DNA vakcína(tiež génová vakcína, vakcína s nukleovou kyselinou)- geneticky upravený konštrukt, ktorý po zavedení do bunky zabezpečuje produkciu patogénnych proteínov alebo nádorových antigénov a vyvoláva imunitnú odpoveď. Zavedenie DNA vakcín do tela sa nazýva genetická imunizácia. Vakcinácia DNA má oproti konvenčným vakcínam niekoľko výhod. Predovšetkým sa ukázalo, že takéto vakcíny zabezpečujú nielen tvorbu protilátok (humorálna imunita), ale aj špecifickú cytotoxickú odpoveď (bunková imunita), ktorá bola predtým dosiahnuteľná len živými vakcínami. Dnes sa DNA vakcíny nepoužívajú na liečbu ľudí, ale predpokladá sa, že genetická imunizácia pomôže prekonať celý rad chorôb.

História stvorenia

Myšlienka použiť fragmenty DNA na očkovanie sa objavila v 50. a 60. rokoch minulého storočia. Po sérii experimentov sa zistilo, že genetická informácia DNA si po prenesení do inej bunky zachováva schopnosť prepisu a prekladu. V tom istom roku sa zistilo, že zavedenie genómu vírusu detskej obrny do zvierat stimuluje tvorbu protilátok. Neskôr bola preukázaná aktivácia humorálnej imunity pre molekuly DNA odvodené od neinfekčných agens. Od 90. rokov 20. storočia začali vedecké laboratóriá čoraz častejšie skúmať imunostimulačné vlastnosti DNA. V roku 1992 Tang a jeho kolegovia ukázali, že gén ľudského rastového hormónu vložený do plazmidu je stabilne exprimovaný u myší a syntetizovaný hormón je rozpoznávaný imunitným systémom ako antigén a stimuluje produkciu protilátok. Proces zavádzania plazmidovej DNA na stimuláciu humorálnej imunity sa nazýva Tango „genetická imunizácia“. Nasledujúci rok však iná skupina vedcov uviedla, že zavedenie plazmidu kódujúceho proteíny vírusu chrípky spôsobuje humorálnu aj bunkovú odpoveď. Indukcia oboch vetiev imunity v tom istom roku bola tiež nájdená pre plazmid obsahujúci gény HIV. Od roku 1995 sa začali objavovať dôkazy, že očkovanie DNA môže aktivovať imunitný systém proti rakovine. Asi pred 20 rokmi prebehli prvé klinické skúšky DNA vakcín, ktoré mali v prvom rade preukázať bezpečnosť novej metódy. Pacientom boli injekčne podané gény pre HIV, vírus chrípky, herpes, hepatitídu B, pôvodcu malárie. Výsledky všetkých testov boli celkom povzbudivé: DNA vakcíny boli dôsledne exprimované, vyvolávali imunitnú odpoveď a nespôsobovali vážne vedľajšie účinky, čo slúžilo ako impulz pre ich ďalší výskum.

Konštrukcia DNA vakcíny

Štrukturálne je DNA vakcína nukleotidová sekvencia vložená do vektora, ktorý kóduje špecifický antigén alebo antigény. Vektor v genetickom inžinierstve je molekula nukleovej kyseliny, ktorá slúži na dodanie genetického materiálu do buniek a zabezpečuje jeho replikáciu alebo expresiu. Predtým sa na transport génov do bunky používali vektory založené na vírusoch: modifikovaný (oslabený) vírus variola, adenovírusy a retrovírusy. Vírusové vektory sú celkom účinné, ale majú významnú pravdepodobnosť vedľajších účinkov spojených s relatívne vysokou imunogenicitou samotného vektora. Preto sa dnes ako vektor najčastejšie používa bakteriálny plazmid – malá stabilná kruhová molekula DNA schopná autonómnej replikácie. Plazmid sám o sebe nespôsobuje požadovanú špecifickú imunitnú odpoveď, preto sú do neho všité gény imunogénnych proteínov. DNA vakcína musí tiež obsahovať regulačné sekvencie potrebné na génovú expresiu v eukaryotických bunkách. Hotový konštrukt DNA sa dodáva do bakteriálnej bunky, kde sa zvyšuje počet jeho kópií. Potom nasleduje izolácia a purifikácia plazmidov, ktoré nesú požadovaný inzert.

Plazmidový vektorový dizajn

Dôležitou etapou pri tvorbe DNA vakcín je návrh (konštrukcia) vektora. Povinné štruktúry plazmidového vektora sú reštrikčné miesta, selektovateľný marker a počiatok replikácie DNA vakcíny v bakteriálnej bunke. Aby prebehla syntéza antigénu, DNA vakcína musí obsahovať promótor a polyadenylačný signál. Promótor je dôležitým faktorom účinnosti vakcíny, pretože určuje silu imunitnej odpovede: čím väčšia je expresia génu kódujúceho vírusový alebo nádorový antigén, tým silnejšia je imunitná odpoveď. Najčastejšie používaným promótorom je vírus SV40 alebo cytomegalovírus (CMV). Na stabilizáciu transkriptov mRNA sa do plazmidu vloží polyadenylačný signál, najčastejšie odvodený od génu rastového hormónu hovädzieho dobytka. (BGH) alebo vírus SV40. Ako selektovateľné markery sa vyberajú gény bakteriálnej rezistencie na antibiotiká, často gén rezistencie na kanamycín. Pri navrhovaní DNA vakcín je najobľúbenejším miestom pôvodu replikácie Escherichia coli.

Génová selekcia na imunizáciu

Vektor je dôležitou zložkou DNA vakcíny, ale jeho imunogenicita je určená presne inzertom, sekvenciou DNA kódujúcou antigén. Spomedzi vírusových antigénov sú na imunizáciu najvhodnejšie fúzne proteíny, sú to relatívne konzervované proteíny, ktoré umožňujú vírusu vstúpiť do bunky. Na očkovanie proti grampozitívnym baktériám je vhodné vložiť do plazmidového vektora gény tých bakteriálnych proteínov, ktoré určujú patogenézu ochorenia. Medzi proteínmi gramnegatívnych baktérií majú vysokú imunogenicitu. Pre terapeutické protinádorové DNA vakcíny sa používajú markerové proteíny rakovinových buniek.

Spôsoby dodávania DNA vakcín do buniek

Hotová vakcína musí byť doručená do ľudského alebo zvieracieho tela, kde jej cieľom sú bunky prezentujúce antigén (APC) - makrofágy, dendritické bunky, B-lymfocyty. Tu prebehne syntéza a posttranslačná modifikácia antigénu, po ktorej sa vloží do bunkovej membrány, aby upútala pozornosť imunitného systému. Hlavným problémom je dodať dostatok plazmidu do APC. Spôsoby dodania genetického materiálu do bunky sú zvyčajne rozdelené do 2 skupín: vírusové a nevírusové. Pretože vírusové vektory majú množstvo významných nedostatkov, v tejto časti sú uvedené len nevírusové metódy na dodávanie DNA vakcín.

mikroinjekcia

Začiatkom 90. rokov boli intramuskulárne mikroinjekcie najbežnejším spôsobom zavedenia DNA do bunky kvôli jednoduchosti metódy. Na to sa DNA rozpustí vo vode alebo izotonickom roztoku, ak je to potrebné, pridá sa adjuvans (látka, ktorá zvyšuje imunitnú odpoveď). Potom sa pomocou tenkej sklenenej trubice vstrekne roztok do svalového tkaniva, kde úlohu APC plnia dendritické bunky. Keď je vakcína v jadre dendritickej bunky, začína sa exprimovať a dochádza k syntéze antigénnych proteínov. Pomocou mikroinjekcií možno DNA vpraviť subkutánne do týmusu, pečene a nádorového tkaniva, avšak práve vo svalovom tkanive je pozorovaná najdlhšia (až ročná) expresia DNA vakcíny. Kvôli vysokej koncentrácii Langerhansových buniek (subtypu dendritických buniek) je koža atraktívnym cieľom pre DNA vakcináciu. Na intradermálne (subkutánne) podanie sa používa rad mikroihiel, ktorých dĺžka je niekoľko stoviek mikrónov. Existujú rôzne možnosti intradermálnej vakcinácie. Jednoduchšie je uvoľniť zrohovatenú vrstvu kože (vonkajšia vrstva kože, zvyčajne 10-20 mikrónov) pomocou radu mikroihiel, aby sa zvýšila jej priepustnosť pre ďalšiu lokálnu injekciu roztoku DNA. Efektívnejšie je použitie mikroihiel potiahnutých suchou vakcínou, ktorá sa rozpustí pod kožou. Účinnosť tejto metódy je zvyčajne nízka, pretože DNA najskôr vstupuje do medzibunkového priestoru a až potom je zahrnutá do buniek.

elektroporácia

Elektroporácia je tradičný prístup na dodávanie DNA do bakteriálnych buniek a bunkových kultúr založený na aplikácii elektrického impulzu. Takýto impulz vytvára póry v bunkovej membráne, čo uľahčuje vstup negatívne nabitej DNA. Táto metóda bola prijatá na dodávanie DNA vakcín zvieratám a ľuďom a môže výrazne zvýšiť účinnosť konvenčnej injekcie. Zariadenie na elektroporáciu obsahuje zdroj elektrického prúdu a jednorazovú mriežku, ktorá pozostáva zo striekačky a ihlových elektród. Striekačka vstrekuje vakcínu do svalového tkaniva a elektródy vytvárajú elektrické pole, ktoré uľahčuje vstup DNA do myocytov a dendritických buniek. Dodnes boli vyvinuté zariadenia, ktoré dokážu zvýšiť účinnosť očkovania 1000-krát v porovnaní s klasickou injekciou. Elektroporácia sa môže použiť na intramuskulárne aj subkutánne podanie DNA vakcíny. Nevýhodou je mierna bolestivosť v mieste vpichu, potreba špecializovaných prístrojov. Namiesto elektrického poľa je možné použiť magnetické pole. Takéto zariadenia fungujú na rovnakom princípe, ale v tomto prípade je postup úplne bezbolestný a menej poškodzuje bunky.

Pôsobenie elektrického poľa nielen zvyšuje absorpciu DNA vakcíny bunkami, ale stimuluje aj rozvoj imunitnej odpovede. Použitie elektroporácie vedie k menšiemu poškodeniu tkaniva - vzniká lokálny zápalový proces. Keď sú bunky poškodené, uvoľňujú sa chemokíny, takže sa k nim posielajú makrofágy, lymfocyty a dendritické bunky. Zvýšenie koncentrácie imunitných buniek v mieste vpichu zvyšuje účinnosť vakcíny.

Sonoporácia

Sonoporácia je metóda prenosu cudzej DNA do buniek pomocou ultrazvuku. Ultrazvuk zvyšuje priepustnosť bunkovej membrány, v dôsledku čoho exogénna DNA ľahšie preniká do bunky. Sonoporácia bola prvýkrát použitá na prenos génov do bunky v roku 1986. Táto metóda sa používa na zavedenie molekúl DNA do buniek rohovky, mozgu, kostného tkaniva, obličiek, pankreasu, embryonálneho tkaniva, kostrových a srdcových svalov. Sonoporácia je v porovnaní s inými metódami málo prebádaná, na zlepšenie jej účinnosti je potrebné oveľa viac úsilia, najmä na úrovni celého organizmu.

