W zależności od techniki przygotowania, hodowle komórkowe dzieli się na:

- pojedyncza warstwa– ogniwa są w stanie przyczepiać się i rozmnażać na powierzchni obojętnego chemicznie szkła lub tworzywa sztucznego.

- zawieszenie- komórki namnażają się w całej objętości pożywki podczas jej mieszania.

- organ- całe fragmenty narządów i tkanek, które zachowują pierwotną strukturę poza ciałem (ograniczone zastosowanie).

Najbardziej rozpowszechnione są jednowarstwowe hodowle komórkowe, który można podzielić w zależności od liczby żywotnych pokoleń na

1) pierwotny (przede wszystkim trypsynizowany),

2) półprzeszczepialne (diploidalne)

3) przeszczepialne.

Początek dzieli się je na organizmy embrionalne, nowotworowe i pochodzące z organizmów dorosłych.

Przez morfogenezę- na fibroblasty, nabłonki itp.

Podstawowy kultury komórkowe to komórki dowolnej tkanki ludzkiej lub zwierzęcej, które mają zdolność wzrostu w postaci monowarstwy na plastikowej lub szklanej powierzchni pokrytej specjalną pożywką. Żywotność takich upraw jest ograniczona. W każdym przypadku uzyskuje się je z tkanki po mechanicznym rozdrobnieniu, obróbce enzymami proteolitycznymi i standaryzacji liczby komórek. Hodowle pierwotne pochodzące z nerek małpy, nerki embrionalne człowieka, owodni człowieka, embriony kurze są szeroko stosowane do izolacji i akumulacji wirusów, a także do produkcji szczepionek wirusowych.

półprzeszczepialne(lub diploidalny ) kultury komórkowe - komórki tego samego typu, zdolne do wytrzymania do 50-100 pasaży in vitro, przy zachowaniu oryginalnego diploidalnego zestawu chromosomów. Diploidalne szczepy ludzkich zarodkowych fibroblastów są wykorzystywane zarówno do diagnozowania infekcji wirusowych, jak i do produkcji szczepionek wirusowych. Najczęściej stosowanymi kulturami są ludzkie fibroblasty embrionalne (WI-38, MRC-5, IMR-9), krowy, świnie, owce itp.

przeszczepione linie komórkowe charakteryzują się potencjalną nieśmiertelnością i heteroploidalnym kariotypem. Pierwotne hodowle komórkowe mogą być źródłem ciągłych linii(na przykład SOC - serce małpy cinamobus, PES - nerki zarodka świni, VNK-21 - z nerek jednodniowych chomików syryjskich; PMS - z nerki świnki morskiej, Vero - nerka zielonej małpy itp.), których poszczególne komórki wykazują tendencję do nieskończonego rozmnażania in vitro. Zespół zmian prowadzących do pojawienia się takich cech z komórek nazywamy transformacją, a komórki przeszczepionych kultur tkankowych nazywamy transformowanymi. Innym źródłem przeszczepialnych linii komórkowych są: nowotwory złośliwe. W tym przypadku transformacja komórek zachodzi in vivo. W praktyce wirusologicznej najczęściej wykorzystywane są następujące linie przeszczepionych komórek: HeLa – pozyskane z raka szyjki macicy; Ner-2 - z raka krtani; Detroit-6 - od przerzutów raka płuc do szpiku kostnego; RH - z ludzkiej nerki, KB - rak jamy ustnej, RD - ludzki mięśniakomięsak prążkowanokomórkowy.

Kultury organów- są skrawkami organów zwierzęcych przygotowanymi w sterylnych warunkach, które przez pewien okres (dni, tygodnie) zachowują swoją żywotną aktywność w specjalnych warunkach hodowli

Hodowle komórkowe - są to jednorodne genetycznie populacje komórek rosnących w stałych warunkach środowiskowych. Mogą to być szczepy normalnych ludzkich, zwierzęcych, roślinnych lub złośliwych komórek nowotworowych.

Warunki uprawy

Komórki są zwykle umieszczane w szklanych słojach, stąd nazwa badanie in vitro (z łac. In – in, vitro – szkło), choć obecnie kultury coraz częściej hoduje się w plastikowych naczyniach. Komórki wyizolowane z tkanek inkubuje się w temperaturze 38°C 39°C (dla komórek zwierzęcych i ludzkich) oraz w 22°C 28°C (dla komórek roślinnych) w pożywce o odpowiednim składzie. Komórki następnie rosną jako zawiesina lub monowarstwa. Hodowla w zawiesinie to hodowla pojedynczych komórek lub ich małych grup w zawiesinie w płynnej pożywce przy użyciu sprzętu, który zapewnia im napowietrzanie i mieszanie. Cechą charakterystyczną kultur zawiesinowych jest ich niejednorodność morfologiczna i biochemiczna. Populacja komórek zawiera komórki, które różnią się wielkością i kształtem.

Aplikacja

Zastosowanie w cytologii

W cytologii ta metoda jest wygodna, ponieważ komórki w hodowli są łatwo dostępne dla różnych manipulacji biochemicznych. Podczas pracy z nimi można wprowadzić substancje radioaktywne, trucizny, hormony itp. w odpowiednim stężeniu przez wymagany czas. Ilość tych substancji może być o rząd wielkości mniejsza niż w doświadczeniach na zwierzętach. Nie ma niebezpieczeństwa, że ​​substancja będzie metabolizowana przez wątrobę, wydalana przez nerki lub odkładana w mięśniach. Zapewnia to rzeczywiste wartości szybkości działania substancji na komórkę lub jej przyswajania przez komórkę.

Do badania żywych komórek roślinnych wykorzystuje się hodowlę izolowanych protoplastów. Wyizolowane protoplasty można zdefiniować jako „nagie” komórki roślinne, ponieważ ściana komórkowa jest usuwana mechanicznie lub enzymatycznie. System izolowanych protoplastów umożliwia przeprowadzanie selekcji na poziomie komórkowym, pracę w małej objętości z dużą liczbą pojedynczych komórek, uzyskiwanie nowych form roślin poprzez bezpośredni transfer genów oraz uzyskiwanie hybryd somatycznych pomiędzy systematycznie odległymi gatunek. Ponieważ regeneracja błony komórkowej natychmiast rozpoczyna się w izolowanych protoplastach, są one wygodnym obiektem do badania powstawania mikrowłókien celulozowych.

Zastosowanie w wirusologii

W wirusologii kultury komórkowe są bardzo szeroko stosowane, ponieważ są stosunkowo łatwe w pracy w laboratorium, w przeciwieństwie do innych metod - hodowli wirusów na zarodkach kurzych lub żywych zwierzętach. Ponadto, cytopatyczne działanie wirusów można dobrze zbadać na pojedynczej warstwie hodowli komórkowej, poprzez tworzenie wtrąceń wewnątrzkomórkowych, blaszek, w reakcjach hemadsorpcji i hemaglutynacji oraz przez rozkład koloru. Podczas pracy z kulturami komórkowymi znaczące wyniki można uzyskać pracując z niewielką liczbą kultur. Eksperymenty, które wymagają setek lub tysięcy zwierząt laboratoryjnych, aby potwierdzić ten lub inny fakt, można przeprowadzić z równą pewnością statystyczną na tej samej liczbie kultur komórkowych. Laboratorium nie musi więc prowadzić wiwarium i nie ma etycznych aspektów postępowania z chorymi zwierzętami.

Badana jest również transformacja komórek przez wirusy, której mechanizm jest podobny do mechanizmu nowotworów złośliwych.

