Sprzęt i odczynnik: papier chromatograficzny; komora chromatograficzna; kolorymetr fotoelektryczny; nożyce; szklane talerze (3x32 cm) - 3 szt .; uchwyt na chromatogramy; szafka do suszenia; mikropipety; probówki z uziemionymi korkami; biureta 25 ml; standardowa mieszanka aminokwasów; testowa mieszanka aminokwasów; butanol, kwas octowy, woda w stosunku 15:3:7; 1% roztwór ninhydryny w 95% acetonie; alkohol etylowy (75%), nasycony siarczanem miedzi.

Zakończenie pracy

Weź arkusz papieru chromatograficznego o wymiarach 18x28 cm i prostym ołówkiem narysuj poziomą linię w odległości 3 cm od jego krótszej krawędzi. Następnie dzieli się ją na nierówne segmenty zgodnie z załączonym schematem i zaznacza strzałkami granice stosowania mieszaniny wzorcowej i testowej, a prostym ołówkiem wykonuje odpowiednie napisy.

Papier mocuje się nad powierzchnią stołu i na linii startu, ograniczonej strzałkami, najpierw specjalną mikropipetą nakłada się cienką linią mieszaninę wzorców, aż cały roztwór z mikropipety zostanie przeniesiony na linię startu (mikropipeta jest wypełniona 2-3 cm). Masę zastosowanego roztworu mierzy się ważąc pipetę napełnioną mieszaniną wzorcową (przed nałożeniem roztworu) i pustą (po naniesieniu roztworu). Na papier nanosi się zwykle 0,02-0,03 g roztworu wzorcowego. Następnie napełnij czystą pipetę mieszanką aminokwasów do badania (podaną przez prowadzącego do badania), zważ ją i nałóż mieszaninę na linię startową z odpowiednim oznaczeniem.

Przygotowany chromatogram umieszcza się w komorze chromatograficznej z wcześniej wlanym do niej układem rozpuszczalników w celu rozdzielenia mieszaniny aminokwasów, np. mieszaniny butanolu, kwasu octowego i wody w stosunku 15:3:7. Rozdzielanie przeprowadza się metodą chromatografii wznoszącej, aż pierwsza linia osiągnie 2-3 cm do górnej krawędzi bibuły chromatograficznej (linia mety). Następnie chromatogram jest wyjmowany z komory, a górny koniec bibuły jest natychmiast wkładany do uchwytu złożonego z trzech szklanych prętów przymocowanych gumowym pierścieniem i umieszczany pod wyciągiem na 20 min w celu usunięcia rozpuszczalników z bibuły.

Ryż. 8. Schemat ułożenia aminokwasów na chromatogramie:

A - punkt aplikacji mieszaniny aminokwasów; I - cystyna i cysteina;

2 - lizyna; 3 - histydyna; 4 - arginina; 5 - kwas asparaginowy,

serie i glicyna; 6 - kwas glutaminowy i treonina; 7 - alanina;

8 - prolina; 9 - tyrozyna; 10 - walina i metionina; II - tryptofan;

12 - fenyloalanina; 13 - leucyna i izoleucyna

Wysuszony chromatogram zanurza się w 1% roztworze ninhydryny w acetonie w celu wykrycia na nim pozycji plamek aminokwasów. Następnie chromatogram umieszcza się na 10 minut pod wyciągiem w celu usunięcia acetonu i przenosi do pieca, gdzie pozostawia się go na 15 minut w temperaturze 70°C. Aminokwasy wzorca i mieszanin testowych są wykrywane jako niebiesko-fioletowe plamki ułożone w łańcuch w kierunku układu rozpuszczalników od linii początkowej do górnej krawędzi chromatogramu.

Identyfikację aminokwasów zawartych w badanej mieszaninie przeprowadza się przypadkowo na chromatogramie pozycji zajmowanych przez aminokwasy mieszaniny wzorcowej i badanej (ryc. 8).

Aby określić ilościową zawartość aminokwasów w badanych mieszaninach, chromatogram rysuje się prostym ołówkiem tak, aby kolorowe strefy leżące na tym samym poziomie, odpowiadające temu samemu aminokwasowi, były zamknięte w mniej więcej identycznych prostokątach (ryc. 9). .

