Podstatu fagocytózy možno opísať len niekoľkými slovami. Pri tomto procese špeciálne fagocytové bunky „vypočítavajú“, požierajú a trávia škodlivé častice, ktoré sa dostali do tela, hlavne infekcie. Účelom tohto javu je chrániť nás pred potenciálnymi patogénmi, toxínmi a pod. A ako presne prebieha mechanizmus fagocytózy? Prechádza niekoľkými fázami, ktoré budú podrobnejšie popísané nižšie.

Fázy fagocytózy:

Chemotaxia

Škodlivý predmet sa dostane do tela a zostane tam krátky čas bez povšimnutia. Tento predmet, či už je to baktéria, cudzie teleso alebo niečo iné, uvoľňuje špeciálne látky (chemoatraktanty) a prichádza priamo do kontaktu s krvou alebo tkanivami. To všetko dáva telu najavo, že je v ňom prítomný agresor.

Nastáva kaskáda biochemických reakcií. V prvom štádiu fagocytózy žírne bunky uvoľňujú do krvného obehu špeciálne zlúčeniny, ktoré spôsobujú zápalovú reakciu. Začiatok zápalového procesu „prebúdza“ makrofágy a iné fagocytové bunky z pokoja. Neutrofily, ktoré zachytávajú prítomnosť chemoatraktantov, rýchlo opúšťajú krv do tkanív a ponáhľajú sa migrovať do zápalového ložiska.

Je ťažké to opísať a ešte ťažšie si to predstaviť, ale prienik patogénu do tela vedie k spusteniu skutočného domino efektu, ktorý zahŕňa stovky (!) rôznych fyziologických javov vyskytujúcich sa v bunkovej a subcelulárnej úrovne. Stav imunitného systému v tomto štádiu fagocytózy možno prirovnať k stavu narušeného včelieho úľa, keď sa jeho početní obyvatelia pripravujú na útok na páchateľa.

Neutrofil - migrujúci fagocyt

Sekvencia fagocytózy pokračuje druhým štádiom, adhéznou reakciou. Fagocyty, ktoré sa priblížili na správne miesto, rozširujú svoje procesy na patogén, prichádzajú s ním do kontaktu a rozpoznávajú ho. Neponáhľajú sa s okamžitým útokom a radšej sa najprv uistia, že sa s „cudzím“ nemýli. Rozpoznanie škodlivého činidla nastáva pomocou špeciálnych receptorov na povrchu membrán fagocytov.

Aktivácia membrány

V treťom štádiu fagocytózy dochádza v obranných bunkách k neviditeľným reakciám, ktoré ich pripravujú na zachytenie a zničenie patogénu.

Ponorenie

Fagocytová membrána je tekutá plastická látka, ktorá môže meniť tvar. Čo robí, keď bunka narazí na škodlivý objekt. Fotografia ukazuje, že fagocyt rozširuje svoje "chápadlá" na cudziu časticu. Potom sa okolo nej postupne rozprestiera, plazí sa po nej a úplne ju uchvacuje.

Fagocyt rozširuje procesy na patogén

Tvorba fagozómov

Keď fagocyt pokryje časticu zo všetkých strán, jeho membrána sa zvonku uzavrie a vnútri bunky zostane uzavretá bublina s napadnutým predmetom vo vnútri. Zdá sa teda, že bunka časticu prehltne. Táto vezikula sa nazýva fagozóm.

Tvorba fagolyzozómu (fúzia)

Kým prebiehali ďalšie štádiá fagocytózy, vo vnútri fagocytu sa pripravovala na použitie jeho zbraň – lyzozómové organely obsahujúce „tráviace“ enzýmy bunky. Hneď ako baktéria alebo iný škodlivý objekt zachytí obranná bunka, lyzozómy sa k nej priblížia. Ich membrány sa spájajú so škrupinou, ktorá obklopuje časticu, a ich obsah sa naleje do tohto „vrecka“.

Toto je najdramatickejší moment v celom mechanizme fagocytózy. Zachytený objekt je strávený a rozložený fagocytom.

Odstránenie produktov štiepenia

Všetko, čo zostane z usmrtenej baktérie alebo inej natrávenej častice, sa z bunky odstráni. Bývalý fagolyzozóm, ktorý je vakom s produktmi degradácie, sa približuje k vonkajšej membráne fagocytu a spája sa s ním. Takže zvyšky absorbovaného objektu sú odstránené z bunky. Sekvencia fagocytózy je dokončená

Fagocytóza (z gréckeho phago - požieram a cytos - bunka) je proces absorpcie a trávenia antigénnych látok vrátane mikroorganizmov bunkami mezodermálneho pôvodu, tzv. fagocyty. I. I. Mečnikov rozdelil fagocyty na makrofágy a mikrofágy. V súčasnosti sú makro- a mikrofágy spojené jediný systém makrofágov (SMF). Tento systém zahŕňa:

• tkanivové makrofágy - epiteloidné bunky,
• hviezdicové retikuloendoteliocyty (Kupfferove bunky),
• alveolárne a peritoneálne makrofágy umiestnené v alveolách a peritoneálnej dutine,
• biele procesné epidermocyty kože (Langerhansove bunky) atď.

Mikrofágy zahŕňajú:

• neutrofily,
• eozinofily,
• bazofily.

Funkcie makrofágov mimoriadne pestrá. Ako prvé reagujú na cudzorodú látku, sú to špecializované bunky, ktoré pohlcujú a ničia cudzie látky v tele (odumierajúce bunky, rakovinové bunky, baktérie, vírusy a iné mikroorganizmy, antigény, nemetabolizovateľné anorganické látky). Okrem toho makrofágy produkujú mnohé biologicky aktívne látky – enzýmy (vrátane lyzozýmu, peroxidázy, esterázy), komplementové proteíny, imunomodulátory, ako sú interleukíny. Prítomnosť na povrchu makrofágov receptorov pre imunoglobulíny (Am) a komplement, ako aj systém mediátorov, zabezpečuje ich interakciu s T- a B-lymfocytmi. Makrofágy zároveň aktivujú ochranné funkcie T-lymfocytov. Vďaka prítomnosti receptorov pre komplement a Am, ako aj histokompatibilného systému Ag (HLA) sa makrofágy podieľajú na väzbe a rozpoznávaní antigénov. Fagocyty teda majú tri funkcie:

• ochranné, spojené s čistením tela od infekčných agens, produktov rozpadu tkaniva atď .;
• reprezentujúce, spočívajúce v prezentácii antigénnych epitolov lymfocytom na fagocytovej membráne;
• sekrečné, spojené so sekréciou lyzozomálnych enzýmov a iných biologicky aktívnych látok – cytokínov, ktoré hrajú dôležitú úlohu v imunogenéze.

Existujú nasledujúce postupne tečúce štádia fagocytózy.

