Реши това се синтезират интерферонив клетката, първо под формата на прекурсори, съдържащи сигнален пептид в N-края на полипептидната верига, който след това се отцепва и в резултат на това се образува зрял интерферон с пълна биологична активност. Бактериите не съдържат ензими, способни да разцепят сигналния пептид, за да образуват зрял протеин. Да се бактериите синтезират зрял интерферон,само частта от гена, която го кодира, трябва да бъде въведена в плазмида, а частта от гена, кодираща сигналния пептид, трябва да бъде отстранена. Процедурата изисква съответствие със следните условия:

Интерфероновият ген трябва да съдържа три Sau 3A1 места на разцепване, от които едното е в съседство със сигнализиращата част.

Непълното разцепване на гена с този ензим прави възможно изолирането на генен фрагмент, съдържащ нуклеотидната последователност, кодираща зрелия интерферон.

Триплетът ATG, кодиращ цистеин, се отцепва от ензима заедно със сигналната част.

За да се възстанови полинуклеотидната последователност на пълния ген, беше химически синтезиран ДНК фрагмент, съдържащ този триплет, както и ATG триплета, съседен на него, точката на започване на протеиновия синтез.

Този фрагмент беше прикрепен към изолираната част от зрелия ген, което доведе до възстановяването на пълния зрял интерферонов ген.

Реконструираният ген се въвежда в плазмида по такъв начин, че да е в съседство с ДНК промоторната област, което осигурява началото на синтеза на иРНК.

Екстракти от Е. коли,съдържащи такъв плазмид , имаше антивирусна активност.

Интерферонът, синтезиран чрез генно инженерство, е изолиран, пречистен и неговите физикохимични свойства се оказват близки до тези на интерферона, получен от донорска кръв. Успя да получи бактерииспособен синтезирамдо 5 mg интерферон на 1 литър бактериална суспензия, съдържаща приблизително 10 11 бактериални клетки, което е 5000 пъти повече от количеството интерферон, което може да бъде извлечено от 1 литър донорска кръв.

Понастоящем интерферонови гени са клонирани в дрожди и висши еукариотни клетки, способни на гликозилиране.

През 1991 г. за първи път в Съединените щати бяха използвани генетично модифицирани дрождени клетки за синтезиране на човешки левкоцитен интерферон. Saccharomyces cerevisiae.Получената ефективна експресия на гена LeIF и замяната на бактериите с клетки от дрожди направи възможно увеличаването на производството на интерферон с 10 пъти.

В Русия през 1994 г. е извършен пълен генен синтез α- И с размер около 600 N. н. (нуклеотидни точки) в Института по биоорганична химия под ръководството на Н. М. Колосов.

Въпреки напредъка, постигнат в областта на получаването на интерферони с помощта на технологии за генно инженерство и тяхното приложение за лечение на различни вирусни заболявания, включително рак, все още има много въпроси за разрешаване по отношение на декодирането на механизмите на техния биосинтез и взаимодействие с други вещества .

Схемата на биологичното действие на интерферона е показана на фигура 8.34.

Ориз. 8.34. Механизмът на действие на интерферона

Механизмът на действие на интерферона може да се сведе до следното основни етапи:

1. Чрез свързване с клетъчните рецептори интерфероните инициират синтеза на 5"-олигоаденилан синтетаза и ензими протеин киназа чрез иницииране на транскрипцията на съответните гени;

2. И двата ензима проявяват своята активност в присъствието на двойноверижна ДНК, които са репликационни продукти на много вируси;

3. Ензимът 5"-олигоаденилансинтетаза катализира синтеза на 2" 5"-олигоаденилати (от АТФ), които активират клетъчната рибонуклеаза;

4. Протеин киназата фосфорилира и по този начин активира фактора за иницииране на транслацията IF 2. В резултат на тези събития биосинтезата на протеини и възпроизвеждането на вируса (разграждане на иРНК и рРНК) се инхибират в заразената клетка, което причинява нейния лизис.

Тема: Интерферони. Получаване на интерферони.

Интерфероните са открити през 1957 г. в Националния институт за медицински изследвания в Лондон като фактори на резистентност към вирусни инфекции. Установено е, че животинските клетки, изложени на вируса, освобождават в околната среда фактор, способен да придаде устойчивост на здравите клетки към вирусна инфекция: изглежда, че предотвратява (пречи) на възпроизвеждането на вируси в клетката и поради тази способност, се нарича интерферон. Има три вида интерферони:

α, β, отнасящи се към първия клас, γ-интерферон, отнасящ се към втория клас.

Интерферон-α, произвеждан от левкоцитите, има предимно антивирусни, антипролиферативни и антитуморни ефекти.

Интерферон-β, образуван от фибробласти, има предимно антитуморен и антивирусен ефект.

Интерферон -γ - се произвежда от Т-лимфоцити и естествени убийци (NK-клетки) и се нарича лимфоцитен и имунен. Има предимно имуномодулиращ и слаб антивирусен ефект.

Производството на интерферони от клас I се индуцира от вируси, двойноверижна РНК, синтетични двойноверижни олигонуклеотиди, производство на интерферон - γ - вирусни и бактериални антигени или антисеруми срещу повърхностни детерминанти на лимфоцити.Антивирусният ефект на интерфероните се дължи на способността да активират синтеза на два ензима в клетките - олигоаденилат синтетаза и протеин киназа, които инхибират протеиновата биосинтеза и репликацията на вируса в заразената клетка, което предизвиква нейния лизис. Това е същият механизъм на антипролиферативно противотуморно действие на интерфероните.

Интерферон-γ е полифункционален имуномодулиращ лимфокин, който влияе върху растежа и диференциацията на различни видове клетки. Той активира макрофагите на етапа на прехвърляне на антигенна информация към лимфоцит, повишава тяхната антимикробна и противотуморна активност и производството на IL-1. IF-γ активира естествените убийци, цитотоксични лимфоцити, които инхибират растежа на тумора.