I II III IV

Ryż. 9. Schemat ułożenia aminokwasów na chromatogramie:

I - mieszanina nr I; II - mieszanina nr 2; 1U - mieszanina nr 3; Ř - standardowe

mieszanka aminokwasów

Zarysowane fragmenty papieru wycina się i umieszcza w probówkach, których liczba powinna odpowiadać liczbie plamek na chromatogramach. 10 ml 75% roztworu alkoholu etylowego nasyconego siarczanem miodu wlewa się do każdej probówki z biurety (0,2 ml nasyconego roztworu siarczanu miedzi dodaje się do 500 ml alkoholu etylowego). Probówkę zamyka się korkiem i okresowo mieszając uzyskuje się całkowite przejście ceglastoczerwonego koloru (sól miedziowa niebiesko-fioletowego Ruemana) z bibuły do ​​roztworu. Zajmuje to 15-20 minut. Absorbancję (gęstość optyczną) roztworów wzorcowych i testowych mierzy się na fotoelektrokalorymetrze z filtrem światła zielonego (540 nm). W strumieniu referencyjnym instaluje się kuwetę z 75% roztworem alkoholu etylowego z siarczanem miedzi.

Ilościową zawartość aminokwasów w roztworze testowym oblicza się ze stosunku ekstynkcji próbki testowej i wzorcowej.

Przykład obliczenia. Zakładając, że mieszanina wzorcowa zawiera 1,8 mg glicyny w 1 ml, 0,02 g tego roztworu wzorcowego nanosi się na pasek startowy. Otrzymano więc chromatogram (1,8×0,02) = 0,036 mg glicyny. Umówmy się dalej, że absorbancja barwnych roztworów wynosiła 0,288 dla wzorca i 0,336 dla nieznanej mieszaniny. Wtedy zawartość glicyny w badanej mieszaninie naniesionej na chromatogram wyniesie (36´0,336): 0,288=42 µg. Jeżeli dodatkowo przyjmiemy, że badaną mieszaninę nanosi się na chromatogram w ilości np. 0,0250 g, to zawartość glicyny w 1 ml badanego roztworu wyniesie (42: 0,0250) = 1680 μg, czyli 1,68 mg / ml.

Opracuj wyniki własnego eksperymentu, wyciągnij z nich wnioski.

Laboratorium nr 15

Separacja jonówFe 3+ , współ 2+ , Ni 2+

Aminokwasy można wykryć za pomocą reakcji barwnych: ninhydrynowych, ksantoproteinowych, Fol, Milon, testów biuretowych itp. Reakcje te są niespecyficzne, ponieważ opierają się na wykrywaniu poszczególnych fragmentów w strukturze aminokwasów, które mogą występować również w innych związkach.

Reakcja ninhydrynowa, reakcja barwna stosowana do jakościowego i ilościowego oznaczania aminokwasów, iminokwasów i amin. Po podgrzaniu w alkalicznym środowisku ninhydryny (triketohydrindenhydrat, C 9 H b O 4) z substancjami mającymi pierwszorzędowe grupy aminowe (-NH 2), powstaje produkt o stabilnym intensywnym niebiesko-fioletowym kolorze z maksymalną absorpcją około 570 nm. Ponieważ absorpcja przy tej długości fali zależy liniowo od liczby wolnych grup aminowych, reakcja ninhydrynowa posłużyła jako podstawa do ich ilościowego oznaczenia metodą kolorymetryczną lub spektrofotometryczną. Reakcja ta wykorzystywana jest również do oznaczania drugorzędowych grup aminowych (>NH) w iminokwasach - prolinie i hydroksyprolinie; w tym przypadku powstaje jasnożółty produkt. Czułość - do 0,01%. Nowoczesna automatyczna analiza aminokwasów jest prowadzona poprzez połączenie separacji jonowymiennej aminokwasów i ich ilościowego oznaczania za pomocą reakcji ninhydrynowej. Przy rozdzielaniu mieszanin aminokwasów metodą chromatografii bibułowej każdy aminokwas można oznaczyć w ilości co najmniej 2-5 μg.

Ilość aminokwasów można ocenić na podstawie intensywności koloru.

Ta reakcja jest pozytywna nie tylko z wolnymi aminokwasami, ale także z peptydami, białkami itp.

reakcja ksantoproteinowa pozwala na wykrycie aminokwasów aromatycznych (fenyloalaniny, tyrozyny, histydyny, tryptofanu) na podstawie reakcji substytucji elektrofilowej w jądrze aromatycznym (nitrowanie).

