В зависимост от техниката на приготвяне клетъчните култури се класифицират на:

- един слой– клетките могат да се прикрепят и да се размножават върху повърхността на химически неутрално стъкло или пластмаса.

- окачване- клетките се размножават в целия обем на хранителната среда при разбъркване.

- орган- цели части от органи и тъкани, които запазват оригиналната си структура извън тялото (ограничена употреба).

Най-разпространени са еднослойни клетъчни култури, който могат да бъдат разделени в зависимост от броя на жизнеспособните поколения на

1) първичен (предимно трипсинизиран),

2) полутрансплантируеми (диплоидни)

3) трансплантируеми.

Произходте се класифицират на ембрионални, неопластични и от възрастни организми.

По морфогенеза- върху фибробластни, епителни и др.

Първиченклетъчните култури са клетки от всяка човешка или животинска тъкан, които имат способността да растат като монослой върху пластмасова или стъклена повърхност, покрита със специална хранителна среда. Продължителността на живота на такива култури е ограничена. Във всеки случай те се получават от тъканта след механично смилане, обработка с протеолитични ензими и стандартизиране на броя на клетките. Първичните култури, получени от бъбреци на маймуни, бъбреци на човешки ембриони, човешки амнион, пилешки ембриони се използват широко за изолиране и натрупване на вируси, както и за производството на вирусни ваксини.

полутрансплантируеми(или диплоиден ) клетъчни култури - клетки от същия тип, способни да издържат до 50-100 пасажа in vitro, като същевременно запазват своя оригинален диплоиден набор от хромозоми. Диплоидни щамове на човешки ембрионални фибробласти се използват както за диагностика на вирусни инфекции, така и при производството на вирусни ваксини. Най-често използваните култури са човешки ембрионални фибробласти (WI-38, MRC-5, IMR-9), крави, свине, овце и др.

трансплантиранклетъчните линии се характеризират с потенциално безсмъртие и хетерплоиден кариотип. Първичните клетъчни култури могат да бъдат източник на непрекъснати линии(например SOC - сърцето на маймуна cinamobus, PES - бъбреците на ембрион на прасе, VNK-21 - от бъбреците на еднодневни сирийски хамстери; PMS - от бъбрек на морско свинче, Vero - бъбрек на зелена маймуна и др.), чиито отделни клетки показват склонност към безкрайно размножаване in vitro. Наборът от промени, водещи до появата на такива характеристики от клетките, се нарича трансформация, а клетките на трансплантирани тъканни култури се наричат ​​трансформирани. Друг източник на трансплантируеми клетъчни линии са злокачествени новообразувания. В този случай клетъчната трансформация се извършва in vivo. Във вирусологичната практика най-често се използват следните линии трансплантирани клетки: HeLa - получени от цервикален карцином; Ner-2 - от карцином на ларинкса; Детройт-6 - от метастази на рак на белия дроб до костния мозък; RH - от човешки бъбрек, KB - карцином на устната кухина, RD - човешки рабдомиосарком.

Органни култури- са срезове от животински органи, приготвени при стерилни условия, които за определен период (дни, седмици) запазват жизнената си активност в специални условия на култивиране

Клетъчни култури -това са генетично хомогенни популации от клетки, растящи в постоянни условия на околната среда. Това могат да бъдат щамове на нормални човешки, животински, растителни или злокачествени туморни клетки.

Условия на отглеждане

Клетките обикновено се поставят в стъклени буркани, откъдето идва и името in vitro изследване (от лат. In - в, vitro - стъкло), въпреки че културите вече по-често се отглеждат в пластмасови съдове. Клетките, изолирани от тъкани, се инкубират при температура от 38 ° C 39 ° C (за животински и човешки клетки) и при 22 ° C 28 ° C (за растителни клетки) в хранителна среда с подходящ състав. След това клетките растат като суспензия или монослой. Суспензионната култура е култивиране на отделни клетки или малки групи от тях в суспензия в течна хранителна среда с помощта на оборудване, което им осигурява аериране и смесване. Характерна особеност на суспензионните култури е тяхната морфологична и биохимична хетерогенност. Клетъчната популация съдържа клетки, които се различават по размер и форма.

Приложение

Приложение в цитологията

В цитологията този метод е удобен, тъй като клетките в култура са лесно достъпни за различни биохимични манипулации. При работа с тях могат да се внасят радиоактивни вещества, отрови, хормони и др. в правилната концентрация за необходимото време. Количеството на тези вещества може да бъде с порядък по-малко, отколкото при опити с животни. Няма опасност субстанцията да се метаболизира от черния дроб, да се отдели от бъбреците или да се отложи в мускулите. Това осигурява реални стойности на скоростта на действие на веществото върху клетката или неговото усвояване от клетката.

За изследване на живи растителни клетки се използва култура от изолирани протопласти. Изолираните протопласти могат да бъдат определени като "голи" растителни клетки, тъй като клетъчната стена се отстранява механично или ензимно. Системата от изолирани протопласти позволява да се извършва селекция на клетъчно ниво, да се работи в малък обем с голям брой отделни клетки, да се получават нови форми на растения чрез директен генен трансфер и да се получават соматични хибриди между систематично отдалечени видове. Тъй като в изолираните протопласти веднага започва регенерация на клетъчната мембрана, те са удобен обект за изследване на образуването на целулозни микрофибрили.

Приложение във вирусологията

Във вирусологията клетъчните култури се използват много широко, тъй като с тях се работи относително лесно в лаборатория, за разлика от други методи - отглеждане на вируси върху пилешки ембриони или в живи животни. В допълнение, цитопатичният ефект на вирусите може да бъде добре проучен върху монослой на клетъчна култура, чрез образуване на вътреклетъчни включвания, плаки, в реакции на хемадсорбция и хемаглутинация и чрез разпадане на цвета. При работа с клетъчни култури могат да се получат значителни резултати при работа с малък брой култури. Експерименти, които изискват стотици или хиляди лабораторни животни, за да потвърдят този или онзи факт, могат да бъдат извършени с еднаква статистическа сигурност върху същия брой клетъчни култури. По този начин не е необходимо лабораторията да поддържа вивариум и няма етични аспекти при боравене с болни животни.

Изследва се и трансформация на клетки от вируси, чийто механизъм е подобен на този при злокачествените тумори.

Приложение във фармакологията

Клетъчните култури се използват широко за тестване на ефектите на вещества, които могат да се използват като лекарства. Въпреки факта, че резултатите, получени върху клетъчни култури, не могат да бъдат екстраполирани към целия организъм, няма съмнение, че ако дадено вещество наруши активността на клетки от няколко различни културни линии, тогава трябва да се очаква и отрицателен ефект, когато това вещество е въведени в тялото.

Приложение в биотехнологиите

Специфичните клетъчни култури са ценен източник на хормони и други биологично активни вещества. Вече се използват за производството на антивирусния протеин интерферон.

Приложение в генетиката

В генетиката способността на клетките да растат в култура се използва в следните области:

• Клониране
• Клетъчно съхранение
• Получаване на мутантни клетки и работа с тях

Видове клетъчни култури

1. Първична трипсинизация - получава се от натрошени човешки и животински тъкани чрез третирането им с трипсин или други ензими. Издържат само на 5-10 деления (пасажи).

2. трансплантируеми - клетки, които са придобили способност за неограничено размножаване, тъй като са производни на човешки и животински тумори.

3. Питеен респлит (диплоиден) - може да издържи до 100 пасажа, като същевременно поддържа оригиналния диплоиден набор от хромозоми.

