ДНК ваксина(също генна ваксина, ваксина с нуклеинова киселина)- генно инженерна конструкция, която след като бъде въведена в клетката, осигурява производството на патогенни протеини или туморни антигени и предизвиква имунен отговор. Въвеждането на ДНК ваксини в тялото се нарича генетична имунизация. ДНК ваксинацията има няколко предимства пред конвенционалните ваксини. По-специално, доказано е, че такива ваксини осигуряват не само производството на антитела (хуморален имунитет), но и специфичен цитотоксичен отговор (клетъчен имунитет), който преди беше постижим само с живи ваксини. Днес ДНК ваксините не се използват за лечение на хора, но се предполага, че генетичната имунизация ще помогне за преодоляването на редица заболявания.

История на създаването

Идеята за използване на ДНК фрагменти за ваксиниране се появява през 50-те и 60-те години на миналия век. След поредица от експерименти беше установено, че генетичната информация на ДНК запазва способността да се транскрибира и транслира, след като бъде прехвърлена в друга клетка. През същата година беше открито, че въвеждането на генома на полиомиелитния вирус в животните стимулира производството на антитела. По-късно беше показано активиране на хуморален имунитет за ДНК молекули, получени от неинфекциозни агенти. От 90-те години на миналия век научните лаборатории започнаха все повече да изследват имуностимулиращите свойства на ДНК. През 1992 г. Tang и колеги показаха, че генът на човешкия растежен хормон, вмъкнат в плазмид, се експресира стабилно в мишки и синтезираният хормон се разпознава от имунната система като антиген и стимулира производството на антитела. Процесът на въвеждане на плазмидна ДНК за стимулиране на хуморалния имунитет е наречен Tango "генетична имунизация". Въпреки това на следващата година друга група учени заявиха, че въвеждането на плазмид, кодиращ протеини на грипния вирус, предизвиква както хуморален, така и клетъчен отговор. Индуциране на двата клона на имунитета от една и съща година беше установено и за плазмида, съдържащ HIV гените. От 1995 г. започнаха да се появяват доказателства, че ДНК ваксинацията може да активира имунната система срещу рак. Преди около 20 години се проведоха първите клинични изпитвания на ДНК ваксини, които на първо място трябваше да покажат безопасността на новия метод. На пациентите са инжектирани гени за ХИВ, грипен вирус, херпес, хепатит В, причинителя на маларията. Резултатите от всички тестове бяха доста обнадеждаващи: ДНК ваксините бяха последователно експресирани, провокираха имунен отговор и не предизвикаха сериозни странични ефекти, което послужи като тласък за по-нататъшните им изследвания.

Конструиране на ДНК ваксина

Структурно, ДНК ваксината е нуклеотидна последователност, вградена във вектор, който кодира специфичен антиген или антигени. Вектор в генното инженерство е молекула нуклеинова киселина, която служи за доставяне на генетичен материал в клетките и осигурява неговата репликация или експресия. Преди това вектори, базирани на вируси, са били използвани за транспортиране на гени в клетката: модифициран (отслабен) вирус на вариола, аденовируси и ретровируси. Вирусните вектори са доста ефективни, но имат значителна вероятност от странични ефекти, свързани с относително високата имуногенност на самия вектор. Затова днес като вектор най-често се използва бактериален плазмид - малка стабилна кръгова ДНК молекула, способна на автономна репликация. Сам по себе си плазмидът не предизвиква желания специфичен имунен отговор, за това в него са пришити гените на имуногенните протеини. Също така, ДНК ваксината трябва да съдържа регулаторните последователности, необходими за генната експресия в еукариотните клетки. Готовата ДНК конструкция се доставя до бактериална клетка, където се увеличава броят на нейните копия. Това е последвано от изолиране и пречистване на плазмиди, които носят желаната инсерция.

Плазмиден векторен дизайн

Важен етап в създаването на ДНК ваксини е проектирането (конструирането) на вектор. Задължителните структури на плазмиден вектор са рестрикционни места, избираем маркер и начало на репликация на ДНК ваксина в бактериална клетка. За да се осъществи синтеза на антиген, ДНК ваксината трябва да съдържа промотор и сигнал за полиаденилиране. Промоторът е важен фактор за ефективността на ваксината, тъй като той определя силата на имунния отговор: колкото по-голяма е експресията на гена, кодиращ вирусния или туморния антиген, толкова по-силен е имунният отговор. Най-често използваният промотор е вирусът SV40 или цитомегаловирус (CMV). За да се стабилизират транскриптите на иРНК, в плазмида се вмъква сигнал за полиаденилиране, най-често получен от гена на говежди растежен хормон. (BGH)или вируса SV40. Като избираеми маркери се избират бактериални гени за резистентност към антибиотици, често генът за резистентност към канамицин. При проектирането на ДНК ваксини, най-популярната точка на произход на репликацията Ешерихия коли.

Селекция на ген за имунизация

Векторът е важен компонент на ДНК ваксината, но неговата имуногенност се определя точно от инсерта, ДНК последователността, кодираща антигена. Сред вирусните антигени слетите протеини са най-подходящи за имунизация; това са относително запазени протеини, които позволяват на вируса да навлезе в клетката. За ваксинация срещу грам-положителни бактерии е препоръчително да се вмъкнат в плазмидния вектор гените на онези бактериални протеини, които определят патогенезата на заболяването. Сред протеините на грам-отрицателните бактерии те имат висока имуногенност. За терапевтични противотуморни ДНК ваксини се използват маркерни протеини на ракови клетки.

Методи за доставяне на ДНК ваксини в клетките

Готовата ваксина трябва да бъде доставена в тялото на човек или животно, където нейната дестинация са антиген-представящи клетки (APC) - макрофаги, дендритни клетки, В-лимфоцити. Тук ще се извърши синтезът и посттранслационната модификация на антигена, след което той ще бъде вмъкнат в клетъчната мембрана, за да привлече вниманието на имунната система. Основният проблем е да се достави достатъчно плазмид към APC. Методите за доставяне на генетичен материал в клетката обикновено се разделят на 2 групи: вирусни и невирусни. Тъй като вирусните вектори имат редица значителни недостатъци, в този раздел са представени само невирусни методи за доставяне на ДНК ваксини.

микроинжектиране

В началото на 90-те години интрамускулните микроинжекции бяха най-разпространеният начин за въвеждане на ДНК в клетка, поради простотата на метода. За да направите това, ДНК се разтваря във вода или изотоничен разтвор, ако е необходимо, се добавя адювант (вещество, което повишава имунния отговор). След това с помощта на тънка стъклена тръба разтворът се инжектира в мускулната тъкан, където ролята на APC се изпълнява от дендритни клетки. Веднъж попаднала в ядрото на дендритната клетка, ваксината започва да се експресира и настъпва синтез на антигенни протеини. С помощта на микроинжекции ДНК може да се инжектира подкожно в тимуса, черния дроб и туморната тъкан, но именно в мускулната тъкан се наблюдава най-продължителната (до една година) експресия на ДНК ваксината. Поради високата концентрация на Лангерхансови клетки (подтип дендритни клетки), кожата е привлекателна цел за ДНК ваксинация. За интрадермално (подкожно) приложение се използва набор от микроигли, чиято дължина е няколкостотин микрона. Има различни възможности за интрадермална ваксинация. По-лесно е да се включи разхлабване с набор от микроигли на роговия слой на кожата (външния слой на кожата, обикновено 10-20 микрона), за да се увеличи неговата пропускливост за по-нататъшно локално инжектиране на ДНК разтвора. По-ефективно е използването на микроигли, покрити със суха ваксина, която се разтваря под кожата. Ефективността на този метод обикновено е ниска, тъй като ДНК първо навлиза в междуклетъчното пространство и едва след това се включва в клетките.

електропорация

Електропорацията е традиционен подход за доставка на ДНК до бактериални клетки и клетъчни култури, базиран на прилагане на електрически импулс. Такъв импулс създава пори в клетъчната мембрана, което улеснява навлизането на отрицателно заредена ДНК. Този метод е възприет за доставяне на ДНК ваксини на животни и хора и може значително да увеличи ефективността на конвенционалната инжекция. Устройството за електропорация съдържа източник на електрически ток и решетка за еднократна употреба, която се състои от спринцовка и иглени електроди. Спринцовката инжектира ваксината в мускулната тъкан, а електродите създават електрическо поле, което улеснява навлизането на ДНК в миоцитите и дендритните клетки. Към днешна дата са разработени устройства, които могат да увеличат ефективността на ваксинацията с 1000 пъти в сравнение с конвенционалната инжекция. Електропорацията може да се използва както за интрамускулно, така и за подкожно приложение на ДНК ваксина. Недостатъците са лека болезненост на мястото на инжектиране, необходимост от специализирани устройства. Вместо електрическо поле може да се използва магнитно поле. Такива устройства работят на същия принцип, но в този случай процедурата е напълно безболезнена и по-малко увреждаща клетките.

Действието на електрическото поле не само засилва усвояването на ДНК ваксината от клетките, но и стимулира развитието на имунен отговор. Използването на електропорация води до незначително увреждане на тъканите - развива се локален възпалителен процес. Когато клетките са повредени, се освобождават хемокини, така че към тях се изпращат макрофаги, лимфоцити и дендритни клетки. Увеличаването на концентрацията на имунните клетки на мястото на инжектиране повишава ефективността на ваксината.

Сонопорация

Сонопорацията е метод за прехвърляне на чужда ДНК в клетки с помощта на ултразвук. Ултразвукът повишава пропускливостта на клетъчната мембрана, в резултат на което екзогенната ДНК прониква по-лесно в клетката. Сонопорацията е използвана за първи път за прехвърляне на гени в клетка през 1986 г. Този метод се използва за въвеждане на ДНК молекули в клетките на роговицата, мозъка, костната тъкан, бъбреците, панкреаса, ембрионалната тъкан, скелетните и сърдечните мускули. В сравнение с други методи, сонопорацията е малко проучена, необходими са много повече усилия за подобряване на нейната ефективност, особено на ниво цял организъм.

Балистична трансфекция

Балистичната трансфекция се основава на обстрел (бомбардиране) на органи и тъкани с микрочастици от тежки метали (злато, волфрам) с диаметър 1-3 микрона, покрити с ДНК молекули. Въведена по този начин, ДНК ваксината се експресира в таргетните клетки и техните продукти навлизат в кръвния поток. За да се осигури ускорение на частиците, се използва устройство, подобно на малки оръжия - генна пушка или генна пушка. Микрочастиците преминават през клетъчните мембрани и пренасят генетичния конструкт директно в клетъчното ядро. Дълбочината на проникване на микрочастиците като правило е малка - до 1 mm, така че методът се използва главно за трансфекция на кожата или съседната хрущялна тъкан. Специалните условия на обвивка позволяват на микрочастиците да проникнат на дълбочина 4-5 mm и да прехвърлят генни конструкции в набраздени мускулни влакна. Обикновено клетките, разположени директно в центъра на изстрела, умират, докато в зоната 0,6-1 cm от центъра са най-успешно протрансформираните клетки. Тази технология се нарича още биобалистика или биолистика.

Първият генен пистолет е създаден от група учени между 1983 и 1986 г. с цел трансформиране на растителни клетки. Това беше пистолет, разработен от устройство за автоматично заковаване. ДНК от репортерния (маркерен) ген се нанася върху волфрамова топка и се изстрелва в петриево блюдо. Експресията на репортерния ген показва ефективността на имунизацията. Днес частици от злато или сребро се използват за доставяне на ДНК, тъй като те не са токсични за клетката, за разлика от волфрамовите.

