Szczepionka DNA(Również szczepionka genowa, szczepionka kwasu nukleinowego)- genetycznie zmodyfikowany konstrukt, który po wprowadzeniu do komórki zapewnia produkcję białek patogenu lub antygenów nowotworowych i wywołuje odpowiedź immunologiczną. Wprowadzenie do organizmu szczepionek DNA nazywa się immunizacją genetyczną. Szczepienie DNA ma kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnymi szczepionkami. W szczególności wykazano, że takie szczepionki zapewniają nie tylko wytwarzanie przeciwciał (odporność humoralna), ale także swoistą odpowiedź cytotoksyczną (odporność komórkową), która była wcześniej osiągalna tylko przy użyciu żywych szczepionek. Obecnie szczepionki DNA nie są stosowane w leczeniu ludzi, ale przewiduje się, że immunizacja genetyczna pomoże przezwyciężyć szereg chorób.

Historia stworzenia

Pomysł wykorzystania fragmentów DNA do szczepień pojawił się w latach 50. i 60. XX wieku. Po serii eksperymentów odkryto, że informacja genetyczna DNA zachowuje zdolność do transkrypcji i translacji po przeniesieniu do innej komórki. W tym samym roku odkryto, że wprowadzenie genomu wirusa polio do zwierząt stymuluje produkcję przeciwciał. Później wykazano aktywację odporności humoralnej dla cząsteczek DNA pochodzących z czynników niezakaźnych. Od lat 90. laboratoria naukowe zaczęły coraz intensywniej badać immunostymulujące właściwości DNA. W 1992 roku Tang i współpracownicy wykazali, że gen ludzkiego hormonu wzrostu wprowadzony do plazmidu ulega stabilnej ekspresji u myszy, a zsyntetyzowany hormon jest rozpoznawany przez układ odpornościowy jako antygen i stymuluje produkcję przeciwciał. Proces wprowadzania plazmidowego DNA w celu stymulacji odporności humoralnej nazwano Tango „immunizacją genetyczną”. Jednak w następnym roku inna grupa naukowców stwierdziła, że ​​wprowadzenie plazmidu kodującego białka wirusa grypy powoduje zarówno odpowiedź humoralną, jak i komórkową. Indukcję obu gałęzi odporności z tego samego roku stwierdzono również dla plazmidu zawierającego geny HIV. Od 1995 roku zaczęły pojawiać się dowody na to, że szczepienie DNA może aktywować układ odpornościowy przeciwko rakowi. Około 20 lat temu miały miejsce pierwsze próby kliniczne szczepionek DNA, które przede wszystkim miały wykazać bezpieczeństwo nowej metody. Pacjentom wstrzyknięto geny wirusa HIV, wirusa grypy, opryszczki, zapalenia wątroby typu B, czynnika wywołującego malarię. Wyniki wszystkich testów były dość zachęcające: szczepionki DNA były konsekwentnie wyrażane, wywoływały odpowiedź immunologiczną i nie powodowały poważnych skutków ubocznych, co było impulsem do dalszych badań.

Budowa szczepionki DNA

Strukturalnie szczepionka DNA jest sekwencją nukleotydową osadzoną w wektorze, który koduje określony antygen lub antygeny. Wektor w inżynierii genetycznej to cząsteczka kwasu nukleinowego, która służy do dostarczania materiału genetycznego do komórek i zapewnia jego replikację lub ekspresję. Wcześniej do transportu genów do komórki używano wektorów opartych na wirusach: zmodyfikowanego (osłabionego) wirusa ospy wietrznej, adenowirusów i retrowirusów. Wektory wirusowe są dość skuteczne, ale mają duże prawdopodobieństwo wystąpienia skutków ubocznych związanych ze stosunkowo wysoką immunogennością samego wektora. Dlatego dzisiaj jako wektor najczęściej stosuje się plazmid bakteryjny - małą stabilną kolistą cząsteczkę DNA zdolną do autonomicznej replikacji. Sam plazmid nie wywołuje pożądanej specyficznej odpowiedzi immunologicznej, w tym celu wszyte są w niego geny białek immunogennych. Ponadto szczepionka DNA musi zawierać sekwencje regulatorowe niezbędne do ekspresji genów w komórkach eukariotycznych. Gotowy konstrukt DNA jest dostarczany do komórki bakteryjnej, gdzie zwiększa się liczba jego kopii. Po tym następuje izolacja i oczyszczanie plazmidów niosących pożądaną wstawkę.

Projekt wektorów plazmidowych

Ważnym etapem tworzenia szczepionek DNA jest zaprojektowanie (konstrukcja) wektora. Obowiązkowe struktury wektora plazmidowego to miejsca restrykcyjne, marker selekcyjny i początek replikacji szczepionki DNA w komórce bakteryjnej. Aby zaszła synteza antygenu, szczepionka DNA musi zawierać promotor i sygnał poliadenylacji. Promotor jest ważnym czynnikiem skuteczności szczepionki, ponieważ decyduje o sile odpowiedzi immunologicznej: im większa ekspresja genu kodującego antygen wirusowy lub nowotworowy, tym silniejsza odpowiedź immunologiczna. Najczęściej stosowanym promotorem jest wirus SV40 lub wirus cytomegalii (CMV). Aby ustabilizować transkrypty mRNA, do plazmidu wprowadza się sygnał poliadenylacji, najczęściej pochodzący z genu bydlęcego hormonu wzrostu. (BGH) lub wirus SV40. Jako markery selekcyjne wybiera się bakteryjne geny oporności na antybiotyki, często gen oporności na kanamycynę. Przy projektowaniu szczepionek DNA najpopularniejszy punkt pochodzenia replikacji Escherichia coli.

Selekcja genów do szczepień

Wektor jest ważnym składnikiem szczepionki DNA, ale o jego immunogenności decyduje właśnie wstawka, czyli sekwencja DNA kodująca antygen. Spośród antygenów wirusowych najlepiej nadają się do immunizacji białka fuzyjne, które są stosunkowo konserwatywnymi białkami, które umożliwiają wirusowi wniknięcie do komórki. W celu szczepienia przeciwko bakteriom Gram-dodatnim wskazane jest wprowadzenie do wektora plazmidowego genów tych białek bakteryjnych, które determinują patogenezę choroby. Wśród białek bakterii Gram-ujemnych mają wysoką immunogenność. W terapeutycznych szczepionkach przeciwnowotworowych DNA stosuje się białka markerowe komórek rakowych.

Metody dostarczania szczepionek DNA do komórek

Gotową szczepionkę należy dostarczyć do organizmu człowieka lub zwierzęcia, gdzie jej przeznaczeniem są komórki prezentujące antygen (APC) – makrofagi, komórki dendrytyczne, limfocyty B. Tutaj nastąpi synteza i potranslacyjna modyfikacja antygenu, po czym zostanie on wprowadzony do błony komórkowej, aby przyciągnąć uwagę układu odpornościowego. Głównym problemem jest dostarczenie wystarczającej ilości plazmidu do APC. Metody dostarczania materiału genetycznego do komórki dzieli się zwykle na 2 grupy: wirusowe i niewirusowe. Ponieważ wektory wirusowe mają wiele istotnych wad, w tej sekcji przedstawiono tylko niewirusowe metody dostarczania szczepionek DNA.

mikrowstrzykiwanie

Na początku lat 90. mikroiniekcje domięśniowe były najczęstszym sposobem wprowadzania DNA do komórki ze względu na prostotę metody. Aby to zrobić, DNA rozpuszcza się w wodzie lub roztworze izotonicznym, w razie potrzeby dodaje się adiuwant (substancję wzmacniającą odpowiedź immunologiczną). Następnie za pomocą cienkiej szklanej rurki roztwór wstrzykiwany jest do tkanki mięśniowej, gdzie rolę APC pełnią komórki dendrytyczne. W jądrze komórki dendrytycznej szczepionka zaczyna ulegać ekspresji i następuje synteza białek antygenowych. Za pomocą mikroiniekcji DNA można wstrzykiwać podskórnie do grasicy, wątroby i tkanki nowotworowej, jednak najdłuższą (do roku) ekspresję szczepionki DNA obserwuje się w tkance mięśniowej. Ze względu na wysokie stężenie komórek Langerhansa (podtyp komórek dendrytycznych) skóra jest atrakcyjnym celem szczepień DNA. Do podawania śródskórnego (podskórnego) stosuje się szereg mikroigieł o długości kilkuset mikronów. Istnieją różne możliwości szczepienia śródskórnego. Łatwiej jest włączyć szereg mikroigieł do obluzowania warstwy rogowej skóry (zewnętrznej warstwy skóry, zwykle 10-20 mikronów) w celu zwiększenia jej przepuszczalności dla dalszych miejscowych wstrzyknięć roztworu DNA. Skuteczniejsze jest zastosowanie mikroigieł pokrytych suchą szczepionką, która rozpuszcza się pod skórą. Skuteczność tej metody jest zwykle niska, ponieważ DNA najpierw wchodzi do przestrzeni międzykomórkowej, a dopiero potem zostaje włączone do komórek.

elektroporacja

Elektroporacja to tradycyjne podejście do dostarczania DNA do komórek bakteryjnych i kultur komórkowych oparte na zastosowaniu impulsu elektrycznego. Taki impuls tworzy pory w błonie komórkowej, co ułatwia wejście ujemnie naładowanego DNA. Metoda ta została zaadoptowana do dostarczania szczepionek DNA zwierzętom i ludziom i może znacząco zwiększyć wydajność konwencjonalnej iniekcji. Urządzenie do elektroporacji zawiera źródło prądu elektrycznego oraz jednorazową siatkę, która składa się ze strzykawki i elektrod igłowych. Strzykawka wstrzykuje szczepionkę w tkankę mięśniową, a elektrody wytwarzają pole elektryczne, które ułatwia wnikanie DNA do miocytów i komórek dendrytycznych. Do tej pory opracowano urządzenia, które mogą zwiększyć skuteczność szczepienia 1000 razy w porównaniu z konwencjonalną iniekcją. Elektroporację można stosować zarówno do domięśniowego, jak i podskórnego podawania szczepionki DNA. Wadą są lekkie zakwasy w miejscu wstrzyknięcia, konieczność stosowania specjalistycznych urządzeń. Zamiast pola elektrycznego można zastosować pole magnetyczne. Takie urządzenia działają na tej samej zasadzie, ale w tym przypadku zabieg jest całkowicie bezbolesny i mniej szkodliwy dla komórek.

Działanie pola elektrycznego nie tylko wzmaga wchłanianie szczepionki DNA przez komórki, ale także stymuluje rozwój odpowiedzi immunologicznej. Zastosowanie elektroporacji prowadzi do niewielkich uszkodzeń tkanek - rozwija się miejscowy proces zapalny. Kiedy komórki ulegają uszkodzeniu, uwalniane są chemokiny, do których trafiają makrofagi, limfocyty i komórki dendrytyczne. Zwiększenie stężenia komórek odpornościowych w miejscu wstrzyknięcia zwiększa skuteczność szczepionki.

Sonoporacja

Sonoporacja to metoda przenoszenia obcego DNA do komórek za pomocą ultradźwięków. Ultradźwięki zwiększają przepuszczalność błony komórkowej, dzięki czemu egzogenny DNA łatwiej przenika do komórki. Sonoporation został po raz pierwszy użyty do przeniesienia genów do komórki w 1986 roku. Metoda ta służy do wprowadzania cząsteczek DNA do komórek rogówki, mózgu, tkanki kostnej, nerek, trzustki, tkanki embrionalnej, mięśni szkieletowych i sercowych. W porównaniu z innymi metodami sonoporacja jest mało zbadana, potrzeba znacznie więcej wysiłku, aby poprawić jej skuteczność, zwłaszcza na poziomie całego organizmu.

Transfekcja balistyczna

Transfekcja balistyczna polega na łuskaniu (bombardowaniu) narządów i tkanek mikrocząsteczkami metali ciężkich (złoto, wolfram) o średnicy 1-3 mikronów pokrytych cząsteczkami DNA. Wprowadzona w ten sposób szczepionka DNA ulega ekspresji w komórkach docelowych, a ich produkty przedostają się do krwiobiegu. Aby zapewnić przyspieszenie cząstek, stosuje się urządzenie podobne do broni strzeleckiej - pistolet genowy lub pistolet genowy. Mikrocząsteczki przechodzą przez błony komórkowe i przenoszą konstrukt genetyczny bezpośrednio do jądra komórkowego. Głębokość penetracji mikrocząstek z reguły jest niewielka - do 1 mm, więc metodę stosuje się głównie do transfekcji skóry lub sąsiedniej tkanki chrzęstnej. Specjalne warunki łuszczenia pozwalają mikrocząsteczkom wnikać na głębokość 4-5 mm i przenosić konstrukty genów do włókien mięśni poprzecznie prążkowanych. Zazwyczaj komórki znajdujące się bezpośrednio w środku wykrojnika śrutowego, natomiast w strefie 0,6-1 cm od środka są najbardziej skutecznie protransformowanymi komórkami. Ta technologia jest również nazywana biobalistyką lub biolistyką.