• Chemotaxia– cielený pohyb fagocytov v smere chemického gradientu chemoatraktantov v prostredí. Schopnosť chemotaxie je spojená s prítomnosťou na membráne špecifických receptorov pre chemoatraktanty (objekty fagocytózy), ktorými môžu byť baktérie, produkty degradácie telesných tkanív atď.
• Priľnavosť(pripútanie) je tiež sprostredkované zodpovedajúcimi receptormi, ale môže prebiehať v súlade so zákonmi nešpecifickej fyzikálno-chemickej interakcie. Častice sú adsorbované na povrchu makrofágov.
• Endocytóza(záchyt) - dochádza k invaginácii bunkovej membrány, zachyteniu cudzorodej častice a jej ponoreniu do protoplazmy. V dôsledku endocytózy sa vytvára fagocytárna vakuola - fagozóm(t.j. bublina v protoplazme okolo absorbovanej častice).
• intracelulárne trávenie- začína absorpciou fagocytovaných predmetov. Fagozóm sa spája s lyzozómom fagocytu, ktorý obsahuje desiatky enzýmov a nastáva tvorba fagolyzozómu (deštrukcia) zachytenej častice enzýmami. Pri pohltení častice patriacej k samotnému organizmu (napríklad mŕtva bunka alebo jej časti, vlastné bielkoviny) dochádza k jej štiepeniu pomocou fagolyzozómových enzýmov na neantigénne látky (aminokyseliny, mastné kyseliny, nukleotidy, monocukry). Ak sa cudzia častica absorbuje, potom enzýmy fagolyzozómu nie sú schopné rozložiť látku na neantigénne zložky. V takýchto prípadoch je fagolyzozóm so zvyšnou časťou antigénu, ktorý si zachoval svoju cudzosť, prenesený makrofágom na T- a B-lymfocyty, t.j. zapne sa špecifické prepojenie imunity.

sekrečnú funkciu je sekrécia fagocytmi biologicky aktívnych látok - cytokínov - ide o interleukín-1 a interleukín-2, čo sú bunkové mediátory, ktoré majú regulačný účinok na proliferáciu, diferenciáciu a funkciu fagocytov, lymfocytov, lymfoblastov a iných buniek. Makrofágy produkujú a vylučujú také dôležité regulačné faktory, ako sú prostaglandíny, leukotriény, cyklické nukleotidy so širokým rozsahom biologickej aktivity. Okrem toho makrofágy syntetizujú a vylučujú množstvo produktov s antibakteriálnou, antivírusovou a cytotoxickou aktivitou (kyslíkové radikály O2-H2O2, lyzozým, interferón atď.).

Fagocytózu zosilňujú opsonínové protilátky, pretože naviazaný alebo antigén sa ľahšie adsorbuje na povrchu fagocytu v dôsledku prítomnosti receptorov pre tieto protilátky. Toto zosilnenie fagocytózy protilátkami sa nazýva opsonizácia, t.j. príprava mikroorganizmov na zachytenie fagocytmi. Fagocytóza opsonizovaných antigénov sa nazýva imunitná.

Charakterizovať aktivitu fagocytózy zavedenej fagocytárny index. Na jej určenie sa pod mikroskopom spočíta počet baktérií absorbovaných jedným fagocytom. Tiež si užite opsonofagocytárny index predstavujúci pomer fagocytárnych parametrov získaných s imunitným a neimunitným sérom. Fagocytárny index a opsonofagocytárny index sa používajú v klinickej imunológii na hodnotenie stavu imunity a imunitného stavu.

Fagocytóza hrá dôležitú úlohu v antibakteriálnej, protiplesňovej a antivírusovej ochrane, udržiava odolnosť organizmu voči cudzorodým látkam. Fagocyty majú tiež aktivačný a supresívny účinok na lymfocyty, podieľajú sa na oživovaní imunologickej tolerancie, protiinfekčnej, transplantačnej a protinádorovej imunity a niektorých foriem alergie (HRT).

Proces fagocytózy (absorpcia objektu na pevnej fáze) pozostáva z piatich etáp.

• 1. Aktivácia (zvýšený energetický metabolizmus). Faktory aktivácie a chemotaxie sú bakteriálne produkty (LPS, peptidy), zložky komplementu (C3 a C5), cytokíny a protilátky.
• 2. Chemotaxia.
• 3. Priľnavosť.
• 4. Absorpcia.
• 5. Výsledok fagocytózy.

Adhézia je spojená s prítomnosťou množstva receptorov na povrchu fagocytov (na Fc fragmenty protilátok, zložky komplementu, fibronektín), ktoré zabezpečujú silu receptorom sprostredkovaných interakcií opsonínov, ktoré obaľujú mikroorganizmy a obmedzujú ich pohyblivosť (protilátky, C3b, fibronektín).

Fagocyty majú pseudopódiu podobné amébe. Pri absorpcii sa s absorbovaným objektom (baktériou) vytvorí fagozóm, spojí sa a zlúči sa s ním lyzozóm obsahujúci lytické enzýmy a vznikne fagolyzozóm.

Existujú tri možné následky fagocytózy:

• - úplná fagocytóza;
• - neúplná fagocytóza;
• - spracovanie antigénov.

Dokončená fagocytóza je úplné trávenie mikroorganizmov vo fagocytárnej bunke.

V procese fagocytózy dochádza k „oxidačnej explózii“ s tvorbou reaktívnych foriem kyslíka, čo poskytuje baktericídny účinok.

Jednou z najdôležitejších funkcií makrofágov (spolu s chemotaxiou, fagocytózou, sekréciou biologicky aktívnych látok) je spracovanie (spracovanie) antigénu a jeho prezentácia imunokompetentným bunkám za účasti proteínov triedy hlavného histokompatibilného systému (MHC). 2.

Fagocytóza nie je len deštrukcia cudzieho, ale aj prezentácia antigénu na spustenie imunitných reakcií a sekréciu mediátorov imunitných a zápalových reakcií. Makrofágový systém je centrálnym článkom nielen prirodzenej rezistencie (druhovej imunity), ale zohráva dôležitú úlohu aj pri získanej imunite, spolupráci buniek v imunitnej odpovedi.

Zápal ako ochranná reakcia organizmu na rôzne poškodenia tkaniva vznikol vo vyššom štádiu evolúcie ako fagocytóza a je charakteristický pre vysoko organizované organizmy s obehovým a nervovým systémom.

Infekčný zápal sprevádzajú rôzne cievne a bunkové (vrátane fagocytózy) reakcie, ako aj spustenie množstva mediátorov zápalových reakcií (histamín, serotonín, kiníny, proteíny akútnej fázy zápalu, leukotriény a prostaglandíny, cytokíny, komplement systém).

Mnohé bakteriálne produkty aktivujú bunky makrofágovo-monocytového systému a lymfocyty, ktoré na ne reagujú uvoľňovaním biologicky aktívnych produktov - cytokínov, najmä interleukínov. Možno ich charakterizovať ako mediátory bunkových imunitných odpovedí. Pri zápalových reakciách hrá hlavnú úlohu interleukín-1 (IL-1), ktorý stimuluje horúčku, zvyšuje vaskulárnu permeabilitu a adhezívne vlastnosti endotelu a aktivuje fagocyty.