Под високо налягане

През 1999 г. бяха разработени устройства за инжектиране, които могат да прилагат ДНК ваксина без използването на игла. Такива устройства работят благодарение на силата на Лоренц: малък мощен магнит създава значително налягане, задейства бутало, което изхвърля лекарството със скоростта на звука. Чрез промяна на силата на тока можете да изберете дълбочината на инжектиране и да дозирате лекарствата. Процедурата е напълно безболезнена и преди е била използвана за прилагане на инсулин на пациенти с диабет и за широкомащабни ваксинации. Съществен недостатък на този метод е, че високото налягане може теоретично да промени структурата на молекулите, които се инжектират. Тази технология за вмъкване обаче продължава да се подобрява и днес са разработени устройства, които могат да доставят ДНК на дълбочина до 16 mm.

Като част от жив бактериален вектор

Живите бактериални вектори са щамове салмонела, Шигелаили листерия,които носят мутация в гените за биосинтеза или инвазия, които елиминират патогенността и способността да поддържат своята жизнеспособност в организма гостоприемник или околната среда. Вместо това необходимите гени за имуногенни протеини се вмъкват в бактериалния геном. Атенюираната бактерия се прилага орално (през устата, чрез поглъщане) или интраназално (чрез инжектиране в носния отвор), така че този метод на ваксиниране не изисква оборудване. В допълнение, такова приложение стимулира имунния отговор на лигавицата, което е важно, тъй като повечето патогени навлизат в тялото през устата и носните отвори. Заобикаляйки стомаха, отслабената бактерия навлиза в тънките черва. По-нататък бактерията прониква в пеерните плаки - чревните лимфни възли. Веднъж попаднали в средата на пейеровите петна, бактериите стават мишена за макрофагите и се подлагат на фагоцитоза. В цитоплазмата на макрофага бактерията освобождава ДНК ваксината, след което ДНК навлиза в ядрото и бактерията се обезврежда от имунната система.

Опаковка в липозоми

Липозоми - сферични образувания (около 100 nm в диаметър), състоящи се от двоен липиден слой. Липозомите са кухи отвътре, които обикновено са пълни с разтворител, но могат да се използват за доставяне на различни вещества, включително ДНК ваксини. Тяхната хидрофобна обвивка им позволява да се слеят с клетъчните мембрани и да транспортират съдържанието си в клетката. Използването на липозоми започва през 1965 г. и това се превръща в мощен двигател за развитието на бионанотехнологиите.

Обещаващ метод за директно въвеждане на ДНК конструкт в целевите клетки е доставянето на генетичен конструкт като част от катионни липозоми, изградени от положително заредени липиди. Катионните липозоми с отрицателно заредена ДНК молекула образуват ДНК-липиден комплекс - липоплекс. Предимствата на използването на такива комплекси са способността да носят голямо количество информация, неинфекциозност, освен това те са прости и евтини за производство. През 2003 г. бяха създадени изключително малки, милимикронни липозоми, покрити с полиетилен гликолов полимер, които са способни да пренасят терапевтична ДНК през кръвно-мозъчната бариера и да я доставят до мозъчните неврони, което преди беше невъзможно.

Изработена от полиплекс

Полиплекси, системи, състоящи се от положително заредени полимери (поликатиони) и отрицателно заредени ДНК молекули, се използват за въвеждане на големи ДНК конструкции (>10 kb) в клетката. Размерът на такива комплекси е по-малък от 100 nm, което, от една страна, ги излага на смилане от макрофаги (тъй като те реагират на частици, по-големи от 200 nm), а от друга страна, те са достатъчно големи, за да не бъдат филтрирани в бъбреците.

Поликатионите кондензират молекулата на ДНК в комплекси, като по този начин осигуряват нейната стабилност и защита от действието на нуклеазите. Като ДНК-свързващи полимери могат да служат катионни протеини, синтетични хомополимери на аминокиселини (полилизини, полиаргинини), хитозанов полизахарид, полиетиленамин. Обикновено поликатионът е в излишък в състава на полиплекса, в резултат на което този комплекс е разтворим и положително зареден. Ако към полиплекса е прикрепен лиганд за специфичен клетъчен рецептор, тогава ДНК ваксината може да бъде насочена към специфичен клетъчен тип. Процесът на доставяне на генетичен материал в полиплекса включва два етапа: екстрацелуларен (път от мястото на инжектиране до целевите клетки) и вътреклетъчен (взаимодействие с целевите клетки, ендоцитоза, излизане от ендозоми, доставка до ядрото). Първата бариера, която комплексът трябва да преодолее, е кръвта и извънклетъчната матрица. Следователно, такива физични и химични параметри на полиплекса са избрани, за да се повиши неговата стабилност, да се избегнат нежелани взаимодействия с кръвните протеини и имунната реакция, причинена от химическата природа на поликатиона. Веднъж попаднал в целевите клетки, полиплексът се абсорбира върху плазмената мембрана, абсорбира се чрез ендоцитоза, след което трябва да напусне ендозома и да се дисоциира в катионен полимер и ДНК молекула. Свободната ДНК се изпраща към ядрото, а полимерните катиони напускат клетката и се изхвърлят от тялото.

Характеристики на най-разпространените методи за доставяне на ДНК ваксини
Метод	Предимства	недостатъци
Интрамускулни или подкожни инжекции	Не е необходимо специално оборудване Постоянна или дълготрайна експресия ДНК се пренася до съседни тъкани	Ниска ефективност Изисква относително голямо количество ДНК
електропорация	Висока ефективност	увреждане на тъканите
ген пистолет	Висока точност Изисква малко количество ДНК	Изисква инертни микрочастици Увреждане на клетките на мястото на изстрела
Въведение поради високо налягане	Сравнително прост метод Няма нужда от микрочастици ДНК може да проникне на дълбочина от няколко mm до 1,5 cm	Влияе върху структурата на ДНК Ниска ефективност на имунизацията Изисква голямо количество ДНК (до 300 mcg)
Опаковка в липозоми	Висока ефективност инвитро Лесно производство Голям капацитет Може да се комбинира с други методи Когато се прилага интравенозно, ваксината има потенциала да достигне до всички тъкани Интраназалното приложение осигурява експресията на ваксината в носната лигавица и производството на имуноглобулини клас А (IgA)	Възможна токсичност Ниска ефективност in vivo

Механизмът на развитие на имунния отговор

Синтезираният в клетката антиген се подлага на обработка, след което се представя на имунокомпетентни клетки. Обработката е разделянето на антигенен протеин на имуногенни пептидни фрагменти. Представяне означава представяне на антигенен фрагмент, свързан с молекули на главния комплекс за хистосъвместимост (МНС) на имунокомпетентни клетки. Има два най-значими класа от тези молекули: MHC клас I (MHC-I) и MHC клас II (MHC-II). За да се свърже с молекули от всеки клас, антигенът се приготвя в специализирани отделения на клетката. Ендогенните антигенни протеини се насочват към протеазомата за разграждане, след което се представят в комплекс с MHC-I на клетъчната повърхност. Тук, когато се срещнат, те се разпознават от CD8 + Т-клетки (Т-убийци), които осъществяват цитотоксичен имунен отговор. Екзогенните протеини се разцепват от лизомнимални протеази, включват се в MHC-II и се разпознават от CD4+ Т-клетъчни (Т-хелперни) рецептори. Последните предизвикват както клетъчни, така и хуморални отговори.

Представяне на антиген чрез MHC-I път

ДНК ваксинацията включва ендогенен синтез на антиген, така че този път е преобладаващ. Обработката на антиген по MHC-I пътя се извършва в няколко стъпки. Синтезираният в ядрото протеин се транспортира до цитоплазмата, протеазомата се разцепва на къси пептиди - епитопи, които се пренасят в ендоплазмения ретикулум (EPR) чрез специални антиген транспортни протеини (TAP). В EPR всеки епитоп се комбинира с молекулата MHC-I, след което образуваният комплекс се изпраща към апарата на Голджи (AG) за гликозилиране. Оттам комплексът в състава на мехурчето се насочва към плазмената мембрана. След сливането на везикулата с плазмената мембрана, комплексът се появява на клетъчната повърхност, където се разпознава от Т-килерните рецептори, които имат цитотоксична активност.

Представяне на антиген по пътя на MHC-II

Основният източник на пептиди, които се свързват с MChS-II, са екзогенни протеини, които са влезли в клетката чрез ендоцитоза. Въпреки това е показано, че някои вътреклетъчни протеини могат също да бъдат представени в комплекс с MChS-II. В този случай новосинтезираните протеини, след като навлязат в цитоплазмата, се прехвърлят в лизозомите, където антигенът се разцепва под действието на киселинни протеази. След това лизозомата, съдържаща епитопите, се слива с везикулата, която носи молекулата MChS-II. Вътре в обединения везикул се образува комплекс епитоп-MChS-II; след сливането на везикула с плазмалемата, той се извежда на клетъчната повърхност. Тук този комплекс се разпознава от Т-хелперните рецептори, което води до тяхното активиране. Това води до стимулиране както на клетъчния (активиране на Т-килърите), така и на хуморалния имунитет (активиране на В-лимфоцитите).

Традиционната ваксинация с разтворими протеинови антигени е насочена към мобилизиране на Т-хелперите. Относително ниският отговор на Т-хелперите е един от недостатъците на ДНК ваксините. Освен това сегашното поколение ДНК ваксини не е в състояние да индуцира производството на високи титри на антитела. За да се увеличи активирането на Т-хелперните клетки, антигенът трябва да бъде пренасочен към пътя на MChS-II. За да направите това, в ДНК ваксината е вграден сигнал за лизозомна локализация; синтезираният антиген ще бъде изпратен до лизозомите, което означава, че ще поеме по пътя на MChS-II

Стратегии за подобряване на ефикасността на ДНК ваксина

Основният въпрос относно бъдещето на ДНК ваксините е как да се увеличи тяхната ефективност. В момента се провеждат голям брой проучвания за оптимизиране на разработените ДНК ваксини. Търсенето на решение се извършва в две посоки: повишаване на експресията на ваксината и повишаване на имуногенността на кодирания антиген.

Оптимизация на транскрипционния елемент

Важен компонент на ДНК ваксината е промоторът. Бактериалните промотори не са подходящи за антигенна експресия в клетки на бозайници, така че вместо тях са използвани промоторите на онкогенни вируси. Сега, за да се подобри безопасността на ваксините, те са заменени с промотори от неканцерогенни обекти, като човешки цитомегаловирус (CMV). За повечето ДНК ваксини този промотор е оптималният избор: той е силно експресиран в широк диапазон от клетки. За генна експресия в специфични тъкани е обещаващо да се използват промотори, специфични за този тип тъкан. Например, използването на мускулен CPK промотор, когато се прилага, води до десетократно увеличение на синтеза на антитяло и индуциране на Т-клетъчен отговор, отколкото използването на подобна ДНК ваксина с CMV промотор. Промоторът на гена desmin, кодиращ един от цитоскелетните протеини, също показва висока ефективност в миоцитите. За да се увеличи експресията на ДНК ваксината в кератиноцитите (клетките на епителната тъкан), се използват промотори на гена металотионеин (протеин, който свързва тежки метали) или гена 3 на витамин D хидроксилазата.