Pod działaniem stężonego kwasu azotowego, na przykład na tyrozynę, powstaje żółty produkt.

Reakcja Fohla. Jest to reakcja na cysteinę i cystynę. Podczas hydrolizy alkalicznej „słabo związana siarka” w cysteinie i cystynie dość łatwo ulega odszczepieniu, w wyniku czego powstaje siarkowodór, który w reakcji z alkaliami daje siarczki sodu lub potasu. Po dodaniu octanu ołowiu (II) tworzy się szaro-czarny osad siarczku ołowiu (II).

Opis doświadczenia. Do probówki wlać 1 ml roztworu cystyny, dodać 0,5 ml 20% roztworu wodorotlenku sodu. Mieszaninę ogrzewa się do wrzenia, po czym dodaje się 0,5 ml roztworu octanu ołowiu(II). Obserwuje się szaro-czarny osad siarczku ołowiu (II):

Reakcja Zimmermanna. Jest to reakcja na aminokwas glicynę.

Opis doświadczenia. Do 2 ml 0,1% roztworu glicyny, doprowadzonego 10% roztworem zasady do pH = 8, wlać 0,5 ml wodnego roztworu dialdehydu o-ftalowego. Mieszanina reakcyjna zaczyna powoli zmieniać kolor na jasnozielony. Po kilku minutach pojawia się zielony osad.

reakcja na tryptofan. Tryptofan reagując w kwaśnym środowisku z aldehydami tworzy barwne produkty kondensacji. Na przykład z kwasem glioksalowym (który jest zanieczyszczeniem stężonego kwasu octowego) reakcja przebiega zgodnie z równaniem:

Reakcja tryptofanu z formaldehydem przebiega według podobnego schematu.

Reakcja Sakaguchiego. Ta reakcja na aminokwas argininę opiera się na interakcji argininy z α-naftolem w obecności czynnika utleniającego. Jego mechanizm nie został jeszcze w pełni wyjaśniony. Najwyraźniej reakcję przeprowadza się zgodnie z następującym równaniem:

Ponieważ pochodne chinonoimin (w tym przypadku naftochinonu), w których wodór grupy iminowej –NH– jest zastąpiony rodnikiem alkilowym lub arylowym, są zawsze zabarwione na żółto-czerwone odcienie, to najwyraźniej pomarańczowo-czerwony Kolor roztworu podczas reakcji Sakaguchi wynika z pojawienia się właśnie pochodnej naftochinoiminy. Nie wyklucza się jednak możliwości powstania jeszcze bardziej złożonego związku w wyniku dalszego utleniania pozostałych grup NH reszty argininy i pierścienia benzenowego α-naftolu:

Opis doświadczenia. Do probówki wlać 2 ml 0,01% roztworu argininy, następnie dodać 2 ml 10% roztworu wodorotlenku sodu i kilka kropli 0,2% alkoholowego roztworu α-naftolu. Zawartość probówki dobrze wymieszać, dodać 0,5 ml roztworu podbromitu i ponownie wymieszać. Natychmiast dodaje się 1 ml 40% roztworu mocznika w celu ustabilizowania szybko rozwijającego się pomarańczowo-czerwonego zabarwienia.

Reakcja biuretowa- stosowany jako reakcja barwna dla białek. W środowisku alkalicznym w obecności soli miedzi(II) dają barwę fioletową. Kolor jest spowodowany tworzeniem się związku kompleksowego miedzi (II), ze względu na grupę peptydową -CO-NH- co jest charakterystyczne dla białek. Ta reakcja ma swoją nazwę od pochodnej mocznika - biuretu, który powstaje przez ogrzewanie mocznika z eliminacją amoniaku:

Oprócz białek i biuretu inne związki zawierające tę grupę również dają to samo zabarwienie: amidy, imidy kwasów karboksylowych, a także związki zawierające grupy -CS-NH- lub \u003d CH-NH- w cząsteczce. Białka, niektóre aminokwasy, peptydy, biurety i średnie peptony również dają reakcję.

Kolor kompleksu otrzymanego w reakcji biuretowej z różnymi peptydami jest nieco inny i zależy od długości łańcucha peptydowego. Peptydy o długości łańcucha czterech reszt aminokwasowych i większej tworzą czerwony kompleks, tripeptydy - fioletowy, a dipeptydy - niebieski.

postać ketonowa polipeptydu

enolowa postać polipeptydu

Kiedy polipeptyd oddziałuje z Cu(OH)2, tworzy się kompleks, którego strukturę można przedstawić następująco.