Най-често срещаните клетъчни линии

клетъчна линия	Обяснение на съкращението	организъм	Текстил	Морфология	Бележки и връзки
293-Т		човек	бъбрек (ембрионален)		Извлечено от HEK-293 ECACC
3Т3 клетки	"3-дневен трансфер, инокулум 3 x 105 клетки"	мишка	ембрионални фибробласти		Известен също като NIH 3T3 ECACC
721		човек	меланом
9л		плъх	глиобластом
A2780		човек	яйчник	рак на яйчниците	ECACC
A2780ADR		човек	яйчник	A2780 производно с резистентност към адриамицин	ECACC
A2780cis		човек	яйчник	цисплатин-резистентно производно на А2780	ECACC
A172		човек	глиобластом	злокачествен глиом	ECACC
A431		човек	кожен епител	плоскоклетъчен карцином	ECACCCell Line Data Base
А-549		човек	белодробен карцином	епител	DSMZECACC
B35		плъх	невробластом		ATCC
ГКП-1		човек	периферни левкоцити	ХИВ + лимфом	ATCC
BEAS-2B	бронхиален епител + хибрид на аденовирус 12-SV40 вирус (Ad12SV40)	човек	бели дробове	епител	ATCC
bEnd.3	мозъчен ендотел	мишка	кора	ендотел	ATCC
BHK-21	„Бъбрек на бебе хамстер“	хамстер	пъпка	фибробласти	ECACCOlympus
BR 293		човек	гърди	рак
BxPC3	Ксенография на биопсия на карцином на панкреаса линия 3	човек	аденокарцином на панкреаса	епител	ATCC
C3H-10T1/2		мишка	ембрионални мезенхимни клетки		ECACC
C6/36		комар	ларвни тъкани		ECACC
CHO	Яйчник на китайски хамстер	Cricetulus griseus	яйчник	епител	ECACCICLC
COR-L23		човек	бели дробове		ECACC
COR-L23/CPR		човек	бели дробове		ECACC
COR-L23/5010		човек	бели дробове		ECACC
COR-L23 / R23		човек	бели дробове	епител	ECACC
COS-7	Cercopithecus aethiops, дефектен произход SV-40	маймуна Cercopithecus aethiops	пъпка	фибробласти	ECACCATCC
ХМЛ Т1	Хронична миелоидна левкемия Т-лимфоцит 1	човек	хронична миелоидна левкемия	Т-клетъчна левкемия	Кръв
CMT	кучешки тумор на млечната жлеза	куче	гърди	епител
D17		куче	остеосаркома		ECACC
DH82		куче	хистиоцитоза	моноцити/макрофаги	ECACC
DU145		човек	карцином	простатата
DuCaP	Рак на твърдата мозъчна обвивка на простатата	човек		епител	11317521
EL4		мишка		Т-клетъчна левкемия	ECACC
EMT6/AR1		мишка	гърди	епител	ECACC
EMT6/AR10.0		мишка	гърди	епител	ECACC
FM3		човек	метастази в лимфен възел	меланом
H1299		човек	бели дробове	рак
H69		човек	бели дробове		ECACC
HB54		хибридома	хибридома	секретира L243 mAb (срещу HLA-DR)	Човешка имунология
HB55		хибридома	хибридома	секретира MA2.1 mAb (срещу HLA-A2 и HLA-B17)	Вестник по имунология
HCA2		човек	фибробласти		Вестник по обща вирусология
HEK-293	човешки ембрионален бъбрек	човек	бъбрек (ембрионален)	епител	ATCC
ХеЛа	Хенриета Лакс	човек	рак на маточната шийка	епител	DSMZECACC
Hepa1c1c7	клон 7 на клон 1 хепатомна линия 1	мишка	хепатом	епител	ECACC
HL-60	човешка левкемия	човек	миелобласти	кръвни клетки	ECACCDSMZ
HMEC	човешка млечна епителна клетка	човек		епител	ECACC
HT-29		човек	епител на дебелото черво	аденокарцином	ECACC База данни за клетъчни линии
Юркат		човек	Т-клетъчна левкемия	бели кръвни телца	ECACC
JY		човек	лимфобласти	В клетки, обезсмъртяване на EBV
K562		човек	лимфобласти		ECACC
Ku812		човек	лимфобласти	еритролевкемия	ECACC
KCL22		човек	лимфобласти	хронична миелоидна левкемия
KYO1	Киото 1	човек	лимфобласти	хронична миелоидна левкемия	DSMZ
LNCap	Рак на лимфните възли на простатата	човек	аденокарцином на простатата	епител	ECACCATCC
Ма-мел 1, 2, 3….48		човек		меланомни клетъчни линии
MC-38		мишка		аденокарцином
MCF-7	Фондация за рак на Мичиган-7	човек	гърди	инвазивен дуктален карцином на гърдата	ER+, PR+
MCF-10A	Фондация за борба с рака в Мичиган	човек	гърди	епител	ATCC
MDA-MB-231		човек	гърди	рак	ECACC
MDA-MB-468	MD Anderson-Метастатична гърда	човек	гърди	рак	ECACC
MDA-MB-435	MD Anderson-Метастатична гърда	човек	гърди	меланом или карцином (няма консенсус)	Патология на Кеймбридж ECACC
MDCK II	Кучешки бъбрек на Мадин Дарби	куче	пъпка	епител	ECACC ATCC
MOR/0,2R		човек	бели дробове		ECACC
NCI-H69/CPR		човек	бели дробове		ECACC
NCI-H69 / LX10		човек	бели дробове		ECACC
NCI-H69 / LX20		човек	бели дробове		ECACC
NCI-H69/LX4		човек	бели дробове		ECACC
NIH-3T3	Национални институти по здравеопазване, 3-дневен трансфер, инокулум 3 x 10 May клетки	мишка	ембрион	фибробласти	ECACCATCC
NALM-1			периферна кръв	хронична миелоидна левкемия	Ракова генетика и цитогенетика
NW-145				меланом	ESTDAB
OPCN/OPCT	Onyvax Рак на простатата....			клетъчни линии на рак на простатата	Астеранд
връстник		човек	Т-клетъчна левкемия		DSMZ
PNT-1A / PNT 2				клетъчни линии на рак на простатата	ECACC
RenCa	Бъбречен карцином	мишка		бъбречен карцином
RIN-5F		мишка	панкреас
RMA/RMAS		мишка		Т-клетъчен рак
Саос-2		човек		остеосаркома	ECACC
Sf-9	Spodoptera frugiperda	пеперуда Spodoptera frugiperda	яйчник		DSMZECACC
SkBr3		човек		карцином на гърдата
Т2		човек		Хибридома на В клетки и Т-клетъчна левкемия	DSMZ
Т-47Д		човек	гърди	канален карцином
T84		човек	карцином на дебелото черво/белодробни метастази	епител	ECACCATCC
THP1		човек	моноцити	остра миелоидна левкемия	ECACC
U373		човек	глиобластом-астроцитом	епител
U87		човек	глиобластом-астроцитом	епител	Abcam
U937		човек	левкемичен моноцитен лимфом		ECACC
VCaP	Прешлен Рак на простатата	човек	метастатичен рак на простатата	епител	ECACC ATCC
Веро	"Вера Рено" / "Веро" ("истина")	африканска зелена маймуна	бъбречен епител		ECACC
WM39		човек	Кожа	първичен меланом
WT-49		човек	лимфобласти
X63		мишка	меланом
YAC-1		мишка	лимфом		База данни за клетъчни линии ECACC
YAR		човек	В-лимфоцити	трансформиран EBV	Човешка имунология

Изпратете добрата си работа в базата знания е лесно. Използвайте формата по-долу

Студенти, докторанти, млади учени, които използват базата от знания в обучението и работата си, ще ви бъдат много благодарни.

публикувано на http://www.allbest.ru/

клетъчна вирусна култура

Въведение

1. Видове клетъчни култури

2. Хранителни среди

4.1 Откриване на вируси

Библиография

Въведение

За количественото натрупване на вируси клетъчните култури са най-удобната система. Първите опити за култивиране на животински клетки извън тялото датират от края на миналия век. Тези фрагментарни наблюдения показват възможността за запазване жизнеспособността на тъканите и клетките при изкуствени условия и отбелязват началото на задълбочени научни изследвания върху тъканните култури.

Голяма заслуга в разработването на методи за култивиране на тъкани принадлежи на Карел, който пръв доказва възможността за възпроизвеждане на животински клетки в изкуствени условия и по този начин демонстрира тяхното "безсмъртие" и сходство с едноклетъчните свободно живеещи организми. Значителен напредък в тази посока е постигнат от група изследователи, ръководени от Ърл. Те бяха първите, които успяха да постигнат растеж на голям брой клетки върху стъкло и в течна разбърквана суспензия. Появата на антибиотиците и напредъкът в изкуствените културни среди поставиха началото на нова ера в развитието на техниките за тъканни култури.

Тъканните култури отдавна се използват за решаване на различни проблеми в биологията и медицината. Но само успехите в областта на вирусологията, постигнати с помощта на тъканни култури, бяха мощен стимул за тяхното развитие до сегашното ниво.

Култивирането на вируси помага за решаването на редица теоретични проблеми, свързани с изучаването на особеностите на взаимодействието "вирус-клетка". В допълнение, решаването на редица приложни проблеми, свързани с диагностиката и производството на лекарства за профилактика на вирусни инфекции, е невъзможно без натрупване на вирусосъдържащи суровини.

1. Видове клетъчни култури

Прехвърлянето на клетките на цял организъм в условията на живот in vitro прекратява тяхното съществуване като един от многобройните структурни елементи на тъканта или органа, в които са били включени преди това. В същото време клетките излизат извън контрола на неврохуморалните фактори и придобиват редица характеристики, които зависят както от самия факт на отхвърляне на клетките от тези тъкани, така и от специфичните условия на тяхното съществуване in vitro.

Клетките или тъканите, живеещи извън тялото, се характеризират с цял комплекс от метаболитни, морфологични и генетични характеристики, които са рязко различни от свойствата на клетките на органите и тъканите in vivo.

Различават се няколко типа оцелели и растящи тъканни и клетъчни култури в зависимост от метода на първична експлантация на тъканта и техниката на нейното култивиране. Най-широко се използват еднослойни и суспензионни култури от растящи клетки. Те са в основата на съвременната лабораторна и индустриална вирусологична практика.

Има два основни вида еднослойни клетъчни култури: първични и трансплантирани.

Терминът "първичен" се отнася до клетъчна култура, получена директно от човешки или животински тъкани в ембрионалния или постнатален период. Продължителността на живота на такива култури е ограничена. След известно време при тях се появяват явления на неспецифична дегенерация, изразяваща се в гранулация и вакуолизация на цитоплазмата, закръгляване на клетките, загуба на комуникация между клетките и твърдия субстрат, върху който са отгледани. Периодичната смяна на средата, промените в състава на последната и други процедури могат само леко да увеличат живота на първичната клетъчна култура, но не могат да предотвратят нейното окончателно унищожаване и смърт. По всяка вероятност този процес е свързан с естественото изчезване на метаболитната активност на клетките, които са извън контрола на неврохуморалните фактори, действащи в целия организъм.

Само отделни клетки или групи от клетки в популацията на фона на дегенерация на по-голямата част от клетъчния слой могат да запазят способността си да растат и да се възпроизвеждат. Тези клетки, след като са открили силата на безкрайното възпроизвеждане in vitro, пораждат трансплантирани клетъчни култури след многократни инокулации.