Нивото на започване на транскрипция има тенденция да се увеличава перакаунт за използване мощен промотор и подобрител,и характеристиките за прекратяване могат да се превърнат в ограничаващ фактор. Ефективността на полиаденилирането и обработката на първичния РНК транскрипт варира в зависимост от последователността на полиА сигнала. Тоест, последователността на полиаденилиране засяга синтеза на антиген. Например, широко използваният полиА сигнал на вируса SV40 е по-малко ефективен от сигнала за полиаденилиране на заешкия β-глобинов ген или гена на говеждия растежен хормон.

За ефективна транслация иРНК на бозайници трябва да има т.нар Козак последователност.Вмъкването на тази последователност в ДНК конструкт може значително да повиши нивото на синтез на антиген. Така че РНК полимеразата НЕ прескача стоп кодона на гена и не се осъществява синтеза на удължен протеин, който след това не може да придобие правилния стил, генът може да бъде прекратен двойна стоп линия.

Когато проектират ДНК ваксини, те също се опитват да оптимизира своите кодони.Процедурата на оптимизация означава замяна на кодони в генната последователност по такъв начин, че аминокиселинната последователност на протеина да не се променя, но ефективността на транслацията на неговата иРНК се увеличава. Причината е, че повечето аминокиселини са кодирани с повече от една граница. Всеки кодон има своя собствена тРНК и представянето на различните тРНК в клетката не е еднакво и също варира в зависимост от вида на организма. Кодоните се избират по такъв начин, че присъствието на желаната тРНК по време на синтеза на антиген не се превръща в ограничаващ фактор.

Оптимизация на антигена

Въпреки че силата на имунния отговор корелира с нивото на експресия на ДНК ваксината, обаче, за всеки антиген има определено плато, след което увеличаването на количеството антигенен протеин ще увеличи производството на антитела. В същото време може да се постигне по-силен имунен отговор чрез оптимизиране на антигена. Например от комбиниране на антиген с лиганд към специфичен рецептор за антиген-представящи клетки.Такъв лиганд може да бъде CD40 маркерният протеин, извънклетъчният домен на Fms-оформена тирозин киназа-3 или Т-килърен антиген-4. Поради взаимодействието на лиганд-рецептора, ефективността на улавяне на антигенния протеин на APC се увеличава.

Улесняване на разграждането на антигена в протеазомата или лизозоматасъщо така стимулират имунния отговор. За да се подобри протеолиотичното разцепване на антигена, в неговата последователност се вмъква сигнал за убиквитиниране. Грешка в цитата: Лошо обаждане: Неозаглавен референтен етикет трябва да има вход.Използването на ДНК ваксини, кодиращи вместо целия антиген, няколко епитопа с различен произход,ви позволява значително да разширите спектъра на имунния отговор.

За противотуморните ДНК ваксини комбинацията е ефективна "туморен антиген + вирусен или бактериален антиген".Например, комбинацията от туморен антиген с епитоп на тетаничен токсин значително повишава активирането на Т клетки убийци срещу ракови клетки.

Включване на адюванти

Когато се използват традиционни ваксини, към тях се добавят адюванти за повишаване на имунния отговор. ДНК ваксината има бактериален произход, така че сама по себе си е имуностимулатор. За засилване на имунния отговор в ДНК ваксината се вмъкват адювантни гени или се използва допълнителен плазмид, който кодира имуностимулиращи протеини.

Имуностимулиращ ефект на бактериални CpG динуклеотиди

Функцията на плазмид не се ограничава до доставяне на гени до клетките. Още през 1893 г. е установено, че смес от бактериални лизати намалява прогресията на раковите тумори, но едва през 1983 г. е установено, че имуностимулиращите свойства на лизата се дължат на бактериални ДНК молекули. През 1995 г. беше показано, че имунната стимулация се причинява от CpG мотиви в бактериална ДНК. При бактериите, както и при ДНК вирусите, тези мотиви са неметилирани. При хората и висшите примати, напротив, цитозинът в повечето CpG динуклеотиди съдържа метилова група. Следователно CpG мотивите без метилиране се възприемат от човешкото тяло като свързани с патогени молекулярни модели (PAMP). Съединенията на Ramri се разпознават от Toll-подобни рецептори, които в зависимост от вида на лиганда се разделят на няколко вида. Мотивите за неметилиране на CpG се разпознават от рецептора TLR-9, разположен върху мембраните на ендоплазмения ретикулум на В лимфоцити, дендритни клетки и естествени клетки убийци. Свързването на рецептора с неметилирани CpG мотиви задейства каскада от реакции, които индуцират синтеза на провъзпалителни цитокини - интерферон-1 и IL-12.

Експресия на цитокини и други имуномодулатори

За ДНК ваксинация цитокиновите гени най-често се използват като адюванти. Цитокините са клас протеинови молекули, които регулират междуклетъчните и междусистемните взаимодействия в организма, по-специално функционирането на имунната система. Всички цитокини, а повече от 30 от тях са известни, могат да модулират имунния отговор. Цитокините IL2, IL-12, интерферон γ, IL-15, IL-18 и IL-23 имат стимулиращ ефект върху Т-хелперите от първи клас. Цитокините, които модулират действието на Т-хелперите от втори клас, включват: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 и IL-13. Типът цитокин се избира в зависимост от вида на имунния отговор, който се желае да се засили.

Възможно е да се постигне повишаване на имунния отговор с помощта на хемокини. Хемокините са семейство цитокини, които могат да причинят хемотаксис на чувствителни клетки, включително имунни. По-специално, хемокинови рецептори се намират върху антиген представящи хемокинови клетки. Свързването на хемокин с неговия рецептор води до ендоцитоза на комплекса антиген-хемокин вътре в APC. Тази стратегия се използва ефективно както при разработването на антивирусни ДНК ваксини, така и на противотуморни.

Функцията на адювант може да се изпълнява и от протеина HSP70 (протеини на топлинен шок, протеини на топлинен шок). Имуностимулиращият ефект на HSP70 се основава на способността му да навлиза в извънклетъчното пространство и да се свързва с APC рецепторите. Механизмът на транспортиране на HSP70 навън все още не е напълно изяснен, но най-вероятно има няколко начина - екзоцитоза, секреция навън или излизане през канала. Свързването на HSP70 с неговия рецептор води до активиране на дендритни клетки, медиира представянето на антиген и стимулира производството на хемокин. Тъй като антигенът е слят с HSP70, той също навлиза в извънклетъчното пространство, така че може да бъде представен по пътя на MES-II и да активира В клетките. ДНК ваксините използват бактериалния HSP70 ген, за да избегнат автоимунни реакции.

Предимства и недостатъци на ДНК ваксините

Методът на ДНК ваксинация има редица предимства, най-важното от които е задействането както на хуморален, така и на клетъчен имунен отговор. Ваксините на основата на ДНК осигуряват дълготрайна експресия на антиген и съответно стабилен имунен отговор. Допълнителни фактори, движещи развитието на ДНК имунизацията, включват лекотата и ниската цена на производството на ваксина.

Предимства

недостатъци

Антигенът придобива нативна конформация Активиране на двата клона на имунитета: хуморален и клетъчен Синтезираният антиген може да бъде селективно насочен към MES-I или MES-II пътя Може да действа избирателно върху различни популации от Т-хелпери Осигурете дълготрайна експресия на антиген Лесен и бърз за производство Ниска производствена цена Не изисква специални условия на съхранение Може да се използва както за профилактика, така и за лечение на заболявания Потенциално ефективен срещу широк спектър от заболявания: бактериални, вирусни, автоимунни и ракови заболявания

Слаба имуногенност За вирусните вектори съществува риск чужда ДНК да се интегрира в клетъчния геном Възможно развитие на автоимунни реакции Плазмидни и вирусни вектори могат да предизвикат неспецифичен имунен отговор

Използването на ДНК ваксини

Първите клинични изследвания на ДНК ваксините, заедно с безопасността на новия метод, показаха ниската му ефективност. Осъзнавайки обещанието за ДНК имунизация, научните лаборатории, заедно с биотехнологичните компании, насочиха усилията си към оптимизиране на новия метод и в рамките на няколко години беше постигнат значителен напредък. През 2005 г. първата ДНК ваксина получи одобрение от FDA. Администрация по храните и лекарствата)за използване при животни. Към 2013 г. повече от сто ДНК ваксини са в клинични изпитвания и четири ДНК ваксини са лицензирани за използване в животновъдството.

ДНК ваксини във ветеринарната медицина

И четирите одобрени от FDA ваксини са базирани на плазмиди. За три от тях производителят е препоръчал начина на приложение - мускулно, за ваксината LifeTide® - инжектиране, комбинирано с електропорация. Ако останалите ваксини са насочени към активиране на имунната система, то за ваксината LifeTide® имуностимулиращият ефект е допълнителен. Продуктът на ваксината е соматолиберин, хормон, който стимулира отделянето на растежен хормон и пролактин от хипофизната жлеза. Действието на последните два хормона при свинете води до увеличаване на масата на животните и увеличаване на броя на котилата. В същото време въвеждането на плазмид, кодиращ соматолиберин, в животни стимулира производството на Т-лимфоцити, естествени убийци, и следователно повишава имунната устойчивост на организма.

Търговската марка на ваксината	Година на лиценз	Цел	Животно	Ваксинен продукт	Целта на ваксината
West Nile-Innovator® (САЩ)	2005	Западнонилски вирус	Коне	Структурен протеин на PreM-E вируса	Защита срещу вируса
Apex-IHN® (Канада)	2005	Причинителят на инфекциозната некроза на хематопоетичната тъкан	Риба от семейството на сьомгата	Вирусен гликопротеин	Повишаване на количеството и качеството на храната за рибки
LifeTide® SW 5 (Австралия)	2008	Хормон на растежа	Свине и друг добитък	Свински соматолиберин	Повишено постеля при свине майки; значително намалява намаляването на перинаталната смъртност и заболеваемост
ONCEPT® (САЩ)	2010	Меланом	кучета	Човешка тирозиназа	Като алтернатива на лъчетерапията и хирургията при лечение на меланом

Перспективи за ДНК ваксинация

ДНК ваксини срещу рак

Докато индукцията на клетъчни и хуморални имунни отговори е убедително демонстрирана за чужди антигени, свързани с инфекциозни заболявания, използването на ДНК ваксини за лечение на рак досега е по-малко успешно. Индукцията на ефективен противотуморен имунитет е трудна задача. Клиничните проучвания потвърждават общата безопасност и ниската токсичност на противотуморните ДНК ваксини, но ефективността на имунния отговор, който те предизвикват, се оказа слаба, а антитуморната активност в някои случаи като цяло е съмнителна.

ДНК ваксини срещу вирусни и бактериални патогени

ДНК ваксина срещу кариес

Причината за кариеса е локална промяна на pH в резултат на ферментация (гликолиза) на въглехидрати, извършвана от бактерии. Учени от Института по вирусология в Ухан (Китай) разработиха ДНК ваксина, насочена срещу един от патогените на кариеса - Streptococcus mutans.Ваксината е базирана на плазмид и кодира два протеина: повърхностен протеин Св. mutans PAcи флагелин, получен от бактерията Салмонелакойто действа като адювант. На етапа на предклиничните изследвания ваксината се прилага през носа на лабораторни гризачи, след което се проверява нивото на имуноглобулини G в кръвния серум и секреторни имуноглобулини А в слюнката при животни. След проучванията учените установиха, че нивото на имунните протеини в кръвта и слюнката се повишава, но по-важното е, че растежът на колониите е инхибиран. Streptococcus mutansвърху зъбния емайл. Тоест зъбите на ваксинираните животни са били по-добре защитени от кариес.