Metody oznaczania aminokwasów

Aminokwasy są substancjami biologicznie czynnymi, odgrywają ważną rolę w życiu organizmu człowieka, mają szerokie zastosowanie jako leki. Niektóre z nich są niezbędne i dostają się do organizmu wraz z pożywieniem. Obecnie istnieje szereg metod ilościowego oznaczania aminokwasów w leczniczych surowcach roślinnych, w lekach i płynach biologicznych oraz w produktach spożywczych.

Z całej gamy metod ilościowego oznaczania aminokwasów w różnych obiektach można wyróżnić cztery główne grupy: chromatograficzne, spektrofotometryczne, miareczkowe oraz elektrochemiczne metody analizy.

Metody chromatograficzne

W ciągu ostatnich dziesięcioleci dokonał się znaczący postęp w dziedzinie chromatografii gazowo-cieczowej aminokwasów. Zaproponowano metodę wykorzystującą mikroupakowane kolumny, która umożliwia niemal całkowite rozdzielenie 17 biologicznie ważnych α-aminokwasów w stosunkowo krótkim czasie.

Opracowano metodę oznaczania aminokwasów metodą chromatografii gazowo-cieczowej w próbkach surowicy, osocza, moczu i płynu mózgowo-rdzeniowego w oparciu o preparat eterów 2,3,4,5,6-pentafluorobenzoiloizobutylowych, a następnie separacja na kolumnie polidimetylosiloksanu w trybie programowania temperatury od 140°C do 250°C z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym. Czas rozdzielania chromatograficznego wynosi 28 minut. W wyniku badań udało się wyodrębnić 27 aminokwasów.

Pomimo różnorodności metod wysokosprawnej chromatografii cieczowej w analizie aminokwasów, wersja z odwróconymi fazami z detekcją spektrofotometryczną jest najbardziej wyrazista i przystępna. W celu skutecznego rozdzielenia i wykrycia aminokwasy są przekształcane w pochodne hydrofobowe i pochłaniające światło, to znaczy przeprowadzana jest derywatyzacja przedkolumnowa. Jako odczynniki do derywatyzacji stosuje się ortoftalaldehyd, naftaleno-2,3-dikarboksyaldehyd, 9-fluorenylometylochloromrówczan.

Opracowano metodę ilościowego oznaczania L-cystyny, kwasu L-glutaminowego i glicyny w leku Eltacin, który wykazuje działanie przeciwutleniające w połączeniu z działaniem przeciwdławicowym. Kwas glutaminowy i glicynę oznaczono metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami po derywatyzacji przedkolumnowej z odczynnikiem ortoftalaldehyd/N-acetylo-L-cysteina. Derywatyzacja cysteiny zdaniem autorów jest trudna ze względu na niestabilność samego aminokwasu i powstałych pochodnych. Dlatego analizę cysteiny przeprowadzono metodą miareczkowania bromatometrycznego. Stwierdzono, że obecność znacznych ilości cysteiny w próbce nie przeszkadza w oznaczaniu produktów derywatyzacji glicyny i kwasu glutaminowego odczynnikiem ortoftalaldehyd / N-acetylo-L-cysteina. Metoda charakteryzuje się dużą powtarzalnością i dokładnością oznaczania.

Możliwość zastosowania 4,7-fenantrolino-5,6-dionu (fanchinonu) jako odczynnika fluorogennego do tworzenia przedkolumnowych jego pochodnych do rozdziału i analizy ilościowej aminokwasów metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej została badane. Nie posiadając własnej fluorescencji, fanchinon reaguje z grupami aminowymi aminokwasów (w temperaturze 68°C przez 160 min), tworząc iminochinole, których fluorescencję mierzy się przy długości fali 460 nm. Wyizolowane pochodne zidentyfikowano za pomocą widm Tm, IR, masowych i PMR. Wysokosprawną chromatografię cieczową przeprowadzono na chromatografie z detektorem fluorescencyjnym i kolumną z elucją gradientową mieszaninami: roztwór trietyloaminy - bufor fosforanowy (pH 3) - metanol. Jako wzorzec wewnętrzny zastosowano chinidynę. Metoda ta jest dość obiecująca w warunkach dużych laboratoriów i może być zaproponowana do analizy aminokwasów w gotowych postaciach dawkowania.