Balistická transfekcia

Balistická transfekcia je založená na ostreľovaní (bombardovaní) orgánov a tkanív mikročasticami ťažkých kovov (zlato, volfrám) s priemerom 1-3 mikróny obalenými molekulami DNA. Takto zavedená DNA vakcína je exprimovaná v cieľových bunkách a ich produkty vstupujú do krvného obehu. Na zabezpečenie zrýchlenia častíc sa používa zariadenie podobné ručným zbraniam - génová pištoľ alebo génová pištoľ. Mikročastice prechádzajú cez bunkové membrány a nesú genetický konštrukt priamo do bunkového jadra. Hĺbka prieniku mikročastíc je spravidla malá - do 1 mm, takže metóda sa používa hlavne na transfekciu kože alebo priľahlého tkaniva chrupavky. Špeciálne podmienky lúskania umožňujú mikročasticiam preniknúť do hĺbky 4-5 mm a preniesť génové konštrukty do priečne pruhovaných svalových vlákien. Typicky bunky umiestnené priamo v strede výstrelu umierajú, zatiaľ čo v zóne 0,6-1 cm od stredu sú najúspešnejšie protransformované bunky. Táto technológia sa nazýva aj biobalistika alebo biolistika.

Prvú génovú pištoľ vytvorila skupina vedcov v rokoch 1983 až 1986 s cieľom transformovať rastlinné bunky. Bola to pištoľ vyvinutá zo zariadenia na automatické pribíjanie klincov. DNA z reportérového (markerového) génu bola aplikovaná na volfrámovú guľu a vstrelená do Petriho misky. Expresia reportérového génu indikovala účinnosť imunizácie. Dnes sa na prenos DNA používajú častice zlata alebo striebra, pretože na rozdiel od volfrámových nie sú pre bunku toxické.

Pod vysokým tlakom

V roku 1999 boli vyvinuté injekčné zariadenia, ktoré sú schopné podať DNA vakcínu bez použitia ihly. Takéto zariadenia fungujú vďaka Lorentzovej sile: malý silný magnet vytvára výrazný tlak, poháňa piest, ktorý vytláča drogu rýchlosťou zvuku. Zmenou sily prúdu si môžete zvoliť hĺbku vpichu a dávkovať lieky. Zákrok je úplne bezbolestný a predtým sa používal na podávanie inzulínu pacientom s cukrovkou a na rozsiahle očkovanie. Významnou nevýhodou tejto metódy je, že vysoký tlak môže teoreticky zmeniť štruktúru molekúl, ktoré sa vstrekujú. Táto technológia vkladania sa však stále zdokonaľuje a dnes boli vyvinuté zariadenia, ktoré dokážu dopraviť DNA do hĺbky až 16 mm.

Ako súčasť živého bakteriálneho vektora

Živé bakteriálne vektory sú kmene salmonela, Shigella alebo listéria, ktoré nesú mutáciu v biosyntéze alebo inváznych génoch, ktoré eliminujú patogenitu a schopnosť udržať si životaschopnosť v hostiteľskom organizme alebo prostredí. Namiesto toho sú potrebné gény pre imunogénne proteíny vložené do bakteriálneho genómu. Oslabená baktéria sa podáva perorálne (ústami, prehltnutím) alebo intranazálne (injekciou do nosového otvoru), takže tento spôsob očkovania nevyžaduje žiadne vybavenie. Okrem toho takéto podávanie stimuluje slizničnú imunitnú odpoveď, čo je dôležité, pretože väčšina patogénov vstupuje do tela cez ústa a nosové otvory. Obchádzajúc žalúdok, oslabená baktéria vstupuje do tenkého čreva. Ďalej baktéria preniká do Peerových plakov - črevných lymfatických uzlín. Keď sa baktérie dostanú do stredu Peyerových plátov, stanú sa cieľom pre makrofágy a podstúpia fagocytózu. V cytoplazme makrofágov baktéria uvoľní DNA vakcínu, po ktorej DNA vstúpi do jadra a baktériu zneškodní imunitný systém.

Balenie v lipozómoch

Lipozómy - sférické útvary (približne 100 nm v priemere), pozostávajúce z dvojitej lipidovej vrstvy. Lipozómy sú vo vnútri duté, ktoré sú zvyčajne naplnené rozpúšťadlom, ale môžu sa použiť na dodávanie rôznych látok vrátane DNA vakcín. Ich hydrofóbny obal im umožňuje splynúť s bunkovými membránami a transportovať ich obsah do bunky. Používanie lipozómov sa začalo v roku 1965 a toto sa stalo silným motorom pre rozvoj bionanotechnológie.

Sľubným spôsobom priameho zavedenia konštruktu DNA do cieľových buniek je dodanie genetického konštruktu ako súčasti katiónových lipozómov vytvorených z pozitívne nabitých lipidov. Katiónové lipozómy s negatívne nabitou molekulou DNA tvoria komplex DNA-lipid – lipoplex. Výhody používania takýchto komplexov sú schopnosť niesť veľké množstvo informácií, neinfekčnosť, navyše sú jednoduché a lacné na výrobu. V roku 2003 boli vytvorené extrémne malé milimikrónové lipozómy, ktoré sú potiahnuté polyetylénglykolovým polymérom, ktoré sú schopné prenášať terapeutickú DNA cez hematoencefalickú bariéru a dodávať ju do mozgových neurónov, čo bolo predtým nemožné.

Vyrobené z polyplexu

Polyplexy, systémy pozostávajúce z kladne nabitých polymérov (polykatióny) a záporne nabitých molekúl DNA, sa používajú na zavedenie veľkých konštruktov DNA (>10 kb) do bunky. Veľkosť takýchto komplexov je menšia ako 100 nm, čo ich na jednej strane vystavuje štiepeniu makrofágmi (keďže reagujú na častice väčšie ako 200 nm), a na druhej strane sú dostatočne veľké na to, aby neboli filtrované v obličky.

Polykatióny kondenzujú molekulu DNA do komplexov, čím zabezpečujú jej stabilitu a ochranu pred pôsobením nukleáz. Ako polyméry viažuce DNA môžu slúžiť katiónové proteíny, syntetické homopolyméry aminokyselín (polylyzíny, polyarginíny), polysacharid chitosanu, polyetylénamín. Zvyčajne je polykatión v zložení polyplexu v nadbytku, v dôsledku čoho je tento komplex rozpustný a kladne nabitý. Ak je ligand pre špecifický bunkový receptor pripojený k polyplexu, potom DNA vakcína môže byť nasmerovaná na špecifický typ bunky. Proces dodania genetického materiálu v rámci polyplexu zahŕňa dva stupne: extracelulárny (cesta z miesta vpichu do cieľových buniek) a intracelulárny (interakcia s cieľovými bunkami, endocytóza, výstup z endozómov, dodanie do jadra). Prvou bariérou, ktorú musí komplex prekonať, je krv a extracelulárna matrica. Preto sa vyberajú také fyzikálne a chemické parametre polyplexu, aby sa zvýšila jeho stabilita, zabránilo sa nežiaducim interakciám s krvnými proteínmi a imunitnej reakcii spôsobenej chemickou povahou polykatiónu. Keď je polyplex v cieľových bunkách, je absorbovaný na plazmatickej membráne, absorbovaný endocytózou, po ktorej musí opustiť endozóm a disociovať sa na katiónový polymér a molekulu DNA. Voľná ​​DNA je poslaná do jadra a polymérne katióny opúšťajú bunku a sú vylučované z tela.

Charakteristika najbežnejších spôsobov podávania DNA vakcín
Metóda	Výhody	Nedostatky
Intramuskulárne alebo subkutánne injekcie	Nevyžaduje sa žiadne špeciálne vybavenie Trvalý alebo dlhodobý prejav DNA sa prenáša do susedných tkanív	Nízka účinnosť Vyžaduje pomerne veľké množstvo DNA
elektroporácia	Vysoká účinnosť	poškodenie tkaniva
génová zbraň	Vysoká presnosť Vyžaduje malé množstvo DNA	Vyžaduje inertné mikročastice Poškodenie buniek v mieste výstrelu
Zavedenie v dôsledku vysokého tlaku	Relatívne jednoduchá metóda Nie sú potrebné mikročastice DNA môže preniknúť do hĺbky od niekoľkých mm do 1,5 cm	Ovplyvňuje štruktúru DNA Nízka účinnosť imunizácie Vyžaduje veľké množstvo DNA (až 300 mcg)
Balenie v lipozómoch	Vysoká účinnosť in vitro Jednoduchosť výroby Veľká kapacita Možno kombinovať s inými metódami Pri intravenóznom podaní má vakcína potenciál dostať sa do všetkých tkanív Intranazálne podanie zabezpečuje expresiu vakcíny v nosovej sliznici a produkciu imunoglobulínov triedy A (IgA)	Možná toxicita Nízka účinnosť in vivo

Mechanizmus vývoja imunitnej odpovede

Antigén syntetizovaný v bunke prechádza spracovaním, po ktorom je prezentovaný imunokompetentným bunkám. Spracovanie je štiepenie antigénneho proteínu na imunogénne peptidové fragmenty. Prezentácia znamená predloženie fragmentu antigénu spojeného s molekulami hlavného histokompatibilného komplexu (MHC) imunokompetentných buniek. Existujú dve najvýznamnejšie triedy týchto molekúl: MHC triedy I (MHC-I) a MHC triedy II (MHC-II). Na naviazanie na molekuly každej triedy sa antigén pripravuje v špecializovaných kompartmentoch bunky. Endogénne antigénne proteíny sú nasmerované do proteazómu na degradáciu, po ktorej sú prezentované v komplexe s MHC-I na bunkovom povrchu. Tu, keď sa stretnú, sú rozpoznané CD8+ T-bunkami (T-killers), ktoré implementujú cytotoxickú imunitnú odpoveď. Exogénne proteíny sú štiepené lysomnimálnymi proteázami, inkorporované do MHC-II a rozpoznávané CD4+ T-bunkovými (T-helper) receptormi. Posledne menované spôsobujú bunkové aj humorálne reakcie.

Prezentácia antigénu dráhou MHC-I

DNA vakcinácia zahŕňa endogénnu syntézu antigénu, takže táto cesta prevláda. Spracovanie antigénu pozdĺž dráhy MHC-I prebieha v niekoľkých krokoch. Proteín syntetizovaný v jadre je transportovaný do cytoplazmy, proteazóm je štiepený na krátke peptidy - epitopy, ktoré sú pomocou špeciálnych antigénových transportných proteínov (TAP) prenesené do endoplazmatického retikula (EPR). V EPR je každý epitop kombinovaný s molekulou MHC-I, po čom je vytvorený komplex odoslaný do Golgiho aparátu (AG) na glykozyláciu. Odtiaľ má komplex v zložení vezikuly tendenciu k plazmatickej membráne. Po fúzii vezikuly s plazmatickou membránou sa komplex objaví na povrchu bunky, kde ho rozpoznávajú T-killer receptory, ktoré majú cytotoxickú aktivitu.