ДНК ваксини и лечение на автоимунни заболявания

ДНК ваксина срещу диабет тип 1

Захарният диабет тип 1 се характеризира със загуба на бета-клетки, произвеждащи инсулин, разположени в Лангерхансовите острови на панкреаса. Основната причина за загуба на бета клетки е автоимунно увреждане от Т клетки убийци. За да предпазят бета клетките от свръхактивна имунна система, учени от университетите Станфорд (САЩ) и Лайден (Холандия) разработиха ДНК ваксината BHT-3021. Ваксината е създадена на базата на плазмид и кодира прекурсора на инсулина проинсулин. Това е ретроактивна ваксина: ако конвенционалните ваксини трябва да активират имунните отговори, тогава BHT-3021, напротив, неутрализира цитотоксичния ефект на Т-убийците, насочен срещу Лангерхансовите острови.

В първата фаза на клиничните изпитвания BHT-3021 показа своята ефективност при група от 80 души. Половината от тях са получавали интрамускулни инжекции BHT-3021 на всеки седем дни в продължение на 12 седмици, а другата половина са получавали плацебо. След този период групата, която е получила ваксината, показва повишаване на нивото на С-пептидите в кръвта, което показва възстановяването на функцията на бета-клетките. Не са регистрирани сериозни странични ефекти при един от участниците. Ефектът от ваксината се поддържа в продължение на 2 месеца.

Въведение

1 Основни групи генно инженерни ензими

1.1 Рестрикционни ензими

1.1.1 Механизъм на действие на рестриктазите

1.1.2 Изграждане на рестрикционни карти

1.3 Лигази

2 Въвеждане на нов ген в клетка

2.1 Регулиране на генната експресия в прокариотите

2.2 Методи за директно въвеждане на ген в клетка

2.3 Въвеждане на гени в клетки на бозайници

2.4 Генетична трансформация на соматични клетки на бозайници

2.5 Генна терапия

2.6 Получаване на трансгенни животни

Заключение

Библиография

Въведение

Генното инженерство е in vitro изграждане на функционално активни генетични структури (рекомбинантна ДНК), или с други думи, създаването на изкуствени генетични програми (Баев А. А.). Според Е. С. Пирузян генното инженерство е система от експериментални методи, които позволяват да се конструират изкуствени генетични структури в лаборатория (в епруветка) под формата на така наречените рекомбинантни или хибридни ДНК молекули.

Говорим за насочено, по предварително зададена програма, изграждане на молекулярно-генетични системи извън тялото с последващото им въвеждане в живия организъм. В този случай рекомбинантната ДНК става неразделна част от генетичния апарат на организма реципиент и му придава нови уникални генетични, биохимични и след това физиологични свойства.

Целта на приложното генно инженерство е да се проектират такива рекомбинантни ДНК молекули, които, когато бъдат въведени в генетичния апарат, да придадат на тялото свойства, полезни за хората.

Рекомбинантната ДНК технология използва следните методи:

Специфично разцепване на ДНК чрез рестрикционни нуклеази, ускоряващо изолирането и манипулирането на отделните гени;

Бързо секвениране на всички нуклеотиди на пречистен ДНК фрагмент, което ви позволява да определите границите на гена и аминокиселинната последователност, кодирана от него;

Конструиране на рекомбинантна ДНК;

Хибридизация на нуклеинова киселина, която позволява откриването на специфични РНК или ДНК последователности с по-голяма точност и чувствителност въз основа на тяхната способност да свързват комплементарни последователности на нуклеинова киселина;

ДНК клониране: in vitro амплификация чрез полимеразна верижна реакция или въвеждане на ДНК фрагмент в бактериална клетка, която след такава трансформация възпроизвежда този фрагмент в милиони копия;

Въвеждане на рекомбинантна ДНК в клетки или организми.

История на генното инженерство

Генното инженерство се появи благодарение на работата на много изследователи в различни клонове на биохимията и молекулярната генетика. В продължение на много години протеините се считат за основния клас макромолекули. Имаше дори предположение, че гените са от протеинова природа. Едва през 1944 г. Ейвъри, Маклауд и Маккарти показват, че ДНК е носител на наследствена информация. Оттогава започва интензивно изследване на нуклеиновите киселини. Десетилетие по-късно, през 1953 г., Дж. Уотсън и Ф. Крик създават двуверижен ДНК модел. Тази година се смята за рождена на молекулярната биология.

В началото на 50-те и 60-те години на миналия век свойствата на генетичния код са изяснени, а в края на 60-те години неговата универсалност е потвърдена експериментално. Имаше интензивно развитие на молекулярната генетика, обект на която бяха E. coli, нейните вируси и плазмиди. Разработени са методи за изолиране на високо пречистени препарати от непокътнати ДНК молекули, плазмиди и вируси. ДНК на вируси и плазмиди се въвежда в клетките в биологично активна форма, осигурявайки нейната репликация и експресия на съответните гени. През 70-те години са открити редица ензими, които катализират реакциите на трансформация на ДНК. Рестрикционните ензими и ДНК лигазите играят специална роля в развитието на методите на генното инженерство.

Историята на развитието на генното инженерство може да бъде разделена на три етапа. Първият етап е свързан с доказването на принципната възможност за получаване на рекомбинантни ДНК молекули in vitro. Тези работи се отнасят до производството на хибриди между различни плазмиди. Доказана е възможността за създаване на рекомбинантни молекули с помощта на оригинални ДНК молекули от различни видове и щамове бактерии, тяхната жизнеспособност, стабилност и функциониране.

Вторият етап е свързан с началото на работата по получаване на рекомбинантни ДНК молекули между хромозомните гени на прокариотите и различни плазмиди, доказващи тяхната стабилност и жизнеспособност.

Третият етап е началото на работата по включването на еукариотни гени, главно гени на животни, във векторни ДНК молекули (ДНК, използвана за генен трансфер и способна да бъде интегрирана в генетичния апарат на реципиентната клетка).

Формално рождената дата на генното инженерство трябва да се счита за 1972 г., когато P. Berg, S. Cohen, H. Boyer и сътрудници създават първата рекомбинантна ДНК, съдържаща ДНК фрагменти на вируса SV40, бактериофага и Е. coli в Станфорд Университет.

1 Основни групи генно инженерни ензими

Генното инженерство е наследник на молекулярната генетика, но дължи раждането си на успехите на генетичната ензимология и химията на нуклеиновите киселини, тъй като ензимите са инструментите за молекулярна манипулация. Ако понякога можем да работим с клетки и клетъчни органели с микроманипулатори, то никакви, дори и най-малките микрохирургични инструменти, няма да помогнат при работа с ДНК и РНК макромолекули. Какво да правя? Ензимите действат като "скалпел", "ножица" и "конци за зашиване".

Само те могат да намерят определени последователности от нуклеотиди, да "изрежат" там молекула или, обратно, да "пробият" дупка в ДНК веригата. Тези ензими работят в клетката от дълго време, изпълнявайки работата по репликиране (удвояване) на ДНК по време на клетъчното делене, възстановяване на щети (възстановяване на целостта на молекулата), в процесите на четене и прехвърляне на генетична информация от клетка на клетка или вътре в клетката. Задачата на генния инженер е да избере ензим, който да изпълнява поставените задачи, тоест да работи с определена част от нуклеиновата киселина.

Трябва да се отбележи, че ензимите, използвани в генното инженерство, не са специфични за видовете, така че експериментаторът може да комбинира ДНК фрагменти от всякакъв произход в едно цяло в избраната от него последователност. Това позволява на генното инженерство да преодолее видовите бариери, установени от природата, и да извърши междувидово кръстосване.

Ензимите, използвани при изграждането на рекомбинантна ДНК, могат да бъдат разделени на няколко групи:

Ензими, които произвеждат ДНК фрагменти (рестриктази);

Ензими, които синтезират ДНК върху матрица на ДНК (полимераза) или РНК (обратна транскриптаза);

Ензими, които свързват ДНК фрагменти (лигази);

Ензими, които правят възможно промяната на структурата на краищата на ДНК фрагменти.

1.1 Рестрикционни ензими

Общоприето е, че термините "рестриктазен ензим", "рестриктазна ендонуклеаза" и "сайт-специфична ендодезоксирибонуклеаза" се считат за синоними.

Всички бактериални рестрикционни ендонуклеази разпознават специфични, доста къси ДНК последователности и се свързват с тях. Този процес е придружен от разрязване на ДНК молекулата или на самото място на разпознаване, или на друго място, което се определя от вида на ензима. Наред с рестрикционната активност, бактериалният щам има способността да метилира ДНК; този процес се характеризира със същата специфичност за ДНК последователностите, както и за рестрикцията. Метилазата добавя метилови групи към аденинови или цитозинови остатъци на същото място, където се свързва рестрикционният ензим. В резултат на метилирането мястото става устойчиво на рестрикция. Следователно метилирането предпазва ДНК от разрязване.

Има 3 основни класа рестриктази: 1, 2 и 3.

Всички рестрикционни ензими разпознават строго определени последователности на двойноверижна ДНК, но рестрикционните ензими от 1-ви клас извършват прекъсвания в произволни точки на ДНК молекулата, а рестрикционните ензими от 2-ри и 3-ти клас разпознават и разцепват ДНК в строго определени точки в рамките на места за разпознаване или на фиксирано разстояние от тях.

Ензимите от тип 1 и 3 имат сложна структура на субединици и имат два вида активност - модифицираща (метилираща) и АТФ-зависима ендонуклеаза.

Ензимите от втория клас се състоят от 2 отделни протеина: рестрикционна ендонуклеаза и модифицираща метилаза, следователно в генното инженерство се използват само ензими от клас 2. Те се нуждаят от магнезиеви йони като кофактори.

Понастоящем са изолирани повече от 500 рестриктази от клас 2, но сред ензимите, изолирани от различни микроорганизми, има такива, които разпознават същите последователности в ДНК. Такива двойки или групи се наричат ​​изошизомери. Истинската изошизомерия се различава, когато ензимите разпознават една и съща нуклеотидна последователност и разрушават ДНК в едни и същи точки, и фалшивата, когато ензимите, разпознавайки едно и също място в ДНК, правят прекъсвания в различни точки в рамките на едно и също място.

Повечето рестриктази от клас 2 разпознават последователности, съдържащи от 4 до 6 нуклеотидни двойки, така че рестриктазите се разделят на малки и големи. Рестрикционните ензими с малък разрез разпознават тетрануклеотида и въвеждат много повече прекъсвания в молекулите, отколкото рестрикционните ензими с голям разрез, които разпознават последователност от шест нуклеотидни двойки. Това се дължи на факта, че вероятността за поява на определена последователност от четири нуклеотида е много по-висока от последователността от шест нуклеотида. Например, ДНК от 40 000 bp на бактериофаг Т7 няма последователност, разпозната от R1 от Е. coli.