Интерфероните-α са протеини, а β и γ - интерфероните - гликопротеини, те са типични глобуларни протеини. В α-интерфероните са открити две дисулфидни връзки. Интерфероните са протеини с ниско молекулно тегло от 146-166 аминокиселинни остатъка, специфични за вида, т.е. човешкият интерферон е биологично активен в човешкото тяло, мишият - само в тялото на мишката.

Сред най-добре проучените интерферони са α-интерфероните; броят на гените, които ги кодират, е приблизително 20; те са локализирани на 9-та хромозома. По отношение на β-интерфероните е изолиран само един протеин, който съответства на човешкия β-интерферон - интерферон β 1 - почти цялата антивирусна активност съответства на него. Възможно е геномът да съдържа редица гени, кодиращи различни β-интерферони. Гените на β-интерферона са локализирани на 9-та хромозома. Интерферон-γ е представен само от един отделен протеин, който е кодиран от един ген, разположен на 12-та хромозома.

Получаване на интерферони. Интерфероните служат като едно от най-ефективните лечения за вирусни инфекции, но те са специфични за вида и могат да бъдат получени само от човешки клетки. Технологията за изолиране и пречистване на интерферони е неефективна, главно поради изключително ниския добив на крайния продукт (от 1 литър кръв може да се изолира само 1 μg интерферон, т.е. приблизително една доза за инжектиране).

На настоящия етап най-обещаващият метод е биосинтезата на интерферони с помощта на генетично модифицирани микроорганизми. сДНК, получени чрез обратна транскрипция, бяха клонирани в Е. coli. Генът на интерферона беше вмъкнат във векторната ДНК и към него бяха прикрепени бактериални регулаторни елементи, програмиращи неговата транскрипция и транслация в бактериалната клетка. Първо, интерфероните в клетката се синтезират под формата на прекурсори, съдържащи сигнален пептид в N-края на полипептидната верига, който след това се отцепва, което води до образуването на зрял интерферон с пълна биологична активност. Бактериите не съдържат ензими, способни да разцепят сигналния пептид, за да образуват зрял протеин. Следователно, за да могат бактериите да синтезират зрял интерферон, само частта от гена, който го кодира, трябва да бъде въведена в плазмида, а частта от гена, кодираща сигналния пептид, трябва да бъде отстранена. Тази процедура се извършва по следния начин. Интерфероновият ген съдържа три места на разцепване Sau 3A1, едно от които е в съседство със сигнализиращата част. Непълното разцепване на гена с този ензим позволява да се изолира генен фрагмент, съдържащ нуклеотидната последователност, кодираща зрелия интерферон, но без първия цистеин. Триплетът ATG, кодиращ цистеин, се отцепва от ензима заедно със сигналната част. За да се възстанови полинуклеотидната последователност на пълния ген, химически се синтезира малък ДНК фрагмент, съдържащ този триплет, както и ATG триплета, съседен на него, точката на започване на протеиновия синтез. Този фрагмент беше прикрепен към изолираната част от зрелия ген и в резултат на това целият зрял интерферонов ген беше възстановен. Реконструираният ген се въвежда в плазмида по такъв начин, че да е в съседство с ДНК промоторната област, което осигурява началото на синтеза на иРНК. Екстракти от E. coli, съдържащи този плазмид, имат антивирусна активност. Интерферонът, синтезиран чрез генно инженерство, беше изолиран, пречистен и неговите физикохимични свойства се оказаха подобни на тези на интерферона, получен от донорска кръв.Беше възможно да се получат бактерии, способни да синтезират до 5 mg интерферон на 1 литър бактериална суспензия, съдържаща приблизително 1011 бактериални клетки, което е 5000 пъти повече от количеството интерферон, което може да бъде извлечено от 1 литър донорска кръв.

С помощта на технологии за генно инженерство в различни лаборатории са получени щамове бактерии, произвеждащи различни интерферони: α-, β- и γ-типове. Недостатъкът на използването на Е. coli за получаване на β- и γ-интерферони е липсата на апарат за гликозилиране на еукариотни протеини в бактерията, което води до синтеза на негликолизирани молекули. И въпреки че ролята на гликозилирането е неясна и негликолизираните β- и γ-интерферони почти напълно запазват своята антивирусна активност, тази характеристика диктува предпазлив подход към използването на генетично модифицирани лекарства в медицинската практика.

Понастоящем интерферонови гени са клонирани в дрожди и висши еукариотни клетки, способни на гликозилиране. През 1981 г. за първи път в Съединените щати генетично модифицираните клетки на дрождите Saccharomyces cerevisiae са използвани за синтезиране на човешки левкоцитен интерферон. Получената ефективна експресия на гена LeIF и замяната на бактериите с клетки от дрожди направи възможно увеличаването на производството на интерферон с 10 пъти.

Интерфероните се произвеждат като лекарства под формата на капки за нос, мехлеми и инжекционни разтвори. Има естествени интерферони, получени от кръвни лимфоцити на донори и изкуствено синтезирани с помощта на технологии за генно инженерство (рекомбинантни). В момента в Русия и в чужбина се произвеждат търговски препарати - човешки левкоцити, лимфобластични (Velferon) и фибробластни (Feron), както и интерферони, получени чрез методи на генно инженерство: рекомбинантен α-интерферон (Roferon, Realderon и др.), β-интерферон и γ-интерферон (Gammaferon).

Интерферонпринадлежи към важните защитни протеини на имунната система. Открито е при изследване на интерференцията на вирусите, т.е. явлението, когато животни или клетъчни култури, заразени с един вирус, стават нечувствителни към инфекция с друг вирус. Оказа се, че намесата се дължи на получения протеин, който има защитно антивирусно свойство. Този протеин е наречен интерферон.

Интерферонът е семейство гликопротеинови протеини, които се синтезират от клетките на имунната система и съединителната тъкан. В зависимост от това кои клетки синтезират интерферон, се разграничават три вида: α, β и γ-интерферони.

Алфа интерферонпроизвежда се от левкоцити и се нарича левкоцит; бета интерфероннаречен фибробластен, защото се синтезира от фибробласти - клетки на съединителната тъкан, и гама интерферон -имунен, тъй като се произвежда от активирани Т-лимфоцити, макрофаги, естествени убийци, т.е. имунни клетки.