Prezentácia antigénu dráhou MHC-II

Hlavným zdrojom peptidov, ktoré sa viažu na MChS-II, sú exogénne proteíny, ktoré vstúpili do bunky endocytózou. Ukázalo sa však, že niektoré intracelulárne proteíny môžu byť prítomné aj v komplexe s MChS-II. V tomto prípade sú novosyntetizované proteíny po vstupe do cytoplazmy prenesené do lyzozómov, kde sa antigén štiepi pôsobením kyslých proteáz. Potom sa lyzozóm obsahujúci epitopy spojí s vezikulou, ktorá nesie molekulu MChS-II. Vo vnútri zjednotenej vezikuly sa vytvorí komplex epitop-MChS-II, ktorý sa po fúzii vezikuly s plazmalemou dostane na povrch bunky. Tu je tento komplex rozpoznávaný T-helper receptormi, čo vedie k ich aktivácii. To vedie k stimulácii bunkovej (aktivácia T-killerov) aj humorálnej imunity (aktivácia B-lymfocytov).

Tradičná vakcinácia rozpustnými proteínovými antigénmi je zameraná na mobilizáciu T-pomocníkov. Relatívne nízka odpoveď T-helperov je jednou z nevýhod DNA vakcín. Súčasná generácia DNA vakcín tiež nie je schopná vyvolať produkciu vysokých titrov protilátok. Na zvýšenie aktivácie pomocných T-buniek musí byť antigén presmerovaný do dráhy MChS-II. Na tento účel je do DNA vakcíny zabudovaný signál lyzozomálnej lokalizácie; syntetizovaný antigén bude poslaný do lyzozómov, čo znamená, že sa vydá cestou MChS-II

Stratégie na zlepšenie účinnosti DNA vakcíny

Hlavná otázka týkajúca sa budúcnosti DNA vakcín sa týka toho, ako zvýšiť ich účinnosť. V súčasnosti prebieha veľké množstvo štúdií na optimalizáciu vyvinutých DNA vakcín. Hľadanie riešenia sa uskutočňuje dvoma smermi: zvýšením expresie vakcíny a zvýšením imunogenicity kódovaného antigénu.

Optimalizácia transkripčných prvkov

Dôležitou zložkou DNA vakcíny je promótor. Bakteriálne promótory nie sú vhodné na antigénnu expresiu v cicavčích bunkách, preto sa namiesto nich použili promótory onkogénnych vírusov. Teraz, aby sa zlepšila bezpečnosť vakcín, boli nahradené promótormi z nekarcinogénnych predmetov, ako je ľudský cytomegalovírus (CMV). Pre väčšinu DNA vakcín je tento promótor optimálnou voľbou: je vysoko exprimovaný v širokom spektre buniek. Pre génovú expresiu v špecifických tkanivách je sľubné použitie promótorov špecifických pre tento typ tkaniva. Napríklad použitie svalového promótora CPK pri podávaní vedie k desaťnásobnému zvýšeniu syntézy protilátok a indukcii odpovede T-buniek ako použitie podobnej DNA vakcíny s promótorom CMV. Promótor génu desmin kódujúci jeden z cytoskeletálnych proteínov tiež vykazoval vysokú účinnosť v myocytoch. Na zvýšenie expresie DNA vakcíny v keratinocytoch (bunkách epitelového tkaniva) sa používajú promótory génu pre metalotioneín (proteín, ktorý viaže ťažké kovy) alebo gén 3 hydroxylázy vitamínu D.

Úroveň iniciácie transkripcie má tendenciu sa zvyšovať za užívateľský účet silný promótor a zosilňovač, a ukončovacie funkcie sa môžu stať limitujúcim faktorom. Účinnosť polyadenylácie a spracovania primárneho transkriptu RNA sa mení v závislosti od sekvencie polyA signálu. To znamená, že polyadenylačná sekvencia ovplyvňuje syntézu antigénu. Napríklad široko používaný signál polyA vírusu SV40 je menej účinný ako polyadenylačný signál génu králičieho p-globínu alebo génu rastového hormónu hovädzieho dobytka.

Pre efektívnu transláciu musí mať cicavčia mRNA tzv Kozákova sekvencia. Vloženie tejto sekvencie do DNA konštruktu môže výrazne zvýšiť úroveň syntézy antigénu. Aby RNA polymeráza nepreskočila stop kodón génu a neprebehla syntéza predĺženého proteínu, ktorý potom nemôže nadobudnúť správny tvar, môže byť gén ukončený dvojitá stop linka.

Pri navrhovaní DNA vakcín sa o to tiež snažia optimalizovať svoje kodóny. Optimalizačný postup znamená nahradenie kodónov v génovej sekvencii tak, že sa nemení aminokyselinová sekvencia proteínu, ale zvyšuje sa translačná účinnosť jeho mRNA. Dôvodom je, že väčšina aminokyselín je kódovaná viac ako jednou hranicou. Každý kodón má svoju tRNA a zastúpenie rôznych tRNA v bunke nie je rovnaké a líši sa aj v závislosti od typu organizmu. Kodóny sa vyberajú takým spôsobom, aby sa prítomnosť požadovanej tRNA počas syntézy antigénu nestala obmedzujúcim faktorom.

Antigénová optimalizácia

Sila imunitnej odpovede síce koreluje s úrovňou expresie DNA vakcíny, avšak pre každý antigén existuje určité plató, po ktorom zvýšenie množstva antigénneho proteínu zvýši tvorbu protilátok. Optimalizáciou antigénu možno zároveň dosiahnuť silnejšiu imunitnú odpoveď. Napríklad tým kombinovanie antigénu s ligandom na špecifický receptor pre bunky prezentujúce antigén. Takýmto ligandom môže byť CD40 markerový proteín, extracelulárna doména Fms-tvarovanej tyrozínkinázy-3 alebo T-killer antigén-4. V dôsledku interakcie ligand-receptor sa zvyšuje účinnosť zachytávania antigénneho proteínu APC.

Uľahčiť degradáciu antigénu v proteazóme alebo lyzozóme stimulujú aj imunitnú odpoveď. Na zvýšenie proteoliotického štiepenia antigénu sa do jeho sekvencie vloží ubikvitinačný signál. Chyba citácie: Nesprávne volanie: Vstup musí mať nepomenovaný ref tag. Použitie DNA vakcín kódujúcich namiesto celého antigénu, niekoľko epitopov rôzneho pôvodu, umožňuje výrazne rozšíriť spektrum imunitnej odpovede.

Pre protinádorové DNA vakcíny je kombinácia účinná „nádorový antigén + vírusový alebo bakteriálny antigén“. Napríklad kombinácia nádorového antigénu s epitopom tetanového toxínu výrazne zvyšuje aktiváciu zabíjačských T buniek proti rakovinovým bunkám.

Zahrnutie adjuvans

Pri použití tradičných vakcín sa k nim pridávajú adjuvans na zvýšenie imunitnej odpovede. DNA vakcína je bakteriálneho pôvodu, je teda sama o sebe imunostimulantom. Na zvýšenie imunitnej odpovede sa do DNA vakcíny vložia adjuvantné gény alebo sa použije ďalší plazmid, ktorý kóduje imunostimulačné proteíny.

Imunostimulačný účinok bakteriálnych CpG dinukleotidov

Funkcia plazmidu nie je obmedzená na dodávanie génov do buniek. Už v roku 1893 sa zistilo, že zmes bakteriálnych lyzátov znižuje progresiu rakovinových nádorov, ale až v roku 1983 sa zistilo, že imunostimulačné vlastnosti lyzátu sú spôsobené molekulami bakteriálnej DNA. V roku 1995 sa ukázalo, že imunitnú stimuláciu spôsobujú CpG motívy v bakteriálnej DNA. V baktériách, ako aj v DNA vírusoch, sú tieto motívy nemetylované. U ľudí a vyšších primátov naopak cytozín vo väčšine CpG dinukleotidov obsahuje metylovú skupinu. Preto sú CpG nemetylačné motívy vnímané ľudským telom ako molekulárne vzory spojené s patogénom (PAMP). Ramri zlúčeniny sú rozpoznávané Toll-like receptormi, ktoré sa v závislosti od typu ligandu delia na niekoľko typov. CpG nemetylačné motívy sú rozpoznávané receptorom TLR-9 umiestneným na membránach endoplazmatického retikula B lymfocytov, dendritických buniek a prirodzených zabíjačských buniek. Väzba receptora na nemetylované CpG motívy spúšťa kaskádu reakcií, ktoré indukujú syntézu prozápalových cytokínov – interferónu-1 a IL-12.

Expresia cytokínov a iných imunomodulátorov

Na DNA vakcináciu sa ako adjuvans najčastejšie používajú cytokínové gény. Cytokíny sú triedou proteínových molekúl, ktoré regulujú medzibunkové a medzisystémové interakcie v tele, najmä fungovanie imunitného systému. Všetky cytokíny, a je ich známych viac ako 30, môžu modulovať imunitnú odpoveď. Cytokíny IL2, IL-12, interferón γ, IL-15, IL-18 a IL-23 majú stimulačný účinok na T-pomocníkov prvej triedy. Cytokíny, ktoré modulujú pôsobenie T-pomocníkov druhej triedy, zahŕňajú: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 I IL-13. Typ cytokínu sa vyberie podľa toho, aký typ imunitnej odpovede sa má zvýšiť.

Pomocou chemokínov je možné dosiahnuť zvýšenie imunitnej odpovede. Chemokíny sú skupinou cytokínov, ktoré môžu spôsobiť chemotaxiu citlivých buniek, vrátane imunitných. Chemokínové receptory sa nachádzajú najmä na chemokínových bunkách prezentujúcich antigén. Väzba chemokínu na jeho receptor vedie k endocytóze komplexu antigén-chemokín vo vnútri APC. Táto stratégia sa efektívne využíva ako pri vývoji antivírusových DNA vakcín, tak aj protinádorových.

Funkciu adjuvans môže plniť aj proteín HSP70 (proteíny tepelného šoku, proteíny tepelného šoku). Imunostimulačný účinok HSP70 je založený na jeho schopnosti vstúpiť do extracelulárneho priestoru a viazať sa na APC receptory. Mechanizmus transportu HSP70 smerom von ešte nie je úplne objasnený, ale s najväčšou pravdepodobnosťou existuje niekoľko spôsobov - exocytóza, sekrécia smerom von alebo výstup cez kanál. Väzba HSP70 na jeho receptor vedie k aktivácii dendritických buniek, sprostredkúva prezentáciu antigénu a stimuluje produkciu chemokínov. Pretože antigén je fúzovaný s HSP70, vstupuje aj do extracelulárneho priestoru, takže môže byť prezentovaný cestou MES-II a aktivovať B bunky. DNA vakcíny používajú bakteriálny gén HSP70, aby sa vyhli autoimunitným reakciám.

Výhody a nevýhody DNA vakcín

Metóda DNA vakcinácie má množstvo výhod, z ktorých najdôležitejšia je spustenie humorálnej aj bunkovej imunitnej odpovede. Vakcíny na báze DNA poskytujú dlhodobú expresiu antigénu a teda stabilnú imunitnú odpoveď. Ďalšie faktory, ktoré riadia vývoj imunizácie DNA, zahŕňajú jednoduchosť a nízke náklady na výrobu vakcíny.