Horúčka. Zvýšenie telesnej teploty je ochranná reakcia organizmu, ktorá zhoršuje podmienky pre reprodukciu mnohých mikroorganizmov, aktivuje makrofágy, urýchľuje prietok krvi a zlepšuje metabolické procesy v tele.

Bariérová funkcia lymfatických uzlín. Podľa P. F. Zdrodovského (1969) sú lymfatické uzliny akýmsi biologickým filtrom pre patogény prenášané lymfou. Tu sú mikroorganizmy, ktoré prenikli kožou alebo sliznicami a sú unášané lymfatickým prúdom, zadržané a vystavené pôsobeniu makrofágov a aktivovaných lymfocytov.

Systém komplementu je komplex bielkovín a glykoproteínov v krvnom sére ľudí a stavovcov (je ich viac ako 20). Jednotlivé zložky sprostredkúvajú procesy zápalu, opsonizáciu cudzích fragmentov pre následnú fagocytózu, podieľajú sa spolu s makrofágmi na priamom ničení mikroorganizmov a iných cudzorodých buniek (lýza baktérií a vírusov). Za fyziologických podmienok sú zložky komplementového systému v neaktívnej forme. Existujú tri spôsoby aktivácie komplementového systému – klasický, alternatívny a pomocou skratu C1.

Klasická dráha – kaskáda proteázových reakcií zo zložky C1q na C9 – sa realizuje v prítomnosti protilátok proti zodpovedajúcemu antigénu. Zložka C1q interaguje s komplexom „antigén-protilátka“, potom C4 a potom C2. Vytvorí sa komplex „antigén-protilátka-C1C4C2“, na ktorý sa napojí C3 (centrálna zložka systému) a spustí sa aktivačný reťazec s efektorovými funkciami (opsonizácia a lýza baktérií, aktivácia makrofágového systému, zápal). .

Alternatívna cesta sa realizuje pri prvotnom kontakte s patogénom (keď ešte neexistujú protilátky). Je indukovaný LPS a inými mikrobiálnymi antigénmi. C1, C4, C2 nie sú zahrnuté, alternatívna a klasická cesta sa spájajú na úrovni C3.

interferónový systém.

Interferóny sú glykoproteíny syntetizované rôznymi bunkami tela so širokým rozsahom biologickej aktivity (predovšetkým antivírusovej), rýchlou reakciou tela na bunky, ktoré dostávajú nešpecifický signál cudzosti. Existuje celý systém interferónov, ktoré sa delia na podtypy alfa, beta a gama s výraznou heterogenitou vlastností. Antivírusový účinok sa prejavuje v schopnosti potlačiť intracelulárnu reprodukciu DNA a RNA vírusov (predovšetkým v dôsledku blokovania syntézy vírusových makromolekúl). Indukciu syntézy interferónu spôsobujú vírusy, baktérie, rickettsie, prvoky, syntetické zlúčeniny.

zabíjačské bunky.

Pri zabezpečovaní druhovej imunity majú podstatnú úlohu T-cytotoxické lymfocyty (T-killery), ako aj hlavný systém histokompatibility (podrobnejšie v nasledujúcich prednáškach).

T-killery tým, že prezentujú antigény hlavného systému histokompatibility triedy 1, rozpoznávajú akékoľvek cudzie antigény (vrátane mutantných, napríklad rakovinové bunky), napádajú ich a ničia.

NK (natural killer) bunky sú dôležité pri udržiavaní genetickej homeostázy a protinádorovej ochrany, ich rozpoznávacie funkcie nezávisia od prezentácie antigénov triedy 1 MHC (major histocompatibility complex).

Systémy nešpecifickej rezistencie a druhovej imunity prispievajú k zachovaniu štrukturálnej a funkčnej integrity organizmu a sú základom pre tvorbu získanej (špecifickej) imunity. Ukotvenie na tejto vyššej úrovni, systémy špecifickej a získanej imunity tvoria jediný a najúčinnejší systém sebaobrany tela pred všetkým cudzím.

Imunitný systém.

Imunitný systém je súbor orgánov, tkanív a buniek, ktoré zabezpečujú bunkovú a genetickú stálosť tela. Princípy antigénnej (genetickej) čistoty sú založené na rozpoznávaní „vlastného mimozemšťana“ a sú do značnej miery determinované systémom génov a glykoproteínov (produktov ich expresie) – hlavného histokompatibilného komplexu (MHC), často nazývaného HLA (ľudský leukocytové antigény) systém u ľudí. MHC proteíny sú jasne exprimované na ľudských leukocytoch, MHC antigény sú typizované pomocou štúdie leukocytov.

orgánov imunitného systému.

Existujú centrálne (kostná dreň - hematopoetický orgán, týmus alebo týmus, lymfoidné tkanivo čreva) a periférne (slezina, lymfatické uzliny, nahromadenie lymfatického tkaniva vo vlastnej vrstve slizníc črevného typu) orgány imunity.

Progenitorové bunky imunokompetentných buniek sú produkované kostnou dreňou. Niektorí potomkovia kmeňových buniek sa stávajú lymfocytmi. Lymfocyty sa delia do dvoch tried – T a B. Prekurzory T-lymfocytov migrujú do týmusu, kde dozrievajú na bunky, ktoré sa môžu podieľať na imunitnej odpovedi. U ľudí dozrievajú B-lymfocyty v kostnej dreni. U vtákov nezrelé B bunky migrujú do Fabriciovej burzy, kde dosiahnu zrelosť. Zrelé B a T lymfocyty kolonizujú periférne lymfatické uzliny. Centrálne orgány imunitného systému teda vykonávajú tvorbu a dozrievanie imunokompetentných buniek, periférne orgány poskytujú primeranú imunitnú odpoveď na antigénnu stimuláciu - „spracovanie antigénu“, jeho rozpoznanie a klonálnu proliferáciu lymfocytov - diferenciáciu závislú od antigénu.

Imunita: mechanizmy nasadenia

Bunky a molekuly pôsobia v zhode a navzájom sa podporujú v rôznych štádiách vývoja imunitnej odpovede.

Nešpecifické mechanizmy

V prvej fáze zrážky s cudzím antigénom sa spustí nešpecifický patologický ochranný proces - zápal sprevádzaný fagocytózou, uvoľnením zápalových mediátorov - histamínu, serotonínu, cytokínov atď. Fagocyty (makrofágy) absorbujú antigény a kontaktujú T- pomocné lymfocyty, ktoré ich prezentujú na povrchových antigénnych determinantoch. T-pomocníci spúšťajú reprodukciu (vylučujú špecifické proteínové látky - interleukíny) klonov T-killerov a B-lymfocytov špecifických pre daný antigén z už existujúcich kmeňových buniek, ktoré boli testované na toleranciu v embryonálnom období (Burnetova klonálna selekčná teória).