Интерферонът непрекъснато се синтезира в тялото и концентрацията му в кръвта се поддържа на около 2 IU / ml (1 международна единица - ME е количеството интерферон, което предпазва клетъчната култура от 1 CPD 50 от вируса). Производството на интерферон се увеличава драстично при заразяване с вируси, както и при излагане на индуктори на интерферон, като РНК, ДНК, сложни полимери. Такива индуктори на интерферон се наричат интерфероногени.

В допълнение към антивирусния ефект, интерферонът има противотуморна защита, тъй като забавя пролиферацията (размножаването) на туморните клетки, както и имуномодулираща активност, стимулираща фагоцитозата, естествени убийци, регулиране на производството на антитела от В-клетките, активиране на експресията на основната хистосъвместимост комплекс.

Механизъм на действиеИнтерферонът е сложен. Интерферонът не действа директно върху вируса извън клетката, но се свързва със специални клетъчни рецептори и засяга процеса на възпроизвеждане на вируса вътре в клетката на етапа на протеиновия синтез.

Използването на интерферон. Действието на интерферона е толкова по-ефективно, колкото по-рано той започва да се синтезира или да влезе в тялото отвън. Поради това се използва за профилактични цели при много вирусни инфекции, като грип, както и за терапевтични цели при хронични вирусни инфекции, като парентерален хепатит (B, C, D), херпес, множествена склероза и др. Интерферонът дава положителен ефект. води до лечение на злокачествени тумори и заболявания, свързани с имунодефицити.

Интерфероните са специфични за вида, т.е. човешкият интерферон е по-малко ефективен за животните и обратно. Тази видова специфика обаче е относителна.

Получаване на интерферон. Интерферонът се получава по два начина: а) чрез заразяване на човешки левкоцити или лимфоцити с безопасен вирус, в резултат на което инфектираните клетки синтезират интерферон, който след това се изолира и от него се изграждат интерферонови препарати; б) чрез генно инженерство - чрез отглеждане в производствени условия на рекомбинантни бактериални щамове, способни да произвеждат интерферон. Обикновено се използват рекомбинантни щамове на Pseudomonas, Escherichia coli с интерферонови гени, вградени в тяхната ДНК. Интерферонът, получен чрез генно инженерство, се нарича рекомбинантен. В нашата страна рекомбинантният интерферон получи официалното име "Reaferon". Производството на това лекарство е много по-ефективно и по-евтино от левкоцитното лекарство.

Рекомбинантният интерферон намира широко приложение в медицината като профилактично и терапевтично средство за вирусни инфекции, неоплазми и имунодефицити.

Антигени. Определение. Концепцията за пълни и дефектни антигени. изисквания към антигените. Понятия за антигенните свойства на микроорганизмите. Антигенна структура на бактериите.

Антигени(от латински анти - срещу, генос - род) - генетично чужди вещества, които при въвеждане във вътрешната среда на тялото могат да предизвикат имунен отговор под формата на образуване на антитела или имунни Т-лимфоцити и да взаимодействат с тях. Основните свойства на антигена са имуногенност и специфичност. Антигените са структурни и химични елементи на клетките и продукти от техния метаболизъм.

Антигените са вещества с колоидна структура, чужди на тялото, които, когато се освободят във вътрешната му среда, са способни да предизвикат специфичен имунологичен отговор, който се проявява по-специално в образуването на специфични антитела, появата на сенсибилизирани лимфоцити, или появата на състояние на толерантност към това вещество.

Веществата, които са антигени, трябва да са чужди на тялото, макромолекулни, да са в колоидно състояние, да влизат в тялото парентерално, т.е. заобикаляйки стомашно-чревния тракт, в който обикновено се случва разграждането на веществото и загубата на неговата чуждост. Чуждостта на антигените трябва да се разбира като определена степен на химическа разлика между антигена и макромолекулите на организма, в чиято вътрешна среда той не влиза.

Антигенните свойства са свързани с молекулното тегло на макромолекулата. Колкото по-високо е молекулното тегло на дадено вещество, толкова по-висока е неговата антигенност. В същото време е неправилно да се приеме, че високото молекулно тегло е задължително свойство на антигена. И така, глюкагон, вазопресин - ангиотензин също имат антигенни свойства.

Обичайно е да се прави разлика между пълни антигени, дефектни антигени (хаптени) и полу-хаптени.

Пълни антигени се наричат ​​тези, които причиняват образуването на антитела или сенсибилизация на лимфоцитите и са в състояние да реагират с тях както в тялото, така и в лабораторни реакции. Протеините, полизахаридите, високомолекулните нуклеинови киселини и сложните съединения на тези вещества имат свойствата на пълноценни антигени.

Дефектните антигени или хаптени сами по себе си не са способни да индуцират образуване на антитела или сенсибилизация на лимфоцитите. Това свойство се проявява само когато към тях се добавят пълни антигени („проводници“) и сред получените антитела или сенсибилизирани лимфоцити някои са специфични за „проводника“, а други са специфични за хаптена.

Полухаптените са относително прости вещества, които при навлизане във вътрешната среда на организма могат химически да се комбинират с протеините на този организъм и да им придадат свойствата на антигени. Някои лекарства (йод, бром, антипирин и др.) също могат да принадлежат към тези вещества.

Молекулата на антигена се състои от две неравни части. Активната (малка част) на c се нарича антигенна детерминанта (епитоп) и определя антигенната специфичност. Антигенните детерминанти се намират в онези места на молекулата на антигена, които са най-свързани с микросредата. В една белтъчна молекула, например, те могат да бъдат разположени не само в краищата на полипептидната верига, но и в други нейни части. Антигенните детерминанти съдържат най-малко три аминокиселини с твърда структура (тирозин, триптофан, фенилаланин). Специфичността на антигена също е свързана с реда на редуване на аминокиселините на полипептидната верига и комбинацията от техните позиции една спрямо друга. Броят на антигенните детерминанти в една антигенна молекула определя нейната валентност. То е толкова по-високо, колкото по-голямо е относителното молекулно тегло на молекулата на антигена.