Výhody

Nedostatky

Antigén získava prirodzenú konformáciu Aktivácia oboch vetiev imunity: humorálnej a bunkovej Syntetizovaný antigén môže byť selektívne nasmerovaný na dráhu MES-I alebo MES-II Môže selektívne pôsobiť na rôzne populácie T-pomocníkov Poskytnite dlhodobú expresiu antigénu Jednoduchá a rýchla výroba Nízke výrobné náklady Nevyžadujú sa špeciálne skladovacie podmienky Môže sa použiť na prevenciu aj liečbu chorôb Potenciálne účinný proti širokému spektru ochorení: bakteriálne, vírusové, autoimunitné a nádorové ochorenia

Slabá imunogenicita V prípade vírusových vektorov existuje riziko integrácie cudzej DNA do bunkového genómu Možný vývoj autoimunitných reakcií Plazmidové a vírusové vektory môžu vyvolať nešpecifickú imunitnú odpoveď

Použitie DNA vakcín

Prvé klinické štúdie DNA vakcín spolu s bezpečnosťou novej metódy preukázali jej nízku účinnosť. Vedecké laboratóriá spolu s biotechnologickými spoločnosťami si uvedomili prísľub DNA imunizácie a nasmerovali svoje úsilie na optimalizáciu novej metódy a v priebehu niekoľkých rokov sa dosiahol významný pokrok. V roku 2005 získala prvá DNA vakcína schválenie FDA. Úrad pre potraviny a liečivá) na použitie u zvierat. Od roku 2013 je viac ako sto DNA vakcín v klinických skúškach a štyri DNA vakcíny sú licencované na použitie v živočíšnej výrobe.

DNA vakcíny vo veterinárnej medicíne

Všetky štyri vakcíny schválené FDA sú založené na plazmidoch. Pri troch z nich výrobca odporučil spôsob podania – intramuskulárne, pri vakcíne LifeTide® injekciu kombinovanú s elektroporáciou. Ak sú ostatné vakcíny zamerané na aktiváciu imunitného systému, potom pre vakcínu LifeTide® je imunostimulačný účinok dodatočný. Produktom vakcíny je somatoliberín, hormón, ktorý stimuluje uvoľňovanie rastového hormónu a prolaktínu hypofýzou. Pôsobenie posledných dvoch hormónov u ošípaných vedie k zvýšeniu hmotnosti zvierat a zvýšeniu počtu vrhov. Súčasne zavedenie plazmidu kódujúceho somatoliberín do zvierat stimuluje produkciu T-lymfocytov, prirodzených zabijakov, a preto zvyšuje imunitnú odolnosť organizmu.

Značka vakcíny	Rok licencie	Cieľ	Zviera	Očkovací produkt	Účel vakcíny
West Nile-Innovator® (USA)	2005	Vírus západného Nílu	Kone	Štrukturálny proteín vírusu PreM-E	Ochrana pred vírusom
Apex-IHN® (Kanada)	2005	Pôvodca infekčnej nekrózy hematopoetického tkaniva	Ryby z rodiny lososov	Vírusový glykoproteín	Zvýšenie množstva a kvality krmiva pre ryby
LifeTide® SW 5 (Austrália)	2008	Rastový hormón	Ošípané a iné hospodárske zvieratá	Prasací somatoliberín	Zvýšená podstielka u prasníc; významne znižuje zníženie perinatálnej mortality a morbidity
ONCEPT® (USA)	2010	Melanóm	Psy	Ľudská tyrozináza	Ako alternatíva radiačnej terapie a chirurgického zákroku pri liečbe melanómu

Vyhliadky na očkovanie DNA

DNA vakcíny proti rakovine

Zatiaľ čo indukcia bunkovej a humorálnej imunitnej odpovede bola presvedčivo preukázaná pre cudzie antigény spojené s infekčnými ochoreniami, použitie DNA vakcín na liečbu rakoviny je zatiaľ menej úspešné. Vyvolanie účinnej protinádorovej imunity je náročná úloha. Klinické štúdie potvrdili celkovú bezpečnosť a nízku toxicitu protinádorových DNA vakcín, avšak účinnosť imunitnej odpovede, ktorú vyvolali, sa ukázala byť slabá a protinádorová aktivita je v niektorých prípadoch všeobecne pochybná.

DNA vakcíny proti vírusovým a bakteriálnym patogénom

DNA vakcína proti zubnému kazu

Príčinou zubného kazu je lokálna zmena pH v dôsledku fermentácie (glykolýzy) sacharidov uskutočňovanej baktériami. Vedci z Wuhanského virologického inštitútu (Čína) vyvinuli DNA vakcínu namierenú proti jednému z patogénov zubného kazu - Streptococcus mutans. Vakcína je založená na plazmide a kóduje dva proteíny: povrchový proteín St. mutans PAc a bičík, odvodený z baktérie Salmonella ktorý pôsobí ako adjuvans. V štádiu predklinických štúdií bola vakcína aplikovaná cez nos laboratórnym hlodavcom, následne bola u zvierat skontrolovaná hladina imunoglobulínov G v krvnom sére a sekrečných imunoglobulínov A v slinách. Po štúdiách vedci zistili, že hladina imunitných proteínov v krvi a slinách sa zvýšila, ale čo je dôležitejšie, rast kolónií bol inhibovaný. Streptococcus mutans na zubnej sklovine. To znamená, že zuby očkovaných zvierat boli lepšie chránené pred kazom.

DNA vakcíny a liečby autoimunitných ochorení

DNA vakcína proti cukrovke 1

Diabetes mellitus 1. typu je charakterizovaný stratou beta buniek produkujúcich inzulín, ktoré sa nachádzajú v Langerhansových ostrovčekoch pankreasu. Hlavnou príčinou straty beta buniek je autoimunitné poškodenie zabíjačskými T bunkami. Na ochranu beta buniek pred nadmerne aktívnym imunitným systémom vyvinuli vedci z univerzít Stanford (USA) a Leiden (Holandsko) DNA vakcínu BHT-3021. Vakcína bola vytvorená na báze plazmidu a kóduje prekurzor inzulínu, proinzulín. Ide o retroaktívnu vakcínu: ak majú konvenčné vakcíny aktivovať imunitné reakcie, potom BHT-3021 naopak neutralizuje cytotoxický účinok T-killerov namierených proti Langerhansovým ostrovčekom.

V prvej fáze klinických skúšok preukázal BHT-3021 svoju účinnosť v skupine 80 ľudí. Polovica z nich dostávala intramuskulárne injekcie BHT-3021 každých sedem dní počas 12 týždňov a druhá polovica dostávala placebo. Po tomto období skupina, ktorá dostala vakcínu, vykazovala zvýšenie hladiny C-peptidov v krvi, čo poukazuje na obnovenie funkcie beta-buniek. U jedného z účastníkov neboli zaznamenané žiadne závažné vedľajšie účinky. Účinok vakcíny sa udržal 2 mesiace.

Úvod

1 Hlavné skupiny enzýmov genetického inžinierstva

1.1 Reštrikčné enzýmy

1.1.1 Mechanizmus účinku restriktáz

1.1.2 Konštrukcia máp obmedzení

1.3 Ligázy

2 Zavedenie nového génu do bunky

2.1 Regulácia génovej expresie u prokaryotov

2.2 Spôsoby priameho zavedenia génu do bunky

2.3 Zavedenie génov do buniek cicavcov

2.4 Genetická transformácia somatických buniek cicavcov

2.5 Génová terapia

2.6 Získavanie transgénnych zvierat

Záver

Bibliografia

Úvod

Genetické inžinierstvo je in vitro konštrukcia funkčne aktívnych genetických štruktúr (rekombinantná DNA), alebo inými slovami, vytváranie umelých genetických programov (Baev A.A.). Genetické inžinierstvo je podľa E. S. Piruzyana systém experimentálnych metód, ktoré umožňujú v laboratóriu (v skúmavke) konštruovať umelé genetické štruktúry vo forme takzvaných rekombinantných alebo hybridných molekúl DNA.

Hovoríme o riadenej, podľa vopred stanoveného programu, výstavbe molekulárno-genetických systémov mimo tela s ich následným zavedením do živého organizmu. V tomto prípade sa rekombinantná DNA stáva integrálnou súčasťou genetického aparátu organizmu príjemcu a prepožičiava mu nové jedinečné genetické, biochemické a následne fyziologické vlastnosti.

Cieľom aplikovaného genetického inžinierstva je navrhnúť také molekuly rekombinantnej DNA, ktoré by po zavedení do genetického aparátu poskytli telu vlastnosti užitočné pre ľudí.

Technológia rekombinantnej DNA využíva nasledujúce metódy:

Špecifické štiepenie DNA reštrikčnými nukleázami, urýchlenie izolácie a manipulácie s jednotlivými génmi;

Rýchle sekvenovanie všetkých nukleotidov purifikovaného fragmentu DNA, ktoré vám umožňuje určiť hranice génu a ním kódovanú sekvenciu aminokyselín;

Konštrukcia rekombinantnej DNA;

Hybridizácia nukleových kyselín, ktorá umožňuje detekciu špecifických sekvencií RNA alebo DNA s väčšou presnosťou a citlivosťou na základe ich schopnosti viazať komplementárne sekvencie nukleových kyselín;

DNA klonovanie: in vitro amplifikácia polymerázovou reťazovou reakciou alebo vloženie fragmentu DNA do bakteriálnej bunky, ktorá po takejto transformácii tento fragment reprodukuje v miliónoch kópií;

Zavedenie rekombinantnej DNA do buniek alebo organizmov.

História genetického inžinierstva

Genetické inžinierstvo sa objavilo vďaka práci mnohých výskumníkov v rôznych odvetviach biochémie a molekulárnej genetiky. Po mnoho rokov sa proteíny považujú za hlavnú triedu makromolekúl. Dokonca sa predpokladalo, že gény sú proteínovej povahy. Až v roku 1944 Avery, McLeod a McCarthy ukázali, že DNA je nositeľom dedičnej informácie. Odvtedy sa začalo intenzívne štúdium nukleových kyselín. O desaťročie neskôr, v roku 1953, J. Watson a F. Crick vytvorili model dvojvláknovej DNA. Tento rok sa považuje za rok zrodu molekulárnej biológie.

Na prelome 50. a 60. rokov 20. storočia boli objasnené vlastnosti genetického kódu a koncom 60. rokov bola experimentálne potvrdená jeho univerzálnosť. Došlo k intenzívnemu rozvoju molekulárnej genetiky, ktorej objektom boli E. coli, jej vírusy a plazmidy. Boli vyvinuté metódy na izoláciu vysoko purifikovaných prípravkov intaktných molekúl DNA, plazmidov a vírusov. DNA vírusov a plazmidov bola zavedená do buniek v biologicky aktívnej forme, čím sa zabezpečila jej replikácia a expresia zodpovedajúcich génov. V 70. rokoch bolo objavených množstvo enzýmov, ktoré katalyzujú reakcie transformácie DNA. Pri vývoji metód genetického inžinierstva zohrávajú osobitnú úlohu reštrikčné enzýmy a DNA ligázy.