Pierwszy pistolet genowy został stworzony przez grupę naukowców w latach 1983-1986 w celu transformacji komórek roślinnych. Był to pistolet opracowany z urządzenia do automatycznego wbijania gwoździ. DNA z genu reporterowego (markerowego) nałożono na kulkę wolframową i wstrzelono na szalkę Petriego. Ekspresja genu reporterowego wskazywała na skuteczność immunizacji. Obecnie cząsteczki złota lub srebra są używane do dostarczania DNA, ponieważ nie są toksyczne dla komórki, w przeciwieństwie do cząsteczek wolframu.

Pod wysokim ciśnieniem

W 1999 roku opracowano urządzenia do wstrzykiwania, które są zdolne do podawania szczepionki DNA bez użycia igły. Takie urządzenia działają dzięki sile Lorentza: mały silny magnes wytwarza znaczne ciśnienie, uruchamia tłok, który wyrzuca lek z prędkością dźwięku. Zmieniając aktualną siłę, możesz wybrać głębokość wstrzyknięcia i dawkować leki. Zabieg jest całkowicie bezbolesny i był wcześniej stosowany do podawania insuliny pacjentom z cukrzycą oraz do szczepień na dużą skalę. Istotną wadą tej metody jest to, że wysokie ciśnienie może teoretycznie zmienić strukturę wstrzykiwanych cząsteczek. Jednak ta technologia wstawiania jest nadal ulepszana, a dziś opracowano urządzenia, które mogą dostarczać DNA na głębokość do 16 mm.

Jako część żywego wektora bakteryjnego

Żywe wektory bakteryjne to szczepy salmonela, Shigella lub listeria, które niosą mutację w genach biosyntezy lub inwazji, które eliminują patogenność i zdolność do utrzymania ich żywotności w organizmie gospodarza lub środowisku. Zamiast tego do genomu bakteryjnego wstawia się niezbędne geny dla białek immunogennych. Atenuowaną bakterię podaje się doustnie (przez usta, połykanie) lub donosowo (przez wstrzyknięcie do otworu nosowego), więc ta metoda szczepienia nie wymaga żadnego sprzętu. Ponadto takie podawanie stymuluje odpowiedź immunologiczną błony śluzowej, co jest ważne, ponieważ większość patogenów dostaje się do organizmu przez usta i otwory nosowe. Omijając żołądek, osłabiona bakteria dostaje się do jelita cienkiego. Ponadto bakteria przenika do blaszek Peer - jelitowych węzłów chłonnych. W środku kęp Peyera bakterie stają się celem dla makrofagów i przechodzą fagocytozę. W cytoplazmie makrofagów bakteria uwalnia szczepionkę DNA, po czym DNA wchodzi do jądra, a układ odpornościowy unieszkodliwia bakterię.

Pakowanie w liposomach

Liposomy - kuliste formacje (o średnicy około 100 nm), składające się z podwójnej warstwy lipidowej. Liposomy są wydrążone w środku, które zwykle wypełnione jest rozpuszczalnikiem, ale można je wykorzystać do dostarczania różnych substancji, w tym szczepionek DNA. Ich hydrofobowa powłoka pozwala im łączyć się z błonami komórkowymi i transportować ich zawartość do komórki. Wykorzystanie liposomów rozpoczęło się w 1965 roku i stało się potężnym silnikiem rozwoju bionanotechnologii.

Obiecującą metodą bezpośredniego wprowadzenia konstruktu DNA do komórek docelowych jest dostarczenie konstruktu genetycznego w ramach liposomów kationowych zbudowanych z dodatnio naładowanych lipidów. Liposomy kationowe z ujemnie naładowaną cząsteczką DNA tworzą kompleks DNA-lipid - lipoplex. Zaletami stosowania takich kompleksów jest możliwość przenoszenia dużej ilości informacji, niezakaźność, ponadto są proste i niedrogie w produkcji. W 2003 roku powstały niezwykle małe, milimikronowe liposomy pokryte polimerem glikolu polietylenowego, które są w stanie przenosić terapeutyczne DNA przez barierę krew-mózg i dostarczać je do neuronów mózgu, co wcześniej było niemożliwe.

Składa się z polyplex

Polipleksy, układy składające się z dodatnio naładowanych polimerów (polikationów) i ujemnie naładowanych cząsteczek DNA, są wykorzystywane do wprowadzania do komórki dużych konstruktów DNA (>10 kb). Wielkość takich kompleksów jest mniejsza niż 100 nm, co z jednej strony naraża je na trawienie przez makrofagi (ponieważ reagują na cząstki większe niż 200 nm), a z drugiej są na tyle duże, że nie są filtrowane w nerki.

Polikationy kondensują cząsteczkę DNA w kompleksy, zapewniając w ten sposób jej stabilność i ochronę przed działaniem nukleaz. Jako polimery wiążące DNA mogą służyć białka kationowe, syntetyczne homopolimery aminokwasów (polilizyny, poliargininy), polisacharyd chitozanu, polietylenoamina. Zwykle polikation występuje w nadmiarze w składzie polipleksu, w wyniku czego kompleks ten jest rozpuszczalny i naładowany dodatnio. Jeżeli do polipleksu przyłączony jest ligand dla specyficznego receptora komórkowego, wówczas szczepionka DNA może być skierowana na określony typ komórki. Proces dostarczania materiału genetycznego w obrębie polipleksu obejmuje dwa etapy: zewnątrzkomórkowy (droga od miejsca wstrzyknięcia do komórek docelowych) i wewnątrzkomórkowy (oddziaływanie z komórkami docelowymi, endocytoza, wyjście z endosomów, dostarczenie do jądra). Pierwszą barierą do pokonania przez kompleks jest krew i macierz zewnątrzkomórkowa. Dlatego takie parametry fizykochemiczne polipleksu dobiera się w celu zwiększenia jego stabilności, uniknięcia niepożądanych oddziaływań z białkami krwi i reakcji immunologicznej spowodowanej chemicznym charakterem polikationu. Po dotarciu do komórek docelowych polipleks jest wchłaniany na błonie komórkowej, wchłaniany przez endocytozę, po czym musi opuścić endosom i zdysocjować na polimer kationowy i cząsteczkę DNA. Wolne DNA jest wysyłane do jądra, a kationy polimerowe opuszczają komórkę i są wydalane z organizmu.

Charakterystyka najczęstszych metod dostarczania szczepionek DNA
metoda	Zalety	Wady
Zastrzyki domięśniowe lub podskórne	Nie jest wymagany żaden specjalny sprzęt Ekspresja stała lub długoterminowa DNA jest przenoszone do sąsiednich tkanek	Słaba efektywność Wymaga stosunkowo dużej ilości DNA
elektroporacja	Wysoka wydajność	uszkodzenie tkanek
pistolet genowy	Wysoka celność Wymaga niewielkiej ilości DNA	Wymaga obojętnych mikrocząstek Uszkodzenie komórek w miejscu strzału
Wprowadzenie z powodu wysokiego ciśnienia	Stosunkowo prosta metoda Nie ma potrzeby stosowania mikrocząstek DNA może wnikać na głębokość od kilku mm do 1,5 cm	Wpływa na strukturę DNA Niska skuteczność szczepień Wymaga dużej ilości DNA (do 300 mcg)
Pakowanie w liposomach	Wysoka wydajność in vitro Łatwość produkcji Duża pojemność Można łączyć z innymi metodami Po podaniu dożylnym szczepionka może dotrzeć do wszystkich tkanek Podanie donosowe zapewnia ekspresję szczepionki w błonie śluzowej nosa oraz produkcję immunoglobulin klasy A (IgA)	Możliwa toksyczność Słaba efektywność in vivo

Mechanizm rozwoju odpowiedzi immunologicznej

Antygen zsyntetyzowany w komórce poddawany jest obróbce, po której jest prezentowany komórkom immunokompetentnym. Przetwarzanie polega na rozszczepieniu białka antygenowego na immunogenne fragmenty peptydowe. Prezentacja oznacza złożenie fragmentu antygenu połączonego z cząsteczkami głównego układu zgodności tkankowej (MHC) komórek immunokompetentnych. Istnieją dwie najważniejsze klasy tych cząsteczek: MHC klasy I (MHC-I) i MHC klasy II (MHC-II). Aby związać się z cząsteczkami każdej klasy, antygen jest przygotowywany w wyspecjalizowanych przedziałach komórki. Endogenne białka antygenowe kierowane są do proteasomu w celu degradacji, po czym są prezentowane w kompleksie z MHC-I na powierzchni komórki. Tutaj, kiedy się spotkają, są rozpoznawane przez komórki T CD8+ (T-killers), które wdrażają cytotoksyczną odpowiedź immunologiczną. Egzogenne białka są cięte przez proteazy lizomnimalne, włączone do MHC-II i rozpoznawane przez receptory komórek T CD4+ (pomocnicze). Te ostatnie powodują zarówno odpowiedzi komórkowe, jak i humoralne.

Prezentacja antygenu szlakiem MHC-I

Szczepienie DNA obejmuje endogenną syntezę antygenu, więc ten szlak jest dominujący. Przetwarzanie antygenu na szlaku MHC-I odbywa się w kilku etapach. Białko syntetyzowane w jądrze jest transportowane do cytoplazmy, proteasom jest cięty na krótkie peptydy - epitopy, które są przenoszone do retikulum endoplazmatycznego (EPR) przez specjalne białka transportujące antygeny (TAP). W EPR każdy epitop łączy się z cząsteczką MHC-I, po czym utworzony kompleks jest przesyłany do aparatu Golgiego (AG) w celu glikozylacji. Stamtąd kompleks w składzie pęcherzyka zmierza do błony plazmatycznej. Po fuzji pęcherzyka z błoną komórkową kompleks pojawia się na powierzchni komórki, gdzie jest rozpoznawany przez receptory T-killer o działaniu cytotoksycznym.

Prezentacja antygenu szlakiem MHC-II

Głównym źródłem peptydów wiążących się z MChS-II są białka egzogenne, które dostały się do komórki na drodze endocytozy. Wykazano jednak, że niektóre białka wewnątrzkomórkowe mogą być również prezentowane w kompleksie z MChS-II. W tym przypadku nowo zsyntetyzowane białka po wejściu do cytoplazmy są przenoszone do lizosomów, gdzie antygen jest rozszczepiany pod wpływem kwaśnych proteaz. Następnie lizosom zawierający epitopy łączy się z pęcherzykiem niosącym cząsteczkę MChS-II. Wewnątrz zjednoczonego pęcherzyka powstaje kompleks epitop-MChS-II, który po połączeniu pęcherzyka z plazmalemą zostaje doprowadzony na powierzchnię komórki. Tutaj kompleks ten jest rozpoznawany przez receptory T-helper, co powoduje ich aktywację. Prowadzi to do pobudzenia zarówno odporności komórkowej (aktywacja T-killerów), jak i humoralnej (aktywacja limfocytów B).

Tradycyjne szczepienie rozpuszczalnymi antygenami białkowymi ma na celu mobilizację T-pomocników. Stosunkowo niska odpowiedź T-pomocników jest jedną z wad szczepionek DNA. Ponadto obecna generacja szczepionek DNA nie jest zdolna do indukowania wytwarzania wysokich mian przeciwciał. Aby zwiększyć aktywację komórek T pomocniczych, antygen musi zostać przekierowany na szlak MChS-II. W tym celu w szczepionce DNA wbudowany jest sygnał lokalizacji lizosomalnej, zsyntetyzowany antygen zostanie wysłany do lizosomów, co oznacza, że ​​przyjmie ścieżkę MChS-II

Strategie poprawy skuteczności szczepionki DNA

Główne pytanie dotyczące przyszłości szczepionek DNA dotyczy tego, jak zwiększyć ich skuteczność. Obecnie trwa wiele badań mających na celu optymalizację opracowanych szczepionek DNA. Poszukiwanie rozwiązania odbywa się w dwóch kierunkach: zwiększenie ekspresji szczepionki i zwiększenie immunogenności kodowanego antygenu.

Optymalizacja elementów transkrypcyjnych

Ważnym składnikiem szczepionki DNA jest promotor. Promotory bakteryjne nie nadają się do ekspresji antygenowej w komórkach ssaków, więc zamiast nich zastosowano promotory wirusów onkogennych. Teraz, aby poprawić bezpieczeństwo szczepionek, zastąpiono je promotorami z obiektów nierakotwórczych, takich jak ludzki cytomegalowirus (CMV). W przypadku większości szczepionek DNA ten promotor jest optymalnym wyborem: ulega silnej ekspresji w wielu różnych komórkach. Do ekspresji genów w określonych tkankach obiecujące jest zastosowanie promotorów specyficznych dla tego typu tkanki. Na przykład, zastosowanie promotora CPK w mięśniach po podaniu prowadzi do dziesięciokrotnego wzrostu syntezy przeciwciał i indukcji odpowiedzi komórek T niż zastosowanie podobnej szczepionki DNA z promotorem CMV. Promotor genu desminy kodującego jedno z białek cytoszkieletu również wykazywał wysoką skuteczność w miocytach. W celu zwiększenia ekspresji szczepionki DNA w keratynocytach (komórkach tkanki nabłonkowej) stosuje się promotory genu metalotioneiny (białka wiążącego metale ciężkie) lub genu 3 hydroksylazy witaminy D.