Zastosowanie w farmakologii

Hodowle komórkowe są szeroko stosowane do testowania działania substancji, które mogą być stosowane jako leki. Pomimo tego, że wyników uzyskanych na hodowlach komórkowych nie można ekstrapolować na cały organizm, nie ma wątpliwości, że jeśli konkretna substancja zaburza aktywność komórek z kilku różnych linii hodowlanych, to należy się również spodziewać negatywnego efektu, gdy ta substancja jest wprowadzony do organizmu.

Zastosowanie w biotechnologii

Specyficzne kultury komórkowe są cennym źródłem hormonów i innych substancji biologicznie czynnych. Już teraz są wykorzystywane do produkcji interferonu białkowego o działaniu przeciwwirusowym.

Zastosowanie w genetyce

W genetyce zdolność komórek do wzrostu w kulturze wykorzystuje się w następujący sposób:

• Klonowanie
• Przechowywanie komórek
• Pozyskiwanie zmutowanych komórek i praca z nimi

Rodzaje kultur komórkowych

1. Trypsynizacja pierwotna – uzyskiwana ze zmiażdżonych tkanek ludzkich i zwierzęcych poprzez traktowanie ich trypsyną lub innymi enzymami. Wytrzymują tylko 5-10 dywizji (pasaży).

2. przeszczepialne - komórki, które nabyły zdolność do nieograniczonej reprodukcji, ponieważ są pochodnymi nowotworów ludzkich i zwierzęcych.

3. Resplit do picia (diploidalny) - może wytrzymać do 100 pasaży, zachowując oryginalny diploidalny zestaw chromosomów.

Najczęstsze linie komórkowe

linia komórkowa	Wyjaśnienie skrótu	organizm	Włókienniczy	Morfologia	Notatki i linki
293-T		człowiek	nerka (zarodkowa)		Pochodzi z HEK-293 ECACC
Ogniwa 3T3	"Transfer 3-dniowy, inokulum 3 x 105 komórek"	mysz	zarodkowe fibroblasty		Znany również jako NIH 3T3 ECACC
721		człowiek	czerniak
9L		szczur	glejak
A2780		człowiek	jajnik	rak jajnika	ECACC
A2780ADR		człowiek	jajnik	Pochodna A2780 z opornością na adriamycynę	ECACC
A2780cis		człowiek	jajnik	oporna na cisplatynę pochodna A2780	ECACC
A172		człowiek	glejak	złośliwy glejak	ECACC
A431		człowiek	nabłonek skóry	rak kolczystokomórkowy	ECACCCell Line Data Base
A-549		człowiek	rak płuc	nabłonek	DSMZECACC
B35		szczur	nerwiak zarodkowy : neuroblastoma		ATCC
BCP-1		człowiek	leukocyty obwodowe	HIV + chłoniak	ATCC
BEAS-2B	nabłonek oskrzeli + adenowirus 12-SV40 hybryda wirusa (Ad12SV40)	człowiek	płuca	nabłonek	ATCC
zgięcie.3	śródbłonek mózgu	mysz	kora	śródbłonek	ATCC
BHK-21	„Nera chomika dziecka”	chomik	pączek	fibroblasty	ECACCOlympus
BR 293		człowiek	pierś	rak
BxPC3	Ksenograf z biopsji linii raka trzustki 3	człowiek	gruczolakorak trzustki	nabłonek	ATCC
C3H-10T1/2		mysz	embrionalne komórki mezenchymalne		ECACC
C6/36		komar	tkanka larwalna		ECACC
CHO	Jajnik chomika chińskiego	Cricetulus griseus	jajnik	nabłonek	ECACCICLC
COR-L23		człowiek	płuca		ECACC
COR-L23/CPR		człowiek	płuca		ECACC
COR-L23/5010		człowiek	płuca		ECACC
COR-L23/R23		człowiek	płuca	nabłonek	ECACC
COS-7	Cercopithecus aethiops, pochodzenie wadliwe SV-40	małpa Cercopithecus aethiops	pączek	fibroblasty	ECACCATCC
CML T1	Przewlekła białaczka szpikowa Limfocyt T 1	człowiek	przewlekła białaczka szpikowa	białaczka z komórek T	Krew
CMT	guz sutka u psa	pies	pierś	nabłonek
D17		pies	kostniakomięsak		ECACC
DH82		pies	histiocytoza	monocyty/makrofagi	ECACC
DU145		człowiek	rak	prostata
DuCaP	Dura mater Rak prostaty	człowiek		nabłonek	11317521
EL4		mysz		białaczka z komórek T	ECACC
EMT6/AR1		mysz	pierś	nabłonek	ECACC
EMT6/AR10.0		mysz	pierś	nabłonek	ECACC
FM3		człowiek	przerzuty do węzła chłonnego	czerniak
H1299		człowiek	płuca	rak
H69		człowiek	płuca		ECACC
HB54		hybrydoma	hybrydoma	wydziela mAb L243 (przeciwko HLA-DR)	Immunologia człowieka
HB55		hybrydoma	hybrydoma	wydziela mAb MA2.1 (przeciwko HLA-A2 i HLA-B17)	Czasopismo Immunologii
HCA2		człowiek	fibroblasty		Czasopismo Wirusologii Ogólnej
HEK-293	ludzka nerka zarodkowa	człowiek	nerka (zarodkowa)	nabłonek	ATCC
Hela	Henrietta Brakuje	człowiek	rak szyjki macicy	nabłonek	DSMZECACC
Hepa1c1c7	klon 7 klonu 1 linia wątrobiaka 1	mysz	wątrobiak	nabłonek	ECACC
HL-60	białaczka ludzka	człowiek	mieloblasty	krwinki	ECACCDSMZ
HMEC	ludzka komórka nabłonka sutka	człowiek		nabłonek	ECACC
HT-29		człowiek	nabłonek okrężnicy	rak gruczołowy	ECACC Baza danych linii komórkowej
Jurkat		człowiek	białaczka z komórek T	białe krwinki	ECACC
JY		człowiek	limfoblasty	komórki B, unieśmiertelnienie EBV
K562		człowiek	limfoblasty		ECACC
Ku812		człowiek	limfoblasty	erytroleukemia	ECACC
KCL22		człowiek	limfoblasty	przewlekła białaczka szpikowa
KYO1	Kioto 1	człowiek	limfoblasty	przewlekła białaczka szpikowa	DSMZ
LNCap	Rak węzła chłonnego prostaty	człowiek	gruczolakorak prostaty	nabłonek	ECACCATCC
Ma-Mel 1, 2, 3….48		człowiek		linie komórkowe czerniaka
MC-38		mysz		rak gruczołowy
MCF-7	Michigan Cancer Foundation-7	człowiek	pierś	inwazyjny rak przewodowy piersi	ER+, PR+
MCF-10A	Michigan Cancer Foundation	człowiek	pierś	nabłonek	ATCC
MDA-MB-231		człowiek	pierś	rak	ECACC
MDA-MB-468	Piersi MD Anderson z przerzutami	człowiek	pierś	rak	ECACC
MDA-MB-435	Piersi MD Anderson z przerzutami	człowiek	pierś	czerniak lub rak (brak konsensusu)	Cambridge Patologia ECACC
MDCK II	Nerka psa Madin Darby	pies	pączek	nabłonek	ECACC ATCC
MOR/0,2R		człowiek	płuca		ECACC
NCI-H69/CPR		człowiek	płuca		ECACC
NCI-H69 / LX10		człowiek	płuca		ECACC
NCI-H69 / LX20		człowiek	płuca		ECACC
NCI-H69/LX4		człowiek	płuca		ECACC
NIH-3T3	National Institutes of Health, transfer 3-dniowy, inokulum 3 x 10 maj komórek	mysz	zarodek	fibroblasty	ECACCATCC
NALM-1			krew obwodowa	przewlekła białaczka szpikowa	Genetyka raka i cytogenetyka
NW-145				czerniak	ESTDAB
OPCN/OPCT	Onyvax Rak Prostaty….			linie komórkowe raka prostaty	Asteranda
rówieśnik		człowiek	białaczka z komórek T		DSMZ
PNT-1A / PNT 2				linie komórkowe raka prostaty	ECACC
RenCa	Rak nerki	mysz		rak nerki
RIN-5F		mysz	trzustka
RMA/RMAS		mysz		Rak komórek T
Saos-2		człowiek		kostniakomięsak	ECACC
Sf-9	Spodoptera frugiperda	motyl Spodoptera frugiperda	jajnik		DSMZECACC
SkBr3		człowiek		rak piersi
T2		człowiek		Hybrydoma limfocytów B i białaczka z limfocytów T	DSMZ
T-47D		człowiek	pierś	rak przewodowy
T84		człowiek	rak okrężnicy/przerzuty do płuc	nabłonek	ECACCATCC
THP1		człowiek	monocyty	ostra białaczka szpikowa	ECACC
U373		człowiek	glejak-gwiaździak	nabłonek
U87		człowiek	glejak-gwiaździak	nabłonek	Abcam
U937		człowiek	białaczkowy chłoniak monocytowy		ECACC
VCaP	Rak prostaty kręgów	człowiek	przerzutowy rak prostaty	nabłonek	ECACC ATCC
Vero	„Vera Reno” / „Vero” („prawda”)	afrykańska zielona małpa	nabłonek nerkowy		ECACC
WM39		człowiek	Skórzany	czerniak pierwotny
WT-49		człowiek	limfoblasty
X63		mysz	czerniak
YAC-1		mysz	chłoniak		Baza danych linii komórkowej ECACC
YAR		człowiek	Limfocyty B	przekształcony EBV	Immunologia człowieka