História vývoja genetického inžinierstva sa dá rozdeliť do troch etáp. Prvá etapa je spojená s preukázaním zásadnej možnosti získania molekúl rekombinantnej DNA in vitro. Tieto práce sa týkajú produkcie hybridov medzi rôznymi plazmidmi. Bola preukázaná možnosť vytvorenia rekombinantných molekúl pomocou pôvodných molekúl DNA z rôznych druhov a kmeňov baktérií, ich životaschopnosť, stabilita a fungovanie.

Druhá etapa je spojená so začiatkom prác na získavaní rekombinantných molekúl DNA medzi chromozomálnymi génmi prokaryotov a rôznych plazmidov, čo dokazuje ich stabilitu a životaschopnosť.

Treťou etapou je začiatok prác na inklúzii eukaryotických génov, najmä živočíšnych, do molekúl vektorovej DNA (DNA slúžiaca na prenos génov a schopná integrácie do genetického aparátu bunky príjemcu).

Formálne treba za dátum zrodu genetického inžinierstva považovať rok 1972, keď P. Berg, S. Cohen, H. Boyer a spolupracovníci vytvorili prvú rekombinantnú DNA obsahujúcu fragmenty DNA vírusu SV40, bakteriofága a E. coli v Stanforde. univerzite.

1 Hlavné skupiny enzýmov genetického inžinierstva

Genetické inžinierstvo je potomkom molekulárnej genetiky, ale za svoj zrod vďačí úspechom genetickej enzymológie a chémie nukleových kyselín, keďže enzýmy sú nástrojmi molekulárnej manipulácie. Ak niekedy vieme pracovať s bunkami a bunkovými organelami pomocou mikromanipulátorov, tak pri práci s makromolekulami DNA a RNA nepomôžu žiadne, ani tie najmenšie mikrochirurgické nástroje. Čo robiť? Enzýmy fungujú ako "skalpel", "nožnice" a "nite na šitie".

Iba oni dokážu nájsť určité sekvencie nukleotidov, „vyrezať“ tam molekulu, alebo naopak „zatracovať“ dieru v reťazci DNA. Tieto enzýmy pracujú v bunke už dlhší čas, vykonávajú prácu na replikácii DNA (zdvojení) pri delení buniek, oprave poškodenia (obnovenie celistvosti molekuly), v procesoch čítania a prenosu genetickej informácie z bunky do bunky resp. v bunke. Úlohou genetického inžiniera je vybrať enzým, ktorý by spĺňal stanovené úlohy, to znamená, že by mohol pracovať s konkrétnym úsekom nukleovej kyseliny.

Treba si uvedomiť, že enzýmy používané v genetickom inžinierstve nie sú druhovo špecifické, takže experimentátor môže spojiť fragmenty DNA akéhokoľvek pôvodu do jedného celku v ním zvolenej sekvencii. To umožňuje genetickému inžinierstvu prekonať druhové bariéry vytvorené prírodou a uskutočniť medzidruhové kríženie.

Enzýmy používané pri konštrukcii rekombinantnej DNA možno rozdeliť do niekoľkých skupín:

Enzýmy, ktoré produkujú fragmenty DNA (reštrikčné enzýmy);

Enzýmy, ktoré syntetizujú DNA na templáte DNA (polymeráza) alebo RNA (reverzná transkriptáza);

Enzýmy, ktoré spájajú fragmenty DNA (ligázy);

Enzýmy, ktoré umožňujú meniť štruktúru koncov fragmentov DNA.

1.1 Reštrikčné enzýmy

Všeobecne sa uznáva, že výrazy "reštrikčný enzým", "reštrikčná endonukleáza" a "miestne špecifická endodeoxyribonukleáza" sa považujú za synonymá.

Všetky bakteriálne reštrikčné endonukleázy rozpoznávajú špecifické, skôr krátke sekvencie DNA a viažu sa na ne. Tento proces je sprevádzaný rozrezaním molekuly DNA buď na samotnom rozpoznávacom mieste alebo na inom mieste, ktoré je určené typom enzýmu. Spolu s reštrikčnou aktivitou má bakteriálny kmeň schopnosť metylovať DNA; tento proces sa vyznačuje rovnakou špecifickosťou pre sekvencie DNA ako pre reštrikciu. Metyláza pridáva metylové skupiny k adenínovým alebo cytozínovým zvyškom na rovnakom mieste, kde sa viaže reštrikčný enzým. V dôsledku metylácie sa miesto stáva odolným voči reštrikcii. Preto metylácia chráni DNA pred prerezaním.

Existujú 3 hlavné triedy obmedzení: 1, 2 a 3.

Všetky reštrikčné enzýmy rozpoznávajú presne definované sekvencie na dvojvláknovej DNA, ale reštrikčné enzýmy 1. triedy vykonávajú zlomy v ľubovoľných bodoch molekuly DNA a reštrikčné enzýmy 2. a 3. triedy rozpoznávajú a štiepia DNA v presne definovaných bodoch v rámci molekuly DNA. rozpoznávacie miesta alebo v pevnej vzdialenosti od nich.vzdialenosť.

Enzýmy typu 1 a 3 majú komplexnú podjednotkovú štruktúru a majú dva typy aktivít – modifikujúcu (metylačnú) a ATP-dependentnú endonukleázu.

Enzýmy druhej triedy pozostávajú z 2 samostatných proteínov: reštrikčnej endonukleázy a modifikujúcej metylázy, preto sa v genetickom inžinierstve používajú iba enzýmy triedy 2. Potrebujú horčíkové ióny ako kofaktory.

V súčasnosti bolo izolovaných viac ako 500 restriktáz triedy 2, avšak medzi enzýmami izolovanými z rôznych mikroorganizmov sú také, ktoré rozpoznávajú rovnaké sekvencie na DNA. Takéto páry alebo skupiny sa nazývajú izoschizoméry. Pravá izoschizoméria sa rozlišuje, keď enzýmy rozpoznávajú rovnakú nukleotidovú sekvenciu a zlomia DNA v rovnakých bodoch, a falošná, keď enzýmy, rozpoznávajúce rovnaké miesto na DNA, robia zlomy v rôznych bodoch toho istého miesta.

Väčšina restriktáz triedy 2 rozpoznáva sekvencie obsahujúce od 4 do 6 nukleotidových párov, takže restriktázy sú rozdelené na malé a veľké. Reštrikčné enzýmy s malým štiepením rozpoznávajú tetranukleotid a zavádzajú do molekúl oveľa viac zlomov ako reštrikčné enzýmy s veľkým štiepením, ktoré rozpoznávajú sekvenciu šiestich nukleotidových párov. Je to spôsobené tým, že pravdepodobnosť výskytu určitej sekvencie štyroch nukleotidov je oveľa vyššia ako sekvencie šiestich nukleotidov. Napríklad 40 000 bp DNA bakteriofága T7 nemá sekvenciu rozpoznávanú R1 z E. coli.

Malé štiepiace sa restriktázy zahŕňajú Hpa II a Alu (z Arthrobacter luteus), veľké štiepenie - Eco R I (z Escherichia coli) a Hind III. Ak predpokladáme, že rozpoznávacie miesta reštrikčných enzýmov sú náhodne rozdelené pozdĺž reťazca DNA, potom by sa cieľ pre enzýmy rozpoznávajúce sekvenciu (miesto) štyroch nukleotidov mal vyskytovať v priemere 1 krát každých 256 párov báz a pre enzýmy rozpoznávajúce šesť nukleotidov po 4096 párov báz. Ak je reštrikčné miesto vo vnútri génu, potom ošetrenie DNA reštrikčným enzýmom povedie k jeho inaktivácii. Pravdepodobnosť takejto udalosti je veľmi vysoká pri liečbe maloreznými restriktázami a nevýznamná pri použití veľkorezných endonukleáz. Preto sa na získanie intaktného génu uskutočňuje štiepenie striedavo niekoľkými veľkými reznými restriktázami, alebo sa používa metóda „podreštrikcia“, t.j. obmedzenie sa uskutočňuje za podmienok, keď štiepenie prebieha len na jednom mieste.

Početné štúdie ukazujú, že použitie rôznych vírusov je veľmi efektívnym riešením, čo vám umožňuje dostať sa cez imunitnú obranu tela a potom infikovať bunky a použiť ich na šírenie vírusu. Na uskutočnenie tohto postupu genetickí inžinieri vybrali najvhodnejšie vírusy zo skupiny retrovírusov a adenovírusov. Retrovírusy prinášajú genetickú informáciu vo forme ribonukleovej kyseliny (RNA), molekuly podobnej DNA, ktorá pomáha spracovať genetickú informáciu uloženú v DNA. Len čo je možné preniknúť hlboko do takzvanej cieľovej bunky, z molekuly RNA sa získa kópia molekuly DNA. Tento proces sa nazýva reverzná transkripcia. Akonáhle je nová molekula DNA pripojená k bunke, všetky nové kópie bunky budú obsahovať tento modifikovaný gén.

Adenovírusy nesú genetickú informáciu okamžite vo forme DNA, ktorá je doručená do nedeliacej sa bunky. Hoci tieto vírusy dodávajú DNA priamo do jadra cieľovej bunky DNA nezapadá do genómu bunky. Takto upravený gén a genetická informácia neprechádzajú do dcérskych buniek. Výhodou génovej terapie realizovanej adenovírusmi je, že je možné zaviesť gény do buniek nervového systému a do sliznice dýchacieho traktu opäť pomocou vektora. Okrem toho existuje tretí spôsob génovej terapie, ktorý sa uskutočňuje prostredníctvom takzvaných adeno-asociovaných vírusov. Tieto vírusy obsahujú relatívne malé množstvo genetickej informácie a je oveľa ťažšie ich eliminovať ako retrovírusy a adenovírusy. Výhodou adeno-asociovaných vírusov je však to, že nevyvolávajú reakciu ľudského imunitného systému.

Genealogická metóda antropogenetiky

Základom tejto metódy je zostavovanie a rozbor rodokmeňov. Táto metóda je široko používaná od staroveku až po súčasnosť pri chove koní, výbere cenných línií hovädzieho dobytka a ošípaných, pri získavaní čistokrvných psov, ako aj pri chove nových plemien kožušinových zvierat.

Ako metóda štúdia genetiky človeka sa genealogická metóda začala používať až od začiatku 20. storočia, keď sa ukázalo, že rozbor rodokmeňov, v ktorých možno nahradiť prenos niektorej vlastnosti (choroby) z generácie na generáciu hybridologickou metódou, ktorá je v skutočnosti pre človeka nepoužiteľná.

Pri zostavovaní rodokmeňov je zdrojom človek – proband, ktorého rodokmeň sa skúma. Zvyčajne je to buď pacient, alebo nositeľ určitého znaku, ktorého dedičnosť je potrebné študovať. Pri zostavovaní genealogických tabuliek sa používajú symboly navrhnuté G. Yustom v roku 1931 (obr. 6.24). Generácie sa označujú rímskymi číslicami, jednotlivci v danej generácii sa označujú arabskými číslicami.

