разделяне.

За повишаване на специфичността и чувствителността на метода на капилярната електрофореза за анализ на отделни α-аминокиселини се използва тяхната предварителна дериватизация, последвана от разделяне в кварцов капиляр и спектрофотометрично определяне на реакционните продукти. Така 9-флуоренилметилформиат, 9-(2-карбазол)-етил хлороформат и цианиново багрило се използват като дериватизиращи агенти. Перспективите на метода се дължат на неговите предимства като бърз анализ, лекота на подготовка на пробите, ниска консумация на реагенти и лекота на инструментализация.

И протеини

Известно е, че всичките 20 разновидности на каноничните α-аминокиселини имат една и съща структура, с три варианта на функционални групи (фиг. 3.3). За съжаление, реакциите към амино и карбокси групи не са много специфични, т.к съответно характерни за всички амини, редица амиди и карбоксилни киселини. Същото важи и за повечето от техните радикали = R, 10 от които са неполярни, т.е. те са представени от алифатни = въглеводородни групи, повечето от които са химически инертни. Специфичността на повечето R полярни аминокиселини също е относително ниска, в които се срещат алкохолни (Ser, Tre, Tyr) амидни (Acn, Gln) и карбоксилни групи (Asp, Glu). По-активни са аминогрупата (Liz), имидазолът His и гуанидиногрупата Arg, докато активността на тиогрупата Cys е най-висока. Следователно универсалната реакция на нинхидрин, специфична за едновременното присъствие на амино и карбокси групи в α-C атома, е получила най-голямо практическо значение в качествения и количествен анализ на α-аминокиселини, включително в аминокиселинни анализатори.

Ориз. 3.3. Общи формули за структурата на α-аминокиселините и техния полимеризационен продукт. Пояснения в текста.

Полимеризацията на α-аминокиселините в структурата на пептидите и протеините (фиг. 3.3) запазва всички видове техни R, но:

1. Реакцията на нинхидрин става отрицателна, т.к с изключение на N- и С-терминала, α-амино и α-карбокси групите се изразходват за образуването на пептидни връзки. Положителната реакция на нинхидрин с протеин по-скоро показва наличието на аминокиселинни примеси в препарата или ястията.

2. За всички пептиди и протеини биуретната реакция към пептидната група, която отсъства в мономерните аминокиселини, е специфична.

3. От по-специфичните реакции към R аминокиселини, следните са полезни: ксантопротеинова реакция с концентрирана азотна киселина, до ароматни R Phe, Tyr, Tri; реакцията с изатин за пет-членния пръстен Pro, както и реакции за имидазола R His, тио групата Cys и гуанидино групата Arg. Важно е да се вземе предвид, че някои от тези Rs са скрити вътре в протеиновите глобули и следователно качествените реакции към тях са отслабени. Следователно, преди да бъдат извършени, протеините обикновено се денатурират по един или друг начин.

4. За разлика от истинските разтвори на аминокиселини, колоидните разтвори на протеини се характеризират с седиментни реакциисвързани с разрушаването на техните хидратационни черупки и в резултат на това намаляване на тяхната разтворимост под действието на средства за отстраняване на водата: неутрални соли = изсоляване, метанол = MeOH, етанол = EtOH, ацетон, урея и други агенти.

Извършвайки качествени реакции, трябва:

1. Внимателно спазвайте правилата за пожарна безопасност и работа с концентрирани киселини и основи = EJ.

2. Маркирайте 2 реда епруветки със стъклограф или флумастер и в една от тях поставете не повече от 0,5 ml (2-5 капки) 1% разтвор на аминокиселини и приблизително същия обем 1% разтвор на протеини. в другата.

3. В чифт епруветки с разтвори на аминокиселини и протеини добавете паралелно 3-5 капки от съответните реагенти и извършете останалите процедури, посочени за съответната реакция.

4. Ако е необходимо да се нагреят епруветките, отстранете капака на тигела и подпалете сухото гориво с кибрит. След това затегнете епруветката в държача, чийто примитивен дизайн е много ненадежден. Ето защо е по-добре да увиете чифт епруветки с лист хартия, сгънат на лента и, като ги държите с палец, равномерно прекарайте долните половини на епруветките през пламъка, като се избягва посоката на вратовете върху съседите и бързото кипене на разтвора. След приключване на операцията своевременно изгасете пламъка с капака на тигела.

5. Резултатите от експериментите, в съответствие с шаблона, съставят върху разпространението на лабораторна тетрадкапод формата на таблица:

6. След разглеждане на резултатите и попълване на протокола, заедно със стелаж с епруветки, ги предайте на учителя за защита.