Има линии и щамове трансплантирани клетки. Първият термин се отнася до трансплантируеми клетки, характеризиращи се с потенциално безсмъртие и, като правило, хетерплоиден кариотип; вторият термин се отнася до полутрансплантируеми клетки с диплоиден набор от хромозоми и ограничена продължителност на живота in vitro. Появата на тези и други клетки е свързана с процеса на селекция в клетъчната популация на първичните култури, които по този начин са източник на всички линии и щамове на трансплантирани клетки.

Основното предимство на трансплантируемите клетъчни линии, в сравнение с всяка първична култура, е потенциалът за неограничено възпроизвеждане извън тялото и относителната автономност, която ги доближава до бактериите и едноклетъчните протозои.

Способността на трансплантираните клетки да се възпроизвеждат безкрайно in vitro бележи качествен скок, в резултат на който клетките придобиват способност за автономно съществуване, подобно на микроорганизмите, отглеждани върху изкуствени хранителни среди. Съвкупността от промени, водещи до появата на такива характеристики в клетките, се нарича трансформация, а клетките на трансплантирани тъканни култури се наричат ​​трансформирани.

Подобренията в техниките за клетъчни култури значително разшириха възможностите за получаване на трансплантируеми клетъчни линии от голямо разнообразие от животински и човешки тъкани. В същото време не е открита възрастова граница, над която тъканите биха загубили способността си да се адаптират към неограничен растеж in vitro, т.е. към трансформация.

Друг източник на трансплантирани клетъчни линии са злокачествените неоплазми. В този случай клетъчната трансформация се случва in vivo в резултат на развитието на патологичен процес, чиято етиология остава до голяма степен неясна.

Не всички злокачествени новообразувания са способни да дадат началото на трансплантируеми клетъчни култури. Така например бяха направени неуспешни опити за получаване на трансплантируеми клетки от ракови тумори на човешкия стомах и млечните жлези. Трудно е да се адаптират към живота in vitro клетки от плоскоклетъчен карцином на кожата и лигавиците. От друга страна, линиите се извличат относително лесно от тъканите на саркоми и злокачествени тумори на нервната система.

2. Хранителни среди

Във всяка клетъчна култура има клетъчна и течна фаза. Течната фаза осигурява жизнената активност на клетките на културата и е хранителна среда с различен състав и свойства.

Всички медии според тяхното предназначение са разделени на растеж и подкрепа. Съставът на растежната среда трябва да съдържа повече хранителни вещества, за да се осигури активно размножаване на клетки за образуване на монослой върху стъклената повърхност или достатъчно висока концентрация на клетъчни елементи в суспензия (при получаване на суспензионни култури). Всъщност поддържащата среда трябва да осигури само оцеляването на клетките във вече образуван монослой по време на възпроизвеждането на вирусни агенти в клетките.

Средите за растеж и поддържане са многокомпонентни. Те могат да включват както природни продукти (амниотична течност, животински серуми), така и субстрати, получени в резултат на частична обработка на природни продукти (ембрионални екстракти, лакталбумин хидролизат, хемохидролизат, аминопептид и др.), Както и синтетични химически чисти вещества (амино киселини, витамини, соли).

Като пример за хранителна среда, състояща се изцяло от естествени компоненти, може да се посочи средата на Buckley, предложена за отглеждане на клетъчни култури от бъбречен епител на маймуни. Тази среда включва амниотична течност от говеда (85%), конски серум (10%) и екстракт от говежди плод (5%).

Всички природни продукти са с нисък стандарт, употребата им е свързана с голяма опасност от микробно и вирусно замърсяване на клетъчните култури. В тази връзка те постепенно се заменят със синтетични стандартни смеси. Най-голямо приложение намират синтетичната среда 199 и иглата. Широко приложение намират среди, съдържащи строго определени количества соли, аминокиселини и витамини.

Независимо от предназначението, всички среди за тъканни култури са проектирани с някакъв балансиран солев разтвор с адекватен буферен капацитет. Най-често това са решения на Ханкс и Ърл. Тези разтвори са основен компонент на всяка хранителна среда. Неразделен компонент на повечето растежни среди е животински серум (телешки, говежди, конски), без присъствието на 5--10% от който не се осъществява клетъчна репродукция и образуване на монослой.

Включването на серум в същото време предотвратява създаването на хранителна среда с точен химичен състав, които са много важни за развитието на фундаменталните изследвания в клетъчната физиология, тъй като заедно със серума (или неговите производни) се въвежда цял комплекс от неконтролируеми фактори , които варират в зависимост от серията серум.

През 50-те години Ewans и Waymouth предложиха среда без серум с точен химичен състав. Въпреки това, тези среди не осигуряват онези показатели за клетъчна пролиферативна активност, които определят среди с добавяне на серуми. В това отношение интерес представлява работата на Бърч и Пирт, които показаха, че включването на сулфатни соли на Fe, Zn, Cu, а също и MnC1 2 е решаващо за осигуряване на интензивен клетъчен растеж в среди без серум.

Антибиотиците се добавят към хранителната среда, както и към буферния разтвор за измиване на тъканите. Те се въвеждат в средата непосредствено преди употреба в размер на 1 ml изходен разтвор на антибиотици на 500 ml среда.

По-долу е представен съставът и методът на приготвяне на една от обикновените хранителни среди.

Сряда Игла

l-аргинин - 17,4

л-цистин - 4,8

l-хистидин - 3.1

l-изолевцин - 26.2

л-левция - 13.1

л-лизин - 14.6

л-метионин - 7,5

l-фенилаланин - 8.3

l-треонин - 11,9

l-триптофан - 2.0

l-тирозин - 18.1

l-валин - 11.7

биотин - 0,24

холин - 0,12

холин хлорид - 0,14

витамин B 12 (птероилглутаминова киселина) - 0,44

никотинамид - 0,12

пантотенова киселина - 0,22

калциев пантотенат - 0,48

пиридоксал (пиридоксин хидрохлорид) - 0,20

тиамин хидрохлорид - 0,34

рибофлавин - 0,04

натриев хлорид - 5850.0

калиев хлорид - 373.0

монозаместен натриев фосфат (NaH 2 PO 4. H 2 O) - 138.0

калциев хлорид - 111.0

натриев бикарбонат (NaHCO3) - 1680.0

магнезиев хлорид (MgCl 2.6H 2 O) - 102.0

глюкоза - 900,0

l-глутамин - 146.2--292.3

пеницилин - 50,0

стрептомицин - 50.0

фенолно червено - 5.0

вода до 1000,0

готвене.

Разтвор 1. В 500 ml вода, загрята до приблизително 80 °, горните количества аминокиселини се разтварят при разбъркване, след което се добавят l-глутамин и фенолово червено.

Разтвор 2. В 100,0 ml вода разтворете неорганичните соли, с изключение на натриев бикарбонат (NaHCO 3 ), смесете с предишния разтвор на неорганични соли и добавете биотин и витамин B 12 .

Разтвор 3. Всички витамини се разтварят в 200,0 ml вода, с изключение на биотин и птеро-илглутаминова киселина и антибиотици - пеницилин и стрептомицин. Всички разтвори се стерилизират чрез филтриране през стъклен всмукателен филтър (плоча от поресто стъкло, размер на порите 0,7--1,5) или през плочи от азбестоцелулоза Seitz след предварително измиване с вода и след това с приготвения разтвор.

Смесват се 500 ml от разтвор 1 + 200 ml от разтвор 2 + 200 ml от разтвор 3 и се разреждат до 1000,0 ml със стерилна вода. Можете да добавите 1 mg инозитол на 1 литър.

3. Получаване на клетъчни култури

3.1 Приготвяне на първични клетъчни култури

Първична - нарича се култура, получена от тъкан и отгледана in vitro преди началото на субкултивирането, т.е. преди първата култура. Първичната култура е лишена от много от клетките, присъстващи в оригиналната тъкан, тъй като не всички клетки са в състояние да се придържат към субстрата и да оцелеят in vitro. В процеса на култивиране на клетки културата е относително изчерпана от неделящи се или бавно делящи се клетки.

На първия етап от получаването на първична култура се извършва стерилно отстраняване на тъканен фрагмент, животински орган и неговата механична или ензимна дезагрегация. Тъканта се натрошава на парчета с обем до 1-3 мм, парчетата тъкан се измиват от еритроцитите с разтвор на Ханк с антибиотици. Трипсин (0,25% суров или 0,01-0,05% пречистен) или колагеназа (200-2000 единици/ml, суров) и други протеолитични ензими се използват за тъканна дезагрегация. Този метод за получаване на култура осигурява висок добив на клетки.

Първичните култури могат да бъдат получени и от 1 mm парчета тъкан, които прилепват към повърхността на субстрата поради тяхната собствена адхезивност или наличието на вдлъбнатини върху съда, или чрез използване на плазмен съсирек. В тези случаи клетките ще растат от фрагменти. Клетки, мигриращи от експланти, могат да се използват за преминаване. Тъканните фрагменти (експланти) се прехвърлят в нови плаки, мигриращите клетки могат да бъдат отстранени чрез субкултивиране, смес от версен и трипсин, а останалите експланти ще образуват нови израстъци.

Известни са такива първични култури като култура на фибробласти от пилешки ембриони, клетъчна култура от телешки бъбрек и левкоцити.