Zápal (lat. inflammatio) je komplexný, lokálny a celkový patologický proces, ktorý vzniká ako reakcia na poškodenie (alteratio) alebo pôsobenie patogénneho podnetu a prejavuje sa reakciami (exudatio a pod.) zameranými na elimináciu produktov poškodenia, a ak je to možné , potom činidlá (dráždidlá), ako aj čo vedie k maximálnej obnove pre tieto stavy (proliferatio, atď.) v zóne poškodenia.

Schéma vývoja zápalu. Vplyvom poškodzujúceho faktora sa makrofágom uvoľňujú prozápalové cytokíny, ktoré priťahujú ďalšie bunky do ohniska zápalu, v dôsledku čoho je ich agregáciou alebo uvoľňovaním účinných látok narušená celistvosť tkaniva. .

Fagocytóza (Fago - požierať a cytos - bunka) - proces, pri ktorom špeciálne bunky krvi a tkanív tela (fagocyty) zachytávajú a trávia patogény infekčných chorôb a odumreté bunky. Vykonávajú ho dva typy buniek: granulované leukocyty (granulocyty) cirkulujúce v krvi a tkanivové makrofágy. Objav fagocytózy patrí I. I. Mečnikovovi, ktorý tento proces odhalil tým, že robil experimenty s hviezdicami a dafniami, pričom do ich tiel vnášal cudzie telesá. Napríklad, keď Mečnikov umiestnil spóru huby do tela dafnie, všimol si, že bola napadnutá špeciálnymi mobilnými bunkami. Keď zaviedol príliš veľa spór, bunky ich nestihli všetky stráviť a zviera zomrelo. Mechnikov nazval bunky, ktoré chránia telo pred baktériami, vírusmi, spórami húb atď., fagocytmi.

U ľudí existujú dva typy profesionálnych fagocytov:neutrofily a monocyty (v tkanivách - makrofágy)

Hlavné štádiá fagocytárnej reakcie sú podobné pre oba typy buniek. Reakciu fagocytózy možno rozdeliť do niekoľkých fáz:

1. Chemotaxia. Pri fagocytóze má významnejšia úloha pozitívnu chemotaxiu. Ako chemoatraktanty sú produkty vylučované mikroorganizmami a aktivovanými bunkami v ohnisku zápalu (cytokíny, leukotrién B4, histamín), ako aj štiepne produkty zložiek komplementu (C3a, C5a), proteolytické fragmenty krvnej koagulácie a faktory fibrinolýzy (trombín , fibrín), neuropeptidy, fragmenty imunoglobulínov atď. „Profesionálne“ chemotaxíny sú však cytokíny zo skupiny chemokínov.

Skôr ako iné bunky, neutrofily migrujú do ohniska zápalu a makrofágy prichádzajú oveľa neskôr. Rýchlosť chemotaktického pohybu pre neutrofily a makrofágy je porovnateľná, rozdiely v čase príchodu sú pravdepodobne spojené s rôznou rýchlosťou ich aktivácie.

2. Adhézia fagocytov k objektu.Je to kvôli prítomnosti na povrchu fagocytov receptorov pre molekuly prezentované na povrchu objektu (vlastného alebo s ním spojeného). Pri fagocytóze baktérií alebo starých buniek hostiteľského organizmu sa rozoznávajú koncové sacharidové skupiny – glukóza, galaktóza, fukóza, manóza atď., ktoré sú prítomné na povrchu fagocytovaných buniek. Rozpoznávanie sa uskutočňuje pomocou lektínových receptorov s vhodnou špecifickosťou, predovšetkým proteínom viažucim manózu a selektínmi prítomnými na povrchu fagocytov.

V prípadoch, keď objektom fagocytózy nie sú živé bunky, ale kúsky uhlia, azbestu, skla, kovu atď., fagocyty najprv urobia objekt absorpcie prijateľným pre reakciu a obalia ho vlastnými produktmi, vrátane zložiek extracelulárnu matricu, ktorú produkujú.

Fagocyty sú síce schopné pohlcovať rôzne druhy „nepripravených“ predmetov, ale najväčšiu intenzitu fagocytárny proces dosahuje pri opsonizácii, t.j. fixácia na povrch predmetov opsonínov, pre ktoré majú fagocyty špecifické receptory – pre Fc fragment protilátok, zložky komplementového systému, fibronektín a pod.

3. Aktivácia membrány.V tejto fáze je objekt pripravený na ponorenie. Dochádza k aktivácii proteínkinázy C, uvoľňovaniu vápenatých iónov z vnútrobunkových zásob. Veľký význam majú sol-gélové prechody v systéme bunkových koloidov a aktín-myozínové preskupenia.

4. Ponorte sa. Objekt sa balí

5. Tvorba fagozómu.Membránový uzáver, ponorenie predmetu s časťou fagocytovej membrány do vnútra bunky.

6. Tvorba fagolyzozómu.Fúzia fagozómu s lyzozómami vedie k vytvoreniu optimálnych podmienok pre bakteriolýzu a štiepenie odumretej bunky. Mechanizmy konvergencie fagozómov a lyzozómov nie sú jasné, pravdepodobne dochádza k aktívnemu pohybu lyzozómov k fagozómom.

7. Zabíjanie a štiepenie.Úloha bunkovej steny natrávenej bunky je veľká. Hlavné látky podieľajúce sa na bakteriolýze: peroxid vodíka, produkty metabolizmu dusíka, lyzozým atď. Proces deštrukcie bakteriálnych buniek je zavŕšený aktivitou proteáz, nukleáz, lipáz a iných enzýmov, ktorých aktivita je optimálna pri nízkej hodnoty pH.

8. Uvoľňovanie produktov degradácie.

Fagocytóza môže byť: dokončená (usmrtenie a trávenie bolo úspešné), neúplné (pre množstvo patogénov je fagocytóza nevyhnutným krokom v ich životnom cykle, napríklad u mykobaktérií a gonokokov).

aktivácia komplementu.

Systém komplementu funguje ako biochemická kaskáda reakcií. Komplement je aktivovaný tromi biochemickými cestami: klasickou, alternatívnou a lektínovou cestou. Všetky tri aktivačné dráhy produkujú rôzne varianty C3 konvertázy (proteín, ktorý štiepi C3). Klasická dráha (bola objavená ako prvá, ale je evolučne nová) vyžaduje aktiváciu protilátok (špecifická imunitná odpoveď, adaptívna imunita), zatiaľ čo alternatívna a lektínová dráha môže byť aktivovaná antigénmi bez prítomnosti protilátok (nešpecifická imunitná odpoveď). odpoveď, vrodená imunita). Výsledok aktivácie komplementu je vo všetkých troch prípadoch rovnaký: C3 konvertáza hydrolyzuje C3, vytvára C3a a C3b a spôsobuje kaskádu ďalšej hydrolýzy prvkov systému komplementu a aktivačných udalostí. V klasickej dráhe vyžaduje aktivácia C3 konvertázy vytvorenie komplexu C4b2a. Tento komplex vzniká po štiepení C2 a C4 komplexom C1. Komplex C1 sa zase na aktiváciu musí viazať na imunoglobulíny triedy M alebo G. C3b sa viaže na povrch patogénov, čo vedie k väčšiemu „záujmu“ fagocytov o bunky spojené s C3b (opsonizácia). C5a je dôležitý chemoatraktant, ktorý pomáha priťahovať nové imunitné bunky do oblasti aktivácie komplementu. C3a aj C5a majú anafylotoxickú aktivitu, priamo spôsobujúcu degranuláciu žírnych buniek (v dôsledku toho uvoľnenie zápalových mediátorov). C5b spúšťa tvorbu membránových atakujúcich komplexov (MAC), ktoré pozostávajú z C5b, C6, C7, C8 a polymérneho C9. MAC je cytolytický konečný produkt aktivácie komplementu. MAC tvorí transmembránový kanál, ktorý spôsobuje osmotickú lýzu cieľovej bunky. Makrofágy pohlcujú patogény označené komplementovým systémom.