1. Нинхидринова реакция.Въз основа на дезаминиране и декарбоксилиране на α-аминокиселини с алкохолен разтвор на нинхидрин:

Полученият амоняк, реагирайки с две молекули нинхидрин, образува оцветено производно с максимум на абсорбция при 540 nm (за Pro - 440 nm).

Напредък: Добавете 3-5 капки 0,5% алкохолен разтвор на нинхидрин към изследваните проби. Леко загрейте епруветките със смеси на пламък и след 2-3 минути регистрирайте появата на цвят.

2. Ксантопротеинова реакция.Както бе споменато по-горе, той се основава на образуването на нитро производни на аминокиселини с ароматен R: Phen, Tyr, Tri.

Напредък: Включете течението на абсорбатора, внимателно добавете няколко капки концентрирана азотна киселина (HNO 3) към чифт епруветки с тестови разтвори. Леко загрейте епруветките на пламък, като избягвате посоката на гърлата към съседните, и регистрирайте развитието на цвета.

3. Реакция на нитропрусид.Основава се на алкална хидролиза на съдържащата сяра аминокиселина цистеин, с освобождаване на натриев сулфид (Na 2 S), който дава червен комплекс с прясно приготвен разтвор на натриев нитропрусид.

Напредък:Добавете еднакъв обем 20% натриев хидроксид към двете епруветки с 5-10 капки тестови разтвори и кипете най-малко 3-5 минути. Добавете 3-5 капки разтвор на натриев нитропрусид в епруветките и запишете развитието на цвета.

4. Биуретова реакция.Основава се на образуването в алкална среда на оцветен комплекс от пептидна връзка с Cu 2+ йон. Служи като универсален тест за откриване на пептиди и протеини в разтвори. Тъй като с увеличаване на броя на пептидните връзки интензитетът на цвета на разтвора се увеличава линейно, той се използва широко за фотометрично определяне на протеинови концентрации.

Напредък. Добавете същото количество 10% разтвор на натриев хидроксид към епруветките с 5-10 капки от тестовите разтвори. Разбъркайте добре и добавете 2 капки 1% разтвор на меден сулфат (CuSO 4). Смесете пробите и след няколко минути регистрирайте развитието на цвета.

5. Проба с варене.Въз основа на термичната денатурация на протеините.

Напредък. Подкиселете двете епруветки с тестови разтвори с не повече от една капка 1% разтвор на оцетна киселина (AcOH) и загрейте до кипене. След кипене на разтворите за 2-3 минути, регистрирайте резултатите и обяснете механизма на явлението.

6. Утаяване със соли на тежки метали(аз) . Техните денатуриращи свойства се основават на способността на тежките Me катиони да реагират с функционални групи R на протеиновата молекула: тио-, амино-, карбокси-, ароматни. Също така, техните силни аниони причиняват презареждане на йоногенни групи в протеиновите молекули, като по този начин разрушават йонните връзки в тях.

Напредък. Добавете няколко капки 5% разтвор на меден сулфат (CuSO 4) към двете епруветки с тестови разтвори. Запишете и обяснете резултатите.

7. Утаяване с органични киселини.Основава се на киселинна денатурация на протеини и образуване на ковалентни производни на тио-, амино- и ароматни групи на R аминокиселини с хлорорганични съединения.

Напредък. Добавете няколко капки от 10% разтвор на трихлороцетна киселина (TCA) към епруветките с тестови разтвори и запишете резултатите след няколко минути

Тази статия ще разгледа методите за определяне на аминокиселини, които се използват не само в анализа на продуктите, но и в биохимията и фармацевтичния анализ.

Общото количество аминокиселини може да се определи чрез фотометричен метод, базиран на определянето на амоняк, получен от аминокиселини по метода на Kjeldahl.

Реакция с 1-нафтол. За определяне на аргинин, хистидин, тирозин е предложена реакция с 1-нафтол. В присъствието на натриев хипохлорит (NaOCl) разтворът става червен. Разтвор на проба в 50% етанол, съдържащ аминокиселината, се охлажда с лед и се добавят 10% разтвор на NaOCl и разтвор на нафтол. Реакционният продукт е оцветен в червено (l max = 550 nm). Съдържанието на аминокиселини се определя от интензитета на цвета на получения разтвор.

Биуретова реакция. Една от най-важните реакции, използвани за определяне на аминокиселините, е биуретовата реакция. Реакцията се провежда чрез добавяне на разреден воден разтвор на медна (II) сол към алкален разтвор на биурет. В този случай разтворът придобива интензивен виолетов цвят поради образуването на сложно съединение.