3.2 Получаване на монослойни непрекъснати клетъчни култури

Както е отбелязано по-горе, един от методите за получаване на трансплантируеми клетъчни линии е селекцията на клетки с повишена активност на растеж и възпроизводство от популацията на първични култури. Селекцията може да се извърши чрез редовна смяна на средата, промиване на монослоя на първичната трипсинизирана клетъчна култура. За целта се избират матраци с добре оформен клетъчен монослой (самите матраци трябва да имат плоско дъно и да нямат драскотини и тъпи петна по стените). Средата за растеж, приготвена за системна промяна, се излива в малки съдове (за да се изключи бактериално замърсяване) и се съхранява при t - 4 °.

Средата се сменя редовно, поне веднъж седмично. През първите 3 седмици се подменя 20-30% от обема на хранителната среда, през следващите 3-4 седмици - 50-60%, по-късно се извършва пълна смяна на средата. Свежата среда непосредствено преди работа се загрява до t - 37 °.

Тъй като средата се променя, клетките променят своята морфология. Някои от клетките са заоблени и падат от стъклото. Повечето от клетките се свиват към центъра и монослоят придобива звездовиден вид. Самите клетки са леко удължени. След 7-10 промени в средата в матраците, като правило, започват да се появяват нови клетъчни елементи, които в различните култури имат различна морфология.

В културата на бъбречните клетки на пилешки ембриони се появяват закръглени клетъчни елементи в центъра на монослоя или между неговите свити области, от които постепенно се образуват клъстери под формата на малки колонии. В културата на клетки от бъбрек на маймуна се появяват единични образувания, наподобяващи зърна. Клетките са плътно прилепнали една към друга, образувайки малки прозрачни колонии. Броят на такива клетки се увеличава бавно, размерът на колониите също почти не се увеличава. Колониите се появяват не само на дъното на матрака, но и на страничните повърхности, на границата на хранителната среда. Следователно задължително условие за смяна на хранителната среда е поддържането на нейния постоянен обем. В културата на човешки ембрионални бъбречни клетки на фона на масова дегенерация на монослоя, стеснен в нишки, се разкриват големи полигонални клетки с дълги процеси.

Атипичните клетъчни елементи, които са възникнали по време на процеса на селекция, трябва да бъдат отделени от останалата част от монослоя и прехвърлени в отделни епруветки или дюшеци. За това може да се използва методът на версенизация или механично разцепване на атипични клетки с помощта на бактериологична бримка или шпатула. Последният метод е особено необходим при работа с клетъчна култура от бъбреци на маймуни, където колониите от атипични клетки са плътно прикрепени към стъклото и не се отделят сами от него.

При смяна на хранителната среда в случай на поява на атипични клетки се препоръчва внимателно да се отстрани по-голямата част от растежната среда и с по-малка част енергично да се изплакне монослоят и да се излее тази среда в епруветки. В този случай в средата могат да се появят атипични клетки, които имат способността да образуват колонии, подходящи за следващи субкултури.

След прехвърляне на културата от атипични клетки в нова чиния, препоръчително е да продължите да наблюдавате основната култура, тъй като процесът на отглеждане на нова клетъчна линия е много сложен и не винаги избраните атипични елементи водят до жизнеспособна линия от трансплантирани клетки . Необходимо е цялата работа по получаване на нови клетъчни линии, която продължава много месеци, да се извършва с едни и същи хранителни среди, животински серуми и серии от антибиотици.

Известни са първични култури като клетъчна култура от бъбрек на златен хамстер (BHK), клетъчна култура от бъбрек на сибирски планински козирог (PSGC), клетъчна култура от бъбрек на зелена маймуна (CV).

3.3 Ролкови клетъчни култури

Доскоро тъканните култури се използваха във вирусологията главно под формата на еднослойни стационарни култури. В много случаи този метод на клетъчна култура е незаменим. Дългогодишният опит показва, че при използването на еднослойни стационарни култури се срещат редица трудности, свързани с огромни разходи за работно време и материали. От тази гледна точка по-изгодни са ролковите култури, които са икономични, характеризиращи се с оптимално съотношение на полезната площ на култивиране към обема на хранителната среда и отварят благоприятни възможности за натрупване на клетъчна маса.

Терминът "ролкова култура" се отнася до метод на култура, при който клетъчен монослой е разположен върху цялата цилиндрична повърхност на хоризонтално въртящи се съдове и периодично се промива с хранителна среда. Поради определени причини определен брой клетки могат в някои случаи да бъдат претеглени в хранителната среда. В това изпълнение клетъчната култура се нарича ролкова суспензия. "Добивът" на клетъчната култура ще бъде по-голям, колкото по-голяма е площта, от която се събират клетките. Изследователите са използвали различни начини за увеличаване на повърхността, върху която клетките могат да се прикрепят и размножават. За целта са използвани различни основи с голяма специфична повърхност: твърди, гъбести, вълнени, колагенови, върху стъклени спирали и др. Тези методи не са широко използвани, тъй като правят манипулациите с клетките много по-трудни, но трябва трябва да се отбележи описаният от L. S. Ratner и V. A. Krikun метод на многослойно култивиране. Клетките се култивират в бутилки от 1,5, 10 и 15 литра, напълно заредени с овални стъклени тръби, успоредни на надлъжната ос на съдовете. В този случай полезната площ се увеличава в сравнение със стационарни еднослойни култури в съдове със същия обем с 20 пъти. Култивирането се проведе на 2 етапа. На първия етап бутилките се въртят около хоризонтална ос, за да се разпределят равномерно клетките. Впоследствие, когато клетките бяха прикрепени към стъклото, култивирането продължи в стационарно положение. Описаната система за култивиране е успешно използвана за култивиране на шап.

По-ефективно се оказва въртенето на съдовете, в които се размножават клетките. Първоначално клетките се отглеждат в епруветки, но с развитието на техническото оборудване обемът на съдовете за култури се увеличава и изследователите преминават от отглеждане на клетки във въртящи се епруветки към въртящи се бутилки. Ролерните култури започват да се използват както за натрупване на клетки, така и за размножаване на вируси.

За ролкова култивация се използват специални стелажи и етажни апарати за въртящи се бутилки или барабани. Най-често за отглеждане се използват бутилки от 0,5--3 литра. При производствени условия техният обем може да достигне 20 литра или повече. Апаратите за ролкова култура са прости, надеждни и лесни за поддръжка. От голямо значение е скоростта на въртене на бутилките. Тя не трябва да бъде твърде висока, за да не се попречи на прикрепването на клетките, но и не много ниска, тъй като продължителното излагане на клетките на газовата фаза влошава хранителните им условия. В произведенията на различни автори скоростта на въртене на бутилките варира от 8–12 rpm до 1 rpm. Най-подходяща за различни клетъчни култури е скоростта на въртене на флаконите в диапазона 0,5--1 rpm. Препоръчва се през първите 30 минути. след посяване на клетките, осигурете висока скорост на въртене на флаконите (0,5–1,0 rpm) за равномерно разпределение на материалите, след което ги прехвърлете на ниска скорост на въртене (20–30 rpm).

Концентрацията на семена в 1 ml от средата е 60-80 хиляди за SPEV, VNK-21, HeLa, L клетки, 100-200 хиляди за диплоидни клетки и 200-300 хиляди за първични култури.Обемът на растежната среда трябва да бъде 1/10, 1/20 от обема на ролкова бутилка. Ролковият метод на култивиране ви позволява да получите по-голям брой клетки. Така от флакон с вместимост 3 l е възможно да се получи реколта от HeLa клетки 8 пъти, VNK-21 - 9 пъти, AO - 11 пъти по-голяма, отколкото при монослойна стационарна култура на флакон с вместимост 1л. Множеството спестявания на медии при използване на 3-литрови флакони е 2,8 за HeLa клетки; ВНК-21 - 5,0, АО - 4,0. Способността да растат и да се възпроизвеждат при ролкови условия се притежава от субкултури, трансплантирани култури и по-рядко първични, както и диплоидни клетъчни щамове. За по-добро възпроизвеждане на клетки в ролкови устройства е необходимо да се адаптират към новите условия на култивиране. Методът на ролерната култура позволява получаването на голям брой клетки. Предимството на ролковите култури в сравнение с традиционните стационарни култури е по-специално по-икономичното използване на хранителни среди и по-висок добив на вирусен антиген (с 1-2 lg).

3.4 Суспензионна клетъчна култура

През 1953 г. Оуенс и сътрудници за първи път демонстрират способността на клетките да се размножават в течна среда в свободно суспендирано състояние. Оттогава методът на суспензионната култура привлича вниманието на изследователите поради високата си ефективност при натрупването на големи количества клетки. Оказа се, че клетки от трансплантирани линии, за разлика от други видове клетъчни култури, могат да се култивират дълго време в суспендирано състояние. Клетките при тези условия се размножават, без да се прикрепят към стените на съда за култура, като са в състояние на суспензия, поради постоянното смесване на средата. При оптимален режим на отглеждане, клетките в суспензиите се размножават бързо и имат по-висок "добивен" от стационарните култури. Първичните и непрекъснатите клетъчни линии имат различна способност да растат в суспензия. По този начин хетероплоидните и анеуплоидните постоянни линии, за разлика от псевдодиплоидните линии, се адаптират по-бързо към растеж в суспензия.