Wysyłanie dobrej pracy do bazy wiedzy jest proste. Skorzystaj z poniższego formularza

Studenci, doktoranci, młodzi naukowcy, którzy wykorzystują bazę wiedzy w swoich studiach i pracy będą Ci bardzo wdzięczni.

Wysłany dnia http://www.allbest.ru/

kultura wirusa komórkowego

Wstęp

1. Rodzaje kultur komórkowych

2. Pożywki

4.1 Wykrywanie wirusów

Bibliografia

Wstęp

Do ilościowej akumulacji wirusów najdogodniejszym systemem są hodowle komórkowe. Pierwsze próby hodowli komórek zwierzęcych poza ciałem datuje się na koniec ubiegłego wieku. Te fragmentaryczne obserwacje wskazywały na możliwość zachowania żywotności tkanek i komórek w sztucznych warunkach i wyznaczały początek głębokich badań naukowych nad kulturami tkankowymi.

Ogromną zasługę w opracowaniu metod hodowli tkanek ma Carrel, który jako pierwszy dowiódł możliwości reprodukcji komórek zwierzęcych w sztucznych warunkach i tym samym wykazał ich „nieśmiertelność” i podobieństwo do jednokomórkowych organizmów wolno żyjących. Znaczący postęp w tym kierunku poczyniła grupa badaczy kierowana przez Earla. Jako pierwsi uzyskali wzrost dużej liczby komórek na szkle iw płynnej zawiesinie mieszanej. Pojawienie się antybiotyków i postępy w sztucznych podłożach hodowlanych zapoczątkowały nową erę w rozwoju technik hodowli tkankowych.

Kultury tkankowe są od dawna wykorzystywane do rozwiązywania różnych problemów w biologii i medycynie. Jednak dopiero sukcesy w dziedzinie wirusologii osiągnięte przy pomocy kultur tkankowych były potężnym bodźcem do ich rozwoju do obecnego poziomu.

Hodowla wirusów pomaga rozwiązać szereg problemów teoretycznych związanych z badaniem cech interakcji „wirus-komórka”. Ponadto rozwiązanie szeregu stosowanych problemów związanych z diagnostyką i produkcją leków do zapobiegania infekcjom wirusowym jest niemożliwe bez akumulacji surowców zawierających wirusy.

1. Rodzaje kultur komórkowych

Przeniesienie komórek całego organizmu do warunków życia in vitro przestaje istnieć jako jeden z licznych elementów strukturalnych tkanki lub narządu, w którym były wcześniej zawarte. Jednocześnie komórki wymykają się spod kontroli czynników neurohumoralnych i nabierają szeregu cech, które zależą zarówno od samego faktu odrzucenia komórek z tych tkanek, jak i od specyficznych warunków ich istnienia in vitro.

Komórki lub tkanki żyjące poza ciałem charakteryzują się całym kompleksem cech metabolicznych, morfologicznych i genetycznych, które znacznie różnią się od właściwości komórek narządów i tkanek in vivo.

W zależności od metody pierwotnej eksplantacji tkanki i techniki jej hodowli wyróżnia się kilka typów przeżywających i rosnących kultur tkankowych i komórkowych. Najszerzej stosowane są jednowarstwowe i zawiesinowe hodowle komórek rosnących. Stanowią podstawę nowoczesnej laboratoryjnej i przemysłowej praktyki wirusologicznej.

Istnieją dwa główne typy jednowarstwowych kultur komórkowych: pierwotne i przeszczepione.

Termin „pierwotny” odnosi się do hodowli komórkowej uzyskanej bezpośrednio z tkanek ludzkich lub zwierzęcych w okresie embrionalnym lub pourodzeniowym. Żywotność takich upraw jest ograniczona. Po pewnym czasie pojawiają się w nich zjawiska niespecyficznej degeneracji, która wyraża się ziarninowaniem i wakuolizacją cytoplazmy, zaokrąglaniem komórek, utratą komunikacji między komórkami a stałym podłożem, na którym je hodowano. Okresowa zmiana pożywki, zmiany składu tej ostatniej i inne procedury mogą tylko nieznacznie wydłużyć żywotność pierwotnej hodowli komórkowej, ale nie mogą zapobiec jej ostatecznemu zniszczeniu i śmierci. Najprawdopodobniej proces ten jest związany z naturalnym wygaszeniem aktywności metabolicznej komórek, które pozostają poza kontrolą czynników neurohumoralnych działających w całym organizmie.

Tylko pojedyncze komórki lub grupy komórek w populacji na tle degeneracji większości warstwy komórkowej mogą zachować zdolność do wzrostu i reprodukcji. Komórki te, po odkryciu siły nieskończonego rozmnażania in vitro, dają początek kulturom przeszczepionych komórek po wielokrotnych inokulacjach.

Istnieją linie i szczepy przeszczepionych komórek. Pierwszy termin odnosi się do komórek przeszczepialnych charakteryzujących się potencjalną nieśmiertelnością i z reguły heteroploidalnym kariotypem, drugi termin odnosi się do komórek półprzeszczepialnych z diploidalnym zestawem chromosomów i ograniczoną żywotnością in vitro. Pojawienie się zarówno tych, jak i innych komórek jest związane z procesem selekcji w populacji komórek kultur pierwotnych, które są zatem źródłem wszystkich linii i szczepów przeszczepianych komórek.

Główną zaletą przeszczepialnych linii komórkowych, w porównaniu z jakąkolwiek pierwotną hodowlą, jest możliwość nieograniczonego rozmnażania poza organizmem oraz względna autonomia, która zbliża je do bakterii i jednokomórkowych pierwotniaków.