Poziom inicjacji transkrypcji ma tendencję do wzrostu za konto użytkowe silny promotor i wzmacniacz, a funkcje zakończenia mogą stać się czynnikiem ograniczającym. Wydajność poliadenylacji i przetwarzania pierwotnego transkryptu RNA zmienia się w zależności od sekwencji sygnału poliA. Oznacza to, że sekwencja poliadenylacji wpływa na syntezę antygenu. Na przykład, szeroko stosowany sygnał poliA wirusa SV40 jest mniej skuteczny niż sygnał poliadenylacji z genu β-globiny królika lub genu bydlęcego hormonu wzrostu.

Aby translacja była wydajna, mRNA ssaków musi mieć tzw Sekwencja Kozaka. Wstawienie tej sekwencji do konstruktu DNA może znacząco zwiększyć poziom syntezy antygenu. Aby polimeraza RNA NIE pomijała kodonu stop genu i nie zachodziła synteza wydłużonego białka, które nie może następnie uzyskać prawidłowej stylizacji, gen można terminować podwójna linia zatrzymania.

Projektując szczepionki DNA, starają się również: zoptymalizować swoje kodony. Procedura optymalizacji polega na zastąpieniu kodonów w sekwencji genu w taki sposób, że sekwencja aminokwasowa białka nie ulega zmianie, ale wzrasta wydajność translacji jego mRNA. Powodem jest to, że większość aminokwasów jest kodowana przez więcej niż jedną granicę. Każdy kodon ma swój własny tRNA, a reprezentacja różnych tRNA w komórce nie jest taka sama, a także różni się w zależności od typu organizmu. Kodony dobiera się w taki sposób, aby obecność pożądanego tRNA podczas syntezy antygenu nie stała się czynnikiem ograniczającym.

Optymalizacja antygenu

Chociaż siła odpowiedzi immunologicznej koreluje z poziomem ekspresji szczepionki DNA, to jednak dla każdego antygenu występuje pewne plateau, po którym wzrost ilości białka antygenowego zwiększy produkcję przeciwciał. Jednocześnie można uzyskać silniejszą odpowiedź immunologiczną poprzez optymalizację antygenu. Na przykład przez łączenie antygenu z ligandem ze specyficznym receptorem dla komórek prezentujących antygen. Takim ligandem może być białko markerowe CD40, zewnątrzkomórkowa domena kinazy tyrozynowej 3 w kształcie Fms lub antygen T-killer-4. Dzięki interakcji ligand-receptor wzrasta skuteczność wychwytywania białka antygenowego APC.

Ułatwiają degradację antygenu w proteasomie lub lizosomie stymulują również odpowiedź immunologiczną. Aby wzmocnić proteolityczne cięcie antygenu, do jego sekwencji wstawiany jest sygnał ubikwitynacji. Błąd cytowania: Złe wywołanie: Niezatytułowany tag ref musi zawierać dane wejściowe. Zastosowanie szczepionek DNA kodujących zamiast całego antygenu, kilka epitopów różnego pochodzenia, pozwala znacznie poszerzyć spektrum odpowiedzi immunologicznej.

W przypadku przeciwnowotworowych szczepionek DNA połączenie jest skuteczne „antygen nowotworowy + antygen wirusowy lub bakteryjny”. Na przykład połączenie antygenu nowotworowego z epitopem toksyny tężcowej znacząco zwiększa aktywację komórek T zabójców przeciwko komórkom nowotworowym.

Włączenie adiuwantów

Przy stosowaniu tradycyjnych szczepionek dodaje się do nich adiuwanty w celu zwiększenia odpowiedzi immunologicznej. Szczepionka DNA jest pochodzenia bakteryjnego, więc sama jest immunostymulantem. Aby wzmocnić odpowiedź immunologiczną, do szczepionki DNA wstawia się geny adiuwantowe lub stosuje się dodatkowy plazmid, który koduje białka immunostymulujące.

Immunostymulujące działanie bakteryjnych dinukleotydów CpG

Funkcja plazmidu nie ogranicza się do dostarczania genów do komórek. Już w 1893 r. odkryto, że mieszanina lizatów bakteryjnych zmniejsza progresję guzów nowotworowych, ale dopiero w 1983 r. ustalono, że właściwości immunostymulujące lizatu są spowodowane cząsteczkami bakteryjnego DNA. W 1995 roku wykazano, że stymulację immunologiczną wywołują motywy CpG w DNA bakterii. W bakteriach, a także w wirusach DNA motywy te są niemetylowane. Natomiast u ludzi i wyższych naczelnych cytozyna w większości dinukleotydów CpG zawiera grupę metylową. Dlatego motywy niemetylacyjne CpG są postrzegane przez organizm ludzki jako wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP). Związki Ramri są rozpoznawane przez receptory Toll-podobne, które w zależności od rodzaju ligandu dzielą się na kilka typów. Motywy demetylacji CpG są rozpoznawane przez receptor TLR-9 zlokalizowany na błonach retikulum endoplazmatycznego limfocytów B, komórek dendrytycznych i komórek NK. Wiązanie się receptora z niemetylowanymi motywami CpG uruchamia kaskadę reakcji, które indukują syntezę prozapalnych cytokin – interferonu-1 i IL-12.

Ekspresja cytokin i innych immunomodulatorów

Do szczepień DNA jako adiuwanty najczęściej stosuje się geny cytokin. Cytokiny to klasa cząsteczek białkowych, które regulują interakcje międzykomórkowe i międzysystemowe w organizmie, w szczególności funkcjonowanie układu odpornościowego. Wszystkie cytokiny, a znanych jest ponad 30 z nich, mogą modulować odpowiedź immunologiczną. Cytokiny IL2, IL-12, interferon γ, IL-15, IL-18 i IL-23 mają stymulujący wpływ na T-pomocników pierwszej klasy. Cytokiny modulujące działanie T-pomocników drugiej klasy obejmują: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 I IL-13. Rodzaj cytokiny jest wybierany w zależności od tego, jaki rodzaj odpowiedzi immunologicznej ma zostać wzmocniony.

Za pomocą chemokin można osiągnąć wzrost odpowiedzi immunologicznej. Chemokiny to rodzina cytokin, które mogą powodować chemotaksję wrażliwych komórek, w tym immunologicznych. W szczególności receptory chemokin znajdują się na komórkach chemokin prezentujących antygen. Wiązanie chemokiny z jej receptorem prowadzi do endocytozy kompleksu antygen-chemokina wewnątrz APC. Strategia ta jest skutecznie wykorzystywana zarówno w opracowywaniu przeciwwirusowych szczepionek DNA, jak i przeciwnowotworowych.

Funkcję adiuwanta może również pełnić białko HSP70 (białka szoku cieplnego, białka szoku cieplnego). Działanie immunostymulujące HSP70 opiera się na jego zdolności do wchodzenia do przestrzeni zewnątrzkomórkowej i wiązania się z receptorami APC. Mechanizm transportu HSP70 na zewnątrz nie został jeszcze w pełni wyjaśniony, ale najprawdopodobniej istnieje kilka sposobów – egzocytoza, sekrecja na zewnątrz lub wyjście przez kanał. Wiązanie HSP70 z jego receptorem powoduje aktywację komórek dendrytycznych, pośredniczy w prezentacji antygenu i stymuluje produkcję chemokiny. Ponieważ antygen jest połączony z HSP70, wchodzi również do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, dzięki czemu może być prezentowany przez szlak MES-II i aktywować komórki B. Szczepionki DNA wykorzystują bakteryjny gen HSP70, aby uniknąć reakcji autoimmunologicznych.

Zalety i wady szczepionek DNA

Metoda szczepienia DNA ma wiele zalet, z których najważniejszą jest wywoływanie zarówno humoralnej, jak i komórkowej odpowiedzi immunologicznej. Szczepionki oparte na DNA zapewniają długotrwałą ekspresję antygenu i odpowiednio stabilną odpowiedź immunologiczną. Dodatkowe czynniki napędzające rozwój immunizacji DNA obejmują łatwość i niski koszt produkcji szczepionek.

Zalety

Wady

Antygen uzyskuje konformację natywną Aktywacja obu gałęzi odporności: humoralnej i komórkowej Zsyntetyzowany antygen można selektywnie skierować na szlak MES-I lub MES-II Może selektywnie działać na różne populacje T-pomocników Zapewnij długotrwałą ekspresję antygenu Prosty i szybki w produkcji Niski koszt produkcji Nie wymagają specjalnych warunków przechowywania Może być stosowany zarówno w profilaktyce, jak i leczeniu chorób Potencjalnie skuteczny przeciwko wielu chorobom: bakteryjnym, wirusowym, autoimmunologicznym i nowotworowym

Słaba immunogenność W przypadku wektorów wirusowych istnieje ryzyko integracji obcego DNA z genomem komórki Możliwy rozwój reakcji autoimmunologicznych Wektory plazmidowe i wirusowe mogą wywoływać nieswoistą odpowiedź immunologiczną

Stosowanie szczepionek DNA

Pierwsze badania kliniczne szczepionek DNA wraz z bezpieczeństwem nowej metody wykazały jej niską skuteczność. Realizując obietnicę immunizacji DNA, laboratoria naukowe wraz z firmami biotechnologicznymi skierowały swoje wysiłki na optymalizację nowej metody iw ciągu kilku lat poczyniono znaczne postępy. W 2005 roku pierwsza szczepionka DNA została zatwierdzona przez FDA. Administracja Jedzenia i Leków) do stosowania u zwierząt. Od 2013 r. ponad sto szczepionek DNA jest w badaniach klinicznych, a cztery szczepionki DNA są licencjonowane do stosowania w produkcji zwierzęcej.

Szczepionki DNA w weterynarii

Wszystkie cztery szczepionki zatwierdzone przez FDA są oparte na plazmidach. Dla trzech z nich producent zalecił sposób podania – domięśniowo, dla szczepionki LifeTide® – iniekcję połączoną z elektroporacją. Jeśli pozostałe szczepionki mają na celu aktywację układu odpornościowego, to w przypadku szczepionki LifeTide® efekt immunostymulujący jest dodatkowy. Produktem szczepionki jest Somatoliberyna, hormon stymulujący uwalnianie hormonu wzrostu i prolaktyny przez przysadkę mózgową. Działanie dwóch ostatnich hormonów u świń prowadzi do wzrostu masy zwierząt i zwiększenia liczby miotów. Jednocześnie wprowadzenie do zwierząt plazmidu kodującego somatoliberynę stymuluje produkcję limfocytów T, naturalnych zabójców, a tym samym zwiększa odporność organizmu.

Nazwa marki szczepionki	Rok licencji	Cel	Zwierzę	Produkt szczepionki	Cel szczepionki
Innowator Zachodniego Nilu® (USA)	2005	wirus Zachodniego Nilu	Konie	Białko strukturalne wirusa PreM-E	Ochrona przed wirusem
Apex-IHN® (Kanada)	2005	Czynnik sprawczy zakaźnej martwicy tkanki krwiotwórczej	Ryby z rodziny łososiowatych	Glikoproteina wirusowa	Zwiększenie ilości i jakości pokarmu dla ryb
LifeTide® SW 5 (Australia)	2008	Hormon wzrostu	Świnie i inne zwierzęta gospodarskie	Somatoliberyna świni	Zwiększona ilość miotu u loch; znacznie zmniejsza śmiertelność i zachorowalność okołoporodową
ONCEPT® (USA)	2010	Czerniak	Psy	Tyrozynaza ludzka	Jako alternatywa dla radioterapii i chirurgii w leczeniu czerniaka

Perspektywy szczepienia DNA

Szczepionki nowotworowe DNA

Podczas gdy indukcja komórkowych i humoralnych odpowiedzi immunologicznych została przekonująco wykazana dla obcych antygenów związanych z chorobami zakaźnymi, zastosowanie szczepionek DNA do leczenia raka było jak dotąd mniej skuteczne. Indukcja skutecznej odporności przeciwnowotworowej jest trudnym zadaniem. Badania kliniczne potwierdziły ogólne bezpieczeństwo i niską toksyczność przeciwnowotworowych szczepionek DNA, jednak skuteczność wywołanej przez nie odpowiedzi immunologicznej okazała się słaba, a działanie przeciwnowotworowe w niektórych przypadkach jest ogólnie wątpliwe.