Суспензионните култури се приготвят от монослойни култури. Клетките се отлепват от стъклото с разтвори на версен и трипсин. Клетъчната пелета след центрофугиране (1000 rpm) се ресуспендира в прясна хранителна среда. Приготвената суспензия се поставя в съдове за култивиране (реактори, ферментатори) и се отглежда при непрекъснато разбъркване. В научните изследвания концентрацията на клетките в първоначалната суспензия варира от 0,3 до 10x10 на 1 ml. Оптималната концентрация на клетки в първоначалната суспензия трябва да бъде 2-5x10 на 1 ml. Според Ърл и неговите сътрудници концентрацията на клетките в суспендираната култура трябва да бъде такава, че фазата на логаритмичен растеж да настъпи не по-късно от 16-24 часа след приготвянето на културата. Суспензионните клетъчни култури преминават през характерни етапи: лаг-фаза, логаритмична фаза на растеж, стационарна фаза и логаритмична фаза на смърт. На първия етап, като правило, броят на клетките намалява, на втория етап клетъчната популация се увеличава (стадий на логаритмичен растеж), на третия етап не се наблюдава увеличение на броя на клетките (стационарна фаза). Ако култивирането продължи по-нататък, тогава се установява период на намаляване на броя на клетките - фазата на логаритмична смърт (фазата на разрушаване). Скоростта на клетъчно възпроизвеждане в логаритмичната фаза на растеж се изразява чрез времето на генериране. Времето за генериране се отнася до периода, необходим за удвояване на популацията от клетки в културата. За култивиране на клетъчна суспензия важно условие е смесването на течността, което трябва да бъде непрекъснато и достатъчно интензивно, за да задържи клетките в суспензия, да предотврати утаяването и закрепването им по стените на съда и в същото време да не причинява механични щета.

Смесването на суспензионните култури се извършва с лопаткови магнитни бъркалки, както и с кръгли люлеещи се столове. Понастоящем широко се използва въртенето на флакони и бутилки около надлъжната ос (15-40 rpm). При магнитните бъркалки скоростта на въртене е 100--200 rpm. Скоростта на смесване зависи от обема на културата; малките обеми култура изискват ниска скорост, докато тя трябва да се увеличи при големи обеми. Извършва се силиконизация, за да се предотврати утаяването на клетките по вътрешната повърхност на съда. Силиконовото покритие, поради своята хидрофобност, предотвратява прикрепването на клетките към съдовата стена.

Вътрешните стени на съда за култура се навлажняват с 5% или 10% разтвор на силикон и след изпаряване на разтворителя (бензен, ацетон) съдовете се държат при 85°C и 200° (съответно 30 и 60 минути). ). След охлаждане съдовете се напълват с гореща бидестилирана вода и се оставят за 2 часа, след което се изплакват 3 пъти с бидестилирана вода и се изсушават при 100°С. Съдовете се стерилизират във фурна при 170°С за 2 часа.

Максималният клетъчен растеж в суспензия се наблюдава при рН 7,0-7,2. Хранителната среда, използвана за отглеждане на клетки в суспензия, не се различава от средата, използвана за отглеждане на клетъчни линии в монослойна култура. Най-често, когато се култивират клетки в суспензии, средата на Eagle се приема с двойна концентрация на аминокиселини и витамини.

Суспензионните култури консумират 2-7 пъти повече глюкоза от монослойните. В процеса на консумация на глюкоза клетките отделят токсична за тях млечна киселина в околната среда. Консумацията на глюкоза от клетките и производството на млечна киселина протичат паралелно и са в пряка зависимост от плътността на клетъчната популация. Оказа се полезно добавянето на инсулин към хранителната среда в количество от 40 до 200 IU на 1 литър. Добавянето на инсулин към хранителната среда променя съотношението между количеството абсорбирана глюкоза и количеството отделена млечна киселина. За L клетки този коефициент може да бъде намален от 74-81 до 37-38%.

Различни аминокиселини се консумират от хранителната среда от растящите клетки с различна скорост. Отбелязва се, че редовното добавяне на аргинин (20-40 mg/l) и увеличаването на количеството глутамин до 450 mg/l благоприятства растежа на суспендираните култури.

Добавянето на инозитол (0,4 mg/l) ускорява растежа на човешки амниотични клетъчни култури. Желателно е към средата да се добавят каталаза (1 mg/l) и тироксин (12 mg/l).

Голям интерес представляват работи, посветени на получаването на суспендирани клетъчни култури в синтетична среда, която не съдържа кръвен серум. Правят се опити за повишаване на вискозитета на хранителната среда за сметка на безпротеинови съставки. За тази цел се използват метилцелулоза и хиалуронова киселина.

Метилцелулозата в концентрация 0,1-0,2% има максимален защитен ефект върху клетките, суспендирани в средата. Защитният ефект на метилцелулозата е, че молекулите образуват защитен слой около клетката, предотвратявайки увреждане на клетката, когато средата се разбърква. Много важен индикатор за състоянието на суспензионната култура е парциалното налягане на кислорода в течната фаза. Концентрацията на кислород в газовата фаза зависи от плътността на клетъчната популация и често е под атмосферната. Липсата на кислород води до появата на гранулация на цитоплазмата, клетките губят правилната си заоблена форма. При лек излишък на кислород клетките имат добре очертана, правилна, заоблена форма и стават много големи под увреждащото действие на излишъка на кислород. Оптималната концентрация на кислород за различни клетъчни култури варира от 9 до 17% или 293 mm Hg. стълб. При концентрации на кислород над 20% растежът на клетките се инхибира. Така при концентрация на кислород от 24% размножаването на заешки ембрионални бъбречни клетки (ERK линия) намалява наполовина, а при 30% намалява до нула. Увеличаването на концентрацията на кислород има токсичен ефект върху клетъчния метаболизъм.

По този начин възпроизвеждането на клетки в суспензия зависи от концентрацията на клетките в първоначалната суспензия, аерацията и рН на средата, състава на хранителната среда, метода на смесване, обема на суспензията и други фактори.

Хомогенността на суспензията, възможността за дългосрочно поддържане на клетките в логаритмичната фаза на растеж, перспективите за математическо моделиране на процесите на клетъчен растеж в зависимост от влиянието на факторите на околната среда, удобството на множество изследвания на физиологичното състояние на клетъчна култура в суспензия, висока ефективност на метода - това не е пълен списък на предимствата на суспензионните култури.

Суспензионните култури се използват широко при вирусологични изследвания и за натрупване на големи количества вируссъдържащ материал, при производството на ваксини и диагностични препарати.

3.5 Култивиране на клетки върху микроносители

През 1967 г. Van Werel предлага метод на култивиране, който съчетава елементи на монослоен и суспензионен клетъчен растеж, който той нарича метод на "микроносителя". Същността му се състои в това, че клетките се прикрепят и размножават върху повърхността на полимерните топчета-частици от "микроносители" (MN), които се съдържат в суспензия с помощта на смесително устройство, като бъркалка. На една MN частица с диаметър 160–230 mm могат да се поберат 350–630 (или средно 460) клетки. В един ml от средата могат да се суспендират няколко хиляди частици микроносител, като общата им площ варира от няколко до 50 cm 2 /ml.

Клетките, инокулирани в култиватора, се прикрепят към повърхността на MN частиците и се размножават, за да образуват непрекъснат монослой върху всяка отделна частица.

Основните предимства на този метод са:

1) създаване на еднакви условия в целия обем на съда, което дава възможност за ефективен контрол на необходимите параметри (pH, p0 2 и др.); 2) получаване на висока плътност на клетъчната популация до 5-6 милиона клетки на 1 ml; 3) култивиране на няколко стотици милиарда клетки едновременно; 4) въвеждане на постоянен контрол върху динамиката на клетъчния растеж; 5) намаляване на растежа на замърсяването поради намаляване на операциите, свързани с намаляване на налягането на съда за култура; 6) значителни икономии на хранителни среди; 7) способността да се задържат порасналите клетки директно върху частиците при ниски температури; 8) способността за изкуствено създаване на различни концентрации на MN с клетки, отглеждани върху тях; 9) възможността за преминаване на културата без използване на трипсин чрез добавяне на свежи части от микроносителя.

Микроносителите трябва да имат:

Малък положителен заряд в диапазона 1,5-1,8 MEKV / g. Поради факта, че повечето животински клетки имат слабо отрицателен заряд, те по-лесно ще се прикрепят към такъв MN:

Плътност 1,05--1,15 g/cm; посочената плътност е оптимална за поддържане на MN в суспензия;

Диаметърът на частиците е от 100 до 250 микрона, което осигурява зони за растеж на няколкостотин клетки;

Гладка повърхност;

Прозрачност;

Липса на токсичност на компонентите за клетките;

Лека абсорбция на средни компоненти;

Универсалност, осигуряваща възможност за използването им за първични, диплоидни и хетерплоидни клетки. Не по-малко важни са свойствата на MH, които позволяват многократното им използване.

Проучване на много гранулирани препарати от различно химическо естество, включително тези, направени от омрежен (PS) декстран, PS-агароза, PS-поливинилпиролидон, полиакрилнитрит, порест силикагел, полистирол, капрон, найлон и алумосиликат, беше проведено в за да ги използваме като микроносители.

Подходящи са само няколко от тях, основно базирани на PS-декстран.

Няколко чуждестранни фирми са разработили готови за употреба търговски препарати от микроносители: Cytodex-1, 2, 3 (Франция, Швеция), Superbit (САЩ, Англия), Biosilon (Дания). Цената на тези лекарства е доста висока, така че е необходимо да се проведат изследвания за разработването и производството на местни MN.

Култивирането на клетки върху микроносители се извършва в конвенционални ферментатори за суспензионни култури. Ферментаторът не трябва да има издатини, джобове, за да се предотврати натрупването на микроносители в застояли зони. Поради това е разумно да се използват ферментатори с кръгло дъно и гладки стени. Вътрешността на ферментатора трябва да бъде силиконизирана, за да се предотврати залепването на микроносители по стъклото или неръждаемата стомана на ферментатора.