klasickým spôsobom

Klasická dráha sa spúšťa aktiváciou komplexu C1 (zahŕňa jednu molekulu C1q a dve molekuly C1r a C1s). Komplex C1 sa viaže cez C1q na imunoglobulíny triedy M a G spojené s antigénmi. Hexamérny C1q má tvar kytice neotvorených tulipánov, ktorých "púčiky" sa môžu viazať na Fc oblasť protilátok. Na spustenie tejto dráhy stačí jedna molekula IgM, aktivácia molekulami IgG je menej účinná a vyžaduje si viac molekúl IgG.

C1q sa viaže priamo na povrch patogénu, čo vedie ku konformačným zmenám v molekule C1q a aktivuje dve molekuly serínových proteáz C1r. Štiepia C1 (tiež serínová proteáza). Komplex C1 sa potom viaže na C4 a C2 a potom ich štiepi za vzniku C2a a C4b. C4b a C2a sa navzájom viažu na povrchu patogénu za vzniku klasickej dráhy C3 konvertázy, C4b2a. Výskyt C3 konvertázy vedie k štiepeniu C3 na C3a a C3b. C3b tvorí spolu s C2a a C4b C5 konvertázu klasickej dráhy.

Alternatívna cesta

Alternatívna cesta sa spúšťa hydrolýzou C3 priamo na povrchu patogénu. Na alternatívnej dráhe sa podieľajú faktory B a D. S ich pomocou vzniká enzým C3bBb. Stabilizuje ho a zabezpečuje jeho dlhodobé fungovanie Proteín P. Ďalej PC3bBb aktivuje C3, čím sa vytvorí C5-konvertáza a spustí sa tvorba komplexu membránového útoku. K ďalšej aktivácii koncových komponentov komplementu dochádza rovnakým spôsobom ako pri klasickej dráhe aktivácie komplementu.

Alternatívna dráha sa od klasickej líši v tom, že aktivácia komplementového systému nevyžaduje tvorbu imunitných komplexov, prebieha bez účasti prvých komplementových komponentov - C1, C2, C4. Líši sa aj tým, že pôsobí ihneď po objavení sa antigénov – jeho aktivátormi môžu byť bakteriálne polysacharidy a lipopolysacharidy, vírusové častice, nádorové bunky.

Lektínová (manózová) dráha aktivácie komplementového systému

Lektínová dráha spojená s manánom (manán je polymér manózy) je homológna s klasickou aktivačnou dráhou komplementového systému. Táto dráha využíva lektín viažuci manán (MBL), proteín podobný klasickej aktivačnej dráhe C1q, ktorý sa viaže na manózové zvyšky a iné cukry na membráne, čím umožňuje rozpoznanie rôznych patogénov. MBL je proteín patriaci do zbernej skupiny proteínov produkovaných pečeňou a môže aktivovať komplementovú kaskádu väzbou na povrch patogénu. MBL je 2-6 vertexová molekula, ktorá tvorí komplex s MASP-I (Mannan-binding lectin Associated Serine Protease, MBL-associated serine protease) a MASP-II. MASP-I a MASP-II sú veľmi podobné C1r a C1s klasickej aktivačnej dráhy a môžu mať spoločného evolučného predka. Keď sa vrcholy MBL určujúce uhľohydráty viažu na špecificky orientované manózové zvyšky na fosfolipidovej dvojvrstve patogénu, aktivujú sa MASP-I a MASP-II a štiepia proteín C4 na C4a a C4b a proteín C2 na C2a a C2b. C4b a C2a sa potom spoja v povrchový patogén tvorbou C3 konvertázy, zatiaľ čo C4a a C2b pôsobia ako chemoatraktanty.

Bunková imunitná odpoveď

Vírus, ktorý sa dostal do tela, je endocytovaný makrofágmi a následne čiastočne zničený v endoplazmatickom retikule (1). V dôsledku toho vznikajú cudzie fragmenty, ktoré sú obnažené na bunkovom povrchu makrofágov (2). Tieto fragmenty sú „predložené“ špeciálnou skupinou membránových proteínov (MHC proteíny). Komplex vírusového fragmentu a proteín hlavného histokompatibilného komplexu [MHC (MHC)] rozpoznávajú a viažu T-bunky pomocou špecifických (T-bunkových) receptorov. Spomedzi obrovského počtu T buniek má len niekoľko T buniek vhodný receptor (3).Väzba vedie k aktivácii týchto T buniek a objaveniu sa ich selektívnych kópií (4, "klonálna selekcia"). Rôzne signálne proteíny podobné hormónom, interleukíny [IL (IL), pozri str. 378]. Tieto proteíny sú vylučované tými bunkami imunitného systému, ktoré sú aktivované, keď sú naviazané na T bunky. Aktivované makrofágy s prezentovaným vírusovým fragmentom teda vylučujú IL-1 (5) a T bunky produkujú IL-2 (6), ktorý stimuluje ich vlastné klonálne kopírovanie a replikáciu T-pomocných buniek.

Klonované a aktivované T bunky vykonávajú rôzne funkcie v závislosti od ich typu. Cytotoxické T bunky (v zelenom diagrame) sú schopné rozpoznať a viazať tie bunky tela, ktoré sú infikované vírusmi a nesú fragmenty vírusu na svojich MHC receptoroch (7). Cytotoxické T bunky vylučujú perforín, proteín, ktorý preniká cez membránu naviazanej infikovanej bunky, čo vedie k bunkovej lýze (8).

Naopak, T-pomocníci (v modrom diagrame) sa viažu na B-bunky, ktoré na svojom povrchu prezentujú fragmenty vírusu asociované s MHC proteínom (9). To vedie k selektívnemu klonovaniu jednotlivých B buniek a ich masívnej proliferácii, Interleukín stimuluje (10) dozrievanie B buniek - transformáciu na plazmatické bunky (11) schopné syntetizovať a vylučovať protilátky (12)

V literatúre je opísaný veľký počet metód na kvantifikáciu fagocytózy. Objem tejto knihy nám neumožňuje podrobne opísať všetky, preto sa obmedzíme na opis len niektorých.