Szczepionki DNA przeciwko patogenom wirusowym i bakteryjnym

Szczepionka DNA przeciwko próchnicy

Przyczyną próchnicy jest lokalna zmiana pH w wyniku fermentacji (glikolizy) węglowodanów prowadzonej przez bakterie. Naukowcy z Instytutu Wirusologii Wuhan (Chiny) opracowali szczepionkę DNA skierowaną przeciwko jednemu z patogenów próchnicy - Streptococcus mutans. Szczepionka oparta jest na plazmidzie i koduje dwa białka: białko powierzchniowe św. mutans PAc i flagelina, pochodząca z bakterii Salmonella który działa jako adiuwant. Na etapie badań przedklinicznych szczepionkę podawano przez nos gryzoniom laboratoryjnym, po czym u zwierząt sprawdzano poziom immunoglobulin G w surowicy krwi oraz wydzielniczych immunoglobulin A w ślinie. Po badaniach naukowcy odkryli, że poziom białek odpornościowych zarówno we krwi, jak i ślinie wzrósł, ale co ważniejsze, wzrost kolonii został zahamowany. Streptococcus mutans na szkliwie zębów. Oznacza to, że zęby szczepionych zwierząt były lepiej chronione przed próchnicą.

Szczepionki DNA i leczenie chorób autoimmunologicznych

Szczepionka DNA przeciwko cukrzycy typu 1

Cukrzyca typu 1 charakteryzuje się utratą komórek beta wytwarzających insulinę, zlokalizowanych w wyspach trzustkowych Langerhansa. Główną przyczyną utraty komórek beta jest uszkodzenie autoimmunologiczne przez limfocyty T zabójców. W celu ochrony komórek beta przed nadaktywnym układem odpornościowym naukowcy z uniwersytetów Stanford (USA) i Leiden (Holandia) opracowali szczepionkę DNA BHT-3021. Szczepionka została stworzona na bazie plazmidu i koduje prekursor insuliny, proinsulinę. Jest to szczepionka retroaktywna: jeśli konwencjonalne szczepionki mają aktywować odpowiedź immunologiczną, to BHT-3021 wręcz przeciwnie, neutralizuje cytotoksyczne działanie T-killerów skierowanych przeciwko wysepkom Langerhansa.

W pierwszej fazie badań klinicznych BHT-3021 wykazał swoją skuteczność w grupie 80 osób. Połowa z nich otrzymywała zastrzyki domięśniowe BHT-3021 co siedem dni przez 12 tygodni, a druga połowa otrzymywała placebo. Po tym okresie grupa, która otrzymała szczepionkę, wykazała wzrost poziomu peptydów C we krwi, co wskazuje na przywrócenie funkcji komórek beta. U jednego z uczestników nie odnotowano żadnych poważnych skutków ubocznych. Efekt szczepionki utrzymywał się przez 2 miesiące.

Wstęp

1 Główne grupy enzymów inżynierii genetycznej

1.1 Enzymy restrykcyjne

1.1.1 Mechanizm działania restryktaz

1.1.2 Budowa map ograniczeń

1.3 Ligazy

2 Wprowadzenie nowego genu do komórki

2.1 Regulacja ekspresji genów u prokariontów

2.2 Metody bezpośredniego wprowadzania genu do komórki

2.3 Wprowadzenie genów do komórek ssaków

2.4 Genetyczna transformacja komórek somatycznych ssaków

2.5 Terapia genowa

2.6 Pozyskiwanie zwierząt transgenicznych

Wniosek

Bibliografia

Wstęp

Inżynieria genetyczna to konstrukcja in vitro funkcjonalnie aktywnych struktur genetycznych (rekombinowanego DNA) lub innymi słowy tworzenie sztucznych programów genetycznych (Baev A.A.). Według E.S. Piruziana inżynieria genetyczna to system metod eksperymentalnych, które umożliwiają konstruowanie sztucznych struktur genetycznych w laboratorium (w probówce) w postaci tzw. rekombinowanych lub hybrydowych cząsteczek DNA.

Mówimy o ukierunkowanej, zgodnie z ustalonym programem, budowie molekularnych systemów genetycznych poza ciałem, a następnie ich wprowadzeniu do żywego organizmu. W tym przypadku zrekombinowany DNA staje się integralną częścią aparatu genetycznego organizmu biorcy i nadaje mu nowe unikalne właściwości genetyczne, biochemiczne, a następnie fizjologiczne.

Celem stosowanej inżynierii genetycznej jest zaprojektowanie takich rekombinowanych cząsteczek DNA, które po wprowadzeniu do aparatu genetycznego nadałyby organizmowi właściwości przydatne dla człowieka.

Technologia rekombinacji DNA wykorzystuje następujące metody:

Swoiste cięcie DNA przez nukleazy restrykcyjne, przyspieszające izolację i manipulację poszczególnymi genami;

Szybkie sekwencjonowanie wszystkich nukleotydów oczyszczonego fragmentu DNA, co pozwala określić granice genu i kodowanej przez niego sekwencji aminokwasowej;

Konstrukcja rekombinowanego DNA;

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych, która umożliwia wykrywanie specyficznych sekwencji RNA lub DNA z większą dokładnością i czułością w oparciu o ich zdolność do wiązania komplementarnych sekwencji kwasów nukleinowych;

klonowanie DNA: amplifikacja in vitro poprzez reakcję łańcuchową polimerazy lub wprowadzenie fragmentu DNA do komórki bakteryjnej, która po takiej transformacji odtwarza ten fragment w milionach kopii;

Wprowadzenie zrekombinowanego DNA do komórek lub organizmów.

Historia inżynierii genetycznej

Inżynieria genetyczna pojawiła się dzięki pracy wielu badaczy z różnych gałęzi biochemii i genetyki molekularnej. Przez wiele lat białka uważane były za główną klasę makrocząsteczek. Założono nawet, że geny mają naturę białkową. Dopiero w 1944 roku Avery, McLeod i McCarthy wykazali, że DNA jest nośnikiem informacji dziedzicznej. Od tego czasu rozpoczęły się intensywne badania kwasów nukleinowych. Dekadę później, w 1953 roku, J. Watson i F. Crick stworzyli model dwuniciowego DNA. Ten rok jest uważany za rok narodzin biologii molekularnej.

Na przełomie lat 50. i 60. wyjaśniono właściwości kodu genetycznego, a pod koniec lat 60. potwierdzono eksperymentalnie jego uniwersalność. Nastąpił intensywny rozwój genetyki molekularnej, której przedmiotem były E. coli, jej wirusy i plazmidy. Opracowano metody izolacji wysoce oczyszczonych preparatów nienaruszonych cząsteczek DNA, plazmidów i wirusów. DNA wirusów i plazmidów zostało wprowadzone do komórek w postaci biologicznie aktywnej, zapewniającej jego replikację i ekspresję odpowiednich genów. W latach 70. odkryto szereg enzymów, które katalizują reakcje transformacji DNA. Enzymy restrykcyjne i ligazy DNA odgrywają szczególną rolę w rozwoju metod inżynierii genetycznej.

Historię rozwoju inżynierii genetycznej można podzielić na trzy etapy. Pierwszy etap związany jest z udowodnieniem fundamentalnej możliwości uzyskania rekombinowanych cząsteczek DNA in vitro. Prace te dotyczą wytwarzania hybryd pomiędzy różnymi plazmidami. Wykazano możliwość tworzenia rekombinowanych cząsteczek przy użyciu oryginalnych cząsteczek DNA z różnych gatunków i szczepów bakterii, ich żywotności, stabilności i funkcjonowania.

Drugi etap związany jest z rozpoczęciem prac nad uzyskaniem rekombinowanych cząsteczek DNA pomiędzy chromosomowymi genami prokariontów a różnymi plazmidami, świadczącymi o ich stabilności i żywotności.

Trzeci etap to rozpoczęcie prac nad włączeniem genów eukariotycznych, głównie zwierzęcych, do cząsteczek wektora DNA (DNA wykorzystywanego do transferu genów i zdolnego do integracji z aparatem genetycznym komórki biorcy).

Formalnie za datę narodzin inżynierii genetycznej należy uznać rok 1972, kiedy to P. Berg, S. Cohen, H. Boyer i współpracownicy stworzyli w Stanford pierwszy rekombinowany DNA zawierający fragmenty DNA wirusa SV40, bakteriofaga i E. coli Uniwersytet.

1 Główne grupy enzymów inżynierii genetycznej

Inżynieria genetyczna jest potomkiem genetyki molekularnej, ale swoje narodziny zawdzięcza sukcesom enzymologii genetycznej i chemii kwasów nukleinowych, ponieważ enzymy są instrumentami manipulacji molekularnej. Jeśli możemy czasem pracować z komórkami i organellami komórkowymi za pomocą mikromanipulatorów, to żadne, nawet najmniejsze instrumenty mikrochirurgiczne nie pomogą w pracy z makrocząsteczkami DNA i RNA. Co robić? Enzymy działają jak „skalpel”, „nożyczki” i „nitki do szycia”.

Tylko oni mogą znaleźć określone sekwencje nukleotydów, „wyciąć” tam cząsteczkę lub odwrotnie, „zacerować” dziurę w łańcuchu DNA. Enzymy te od dawna pracują w komórce, wykonując pracę replikacji (podwajania) DNA podczas podziału komórki, naprawy uszkodzeń (przywracania integralności cząsteczki), w procesach odczytu i przenoszenia informacji genetycznej z komórki do komórki lub w komórce. Zadaniem inżyniera genetycznego jest wyselekcjonowanie enzymu, który spełni postawione zadania, czyli będzie mógł pracować z określoną sekcją kwasu nukleinowego.

Należy zauważyć, że enzymy stosowane w inżynierii genetycznej nie są specyficzne gatunkowo, więc eksperymentator może łączyć fragmenty DNA dowolnego pochodzenia w jedną całość w wybranej przez siebie sekwencji. Dzięki temu inżynieria genetyczna może pokonać bariery gatunkowe ustanowione przez naturę i przeprowadzić krzyżowanie międzygatunkowe.

Enzymy wykorzystywane do budowy rekombinowanego DNA można podzielić na kilka grup:

Enzymy wytwarzające fragmenty DNA (enzymy restrykcyjne);

Enzymy syntetyzujące DNA na matrycy DNA (polimeraza) lub RNA (odwrotna transkryptaza);

Enzymy łączące fragmenty DNA (ligazy);

Enzymy umożliwiające zmianę struktury końców fragmentów DNA.

1.1 Enzymy restrykcyjne

Ogólnie przyjmuje się, że terminy „enzym restrykcyjny”, „endonukleaza restrykcyjna” i „endodeoksyrybonukleaza specyficzna miejscowo” są uważane za synonimy.

Wszystkie bakteryjne endonukleazy restrykcyjne rozpoznają specyficzne, raczej krótkie sekwencje DNA i wiążą się z nimi. Procesowi temu towarzyszy cięcie cząsteczki DNA albo w samym miejscu rozpoznania, albo w innym miejscu, które jest określone przez rodzaj enzymu. Wraz z aktywnością restrykcyjną szczep bakteryjny ma zdolność do metylacji DNA; proces ten charakteryzuje się taką samą specyficznością dla sekwencji DNA jak dla restrykcji. Metylaza dodaje grupy metylowe do reszt adeninowych lub cytozyny w tym samym miejscu, w którym wiąże się enzym restrykcyjny. W wyniku metylacji miejsce staje się odporne na restrykcje. Dlatego metylacja chroni DNA przed przecięciem.

Istnieją 3 główne klasy restrykcji: 1, 2 i 3.

Wszystkie enzymy restrykcyjne rozpoznają ściśle określone sekwencje na dwuniciowym DNA, ale enzymy restrykcyjne I klasy dokonują przerw w dowolnych punktach cząsteczki DNA, a enzymy restrykcyjne II i III klasy rozpoznają i rozszczepiają DNA w ściśle określonych punktach rozpoznawane miejsca lub w stałej odległości od nich.

Enzymy typu 1 i 3 mają złożoną strukturę podjednostek i mają dwa rodzaje aktywności - endonukleazę modyfikującą (metylującą) i zależną od ATP.

Enzymy drugiej klasy składają się z 2 oddzielnych białek: endonukleazy restrykcyjnej i metylazy modyfikującej, dlatego w inżynierii genetycznej stosuje się tylko enzymy klasy 2. Potrzebują jonów magnezu jako kofaktorów.

Obecnie wyizolowano ponad 500 restryktaz klasy 2, jednak wśród enzymów izolowanych z różnych mikroorganizmów są takie, które rozpoznają te same sekwencje w DNA. Takie pary lub grupy nazywane są izoschizomerami. Prawdziwą izoschizomerię rozróżnia się, gdy enzymy rozpoznają tę samą sekwencję nukleotydową i rozbijają DNA w tych samych punktach, a fałszywą, gdy enzymy rozpoznające to samo miejsce na DNA dokonują złamań w różnych punktach tego samego miejsca.