Pomocou genealogickej metódy možno určiť dedičnú podmienenosť študovaného znaku, ako aj typ jeho dedičnosti (autozomálne dominantné, autozomálne recesívne, X-viazané dominantné alebo recesívne, Y-viazané). Pri analýze rodokmeňov pre niekoľko znakov možno odhaliť prepojený charakter ich dedičnosti, čo sa používa pri zostavovaní chromozómových máp. Táto metóda umožňuje študovať intenzitu mutačného procesu, hodnotiť expresivitu a penetráciu alely. Je široko používaný v lekárskom genetickom poradenstve na predpovedanie potomstva. Treba však poznamenať, že genealogická analýza sa stáva oveľa komplikovanejšou, keď majú rodiny málo detí.

Proces zavádzania rekombinantnej DNA do bakteriálnej bunky sa nazýva tzv transformácia. Výsledkom transformácie je získanie nových sekvencií DNA a následne nových fenotypových znakov hostiteľskou bunkou, napríklad rezistencia na niektoré antibiotiká. Hostiteľská bunka použitá v takýchto experimentoch musí mať najmä určitý fenotyp r-, t.j. nemal by obsahovať reštrikčné enzýmy; musí byť neschopný všeobecnej rekombinácie ( recA-) takže exogénna DNA nie je modifikovaná homológnou rekombináciou. Jednou z najpoužívanejších kultúr na tento účel je laboratórny kmeň baktérií. E.coli- kmeň K12.

Bunky, ktoré môžu absorbovať cudziu DNA, sa nazývajú kompetentných. kompetencie E. coli je potrebné vyvolať a niektoré iné baktérie majú túto vlastnosť spočiatku. Podiel kompetentných buniek možno zvýšiť použitím špeciálneho živného média alebo kultivačných podmienok. V prípade baktérií odolných voči chemickým induktorom spôsobilosti alebo bez prirodzenej kompetencie sa používajú iné systémy dodávania DNA.

Najčastejšie používané metódy transformácie bakteriálnych buniek v laboratórnej praxi sú:

Transformácia E.coli pôsobením chloridu vápenatého;

elektroporácia– zvýšenie priepustnosti buniek vplyvom prúdového impulzu s trvaním ~4,5 ms;

Výsledky transformácie možno kvantifikovať: určením buď frekvencia, alebo efektívnosť transformácií.

Frekvencia transformácie je podiel buniek v populácii buniek, ktoré dostali cudziu DNA; vyjadrené ako počet transformantov k celkovému počtu buniek.

Účinnosť transformácie- počet transformantov na 1 ug DNA odobratej na transformáciu.

Informácie o klonovaní rekombinantnej DNA pomocou plazmidového vektora pBR322 uvedené v tejto časti sú zhrnuté vo forme experimentálnej schémy a sú uvedené na obrázku 20.

Ryža. 20. Klonovanie DNA v plazmidovom vektore pBR322

1, 2, 3, 4 a 5 - fázy postupu klonovania (pozri text).

1. DNA pBR322 sa štiepi reštrikčnou endonukleázou Pstl v mieste ampicilínovej rezistencie.

2. Fragmenty donorovej DNA, tiež získané použitím PstI a s lepivými koncami, ako je linearizovaný vektor pBR322, sa ligujú do vektorovej DNA pomocou DNA ligázy. Dôsledkom vytvorenia takéhoto konštruktu je deštrukcia génu, ktorý poskytuje rezistenciu na ampicilín. Takto sa vytvorí rekombinantná DNA, keď sa zavedie do buniek E.coli nebudú schopné zabezpečiť ich prežitie na médiu s ampicilínom.

3. Bunky E.coli transformovať rekombinantnou DNA.

4. Po transformačnom postupe sa bunková suspenzia umiestni na agarové platne a živné médium obsahujúce antibiotikum tetracyklín. V tomto štádiu nastáva selekcia, t.j. výber buniek, ktoré sú schopné rásť na médiu s tetracyklínom. Bunky pestované na tomto agare obsahujú rekombinantnú DNA a pBR322 DNA, ktoré neobsahujú inzert donorovej DNA; obnovili pôvodnú štruktúru vektora.

5. Jednotlivé bunkové kolónie E.coli pestované na pohári s tetracyklínom, subkultúra dvoch pohárov na pohároch, z ktorých jeden obsahuje agar s ampicilínom a druhý s tetracyklínom. Bunky obsahujúce rekombinantnú plazmidovú DNA rastú iba na tetracyklínovom agare, pretože gén, ktorý poskytuje rezistenciu na ampicilín, je deštruktúrovaný v dôsledku inzercie donorovej DNA. Kým bunky z pôvodného, ​​t.j. izolovaného pBR322 vektora DNA rastú na oboch platniach, pretože gény pre rezistenciu na obe antibiotiká sú v natívnych, t.j. v pôvodnom stave.

Z buniek vybraných klonov E.coli extrahovať plazmidovú DNA a analyzovať jej štruktúru.

Iné plazmidové vektory

Éra vektora pBR322, ktorú začali Bolivar a Rodriguez na samom začiatku 80. rokov, trvá dodnes. Avšak pri všetkej svojej spoľahlivosti a klasickej zhode so všetkými požiadavkami na vektory má tento vektor len niekoľko vhodných miest na klonovanie. Navyše selekcia transformovaných buniek v experimentoch s rekombinantnou DNA na jej základe trvá dlho. Bolo potrebné vyvinúť alternatívne, pokročilejšie, klonovacie systémy. Tak bola vytvorená skupina vektorov rodiny pUC. V názve vektorov tejto rodiny sú písmená „U“ a „C“ prvé písmená zo slov Kalifornská univerzita. Vedci z tejto univerzity vytvorili sériu vektorov, ktoré majú dôležitú vlastnosť – prítomnosť v štruktúre DNA integrovaného syntetického polylinkerčo je nukleotidová sekvencia zložená z rozpoznávacích miest pre množstvo reštrikčných endonukleáz jedinečných pre tento vektor - MCS (Multiple Cloning Sites). Názvy jednotlivých vektorov z rodiny pUC sa líšia dvojciferným číslom a primárna štruktúra rôznych vektorov sa líši v zložení miest MCS MCS - Multiple Cloning Sites v polylinkeri.

Pozrime sa podrobnejšie na vlastnosti vektorov zahrnutých v tejto skupine, pričom ako príklad použijeme vektor pUC19 (obr. 21).

Plazmid pUC19 je dlhý 2686 bp. a obsahuje: gén rezistencie na ampicilín; regulovaný segment génu β-galaktozidázy (lacZ") laktózový operón E. coli gén lacI, kódujúci represor, ktorý riadi génovú expresiu lacZ"; polylinker - krátka sekvencia s mnohými jedinečnými rozpoznávacími miestami pre endonukleázy (EcoRI, SacI, KrpI, Xmal, Smal, BamHI, Xbal, SalI, HincII, AccI, BspMI, PstI, Sphl a HindIII); začiatok replikácie plazmidu ColE1.

Ryža. 21. Plazmidový vektor pUC19

Mapa je vysvetlená v texte.

Prítomnosť génu, ktorý poskytuje rezistenciu voči ampicilínu v plazmide pUC19, umožňuje selekciu klonov E. coli obsahujúcich tento vektor alebo na ňom založenú rekombinantnú DNA na živnom médiu s týmto antibiotikom. Takéto modulárne prvky štruktúry uvažovaného vektora ako lacZ", lacI a MCS umožňujú urýchliť a zintenzívniť selekciu klonov s rekombinantnou DNA.

Ak sa bunky obsahujúce nemodifikovaný plazmid pUC19 pestujú v prítomnosti izopropyl-β-D-tiogalaktopyranozidu (IPTG), ktorý je induktorom lac- operón, potom génový produkt lacI, tzv represor nebude schopný viazať sa na promótor-operátorovú oblasť génu lacZ", a v dôsledku toho dôjde k transkripcii a translácii plazmidového fragmentu génu lacZ". Produkt tohto fragmentu sa bude viazať na proteín kódovaný chromozomálnou DNA ( α-komplementácia), a v dôsledku toho sa tvorí aktívna ß-galaktozidáza. Sekvencia s viacerými reštrikčnými miestami (polylinker) je vložená do génu lacZ" tak, že neovplyvňuje tvorbu funkčnej β-galaktozidázy a ak je v médiu prítomný jej substrát 5-bróm-4-chlór-3-indolyl-β-D-galaktopyranozid (X-Gal), potom bude hydrolyzované pôsobením tohto enzýmu za vzniku modrého produktu, ktorý farbí kolónie buniek obsahujúcich nemodifikované, t.j. bez inzercie cudzej DNA, plazmidu pUC19 (obr. 22).

Ryža. 22. Sekvencia postupov klonovania DNA vo vektore pUC19.

1, 2, 3 a 4 - fázy klonovania (pozri text)

1. Donorová DNA je ošetrená jednou z reštrikčných endonukleáz, pre ktorú existuje miesto v polylinkeri. DNA vektora pUC19 sa ošetrí rovnakým enzýmom

2. Ligácia linearizovaného vektora a inzertu s T4 DNA ligázou.

3. Po ligácii s inkubačnou zmesou sa transformujú bunky schopné α-komplementácie, ktoré dokážu syntetizovať tú časť ß-galaktozidázy (LacZα), ktorá je napojená na génový produkt lacZ" s tvorbou aktívneho enzýmu.

4. Ošetrené bunky sa naočkujú na živné médium s ampicilínom, IPTG a substrátom pre ß-galaktozidázu. Netransformované bunky nemôžu rásť v prítomnosti ampicilínu a bunky nesúce intaktný plazmid tvoria modré kolónie na médiu s ampicilínom. Hostiteľské bunky nesúce hybrid, t.j. rekombinantný, plazmid, tvoria biele kolónie na rovnakom médiu. Je to spôsobené tým, že zvyčajne, keď sa cudzia DNA vloží do polylinkera, nemôže sa vytvoriť kompletný génový produkt. lacZ" a následne sa v procese α-komplementácie nevytvorí aktívna ß-galaktozidáza, ktorá štiepi substrát X-Gal na produkt, ktorý zaisťuje modré farbenie buniek kolónií.

Vektory založené na bakteriofágu λ

Plazmidové vektory umožňujú klonovať fragmenty DNA, ktorých veľkosť nepresahuje 10 kb. Na vyriešenie problému klonovania chromozomálnej DNA aj malého organizmu, napríklad baktérie, je však potrebné vytvárať kompletné zbierky týchto fragmentov DNA, preto je často potrebné pracovať s väčšími fragmentmi. Na tento účel sa používajú vektory založené na bakteriofágu λ E. coli.

Keď fág λ prenikne do buniek E. coli. Existujú dve alternatívne cesty vývoja udalostí:

1. lytický cyklus- fág sa začne aktívne množiť a asi po 20 minútach je bunka zničená s uvoľnením až 100 nových fágových častíc.

2. Stav lyzogenézy– Fágová DNA je zahrnutá v chromozóme E. coli ako profág a replikuje sa v bunke spolu s normálnymi bakteriálnymi bunkami. Za nepriaznivých podmienok (nedostatok výživy) sa však spustí lytický cyklus (obr. 23):

1. Počas replikácie cDNA bakteriofága λ sa vytvorí lineárna molekula pozostávajúca z opakujúcich sa segmentov s dĺžkou približne 50 kb. Každý z týchto segmentov je fágová DNA s plnou dĺžkou ohraničená lepkavou cos-miesta - jednovláknové 5 "-"chvosty" 12 nukleotidov. Nazývajú sa lepivé ( cos) konce, pretože sú vzájomne komplementárne a môžu sa navzájom párovať ako lepkavé konce restrikčných fragmentov.