Zdolność przeszczepionych komórek do nieskończonej reprodukcji in vitro oznacza skok jakościowy, w wyniku którego komórki uzyskują zdolność do autonomicznego istnienia, podobnie jak mikroorganizmy hodowane na sztucznych pożywkach. Całość zmian prowadzących do pojawienia się takich cech w komórkach nazywamy transformacją, a komórki przeszczepionych kultur tkankowych nazywamy transformacją.

Udoskonalenia technik hodowli komórek znacznie rozszerzyły możliwości otrzymywania przeszczepialnych linii komórkowych z szerokiej gamy tkanek zwierzęcych i ludzkich. Jednocześnie nie stwierdzono granicy wieku, powyżej której tkanki traciłyby zdolność przystosowania się do nieograniczonego wzrostu in vitro, tj. do transformacji.

Innym źródłem przeszczepionych linii komórkowych są nowotwory złośliwe. W tym przypadku transformacja komórkowa zachodzi in vivo w wyniku rozwoju procesu patologicznego, którego etiologia pozostaje w dużej mierze niejasna.

Nie wszystkie nowotwory złośliwe są zdolne do wytworzenia przeszczepialnych kultur komórkowych. Tak więc na przykład podjęto nieudane próby uzyskania przeszczepianych komórek z guzów nowotworowych ludzkiego żołądka i gruczołów sutkowych. Komórki raka płaskonabłonkowego skóry i błon śluzowych in vitro są trudne do przystosowania do życia. Z drugiej strony linie stosunkowo łatwo wyprowadza się z tkanek mięsaków i nowotworów złośliwych układu nerwowego.

2. Pożywki

W każdej hodowli komórkowej występują fazy komórkowe i płynne. Faza ciekła zapewnia życiową aktywność komórek hodowlanych i jest pożywką o różnym składzie i właściwościach.

Wszystkie media zgodnie z ich przeznaczeniem dzielą się na wzrost i wsparcie. Skład pożywki hodowlanej powinien zawierać więcej składników odżywczych, aby zapewnić aktywne namnażanie komórek do postaci monowarstwy na powierzchni szkła lub odpowiednio wysokie stężenie elementów komórkowych w zawiesinie (przy otrzymywaniu kultur zawiesinowych). W rzeczywistości podłoża podtrzymujące powinny zapewniać przeżycie komórek jedynie w już utworzonej monowarstwie podczas reprodukcji czynników wirusowych w komórkach.

Media wzrostu i wsparcia są wieloskładnikowe. Mogą to być zarówno produkty naturalne (płyny owodniowe, surowice zwierzęce), jak i substraty uzyskane w wyniku częściowej obróbki produktów naturalnych (ekstrakty zarodkowe, hydrolizat laktoalbuminy, hemohydrolizat, aminopeptyd itp.), a także syntetyczne substancje chemicznie czyste (amino kwasy, witaminy, sole).

Jako przykład pożywki składającej się wyłącznie z naturalnych składników można wymienić pożywkę Buckleya, proponowaną do hodowli kultur komórkowych z nabłonka nerkowego małp. To podłoże zawiera płyn owodniowy bydlęcy (85%), surowicę końską (10%) i ekstrakt z płodu bydlęcego (5%).

Wszystkie produkty naturalne mają niski standard, ich stosowanie wiąże się z dużym niebezpieczeństwem skażenia kultur komórkowych mikrobiologicznym i wirusowym. W związku z tym są stopniowo zastępowane syntetycznymi standardowymi mieszaninami. Największe zastosowanie znajdują medium syntetyczne 199 i medium Needle. Szeroko stosowane są media zawierające ściśle określone ilości soli, aminokwasów i witamin.

Niezależnie od przeznaczenia, wszystkie podłoża do hodowli tkankowych są zaprojektowane z pewnego rodzaju zrównoważonym roztworem soli o odpowiedniej pojemności buforowej. Najczęściej są to rozwiązania Hanksa i Earla. Roztwory te są niezbędnym składnikiem każdej pożywki. Integralnym składnikiem większości pożywek wzrostowych jest surowica zwierzęca (cielęca, bydlęca, końska), bez której 5-10% nie występuje reprodukcja komórek i tworzenie monowarstw.

Włączenie surowicy jednocześnie zapobiega tworzeniu pożywek wzrostowych o precyzyjnym składzie chemicznym, które są bardzo ważne dla rozwoju badań podstawowych w fizjologii komórki, ponieważ wraz z surowicą (lub jej pochodnymi) wprowadzany jest cały kompleks niekontrolowanych czynników , które różnią się w zależności od serii serum.

W latach pięćdziesiątych Ewans i Waymouth zaproponowali bezsurowicze podłoża o dokładnym składzie chemicznym. Pożywki te nie dostarczyły jednak tych wskaźników aktywności proliferacyjnej komórek, które określają pożywki z dodatkiem surowic. W tym kontekście interesujące są prace Bircha i Pirta, którzy wykazali, że włączenie soli siarczanowych Fe, Zn, Cu, a także MnC1 2 ma decydujące znaczenie dla zapewnienia intensywnego wzrostu komórek w pożywkach bezsurowiczych.

Antybiotyki są dodawane do pożywki wzrostowej, a także do roztworu buforowego do płukania tkanek. Wprowadza się je do pożywki bezpośrednio przed użyciem w ilości 1 ml roztworu podstawowego antybiotyków na 500 ml pożywki.

Poniżej znajduje się skład i sposób przygotowania jednego z popularnych podłoży hodowlanych.

Środowa Igła

l-arginina - 17,4

l-cystyna - 4,8

l-histydyna - 3,1

l-izoleucyna - 26,2

l-leucia - 13,1

l-lizyna - 14,6

l-metionina - 7,5

1-fenyloalanina - 8,3

l-treonina - 11,9

l-tryptofan - 2,0

l-tyrozyna - 18,1

l-walina - 11,7

biotyna - 0,24

cholina - 0,12

chlorek choliny - 0,14

witamina B 12 (kwas pteroiloglutaminowy) - 0,44

nikotynamid - 0,12

kwas pantotenowy - 0,22

pantotenian wapnia - 0,48

pirydoksal (chlorowodorek pirydoksyny) - 0,20

chlorowodorek tiaminy - 0,34

ryboflawina - 0,04

chlorek sodu - 5850,0

chlorek potasu - 373,0

monopodstawiony fosforan sodu (NaH 2 PO 4. H 2 O) - 138,0

chlorek wapnia - 111,0

wodorowęglan sodu (NaHCO 3) - 1680,0

chlorek magnezu (MgCl 2,6H2O) - 102,0

glukoza - 900,0

l-glutamina - 146,2-292,3

penicylina - 50,0

streptomycyna - 50,0

czerwień fenolowa - 5,0

woda do 1000,0

Gotowanie.

Roztwór 1. W 500 ml wody podgrzanej do około 80 ° powyższe ilości aminokwasów rozpuszcza się mieszając, po czym dodaje się l-glutaminę i czerwień fenolową.

Roztwór 2. W 100,0 ml wody rozpuścić sole nieorganiczne z wyjątkiem wodorowęglanu sodu (NaHCO 3 ), wymieszać z poprzednim roztworem soli nieorganicznych oraz dodać biotynę i witaminę B 12 .

Roztwór 3. Wszystkie witaminy rozpuszcza się w 200,0 ml wody, z wyjątkiem biotyny i kwasu ptero-iloglutaminowego oraz antybiotyków - penicyliny i streptomycyny. Wszystkie roztwory sterylizuje się przez filtrację przez szklany filtr ssący (płyta szklana porowata, wielkość porów 0,7-1,5) lub przez płytki azbestowo-celulozowe Seitz po wstępnym przemyciu wodą, a następnie przygotowanym roztworem.