Większość restryktaz klasy 2 rozpoznaje sekwencje zawierające od 4 do 6 par nukleotydów, dlatego restryktazy dzielą się na małe i duże. Enzymy restrykcyjne o małym przekroju rozpoznają tetranukleotyd i wprowadzają do cząsteczek znacznie więcej przerw niż enzymy restrykcyjne o dużym przekroju, które rozpoznają sekwencję sześciu par nukleotydów. Wynika to z faktu, że prawdopodobieństwo wystąpienia określonej sekwencji czterech nukleotydów jest znacznie wyższe niż sekwencji sześciu nukleotydów. Na przykład, 40 000 bp DNA bakteriofaga T7 nie ma sekwencji rozpoznawanej przez R1 z E. coli.

Restrytazy rozszczepiające na małe obejmują Hpa II i Alu (z Arthrobacter luteus), rozszczepiające na duże - EcoRI (z Escherichia coli) i Hind III. Jeżeli przyjmiemy, że miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne są losowo rozmieszczone wzdłuż łańcucha DNA, to cel dla enzymów rozpoznających sekwencję (miejsce) czterech nukleotydów powinien wystąpić średnio 1 raz na 256 par zasad, a dla enzymów rozpoznających sześć nukleotydów po 4096 par zasad. Jeśli miejsce restrykcyjne znajduje się wewnątrz genu, to traktowanie enzymem restrykcyjnym DNA doprowadzi do jego inaktywacji. Prawdopodobieństwo takiego zdarzenia jest bardzo wysokie w przypadku leczenia restryktazami o małych cięciach i nieistotne w przypadku stosowania endonukleaz o dużym stopniu cięcia. Dlatego, aby uzyskać nienaruszony gen, cięcie przeprowadza się naprzemiennie kilkoma restryktazami o dużych cięciach lub stosuje się metodę „underrestriction”, tj. ograniczenie przeprowadza się w warunkach, w których rozszczepienie następuje tylko w jednym miejscu.

Rekombinowany DNA jest wprowadzany do komórek biorcy. W inżynierii genetycznej takie komórki biorcy odgrywają dwie role. 1. Umożliwiają wyszukiwanie klonów zsyntetyzowanego rekombinowanego DNA w banku genów. 2 Następnie takie komórki biorcy można wykorzystać do uzyskania docelowych produktów.

Sposób wprowadzenia zrekombinowanego DNA jest brany pod uwagę na podstawie jakiego typu wektora taki zrekombinowany DNA został uzyskany i do komórek jakich organizmów należy go wprowadzić poprzez transformację komórki lub protoplastu, bądź metodą elektroporacji. Jeśli na bazie fagów uzyskamy zrekombinowany DNA, można go wprowadzić do wyizolowanego DNA – jest to transwekcja. Możliwe jest wprowadzenie nienaruszonych cząstek fagów - jest to infekcja (kosmidy, straszyki).

Dr. metody wymiany genetycznej - koniugacja, transdukcja.

W komórkach roślinnych - transformacja protoplastów roślinnych, traktowanie komórek lub tkanek roślinnych rekombinowanym DNA; szeroko stosowane są wstrzyknięcia rekombinowanego DNA do jądra; zastosowanie liposomów. Liposomy to kuliste struktury, które mają powłokę lipidową, wewnątrz której znajduje się zrekombinowany DNA. Do wprowadzenia do komórek zwierzęcych - infekcje wirusowe, metoda elektroporacji, mikroiniekcje do jądra. Jeśli po wprowadzeniu zrekombinowanego DNA odziedziczą go wszystkie komórki w ciele, to mówi się o uzyskaniu organizmu transgenicznego.

Elektroporacja - ogniwa lub protoplast są przez krótki czas poddawane działaniu prądu o wysokim napięciu (2000-4000 woltów). W wyniku tego w błonie komórkowej ok. 1 godz. 30 nm, który może istnieć przez 1-2 minuty i przez który zrekombinowany DNA może dostać się do komórki. Pory następnie zamykają się, a DNA pozostaje w komórce. To jest uniwersalny sposób.

metoda balistyczna- stosowany głównie u eukariontów. Stosowane są działa balistyczne, w których wprowadza się cząstki AK lub W, na które natryskuje się zrekombinowany DNA. Następnie, za pomocą gazów obojętnych w P, takie cząstki są wystrzeliwane z pistoletu do hodowli komórkowej. Zgodnie z różnymi wzorcami, niektóre cząstki wnikają do jądra i tam zatrzymywane jest zrekombinowane DNA.

Szukaj klonów z rekombinowanym DNA.

Ten etap jest trudny i nieprzewidywalny.

Najprostszą metodą jest wyszukiwanie klonów według fenotypu po wprowadzeniu rekombinowanego DNA(np. pigmentacja). Można zastosować testy komplementacji, ale konieczne jest posiadanie zmutowanych komórek, które są uszkodzone w syntezie aktywnego produktu.

Metody hybrydyzacji – wymagana jest obecność specyficznych znakowanych sond DNA lub RNA. Częściej są oznaczone P 32. Sondy m.in. krótkie sekwencje oligonukleotydowe, które odpowiadają najbardziej konserwatywnej części poszukiwanego genu. Te konserwatywne sekwencje mogą zawierać do 100 nukleotydów dla prokariontów i do 1000 dla eukariontów.

Po wprowadzeniu zrekombinowanego DNA kolonie utworzone na pożywce przenosi się na specjalny filtr nitrocelulozowy. Poddaje się je lizie, a następnie denaturacji DNA za pomocą alkaliów. DNA silnie wiąże się z filtrem. Filtr jest przemywany i przetwarzany za pomocą sondy znakowanej radioaktywnie i określany jest klon, z którym ta sonda się kontaktowała.

Metody immunochemiczne - klony po wprowadzeniu rekombinowanego DNA są poddawane lizie i traktowane przeciwciałami do odpowiedniego produktu. Te przeciwciała są znakowane.

Proces wprowadzania rekombinowanego DNA do komórki bakteryjnej nazywa się transformacja. Efektem transformacji jest pozyskiwanie przez komórkę gospodarza nowych sekwencji DNA, aw konsekwencji nowych cech fenotypowych, np. oporności na niektóre antybiotyki. Komórka gospodarza wykorzystywana w takich eksperymentach musi mieć określony fenotyp, w szczególności r-, tj. nie powinien zawierać enzymów restrykcyjnych; musi być niezdolny do ogólnej rekombinacji ( recA-) tak, że egzogenny DNA nie jest modyfikowany przez rekombinację homologiczną. Jedną z najszerzej stosowanych kultur do tego celu jest laboratoryjny szczep bakterii. E coli- szczep K12.

Komórki, które mogą wchłonąć obce DNA, nazywane są kompetentny. Kompetencja E coli konieczne jest wywołanie, a niektóre inne bakterie początkowo mają tę właściwość. Proporcję komórek kompetentnych można zwiększyć, stosując specjalną pożywkę lub warunki hodowli. W przypadku bakterii opornych na chemiczne induktory kompetencji lub pozbawionych naturalnych kompetencji stosuje się inne systemy dostarczania DNA.

Najczęściej stosowane metody transformacji komórek bakteryjnych w praktyce laboratoryjnej to:

Transformacja E coli przez traktowanie chlorkiem wapnia;

elektroporacja– wzrost przepuszczalności komórek pod wpływem impulsu prądowego o czasie trwania ~4,5 ms;

Wyniki transformacji można określić ilościowo: określając albo częstotliwość, lub efektywność przekształcenia.

Częstotliwość transformacji to odsetek komórek w populacji komórek, które otrzymały obce DNA; wyrażona jako liczba transformantów do całkowitej liczby komórek.

Efektywność transformacji- liczba transformantów na 1 µg DNA pobranego do transformacji.

Informacje na temat klonowania rekombinowanego DNA przy użyciu wektora plazmidowego pBR322 przedstawione w tej sekcji podsumowano w formie schematu doświadczalnego i przedstawiono na Figurze 20.

Ryż. 20. Klonowanie DNA w wektorze plazmidowym pBR322

1, 2, 3, 4 i 5 - etapy procedury klonowania (patrz tekst).

1. DNA pBR322 tnie się endonukleazą restrykcyjną PstI w miejscu oporności na ampicylinę.

2. Fragmenty DNA dawcy, również otrzymane przy użyciu PstI i mające lepkie końce, jak linearyzowany wektor pBR322, poddaje się ligacji z wektorem DNA przy użyciu ligazy DNA. Konsekwencją powstania takiego konstruktu jest destrukturyzacja genu zapewniającego odporność na ampicylinę. Tak więc wytworzony zrekombinowany DNA po wprowadzeniu do komórek E coli nie będzie w stanie zapewnić sobie przeżycia na podłożu z ampicyliną.

3. Komórki E coli transformować rekombinowanym DNA.

4. Po procedurze transformacji zawiesinę komórek wysiewa się na płytki agarowe i pożywkę zawierającą antybiotyk tetracyklinę. Na tym etapie następuje selekcja, tj. selekcja komórek zdolnych do wzrostu na pożywce z tetracykliną. Komórki wyhodowane na tym agarze zawierają zrekombinowany DNA i DNA pBR322, które nie zawierały wstawki DNA dawcy; przywrócono pierwotną strukturę wektora.

5. Pojedyncze kolonie komórek E coli hodowane na kubku z subkulturą tetracyklinową dwa kubki na kubkach, z których jeden zawiera agar z ampicyliną, a drugi z tetracykliną. Komórki zawierające zrekombinowany plazmidowy DNA rosną tylko na agarze tetracyklinowym, ponieważ gen zapewniający oporność na ampicylinę ulega destrukturyzacji w wyniku insercji DNA dawcy. Natomiast komórki z oryginału, czyli odzyskanego DNA wektora pBR322 rośnie na obu płytkach, ponieważ geny oporności na oba antybiotyki znajdują się w natywnym, tj. w oryginalnym stanie.

Z komórek wybranych klonów E coli ekstrahować plazmidowy DNA i analizować jego strukturę.

Inne wektory plazmidowe

Era wektora pBR322, zapoczątkowana przez Bolivara i Rodrigueza na początku lat 80. trwa do dziś. Jednak ze względu na całą swoją niezawodność i klasyczną zgodność ze wszystkimi wymaganiami dotyczącymi wektorów, wektor ten ma tylko kilka dogodnych miejsc do klonowania. Ponadto selekcja transformowanych komórek w eksperymentach z opartym na nim rekombinowanym DNA zajmuje dużo czasu. Zaistniała potrzeba opracowania alternatywnych, bardziej zaawansowanych systemów klonowania. W ten sposób powstała grupa wektorów z rodziny pUC. W nazwie wektorów tej rodziny litery „U” i „C” są pierwszymi literami słów Uniwersytet Kalifornijski. Naukowcy tej uczelni stworzyli szereg wektorów, które mają ważną cechę - obecność w strukturze DNA zintegrowanego syntetycznego polilinker, która jest sekwencją nukleotydową złożoną z miejsc rozpoznawanych przez wiele endonukleaz restrykcyjnych unikalnych dla tego wektora - MCS (Multiple Cloning Sites). Nazwy poszczególnych wektorów z rodziny pUC różnią się liczbą dwucyfrową, a struktura pierwotna różnych wektorów różni się składem miejsc MCS MCS - Multiple Cloning Sites w polilinkerze.

Rozważmy bardziej szczegółowo cechy wektorów należących do tej grupy, na przykładzie wektora pUC19 (ryc. 21).

Plazmid pUC19 ma długość 2686 pz. i zawiera: gen oporności na ampicylinę; regulowany segment genu β-galaktozydazy (lacZ") operon laktozowy E coli gen lacI, represor kodujący kontrolujący ekspresję genów lacZ"; polilinker - krótka sekwencja z wieloma unikalnymi miejscami rozpoznawanymi przez endonukleazy (EcoRI, SacI, KrpI, Xmal, Smal, BamHI, XbaI, SalI, HincII, AccI, BspMI, PstI, SphI i HindIII); początek replikacji plazmidu ColE1.

Ryż. 21. Wektor plazmidowy pUC19

Mapa jest wyjaśniona w tekście.

Obecność w plazmidzie pUC19 genu zapewniającego oporność na ampicylinę umożliwia selekcję klonów E. coli zawierających ten wektor lub opartego na nim zrekombinowanego DNA na pożywce z tym antybiotykiem. Takie modułowe elementy struktury rozważanego wektora, jak lacZ", lacI a MCS umożliwiają przyspieszenie i intensyfikację selekcji klonów z rekombinowanym DNA.

Jeśli komórki zawierające niezmodyfikowany plazmid pUC19 są hodowane w obecności izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG), który jest induktorem gumilaka- operon, to produkt genu lacI, tak zwana represor, nie będzie w stanie wiązać się z regionem promotora-operatora genu lacZ", w wyniku czego nastąpi transkrypcja i translacja fragmentu plazmidu genu lacZ". Produkt tego fragmentu zwiąże się z białkiem kodowanym przez chromosomalny DNA ( α-komplementacja), w wyniku czego powstaje aktywna β-galaktozydaza. Sekwencja z wieloma miejscami restrykcyjnymi (polilinker) jest wstawiona do genu lacZ" aby nie wpływała na wytwarzanie funkcjonalnej β-galaktozydazy, a jeśli w pożywce występuje jej substrat 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopiranozyd (X-Gal) to będzie hydrolizuje pod wpływem działania tego enzymu, tworząc niebieski produkt, który barwi kolonie komórek zawierających niezmodyfikowane, tj. bez wstawiania obcego DNA, plazmid pUC19 (fig. 22).