Рестриктазите с малко разцепване включват Hpa II и Alu (от Arthrobacter luteus), с голямо разцепване - Eco R I (от Escherichia coli) и Hind III. Ако приемем, че местата за разпознаване на рестрикционните ензими са произволно разпределени по веригата на ДНК, тогава целта за ензими, разпознаващи последователност (място) от четири нуклеотида, трябва да се появи средно 1 път на всеки 256 базови двойки, а за ензими, разпознаващи шест нуклеотида, след 4096 базови двойки. Ако рестрикционното място е вътре в гена, тогава лечението с ДНК рестрикционен ензим ще доведе до неговото инактивиране. Вероятността от такова събитие е много висока при третиране с дребноразрязващи рестриктази и незначителна при използване на едроразрязващи ендонуклеази. Следователно, за да се получи интактен ген, разцепването се извършва последователно от няколко рестриктази с големи разрези или се използва методът на "недостатъчно ограничаване", т.е. ограничението се извършва при условия, при които разцепването се случва само на едно място.

Рекомбинантна ДНК се въвежда в реципиентните клетки. В генното инженерство такива реципиентни клетки играят две роли. 1. Дават възможност за търсене на клонове на синтезирана рекомбинантна ДНК в генната банка. 2 Впоследствие такива реципиентни клетки могат да се използват за получаване на целеви продукти.

Методът за въвеждане на рекомбинантна ДНК се взема предвид въз основа на какъв тип вектор е получена такава рекомбинантна ДНК и в клетките на кои организми е необходимо да се въведе чрез трансформиране на клетката или протопласта или чрез използване на метода на електропорация. Ако се получи рекомбинантна ДНК на базата на фаги, тя може да бъде въведена в изолирана ДНК - това е трансвекция. Възможно е въвеждането на непокътнати фагови частици - това е инфекция (козмиди, фазмиди).

д-р методи на генетичен обмен - конюгация, трансдукция.

В растителни клетки - трансформация на растителни протопласти, третиране на растителни клетки или тъкани с рекомбинантна ДНК; широко се използват инжекции на рекомбинантна ДНК в ядрото; използването на липозоми. Липозомите са сферични структури, които имат липидна обвивка, вътре в която е рекомбинантна ДНК. За въвеждане в животински клетки - вирусни инфекции, метод на електропорация, микроинжекции в ядрото. Ако след въвеждането на рекомбинантна ДНК всички клетки в тялото я наследят, тогава се говори за получаване на трансгенен организъм.

Електропорация - клетките или протопластите се излагат на ток с високо напрежение (2000-4000 волта) за кратък период от време. В резултат на това се образуват пори в клетъчната мембрана на прибл. 30 nm, който може да съществува 1-2 минути и през който рекомбинантна ДНК може да влезе в клетката. След това порите се затварят и ДНК остава в клетката. Това е универсален начин.

балистичен метод- използва се главно при еукариотите. Използват се балистични пистолети, в които се въвеждат AK или W частици, върху които се напръсква рекомбинантна ДНК. След това, с помощта на инертни газове при P, такива частици се изстрелват от пистолета в клетъчната култура. По различни закономерности част от частиците навлизат в ядрото и там се задържа рекомбинантната ДНК.

Търсене на клонове с рекомбинантна ДНК.

Този етап е труден и непредвидим.

Най-простият метод е да се търсят клонове по фенотип след въвеждането на рекомбинантна ДНК(напр. пигментация). Тестовете за допълване могат да се използват, но е необходимо да има мутантни клетки, които са дефектни в синтеза на активния продукт.

Хибридизационни методи - необходимо е наличието на специфични маркирани ДНК или РНК проби. По-често те са етикетирани с P 32. Сонди m. къси олигонуклеотидни последователности, които съответстват на най-консервативната част от търсения ген. Тези запазени последователности могат да включват до 100 нуклеотида за прокариоти и до 1000 за еукариоти.

След въвеждането на рекомбинантна ДНК колониите, образувани върху средата, се прехвърлят в специален нитроцелулозен филтър. Те се подлагат на лизис и последваща денатурация на ДНК с помощта на алкали. ДНК се свързва силно с филтъра. Филтърът се измива и обработва с радиоактивно маркирана сонда и се определя клонът, с който тази сонда е контактувала.

Имунохимични методи - клоновете след въвеждане на рекомбинантна ДНК се лизират и третират с антитела към съответния продукт. Тези антитела са маркирани.

Процесът на въвеждане на рекомбинантна ДНК в бактериална клетка се нарича трансформация. Резултатът от трансформацията е придобиването от клетката гостоприемник на нови ДНК последователности и, следователно, нови фенотипни характеристики, например резистентност към определени антибиотици. Клетката гостоприемник, използвана в такива експерименти, трябва да има определен фенотип, по-специално р-, т.е. не трябва да съдържа рестрикционни ензими; трябва да е неспособен на обща рекомбинация ( recA-)така че екзогенната ДНК не се модифицира чрез хомоложна рекомбинация. Една от най-широко използваните култури за тази цел е лабораторен щам бактерии. E.coli- щам К12.

Наричат ​​се клетки, които могат да абсорбират чужда ДНК компетентен.Компетентност E. coliнеобходимо е да се индуцира и някои други бактерии първоначално имат това свойство. Делът на компетентните клетки може да се увеличи с помощта на специална хранителна среда или условия на култивиране. За бактерии, устойчиви на химически индуктори на компетентност или без естествена компетентност, се използват други системи за доставяне на ДНК.

Най-често използваните методи за трансформация на бактериални клетки в лабораторната практика са:

Трансформация E.coliчрез третиране с калциев хлорид;

електропорация– повишаване на клетъчната пропускливост под въздействието на токов импулс с продължителност ~4,5 ms;

Резултатите от трансформацията могат да бъдат количествено определени: чрез определяне на едно от двете честота, или ефективносттрансформации.

Честота на трансформацияе делът на клетките в клетъчната популация, които са получили чужда ДНК; изразено като броя на трансформантите към общия брой клетки.

Ефективност на трансформацията- брой трансформанти на 1 µg ДНК, взета за трансформация.

Информацията за клониране на рекомбинантна ДНК с помощта на плазмиден вектор pBR322, представена в този раздел, е обобщена под формата на експериментална схема и представена на Фигура 20.

Ориз. 20. Клониране на ДНК в плазмиден вектор pBR322

1, 2, 3, 4 и 5 - етапи на процедурата по клониране (виж текста).

1. pBR322 ДНК се нарязва с рестрикционна ендонуклеаза PstI в мястото на устойчивост на ампицилин.

2. Донорни ДНК фрагменти, също получени с помощта на PstI и имащи лепкави краища, като линеаризирания pBR322 вектор, се лигират с векторна ДНК с помощта на ДНК лигаза. Последицата от образуването на такава конструкция е разрушаването на гена, който осигурява резистентност към ампицилин. По този начин, създадената рекомбинантна ДНК, когато се въведе в клетките E.coliняма да могат да осигурят оцеляването си върху среда с ампицилин.

3. Клетки E.coliтрансформират с рекомбинантна ДНК.

4. След процедурата на трансформация, клетъчната суспензия се посява върху агарови плаки и хранителна среда, съдържаща антибиотика тетрациклин. На този етап се извършва селекция, т.е. селекция на клетки, способни да растат върху среда с тетрациклин. Клетките, отгледани върху този агар, съдържат рекомбинантна ДНК и pBR322 ДНК, които не включват вмъкната донорна ДНК; възстанови оригиналната структура на вектора.

5. Индивидуални клетъчни колонии E.coliотглеждани върху чаша с тетрациклинова субкултура две чаши върху чаши, едната от които съдържа агар с ампицилин, а втората с тетрациклин. Клетки, съдържащи рекомбинантна плазмидна ДНК, растат само върху тетрациклинов агар, тъй като генът, който осигурява резистентност към ампицилин, се деструктурира поради вмъкването на донорна ДНК. Докато клетките от оригинала, т.е. от възстановената pBR322 векторна ДНК растат и на двете плаки, тъй като гените за резистентност към двата антибиотика са в нативния, т.е. в оригинално състояние.

От клетки на избрани клонове E.coliизвлича плазмидна ДНК и анализира нейната структура.

Други плазмидни вектори

Ерата на вектора pBR322, започната от Боливар и Родригес в самото начало на 80-те години, продължава и до днес. Въпреки това, при цялата си надеждност и класическо съответствие с всички изисквания за вектори, този вектор има само няколко удобни места за клониране. В допълнение, селекцията на трансформирани клетки в експерименти с рекомбинантна ДНК, базирана на нея, отнема много време. Имаше нужда от разработване на алтернативни, по-напреднали системи за клониране. Така беше създадена група от вектори от семейството pUC. В името на векторите на това семейство буквите „U” и „C” са първите букви от думите Калифорнийски университет. Изследователите от този университет са създали серия от вектори, които имат важна характеристика - наличието в структурата на ДНК на интегриран синтетичен полилинкер, която е нуклеотидна последователност, съставена от сайтове за разпознаване за редица рестрикционни ендонуклеази, уникални за този вектор - MCS (Множествени сайтове за клониране). Имената на отделните вектори от семейството pUC се различават с двуцифрено число и първичната структура на различните вектори се различава в състава на MCS сайтовете MCS - Множествени сайтове за клониране в полилинкер.

Нека разгледаме по-подробно характеристиките на векторите, включени в тази група, използвайки вектора pUC19 като пример (фиг. 21).

Плазмидът pUC19 е дълъг 2686 bp. и съдържа: ген за устойчивост на ампицилин; регулиран сегмент на β-галактозидазния ген (lacZ")лактозен оперон E. coliген lacI,кодиращ репресор, който контролира генната експресия lacZ";полилинкер - къса последователност с много уникални места за разпознаване на ендонуклеази (EcoRI, SacI, KrpI, Xmal, Smal, BamHI, Xbal, SalI, HincII, AccI, BspMI, PstI, SphI и HindIII); начало на репликация на плазмида ColE1.

Ориз. 21. Плазмиден вектор pUC19

Картата е обяснена в текста.

Наличието в плазмида pUC19 на ген, който осигурява резистентност към ампицилин, позволява да се изберат клонове на Е. coli, съдържащи този вектор или рекомбинантна ДНК на базата на него върху хранителна среда с този антибиотик. Такива модулни елементи от структурата на разглеждания вектор като lacZ", lacIи MCS позволяват да се ускори и интензифицира селекцията на клонинги с рекомбинантна ДНК.

Ако клетки, съдържащи немодифицирания плазмид pUC19, се отглеждат в присъствието на изопропил-β-D-тиогалактопиранозид (IPTG), който е индуктор лак-оперон, след това генният продукт lacI,т.нар репресор, няма да може да се свърже с промоторно-операторната област на гена lacZ",и в резултат ще настъпи транскрипция и транслация на плазмидния фрагмент на гена lacZ".Продуктът от този фрагмент ще се свърже с протеин, кодиран от хромозомна ДНК ( α-комплементация), и в резултат на това се образува активна ß-галактозидаза. Последователност с множество рестрикционни сайтове (полилинкер) се вмъква в ген lacZ"така че да не повлиява производството на функционална β-галактозидаза и ако неговият субстрат 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-β-D-галактопиранозид (X-Gal) присъства в средата, тогава ще бъде хидролизира под действието на този ензим, за да образува син продукт, който оцветява колонии от клетки, съдържащи немодифицирани, т.е. без вмъкване на чужда ДНК, pUC19 плазмид (фиг. 22).