Смята се, че останалата (неактивна) част от молекулата на антигена играе ролята на детерминантен носител и насърчава проникването на антигена във вътрешната среда на тялото, неговата пиноцитоза или фагоцитоза, клетъчната реакция към проникването на антигена, образуването на медиатори на междуклетъчно взаимодействие в имунния отговор (Т-лимфоцитите имат рецептори за носителя, В- към антигенната детерминанта).

Според анатомичните структури на бактериалната клетка има Н-антигени (флагелирани, ако бактерията ги има), К-антигени (разположени на повърхността на клетъчната стена), О-антигени (свързани с клетъчната стена на бактериите ), антигени, екскретирани от бактериите в тяхната среда (протеини-екзотоксини, капсулни полизахариди).

Сред многобройните антигени на микробна клетка има такива, които са присъщи само на даден тип микроби (типови антигени), даден вид (видови антигени), както и общи за група (семейство) микроорганизми (групови антигени ).

По този начин бактериалната клетка (подобно на микроорганизмите от други царства на микробите - вируси, протозои, гъбички) е сложен комплекс от множество антигени. Когато навлезе във вътрешната среда на макроорганизма, много от тези антигени ще образуват свои собствени специфични антитела. Някои антигени предизвикват образуването на едва забележимо количество антитела (титър), други - бързо и значително образуване на антитела. Съответно се разграничават "слаби" и "силни" антигени.

Не всички антигени на бактериална клетка са еднакво включени в индуцирането на резистентност (имунитет) срещу повторно навлизане на патогенни микроби от същия вид в макроорганизма. Способността на антигена да индуцира имунитет се нарича имуногенност, а такъв антиген се нарича имуноген. Установено е също, че някои антигени на някои микроорганизми могат да предизвикат развитието на различни видове свръхчувствителност (алергия). Такива антигени се наричат ​​алергени.

Според структурата на вирусната частица се разграничават няколко групи антигени: ядрени, капсидни и суперкапсидни. Антигенният състав на вириона зависи от структурата на самата вирусна частица. Антигенната специфичност на просто организираните вируси е свързана с рибо- и дезоксинуклеопротеини. При сложните вируси част от антигена е свързана с нуклеокапсида, а другата е локализирана във външната обвивка - суперкапсид.

Имуногенност- способността за предизвикване на имунен отговор.

Специфичност- способността на антигена да влиза в реакции на взаимодействие със специфични за него антитела или активирани (праймирани) лимфоцити, което води до неутрализиране на този антиген.

Имуногенността се определя:

чуждост, тези. веществото трябва да бъде разпознато от имунната система като "не само". Освен това, колкото по-слабо е изразена генетичната връзка между организма и приложеното вещество, толкова по-добър имуноген е той;

молекулно тегло, която трябва да бъде поне 5-10 kD. Колкото по-голямо е молекулното тегло на антигена, толкова по-силен ще бъде имунният отговор;

химическа природа. Антигените могат да бъдат протеини, полизахариди, полипептиди, фосфолипиди, нуклеинови киселини и др.

В зависимост от химическата природа и молекулното тегло антигените могат да бъдат пълен и непълна

(хаптени).

Пълни антигени(имуногени) предизвикват специфичен имунен отговор и взаимодействат с антитела и активирани Т-лимфоцити. Това са високомолекулни вещества - протеини, полизахариди, гликопротеини, липополизахариди, липопротеини, нуклеопротеини и корпускулни форми (микроорганизми, чужди клетки и др.). Антигените могат да бъдат екзогенни или ендогенни. Ендогенна АГ - собствените клетки на тялото с модифициран геном и продуктите, които образуват ( автоантигени).

Хаптени- това са прости химични съединения с малко молекулно тегло: дизахариди, липиди, пептиди, нуклеинови киселини и др. Те не са имуногенни, но имат високо ниво на специфичност при взаимодействие с продуктите на имунния отговор (антитела и Т-лимфоцити) . Ако хаптенът се комбинира с протеин, той придобива свойството на имуногенност (т.е. става пълен). Спецификата на този комплекс се определя от хаптена

Полухаптени

Проантигени

Полухаптенисе образуват при свързване на неорганични вещества (йод, бром, азот и др.) с протеини. Такива комплекси могат да индуцират образуването на антитела, специфични за неорганични съединения.

Проантигениса алергени-хаптени или неантигенни вещества (сулфонамиди, антибиотици, фенолфталеин и др.). Когато се комбинират с протеини на макроорганизми, те могат да причинят състояние на сенсибилизация и развитие на алергични реакции.

Полухаптенисе образуват при свързване на неорганични вещества (йод, бром, азот и др.) с протеини. Такива комплекси могат да индуцират образуването на антитела, специфични за неорганични съединения.

Проантигениса алергени-хаптени или неантигенни вещества (сулфонамиди, антибиотици, фенолфталеин и др.). Когато се комбинират с протеини на макроорганизми, те могат да причинят състояние на сенсибилизация и развитие на алергични реакции.