Ryż. 22. Sekwencja procedur klonowania DNA w wektorze pUC19.

1, 2, 3 i 4 - etapy klonowania (patrz tekst)

1. Donor DNA jest traktowany jedną z endonukleaz restrykcyjnych, dla której jest miejsce w polilinkerze. DNA wektora pUC19 traktuje się tym samym enzymem

2. Ligacja zlinearyzowanego wektora i wstawka z ligazą DNA T4.

3. Po procedurze ligacji z mieszaniną inkubacyjną transformowane są komórki zdolne do α-komplementacji, które mogą syntetyzować tę część β-galaktozydazy (LacZaα), która jest połączona z produktem genu lacZ" z tworzeniem aktywnego enzymu.

4. Traktowane komórki wysiewa się na pożywce zawierającej ampicylinę, IPTG i substrat dla ß-galaktozydazy. Nietransformowane komórki nie mogą rosnąć w obecności ampicyliny, a komórki niosące nienaruszony plazmid tworzą niebieskie kolonie na pożywce z ampicyliną. Komórki gospodarza niosące hybrydę, tj. rekombinowany, plazmid, tworzą białe kolonie na tym samym podłożu. Wynika to z faktu, że zwykle po wstawieniu obcego DNA do polilinkera nie można utworzyć pełnego produktu genu. lacZ", aw konsekwencji w procesie α-komplementacji nie powstaje aktywna β-galaktozydaza, która rozszczepia substrat X-Gal do produktu, który zapewnia niebieskie zabarwienie komórek kolonii.

Wektory na podstawie bakteriofaga λ

Wektory plazmidowe umożliwiają klonowanie fragmentów DNA, których wielkość nie przekracza 10 kb. Aby jednak rozwiązać problem klonowania chromosomalnego DNA nawet niewielkiego organizmu, na przykład bakterii, konieczne jest stworzenie kompletnych kolekcji fragmentów tego DNA, dlatego często konieczna jest praca z większymi fragmentami. W tym celu wektory oparte na bakteriofagu λ MI. coli.

Gdy fag λ wnika do komórek E. coli. Istnieją dwie alternatywne ścieżki rozwoju wydarzeń:

1. cykl lityczny- fag zaczyna się aktywnie namnażać i po około 20 minutach komórka ulega zniszczeniu z uwolnieniem do 100 nowych cząstek faga.

2. Stan lizogenii– Fagowy DNA jest zawarty w chromosomie E. coli jako profag i replikuje się w komórce wraz z normalnymi komórkami bakteryjnymi. Jednak w niesprzyjających warunkach (brak odżywienia) rozpoczyna się cykl lityczny (ryc. 23):

1. Podczas replikacji cDNA bakteriofaga λ powstaje liniowa cząsteczka składająca się z powtarzających się segmentów o długości około 50 kb. Każdy z tych segmentów to pełnej długości fagowy DNA oflankowany przez lepki sałata-sites - jednoniciowe 5 "-"ogonów" z 12 nukleotydów. Nazywa się je lepkimi ( sałata) kończy się, ponieważ wzajemnie się uzupełniają i mogą się ze sobą łączyć jak lepkie końce fragmentów restrykcyjnych.

2. Głowica faga zawiera jeden taki segment, następnie już zmontowany proces jest przyczepiany do głowy.

Ryż. 23. Lityczna droga rozwoju bakteriofaga λ

1 - upakowanie w główce faga jednego segmentu DNA faga o pełnej długości; 2 - montaż pełnowartościowej cząstki faga.

Rozmiar DNA faga λ wynosi około 50 kb, a znaczna jego część (około 20 kb) nie jest niezbędna do reprodukcji faga i jest odpowiedzialna za jego włączenie do DNA gospodarza. W związku z tym powstał pomysł, że można go zastąpić fragmentem innego DNA o równoważnej wielkości. Powstała zrekombinowana cząsteczka będzie replikować się w komórce jako DNA „rekombinowanego” faga, który „wszedł” na lityczną ścieżkę rozwoju. Rekombinowane cząsteczki są pakowane do główek bakteriofaga λ in vitro a po dodaniu procesów uzyskuje się zakaźne cząstki faga (ryc. 24).

Ryż. 24. Zastosowanie wektorów fagowych λ do klonowania fragmentów DHA w komórkach MI. coli.

Przygotowanie ekstraktów do pakowania in vitro DNA faga λ odbywa się przy użyciu dwóch szczepów E coli, z których każdy jest lizogenny przeciwko pewnemu zmutowanemu szczepowi faga λ (Fig. 25). Jeden z mutantów nie jest w stanie syntetyzować białka A (jednego z polipeptydów terminazy fagowej), drugi nie jest w stanie syntetyzować białka E (białka głowy faga). Oba te białka są wymagane do pakowania DNA faga λ. Ekstrakty „A” i „E” miesza się i dodaje konkatemery (segmenty DNA fagowego o pełnej długości spolimeryzowane zgodnie z sałata-sites) fagowy DNA, który wiąże się z terminazą, zanim zostanie pocięty na sałata witryn i pakowane w głowy fagów.

Ryż. 25. Pakowanie in vitro Faga λ DNA

Podczas pakowania cząsteczki DNA o długości mniejszej niż 38 kb. otrzymuje się niezakaźną cząstkę faga i fragmenty o długości ponad 52 ton, t.w. nie mieszczą się w głowie. Segmenty o długości 50 kb. w liniowej cząsteczce DNA są one oddzielone miejscami cos i to w tych miejscach cząsteczka jest przecinana, gdy następny segment wypełnia głowę. Cięcie odbywa się za pomocą enzymu znajdującego się przy wejściu do głowy.

Proces wprowadzania rekombinowanego fagowego DNA z osadzonym fragmentem obcej informacji genetycznej do komórek biorcy opiera się na zjawisku naturalnym – transdukcji fagowego DNA.

transdukcja(łac. transdukcja- ruch) to proces przenoszenia DNA bakterii z jednej komórki do drugiej przez bakteriofaga. Tak więc transformacja komórek bakteryjnych przy użyciu rekombinowanego DNA opartego na DNA fagowym nie wymaga specjalnego przygotowania komórek biorcy ani żadnego specjalnego oprzyrządowania.

Do poszukiwania komórek zawierających fagi ze zrekombinowanym DNA stosuje się metody hybrydyzacji molekularnej i przesiewowych badań immunologicznych, co zostanie omówione w następnym rozdziale.

Wynalazek dotyczy dziedziny biotechnologii, w szczególności sposobu ukierunkowanego dostarczania DNA do komórek nowotworowych i macierzystych wykazujących ekspresję receptora CXCR4. Niniejszy wynalazek może być stosowany do celowanego dostarczania konstruktów genetycznych do macierzystych i złośliwych komórek nowotworowych w celu korygowania defektów genów i zapobiegania chorobom. Metoda obejmuje przygotowanie nośników konstruktów genetycznych poprzez włączenie w skład cząsteczki nośnika sekwencji sygnałowej, która jest sekwencją wiążącą DNA ośmiu reszt aminokwasowych lizyny - KKKKKKKKK. Dołączenie sekwencji sygnałowej do sekwencji wiążącej DNA przeprowadza się przy użyciu odcinka łącznikowego dwóch cząsteczek kwasu ε-aminoheksanowego. Następnie tworzą się kompleksy DNA/nośnik. Następnie przeprowadza się transfekcję in vitro. Proponowany wynalazek umożliwia zwiększenie wydajności dostarczania interesującego genu do komórek nowotworowych i macierzystych. 2 w.p. mucha, 4 chore.

Wynalazek dotyczy medycyny genowej, terapii genowej, biotechnologii i farmaceutyków i może być stosowany do celowanego dostarczania konstruktów genetycznych do macierzystych i złośliwych komórek nowotworowych w celu korygowania defektów genów i zapobiegania chorobom. Specyficzne tkankowo dostarczanie konstruktów genowych jest zapewnione poprzez zastosowanie sekwencji sygnałowych dla receptora CXCR4, który ulega ekspresji w tego typu komórkach.

Tym, co odróżnia terapię genową od metod medycyny konwencjonalnej, jest skupienie się na zwalczaniu przyczyny choroby, a nie objawów i konsekwencji. Obecnie opracowywane są metody terapii genowej do leczenia lub zapobiegania wielu chorobom człowieka. Te podejścia mogą mieć zastosowanie w terapii in vivo i ex vivo. Terapia in vivo opiera się na bezpośrednim wprowadzeniu konstruktów genetycznych bezpośrednio do tkanek organizmu. Poród można wykonać dożylnie za pomocą dozowników aerozolowych lub iniekcji do określonych tkanek. Terapia genowa ex vivo polega na izolacji określonego typu komórek z organizmu, wprowadzeniu do nich „terapeutycznego” konstruktu genowego, selekcji transfekowanych komórek i późniejszej reimplantacji u pacjenta.

Istnieją trzy główne kierunki w obecnie opracowywanych podejściach do dostarczania konstruktów genetycznych:

1) klonowanie w ramach wektorów wirusowych;

2) stosowanie fizycznych metod transfekcji;

3) zastosowanie kompleksów plazmidowych wektorów ekspresyjnych i niewirusowych cząsteczek nośnikowych.

Transfer za pośrednictwem wirusa jest wysoce wydajną metodą dostarczania DNA do komórek docelowych, ponieważ wejście zmodyfikowanego wektora wirusowego jest podobne do procesu, który zachodzi naturalnie, gdy genom wirusa jest przenoszony do komórek gospodarza. Najbardziej badane są wektory utworzone na bazie wirusów retro-, adeno-, adeno-stowarzyszonych. Zalety wirusów to przede wszystkim połączenie właściwości wektora ekspresyjnego i nośnika, możliwość specyficznego dostarczania, zdolność do transfekcji komórek dzielących się i niedzielących, możliwość osadzenia DNA w chromosomie w celu zapewnienia długoterminowa ekspresja. Ze względu na te zalety podejście to jest nadal szeroko stosowane w badaniach nad dostarczaniem genów, chociaż ma pewne wady. Wirusy retro- i adeno-związane mają ograniczoną wielkość sklonowanego fragmentu DNA i ryzyko mutagenezy insercyjnej, gdy wirus jest wstawiony do genomu gospodarza. Poważną wadą wektorów adenowirusowych jest wyraźna odpowiedź immunologiczna przy wysokich dawkach i powtarzane wstrzyknięcia konstruktów adenowirusowych (Walther W., Stein U. Wektory wirusowe do przenoszenia genów: przegląd ich zastosowania w leczeniu chorób ludzi // Leki. - 2000. - v. 60. - P. 249-271, patent RF nr 2252255, C12N 15/37, C12N 15/86, C12N 15/861, C12N 15/867, opublikowany 2005.05.20).

Wstrzyknięcie konstruktów nagiego plazmidowego DNA było jednym z pierwszych podejść w opracowywaniu strategii leczenia terapii genowej. Niska wydajność transfekcji przy użyciu „nagiego” DNA dała impuls do opracowania nowych metod dostarczania konstruktów genetycznych. Badano różne fizyczne metody dostarczania DNA do komórek ciała. Najbardziej popularne wśród nich są metody transfekcji balistycznej i elektroporacji, które są szeroko stosowane do transfekcji komórek skóry i mięśni. Metoda transfekcji balistycznej polega na penetracji do komórki DNA osadzonego na mikrocząstkach złota lub wolframu. Transfekcja następuje pod ciśnieniem strumienia sprężonego gazu lub cieczy. Metoda elektroporacji opiera się na lokalnej zmianie potencjału elektrycznego błony komórkowej w wyniku działania prądu elektrycznego. Impulsy elektryczne prowadzą do tworzenia porów w błonie komórkowej, dzięki czemu staje się ona przepuszczalna dla biomolekuł. Aby przezwyciężyć niską wydajność transfekcji nagiego DNA in vivo, stosuje się również metodę szoku hydrodynamicznego – dożylne lub dotętnicze wstrzyknięcie wektora plazmidowego w dużej objętości roztworu. Głównymi wadami istniejących fizycznych metod transfekcji są niska wydajność i lokalizacja efektu dostarczania DNA. Pozwalają plazmidowi pokonać błonę komórkową i uniknąć wtrącenia w endosomach, zapobiegając w ten sposób degradacji enzymatycznej, ale z reguły nie zapewniają długotrwałej trwałości wprowadzonych konstruktów genetycznych (Wells D.J. Postęp i perspektywy terapii genowej: elektroporacja i inne metody fizyczne // Gene Ther. - 2004. - v.11, nr 18. - P.1363-1369; Wang S., Joshi S, Lu S. Dostarczanie DNA do skóry przez bombardowanie cząstkami // Metody Mol Biol. - 2004. - v.245. - P.185-196; Herweijer H., Wolff J.A. Postęp i perspektywy: transfer genów nagiego DNA i terapia // Terapia genowa. - 2003. - v.10, nr 6. - P 0,453-458).