Materiály a vybavenie

Ak chcete pracovať, musíte mať:

Citrátextrózový antikoagulant: 8 g kyseliny citrónovej. 22 g trisubstituovaného citrátu sodného (dvojvoda), 24,5 g glukózy sa rozpustí v 1 litri vody;

Roztok dextrosodextránu: 4,5 g NaCl, 25 g glukózy, 30 g dextránu (rel. mol. hmotnosť 500 000) v 1 1;

Roztok chloridu amónneho: 9 dielov 0,83 % chloridu amónneho, 1 diel Tris-HCl pufra pH 7,2 (20,6 g/l);

Zmes ficoll - vizotrast: 9 g ficollu, 20 ml vizotrastu, 100 ml dvakrát destilovanej H 2 0, hustota 1,077;

Substrát pre β-glukuronidázu: 31,5 mg p-nitrofenyl-β-glukuronidu a 100 um Triton X 100 sa rozpustí v 100 ml 0,05 M pufra octanu sodného pH 5;

Reagencie z nedostatku myeloperoxidázy: fixačné činidlo (10 ml 37 % formaldehydu s 90 ml absolútneho etanolu), roztok substrátu (100 ml 30 % EDTA, 0,3 g benzidínchloridu, 0,038 g ZnS0 4 x 7H 2 0, 1 ml destilovanej vody, 1,0 g CH 3C00Nax3H20, 0,7 ml 3% H202); upravte pH 1,0 M NaOH na 6,0.

Komerčné činidlá:

FSB, Hankov roztok a Eagle-MEM médium (Štátny inštitút pre imunitné prípravky a živné médiá, Berlín-Weissensee, NDR);

heparín (5000 IU/mg) (Gedeon Richter, Maďarsko);

Sérum embryí hovädzieho dobytka (Flow Laboratories, USA, možno použiť inú spoločnosť);

Visotrast (VEB Fahlberg List, Magdeburg, NDR);

Infucoll (VEB Serumwerk Bernburg, NDR);

Dextran, ficoll (Pharmacia, Švédsko);

Koloidný uhlík Сl1/143a (Wagner, Pelikanwerke, Nemecko);

diizodecylftalát, paradioxán (Coleman, Matheson and Bell, USA);

Triton X 100 (Serva, Nemecko, je možná iná spoločnosť);

Oil red O (Allied chemical corp., Morristown, NY, USA);

Iaranitrofenyl-p-glukuronid (Sigma, USA);

Safranin O (Fischer Scientific Lab., Chicago, USA);

Polystyrénové guľôčky, rúrky (Nunc, Dánsko);

Mriežka F 905 (VEB Orvo Wolfen, NDR).

Získanie fagocytov

Potrebné informácie o izolácii ľudských granulocytov možno získať v kapitole „Separácia buniek imunitného systému“; pre získanie peritoneálnych makrofágov pozri časti "Kultivácia makrofágov a monocytov" a "Izolácia makrofágov zo suspenzie splejocytov". Touto problematikou sa podrobne zaoberá množstvo prác.

Okrem toho by sa mali uviesť aj tieto metódy:

8 ml krvi sa zmieša s roztokom dextranglukózy. Potom sa pridá 6 % roztok dextránu 75 v 0,15 M NaCl (5 ml). Zmes sa nechá 45 až 50 minút pri teplote miestnosti na sedimentáciu erytrocytov. Odsajte plazmu. Zvyškové erytrocyty sa lyzujú pridaním 0,83 % chloridu amónneho (35 ml až 15 ml plazmy). Centrifugujte 10 minút pri 80 g, zrazeninu suspendujte v 0,15 M NaCl ochladenom na 0 °C. Zmiešajte niekoľko precipitátov a centrifugujte 10 minút pri 800 g. Bunky sa najlepšie uchovávajú na ľade v 0,15 M NaCl (toto médium je vhodnejšie ako pufrované médiá s dvojmocnými katiónmi, ktoré spôsobujú zlepenie buniek);

Ak sú predmetom fagocytózy kvasinky, krok spracovania chloridom amónnym možno vynechať, pretože červené krvinky neinterferujú s procesom. Mononukleárne bunky je možné získať nasledovne: heparinizovanú krv zmiešame s 1/3 objemu Eaglovho média s obsahom 15 % glukózy, navrstvíme na vrstvu zmesi ficoll – visotrast a odstredíme 20 minút pri 400 g. Frakcia mononukleárnych buniek sa odsaje Pasteurovou pipetou, dvakrát sa premyje PBS a pripraví sa suspenzia v Eaglovom médiu (1x107 buniek/ml).

Príprava častíc na fagocytózu

Častejšie sa používajú živé kultúry Staphylococcus aureus (SG 511 alebo 502 A), Staphylococcus epididermidis SG 475, E. coli a iných enterobaktérií, listérií, korynebaktérií, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae. Mikroorganizmy sa pestujú 24 hodín (v prípade potreby 48 hodín) na pevnom a tekutom živnom médiu. Zozbieraná biomasa sa trikrát premyje 0,15 M NaCl. Príliš hustá suspenzia sa meria pri 640 nm, koncentrácia sa určuje z kalibračnej krivky.

Koncentrácia mikroorganizmov je tiež určená metódami preosievania na hustých živných médiách; v niektorých prípadoch je možné vykonať sčítanie mikroorganizmov v počítacích komorách.

Pri práci so živými bakteriálnymi kultúrami je potrebné dbať na to, aby sa kultúry používali vždy v rovnakom štádiu. Pridanie 0,01 % hovädzieho sérového albumínu podporuje prežitie mikroorganizmov. Pripravená suspenzia zostáva stabilná 1-2 hodiny.

Kultúry usmrtených mikroorganizmov sa zvyčajne získavajú zahrievaním počas 30 minút na 80 °C alebo pôsobením prúdiacej pary. Usmrtené mikróby sa trikrát premyjú 0,15 M NaCl, resuspendujú sa a stanoví sa koncentrácia suspenzie.

Príprava pekárskeho droždia: 0,5 g pekárskeho droždia sa suspenduje v 0,15 M NaCl a umiestni sa na 30 minút do vriaceho vodného kúpeľa. Prefiltrujte cez filter z bavlnenej gázy. Pri použití živých kvasiniek sa čerstvé bunky (4-5 dňová kultúra) trikrát premyjú v Eaglovom médiu s prídavkom 1,0 % glukózy. Zvyčajne sa používa bunková suspenzia 108 a 109 buniek/ml. Kvasinky sa používajú ako testovacie častice pri zisťovaní defektov v komponente C5.

Použitie suspenzie polystyrénových častíc: Pripravte 10% vodnú suspenziu polystyrénových častíc s priemerom 1,091 μm. Zriedi sa v pomere 1 + 1 0,2 % roztokom BSA v 0,15 M NaCl, odstredí sa. Pri vlnovej dĺžke 253 nm poskytuje suspenzia polystyrénu 1 μg/ml absorpciu 1,17 x 10-3.