Стандартното оборудване може да се използва за контролиране на условията на културите като pH и O 2 . Скоростта на смесване на суспензията с носителя трябва да бъде 40-60 rpm. Различни видове клетки се използват за култивиране върху MH.

Концентрацията на Cytodex може да варира от 0,5 до 5 mg/ml. Но при производството на профилактични ваксини обикновено се използва крайна концентрация на цитодекс, която не надвишава 1 mg/ml. Увеличаването на концентрацията до 3 mg/ml и повече създава допълнителни трудности, свързани с необходимостта от перфузия на хранителната среда и нейната частична подмяна, което усложнява технологичния процес.

Инокулативната концентрация на клетките, както и условията на култивиране върху MN в първите часове, до голяма степен определят оптималните параметри за пролиферация и максимално натрупване на клетки. Показано е, че инокулирането на 10 клетки/ml от непрекъсната линия от бъбреци на маймуни (Vero) и диплоидни клетки от човешки ембрионални фибробласти (MRC-5) в среден обем, намален до 1/3 и с периодично включвана бъркалка (30 rpm) за една минута след всеки час в продължение на 4 часа, последвано от добавяне на хранителна среда до крайния обем, води до увеличаване на клетъчната пролиферация и техния брой в сравнение с контролата (пълен обем на хранителната среда към момента на засаждане на клетките и непрекъсната работа на бъркалката от началото на култивирането).

Хранителната среда е важна за култивиране на клетки върху MN. Правилният избор на хранителна среда също ще помогне за оптимизиране на процеса на клетъчна пролиферация и тяхното качество. Необходимо е да се изберат хранителни среди за култивиране на клетки върху различни видове MN. Беше показано, че трансплантираната клетъчна линия на маймунски бъбреци (Vero) върху cytodex дава най-висок добив при използване на Eagle DME среда (концентрация на клетките за засаждане 10 5 ml), но в сравнение с BME и среда 199. Ако броят на клетките по време на засаждането е намален до 10 4, тогава най-добрата среда 199 дава резултати.Всички тествани среди съдържат 10% фетален серум.

3.6 Отглеждане на вируси в клетъчни култури

Понастоящем за изолиране и размножаване на животински вируси се използват първични култури, клетъчни щамове и установени клетъчни линии. Като цяло процедурата е една и съща за всички вируси.

Средата се отстранява от клетъчния монослой и монослоят се промива с балансирани буферирани солеви разтвори (SBSR) или фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS), за да се отстранят инхибиторите (антитела), които могат да присъстват в средата. Вирусните частици се суспендират в малко количество SBSR или PBS и се адсорбират от клетките в рамките на 30-60 минути. След това физиологичните разтвори се заменят с прясна среда.

Инфекцията на култивирани клетки с вируси причинява характерни морфологични промени в клетките. Окончателните дегенеративни клетъчни процеси (цитопатогенен ефект, CPE) се откриват само след няколко седмици растеж в присъствието на вируси, но в някои случаи CPE се откриват след 12 часа.Детайлите на морфологичните промени са различни в случай на различни вируси.

Ако вместо продуктивна инфекция вирусът причинява клетъчна трансформация, това също е придружено от характерни промени в морфологията и характеристиките на клетъчния растеж.

4. Предпазни мерки при работа с инфектирани с вируси клетки

Вирусите имат цитопатогенен ефект и служат като етиологични агенти при много заболявания на човека и животните. В допълнение, много вируси (напр. онкорнавируси, херпесен вирус тип II, аденовируси, полиома вирус и SV40) изглежда са агенти, причиняващи тумори при животни. Поради способността на вирусите да преминават през бактериални филтри, може да бъде трудно да се изключат вируси от неинфектирани клетъчни култури в присъствието на вирусни суспензии, където е възможно предаване на вируса през въздуха на помещението за култивиране.

Следните предпазни мерки са от общ характер и се прилагат само когато вирусите не представляват особен риск. Когато се използват изключително опасни вируси, които представляват опасност за здравето на лабораторния персонал или хората и животните в околния свят, трябва да се вземат допълнителни предпазни мерки. Вирусите, предизвикващи особено безпокойство, включват вируси на нюкасълската болест, вируси на шап, вируси на везикулозен стоматит, вируси на шарка, вируси на бяс, вируси на херпес тип В и т.н. Освен това не можем да сме сигурни, че дори вируси като SV40 не представляват опасност за хората.

Трябва да се използва специална стая или група от стаи за заразяване на клетки и отглеждане на заразени с вируси клетки.

Никакви живи вируси не трябва да се отстраняват от тези стаи, освен ако не се съдържат в плътно затворени контейнери. Трябва да се вземат предпазни мерки, за да се гарантира, че външните повърхности на тези контейнери не са замърсени с вирусни частици.

При работа с вируси трябва да се използва специално защитно облекло (лабораторни престилки). След работа тези дрехи трябва да се поставят в специален резервоар за автоклавиране.

Всички среди и стъклария, които са били в контакт с вируси, трябва да бъдат третирани с хлор; едва след това те могат да бъдат изнесени от стаята, предназначена за работа с вируси.

Всички пластмасови прибори трябва да се поставят в специален резервоар за автоклавиране.

Оборудването за съхранение и работа с вирусен материал трябва да бъде разположено в съоръжението за работа с вируси.

Лабораторията трябва да бъде оборудвана с двуциклови автоклави, така че лабораторният персонал да бъде защитен от вредни материали.

4.1 Откриване на вируси

Вирусите могат да бъдат открити и количествено определени с помощта на редица различни тестове, като например:

1) Вирусната активност се измерва чрез определяне на количеството вирус-съдържащ материал, необходим за предизвикване на специфичен отговор в гостоприемника. Индуцираният от вируса отговор може да бъде всичко или нищо (т.е. наличие или отсъствие на инфекция) или може да бъде количествено определен, като например продължителността на времето, необходимо за появата на инфекция, или броя на лезиите в податлива клетка слой. Количественото определяне на вирусната активност се нарича титруване.

Най-малкото количество вирус, което може да предизвика подходяща реакция, се нарича инфекциозна единица, а титърът на първоначалната вирусна суспензия се изразява като брой инфекциозни единици на единица обем. Например, ако минималното количество суспензия от грипен вирус, което причинява пневмония при мишка при интраназално инжектиране със суспензия от заразена белодробна тъкан в разреждане 1:10 6, е 0,1 ml, тогава това означава, че титърът на грипния вирус в първоначалната суспензия на белодробната тъкан е 10 7 инфекциозни единици на 1 ml--1/(10~1-10-6)=10 7 .

По правило задължителен компонент на метода за титруване на вируса е тест, който ви позволява да оцените резултата от инокулацията като положителен или отрицателен. Например, когато се титруват животински вируси, такъв тест може да бъде наличието или отсъствието на видими лезии в клетъчната култура, възпалителна реакция на мястото на инокулация на вируса в кожата или роговицата, парализа в резултат на въвеждането на вируса в мозъка на животното и др. Понякога възпроизвеждането на вируса може да бъде открито дори при липса на видима реакция от организма гостоприемник: например, инфекция на пилешки ембриони с миксовируси може да бъде открита чрез появата на хемаглутинини в алантоиса течност.

Най-добри резултати се получават чрез методи на титруване, които се основават на преброяване на броя на дискретни лезии в определена област на слой от клетки, заразени с известно количество вирус-съдържащ материал. В случаите, когато броят на вирусочувствителните и достъпни клетки може да се счита за практически безкрайно голям, като например, когато еднослойна култура от бактерии върху хранителен агар е заразена с фаг или когато непрекъсната монослойна култура от животински клетки е заразена с вирус, лезии, причинени от вируса, или плаки, образувани от фаг, в този смисъл са подобни на бактериални колонии върху плътна хранителна среда. Точно както броят на тези колонии е пропорционален на броя на бактериалните клетки, съдържащи се в титруемия препарат, така и броят на плаките е право пропорционален на количеството вирус, добавен към монослойната култура, образуването на вирусни частици от заразените клетки, което могат да бъдат идентифицирани, например, чрез природата на нуклеиновите киселини и симетрията на частиците.

2) Производство на нуклеинови киселини от инфектирани клетки, които могат да имат характерна плътност чрез центрофугиране с градиент на плътност или характерен размер чрез електрофореза в агарозен гел или центрофугиране с градиент на концентрация на захароза.

3) Образуване от инфектирани клетки или трансформирани клетки на характерни антигени, които могат да бъдат визуализирани чрез оцветяване с флуоресцентни специфични антитела или да причинят промени в клетъчната мембрана, водещи до адсорбция на хема. При директния метод антителата, генерирани срещу вирусни антигени, се комбинират с флуорохром и се използват за оцветяване на заразените клетки. Положителната реакция (жълто-зелена във флуоресцентен микроскоп) показва наличието на вирусни антигени в клетките. Следователно този метод може да се използва за откриване на клетъчна трансформация, когато се генерират антитела срещу, например, ранни антигени на вируса SV40, или за откриване на образуването на зрели вируси, когато се генерират антитела срещу капсидни протеини. При индиректния метод антителата не се комбинират с флуорохром. Вместо това, след взаимодействие на антитела с антигени във фиксирани клетъчни препарати, към тях се добавят анти-гама глобулинови антитела, конюгирани с флуорохром. Този метод е по-чувствителен и избягва конюгацията на всяко отделно антитяло с флуоресцентно багрило. По този начин същите флуоресцентни антитела срещу заешки антитела (получени при овце срещу заешки гама глобулини) могат да се използват за оцветяване на всякакви антитела, произведени в зайци и взаимодействащи с вирусни антигени в продуктивно инфектирани или трансформирани клетки. Още по-индиректен, но много по-чувствителен метод, който не изисква използването на флуоресцентен микроскоп, е пероксидазно-антипероксидазният метод. Съгласно този метод заешките антитела взаимодействат с фиксирани клетъчни антигени и след това се покриват с кози антитела срещу заешки имуноглобулини, конюгирани с комплекси от пероксидаза от хрян и заешка антипероксидаза. След това препаратите се третират с диамино-бензидин и водороден прекис; кафяв цвят показва наличието на антигени.