Wymieszać 500 ml roztworu 1 + 200 ml roztworu 2 + 200 ml roztworu 3 i rozcieńczyć do 1000,0 ml sterylną wodą. Możesz dodać 1 mg inozytolu na 1 litr.

3. Uzyskiwanie kultur komórkowych

3.1 Przygotowanie pierwotnych kultur komórkowych

Podstawowy - nazywany jest kulturą uzyskaną z tkanki i wyhodowaną in vitro przed rozpoczęciem subkultury, czyli przed pierwszym plonem. Hodowla pierwotna pozbawiona jest wielu komórek obecnych w oryginalnej tkance, ponieważ nie wszystkie komórki są w stanie przylgnąć do podłoża i przetrwać in vitro. W procesie hodowli komórek, hodowla jest stosunkowo uboga w niedzielące się lub wolno dzielące się komórki.

W pierwszym etapie uzyskania hodowli pierwotnej przeprowadza się sterylne usunięcie fragmentu tkanki, narządu zwierzęcego oraz jego mechaniczną lub enzymatyczną dezagregację. Tkankę kruszy się na kawałki o objętości do 1-3 mm, kawałki tkanki przemywa się z erytrocytów roztworem Hanka z antybiotykami. Trypsyna (0,25% surowa lub 0,01-0,05% oczyszczona) lub kolagenaza (200-2000 jednostek/ml, surowa) i inne enzymy proteolityczne są stosowane do dezagregacji tkanek. Ta metoda pozyskiwania hodowli zapewnia wysoką wydajność komórek.

Hodowle pierwotne można również uzyskać z 1 mm kawałków tkanki, które przywierają do powierzchni podłoża dzięki własnej przyczepności lub obecności nacięć na szalce lub przy użyciu skrzepu plazmowego. W takich przypadkach komórki wyrosną z fragmentów. Do pasażu można wykorzystać komórki migrujące z eksplantów. Fragmenty tkanek (eksplanty) są przenoszone na nowe płytki, migrujące komórki można usunąć przez subkulturę, mieszaninę wersenu i trypsyny, a pozostałe eksplanty utworzą nowe wyrostki.

Znane są takie pierwotne hodowle, jak hodowla fibroblastów zarodków kurzych, hodowla komórek nerek cielęcia i leukocyty.

3.2 Uzyskiwanie jednowarstwowych ciągłych hodowli komórkowych

Jak zauważono powyżej, jedną z metod otrzymywania przeszczepialnych linii komórkowych jest selekcja komórek o zwiększonej aktywności wzrostu i reprodukcji z populacji hodowli pierwotnych. Selekcję można przeprowadzić przez regularne zmienianie środowiska, płukanie monowarstwy pierwotnej trypsynizowanej hodowli komórkowej. W tym celu wybierane są materace z dobrze uformowaną monowarstwą komórkową (same materace muszą mieć płaskie dno i nie mogą mieć rys i plam na ścianach). Pożywkę przygotowaną do systematycznej zmiany rozlewa się do małych naczyń (aby wykluczyć skażenie bakteryjne) i przechowuje w t - 4°.

Pożywkę zmienia się regularnie, przynajmniej raz w tygodniu. W ciągu pierwszych 3 tygodni wymienia się 20-30% objętości pożywki, w ciągu następnych 3-4 tygodni 50-60%, później następuje całkowita wymiana pożywki. Świeże środowisko bezpośrednio przed pracą jest podgrzewane do t - 37 °.

Wraz ze zmianą pożywki komórki zmieniają swoją morfologię. Niektóre komórki są zaokrąglone i odpadają od szkła. Większość komórek kurczy się w kierunku środka, a monowarstwa nabiera gwiaździstego wyglądu. Same komórki są lekko wydłużone. Po 7-10 zmianach środowiska w materacach z reguły zaczynają pojawiać się nowe elementy komórkowe, które w różnych kulturach mają różną morfologię.

W hodowli komórek nerki zarodków kurzych zaokrąglone elementy komórkowe pojawiają się w centrum monowarstwy lub między jej skurczonymi obszarami, z których stopniowo tworzą się skupiska w postaci małych kolonii. W hodowli komórek nerki małpy pojawiają się pojedyncze formacje przypominające ziarna. Komórki ściśle przylegają do siebie, tworząc małe przezroczyste kolonie. Liczba takich komórek rośnie powoli, wielkość kolonii również prawie się nie zwiększa. Kolonie pojawiają się nie tylko na spodzie materaca, ale także na bocznych powierzchniach, na granicy pożywki. Dlatego warunkiem wymiany pożywki jest utrzymanie jej stałej objętości. W hodowli ludzkich embrionalnych komórek nerkowych na tle masowej degeneracji monowarstwy zwężonej w nici ujawniają się duże wielokątne komórki z długimi procesami.

Nietypowe elementy komórkowe, które powstały w procesie selekcji, należy oddzielić od reszty monowarstwy i przenieść do oddzielnych probówek lub materacy. W tym celu można zastosować metodę wersenizacji lub mechaniczne rozszczepienie nietypowych komórek za pomocą pętli bakteriologicznej lub szpatułki. Ta ostatnia metoda jest szczególnie potrzebna podczas pracy z hodowlą komórkową nerek małpy, gdzie kolonie nietypowych komórek są ściśle związane ze szkłem i same się od niego nie oddzielają.

Przy zmianie pożywki w przypadku pojawienia się nietypowych komórek zaleca się ostrożne usunięcie większości pożywki, a mniejszą częścią energicznie przepłukać monowarstwę i wlać tę pożywkę do probówek. W takim przypadku w pożywce mogą pojawić się komórki atypowe, które mają zdolność tworzenia kolonii odpowiednich do dalszych podhodowli.

Po przeniesieniu hodowli komórek atypowych do nowej szalki wskazane jest dalsze monitorowanie hodowli głównej, ponieważ proces hodowli nowej linii komórkowej jest bardzo skomplikowany, a nie zawsze wyselekcjonowane nietypowe elementy dają początek żywotnej linii przeszczepionych komórek . Konieczne jest, aby wszystkie prace nad uzyskaniem nowych linii komórkowych, które trwają wiele miesięcy, były prowadzone przy użyciu tych samych pożywek, surowic zwierzęcych i serii antybiotyków.

Znane są kultury pierwotne, takie jak hodowla komórek nerki złotego chomika (BHK), hodowla komórek nerki koziorożca syberyjskiego (PSGC), hodowla komórek nerki zielonej małpy (CV).

3.3 Hodowla komórek na rolkach

Do niedawna w wirusologii wykorzystywano hodowle tkankowe głównie w postaci jednowarstwowych kultur stacjonarnych. W wielu przypadkach ta metoda hodowli komórkowej jest niezbędna. Wieloletnie doświadczenie pokazuje, że przy stosowaniu jednowarstwowych kultur stacjonarnych napotyka się szereg trudności, związanych z ogromnymi nakładami czasu pracy i materiałów. Z tego punktu widzenia bardziej opłacalne są hodowle rolkowe, które są ekonomiczne, charakteryzują się optymalnym stosunkiem użytecznej powierzchni uprawy do objętości pożywki i otwierają korzystne możliwości akumulacji masy komórkowej.