Opracowano technikę wysokosprawnej chromatografii cieczowej z bioczujnikiem potencjometrycznym do ilościowego oznaczania lizyny. Bioczujnik jest skonstruowany poprzez przymocowanie membrany zawierającej oksydazę lizynową do jonoselektywnej elektrody NH4+. Jony amonowe powstające podczas enzymatycznej degradacji lizyny są wykrywane potencjometrycznie. Opracowano chromatodensytometryczną ekspresową metodę analizy tryptofanu w płynach hodowlanych. Chromatografię cienkowarstwową przeprowadzono na płytkach Sorbfil. Chromatografię prowadzono w układzie propanol-2 - 25% roztwór wodorotlenku amonu (7:3) przez 25 minut. Chromatogramy wysuszono w temperaturze pokojowej i utrzymywano w temperaturze 120°C przez 15 minut. Do wykrywania plam na chromatogramach użyto specyficznego odczynnika - 4-dimetyloaminobenzaldehydu, selektywnego względem pierścienia indolowego tryptofanu, w postaci 0,5% roztworu etanolu z dodatkiem 5% stężonego kwasu siarkowego. Po wywołaniu chromatogramów przez zanurzenie w kuwecie teflonowej ze świeżo przygotowanym roztworem 4-dimetyloaminobenzaldehydu, trzymano je przez 5-7 minut w temperaturze 110°C. Plamy tryptofanu skanowano przy długości fali 625 nm za pomocą komputerowego densytometru wideo. Opracowana metoda, pomimo dużej dokładności oznaczania i produktywności, jest specyficzna dla tryptofanu.

Do analizy α-aminokwasów w płynach ustrojowych, lekach i produktach spożywczych szeroko stosowane są metody elektroforezy kapilarnej, polegające na rozdzielaniu składników złożonej mieszaniny w kwarcowej kapilarze pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego. Ponieważ aminokwasy są z natury jonami obojnaczymi, można je rozdzielić za pomocą buforów elektrolitycznych o odpowiednim pH, najczęściej stosuje się neutralne i zasadowe bufory rozdzielające.

W celu zwiększenia specyficzności i czułości metody elektroforezy kapilarnej do analizy poszczególnych α-aminokwasów stosuje się ich wstępną derywatyzację, następnie rozdział w kwarcowej kapilarze i spektrofotometryczne oznaczenie produktów reakcji. Tak więc mrówczan 9-fluorenylometylu, chloromrówczan 9-(2-karbazolo)-etylu i barwnik cyjaninowy są stosowane jako środki derywatyzujące. Perspektywy tej metody wynikają z jej zalet, takich jak szybkość analizy, łatwość przygotowania próbki, niskie zużycie odczynników i łatwość oprzyrządowania.

I białka

Wiadomo, że wszystkie 20 odmian kanonicznych α-aminokwasów ma taką samą budowę, z trzema wariantami grup funkcyjnych (ryc. 3.3). Niestety reakcje na grupy aminowe i karboksylowe są mało specyficzne, ponieważ odpowiednio, charakterystyczne dla wszystkich amin, szereg amidów i kwasów karboksylowych. To samo dotyczy większości ich rodników = R, z których 10 jest niepolarnych, to znaczy są one reprezentowane przez grupy alifatyczne = węglowodorowe, z których większość jest chemicznie obojętna. Swoistość większości polarnych aminokwasów R jest również stosunkowo niska, w których występują grupy alkoholowe (Ser, Tre, Tyr)amidowe (Acn, Gln) i karboksylowe (Asp, Glu). Bardziej aktywna jest grupa aminowa (Liz), imidazol His oraz grupa guanidynowa Arg, podczas gdy aktywność grupy tio Cys jest najwyższa. Dlatego uniwersalna reakcja ninhydrynowa, specyficzna dla jednoczesnej obecności grup aminowych i karboksylowych przy atomie α-C, zyskała największe praktyczne znaczenie w jakościowej i ilościowej analizie α-aminokwasów, w tym w analizatorach aminokwasów.

Ryż. 3.3. Ogólne wzory budowy α-aminokwasów i produktów ich polimeryzacji. Wyjaśnienia w tekście.