През 1957 г. учените откриха, че клетките, заразени с вирус, произвеждат специално вещество, което инхибира възпроизвеждането както на хомоложни, така и на хетероложни вируси, което те нарекоха интерферон. Ако имунната система осигурява протеинова хомеостаза и елиминира чрез нея чужда генетична информация, тогава интерфероновата система директно засяга чуждата генетична информация, като я елиминира от тялото на клетъчно ниво и по този начин осигурява нуклеиновата хомеостаза. Интерфероновата система тясно взаимодейства с имунната система.
Интерфероните са кодирани в генетичния апарат на клетката. Гените за човешкия фибробластен интерферон са разположени във 2-ро, 9-то и дълго рамо на 5-та хромозома, генът, регулиращ транскрипцията, е в късото рамо на същата хромозома. Генът, който определя чувствителността към действието на интерферона, е локализиран в 21-вата хромозома. Генът за α-интерферон се намира на 9-та хромозома, за γ-интерферон - на 11-та хромозома.
Интерфероновата система няма централен орган, тъй като всички клетки на тялото на гръбначните животни имат способността да произвеждат интерферон, въпреки че белите кръвни клетки го произвеждат най-активно.
Интерферонът не се произвежда спонтанно от непокътнати клетки и за неговото образуване са необходими индуктори, които могат да бъдат вируси, бактериални токсини, екстракти от гъбични бактерии, фитохемаглутинини, синтетични вещества - поликарбоксилати, полисулфати, декстрани, но най-ефективните индуктори на интерферона са двойно- усукана РНК: двойно-верижна вирусна РНК, двойно-верижни синтетични съполимери на рибонуклеотиди (поли-GC, поли-IC) и др. Индукцията на интерферон възниква поради дерепресия на неговите гени.
Видове интерферони. Известни са три вида човешки интерферони: α-интерферон или левкоцитен интерферон, който се произвежда от левкоцити, третирани с вируси и други агенти; β-интерферон или фибробластен интерферон, който се произвежда от фибробласти, третирани с вируси и други агенти. И двата интерферона принадлежат към тип 1. По-силният γ-интерферон, или имунен интерферон, принадлежи към тип 2. Има няколко подвида на α-интерферон и общият им брой при хората достига 25. Сравнителните характеристики на човешките интерферони са дадени в масата. Активността на интерферона се измерва в международни единици (ME). Една единица съответства на количеството интерферон, което инхибира размножаването на вируса с 50%.
По време на индуцирането на интерферони се синтезират два или повече от неговите видове. И така, при индуцирането на интерферон върху лимфобластите се образуват 87% от левкоцитния и 13% от фибробластния интерферон, при индуцирането на интерферон върху фибробластите има обратна връзка. Между трите вида интерферони могат да съществуват синергични взаимодействия.

таблица 2
Сравнителни характеристики на човешки интерферони

Свойства на интерфероните. Интерфероните имат специфична тъканна специфичност. Това означава, че човешкият интерферон е активен само в човешкото тяло, но е неактивен в тялото на други биологични видове. Разбира се, бариерите пред видовата специфичност не са абсолютни: човешкият интерферон проявява известна активност в тъканите на човекоподобните маймуни, акринният интерферон в тялото на сродни видове от семейство Кокоши. Въпреки това, активността на интерферона в хетерогенни организми е рязко намалена.
Следователно може да се заключи, че интерфероните, появили се в гръбначните животни, са еволюирали заедно с техните гостоприемници. Интерферонът е сравнително стабилен протеин и понася добре кисела среда (рН 2,2), което се използва за изолирането и пречистването му. Антигенните свойства на интерфероните не са много изразени, поради което антителата към него могат да бъдат получени само след многократни имунизации.
Интерфероните нямат специфичност по отношение на вирусите и действат потискащо върху репродукцията на различни вируси, въпреки че различните вируси имат различна чувствителност към кинтерферон. Чувствителността към него обикновено съвпада със синдузивната активност на кинтерферон. Най-често използваните индуктори на интерферон и тестови вируси за титруването му са рабдовируси (вирус на везикулозен стоматит), парамиксовируси и тогавируси. Производството на интерферон също зависи от естеството на използваните клетки. Има клетки, които са дефектни в няколко интерферонови гена.
Интерфероните имат антивирусно, противотуморно, имуномодулиращо и други действия. Тяхното антивирусно действие е най-изучено и именно върху вирусни модели са изяснени биологичните и други свойства на интерфероните.
Интерферонът има антитуморен ефект, когато се прилага парентерално във високи дози, свързан с потискане на цитопролиферативната активност. Добавянето на интерферон към културата на нормални клетки е придружено още след 2 часа от инхибирането на техния ДНК синтез. При индуцирани от вируси тумори интерферонът инхибира възпроизвеждането на онковируси и едновременно с това потиска цитопролиферативната активност.
Интерферонът е регулатор на различни механизми на имунния отговор, осигурявайки стимулиращ или потискащ ефект върху имунните отговори.
Механизъм на действие на интерферона. Интерферонът се свързва с клетъчните рецептори, разположени на плазмената мембрана, което служи като сигнал за дерепресия на съответните гени. В резултат на това се индуцира синтеза на специална протеин киназа PKs, която присъства в следи във всички клетки на бозайниците и се активира от ниски концентрации на двойноверижна РНК, а в инфектираните с вирус клетки - от вирусни репликационни комплекси.
Протеин киназата фосфорилира а-субединицата на иницииращия транслационен фактор eIF-2 и фосфорилирането блокира активността на иницииращия фактор. В резултат на това иРНК, свързана с иницииращия комплекс, не може да се свърже с голямата рибозомна субединица и следователно нейната транслация е блокирана. Иницииращият фактор eIF-2 е еднакво необходим за транслацията както на клетъчни, така и на вирусни иРНК, но транслацията на вирусни иРНК, свързани с вирусни двойноверижни РНК структури, е предимно блокирана в резултат на локално активиране на протеин киназата.
В клетките, третирани с интерферон, се индуцира синтеза на ензима синтетаза, който катализира 2,5-олигоадениловата киселина, която превключва действието на клетъчните нуклеази към разрушаване на вирусната иРНК. По този начин вирусните иРНК се разграждат от нуклеази. Блокирането от интерферон на етапа на започване на транслацията и разрушаването на иРНК определя универсалния му механизъм на действие при инфекции, причинени от вируси с различен генетичен материал.
Използването на интерферони. Интерфероните се използват за предотвратяване и лечение на редица вирусни инфекции. Техният ефект се определя от дозата на лекарството, но високите дози интерферон имат токсичен ефект. Интерфероните се използват широко при грип и други остри респираторни заболявания. Лекарството е ефективно в ранните стадии на заболяването, прилага се локално, например чрез вливане или вдишване на горните дихателни пътища в концентрации до 3∙104-5∙104 единици 2-3 пъти на ден. При конюнктивит интерферонът се използва под формата на капки за очи. Интерфероните имат терапевтичен ефект при хепатит В, херпес, както и при злокачествени новообразувания. При тези заболявания се предписват по-високи концентрации. Лекарството се използва парентерално - интравенозно и интрамускулно в доза от 105 единици на 1 kg телесно тегло. По-високите дози имат странични ефекти (треска, главоболие, косопад, замъглено зрение и др.). Интерферонът може също да причини лимфопения, забавено узряване на макрофагите, при деца - тежки шокови състояния, при пациенти със сърдечно-съдови заболявания - инфаркт на миокарда. Пречистването на интерферона значително намалява неговата токсичност и позволява използването на високи концентрации. Пречистването се извършва чрез афинитетна хроматография с използване на моноклонални антитела срещу кинтерферон.
Генно модифициран интерферон. Генно модифицираният левкоцитен интерферон се получава в прокариотни системи (Е. coli). Биотехнологията за получаване на интерферон включва следните стъпки:
1) лечение на левкоцитна маса с индуктори на интерферон;
2) изолиране на иРНК сместа от третираните клетки;
3) получаване на обща комплементарна ДНК (cDNA) с помощта на обратна транскриптаза;
4) вмъкване на cDNA в плазмида на Escherichia coli и неговото клониране;
5) селекция на клонове, съдържащи интерферонови гени;
6) включване на силен промотор в плазмида за успешна генна транскрипция;
7) експресия на интерфероновия ген, т.е. синтез на съответния протеин;
8) разрушаване на прокариотни клетки и пречистване на интерферон с помощта на афинитетна хроматография.
Получени са високопречистени и концентрирани интерферонови препарати, които се изпитват в клиниката.
Човешкият левкоцитен интерферон, нативен и концентриран, е предназначен за профилактика и лечение на грип и други вирусни респираторни заболявания.
Левкоцитният интерферон е видоспецифичен протеин, синтезиран от човешки левкоцити в отговор на ефектите на интерфероногенния вирус. Интерферонът няма селективна антивирусна активност и действа върху почти всички вируси.
За получаването на интерферон се използват левкоцити от прясно получена донорска кръв. Под въздействието на вирус - интерфероноген, левкоцитите в културалната среда синтезират интерферон. След това левкоцитите се отстраняват чрез центрофугиране, вирусът се инактивира. Лекарството е нативен интерферон. За да се получи концентриран нативен интерферон, той се пречиства допълнително чрез хроматографско разделяне на колони със сефадекс.
Интерферонът се произвежда в суха форма в ампули. Природният сух интерферон е сиво-кафяв порест прах, който е лесно разтворим в дестилирана вода. Разтвореното лекарство има розово-червен цвят с бледене. Допуска се лек кафяв нюанс на разтвора. Концентрираният сух препарат е порест сиво-бял прах, който също е лесно разтворим в дестилирана вода. Разтворът на лекарството има сивкав цвят с копалесценция, да кажем лек жълтеникаво-кафяв оттенък. Не трябва да се съдържат чужди примеси.
Човешкият левкоцитен интерферон се произвежда вирусологично и бактериологично стерилен. Антивирусната активност на местното лекарство трябва да бъде най-малко 32 единици, концентрирана - 100 единици. Активността се определя чрез титруване върху първичната клетъчна култура на мускулно-скелетната тъкан на човешки ембрион с вирус на везикулозен стоматит.
Няма противопоказания за употребата на лекарството. Интерферонът е нереактивен, не предизвиква странични ефекти.
Лекарството се съхранява при температура 4 °C. Срок на годност 1 година. След изтичането му може да се извърши повторен контрол от института, произвел тази серия от лекарството. При запазване на физическите свойства и активност, срокът на годност на лекарството може да бъде удължен с още 3 месеца.