Aplikácia suspenzie lipopolysacharidu - olejová červeň O v minerálnom oleji: 2 g olejovej červene sa rozotrie v 50 ml diizodecylftalátu (alebo vazelínového oleja) v porcelánovej mažiari. Centrifugujte 20 minút pri 500 g. Pridajte 10 μg frakcie supernatantu do 10 ml dioxínu, zmerajte optickú hustotu pri vlnovej dĺžke 525 nm. Konverzný faktor je 0,92. V druhom stupni sa 40 mg lipopolysacharidu (E. coli 0,26 B6 atď.) rozpustí v 3 ml 0,15 M NaCl. Potom sa k tejto zmesi pridá 1 ml roztoku olejovej červenej O v diizodecylsulfáte a zmes sa suspenduje počas 90 sekúnd. Suspenzia sa ihneď použije a môže sa zmraziť.

Na nastavenie reakcie fagocytózy sa ako testovacie častice môžu použiť formalizované erytrocyty.

Fagocytóza baktérií, baktericídna

Experiment so suspenziou živých baktérií: Zvyčajne sa používa pomer 3-10 mikróbov/fagocyt. V celkovom objeme 2 ml sa zmieša 1x106 fagocytov s 3x106 - 1x107 mikróbov. V praxi sa 1 ml bakteriálnej suspenzie pridá do 1 ml suspenzie fagocytov, do ktorej sa pridalo 8 IU heparínu. Interakčný čas je zvyčajne 30 minút, v niektorých prípadoch je dlhší. Po inkubácii sa odoberie 0,5 ml zmesi, pridá sa 1,5 ml 0,1% roztoku želatíny v Hankovom roztoku ochladenom na 0 °C a centrifuguje sa 3-4 minúty pri 300 g. Zo zrazeniny sa pripravia nátery, ktoré sa farbia podľa Pappenheima. Zobrazte 200 buniek (ak je to možné trikrát). Vypočítajte percento fagocytózy. Podľa počtu baktérií obsiahnutých v bunkách sa vypočíta index aktivity fagocytózy: počet fagocytovaných baktérií sa vynásobí percentom fagocytujúcich buniek; intenzita fagocytózy je vyjadrená číslami od 1 do 4.

Stupeň 1: Fagocytovaný baktériami I-4
Stupeň 2: fagocytované 5-7 baktérií
Stupeň 3: fagocytované 8-10 baktérií
Stupeň 4: Fagocytovalo sa viac ako 10 baktérií na bunku

Pri stanovení úrovne fagocytózy živých mikróbov sa oddelene kontroluje bunkový sediment a frakcia supernatantu. Počet živých mikróbov sa stanoví preosiatím na pevných živných pôdach 0,1 ml študovaných frakcií. Inkubované 24 (48) hodín Pri výpočte baktericídnej aktivity sa predpokladá, že jedna vytvorená kolónia zodpovedá jednému živému mikróbu.

Na cielenú štúdiu baktericídnej aktivity sa krv pacientov a zdravých darcov vyšetruje s pridaním roztoku antibiotika (5 000 IU penicilínu a streptomycínu / ml) a bez neho a vykonáva sa aj bakteriálna kontrola. Zloženie vzorky: 0,3 ml Hankovho roztoku + 0,1 ml normálneho séra získaného z krvi odobratej od 5 darcov + 0,5 ml suspenzie leukocytov (10 7 buniek / ml) + 0,1 ml mikrobiálnej suspenzie (10 6 mikróbov/ml). Pridá sa roztok antibiotík v 0,02 ml na vzorku. Vzorky inkubujte pri 37 °C a po 20 minútach, 1,5 hodine a 3 hodinách stanovte počet mikróbov. Na tento účel odoberte z každej vzorky 0,1 ml, vybrané alikvotné časti rozrieďte Hankovým roztokom 10, 100 a 1000-krát a naneste na zohriaty agar. Niekedy, najmä ak boli pridané antibiotiká, sa pripravia prechodné riedenia na presné počítanie mikróbov (napríklad 0,2 ml vzorky sa zmieša s 5 ml Hankovho roztoku, odstredí sa 5 minút pri 450 g, zrazenina sa rozpustí v 1,9 ml PBS, naneseného na agar). Ak chcete skrátiť trvanie bakteriologickej štúdie, môžete mikróby vo vnútri bunky určiť fluorescenciou pomocou farbenia akridínovou žltou.

Fagocytóza pekárskych kvasníc: pripravte suspenziu 10 9 buniek/ml v 0,15 M NaCl. Zmiešajte 0,1 ml suspenzie s 0,1 ml plazmy pacienta, inkubujte 30 minút pri 37 °C, pridajte 0,2 ml (106) PMNL, inkubujte 30 minút. Alikvóty sa odoberajú v intervaloch 5 až 30 minút. Spočíta sa 100 PMN a určí sa počet zachytených častíc kvasiniek na bunku. Známa je nasledujúca modifikácia: 50 µl testovacieho séra sa pridá k 50 µl séra z morčiat (predtým sa riedi v pomere 1 + 1 Eaglovým médiom s glukózou), 50-200 µl suspenzie leukocytov ( 107 buniek/ml), objem sa upraví na 450 ul strednou ihlou s glukózou a inkubuje sa 30 minút pri 37 °C. Potom pridajte 50 μl kvasinkovej suspenzie (10 8 buniek/ml), premiešajte a inkubujte 40 minút pri 37 °C. Pridajte 50 μl L-75 Se-metionínu (celková aktivita 100 kBq), premiešajte a inkubujte 1 hodinu pri 37 °C. Bunky sa vyzrážajú centrifugáciou počas 5 minút pri 1000 g, premyjú sa dvakrát PBS, rádioaktivita sa meria na gama čítači. Percento fagocytovaných kvasiniek sa vypočíta podľa vzorca:

Fagocytóza s použitím roztoku olejovej červene v minerálnom oleji: 0,2 ml suspenzie častíc sa zmieša s 0,8 ml bunkovej suspenzie predhriatej na 37 °C. Po 5 minútach inkubácie sa pridá 6 ml 0,15 M roztoku NaCl ochladeného na 0 °C obsahujúceho 126 ug/l N-etylmaleimidu (na zastavenie zachytávania častíc). Centrifugujte 10 minút pri 250 g. Frakcia supernatantu sa vyhodí, zrazenina sa resuspenduje v roztoku NaCl a N-etylmaleimidu (pozri vyššie), bunky sa dvakrát premyjú. Bunky sú lyzované ultrazvukom, uvoľňuje sa olejová červeň. Pridajte 1 ml dioxánu. Centrifuguje sa 15 minút pri 500 g, zmeria sa optická hustota pri vlnovej dĺžke 525 nm oproti čistému dioxánu. Stupeň fagocytózy (IF) je definovaný ako množstvo minerálneho oleja (mg) absorbovaného za minútu 107 bunkami. Na výpočet môžete použiť nasledujúci vzorec:

Štúdium fagocytózy v monovrstve makrofágov:

1. Fáza: 2 ml bunkovej suspenzie (200 000 buniek/ml) sa pridajú do sterilných polystyrénových skúmaviek. Inokulujte 5 hodín pri 37 °C, potom premyte Eaglovým médiom. Do skúmaviek sa pridajú 2 ml kultivačného média s 10 % inaktivovaným (30 minút, 56 °C) sérom embryí hovädzieho dobytka a inkubujú sa pri 37 °C.