Polimeryzacja α-aminokwasów w strukturę peptydów i białek (ryc. 3.3) zachowuje wszystkie typy ich R, ale:

1. Reakcja ninhydrynowa staje się ujemna, ponieważ z wyjątkiem N- i C-końcowych grup α-aminowych i α-karboksylowych są zużywane na tworzenie wiązań peptydowych. Dodatnia reakcja ninhydryny z białkiem wskazuje raczej na obecność zanieczyszczeń aminokwasowych w preparacie lub potrawach.

2. Dla wszystkich peptydów i białek reakcja biuretowa na grupę peptydową, której nie ma w monomerycznych aminokwasach, jest specyficzna.

3. Spośród bardziej specyficznych reakcji na aminokwasy R przydatne są: reakcja ksantoprotein ze stężonym kwasem azotowym, do aromatycznych R Phe, Tyr, Tri; reakcja z izatyną dla pięcioczłonowego pierścienia Pro, jak również reakcje dla imidazolu R His, grupy tiolowej Cys i grupy guanidynowej Arg. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że niektóre z tych R są ukryte w kulkach białkowych, a zatem jakościowe reakcje na nie są osłabione. Dlatego przed ich przeprowadzeniem białka są zwykle denaturowane w taki czy inny sposób.

4. W przeciwieństwie do prawdziwych roztworów aminokwasów, koloidalne roztwory białek charakteryzują się reakcje sedymentacyjne związane z niszczeniem ich otoczek hydratacyjnych i w efekcie spadkiem ich rozpuszczalności pod wpływem środków odwadniających: sole obojętne = wysalanie, metanol = MeOH, etanol = EtOH, aceton, mocznik i inne środki.

Wykonując reakcje jakościowe, należy:

1. Ściśle przestrzegać zasad bezpieczeństwa pożarowego i pracy ze stężonymi kwasami i zasadami = EJ.

2. Szklanym lub flamastrem zaznaczyć 2 rzędy probówek i umieścić w jednej z nich nie więcej niż 0,5 ml (2-5 kropli) 1% roztworu aminokwasów i mniej więcej taką samą objętość 1% roztworu białek w innym.

3. Do dwóch probówek z roztworami aminokwasów i białek dodaj równolegle 3-5 kropli odpowiednich odczynników i wykonaj pozostałe procedury wskazane dla odpowiedniej reakcji.

4. Jeżeli konieczne jest podgrzanie probówek, zdjąć pokrywę tygla i podpalić suche paliwo zapałką. Następnie zaciśnij probówkę w uchwycie, którego prymitywna konstrukcja jest bardzo zawodna. Dlatego lepiej owinąć parę probówek kartką papieru złożoną w pasek i trzymając je kciukiem równomiernie przepuścić dolne połówki probówek przez płomień, unikając kierowania szyjek na sąsiadów i szybkiego wrzenia roztworu. Po zakończeniu operacji w odpowiednim czasie zgaś płomień pokrywą tygla.

5. Wyniki eksperymentów sporządzić zgodnie z szablonem na rozłożeniu zeszytu laboratoryjnego w formie tabeli:

6. Po rozważeniu wyników i wypełnieniu protokołu wraz ze stojakiem z probówkami, przedstaw je nauczycielowi do zabezpieczenia.

1. Reakcja ninhydrynowa. Na podstawie deaminacji i dekarboksylacji α-aminokwasów alkoholowym roztworem ninhydryny:

Powstały amoniak, reagując z dwiema cząsteczkami ninhydryny, tworzy barwną pochodną o maksimum absorpcji przy 540 nm (dla Pro - 440 nm).

Postęp: Dodać 3-5 kropli 0,5% alkoholowego roztworu ninhydryny do badanych próbek. Probówki z mieszaninami delikatnie podgrzać na ogniu i po 2-3 minutach zarejestrować pojawienie się barwy.

2. Reakcja ksantoproteinowa. Jak wspomniano powyżej, opiera się na tworzeniu nitrowych pochodnych aminokwasów o aromatycznym R: Phen, Tyr, Tri.

Postęp: Włączając wyciąg pod wyciągiem, ostrożnie dodaj kilka kropli stężonego kwasu azotowego (HNO 3) do pary probówek z roztworami testowymi. Delikatnie podgrzej probówki nad płomieniem, unikając kierowania szyjek do sąsiadów, i zarejestruj rozwój koloru.

3. Reakcja nitroprusydku. Polega na alkalicznej hydrolizie zawierającego siarkę aminokwasu cysteiny, z uwolnieniem siarczku sodu (Na2S), który daje czerwony kompleks ze świeżo przygotowanym roztworem nitroprusydku sodu.