интерферон левкоцитен ген вирус

Понастоящем методът за получаване на интерферон чрез микробиологичен синтез е признат за по-обещаващ, което прави възможно получаването на целевия продукт с много по-висок добив от сравнително евтина суровина. Подходите, използвани в този случай, позволяват да се създадат варианти на структурния ген, които са оптимални за бактериална експресия, както и регулаторни елементи, които контролират неговата експресия.

Като изходни микроорганизми се използват различни дизайни на щамове Pichia pastoris, Pseudomonas putida и Escherichia coli.

Недостатъкът на използването на P. pastoris като производител на интерферон е изключително трудните условия на ферментация за този вид дрожди, необходимостта от стриктно поддържане на концентрацията на индуктора, по-специално на метанола, по време на процеса на биосинтеза.

Недостатъкът на използването на щамове на Ps. putida е сложността на процеса на ферментация при ниско ниво на експресия (10 mg интерферон на 1 литър културална среда). По-продуктивно е използването на щамове Escherichia coli.

Известни са голям брой плазмиди и интерферон-експресиращи щамове E. coli: щамове E. coli ATCC 31633 и 31644 с плазмиди Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 или Z-pBR 322(Pstl)/HclN SN 35 - AHL6 (SU 1764515), E. coli щам pINF-AP2 (SU 1312961), E. coli щам pINF-F-Pa (AU 1312962), E. coli щам SG 20050 с p280/21FN плазмид, E. coli щам SG 20050 с плазмид pINF14 (SU 1703691), щам E. coli SG 20050 с плазмид pINF16 (RU 2054041) и др. Недостатъкът на технологиите, базирани на използването на тези щамове, е тяхната нестабилност, както и недостатъчното ниво на експресия на интерферон.

Наред с характеристиките на използваните щамове, ефективността на процеса до голяма степен зависи от използваната технология за изолиране и пречистване на интерферона.

Известен е метод за производство на интерферон, който включва култивиране на клетки Ps. putida, разрушаване на биомаса, третиране с полиетиленимин, фракциониране с амониев сулфат, хидрофобна хроматография върху фенилсилохром С-80, рН фракциониране на лизата, неговото концентриране и диафилтрация, йонообменна хроматография върху DE-52 целулоза, рН градиентно елуиране, йонообменна хроматография на полученият елуент върху СМ целулоза -52, концентрация чрез преминаване през филтърна касета и гел филтрация върху Sephadex G-100 (SU 1640996). Недостатъкът на този метод, освен сложната многоетапна ферментация, е многоетапният процес при получаване на крайния продукт.