2. Fáza A: zavedie sa suspenzia mikróbov (3-10/makrofág), inkubuje sa 30-60 minút pri 37 °C, skúmavky sa 6-krát prepláchnu 3 ml podielmi média, aby sa odstránili nefagocytované mikróby. Ihneď zafixujte zmesou 1 dielu ľadovej kyseliny octovej a 3 dielov metanolu. Farbiť prípravok podľa May - Griinwald, spočítať bunky.

Fáza B: stanovenie intracelulárnych živých baktérií. Postupnosť operácií je rovnaká ako vo fáze A pred fázou fixácie. Po umytí opatrne odstráňte všetky stopy média. Bunky sa lýzujú, pričom sa pridajú 2 ml 0,01 % sterilného roztoku albumínu hovädzieho séra (4 °C), pričom sa opakovane pretrepáva. Väčšina buniek sa lýzuje po 20 minútach. Uvoľnené baktérie sa určujú preosievaním na hustých živných médiách.

Fagocytóza erytrocytov: zmiešajte 4x107 fagocytov s 5x107 testovaných erytrocytov v 5 ml PBS. Preneste 2 ml zmesi do 5 mM fosfátového pufra ochladeného na 0 °C a odstreďte. Zmerajte optickú hustotu frakcie supernatantu pri vlnovej dĺžke 420 nm. Stupeň fagocytózy je určený znížením obsahu hemoglobínu v bezbunkovej fáze pomocou kalibračných kriviek.

Zjednodušená metóda na určenie vôle

Príklad stanovenia klírensu u potkanov: zvieratám sa intraperitoneálne injikuje 5 x 107 mikróbov na 100 g hmotnosti (0,1 ml//100 g). Optimálna dávka sa môže pohybovať od 10 6 do 10 8 na 100 g hmotnosti. V intervale 1-2 hodín sa zabíjajú 3 jedince z každej skupiny pokusných zvierat; celkové trvanie experimentu 16 hodín. Sterilne odoberte 0,5 ml krvi zo srdca, 1 ml peritoneálnej tekutiny, vylúčte pľúca, pečeň, slezinu a obličky. Z tkaniva orgánu sa Pasteurovou pipetou vyrežú valce. Stanovte počet mikroorganizmov kultiváciou na tekutých a pevných živných pôdach.

Príklad stanovenia klírensu u myší: používa sa koloidné uhlie alebo značené 51 [Cr] baraními erytrocytmi. Myšiam (najmenej 5 jedincov na skúsenosť) sa intravenózne vstrekne 0,01 ml suspenzie uhlia rýchlosťou 16 mg na 100 g hmotnosti. Do 15 minút s intervalom 2 minút sa odoberie 0,025 ml krvi z retroorbitálneho priestoru. Zvolených 0,025 ml krvi sa pridá k 2,0 ml 0,1 % roztoku Na2C03. Po hemolýze sa koncentrácia uhlia stanoví kolorimetricky pri vlnovej dĺžke 675 nm pomocou kalibračných kriviek.

t je čas v minútach, C je koncentrácia uhlíka vo vzorke.

Korigovaná hodnota fagocytózy:

Funkčný skríning fagocytov

Stanovenie degranulácie (meranie aktivity (β-glukuropidáza): 10 7 leukocytov sa suspenduje v 0,8 ml PBS v plastových skúmavkách, pretrepáva sa 5 minút pri 37 °C. Pridá sa 0,2 ml senzibilizovaného LPS, fluorochrómne častice (FC 80), ochladí sa na 30 °C minút na ľade, odstreďovať 10 minút pri 250 g Skontrolujte aktivitu enzýmu v supernatantovej frakcii Inkubujte 0,9 ml substrátovej zmesi 18 hodín s 0,1 ml skúmanej frakcie Pridajte 2 ml 0,1 M NaOH, zmerajte optickú hustotu na vlne 410 nm.

Kalkulácia:

(OD 410 x20)/(1,84x18) = počet nmol látky uvoľnenej za 1 hodinu 107 leukocytmi, t.j. stupeň degranulácie je vyjadrený v nanomóloch paranitrofenyl-β-glukuronidu.

Metóda stanovenia defektov myeloperoxidázy: najlepšie výsledky sa získajú biochemickým stanovením H 2 0 2, čo naznačuje zmeny metabolizmu počas fagocytózy. Pre praktické účely je veľmi dôležité, aby aktivácia hexóza-monofosfátového skratu, redukcia tetrazóliumnitroénu a väzba exogénneho jódu na PMNL proteíny korelovali s tvorbou H 2 0 2 . Bežný krvný náter sa fixuje na 30 sekúnd zmesou alkoholu a formalínu. Premyté destilovanou vodou a zafarbené na peroxidázu počas 30 sekúnd. V bunkách obsahujúcich peroxidázu sa detegujú inklúzie zafarbené na tmavomodro.

Test na redukciu tetrazóliovej nitromodrej (TNS). THC sa normálnym PMNL redukuje na formazan. Zmiešajte s 0,1 ml krvi 0,1 ml 0,1 % roztoku THC v 0,15 M NaCl, inkubujte 20 minút pri 37 °C, znova dôkladne premiešajte. Inkorporácia formazanu do buniek sa stanoví mikroskopicky. Výsledok je vyjadrený ako percento buniek pozitívnych na formazan.

Nasledujúca metóda je o niečo zložitejšia: 1 kvapka krvi pacienta sa aplikuje na krycie sklíčko. Inkubujte 20 minút pri 37 °C vo vlhkej komore, potom opatrne umyte sklo sterilným 0,15 M NaCl. Umiestnite krycie sklíčko na sklíčko obsahujúce 1 kvapku média THC (0,5 ml séra + 0,3 ml sterilného 0,15 M NaCl + 0,6 ml THC, pozri vyššie). Inkubujte 30 minút vo vlhkej komore pri 37 °C, odstráňte krycie sklíčko a vysušte na vzduchu. Fixujte absolútnym metanolom počas 60 sekúnd a premyte destilovanou vodou. Farbiť 5 min safranínom (1 g safranínu + 100 ml destilovanej vody + 40 ml glycerínu), umyť. Formazan-pozitívne bunky sú veľké, podobné výbuchom a obsahujú modré granuly. Zvyčajne sa v prípravku deteguje asi 30 % buniek pozitívnych na formazan.

Vyššie uvedené metódy hodnotenia fagocytózy sú súhrnom veľmi veľkého počtu publikácií. Podrobnejšie informácie o týchto otázkach nájdete v príslušných prácach.