2. Hlava fága obsahuje jeden takýto segment, potom je už zostavený proces pripojený k hlave.

Ryža. 23. Lytická dráha vývoja bakteriofága λ

1 - balenie jedného segmentu kompletnej fágovej DNA do hlavy fágu; 2 - zostavenie plnohodnotnej fágovej častice.

Veľkosť DNA fágu λ je približne 50 kb a jej významná časť (asi 20 kb) nie je podstatná pre reprodukciu fága a je zodpovedná za jeho začlenenie do hostiteľskej DNA. V tejto súvislosti vznikla myšlienka, že by sa dala nahradiť fragmentom inej DNA rovnakej veľkosti. Výsledná rekombinantná molekula sa bude replikovať v bunke ako DNA "rekombinantného" fága, ktorý "vstúpil" do lytickej cesty vývoja. Rekombinantné molekuly sú zabalené do hláv bakteriofága λ in vitro a po pridaní procesov sa získajú infekčné fágové častice (obr. 24).

Ryža. 24. Použitie A-fágových vektorov na klonovanie DHA fragmentov v bunkách E. coli.

Príprava extraktov pre in vitro balenie DNA fága λ sa uskutočňuje pomocou dvoch kmeňov E.coli, z ktorých každý je lyzogénny proti určitému mutantnému kmeňu fága λ (obr. 25). Jeden z mutantov nie je schopný syntetizovať proteín A (jeden z polypeptidov fágovej terminázy), druhý nie je schopný syntetizovať proteín E (proteín hlavy fága). Oba tieto proteíny sú potrebné na balenie DNA fága λ. Extrakty „A“ a „E“ sa zmiešajú a pridajú sa konkatemerické (segmenty fágovej DNA s plnou dĺžkou polymerizované podľa cos-miesta) fágová DNA, ktorá sa viaže na terminázu predtým, ako je narezaná cos miest a zabalené do fágových hláv.

Ryža. 25. Balenie in vitro DNA fága λ

Pri balení molekuly DNA s dĺžkou menšou ako 38 kb. získa sa neinfekčná fágová častica a fragmenty s dĺžkou viac ako 52 ton, b.p. nezmestia sa do hlavy. Segmenty dlhé 50 kb. v lineárnej molekule DNA sú oddelené miestami cos a práve na týchto miestach sa molekula odreže, keď ďalší segment vyplní hlavu. Rezanie sa vykonáva pomocou enzýmu umiestneného pri vstupe do hlavy.

Proces zavádzania rekombinantnej fágovej DNA s vloženým fragmentom cudzej genetickej informácie do recipientných buniek je založený na prirodzenom jave – transdukcii fágovej DNA.

transdukcia(lat. transdukcia- pohyb) je proces prenosu bakteriálnej DNA z jednej bunky do druhej bakteriofágom. Transformácia bakteriálnych buniek pomocou rekombinantnej DNA na báze fágovej DNA teda nevyžaduje špeciálnu prípravu recipientných buniek ani žiadne špeciálne prístrojové vybavenie.

Na vyhľadávanie buniek obsahujúcich fágy s rekombinantnou DNA sa používajú metódy molekulárnej hybridizácie a imunologického skríningu, o ktorých bude reč v ďalšej časti.

8860 0

V súčasnosti je známych asi 40 rôznych metód dodávania rekombinantnej DNA do buniek, ktoré riešia problém prechodu cez plazmatickú membránu rôznymi spôsobmi. Doteraz neexistuje jednotná klasifikácia metód na dodávanie rekombinantnej DNA do buniek. Každý autor recenzií klasifikuje svojím vlastným spôsobom, možno preto, že pre mnohé empiricky nájdené metódy stále nie je jasný mechanizmus prekonania membrány, napríklad pre transformáciu. Neistota je aj s terminológiou, čo nie je prekvapujúce pre rýchlo sa rozvíjajúcu novú oblasť vedy a praxe.

Každý zo spôsobov dodávania cudzej DNA do buniek má svoje vlastné charakteristiky, výhody a nevýhody z hľadiska prežitia buniek, účinnosti podávania, všestrannosti a technických možností implementácie. Výber metódy závisí od typu hostiteľských buniek a typu použitého vektora, ako aj od osobných preferencií a schopností experimentátora. Niektoré z najznámejších spôsobov dodania DNA do cieľových buniek sú podrobne diskutované nižšie.

Transformácia vo svojom najvšeobecnejšom zmysle je proces zavedenia voľnej DNA do bunky. V užšom zmysle sa pojem používa najmä vo vzťahu k baktériám, pričom označuje proces absorpcie rekombinantnej DNA kompetentnými bunkami, vyvolaný teplotným fázovým prechodom bunkovej membrány. E. coli je najbežnejším organizmom pri práci s rekombinantnou DNA a na zabezpečenie zavedenia plazmidovej DNA do buniek sa bunky uchovávajú v ľadovo chladnom roztoku CaCl2 a DNA a potom sa podrobia tepelnému šoku pri 42 °C po dobu ~1 min.

Zrejme v dôsledku takejto liečby dochádza k lokálnej deštrukcii bunkovej steny. Účinnosť transformácie, ktorá je definovaná ako počet transformantov na 1 µg pridanej DNA,
pričom je to približne 10000 - 10000000 . Účinnosť tejto metódy je nízka, transformuje sa približne menej ako 0,1 % buniek, ale táto nevýhoda je kompenzovaná použitím selekčných schém, ktoré umožňujú rýchlo identifikovať požadované klony.

Bunky schopné absorbovať cudziu DNA sa nazývajú kompetentné. Podiel týchto buniek v populácii je zvyčajne veľmi malý, ale je možné ho zvýšiť pomocou špeciálneho živného média, kultivačných podmienok a induktorov chemickej kompetencie (vybraných spravidla empiricky). Často používaným štádiom prípravy kompetentných buniek je výroba sféroplastov - buniek čiastočne alebo úplne (protoplasty) bez vonkajšej pevnej bunkovej steny.

Toto je napríklad jediný spôsob, ako efektívne transformovať mnohé grampozitívne baktérie rodov Bacillus, Listeria, Streptommyces a i. Niektoré techniky transformácie kvasiniek zahŕňajú aj kroky enzymatického odstránenia bunkovej steny kvasiniek pomocou glukozidáz. Pre organizmy, ktoré sú odolné voči chemickým induktorom spôsobilosti alebo im chýbajú prirodzené schopnosti, sa používajú iné systémy na dodávanie DNA.

Konjugácia. Existujú bakteriálne plazmidy (konjugatívne plazmidy), ktoré majú schopnosť vytvárať medzibunkové kontakty, ktorými prechádzajú z jednej bunky do druhej. Vytváranie kontaktov medzi bunkami darcu a príjemcu je zabezpečené konjugačnými vlastnosťami plazmidov a samotný prenos DNA je zabezpečený mobilizačnými vlastnosťami. V tomto prípade môže konjugačný plazmid niesť obvyklý plazmidový vektor umiestnený v tej istej bunke.

Je teda možné transformovať bunky príjemcu, ktoré sa ťažko transformujú inými prostriedkami. Napríklad sa ukázal mobilizačný prenos kyvadlového vektora pAT187 širokého hostiteľského rozsahu z E. coli na rôzne grampozitívne baktérie (rody Bacillus, Enterococcus, Staphylococcus atď.), hoci s oveľa menšou účinnosťou ako pri prenose medzi rôznymi kmene E. coli.

Okrem toho bola nedávno preukázaná možnosť konjugačného prenosu DNA z bakteriálnych buniek do kultivovaných živočíšnych buniek. Počas konjugácie sa prenesie len jedno vlákno donorového plazmidu, na ktorom sa potom syntetizuje druhé vlákno. To vedie k tomu, že konjugatívne prenesený plazmid nie je napadnutý hostiteľskými reštrikčnými enzýmami. Účinnosť tejto metódy pre baktérie je porovnateľná s účinnosťou transformácie.

Vírusová infekcia. Na zavedenie vektorov na báze vírusov sa široko používa prirodzená infekčná cesta infekcie hostiteľskej bunky, ktorá závisí od typu vírusu.

metódy perforácie. Jednou z populárnych metód zavádzania nukleových kyselín do cieľových buniek je elektroporácia - dočasné vytvorenie pórov v lipidovej dvojvrstvovej membráne pri krátkom vystavení elektrickému poľu. Ide o univerzálnu fyzikálnu metódu transformácie, ktorej technika bola vyvinutá pre takmer všetky typy buniek.

Pri práci s E. coli sa pripravená bunková suspenzia (~50 µl) a DNA umiestnia medzi elektródy a aplikuje sa jeden prúdový impulz s trvaním ~4,5 ms pri napätí 1,8 kV, vzdialenosť medzi elektródami je 1 mm. Po takomto ošetrení sa účinnosť transformácie zvýši na 109-1011 pre malé plazmidy (~3-6 kb) a až na 106 pre veľké plazmidy (~135 kb). Podobné podmienky sa používajú na zavedenie vektora BAC do E. coli.

Elektroporačný účinok vysokonapäťového výboja na dvojvrstvovú lipidovú membránu zrejme závisí od polomeru jej zakrivenia. Preto malé bakteriálne bunky účinne absorbujú DNA pri oveľa vyššej intenzite poľa (12–18 kV/cm) ako veľké živočíšne a rastlinné bunky, ktoré účinne absorbujú DNA pri sile poľa 1–2 kV/cm. Elektroporácia je najjednoduchšia, najefektívnejšia a reprodukovateľná metóda zavádzania molekúl DNA do buniek, ktorá si však vyžaduje špeciálny elektroporátor.

Ďalšie spôsoby perforácie na dodanie DNA do bunky sú: ošetrenie buniek ultrazvukom, zoškrabanie buniek zo substrátu v prítomnosti exogénneho materiálu, centrifugácia buniek v médiu s DNA v kombinácii s elektroporáciou, osmotická perforácia plazmatickej membrány, bunky sondou laserovým mikrolúčom a použitie toxínu streptolyzínu-O tvoriaceho póry.

Transfekcia. Spočiatku tento termín znamenal zavedenie vírusovej DNA do buniek, teraz sa jeho význam rozšíril na zavedenie akejkoľvek cudzej DNA do eukaryotických buniek. Pojem "transformácia", ktorý označuje proces zavádzania DNA do bunky pre prokaryoty a kvasinky, sa ukázal ako nepohodlný, pretože vo vzťahu k živočíšnym bunkám je transformácia transformáciou normálnych buniek na rakovinové bunky. V užšom zmysle sa transfekcia všeobecne chápe ako zavedenie DNA do eukaryotických buniek pomocou rôznych chemických činidiel.

Jednou z prvých metód vyvinutých na účinnú transfekciu bola inkubácia DNA s DEAE-dextránom. Získaná účinnosť bola porovnateľná s transformáciou baktérií a dosiahla 106 transfektantov na ug DNA.