Termin „hodowla rolkowa” odnosi się do metody hodowli, w której pojedyncza warstwa komórek jest umieszczona na całej cylindrycznej powierzchni poziomo obracających się naczyń i jest okresowo przemywana pożywką. Z pewnych powodów w pożywce hodowlanej można w niektórych przypadkach odważyć pewną liczbę komórek. W tej postaci hodowlę komórkową nazywa się zawieszaniem na rolkach. „Wydajność” hodowli komórkowej będzie tym większa, im większy obszar, z którego zbierane są komórki. Badacze zastosowali różne sposoby zwiększania powierzchni, na której komórki mogą się przyczepiać i namnażać. W tym celu zastosowano różne bazy o dużej powierzchni właściwej: twarde, gąbczaste, wykonane z wełny, kolagenu, na szklanych spiralach itp. Metody te nie były szeroko stosowane, ponieważ znacznie utrudniały manipulacje komórkami, ale powinno to należy zauważyć opisaną przez L.S. Ratnera i V.A. Krikun metodę wielopoziomowej uprawy. Komórki hodowano w 1,5, 10 i 15 litrowych butelkach w pełni wypełnionych owalnymi szklanymi probówkami równoległymi do podłużnej osi naczyń. W tym przypadku powierzchnia użytkowa wzrosła 20-krotnie w porównaniu ze stacjonarnymi hodowlami jednowarstwowymi w naczyniach o tej samej objętości. Uprawa odbywała się w 2 etapach. W pierwszym etapie butelki obracano wokół osi poziomej w celu równomiernego rozmieszczenia komórek. Następnie, gdy komórki przyczepiły się do szkła, hodowlę kontynuowano w pozycji stacjonarnej. Opisany system hodowli został z powodzeniem wykorzystany do hodowli FMDV.

Rotacja naczyń, w których namnażały się komórki, okazała się skuteczniejsza. Początkowo komórki hodowano w probówkach, ale wraz z rozwojem sprzętu technicznego zwiększyła się objętość naczyń hodowlanych, a naukowcy przeszli z hodowli komórek w probówkach obrotowych na obracające się butelki. Hodowle rolkowe zaczęto stosować zarówno do akumulacji komórek, jak i do namnażania wirusów.

Do uprawy na rolkach stosuje się specjalne urządzenia typu rack-and-tier do obracania butelek lub bębnów. Najczęściej do uprawy używa się butelek 0,5-3-litrowych. W warunkach produkcyjnych ich objętość może osiągnąć 20 litrów lub więcej. Aparaty do hodowli rolkowej są proste, niezawodne i łatwe w utrzymaniu. Ogromne znaczenie ma szybkość obrotu butelek. Nie powinna być zbyt wysoka, aby nie zapobiegać przyczepianiu się komórek, ale też nie powinna być zbyt niska, gdyż przedłużająca się ekspozycja komórek na fazę gazową pogarsza ich warunki odżywienia. W pracach różnych autorów prędkość obrotu butelek wahała się od 8–12 obr./min do 1 obr./min. Najbardziej odpowiednia dla różnych hodowli komórkowych była prędkość rotacji fiolek w zakresie 0,5-1 obr./min. Zalecane w ciągu pierwszych 30 minut. po wysianiu komórek zapewnić wysoką prędkość obrotową fiolek (0,5–1,0 obr./min) w celu równomiernego rozprowadzenia materiałów, a następnie przenieś je na niską prędkość obrotową (20–30 obr./min).

Stężenie nasion w 1 ml pożywki wynosi 60-80 tys. dla komórek SPEV, VNK-21, HeLa, L, 100-200 tys. dla komórek diploidalnych i 200-300 tys. wynosić 1/10, 1/20 objętości butelki typu roller. Metoda uprawy rolkowej pozwala na uzyskanie większej liczby komórek. Tak więc z fiolki o pojemności 3 l można uzyskać 8-krotny plon komórek HeLa, VNK-21 - 9-krotnie, AO - 11-krotnie większy niż z jednowarstwowej stacjonarnej hodowli fiolki z pojemność 1 l. Wielokrotność oszczędności pożywki przy użyciu 3-litrowych fiolek wynosi 2,8 dla komórek HeLa; VNK-21 - 5,0, AO - 4,0. Zdolność do wzrostu i rozmnażania w warunkach wałkowych posiadają subkultury, kultury przeszczepione, rzadziej pierwotne i diploidalne szczepy komórkowe. Dla lepszego rozmnażania komórek w urządzeniach rolkowych konieczne jest przystosowanie ich do nowych warunków hodowli. Metoda hodowli rolkowej pozwala na uzyskanie dużej liczby komórek. Zaletą hodowli na rolkach w porównaniu z tradycyjnymi hodowlami stacjonarnymi jest w szczególności bardziej ekonomiczne wykorzystanie pożywek i wyższa wydajność antygenu wirusowego (o 1-2 lg).

3.4 Zawiesinowa hodowla komórek

W 1953 Owens i współpracownicy po raz pierwszy zademonstrowali zdolność komórek do namnażania się w płynnej pożywce w stanie swobodnie zawieszonym. Od tego czasu metoda hodowli zawiesinowej przyciągnęła uwagę badaczy ze względu na wysoką skuteczność w akumulacji dużej ilości komórek. Okazało się, że komórki z przeszczepionych linii, w przeciwieństwie do innych typów kultur komórkowych, mogą być hodowane przez długi czas w stanie zawieszonym. Komórki w tych warunkach namnażają się bez przyczepiania się do ścian naczynia hodowlanego, będąc w stanie zawiesiny, dzięki ciągłemu mieszaniu pożywki. W optymalnym reżimie wzrostu komórki w zawiesinach szybko się namnażają i mają wyższą „wydajność” niż w hodowlach stacjonarnych. Pierwotne i ciągłe linie komórkowe mają różną zdolność wzrostu w zawiesinie. Zatem linie trwałe heteroploidalne i aneuploidalne, w przeciwieństwie do linii pseudodiploidalnych, szybciej przystosowują się do wzrostu w zawiesinie.

Kultury zawiesinowe są przygotowywane z kultur jednowarstwowych. Komórki odrywa się od szkła roztworami wersenu i trypsyny. Osad komórek po odwirowaniu (1000 obr./min) ponownie zawiesza się w świeżej pożywce. Przygotowaną zawiesinę umieszcza się w naczyniach hodowlanych (reaktorach, fermentorach) i hoduje z ciągłym mieszaniem. W badaniach naukowych stężenie komórek w początkowej zawiesinie waha się od 0,3 do 10x10 na 1 ml. Optymalne stężenie komórek w początkowej zawiesinie powinno wynosić 2-5x10 na 1 ml. Według Earle'a i jego współpracowników stężenie komórek w zawieszonej hodowli powinno być takie, aby logarytmiczna faza wzrostu wystąpiła nie później niż 16-24 godziny po przygotowaniu hodowli. Hodowle komórkowe w zawiesinie przechodzą przez charakterystyczne etapy: fazę zastoju, logarytmiczną fazę wzrostu, fazę stacjonarną i logarytmiczną fazę śmierci. W pierwszym etapie z reguły zmniejsza się liczba komórek, w drugim następuje wzrost populacji komórek (faza wzrostu logarytmicznego), w trzecim etapie nie obserwuje się wzrostu liczby komórek (faza stacjonarna). Jeśli hodowla jest kontynuowana dalej, wówczas stwierdza się okres spadku liczby komórek - fazę śmierci logarytmicznej (faza destrukcji). Szybkość reprodukcji komórek w logarytmicznej fazie wzrostu wyraża się czasem generacji. Czas generacji odnosi się do okresu wymaganego do podwojenia populacji komórek w hodowli. W hodowli w zawiesinie komórkowej ważnym warunkiem jest mieszanie płynu, które musi być ciągłe i na tyle intensywne, aby utrzymać komórki w zawiesinie, zapobiec ich osadzaniu się i przywieraniu do ścian naczynia, a jednocześnie nie powodować mechanicznego szkoda.