Nośniki niewirusowe są alternatywą dla transferu konstruktów genetycznych do komórek ssaków za pośrednictwem wirusa. Nośniki niewirusowe są łatwo syntetyzowane, łatwość ich modyfikacji umożliwia dokonywanie zmian w strukturze i składzie cząsteczek, poprawiając tym samym sposób dostarczania. W przypadku stosowania pożywek niewirusowych nie ma ograniczeń co do wielkości dostarczanego wektora ekspresyjnego. Ponadto są mniej toksyczne, w większości przypadków nie wywołują swoistej odpowiedzi immunologicznej i są bezpieczniejsze w użyciu in vivo niż wektory wirusowe. Dlatego wprowadzenie konstruktu genetycznego upakowanego w niewirusowych nosicielach można powtórzyć. Badanie nośników niewirusowych rozwija się w kierunku poprawy właściwości transfekcyjnych plazmidowego DNA poprzez tworzenie kompleksów DNA z różnymi związkami syntetycznymi (lipidy, oligo- i polipeptydy, polimery itp.) (na przykład patent RF nr 2336090 , A61K 39/00, A61K 47/00, opublikowany 2008.10.20). Udoskonalenie niewirusowych nośników dostarczania w dużej mierze zależy od szczegółowego zrozumienia barier wnikania DNA do komórek organizmu (Schmidt-Wolf G.D., Schmidt-Wolf I.G. Wektory niewirusowe i hybrydowe w terapii genowej człowieka: aktualizacja // Trendy Mol Med. - 2003. - v.9, nr 2. - P.67-72; Gardlic R, Palffy R, Hodosy J., Turna J., Celec P. Wektory i systemy dostarczania w terapii genowej // Med Sci Monit - 2005. - v .11, nr 4. - P.110-121; Wiethoff CM, Middaugh CR Barriers to niewirusowe dostarczanie genów // J Pharm Sci. - 2003. - v.92, nr 2. - P .203-217).

Uważa się, że nosiciel niewirusowy powinien mieć następujące cechy:

1) być nietoksyczny, zwarty i chronić plazmidowy DNA przed degradacją enzymatyczną, być wydalany z organizmu po użyciu;

2) zapewnić przenikanie plazmidu do komórki poprzez specyficzne wiązanie z błoną komórkową komórki:

3) mają zdolność uwalniania DNA z przedziału endosomalnego;

zapewnić dysocjację DNA z kompleksu w celu późniejszego transportu plazmidu do jądra.

Na potrzeby terapii genowej najbardziej preferowaną metodą dostarczania konstruktów genetycznych jest ich specyficzny tkankowo transfer do komórek i tkanek organizmu.

Pierwszą barierą dla wewnątrzkomórkowej penetracji kompleksów jest błona plazmatyczna. Większość kompleksów oddziałuje z powierzchnią komórki za pomocą sił elektrostatycznych. Możliwym mechanizmem wiązania kompleksów z komórką jest ich interakcja z białkami powierzchniowymi komórki, glikozaminoglikanami. Jednak przy tym mechanizmie penetracji kompleksów nie ma specyficznego tkankowo transferu konstruktów genowych. Jednocześnie problem specyficznego tkankowo dostarczania konstruktów genetycznych jest istotny w terapii genowej wielu chorób. Do specyficznej interakcji z powierzchnią komórki kompleksy zawierają ligandy receptorów na powierzchni komórki. Do tej pory scharakteryzowano szereg ligandów integryn peptydowych. Należą do nich w szczególności fragment tripeptydowy RGD (integryny są obecne na powierzchni wielu komórek), transferyna (jej receptor ma zwiększoną ekspresję w komórkach proliferujących), asialorosomukoid (receptor asialoglikoproteiny ma specyficzną ekspresję w hepatocytach wątroby).

Do specyficznego dostarczania materiału genetycznego do komórek nerwowych Zeng i współpracownicy zaproponowali użycie nośnika składającego się z regionu sygnałowego do receptora TrkA (80-108 aminokwasów z czynnika wzrostu nerwów) i sekwencji wiążącej DNA z 10 reszt aminokwasowych lizyny . Nośnik ten, w obecności czynnika endosomolitycznego chlorochiny, który ułatwia uwalnianie kompleksów z przedziału endosomalnego komórki, był w stanie specyficznie tkankowo dostarczyć gen markerowy tylko do komórek wyrażających receptor TrkA. Nośnik ten może być stosowany w terapii genowej różnych chorób neurologicznych, takich jak padaczka, choroba Parkinsona i Alzheimera. Nie nadaje się jednak do dostarczania materiału genetycznego do innych typów komórek (Zeng J, Too HP, Ma Y, Luo E, Wang S A syntetyczny peptyd zawierający pętlę 4 czynnika wzrostu nerwów do ukierunkowanego dostarczania genów // J Gene Med 2004; 6 : 1247-1256).

Ludzkie komórki macierzyste są uważane za obiecujące środki w terapii komórkowej i genowej różnych ludzkich chorób. Jednocześnie należą do najtrudniejszych do transfekcji typów komórek. W terapii genowej raka konieczne jest zapewnienie dostarczania genów bezpośrednio do komórek nowotworowych.

CXCR4 jest receptorem czynnika migracji komórek macierzystych dla chemokiny SDF-1α. CXCR4 ulega ekspresji w komórkach krwiotwórczych, śródbłonku naczyniowym i komórkach satelitarnych mięśni. Wysoki poziom ekspresji tego genu odnotowano w ponad 20 typach guzów nowotworowych (rak piersi, rak prostaty itp.), a także w migrujących komórkach macierzystych. Receptor CXCR4 jest również zdolny do wiązania się z wirusową chemokiną vMIP-II (wirus mięsaka Kaposiego). Tak więc włączenie sekwencji sygnałowych do wiązania z receptorem CXCR4 do cząsteczek nośnika jest obiecującym sposobem tworzenia systemów ukierunkowanego dostarczania genów do komórek nowotworowych i macierzystych.

Aby dostarczyć materiał genetyczny do komórek, w których zachodzi ekspresja receptora CXCR4, Le Bon i współpracownicy wykorzystali syntetyczny ligand tego receptora, AMD3100, sprzężony z polietylenoiminą lub lipidami kationowymi. Kompleksy materiału genetycznego z tymi związkami nie doprowadziły do ​​istotnego wzrostu wydajności dostarczania genu markerowego do komórek CXCR4+ w porównaniu ze związkami bez sygnałów. Nośniki stosowane przez Le Bona nie były skuteczne, ponieważ specyficzne dostarczanie z ich pomocą jest możliwe tylko wtedy, gdy do pożywki transfekcyjnej zostanie dodana substancja promująca internalizację receptora CXCR4 (ester forbolu). (Le Bon B, Van Craynest N, Daoudi JM, Di Giorgio C, Domb AJ, Vierling P. AMD3100 Koniugaty jako składniki celowanych niewirusowych systemów dostarczania genów: wydajność syntezy i transfekcji in vitro komórek z ekspresją CXCR4. // Bioconjugate Chem 2004 , 15: 413-423).

W związku z tym istnieje potrzeba stworzenia nośnika konstruktów genetycznych, które mogą zapewnić swoiste dostarczanie do komórek CXCR4(+) i nie wpływać na pobliskie tkanki. Taki sposób zapewnia niniejszy wynalazek.

Wynalazek opiera się na zadaniu opracowania metody specyficznego dostarczania konstruktów genetycznych do komórek wyrażających receptor CXCR4, w którym poprzez zastosowanie nośników konstruktów genetycznych zawierających sekwencje sygnałowe dla receptora CXCR4 zwiększa się wydajność dostarczania gen „zainteresowania” zostaje osiągnięty. Należy zauważyć, że syntezę zastrzeganych nośników można przeprowadzić przy użyciu dowolnej ze znanych metod syntezy peptydów w fazie stałej.

Rozwiązanie problemu technicznego zapewnia fakt, że w metodzie celowanego dostarczania DNA do komórek nowotworowych i macierzystych z ekspresją receptora CXCR4, w tym przygotowanie nośników konstruktów genetycznych poprzez włączenie w skład cząsteczek nośnika, co jest sekwencja wiążąca DNA ośmiu reszt aminokwasowych lizyny - KKKKKKKK, sekwencje sygnałowe, tworzenie kompleksów DNA/nośnik, przeprowadzanie transfekcji in vitro, sekwencja sygnałowa jest wybrana z grupy: fragment od 1 do 8 aminokwasów sekwencja N-końca białka SDF-1α - KPVSLSYR; fragment od 1 do 17 aminokwasów sekwencji końca N białka SDF-1α - KPVSLSYRCPCRFFESH, gdzie 9 i 11 aminokwasów zastąpiono seryną; lub fragment od 1 do 10 aminokwasów N-końcowej sekwencji wirusowej chemokiny vMIP-II - LGASWHRPDK; przyłączenie sekwencji sygnałowej do sekwencji wiążącej DNA przeprowadza się przy użyciu miejsca łącznikowego dwóch cząsteczek kwasu ε-aminoheksanowego.

W tym przypadku sekwencja sygnałowa może być fragmentem od aminokwasów 1 do 8 sekwencji końca N białka SDF-1α-KPVSLSYR.

Alternatywnie, sekwencja sygnałowa może być fragmentem od aminokwasów od 1 do 17 N-końcowej sekwencji białka SDF-1α - KPVSLSYRCPCRFFESH, gdzie aminokwasy 9 i 11 zastąpiono seryną.

Jako region sygnałowy można również zastosować fragment aminokwasów od 1 do 10 N-końcowej sekwencji wirusowej chemokiny vMIP-II - LGASWHRPDK, zsyntetyzowany z D-aminokwasów.

Jako składnik zapewniający wyjście z endosomów kompleksów składających się z nośników i materiału genetycznego można zastosować glicerol lub chlorochinę.

Plazmidowy DNA może być użyty jako materiał genetyczny dla nosicieli.

Określony wynik techniczny w niniejszym wynalazku uzyskuje się poprzez zastosowanie cząsteczek oligolizyny - KKKKKKKK (K8) skoniugowanych z sekwencjami sygnałowymi do receptora CXCR4 z białek SDF-1 lub vMIP-II, czyli N-końcowej sekwencji SDF-1 chemokina (z 1 do 8 aminokwasów) lub N-końcowa sekwencja chemokiny SDF-1 (od 1 do 17 aminokwasów, z zastąpieniem 9 i 11 aminokwasów seryną) lub N-końcowa sekwencja wirusa vMIP-II chemokina (od 1 do 10 aminokwasów w konformacji D). Obecność oligolizyny KKKKKKKK w składzie nośnika umożliwia tworzenie przez koniugaty kompleksów z kwasami nukleinowymi, w szczególności z plazmidowym DNA, dzięki oddziaływaniu elektrostatycznemu.

Podany wynik techniczny osiągają trzy warianty proponowanych mediów.

Określony wynik techniczny według pierwszego wariantu uzyskuje się dzięki temu, że w krótkim nośniku CDP opartym na syntetycznych analogach chemokiny SDF-1, która zawiera składnik kationowy, jakim jest oligolizyna K8, stosowana do kondensacji plazmidowego DNA oraz składnik ligandowy do oddziaływania z receptorem CXCR4, według wynalazku fragment (1-8 aa) sekwencji N-końca białka SDF-1, posiadający strukturę KPVSLSYR i wykazujący aktywność agonistów receptora CXCR4, jest stosowany jako składnik ligandowy, a składnik kationowy koniugatu ma strukturę KKKKKKKK i jest przyłączony do składnika ligandowego poprzez odstępnik – dwie cząsteczki kwasu ε-aminoheksanowego (Ahx).

Określony wynik techniczny według wariantu drugiego uzyskuje się dzięki temu, że w nośniku (długi CDP) oparty jest na syntetycznych analogach chemokiny SDF-1, która zawiera składnik kationowy, jakim jest oligolizyna K8 wykorzystywana do kondensacji plazmidowego DNA, oraz składnik ligandowy do oddziaływania z receptorem CXCR4, zgodnie z zastrzeganym wynalazkiem, fragment (1-17 aa; aa9 i aa11 zastąpiony seryną) sekwencji końca N białka SDF-1, mający struktura KPVSLSYRSPSRFFESH i posiadająca aktywność agonistów receptora CXCR4, jest stosowana jako składnik ligandowy, a składnik kationowy koniugatu ma strukturę KKKKKKKK i jest przyłączony do składnika ligandowego poprzez odstępnik - dwie cząsteczki kwasu ε-aminoheksanowego.