Съединения, съдържащи поне 2 амидни групи или аминохидроксиетиленова група, както и амиди и имиди на аминокиселини влизат в биуретовата реакция. Протеините и концентрираните разтвори на аминокиселини и амиди дават тази реакция. Разредените разтвори на аминокиселини не дават биуретна реакция и следователно реакцията може да се използва за установяване на края на протеиновата хидролиза. Реакцията се използва и за качествено и количествено определяне на протеин. Методите, използвани в клиничните диагностични лаборатории за определяне на протеин в кръвта и други биологични течности, се основават на биуретовата реакция.

нинхидринова реакция. Втората най-важна реакция, използвана за определяне на аминокиселини, е реакцията на нинхидрин - цветна реакция за а-аминокиселини, която се извършва чрез нагряване на последните в алкален разтвор на излишък от нинхидрин.

Нинхидринът извършва окислително декарбоксилиране на а-аминокиселини с образуването на амоняк, въглероден диоксид и алдехид, съдържащ един въглероден атом по-малко от оригиналната аминокиселина. Редуцираният нинхидрин след това реагира с освободения амоняк и втората молекула нинхидрин, образувайки оцветен кондензационен продукт с амоняк.

Полученото съединение (пигмент) има виолетово-син цвят (l max = 570 nm). Образуването на това оцветено съединение се използва в количествен тест за a-аминокиселини, с който могат да бъдат открити аминокиселини, дори тяхното количество да не надвишава 1 μg.

Пролинът и хидроксипролинът, които нямат а-аминогрупа, реагират с нинхидрин, за да образуват жълти производни (l max = 440 nm). Реакцията не е специфична, т.к оцветен продукт с нинхидрин също дава амоняк и съединения, съдържащи аминогрупа (амини, протеини, пептиди). С тези съединения обаче не се отделя CO 2 . Отделянето на въглероден диоксид е характерно само за а-аминокиселините. Реакцията се използва за колориметрично количествено определяне на a-аминокиселини, включително в автоматични анализатори на аминокиселини (измерване на обем CO 2 ).

Реакцията на нинхидрин се използва за определяне на глицин, изолевцин, левцин; по-малко интензивен цвят се дава от серин, фенилаланин, цистеин, тирозин, триптофан и др.

Получените продукти се характеризират с доста интензивен цвят (e = 1,8–3,3 · 10 4), но оцветените продукти са нестабилни. Интензивността на цвета намалява бързо. За стабилизиране се добавя CdCl2. Образува стабилни комплекси с получените съединения. Кадмиевият хлорид също ускорява реакцията.

Аминокиселините и някои други съединения, съдържащи аминогрупа, кондензират в алкална среда с 1,2-нафтохинон-4-сулфоксилат, за да образуват червени, жълти, оранжеви производни на 1,2-нафтохинон моноимин.

Реакцията се използва за определяне на а-аминокиселини (валин, изолевцин, левцин и др.).

Реакцията с 4-диметиламинобензалдехид може да се използва за определяне на триптофан. Реакционният продукт е оцветен в лилаво и интензитетът на цвета определя съдържанието на триптофан в анализирания разтвор.

Трябва да се отбележи обаче, че тази реакция рядко се използва в анализа на храните.

За количествено определяне на аминокиселини, съдържащи сяра, се използва броматометричен метод, базиран на следната реакция:

Разтвор на цистеин в 1% разтвор на NaOH се излива в колба със смляна запушалка, 0,1 N. разтвор на калиев бромат, сух калиев бромид и подкислен с 10% НС1.

BrO 3 - + 5Br - + 6H + → 3Br 2 + 3H 2 O

Образуваният в резултат на реакцията бром, чието количество е еквивалентно на количеството калиев бромат, реагира с аминокиселината. След 10 минути се добавя калиев йодид, който реагира с нереагиралия бром и освободеният йод се титрува с 0,1 N. разтвор на натриев тиосулфат с нишесте като индикатор.

2I - + Br 2 → Br - + I 2

Количеството тиосулфат, използвано за титруване, е еквивалентно на количеството бром, който не е реагирал с аминокиселината. По разликата между количеството на добавения калиев бромат и тиосулфат се установява количеството бром, което е реагирало с аминокиселината, а оттам и количеството на аминокиселината.

Метионинът се определя по подобен начин. Метионинът се окислява до сулфон:

Тази реакция при определени условия ви позволява много точно да определите съдържанието на метионин.