Също така е известен метод за производство на интерферон, който включва култивиране на щам E. coli SG 20050/pIF16 в LB бульон в колби в термостатиран шейкър, центрофугиране на биомасата, промиване с буферен разтвор и обработка с ултразвук за унищожаване на клетките. Полученият лизат се центрофугира, промива се с 3М урея в буфер, разтваря се в гуанидин хлорид в буфер, обработва се с ултразвук, центрофугира се, окислителна сулфитолиза, диализа срещу 8М урея, ренатурация и крайна двустепенна хроматография върху CM-52 целулоза и Sephadex G-50 (EN 2054041).

Недостатъците на този метод са неговата относително ниска производителност на основните етапи на процеса на изолиране и пречистване. По-специално, това се отнася за ултразвукова обработка на продукта, диализа и окислителна сулфитолиза, което води до нестабилност в добива на интерферон, както и невъзможността за използване на този метод за промишлено производство на интерферон.

Като най-близък аналог (прототип) може да се посочи метод за получаване на човешки левкоцитен интерферон, който се състои в култивиране на рекомбинантен щам на Е. coli, замразяване на получената биомаса при температура не по-висока от -70 ° C, размразяване, унищожаване на клетки от микроорганизми с лизозим, отстраняване на ДНК и РНК чрез въвеждане в ДНКазния лизат и пречистване на изолираната неразтворима форма на интерферон чрез промиване с буферен разтвор с детергенти, разтваряне на утайката на интерферон в разтвор на гуанидин хидрохлорид, ренатуриране и едноетапно пречистване чрез йонообменна хроматография. Като продуцент се използва щамът E. coli SS5, получен с помощта на рекомбинантния pSS5 плазмид, съдържащ три промотора: Plac, Pt7 и Ptrp, и алфа-интерфероновия ген с въведени нуклеотидни замествания.

Експресията на интерферон от щама E. coli SS5, съдържащ този плазмид, се контролира от три промотора: Plac, Pt7 и Ptrp. Нивото на експресия на интерферон е около 800 mg на 1 литър клетъчна суспензия.

Недостатъкът на този метод е ниската технологичност на използването на ензимно разрушаване на клетки, ДНК и РНК на микроорганизма и едноетапно хроматографско пречистване на интерферон. Това причинява нестабилност на процеса на изолиране на интерферон, води до намаляване на качеството му и ограничава възможността за използване на горната схема за промишлено производство на интерферон.

Недостатъците на този плазмид и щама, базиран на него, са използването в плазмида на силен нерегулиран Т7 фагов промотор в щама E. coli BL21 (DE3), в който Т7 РНК полимеразният ген е под промотора на lac оперон и който винаги "тече". Следователно, синтезът на интерферон се извършва непрекъснато в клетката, което води до дисоциация на плазмида и намаляване на жизнеспособността на клетките на щама и в резултат на това до намаляване на добива на интерферон.

Пример за получаване на рекомбинантен интерферон:

600 g от биомасата на Pseudomonas putida 84 клетки, съдържащи рекомбинантния p VG-3 плазмид, съдържат 130 mg алфа-2 интерферон след култивиране. Клетките се зареждат в балистичен дезинтегратор с механична бъркалка с капацитет 5,0 l и 3,0 l лизисен буфер, съдържащ 1,2% натриев хлорид, 1,2% трис-(хидроксиметил)-аминометан, 10% захароза, 0,15% етилендиаминтетраоцетна киселина ( EDTA), 0,02% фенилметилсулфонил флуорид и 0,01% дитиотреитол при рН 7,7. Биомасата се разбърква до получаване на хомогенна суспензия в продължение на 30 минути, след което се разпада в циркулационен режим в балистичен дезинтегратор в съответствие с инструкциите за работа. Времето за разпадане е 1,5 ч. Процесът на разпадане завършва, когато по време на микроскопията на препарата практически не се наблюдават цели клетки от микроорганизми в няколко зрителни полета на микроскопа. Обемът на лизираната суспензия от биомаса е 3,5 литра.

Полученият на този етап лизат след това навлиза в етапа на утаяване на нуклеинови киселини. За да направите това, 180 ml от 5% разтвор на полиетиленимин се добавят към контейнера, съдържащ лизата, при разбъркване със скорост 1-1,2 l/h. Суспензията се разбърква в продължение на 1 час и се центрофугира за отделяне на утайката от нуклеинови киселини в продължение на 1 час при (9500±500) rpm, при температура (5±2)C. След центрофугиране се отделя супернатантата, чийто обем е 3,0 l.

При бавно разбъркване с бъркалка 182 g сух амониев сулфат се изсипват в супернатанта на малки порции (всяка следваща порция се добавя след пълното разтваряне на предходната). След приключване на добавянето на амониев сулфат, разбъркването продължава до пълното разтваряне на солта и суспензията от протеинова утайка се държи при температура (5 ± 2) С в продължение на 16 часа и след това се центрофугира в продължение на 1 час при (13500 ± 500) rpm при температура (5 ± 2) ОТ.

Получената утайка се разтваря в дестилирана вода, довеждайки общия обем до 4 литра. Беше извършено киселинно фракциониране на получения разтвор, съдържащ алфа-2 интерферон, за да се утаят съпътстващите протеини. За тази цел към разтвора се добавят 5,0 ml 50% оцетна киселина до рН 4,75. Получената смес се прехвърля в хладилник и се оставя при температура (5±2)С за 3 h, след което протеиновата суспензия се центрофугира при (13500±500) rpm за 30 min при (5±2)С.

Към 4 1 от супернатанта се добавят 50.0 ml 1 М Tris разтвор до рН (6.9 ± 0.1). Концентрацията на общия протеин, определена по метода на Lowry, е 9,0 mg / ml, биологичната активност на алфа-2 интерферон (6.80.5) 106 IU / ml. Специфична активност 8.5105 IU/mg. Общото съдържание на алфа-2 интерферон на този етап е 2,91010 IU.