Ориз. 22. Последователността на процедурите за клониране на ДНК във вектора pUC19.

1, 2, 3 и 4 - етапи на клониране (вижте текста)

1. Донорната ДНК се третира с една от рестрикционните ендонуклеази, за които има място в полилинкера. pUC19 векторна ДНК се третира със същия ензим

2. Лигиране на линеаризирания вектор и вмъкване с Т4 ДНК лигаза.

3. След процедурата на лигиране с инкубационната смес се трансформират клетки, способни на α-комплементация, които могат да синтезират тази част от ß-галактозидаза (LacZα), която е свързана с генния продукт lacZ"с образуването на активен ензим.

4. Третираните клетки се посяват върху хранителна среда с ампицилин, IPTG и субстрат за ß-галактозидаза. Нетрансформираните клетки не могат да растат в присъствието на ампицилин и клетките, носещи интактен плазмид, образуват сини колонии върху средата с ампицилин. Клетките гостоприемници, носещи хибрид, т.е. рекомбинантен, плазмид, образуват бели колонии върху същата среда. Това се дължи на факта, че обикновено, когато чужда ДНК се вмъкне в полилинкер, не може да се образува пълен генен продукт. lacZ", и следователно в процеса на α-комплементация не се образува активна ß-галактозидаза, която разцепва X-Gal субстрата до продукт, който осигурява синьо оцветяване на клетките на колонията.

Вектори на базата на бактериофаг λ

Плазмидните вектори позволяват клонирането на ДНК фрагменти, чийто размер не надвишава 10 kb. Въпреки това, за да се реши проблемът с клонирането на хромозомна ДНК дори на малък организъм, например бактерия, е необходимо да се създадат пълни колекции от тези ДНК фрагменти; следователно често е необходимо да се работи с по-големи фрагменти. За това са използвани вектори, базирани на бактериофага λ д. коли.

Когато фаг λ проникне в клетките на E. coli. Има два алтернативни пътя за развитие на събитията:

1. литичен цикъл- фагът започва да се размножава активно и след около 20 минути клетката се разрушава с освобождаването на до 100 нови фагови частици.

2. Състоянието на лизогения– Фаговата ДНК е включена в хромозомата на E. coli като профаг и се репликира в клетката заедно с нормалните бактериални клетки. Въпреки това, при неблагоприятни условия (липса на хранене), литичният цикъл започва (фиг. 23):

1. По време на репликацията на кДНК на бактериофаг λ се образува линейна молекула, състояща се от повтарящи се сегменти с дължина приблизително 50 kb. Всеки от тези сегменти е фагова ДНК с пълна дължина, оградена от лепкава cos-сайтове - едноверижни 5 "-"опашки" от 12 нуклеотида. Наричат ​​се лепкави ( cos) завършва, защото те са взаимно допълващи се и могат да се сдвояват един с друг като лепкави краища на рестрикционни фрагменти.

2. Главата на фага съдържа един такъв сегмент, след което вече сглобеният процес се прикрепя към главата.

Ориз. 23. Литичен път на развитие на бактериофаг λ

1 - опаковане във фаговата глава на един сегмент от фагова ДНК с пълна дължина; 2 - сглобяване на пълноценна фагова частица.

Размерът на ДНК на фаг λ е приблизително 50 kb, като значителна част от него (около 20 kb) не е от съществено значение за репродукцията на фага и е отговорна за включването му в ДНК на гостоприемника. В тази връзка възниква идеята, че той може да бъде заменен с фрагмент от друга ДНК с еквивалентен размер. Получената рекомбинантна молекула ще се репликира в клетката като ДНК на "рекомбинантен" фаг, който е "влязъл" в литичния път на развитие. Рекомбинантните молекули са опаковани в глави на бактериофаг λ инвитрои след добавяне на процесите се получават инфекциозни фагови частици (фиг. 24).

Ориз. 24. Използване на λ-фагови вектори за клониране на DHA фрагменти в клетки д. коли.

Приготвянето на екстракти за in vitro опаковане на ДНК на фаг λ се извършва с помощта на два щама E.coli, всеки от които е лизогенен срещу определен мутантен щам на фаг λ (фиг. 25). Единият от мутантите не е в състояние да синтезира протеин А (един от полипептидите на фаговата терминаза), другият не е в състояние да синтезира протеин Е (протеин в главата на фага). И двата протеина са необходими за опаковането на ДНК на фаг λ. “А”- и “Е”-екстракти се смесват и се добавя конкатемер (сегменти от фагова ДНК с пълна дължина, полимеризирана съгласно cos-сайтове) фагова ДНК, която се свързва с терминаза, преди да бъде нарязана cosсайтове и опаковани във фагови глави.

Ориз. 25. Опаковка инвитроФаг λ ДНК

При опаковане на ДНК молекула с дължина под 38 kb. получава се неинфекциозна фагова частица и фрагменти с дължина над 52 тона, т.к. не се вписват в главата. Сегменти с дължина 50 kb. в линейна ДНК молекула те са разделени от cos места и именно в тези места молекулата се нарязва, когато следващият сегмент запълни главата. Разрязването се извършва от ензим, разположен на входа на главата.

Процесът на въвеждане на рекомбинантна фагова ДНК с вграден фрагмент от чужда генетична информация в реципиентните клетки се основава на естествен феномен - фагова ДНК трансдукция.

трансдукция(лат. трансдукция- движение) е процес на прехвърляне на бактериална ДНК от една клетка в друга от бактериофаг. По този начин, трансформацията на бактериални клетки с помощта на рекомбинантна ДНК на базата на фагова ДНК не изисква специална подготовка на реципиентните клетки или някакви специални инструменти.

Методите за молекулярна хибридизация и имунологичен скрининг се използват за търсене на клетки, съдържащи фаги с рекомбинантна ДНК, които ще бъдат обсъдени в следващия раздел.

Изобретението се отнася до областта на биотехнологиите, по-специално до метод за целенасочено доставяне на ДНК до туморни и стволови клетки, експресиращи CXCR4 рецептора. Настоящото изобретение може да се използва за целенасочено доставяне на генетични конструкции до стволови и злокачествени туморни клетки с цел коригиране на генни дефекти и предотвратяване на заболявания. Методът включва приготвяне на носители на генетични конструкции чрез включване на сигнални последователности в състава на молекулите носители, които представляват ДНК-свързваща последователност от осем аминокиселинни остатъка на лизин - KKKKKKKKK. Прикрепването на сигналната последователност към ДНК-свързващата последователност се извършва с помощта на линкерна секция от две молекули на ε-аминохексанова киселина. След това се образуват комплекси ДНК/носител. След това трансфекцията се извършва in vitro. Предложеното изобретение дава възможност да се повиши ефективността на доставяне на гена, който представлява интерес, до туморни и стволови клетки. 2 т.п. f-ly, 4 ил.

Изобретението се отнася до генната медицина, генната терапия, биотехнологиите и фармацевтиката и може да се използва за целенасочено доставяне на генетични конструкции до стволови и злокачествени туморни клетки с цел коригиране на генни дефекти и предотвратяване на заболявания. Тъканно-специфичното доставяне на генни конструкции се осигурява чрез използването на сигнални последователности за CXCR4 рецептора, който се експресира в клетки от този тип.

Това, което отличава генната терапия от подходите на конвенционалната медицина, е нейният фокус върху борбата с причината за заболяването, а не със симптомите и последствията. В момента се разработват подходи за генна терапия за лечение или предотвратяване на широк спектър от човешки заболявания. Тези подходи могат да бъдат приложими за in vivo и ex vivo терапия. In vivo терапията се основава на директното въвеждане на генетични конструкции директно в телесните тъкани. Доставката може да се извърши интравенозно с помощта на аерозолни опаковки или инжекции в специфични тъкани. Генната терапия ex vivo се основава на изолирането на специфичен тип клетки от тялото, въвеждането в тях на "терапевтичен" генен конструкт, подбор на трансфектирани клетки и последваща реимплантация в пациент.

Има три основни направления в разработваните към момента подходи за доставка на генетични конструкции:

1) клониране като част от вирусни вектори;

2) използване на физични методи на трансфекция;

3) използването на комплекси от плазмидни експресионни вектори и невирусни молекули-носители.

Вирус-медиираният трансфер е високоефективен метод за доставяне на ДНК до целевите клетки, тъй като навлизането на модифициран вирусен вектор е подобно на процеса, който се случва естествено, когато вирусният геном се прехвърли в клетките гостоприемници. Най-изследвани са векторите, създадени на базата на ретро-, адено-, адено-асоциирани вируси. Предимствата на вирусите включват, на първо място, комбинацията от свойствата на експресионния вектор и носителя, възможността за специфично доставяне, способността за трансфектиране на делящи се и неделящи се клетки, възможността за вграждане на ДНК в хромозомата, за да се гарантира дългосрочно изразяване. Поради тези предимства, този подход все още се използва широко в изследванията за доставка на гени, въпреки че има някои недостатъци. Ретро- и адено-асоциираните вируси имат ограничен размер на клонирания ДНК фрагмент и риск от инсерционна мутагенеза, когато вирусът се вмъкне в генома на гостоприемника. Сериозен недостатък на аденовирусните вектори е изразеният имунен отговор при високи дози и повтарящи се инжекции на аденовирусни конструкции (Walther W., Stein U. Viral vectors for gen transfer: a review of their use in the treation of human disease // Drugs. - 2000. - v. 60. - P. 249-271, RF патент № 2252255, C12N 15/37, C12N 15/86, C12N 15/861, C12N 15/867, публикуван 2005.05.20).

Инжектирането на голи плазмидни ДНК конструкции беше един от първите подходи в разработването на стратегии за лечение с генна терапия. Ниската ефективност на трансфекцията с помощта на "гола" ДНК даде тласък на разработването на нови методи за доставка на генетични конструкции. Изследвани са различни физически методи за доставяне на ДНК до клетките на тялото. Най-популярни сред тях са методът на балистичната трансфекция и електропорацията, които се използват широко за трансфекция на кожни и мускулни клетки. Методът на балистична трансфекция се основава на проникването в клетката на ДНК, нанесена върху златни или волфрамови микрочастици. Трансфекцията се извършва под налягането на поток от сгъстен газ или течност. Методът на електропорация се основава на локална промяна в електрическия потенциал на клетъчната мембрана поради действието на електрически ток. Електрическите импулси водят до образуването на пори в клетъчната мембрана, като по този начин я правят пропусклива за биомолекулите. За преодоляване на ниската ефективност на голата ДНК трансфекция in vivo се използва и методът на хидродинамичния шок - венозно или интраартериално инжектиране на плазмиден вектор в голям обем разтвор. Основните недостатъци на съществуващите физични методи за трансфекция са ниската ефективност и локалността на ефекта от доставката на ДНК. Те позволяват на плазмида да преодолее клетъчната мембрана и да избегне включването в ендозомите, като по този начин предотвратява ензимното разграждане, но като правило не осигуряват дълготрайна устойчивост на въведените генетични конструкции (Wells D.J. Gene therapy progress and prospects: electroporation and other физични методи // Gene Ther.- 2004. - v.11, No. - 2004. - т. 245. - С. 185-196; Herweijer H., Wolff J. A. Напредък и перспективи: трансфер и терапия на гол ДНК ген // Генна терапия. - 2003. - т. 10, № 6. - С. .453-458).