Mieszanie kultur zawiesinowych odbywa się za pomocą mieszadeł magnetycznych z łopatkami, a także okrągłych foteli bujanych. Obecnie szeroko stosowany jest obrót fiolek i butelek wokół osi podłużnej (15-40 obr./min). W mieszadłach magnetycznych prędkość obrotowa wynosi 100-200 obr./min. Szybkość mieszania zależy od objętości kultury; małe objętości hodowli wymagają niskiej prędkości, podczas gdy przy dużych objętościach należy ją zwiększyć. Silikonizacja jest przeprowadzana, aby zapobiec osadzaniu się komórek na wewnętrznej powierzchni naczynia. Powłoka silikonowa ze względu na swoją hydrofobowość zapobiega przyczepianiu się komórek do ścianek naczynia.

Wewnętrzne ścianki naczynia hodowlanego zwilża się 5% lub 10% roztworem silikonu, a po odparowaniu rozpuszczalnika (benzenu, acetonu) naczynia utrzymuje się w temperaturze 85°C i 200° (odpowiednio przez 30 i 60 minut). ). Po schłodzeniu naczynia napełnia się gorącą wodą podwójnie destylowaną i pozostawia na 2 godziny, następnie przemywa 3 razy wodą podwójnie destylowaną i suszy w 100°C. Naczynia sterylizuje się w piecu w 170°C przez 2 godziny.

Maksymalny wzrost komórek w zawiesinie obserwuje się przy pH 7,0-7,2. Pożywki stosowane do hodowli komórek w zawiesinie nie różnią się od pożywek stosowanych do hodowli linii komórkowych w hodowli jednowarstwowej. Najczęściej przy hodowli komórek w zawiesinach pożywkę Eagle'a przyjmuje się z podwójnym stężeniem aminokwasów i witamin.

Kultury zawiesinowe zużywają 2-7 razy więcej glukozy niż jednowarstwowe. W procesie konsumowania glukozy komórki uwalniają do środowiska toksyczny dla nich kwas mlekowy. Zużycie glukozy przez komórki i produkcja kwasu mlekowego przebiegają równolegle i są bezpośrednio zależne od gęstości populacji komórek. Przydatne okazało się dodanie insuliny do pożywki w ilości od 40 do 200 IU na 1 litr. Dodatek insuliny do pożywki zmienia stosunek ilości wchłoniętej glukozy do ilości uwolnionego kwasu mlekowego. W przypadku komórek L współczynnik ten można zmniejszyć z 74-81 do 37-38%.

Różne aminokwasy są zużywane z pożywki przez rosnące komórki w różnym tempie. Należy zauważyć, że regularne dodawanie argininy (20-40 mg/l) i zwiększanie ilości glutaminy do 450 mg/l sprzyjają wzrostowi kultur zawieszonych.

Dodatek inozytolu (0,4 mg/l) przyspiesza wzrost kultur ludzkich komórek owodniowych. Pożądane jest dodanie do pożywki katalazy (1 mg/l) i tyroksyny (12 mg/l).

Dużym zainteresowaniem cieszą się prace poświęcone otrzymywaniu zawieszonych kultur komórkowych na syntetycznym podłożu niezawierającym surowicy krwi. Podejmowane są próby zwiększenia lepkości pożywki kosztem składników bezbiałkowych. W tym celu stosuje się metylocelulozę i kwas hialuronowy.

Metyloceluloza w stężeniu 0,1-0,2% wykazuje maksymalne działanie ochronne na komórki zawieszone w pożywce. Ochronne działanie metylocelulozy polega na tym, że cząsteczki tworzą warstwę ochronną wokół komórki, zapobiegając uszkodzeniom komórek podczas mieszania podłoża. Bardzo ważnym wskaźnikiem stanu hodowli zawiesinowej jest ciśnienie cząstkowe tlenu w fazie ciekłej. Stężenie tlenu w fazie gazowej zależy od gęstości populacji komórek i często jest niższe od atmosferycznego. Brak tlenu prowadzi do pojawienia się granulacji cytoplazmy, komórki tracą swój regularny zaokrąglony kształt. Przy niewielkim nadmiarze tlenu komórki mają dobrze zdefiniowany, regularny, zaokrąglony kształt i stają się bardzo duże pod wpływem niszczącego działania nadmiaru tlenu. Optymalne stężenie tlenu dla różnych kultur komórkowych wynosi od 9 do 17% lub 293 mm Hg. filar. Przy stężeniach tlenu powyżej 20% wzrost komórek jest zahamowany. Tak więc przy stężeniu tlenu 24% namnażanie embrionalnych komórek nerki królika (linia ERK) zmniejszyło się o połowę, a przy 30% spadło do zera. Wzrost stężenia tlenu ma toksyczny wpływ na metabolizm komórkowy.

Zatem reprodukcja komórek w zawiesinie zależy od stężenia komórek w początkowej zawiesinie, napowietrzenia i pH pożywki, składu pożywki, sposobu mieszania, objętości zawiesiny i innych czynników.

Jednorodność zawiesiny, możliwość długotrwałego utrzymania komórek w logarytmicznej fazie wzrostu, perspektywy matematycznego modelowania procesów wzrostu komórek w zależności od wpływu czynników środowiskowych, wygoda wielokrotnych badań stanu fizjologicznego hodowla komórkowa w zawiesinie, wysoka skuteczność metody – to nie jest pełna lista zalet kultur zawiesinowych.

Hodowle zawiesinowe są szeroko stosowane w badaniach wirusologicznych i do akumulacji dużych ilości materiału zawierającego wirusy, w produkcji szczepionek i preparatów diagnostycznych.

3.5 Hodowla komórek na mikronośnikach

W 1967 Van Werel zaproponował metodę hodowli, która łączy elementy jednowarstwowego i zawiesinowego wzrostu komórek, którą nazwał metodą „mikronośnika”. Jego istota polega na tym, że komórki przyczepiają się i rozmnażają na powierzchni kulek polimerowych-cząstek „mikronośników” (MN), które zawarte są w zawiesinie za pomocą urządzenia mieszającego, takiego jak mieszadło. Na jednej cząstce MN o średnicy 160–230 mm zmieści się 350–630 (lub średnio 460) komórek. W jednym ml pożywki można zawiesić kilka tysięcy cząstek mikronośnika o łącznej powierzchni od kilku do 50 cm 2 /ml.

Komórki zaszczepione w kultywatorze przyczepiają się do powierzchni cząstek MN i mnożą się, tworząc ciągłą monowarstwę na każdej pojedynczej cząstce.

Główne zalety tej metody to:

1) tworzenie jednolitych warunków w całej objętości naczynia, co umożliwia skuteczną kontrolę niezbędnych parametrów (pH, p0 2 itp.); 2) uzyskanie dużej gęstości populacji komórek do 5-6 mln komórek na 1 ml; 3) hodowlę kilkuset miliardów komórek jednocześnie; 4) wprowadzenie stałej kontroli dynamiki wzrostu komórek; 5) zmniejszenie wzrostu zanieczyszczenia z powodu zmniejszenia operacji związanych z rozprężaniem naczynia hodowlanego; 6) znaczne oszczędności w pożywkach; 7) zdolność do utrzymywania wyhodowanych komórek bezpośrednio na cząsteczkach w niskich temperaturach; 8) zdolność do sztucznego tworzenia różnych stężeń MN z wyhodowanymi na nich komórkami; 9) możliwość przejścia hodowli bez użycia trypsyny poprzez dodanie świeżych porcji mikronośnika.