Сорбентът Soloz KG в количество от 0,6 l под формата на водна суспензия се поставя в хроматографска колона. След това, използвайки перисталтична помпа, 2,0 L 0,2 М разтвор на натриев хидроксид, 6,0 L дестилирана вода и 4,5 L 0,05 М трис-ацетатен буферен разтвор бяха последователно прекарани през сорбента при рН (7,1 ± 0, 1), което се наблюдава с рН метър на изхода на колоната.

Протеиновият разтвор, съдържащ алфа-2 интерферон, се разрежда с дестилирана вода до проводимост (6.0+2.0) mS/cm при стайна температура. Обемът на разтвора в този случай е 19,2 литра.

Разтворът се нанася в колоната със скорост 1.5 l/час, след което сорбентът се промива с 2.0 l трис-ацетатен буфер 0.05 М при рН 7.0. Елуирането се извършва с 1,2 1 0,05 М разтвор на Tris с рН (10,2±0,1) Съдържанието на интерферон във фракциите, събрани с помощта на фракционния колектор, се определя чрез ензимен имуноанализ.

Концентрацията на общия протеин, определена по метода на Lowry, е (2,2 ± 0,2) mg / ml, биологичната активност на алфа-2 интерферон е (2,1 ± 0,5) 107 IU / ml, специфичната активност на лекарството е (9,7 ± 0,5)106 IU/mg. Общото съдържание на алфа-2 интерферон на този етап е (1,5±0,5)1010 IU.

Сорбент Spherocell qae в количество 0,15 l под формата на водна суспензия се зарежда в колоната и се промива със скорост 0,15 l/h последователно с 0,5 l 2 М разтвор на натриев хлорид, 1,5 l дестилирана вода и 1,0 l трис-ацетатен буферен разтвор 0,05 М с рН 8,0, като рН на буферния разтвор се контролира на изхода на колоната с рН метър.

0.7 1 протеинов разтвор, съдържащ алфа-2 интерферон, се прилага към 0.15 1 Spherocell-QAE сорбентна колона със скорост 0.2 1/h. Колоната се промива с 0.05 М трис-ацетатен буферен разтвор (рН 8.0) с обем от 0.1 L, след това онечистените протеини се промиват с 1.0 L от същия буферен разтвор с добавяне на 0.05 М NaCI. Интерферонът се елуира с 0.8 1 0.1 М натриев ацетатен буферен разтвор при рН 5.0. Съдържанието на алфа-2 интерферон във фракции, събрани с помощта на колектор, се определя чрез ензимен имуноанализ. Концентрацията на протеин е (0,35±0,05) mg/ml, биологичната активност на алфа-2 интерферон е (1,7±0,2) 107 IU/ml. Специфичната активност на лекарството е 5,5107 IU/mg протеин. Елуатът съдържа 1.20 х 1010 IU. Добивът на биологична активност на този етап е 82,5%.

Полученият разтвор се коригира до рН (5.0±0.1) с 50% оцетна киселина и се разрежда с 0.05 М натриев ацетатен буфер. Специфичната електропроводимост е (0,29±0,02) mS/cm при температура (5±2)C. Полученият по този начин протеинов разтвор се нанася в колона със сорбент Spherocell LP-M със скорост 0,1 l/h, промива се с 0,3 l от горния буферен разтвор и след това интерферонът се елуира с линейна концентрация на натриев хлорид. градиент, създаден с помощта на градиентен миксер Ultrograd. Елуатът се фракционира с помощта на фракционен колектор и се измерва концентрацията на общия протеин и алфа-2 интерферон. Концентрация на протеин в сборни фракции (0,45±0,02) mg/ml. Обемът на разтвора е 0,1 l. Общото съдържание на алфа-2 интерферон (8,6±0,2) 109 IU. Специфична активност - e (7,5 ± 0,2) 107 IU / mg. Добивът на този етап е 73%.

Полученият 3 0.1 L разтвор се концентрира до (5.0±0.2) ml с ултрафилтрационна клетка, като се използва Amicon YM-3 мембрана. Така приготвената проба се нанася върху сорбентна колона Sephadex G-100, уравновесена с фосфатно буфериран физиологичен разтвор при скорост от 0.025 l/h. Обемът на фракциите е 10,0 ml. Фракциите, получени след хроматография, се изследват за съдържанието на алфа-2 интерферон чрез ензимен имуноанализ и чрез комбиниране на фракции, съдържащи основния пик на алфа-2 интерферон. Обемът на получения разтвор е 30,2 ml. Концентрацията на общ протеин, определена по метода на Lowry, (0,90±0,02) mg/ml. Общото съдържание на алфа-2 интерферон в разтвора е 5,5109 IU. Специфичната активност на полученото лекарство алфа-2 интерферон 2,3108 IU/mg. Изходът на алфа-2 интерферон на този етап е 90,2%. Полученият продукт се стерилизира и опакова. Общият добив на лекарството е 35,8%, включително 51% на етапа на пречистване.

За получаване на големи количества IFN се използват шестдневни еднослойни култури от клетки от пилешки ембриони или култивирани човешки кръвни левкоцити, заразени с определен тип вирус. С други думи, за получаване на IFN се създава специфична вирусно-клетъчна система.

Генът, отговорен за биосинтезата на IFN, е изолиран от човешка клетка. Екзогенният човешки IFN се получава с помощта на рекомбинантна ДНК технология. Процедурата за изолиране на cDNA на IFN е както следва:

1) иРНК се изолира от човешки левкоцити, фракционира се по размер, извършва се обратна транскрипция и се вмъква в мястото на модифицирания плазмид.

2) Полученият продукт се трансформира в Е. coli; получените клонове се разделят на групи, които се идентифицират.

3) Всяка група клонинги, хибридизирани с IFN - иРНК.

4) От получените хибриди, съдържащи cDNA и xRNA, се изолира иРНК, нейната транслация се извършва в системата за синтез на протеини.

5) Определете интерфероновата антивирусна активност на всяка смес, получена в резултат на транслация. Групи, които са показали интерферонова активност, съдържат cDNA клонинг, хибридизиран с IFN - mRNA; повторно идентифициране на клонинг, съдържащ IFN с пълна дължина - човешка кДНК.

Подобна информация.