Невирусните носители са алтернатива на вирусно-медиирания трансфер на генетични конструкции в клетки на бозайници. Невирусните носители се синтезират лесно, лекотата на тяхната модификация позволява да се правят промени в структурата и състава на молекулите, като по този начин се подобряват средствата за доставка. Когато се използва невирусна среда, няма ограничения за размера на доставения експресионен вектор. Освен това те са по-малко токсични, в повечето случаи не предизвикват специфичен имунен отговор и са по-безопасни за използване in vivo от вирусните вектори. Следователно въвеждането на генетичен конструкт, опакован в невирусни носители, може да се повтори. Изследването на невирусни носители се развива в посока на подобряване на трансфекционните свойства на плазмидната ДНК чрез образуване на ДНК комплекси с различни синтетични съединения (липиди, олиго- и полипептиди, полимери и др.) (например RF патент № 2336090 , A61K 39/00, A61K 47/00, публикувано 20.10.2008 г.). Подобряването на невирусните носители до голяма степен зависи от подробното разбиране на бариерите пред проникването на ДНК в клетките на тялото (Schmidt-Wolf GD, Schmidt-Wolf I.G. Невирусни и хибридни вектори в човешката генна терапия: актуализация // Trends Mol Med.- 2003. - v.9, No. - 2005. - v.11, No. 4. - P.110-121; Wiethoff C.M., Middaugh C.R. Бариери пред доставката на невирусен ген // J Pharm Sci. - 2003. - v.92, No. 2. - P .203-217).

Смята се, че невирусният носител трябва да има следните характеристики:

1) да бъде нетоксичен, компактен и да предпазва плазмидната ДНК от ензимно разграждане, да се екскретира от тялото след употреба;

2) осигуряване на проникването на плазмида в клетката чрез специфично свързване към плазмената мембрана на клетката:

3) имат способността да освобождават ДНК от ендозомния компартмент;

осигуряват дисоциацията на ДНК от комплекса за последващ транспорт на плазмида в ядрото.

За целите на генната терапия най-предпочитаният метод за доставяне на генетични конструкции е техният тъканно-специфичен трансфер в клетките и тъканите на тялото.

Първата бариера за вътреклетъчното проникване на комплексите е плазмената мембрана. Повечето комплекси взаимодействат с клетъчната повърхност чрез електростатични сили. Възможен механизъм за свързване на комплексите с клетката е тяхното взаимодействие с протеини на клетъчната повърхност, гликозаминогликани. При този механизъм на проникване на комплексите обаче няма тъканно-специфичен трансфер на генни конструкции. В същото време проблемът за тъканно-специфичното доставяне на генетични конструкции е актуален за генната терапия на редица заболявания. За специфично взаимодействие с клетъчната повърхност, комплексите включват лиганди към рецепторите на клетъчната повърхност. Към днешна дата са характеризирани редица интегринови пептидни лиганди. Те включват по-специално трипептидния фрагмент RGD (интегрините присъстват на повърхността на много клетки), трансферин (рецепторът му има повишена експресия в пролифериращи клетки), асиалорозомукоид (асиалогликопротеиновият рецептор има специфична експресия в хепатоцитите на черния дроб).

За специфичното доставяне на генетичен материал в нервните клетки, Зенг и колеги предложиха да се използва носител, състоящ се от сигнална област към TrkA рецептора (80-108 аминокиселини от нервен растежен фактор) и ДНК-свързваща последователност от 10 лизинови аминокиселинни остатъка . Този носител, в присъствието на ендозомолитичния агент хлорохин, който улеснява освобождаването на комплекси от ендозомалното отделение на клетката, е в състояние да достави тъканно-специфично маркерния ген само до клетки, експресиращи TrkA рецептора. Този носител може да се използва за лечение на генна терапия на различни неврологични заболявания като епилепсия, болести на Паркинсон и Алцхаймер. Въпреки това, той не е подходящ за доставяне на генетичен материал до други типове клетки (Zeng J, Too HP, Ma Y, Luo E, Wang S. Синтетичен пептид, съдържащ верига 4 от нервен растежен фактор за насочена доставка на ген // J Gene Med 2004; 6 : 1247 -1256).

Човешките стволови клетки се считат за обещаващи средства за клетъчна и генна терапия за различни човешки заболявания. В същото време те са сред най-трудните за трансфектиране типове клетки. При лечението на рак с генна терапия е необходимо да се осигури доставянето на гени директно до туморните клетки.

CXCR4 е рецептор на миграционен фактор на стволови клетки за хемокина SDF-1α. CXCR4 се експресира в хемопоетични клетки, съдов ендотел и мускулни сателитни клетки. Високо ниво на експресия на този ген е отбелязано в повече от 20 вида ракови тумори (рак на гърдата, рак на простатата и др.), Както и в мигриращи стволови клетки. Рецепторът CXCR4 също е способен да се свързва с вирусния хемокин vMIP-II (вирус на саркома на Капоши). По този начин, включването на сигнални последователности за свързване към CXCR4 рецептора в молекулите на носителя е обещаващ начин за създаване на системи за насочена доставка на ген към туморни и стволови клетки.

За да доставят генетичен материал на клетки, експресиращи рецептора CXCR4, Le Bon и колеги са използвали синтетичен лиганд за този рецептор, AMD3100, който е свързан с полиетиленимин или катионни липиди. Комплексите от генетичен материал с тези съединения не водят до значително повишаване на ефективността на доставяне на маркерен ген до CXCR4+ клетки в сравнение със съединения без сигнали. Носителите, използвани от Le Bon, не са ефективни, тъй като специфичното доставяне с тяхна помощ е възможно само когато към трансфекционната среда се добави вещество, което насърчава интернализацията на рецептора CXCR4 (форболов естер). (Le Bon B, Van Craynest N, Daoudi JM, Di Giorgio C, Domb AJ, Vierling P. AMD3100 конюгати като компоненти на насочени невирусни системи за доставяне на гени: Синтез и in vitro трансфекция Ефикасност на CXCR4-експресиращи клетки // Bioconjugate Chem 2004 , 15: 413-423).

По този начин има нужда да се създаде носител на генетични конструкции, който може да осигури специфична доставка до CXCR4(+) клетки и да не засяга близките тъкани. Такъв метод е осигурен от настоящото изобретение.

Изобретението се основава на задачата да се разработи метод за специфично доставяне на генетични конструкции до клетки, експресиращи CXCR4 рецептора, при който чрез използване на носители на генетични конструкции, съдържащи сигнални последователности за CXCR4 рецептора, се повишава ефективността на доставяне на генът "интерес" се постига. Важно е да се отбележи, че синтезата на претендираните носители може да бъде извършена с помощта на всеки от известните методи за твърдофазов пептиден синтез.

Решението на техническия проблем се осигурява от факта, че в метода за целенасочена доставка на ДНК до туморни и стволови клетки, експресиращи рецептора CXCR4, включващ подготовката на носители на генетични конструкции чрез включване в състава на молекулите на носителя, което е ДНК-свързваща последователност от осем лизинови аминокиселинни остатъка - KKKKKKKK, сигнални последователности, образуване на комплекси ДНК/носител, извършване на трансфекция in vitro, сигналната последователност е избрана от групата: фрагмент от 1 до 8 аминокиселини на последователност на N-края на протеина SDF-1α - KPVSLSYR; фрагмент от 1 до 17 аминокиселини от последователността на N-края на SDF-1α протеина - KPVSLSYRCPCRFFESH, където 9 и 11 аминокиселини са заменени със серин; или фрагмент от 1 до 10 аминокиселини от N-терминалната последователност на вирусния хемокин vMIP-II - LGASWHRPDK; прикрепването на сигналната последователност към ДНК-свързващата последователност се извършва с помощта на линкерно място от две молекули на ε-аминохексанова киселина.

В този случай сигналната последователност може да бъде фрагмент от аминокиселини 1 до 8 от последователността на N-края на протеина SDF-1α-KPVSLSYR.

Алтернативно, сигналната последователност може да бъде фрагмент от аминокиселини 1 до 17 от N-терминалната последователност на SDF-1α протеина - KPVSLSYRCPCRFFESH, където аминокиселини 9 и 11 са заменени със серин.

Фрагмент от аминокиселини 1 до 10 от N-терминалната последователност на вирусния хемокин vMIP-II - LGASWHRPDK, синтезиран от D-аминокиселини, може също да се използва като сигнална област.

Глицеролът или хлорохинът могат да се използват като компонент, осигуряващ изхода от ендозоми на комплекси, състоящи се от носители и генетичен материал.

Плазмидната ДНК може да се използва като генетичен материал за носители.

Посоченият технически резултат в настоящото изобретение се постига чрез използването на олиголизинови молекули - KKKKKKKK (K8), конюгирани със сигнални последователности към CXCR4 рецептора от SDF-1 или vMIP-II протеини, а именно N-терминалната последователност на SDF-1 хемокин (с 1 до 8 аа) или N-терминалната последователност на SDF-1 хемокина (от 1 до 17 аа, със заместването на 9 и 11 аа със серин) или N-крайната последователност на vMIP-II вируса хемокин (от 1 до 10 аа в D-конформацията). Наличието на олиголизин KKKKKKKK в състава на носителя позволява на конюгатите да образуват комплекси с нуклеинови киселини, по-специално с плазмидна ДНК, поради електростатично взаимодействие.

Посоченият технически резултат се постига чрез три варианта на предложената среда.

Посоченият технически резултат по първия вариант се постига с факта, че в късия CDP носител на базата на синтетични аналози на хемокина SDF-1, който включва катионен компонент, който е К8 олиголизин, използван за кондензиране на плазмидна ДНК, и лиганден компонент за взаимодействие с рецептора CXCR4, съгласно изобретението, фрагмент (1-8 аа) от последователността на N-края на протеина SDF-1, имащ структурата KPVSLSYR и притежаващ активността на агонисти на рецептора CXCR4, се използва като лиганден компонент, а катионният компонент на конюгата има структура KKKKKKKK и е прикрепен към лигандния компонент чрез спейсер - две молекули ε-аминохексанова киселина (Ahx).

Посоченият технически резултат съгласно втория вариант се постига чрез факта, че в носителя (дълъг CDP) на базата на синтетични аналози на хемокина SDF-1, който включва катионен компонент, който е К8 олиголизин, използван за кондензация на плазмидна ДНК, и лиганден компонент за взаимодействие с рецептора CXCR4, в съответствие с претендираното изобретение, фрагмент (1-17 аа; аа9 и аа11 заместени със серин) от последователността на N-края на протеина SDF-1, имащ структура KPVSLSYRSPSRFFESH и имащ активността на агонисти на рецептора CXCR4, се използва като компонент на лиганда, а катионният компонент на конюгата има структурата KKKKKKKK и е свързан към компонента на лиганда чрез спейсер - две молекули ε-аминохексанова киселина.

Посоченият технически резултат по третия вариант се постига с факта, че в носителя (вирусен CDP) на базата на синтетични аналози на протеина на вируса на саркома на Капоши vMIP-II, който включва катионен компонент, който е К8 олиголизин, се използва за кондензиране на плазмидна ДНК и лиганден компонент за взаимодействие с рецептора CXCR4, в съответствие с заявеното изобретение, фрагмент (1-10 Daa - синтезиран от D-аминокиселини) от последователността на N-края на vMIP- II протеин, имащ структурата LGASWHRPDK и притежаващ активността на антагонисти на CXCR4 рецептора, се използва като лиганден компонент, а катионният компонент на конюгата има структурата KKKKKKKKK и е свързан към лигандния компонент чрез спейсер - две молекули от ε -аминохексанова киселина.