4) Наличието на антигени върху вирусни частици може да доведе до реакции на хемаглутинация, което позволява количествена оценка. Много вируси имат антигени, които могат да се адсорбират върху червените кръвни клетки и да ги накарат да се слепят. При взаимодействие на голям брой вирусни частици и еритроцити се образува мрежа от клетки, а суспензията аглутинира, т.е. еритроцитите се утаяват. Има известна специфика в това, че някои вируси причиняват аглутинация на еритроцитите на определени животни, но ако се открие активна комбинация, тогава хемаглутинацията се превръща в бърз тест за определяне на титъра на вируса. Кръвта се изтегля в хепаринизирана спринцовка и еритроцитите се промиват три пъти с повторно утаяване в 0,85% NaCl при 200 g за 10 минути. Крайната еритроцитна утайка се суспендира в 200-кратен обем от 0,85% разтвор на NaCl. Най-удобният начин за изследване на хемаглутинацията е в микротитърни плаки. В серия от ямки на микротитърна плака добавете 25 µl 0,85% NaCl или PBS; 25 μl вирусна суспензия се добавя към първата ямка и сместа се разбърква (разреждане 1:2). След това 25 µl се прехвърлят от първата ямка във втората (разреждане 1:4) и така нататък, докато крайното разреждане стане 1:2048. След това към всяка ямка се добавят 25 µl еритроцитна суспензия, сместа се разбърква и се оставя при 4°С, стайна температура или 37°С до настъпване на хемаглутинация (1-2 часа). В ямките, където е настъпила аглутинация, еритроцитната утайка има неправилна форма, а в ямките, където не е настъпила хемаглутинация, клетъчната утайка образува компактна точка на дъното на ямката. Разреждането в последната ямка, в която е настъпила хемаглутинация, се счита за титър и на това разреждане се приписва стойност от 1 хемаглутинационна единица (HAU). Предишното разреждане съдържа съответно 2 HAU и т.н.

5) Образуването от инфектираните клетки на характерни ензими или ензими, които лесно се различават по свойствата си от съответните ензими на клетките гостоприемници.

4.2 Култивиране на пикорнавируси, използвайки примера за получаване на полиовирус тип 3 в клетъчна култура HeLa

Като специфична техника за култивиране на вируси може да се посочи метод за отглеждане на полиовирус в непрекъснати клетки.

Всички процедури се извършват при стерилни условия.

Някои подлинии на HeLa клетки (напр. HeLa S3) могат да растат в среда с ниско съдържание на калциеви йони (напр. CaS2MEM). За ефективна инфекция е важно клетките да растат добре в хомогенна суспензия. Клетките се пелетират чрез центрофугиране с ниска скорост (15 минути при 900 g) и се ресуспендират в CaS2MEM до концентрация ~2. 107 клетки/ml (~1/20 от първоначалния обем).

Вирусът се добавя към клетъчната суспензия в концентрация от 10-50 PFU на клетка; инкубирайте го на магнитна бъркалка за 1 час при 35°C.

Суспензията се разрежда със същата среда до концентрация 2. 106 клетки/ml и добавете 100 μCi от [3H]-уридин.

Клетъчната суспензия се инкубира в продължение на 8 часа, след което клетките се пелетират чрез центрофугиране с ниска скорост (15 минути при 900 g) и се промиват веднъж с фосфатен буферен разтвор (PBS), свободен от магнезиеви и калциеви йони.

Клетките се ресуспендират в PBS (5-107 клетки/ml) и се подлагат на три цикъла на замразяване-размразяване.

Клетъчните остатъци се отстраняват чрез центрофугиране.

Супернатантата се съхранява за по-нататъшно пречистване.

Библиография

1. Адамс Р. Методи за клетъчни култури за биохимици. - М.: Мир, 1983, 263 с.

2. Вирусология. Методи. / Ед. Б. Мейхи. - М.: Мир, 1988, 344 с.

3. Голубев Д.Б., Соминина А.А., Медведева М.Н. Насоки за използване на клетъчни култури във вирусологията. - Л .: Медицина, 1976, 224 с.

4. Дяконов Л.П., Глухов В.Ф., Поздняков А.А., Денисенко Г.Ф., Калмикова Т.П. Култивиране на клетки и тъкани от животни. - Ставропол: Stavrop. Правда, 1988, част 2, 91 с.

5. Животинска клетка в култура под. изд. Л.П. Дяконова, В.И. Ситкова. - М.: 2000.

6. Култура от животински клетки. Методи. / Ед. Р. Фрешни. - М.: Мир, 1989, 333 с.

7. Ръководство по ветеринарна вирусология. / Ед. В.Н. Шурин. - М.: Колос, 1965, 687 с.

8. Сергеев В.А. Възпроизвеждане и култивиране на животински вируси. - М.: Колос, 1976, 303 с.

9. Fenner F., McOslen B., Mims S., Sambrook J., White D. Биология на животинските вируси. - М.: Мир, 1977, том 1, 447 с.

Хоствано на Allbest.ru

...

Подобни документи

Основните начини за заразяване на пилешки ембриони с вирус. Етапи на получаване на субкултури: отстраняване на клетъчния слой, отделяне и засяване на клетки, метод за заразяване на клетъчни култури с вирус, записване на резултатите. Полупостоянни култури от човешки и животински клетки.

презентация, добавена на 29.01.2015 г


Хранителни среди в микробиологията, тяхната класификация и разновидности, области и особености на употреба. Култивиране на аеробни и анаеробни микроорганизми. Методи за количествено отчитане на микроорганизмите, основни правила и условия за съхранение на техните култури.

резюме, добавено на 25.03.2013 г


Флавани във висшите растения: структура, основни представители, локализация, функционална роля. Морфофизиологични и биохимични характеристики на клетъчни и калусни култури от чаени растения. Определяне съдържанието на флавани и проантоцианидини.

дисертация, добавена на 02.02.2018 г


Видове носители за имобилизиране на клетки и ензими. Имобилизирани култури и възможността за тяхното приложение в различни индустрии. Видове реактори, използващи имобилизирани култури. Предимства и недостатъци на използването на имобилизирани култури.

курсова работа, добавена на 15.01.2012 г


Изследване на процеса на създаване на изкуствени клетъчни асоциации, с помощта на които е възможно да се извършва жизнената дейност на азотфиксиращите организми в клетките и тъканите на култивираните растения. Асоциации от ендо- и екзосимбиотичен тип. Целта на създаването на популации.

презентация, добавена на 18.03.2015 г


Стойността на влажността на околната среда при култивирането на ензими върху свободна среда. Влияние на степента на аериране на култури от микроскопични гъби. Влиянието на състава на средата и продължителността на култивиране върху биосинтезата на липаза. Методи за обработка и отглеждане на култури.

презентация, добавена на 19.03.2015 г


презентация, добавена на 23.02.2014 г


Методи за изолиране на чисти култури от микроводорасли и методи за тяхната идентификация. Изолиране на чиста култура от Euglena glacilis; разглеждане на методи за определяне на жизнеспособността на клетките. Да се ​​изследват ефектите на разединителите на дишането и синтеза на АТФ върху клетъчната подвижност.

дисертация, добавена на 24.05.2012 г


Специфични фактори на антивирусния имунитет и синтеза на антитела към специфичен антиген. Клетките на паметта и издаването на имунен отговор под формата на биосинтеза на антитела. Разпространение на инфекциозен бронхит на птици и панголини. Култивиране на вируси в клетки.

тест, добавен на 17.11.2010 г


Приложение на клетъчните технологии в растениевъдството. Използване на in vitro методи при далечна хибридизация. Работи по отглеждането на калус с цел получаване на нов разплоден материал. Хибридизация на соматични клетки и нейните основни резултати.

1966).

Техниките за клетъчни култури се развиха значително през 40-те и 50-те години на миналия век във връзка с изследванията в областта на вирусологията. Култивирането на вируси в клетъчни култури направи възможно получаването на чист вирусен материал за производството на ваксини. Полиомиелитната ваксина е едно от първите лекарства, които се произвеждат масово с помощта на технология за клетъчни култури. През 1954 г. Ендерс, Уелър и Робинс получават Нобелова награда "за откриването на способността на полиомиелитния вирус да расте в култури от различни тъкани". През 1952 г. е разработена добре известната линия човешки ракови клетки HeLa.

Основни принципи на отглеждане[ | ]

Клетъчна изолация[ | ]

За култивиране извън тялото живите клетки могат да бъдат получени по няколко начина. Клетките могат да бъдат изолирани от кръвта, но само левкоцитите могат да растат в култура. Мононуклеарните клетки могат да бъдат изолирани от меките тъкани с помощта на ензими като колагеназа, трипсин и проназа, които разграждат извънклетъчния матрикс. Освен това в хранителната среда могат да се поставят парчета тъкани и материали.