Mechanizmus účinku DEAE-dextránu nebol úplne stanovený, ale je známe, že sa viaže na DNA a na bunkovú membránu, čím stimuluje pinocytózu (obr. 2.8), hoci sám nie je absorbovaný bunkami. Medzi nevýhody metódy patrí toxicita DEAE-dextránu pre niektoré typy buniek, závislosť účinnosti od kvality prípravku a veľmi nízka frekvencia získania stabilných transfektantov.

Ryža. 2.8. Schéma zavedenia DNA ako súčasti rôznych komplexov do bunky endocytózou: fagocytóza a pinocytóza (a). Schematické znázornenie častice z nelipidového polykatiónu v dendroforme s naviazanou DNA, ktorej negatívny náboj je kompenzovaný katiónovým polymérom (b)

Účinnosť transfekcie sa zvýšila 10 až 100-krát inkubáciou buniek s DNA vyzrážanou fosforečnanom vápenatým. Husté častice kalciového precipitátu DNA sú absorbované bunkou fagocytózou (obr. 2.8), ale len malá časť penetrujúcich molekúl sa dostane do jadra a integruje sa do chromozomálnej DNA. Metóda fosforečnanu vápenatého je efektívnejšia a lacnejšia, ale spôsobuje rozbitie molekúl DNA, čím sa kruhové molekuly premenia na lineárnu formu, v prípade transfekcie vírusov niekedy aj neinfekčnú. Okrem toho sa podmienky transfekcie fosforečnanom vápenatým musia zvoliť individuálne pre každú cieľovú bunku.

Počas hľadania iných transfekčných činidiel sa zistilo, že molekuly polyméru nesúce prebytok katiónového náboja môžu významne zvýšiť účinnosť transfekcie. Polymérne katióny tvoria stabilné komplexy s neutralizovanými nábojmi s nukleovými kyselinami, ktoré dokážu s vysokou účinnosťou transportovať DNA a RNA do bunky, chránia pred pôsobením endonukleáz na ceste do jadra (obr. 2.9).

Ryža. 2. 9. Schéma transportu DNA do bunkového jadra ako súčasť komplexu polykatión-DNA asociovaného so špecifickým ligandom endocytózou sprostredkovanou ligandom

Syntetické nelipidové polymérne katióny v lineárnej alebo rozvetvenej konformácii (dendritická forma) môžu kondenzovať DNA a RNA na relatívne malé častice, ktoré sa potom viažu na bunkovú membránu a vstupujú do bunky nešpecifickou endocytózou. V súčasnosti sa na transfekciu zo skupiny nelipidových polykatiónov, najmä polyetylénimínu, polyamidoamínov a dendrimérov na ich báze, používajú katiónové proteíny ako polylyzín, protamín a históny, ako aj rôzne komerčné produkty, ako je PAMAM.

Revolúciou bolo zavedenie do praxe prvého nízkotoxického katiónového lipidu DOTMA (1,2-dioleyl-3-N,N,N-trimetylaminopropán) syntetizovaného Feignerom (Feigner, 1987) et al. Účinnosť transfekcie s katiónovým lipidom (obrázok 2.10) bola asi 100-krát vyššia ako u akejkoľvek inej chemikálie, s veľkým podielom stabilných transgénnych buniek.

Ryža. Obr. 2. 10. Štruktúra komplexu s DNA (a) a všeobecná štruktúra katiónového lipidového polyméru (b). Katiónové lipidové polyméry (lineárne a rozvetvené), podobné štruktúrou a vlastnosťami fosfolipidom bunkovej membrány, tvoria komplexy s DNA vo forme viacvrstvových katiónových lipozómov (a) jednoduchým zmiešaním činidiel. Takéto komplexy vstupujú do bunky endocytózou alebo fúziou s bunkovou membránou cez lipidovú časť.

Zároveň bol do praxe zavedený nový pojem „lipofekcia“, zdôrazňujúci vysokú účinnosť genetickej transformácie buniek, čím sa lipidovo-katiónové komplexy približujú k infekčným vírusovým časticiam.

Na základe tohto úspechu boli vyvinuté mnohé variácie týchto zlúčenín (Lipofectin, Lipofectamine, Cellfectin atď.).

Paralelne boli vyvinuté dodávacie vehikulá na báze fosfolipidových lipozómov naplnených DNA alebo RNA.

Malé guľôčky umelých membrán sa môžu zlúčiť s plazmatickými membránami buniek alebo byť pohltené endocytózou, čím sa obsah uvoľní do bunky. Nízka účinnosť lipozomálnej transfekcie sa zvýšila zavedením fosfolipidov do štruktúry lipozómov, napríklad kardiolipínu a fosfatidyletanolamínu, ktoré spolu s dvojvrstvovými membránami tvoria aj invertované micelárne štruktúry, známe ako kubické a šesťuholníkové fázy, schopné iniciovať membránu fúzie.

Lipozomálna metóda je dosť rozmarná a vyžaduje starostlivý výber všetkých podmienok pre účinnú transfekciu špecifických buniek. Okrem toho proces enkapsulácie, zvyčajne sonikácia, často poškodzuje veľké molekuly DNA.

Novou etapou vo vývoji transfekčných činidiel bol vývoj účinnejšieho a cielenejšieho dodávania nukleových kyselín do špecifických cieľových buniek zavedením rôznych ligandov do štruktúry syntetických transfekčných činidiel a lipozómov na väzbu na proteíny membránového receptora. Prítomnosť takýchto cieľových skupín (ligandov) rozpoznávaných bunkovými receptormi umožňuje využiť mechanizmy ligandom sprostredkovanej endocytózy (pozri obr. 2.9).

Ako také ligandy sa používajú proteíny a peptidy rozpoznávané receptormi; oligosacharidy, keďže na povrchu mnohých živočíšnych buniek sú lektíny - receptorové proteíny, ktoré ich špecificky viažu; polysacharidy. Procesy interakcie takýchto cielených komplexov DNA(RNA)-transfekčných činidiel s bunkami sú podobné ako pri penetrácii vírusových častíc do bunky.

V súčasnosti biotechnologické spoločnosti ponúkajú širokú škálu rôznych transfekčných činidiel – od najjednoduchších a najlacnejších až po najnovší vývoj, špecializovaných na rôzne typy buniek a úlohy. Intenzívne pokračuje aj vytváranie nových ešte účinnejších transfekčných činidiel.

Mikroinjekcia - bunková membrána sa prepichne mikroihlou a do cytoplazmy bunky alebo priamo do jadra sa vstrekne roztok obsahujúci DNA, ak je jadro dostatočne veľké (napríklad jadro vajíčka). Mikroinjekcia DNA do buniek cicavcov bola možná s príchodom zariadenia na výrobu mikropipiet s priemerom 0,1-0,5 mikrónu a mikromanipulátora. Metóda je veľmi účinná, podiel buniek so stabilnou integráciou a expresiou injikovaných génov môže dosiahnuť 50 %. Výhodou opísanej metódy je tiež to, že umožňuje zavedenie akejkoľvek DNA do akýchkoľvek buniek a nie je potrebný žiadny selektívny tlak na zachovanie vneseného génu v bunkách.

Balistická transfekcia, biobalistika alebo biolistika (bombardovanie mikročasticami), je založená na bombardovaní buniek mikrosférami s veľkosťou približne 1-2 mikróny, ktoré sú potiahnuté DNA. Používajú sa mikročastice zlata, volfrámu (niekedy fytotoxický), silikónu a rôznych syntetických nanoguľôčok. Mikročastice potiahnuté DNA prechádzajú cez bunkové vrstvy a prenášajú genetický konštrukt priamo do organel a jadier buniek. Na tento účel vytvorená „gene gun“ (gene gun), alebo „gene gun“, ktorú vyvinul J. Sanford v roku 1987 na zavedenie DNA do obilných zŕn, je svojou konštrukciou podobná pneumatickým zbraniam (obr. 2.11). .

Ryža. 2.11. Zavedenie rekombinantnej DNA do listov rastlín pomocou Bio-Rad opätovne použiteľného génového pištole (a) a jeho všeobecnej schémy (b). Pulz hélia vytlačí mikročastice potiahnuté DNA alebo RNA z puzdra vzorky. Mikročastice nesúce DNA sú zrýchlené a zaostrené na maximálnu penetráciu do buniek, pričom sa pohybujú pozdĺž urýchľovacieho kanála a pozdĺž hlavne pištole, zatiaľ čo pri širokom výstupe sa prúd hélia difúzne rozbieha do strán. Filtračná vložka udržuje optimálnu vzdialenosť na zasiahnutie cieľa s maximálnym odstránením hélia, aby sa minimalizovali škodlivé účinky na bunkový povrch.

Hĺbka prieniku mikročastíc je spravidla malá - do 1 mm, avšak za špeciálnych podmienok lúpania môžu mikročastice preniknúť do tkaniva do hĺbky 4 až 5 mm a preniesť gény napríklad do priečne pruhovaných svalových vlákien. Balistická transfekcia je veľmi účinná aj tam, kde sú hrubé bunkové steny (kvasinky, rastliny) prekážkou pre mnohé iné spôsoby podávania a aplikuje sa na tkanivá, orgány a dokonca aj celé organizmy. V súčasnosti sa široko používa v génovej terapii na získanie transgénnych zvierat a rastlín.

Takáto rozmanitosť prostriedkov a metód transfekcie je spôsobená rôznymi úlohami, širokým spektrom cieľových buniek a typov nukleových kyselín dodávaných bunkám, ako aj potrebou spoločnosti získať stále účinnejšie prostriedky na prenos genetickej informácie do buniek. tkanivách a celých organizmoch. Osobitná pozornosť sa venuje vývoju transfekčných činidiel a metód v súvislosti s pozoruhodnými vyhliadkami ľudskej génovej terapie, ktorá si vyžaduje cielené, vysoko účinné a bezpečné nosiče génov.

Stabilné a prechodné zavedenie cudzej DNA do bunky. Po zavedení rekombinantnej DNA do eukaryotickej bunky len malá časť z nej skončí v jadre, keďže jadrová membrána je impozantnou bariérou pre cudziu DNA. V jadre môže byť rekombinantná DNA integrovaná do chromozómu alebo môže existovať nejaký čas v extrachromozomálnom stave.

V súlade s tým sa rozlišuje medzi stabilnou transfekciou, keď sa rekombinantná DNA integruje do chromozómov recipientných buniek a stane sa ich integrálnou súčasťou, ako aj medzi dočasnou alebo prechodnou transfekciou, pri ktorej existujú molekuly rekombinantnej DNA a sú transkribované v jadrách v extrachromozomálnych bunkách. stav na krátky čas. Stabilná dedičnosť zavedenej cudzej DNA je hlavnou podmienkou získania transgénnych organizmov na ekonomické účely.

Preto sa osobitná pozornosť venuje vývoju metód na zavedenie DNA do buniek, čo vedie k produkcii väčšieho podielu stabilných transformantov. Okrem toho veľké percento stabilných transformantov tiež umožňuje opustiť selektívne a markerové gény, ktoré sú balastom pri vytváraní transgénnych organizmov.

NA. Voinov, T.G. Volova