Postęp: Dodaj równą objętość 20% wodorotlenku sodu do obu probówek z 5-10 kroplami roztworów testowych i gotuj przez co najmniej 3-5 minut. Dodać 3-5 kropli roztworu nitroprusydku sodu do probówek i zanotować rozwój barwy.

4. Reakcja biuretowa. Polega na tworzeniu się w środowisku alkalicznym barwnego kompleksu wiązania peptydowego z jonem Cu 2+. Służy jako uniwersalny test do wykrywania peptydów i białek w roztworach. Ponieważ wraz ze wzrostem liczby wiązań peptydowych intensywność barwy roztworu wzrasta liniowo, jest szeroko stosowana do fotometrycznego oznaczania stężeń białek.

Postęp. Dodaj taką samą ilość 10% roztworu wodorotlenku sodu do probówek z 5-10 kroplami roztworów testowych. Dobrze wymieszaj i dodaj 2 krople 1% roztworu siarczanu miedzi (CuSO4). Wymieszać próbki i po kilku minutach zarejestrować rozwój koloru.

5. Test z gotowaniem. Oparta na termicznej denaturacji białek.

Postęp. Zakwasić obie probówki roztworami testowymi zawierającymi nie więcej niż jedną kroplę 1% roztworu kwasu octowego (AcOH) i ogrzać do wrzenia. Po gotowaniu roztworów przez 2-3 minuty zapisz wyniki i wyjaśnij mechanizm zjawiska.

6. Strącanie solami metali ciężkich(Ja) . Ich właściwości denaturujące opierają się na zdolności ciężkich kationów Me do reagowania z grupami funkcyjnymi R cząsteczki białka: tio-, amino-, karboksy-, aromatycznymi. Również ich silne aniony powodują ładowanie grup jonogennych w cząsteczkach białek, niszcząc w ten sposób wiązania jonowe w nich.

Postęp. Dodać kilka kropli 5% roztworu siarczanu miedzi (CuSO4) do obu probówek z roztworami testowymi. Zapisz i wyjaśnij wyniki.

7. Strącanie kwasami organicznymi. Polega na kwasowej denaturacji białek i tworzeniu kowalencyjnych pochodnych grup tio-, aminowych i aromatycznych aminokwasów R z chloroorganicznymi.

Postęp. Dodaj kilka kropli 10% roztworu kwasu trichlorooctowego (TCA) do probówek z roztworami testowymi i zapisz wyniki w ciągu kilku minut

W tym artykule rozważymy metody oznaczania aminokwasów, które są wykorzystywane nie tylko w analizie produktów, ale także w biochemii i analizie farmaceutycznej.

Całkowitą ilość aminokwasów można przeprowadzić metodą fotometryczną polegającą na oznaczaniu amoniaku otrzymanego z aminokwasów metodą Kjeldahla.

Reakcja z 1-naftolem. Do oznaczenia argininy, histydyny, tyrozyny zaproponowano reakcję z 1-naftolem. W obecności podchlorynu sodu (NaOCl) roztwór zmienia kolor na czerwony. Roztwór próbki w 50% etanolu zawierający aminokwas schładza się lodem i dodaje 10% roztwór NaOCl i roztwór naftolu. Produkt reakcji barwi się na czerwono (1max = 550 nm). Zawartość aminokwasów określa się na podstawie intensywności barwy otrzymanego roztworu.

Reakcja biuretowa. Jedną z najważniejszych reakcji stosowanych do oznaczania aminokwasów jest reakcja biuretowa. Reakcję prowadzi się dodając rozcieńczony wodny roztwór soli miedzi (II) do alkalicznego roztworu biuretu. W tym przypadku roztwór zmienia kolor na intensywny fioletowy z powodu tworzenia złożonego związku.

Do reakcji biuretowej wchodzą związki zawierające co najmniej 2 grupy amidowe lub grupę aminohydroksyetylenową, a także amidy i imidy aminokwasów. Białka i stężone roztwory aminokwasów i amidów dają tę reakcję. Rozcieńczone roztwory aminokwasów nie dają reakcji biuretowej, dlatego reakcję można wykorzystać do ustalenia końca hydrolizy białek. Reakcję stosuje się również do jakościowego i ilościowego oznaczania białka. Stosowane w klinicznych laboratoriach diagnostycznych metody oznaczania białka we krwi i innych płynach biologicznych opierają się na reakcji biuretowej.

reakcja ninhydrynowa. Drugą najważniejszą reakcją służącą do oznaczania aminokwasów jest reakcja ninhydrynowa - reakcja barwna dla α-aminokwasów, która przeprowadzana jest poprzez ogrzewanie tych ostatnich w alkalicznym roztworze nadmiaru ninhydryny.