Określony wynik techniczny według trzeciego wariantu osiąga się dzięki temu, że w nośniku (wirusowym CDP) opartym na syntetycznych analogach białka wirusa mięsaka Kaposiego vMIP-II, który zawiera składnik kationowy, jakim jest oligolizyna K8, zastosowano do kondensacji plazmidowego DNA i składnika ligandowego do oddziaływania z receptorem CXCR4, zgodnie z zastrzeganym wynalazkiem, fragment (1-10 Daa - zsyntetyzowany z D-aminokwasów) sekwencji N-końca vMIP- Białko II, mające strukturę LGASWHRPDK i wykazujące aktywność antagonistów receptora CXCR4, stosuje się jako składnik ligandowy, a składnik kationowy koniugatu ma strukturę KKKKKKKKK i jest przyłączony do składnika ligandowego poprzez odstępnik - dwie cząsteczki ε kwas -aminoheksanowy.

Wszystkie trzy warianty zastrzeganego nośnika można zsyntetyzować przy użyciu znanych metod syntezy peptydów, na przykład metody Boc w fazie stałej (Merrifield, R.B. Synteza peptydów w fazie stałej. I. Synteza tetrapeptydu // Journal of the American Chemical Society. 1963. V.85 (14), s. 2149-2154).

Konkretne przykłady realizacji

Wynalazek zilustrowano za pomocą figury 1, która przedstawia zmianę intensywności fluorescencji bromku etydyny wraz ze wzrostem stosunków ładunku nośnik/DNA w kompleksach krótkich CDP/DNA, długich CDP/DNA i wirusowych CDP/DNA. Spadek intensywności fluorescencji wskazuje na wzrost gęstości utworzonych kompleksów. Plateauowanie krzywych fluorescencji wskazuje, że kompleksy osiągnęły gęstość wystarczającą do wygaszenia fluorescencji bromku etydyny.

Figura 2 przedstawia zależność aktywności lucyferazy w komórkach HeLa (CXCR4+) po transfekcji kompleksami krótkiego CDP/DNA, długim CDP/DNA i wirusowym CDP/DNA w obecności czynnika endosomolitycznego, glicerolu. W tym przypadku zastosowano kompleksy utworzone przy następujących stosunkach ładunku nośnik/DNA: 3/1, 6/1, 9/1, 12/1. Nienaruszona cząsteczka, kompleksy DNA, PEI/DNA 1/8 (kontrola pozytywna eksperymentu - komercyjny nośnik rozgałęzionej polietylenoiminy 25 kDa - PEI) oraz kompleksy zawierające DNA i peptyd kontrolny (CP) służyły jako kontrole eksperymentalne. CP różni się od nośników w niniejszym wynalazku tym, że nie ma sygnału wiązania receptora CXCR4 i jest strukturalnie oligolizyną KKKKKKKK. Skuteczność dostarczania genów markerowych przez nosicieli krótkiego CDP, długiego CDP i wirusowego CDP była 10–100 razy wyższa niż w przypadku kontrolnej CP.

Figura 3 przedstawia zależność aktywności lucyferazy w komórkach A172 (CXCR4+) po transfekcji kompleksami krótkiego CDP/DNA, długim CDP/DNA i wirusowym CDP/DNA w obecności czynnika endosomolitycznego, glicerolu. Tutaj użyliśmy kompleksów utworzonych w następujących stosunkach ładunku nośnik/DNA: 9/1, 12/1. Nienaruszona cząsteczka DNA, kompleksy PEI/DNA 1/8 oraz kompleksy zawierające DNA i peptyd CP służyły jako kontrole eksperymentalne. Skuteczność dostarczania genów markerowych przez nosicieli krótkiego CDP, długiego CDP i wirusowego CDP była 10 razy wyższa niż w przypadku kontrolnego CP.

Wyniki na Figurze 2 i Figurze 3 potwierdzają specyficzność nośników w niniejszym wynalazku wobec receptora CXCR4.

Figura 4 przedstawia zależność aktywności lucyferazy w komórkach CHO (CXCR4-) po transfekcji kompleksami krótkiego CDP/DNA, długim CDP/DNA i wirusowym CDP/DNA w obecności czynnika endosomolitycznego, glicerolu. Zastosowano kompleksy utworzone w następujących stosunkach ładunku nośnik/DNA: 9/1, 12/1. Nienaruszona cząsteczka DNA, kompleksy PEI/DNA 1/8 oraz kompleksy zawierające DNA i peptyd CP służyły jako kontrole eksperymentalne. Wydajność dostarczania genów markerowych przez nosicieli krótkiego CDP, długiego CDP i wirusowego CDP była prawie taka sama jak przy użyciu kontrolnego CP.

Nosiciele z sygnałem nie są w stanie zapewnić znacznie wyższego poziomu dostarczania materiału genetycznego do komórek bez ekspresji receptora w porównaniu z kontrolą.

Wdrożenie wynalazku można wyjaśnić w następujący sposób. Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie ukierunkowanego dostarczania konstruktów genetycznych do komórek wyrażających receptor CXCR4 przy użyciu nośników materiału genetycznego zawierającego sekwencje sygnałowe dla tego receptora.

W pierwszym etapie następuje tworzenie kompleksów jednego z wykonań nosiciela z konstruktem genetycznym zawierającym gen „zainteresowania”. Powstałe kompleksy służą do dostarczania materiału genetycznego do odpowiednich komórek docelowych. Analizę efektywności penetracji komórek ocenia się metodami enzymatycznymi lub immunohistochemicznymi.

Tworzenie kompleksów odbywa się w roztworze izotonicznym. Korzystny jest bufor bezsolny HBM (mannitol buforowany Hepes). Wielkość powstałych kompleksów wynosi 170-230 nm.

Jako konstrukty genetyczne w jednym z wykonań z użyciem plazmidowego DNA.

Plazmidowy DNA zawiera marker (luc, lacZ) lub gen terapeutyczny (w zależności od choroby), pod kontrolą odpowiednich promotorów i wzmacniaczy (CMV, SV40 itp.) oraz innych elementów niezbędnych np. do replikacji w gospodarzu komórka lub integracja z genomem. W leczeniu raka za pomocą terapii genowej można zastosować geny HLA-B7, IL-2, IL-4, TNF, IFN, P53, kinazę tymidynową i inne.

W innej postaci oligonukleotydy składające się z małego DNA lub RNA komplementarnego do specyficznej sekwencji w mRNA lub jego prekursora stosuje się jako konstrukt genetyczny do hamowania syntezy produktu białkowego lub odrzucania eksonu niosącego mutację z mRNA. Powstałe kompleksy służą do dostarczania materiału genetycznego do komórek wyrażających receptor CXCR4. Penetracja kompleksów nośnikowych według niniejszego wynalazku zachodzi głównie przez transport za pośrednictwem receptora przez wiązanie z zewnątrzkomórkowymi domenami receptora CXCR4 i późniejszą internalizację receptora.

Dawka nośników i materiału genetycznego ustalana jest indywidualnie i zależy od rodzaju komórek, ilości receptora CXCR4 na ich powierzchni oraz złożoności transfekcji tych komórek.

Aby zwiększyć wydajność tych nośników, transfekcję komórek korzystnie prowadzi się przy użyciu środka endosomolitycznego. Należą do nich glicerol, chlorochina itp. Substancje te dodaje się do pożywki transfekcyjnej bezpośrednio przed dodaniem kompleksów do komórek. Pozostają niezwiązane z kompleksami, a zatem nie wpływają na ich strukturę.

Peptydy, inne związki polimerowe, liposomy zdolne do kompaktowania kwasów nukleinowych mogą być użyte jako część nośnika wiążąca DNA. Ponadto mogą mieć właściwości endosomolityczne (nie ma potrzeby stosowania dodatkowego środka endosomolitycznego) i w razie potrzeby (np. w celu dostarczenia genów terapeutycznych lub markerowych) dostarczać do jądra materiał genetyczny.

Przy doborze warunków transfekcji mają one na celu zapewnienie jak najwyższej efektywności dostaw. Korzystne jest inkubowanie kompleksów z komórkami przez 4 godziny. Możesz jednak zmienić ten czas od 3 do 6 godzin. Po upływie czasu inkubacji pożywkę zmienia się, a komórki pozostawia się na 24-48 godzin (w zależności od typu komórki i materiału genetycznego) w celu ekspresji wprowadzonych konstruktów z interesującym genem lub wykazania efektu terapeutycznego oligonukleotydów.

Analizę wydajności dostarczania przeprowadza się metodami enzymatycznymi lub immunohistochemicznymi, w zależności od rodzaju wprowadzonego konstruktu genowego.

Przykład 1 Tworzenie kompleksów DNA/nośnik i badanie procesu kompleksowania.

Plazmid pCLUC4 zawierający gen lucyferazy świetlika pod kontrolą promotora cytomegalowirusa zastosowano jako materiał genetyczny do ukierunkowanego dostarczania genów do komórek. Zastosowano jeden z przykładów wykonania nośnika.

Roztwory 1 μg DNA w 40 μl buforu 1X HBM (5% wag./obj. mannitol, 5 mM Hepes, pH 7,5) i roztwory nośników odpowiadające różnym stosunkom ładunku DNA/nośnik przygotowano w równej objętości buforu. Roztwór nośnika stopniowo dodawano do probówki Eppendorfa z roztworem DNA i energicznie mieszano przez 20 sekund. Otrzymaną mieszaninę pozostawiono na 30 minut w temperaturze pokojowej do zakończenia tworzenia kompleksów.

Wyniki kompleksowania analizuje się metodą wypierania bromkiem etydyny. Fluorescencję bromku etydyny mierzy się za pomocą wielomodowego czytnika spektralnego Varioscan Flash (Thermo, Finlandia). Przemieszczenie bromku etydyny zaobserwowano przy 590 nm (wzbudzenie przy 544 nm) po dodaniu nośnika do DNA (20 μg/ml) wstępnie inkubowanego ze środkiem interkalującym, bromkiem etydyny (400 ng/ml). Przemieszczenie obliczono stosując wzór (F-Ff)/(Fb-Ff), gdzie Ff i Fb oznaczają intensywności fluorescencji bromku etydyny odpowiednio w nieobecności i obecności DNA.

Przykład 2 Przeprowadzanie transfekcji in vitro.

Komórki HeLa, A172 i CHO umieszczono na 48-studzienkowych płytkach hodowlanych (Nunc) 24 godziny przed transfekcją przy 50 000 komórek na studzienkę, zawierających 500 µl standardowej mieszaniny hodowlanej składającej się z pożywki hodowlanej DMEM (GIBCO), 10% płodowej surowicy bydlęcej (GIBCO), 2 mM glutaminy, uzupełnione penicyliną (50 U/ml), streptomycyną (50 µg/ml) i 1 mM pirogronianem sodu. Zawiesinę kompleksów przygotowano zgodnie z metodą opisaną w przykładzie 1 w ilości 2 μg DNA na studzienkę płytki hodowlanej. 10 minut przed dodaniem zawiesiny kompleksów DNA/nośnik, komórki przemyto kilka razy DMEM i do każdej studzienki dodano 500 µl pożywki zawierającej 15% glicerol i 1,5% etanol. Transfekcję przeprowadzono przez dodanie do pożywki zawiesiny kompleksów DNA/nośnik. Po sporządzeniu kompleksów płytki z komórkami umieszczono w termostacie o temperaturze 37°C i 5% CO2 na 4 godziny. Po czasie inkubacji komórki przemyto pożywką DMEM i do każdej studzienki dodano 500 µl standardowej mieszaniny hodowlanej. Płytkę hodowlaną inkubowano w termostacie w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez 48 godzin, po czym wykryto ekspresję genu markerowego.

Przykład 3 Wykrywanie ekspresji genu lucyferazy po transfekcji in vitro.

Pożywkę usunięto z płytek hodowlanych, komórki przemyto 1x PBS (pH 7,2). Do każdego dołka dodano 80 μl buforu do lizy (25 M Gly-Gly, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF; pH 7,8). 50 µl lizatu przeniesiono na płytki polistyrenowe o nieprzezroczystych ściankach w celu pomiaru aktywności lucyferazy. Pomiar przeprowadzono przy użyciu wielomodowego czytnika skanowania spektralnego Varioscan Flash (Thermo, Finlandia). Pomiar wykonano przy użyciu roztworu lucyferase flash mix (20 mM Tricine, 1,07 mM (MgCO 3) 4 Mg(OH) 2 × 5 H 2 O, 2,67 mM MgSO 4 , 0,1 mM EDTA, 33,3 mM DTT, 530 μM ATP , 270 μM acetylokoenzym A, 470 μM lucyferyna). Każdy pomiar wykonywano przez 10 sekund. Odczyty przyrządu uzyskano we względnych jednostkach światła (RLU). Wyniki doświadczenia oceniono we względnych jednostkach światła na 1 mg białka całkowitego z ekstraktów komórkowych w studzience płytki hodowlanej. Całkowitą ilość białka w każdej studzience zmierzono przy użyciu zestawu do oznaczania białka (Bio-Rad) względem standardowej krzywej albuminy surowicy bydlęcej. Wyniki przedstawiono na rysunkach 2, 3, 4.