Култури от клетки, взети директно от обекта (ex vivo), се наричат ​​първични. Повечето първични клетки, с изключение на туморните клетки, имат ограничен живот. След определен брой клетъчни деления такива клетки остаряват и спират да се делят, въпреки че все още могат да останат жизнеспособни.

Има обезсмъртени („безсмъртни“) клетъчни линии, които могат да се размножават неограничено. В повечето туморни клетки тази способност е резултат от произволна мутация, но в някои лабораторни клетъчни линии тя се придобива изкуствено, чрез активиране на гена за теломераза.

Клетъчна култура[ | ]

Клетките се отглеждат в специални хранителни среди при постоянна температура. Променливото осветление се използва за растителни клетъчни култури, докато клетките на бозайници обикновено също изискват специална атмосфера, поддържана в инкубатор за клетъчни култури. По правило се регулира концентрацията на въглероден диоксид и водни пари във въздуха, но понякога и на кислород. Хранителните среди за различните клетъчни култури се различават по състав, концентрация на глюкоза, състав на растежни фактори и др. Растежните фактори, използвани в среди за клетъчни култури на бозайници, най-често се добавят заедно с кръвния серум. Един от рисковите фактори в този случай е възможността за заразяване на клетъчната култура с приони или вируси. При култивирането една от важните задачи е избягването или минимизирането на употребата на замърсени съставки. На практика обаче това не винаги се постига. Най-добрият, но и най-скъпият начин е да се допълнят с пречистени растежни фактори вместо серум.

Кръстосано замърсяване на клетъчни линии[ | ]

Когато работят с клетъчни култури, учените могат да се сблъскат с проблема с кръстосаното замърсяване.

Характеристики на растежа на клетките[ | ]

При отглеждане на клетки, поради постоянно делене, може да възникне тяхното изобилие в културата и в резултат на това възникват следните проблеми:

За поддържане на нормалното функциониране на клетъчните култури, както и за предотвратяване на негативни явления, периодично се извършва подмяна на хранителната среда, стареене на клетките и трансфекция. За да се избегне замърсяване на културите с бактерии, дрожди или други клетъчни линии, всички манипулации обикновено се извършват при асептични условия в стерилна кутия. Към хранителната среда могат да се добавят антибиотици (пеницилин, стрептомицин) и противогъбични средства (амфотерицин В) за потискане на микрофлората.

Култивирането на човешки клетки донякъде противоречи на правилата на биоетиката, тъй като клетките, отгледани в изолация, могат да надживеят родителския организъм и след това да бъдат използвани за провеждане на експерименти или за разработване на нови лечения и печалба от това. Първото съдебно решение в тази област дойде във Върховния съд на Калифорния по делото Джон Мур срещу Калифорнийския университет, според което пациентите нямат собственост върху клетъчни линии, получени от органи, отстранени с тяхно съгласие.

хибридома [ | ]

Използване на клетъчни култури[ | ]

Масовата клетъчна култура е основата за индустриалното производство на вирусни ваксини и различни биотехнологични продукти.

Биотехнологични продукти[ | ]

Индустриален метод от клетъчни култури произвежда продукти като ензими, синтетични хормони, моноклонални антитела, интерлевкини, лимфокини, противотуморни лекарства. Въпреки че много прости протеини могат да бъдат получени сравнително лесно с помощта на бактериални култури, по-сложни протеини като гликопротеини в момента могат да бъдат получени само от животински клетки. Един от тези важни протеини е хормонът еритропоетин. Разходите за отглеждане на клетъчни култури от бозайници са доста високи, така че в момента се правят изследвания за възможността за производство на сложни протеини в клетъчни култури от насекоми или висши растения.

тъканни култури[ | ]

Клетъчната култура е неразделна част от технологията на тъканните култури и тъканното инженерство, тъй като определя основата за отглеждане на клетки и поддържането им в жизнеспособно състояние ex vivo.

Ваксини [ | ]

С помощта на техники за клетъчни култури в момента се произвеждат ваксини срещу полиомиелит, морбили, паротит, рубеола и варицела. Поради заплахата от грипна пандемия H5N1, правителството на Съединените щати в момента финансира изследване на ваксина срещу птичи грип, използвайки клетъчни култури.

Клетъчни култури от небозайници[ | ]

Растителни клетъчни култури[ | ]

Растителните клетъчни култури обикновено се отглеждат или като суспензия в течна хранителна среда, или като калусна култура върху твърда хранителна основа. Култивирането на недиференцирани клетки и калус изисква поддържане на определен баланс на хормоните на растежа на растенията ауксини и цитокинини.

Бактериални, дрождеви култури[ | ]

Основна статия:

За култивиране на малък брой бактериални и дрождени клетки, клетките се посяват върху твърда хранителна среда на базата на желатин или агар-агар. За масово производство се използва култивиране в течни хранителни среди (бульони).

вирусни култури[ | ]

I. Клетъчни култури

Най-често срещаните са еднослойни клетъчни култури, които могат да бъдат разделени на 1) първични (първично трипсинизирани), 2) полутрансплантируеми (диплоидни) и 3) трансплантируеми.

Произходте се класифицират на ембрионални, неопластични и от възрастни организми; чрез морфогенеза- върху фибробластни, епителни и др.

Първиченклетъчните култури са клетки от всяка човешка или животинска тъкан, които имат способността да растат като монослой върху пластмасова или стъклена повърхност, покрита със специална хранителна среда. Продължителността на живота на такива култури е ограничена. Във всеки случай те се получават от тъканта след механично смилане, обработка с протеолитични ензими и стандартизиране на броя на клетките. Първичните култури, получени от бъбреци на маймуни, бъбреци на човешки ембриони, човешки амнион, пилешки ембриони, се използват широко за изолиране и натрупване на вируси, както и за производството на вирусни ваксини.

полутрансплантируеми(или диплоиден ) клетъчни култури - клетки от същия тип, способни да издържат до 50-100 пасажа in vitro, като същевременно запазват своя оригинален диплоиден набор от хромозоми. Диплоидни щамове на човешки ембрионални фибробласти се използват както за диагностика на вирусни инфекции, така и при производството на вирусни ваксини.

трансплантиранклетъчните линии се характеризират с потенциално безсмъртие и хетерплоиден кариотип.

Източникът на трансплантирани линии са първични клетъчни култури (например SOC, PES, VNK-21 - от бъбреците на еднодневни сирийски хамстери; PMS - от бъбрек на морско свинче и др.), отделните клетки на които показват склонност към безкрайно размножаване in vitro. Наборът от промени, водещи до появата на такива характеристики от клетките, се нарича трансформация, а клетките на трансплантирани тъканни култури се наричат ​​трансформирани.

Друг източник на трансплантирани клетъчни линии са злокачествените неоплазми. В този случай клетъчната трансформация се извършва in vivo. Във вирусологичната практика най-често се използват следните линии трансплантирани клетки: HeLa - получени от цервикален карцином; Ner-2 - от карцином на ларинкса; Детройт-6 - от метастази на рак на белия дроб до костния мозък; RH - от човешкия бъбрек.

За култивирането на клетките са необходими хранителни среди, които според предназначението си се делят на растежни и поддържащи. Съставът на растежната среда трябва да съдържа повече хранителни вещества, за да се осигури активно размножаване на клетките за образуване на монослой. Поддържащата среда трябва да гарантира само оцеляването на клетките във вече образуван монослой по време на репродукцията на вируси в клетката.

Стандартните синтетични среди, като Synthetic 199 медии и Needle медии, са широко използвани. Независимо от предназначението, всички хранителни среди за клетъчни култури са проектирани на базата на балансиран солев разтвор. Най-често това е решението на Ханк. Неразделна част от повечето растежни среди е кръвният серум на животни (теле, бик, кон), без наличието на 5-10% от които не се извършва възпроизвеждане на клетки и образуване на монослой. Серумът не е включен в поддържащата среда.

I. Клетъчни култури - понятие и видове. Класификация и особености на категория "I. Клетъчни култури" 2017, 2018г.

- III. Радиорелейни комуникации

II. Безжични комуникации I. Жични комуникации Ø Градска телефонна комуникация Ø Директна телефонна комуникация (селектор) Ø Радиотелефонна комуникация ("Алтай") Ø Индуктивна комуникация (EKV комуникация "Дистон", "Налмес") Ø... .

- Разход на материали за 1 км път с асфалтобетонова настилка IV тип

Таблица 15 Таблица 14 Таблица 13 Таблица 12 Таблица 11 Пътища Трафик при сложна лихва в различни години на експлоатация Стойности на коефициентите m, K0, K0m с нарастваща интензивност Таблица... .

- III. Време 90 минути.

Урок № 5 Спирачна система Тема № 8 Механизми за управление Според разположението на автомобилното оборудване Провеждане на групов урок План - абстрактно Подполковник Федотов С.А. "____"... .

- Определяне на Zmin и Xmin от условието за липса на подбиване

Фиг.5.9. За рязане на зъбите на колелата. Нека разгледаме как коефициентът на срязване на релсата x е свързан с броя на зъбите, които могат да бъдат срязани от релсата на колелото. Оставете релсата да е монтирана в позиция 1 (фиг. 5.9.). В този случай правата глава на стелажа ще пресече линията на зацепване N-N в т. И ....

- Verbos que terminan en -it, -et

Los verbos irregulares Go - ir Eat - comer Sleep - dormir Want - querer I Go Eat Sleep Want You Go Eat Sleep Do He, She Go Eat Sleep Want We Go Eat Sleep Want You Go Eat Sleep Do They Go...