Ninhydryna przeprowadza oksydacyjną dekarboksylację α-aminokwasów z utworzeniem amoniaku, dwutlenku węgla i aldehydu zawierającego jeden atom węgla mniej niż pierwotny aminokwas. Zredukowana ninhydryna reaguje następnie z uwolnionym amoniakiem i drugą cząsteczką ninhydryny, tworząc barwny produkt kondensacji z amoniakiem.

Otrzymany związek (pigment) ma fioletowo-niebieską barwę (1max = 570 nm). Powstawanie tego barwnego związku jest wykorzystywane w teście ilościowym na obecność α-aminokwasów, za pomocą których można wykryć aminokwasy, nawet jeśli ich ilość nie przekracza 1 μg.

Prolina i hydroksyprolina, które nie mają grupy a-aminowej, reagują z ninhydryną, tworząc żółte pochodne (lmax = 440 nm). Reakcja nie jest specyficzna, ponieważ barwiony produkt z ninhydryną daje również amoniak i związki zawierające grupę aminową (aminy, białka, peptydy). Jednak z tymi związkami nie uwalnia się CO2. Uwalnianie dwutlenku węgla jest charakterystyczne tylko dla α-aminokwasów. Reakcja wykorzystywana jest do kolorymetrycznego oznaczania ilościowego α-aminokwasów, w tym w automatycznych analizatorach aminokwasów (pomiar objętości CO 2 ).

Reakcja ninhydrynowa służy do oznaczania glicyny, izoleucyny, leucyny; mniej intensywny kolor nadają seryna, fenyloalanina, cysteina, tyrozyna, tryptofan itp.

Otrzymane produkty charakteryzują się dość intensywną barwą (e = 1,8–3,3 · 10 4), ale produkty barwione są niestabilne. Intensywność koloru szybko spada. Dodaje się CdCl2 w celu ustabilizowania. Tworzy trwałe kompleksy z powstałymi związkami. Chlorek kadmu również przyspiesza reakcję.

Aminokwasy i niektóre inne związki zawierające grupę aminową kondensują w środowisku alkalicznym z 4-sulfoksylanem 1,2-naftochinonu, tworząc czerwone, żółte, pomarańczowe pochodne monoiminy 1,2-naftochinonu.

Reakcja służy do oznaczania α-aminokwasów (waliny, izoleucyny, leucyny itp.).

Reakcję z 4-dimetyloaminobenzaldehydem można wykorzystać do oznaczenia tryptofanu. Produkt reakcji ma barwę fioletową, a intensywność barwy określa zawartość tryptofanu w analizowanym roztworze.

Należy jednak zaznaczyć, że reakcja ta jest rzadko stosowana w analizie żywności.

Do ilościowego oznaczania aminokwasów zawierających siarkę stosuje się metodę bromatometryczną, opartą na następującej reakcji:

Roztwór cysteiny w 1% roztworze NaOH wlewa się do kolby ze szlifowanym korkiem, 0,1 N. roztworem bromianu potasu, suchym bromkiem potasu i zakwaszono 10% HCl.

BrO3 - + 5Br - + 6H + → 3Br2 + 3H2O

Powstały w wyniku reakcji brom, którego ilość odpowiada ilości bromianu potasu, reaguje z aminokwasem. Po 10 minutach dodaje się jodek potasu, który reaguje z nieprzereagowanym bromem i uwolniony jod miareczkuje się 0,1 N. roztwór tiosiarczanu sodu ze skrobią jako wskaźnikiem.

2I - + Br 2 → Br - + I 2

Ilość tiosiarczanu użytego do miareczkowania jest równoważna ilości bromu, który nie przereagował z aminokwasem. Z różnicy między ilością dodanego bromianu potasu i tiosiarczanu określa się ilość bromu, który przereagował z aminokwasem, a zatem ilość aminokwasu.

Podobnie oznacza się metioninę. Metionina utlenia się do sulfonu:

Reakcja ta, w określonych warunkach, pozwala bardzo dokładnie określić zawartość metioniny.