И трите варианта на претендирания носител могат да бъдат синтезирани, като се използват известни методи за синтез на пептиди, например методът Boc на твърдата фаза (Merrifield, R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide // Journal of the American Chemical Society. 1963. V.85 (14), pp.2149-2154).

Конкретни примери за изпълнение

Изобретението е илюстрирано с помощта на фигура 1, която показва промяната в интензитета на флуоресценцията на етидиев бромид с увеличаване на съотношенията на заряда носител/ДНК в къси CDP/ДНК, дълги CDP/ДНК и вирусни CDP/ДНК комплекси. Намаляването на интензитета на флуоресценцията показва увеличаване на плътността на образуваните комплекси. Платото на флуоресцентните криви показва, че комплексите са достигнали плътност, достатъчна за потушаване на флуоресценцията на етидиев бромид.

Фигура 2 показва зависимостта на луциферазната активност в HeLa (CXCR4+) клетки след трансфекция с къси CDP/DNA, дълги CDP/DNA и вирусни CDP/DNA комплекси в присъствието на ендозомолитичния агент глицерол. В този случай бяха използвани комплексите, образувани при следните съотношения на заряда носител/ДНК: 3/1, 6/1, 9/1, 12/1. Интактната молекула, ДНК, PEI/DNA 1/8 комплекси (положителна контрола на експеримента - търговски носител разклонен полиетиленимин 25 kDa - PEI) и комплекси, съдържащи ДНК и контролен пептид (СР) служат като експериментални контроли. СР се различава от носителите в настоящото изобретение по това, че му липсва CXCR4 рецепторен свързващ сигнал и е структурно олиголизин KKKKKKKK. Ефективността на доставяне на маркерен ген от носители на къс CDP, дълъг CDP и вирусен CDP е 10–100 пъти по-висока от тази на контролния CP.

Фигура 3 показва зависимостта на луциферазната активност в A172 (CXCR4+) клетки след трансфекция с къси CDP/DNA, дълги CDP/DNA и вирусни CDP/DNA комплекси в присъствието на ендозомолитичния агент глицерол. Тук използвахме комплекси, образувани при следните съотношения на заряда на носител/ДНК: 9/1, 12/1. Интактна ДНК молекула, PEI/DNA 1/8 комплекси и комплекси, съдържащи ДНК и CP пептид, служат като експериментални контроли. Ефективността на доставяне на маркерен ген от носители на къс CDP, дълъг CDP и вирусен CDP е 10 пъти по-висока от тази на контролния CP.

Резултатите на Фигура 2 и Фигура 3 подкрепят специфичността на носителите в настоящото изобретение за CXCR4 рецептора.

Фигура 4 показва зависимостта на луциферазната активност в CHO (CXCR4-) клетки след трансфекция с къси CDP/DNA, дълги CDP/DNA и вирусни CDP/DNA комплекси в присъствието на ендозомолитичния агент глицерол. Използвани са комплексите, образувани при следните зарядни съотношения носител/ДНК: 9/1, 12/1. Интактна ДНК молекула, PEI/DNA 1/8 комплекси и комплекси, съдържащи ДНК и CP пептид, служат като експериментални контроли. Ефективността на доставяне на маркерен ген чрез къси CDP, дълги CDP и вирусни CDP носители е почти същата като при използване на контролния CP.

Носителите със сигнал не са в състояние да осигурят значително по-високо ниво на доставка на генетичен материал в клетки без рецепторна експресия в сравнение с контролата.

Изпълнението на изобретението може да бъде обяснено по следния начин. Целта на настоящото изобретение е да осигури насочена доставка на генетични конструкции към клетки, експресиращи CXCR4 рецептора, използвайки носители на генетичен материал, съдържащ сигнални последователности за този рецептор.

На първия етап се извършва образуването на комплекси на едно от изпълненията на носителя с генетична конструкция, съдържаща "интересния" ген. Образуваните комплекси се използват за доставяне на генетичния материал до съответните целеви клетки. Анализът на ефективността на клетъчното проникване се оценява чрез ензимни или имунохистохимични методи.

Образуването на комплекси се извършва в изотоничен разтвор. Предпочита се безсолен буфер HBM (Hepes-буфериран манитол). Размерът на получените комплекси е 170–230 nm.

Като генетични конструкции в едно от изпълненията, използващи плазмидна ДНК.

Плазмидната ДНК съдържа маркер (luc, lacZ) или терапевтичен ген (в зависимост от заболяването), под контрола на съответните промотори и енхансери (CMV, SV40 и др.) и други елементи, необходими, например, за репликация в гостоприемника клетка или интегриране в генома. При геннотерапевтично лечение на рак могат да се използват гените за HLA-B7, IL-2, IL-4, TNF, IFN, P53, тимидин киназа и др.

В друго изпълнение, олигонуклеотиди, състоящи се от малка ДНК или РНК, комплементарна на специфична последователност в иРНК или нейния прекурсор, се използват като генетичен конструкт за потискане на синтеза на протеинов продукт или за изхвърляне на екзон, носещ мутация от иРНК. Образуваните комплекси се използват за доставяне на генетичен материал до клетки, експресиращи CXCR4 рецептора. Проникването на носещите комплекси от настоящото изобретение се осъществява предимно чрез рецептор-медииран транспорт чрез свързване към екстрацелуларните домени на CXCR4 рецептора и последващо интернализиране на рецептора.

Дозата на носителите и генетичния материал се определя индивидуално и зависи от вида на клетките, количеството CXCR4 рецептор на тяхната повърхност и сложността на трансфектиране на тези клетки.

За да се повиши ефективността на тези носители, трансфекцията на клетките за предпочитане се извършва с помощта на ендозомолитичен агент. Те включват глицерол, хлорохин и др. Тези вещества се добавят към трансфекционната среда непосредствено преди комплексите да се добавят към клетките. Те остават несвързани с комплексите и следователно не засягат тяхната структура.

Пептиди, други полимерни съединения, липозоми, способни да уплътняват нуклеинови киселини, могат да се използват като ДНК-свързваща част на носителя. В допълнение, те могат да имат ендозомолитични свойства (няма нужда да се използва допълнителен ендозомолитичен агент) и, когато е необходимо (например за доставяне на терапевтични или маркерни гени), доставят генетичен материал до ядрото.

Когато се избират условията на трансфекция, те са проектирани да осигурят най-висока ефективност на доставяне. За предпочитане е да се инкубират комплекси с клетки в продължение на 4 часа. Можете обаче да варирате това време от 3 до 6 часа. След изтичане на инкубационното време, средата се сменя и клетките се оставят за 24-48 часа (в зависимост от вида на клетката и генетичния материал) за експресия на въведените конструкции с интересния ген или проява на терапевтичния ефект. на олигонуклеотиди.

Анализът на ефективността на доставяне се извършва чрез ензимни или имунохистохимични методи, в зависимост от вида на въведената генна конструкция.

Пример 1 Образуване на комплекси ДНК/носител и изследване на процеса на комплексообразуване.

Плазмидът pCLUC4, съдържащ гена на луциферазата на светулка под контрола на цитомегаловирусния промотор, беше използван като генетичен материал за целево доставяне на гени в клетките. Използвано е едно от изпълненията на носача.

Разтвори на 1 μg ДНК в 40 μl 1X HBM буфер (5% w/v манитол, 5 mM Hepes, рН 7,5) и разтвори на носители, съответстващи на различни съотношения на заряд на ДНК/носител, се приготвят в равен обем буфер. Разтворът на носителя се добавя постепенно към епруветката Eppendorf с ДНК разтвора и се разбърква енергично в продължение на 20 секунди. Получената смес се оставя за 30 минути при стайна температура, за да завърши образуването на комплексите.

Резултатите от комплексообразуването се анализират чрез метода на изместване с етидиев бромид. Флуоресценцията на етидиев бромид се измерва с помощта на многорежимен четец за спектрално сканиране Varioscan Flash (Thermo, Финландия). Изместване на етидиев бромид се наблюдава при 590 nm (възбуждане при 544 nm) след добавяне на носител към ДНК (20 μg/ml), предварително инкубирана с интеркалиращ агент етидиев бромид (400 ng/ml). Изместването се изчислява с помощта на формулата (F-Ff)/(Fb-Ff), където Ff и Fb са интензитетите на флуоресценция на етидиев бромид съответно в отсъствие и присъствие на ДНК.Резултатите са показани на ФИГ.

Пример 2 Провеждане на in vitro трансфекция.

HeLa, A172 и CHO клетки се поставят в културни плаки с 48 ямки (Nunc) 24 часа преди трансфекцията при 50 000 клетки на ямка, съдържаща 500 µl от стандартна културална смес, състояща се от DMEM културална среда (GIBCO), 10% фетален говежди серум (GIBCO), 2 mM глутамин, допълнен с пеницилин (50 U/ml), стрептомицин (50 ug/ml) и 1 mM натриев пируват. Суспензията на комплексите се приготвя съгласно метода, описан в пример 1 при скорост от 2 μg ДНК на ямка на културалната плака. 10 минути преди добавянето на суспензията от комплекси ДНК/носител, клетките се промиват няколко пъти с DMEM и към всяка ямка се добавят 500 ul среда, съдържаща 15% глицерол и 1.5% етанол. Трансфекцията се извършва чрез добавяне на суспензия от комплекси ДНК/носител към средата. След направата на комплексите, плаките с клетките се поставят в термостат с температура 37°C и 5% CO 2 за 4 часа. След времето на инкубация, клетките се промиват с DMEM среда и към всяка ямка се добавят 500 ul от стандартната културална смес. Културалната плака се инкубира в термостат при температура 37°С и 5% СО2 за 48 часа, след което се открива експресията на маркерния ген.

Пример 3 Откриване на експресия на луциферазен ген след трансфекция in vitro.

Средата се отстранява от културалните плаки, клетките се промиват в 1x PBS (рН 7.2). 80 μl лизисен буфер (25 М Gly-Gly, 15 mM MgS04, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF; рН 7.8) се добавя към всяка ямка. 50 μl лизат се прехвърлят в полистиренови плаки с непрозрачни стени за измерване на луциферазната активност. Измерването беше извършено с помощта на спектрално сканиращ многорежимен четец Varioscan Flash (Thermo, Финландия). Измерването беше извършено с помощта на разтвор на луциферазна флаш микс (20 mM Tricine, 1.07 mM (MgCO 3) 4 Mg(OH) 2 × 5 H 2 O, 2.67 mM MgSO 4 , 0,1 mM EDTA, 33.3 mM DTT, 530 μM ATP , 270 μM ацетил коензим А, 470 μM луциферин). Всяко измерване се извършва за 10 секунди. Показанията на инструмента бяха получени в относителни светлинни единици (RLU). Резултатите от експеримента бяха оценени в относителни светлинни единици за 1 mg общ протеин от клетъчни екстракти в ямката на културалната плака. Общото количество протеин във всяка ямка се измерва с помощта на комплект за анализ на протеин (Bio-Rad), спрямо стандартна крива за говежди серумен албумин. Резултатите са представени на фигури 2, 3, 4.