Mikronośniki muszą posiadać:

Mały ładunek dodatni w zakresie 1,5-1,8 MEKV/g. Ze względu na to, że większość komórek zwierzęcych ma ładunek słabo ujemny, łatwiej przywiążą się do takiego MN:

Gęstość 1,05-1,15 g/cm; wskazana gęstość jest optymalna dla utrzymania MN w zawiesinie;

Średnica cząstek wynosi od 100 do 250 mikronów, co zapewnia obszary do wzrostu kilkuset komórek;

Gładka powierzchnia;

Przezroczystość;

Brak toksyczności składników dla komórek;

Niewielka absorpcja składników pożywki;

Uniwersalność, dająca możliwość zastosowania ich do komórek pierwotnych, diploidalnych i heteroploidalnych. Nie bez znaczenia są właściwości MH, które pozwalają na ich wielokrotne stosowanie.

Przeprowadzono badania wielu preparatów ziarnistych o różnym charakterze chemicznym, m.in. z usieciowanego (PS) dekstranu, PS-agarozy, PS-poliwinylopirolidonu, poliakrylonitrytu, porowatego żelu krzemionkowego, polistyrenu, kapronu, nylonu i glinokrzemianu. aby używać ich jako mikronośników.

Odpowiednie są tylko niektóre z nich, głównie oparte na PS-dekstranie.

Kilka firm zagranicznych opracowało gotowe do użycia komercyjne preparaty mikronośników: Cytodex-1, 2, 3 (Francja, Szwecja), Superbit (USA, Anglia), Biosilon (Dania). Koszt tych leków jest dość wysoki, dlatego konieczne jest prowadzenie badań nad rozwojem i produkcją krajowych MN.

Hodowlę komórkową na mikronośnikach prowadzi się w konwencjonalnych fermentorach do hodowli zawiesinowych. Fermentor nie powinien mieć żadnych występów, kieszeni, aby zapobiec gromadzeniu się mikronośników w strefach zastoju. Dlatego rozsądne jest stosowanie fermentorów z okrągłym dnem i gładkimi ściankami. Wnętrze fermentora musi być silikonowane, aby zapobiec przywieraniu mikronośników do szkła lub stali nierdzewnej fermentora.

Standardowy sprzęt może być używany do kontrolowania warunków upraw, takich jak pH i O2. Szybkość mieszania zawiesiny z nośnikiem powinna wynosić 40-60 obr/min. Do hodowli na MH stosuje się różne typy komórek.

Stężenie Cytodexu może wahać się od 0,5 do 5 mg/ml. Jednak w produkcji szczepionek profilaktycznych zwykle stosuje się końcowe stężenie cytodeksu nieprzekraczające 1 mg/ml. Podwyższenie stężenia do 3 mg/ml i powyżej stwarza dodatkowe trudności związane z koniecznością perfuzji pożywki i jej częściową wymianą, co komplikuje proces technologiczny.

Stężenie inokulum komórek, a także warunki hodowli na MN w pierwszych godzinach, w dużej mierze determinują optymalne parametry proliferacji i maksymalnej akumulacji komórek. Wykazano, że inokulacja 10 komórek/ml ciągłej linii małpich nerek (Vero) i diploidalnych komórek ludzkich embrionalnych fibroblastów (MRC-5) w średniej objętości zredukowanej do 1/3 iz okresowo włączonym mieszadłem (30 obr./min) przez jedną minutę po każdej godzinie przez 4 godziny, a następnie dodanie pożywki do końcowej objętości prowadzi do wzrostu proliferacji komórek i ich liczby w porównaniu z kontrolą (pełna objętość pożywki w momencie sadzenie komórek i ciągła praca mieszadła od początku hodowli).

Pożywka jest ważna dla hodowli komórek na MN. Właściwy dobór pożywki pomoże również zoptymalizować proces proliferacji komórek i ich jakość. Niezbędny jest dobór pożywek do hodowli komórek na różnych typach MN. Wykazano, że przeszczepiona linia komórkowa nerek małpy (Vero) na cytodeksu daje najwyższy plon przy zastosowaniu pożywki Eagle DME (stężenie komórek sadzenia 105 ml), ale w porównaniu z pożywką BME i 199. Jeśli liczba komórek podczas sadzenia jest zmniejszona do 104, wtedy wyniki daje najlepsza pożywka 199. Wszystkie badane pożywki zawierały 10% surowicy płodowej.

3.6 Rosnące wirusy w kulturach komórkowych

Hodowle pierwotne, szczepy komórkowe i ustalone linie komórkowe są obecnie wykorzystywane do izolacji i namnażania wirusów zwierzęcych. Ogólnie rzecz biorąc, procedura jest taka sama dla wszystkich wirusów.

Pożywkę usuwa się z monowarstwy komórek i monowarstwę przemywa się zrównoważonymi buforowanymi roztworami soli (SBSR) lub solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) w celu usunięcia inhibitorów (przeciwciał), które mogą być obecne w pożywce. Cząstki wirusa są zawieszone w niewielkiej ilości SBSR lub PBS i adsorbowane przez komórki w ciągu 30-60 minut. Roztwory soli są następnie zastępowane świeżą pożywką.

Zakażenie hodowanych komórek wirusami powoduje charakterystyczne zmiany morfologiczne w komórkach. Ostateczne zwyrodnieniowe procesy komórkowe (efekt cytopatogenny, CPE) wykrywa się dopiero po kilku tygodniach wzrostu w obecności wirusów, ale w niektórych przypadkach CPE wykrywa się po 12 h. Szczegóły zmian morfologicznych są różne w przypadku różnych wirusów.

Jeśli zamiast produktywnej infekcji wirus powoduje transformację komórkową, towarzyszą temu również charakterystyczne zmiany w morfologii i cechach wzrostu komórek.

4. Środki ostrożności podczas obchodzenia się z komórkami zakażonymi wirusem

Wirusy mają działanie cytopatogenne i służą jako czynniki etiologiczne w wielu chorobach ludzi i zwierząt. Ponadto wiele wirusów (np. onkornawirusy, herpeswirus typu II, adenowirusy, wirus polioma i SV40) wydaje się być czynnikami wywołującymi nowotwory u zwierząt. Ze względu na zdolność wirusów do przechodzenia przez filtry bakteryjne, może być trudne wykluczenie wirusów z niezainfekowanych hodowli komórkowych w obecności zawiesiny wirusów, gdzie możliwe jest przeniesienie wirusa przez powietrze w pomieszczeniu hodowlanym.

Poniższe środki ostrożności mają charakter ogólny i mają zastosowanie tylko wtedy, gdy wirusy nie stanowią szczególnego zagrożenia. W przypadku stosowania wysoce niebezpiecznych wirusów, które stanowią zagrożenie dla zdrowia personelu laboratorium lub ludzi i zwierząt w otaczającym świecie, należy podjąć dodatkowe środki ostrożności. Wirusy o szczególnym znaczeniu obejmują wirusy choroby Newcastle, wirusy pryszczycy, wirusy pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej, wirusy ospy, wirusy wścieklizny, wirusy opryszczki typu B i tak dalej. Ponadto nie można mieć pewności, że nawet wirusy takie jak SV40 nie stanowią zagrożenia dla ludzi.

Do infekowania komórek i hodowli komórek zakażonych wirusem należy użyć specjalnego pomieszczenia lub grupy pomieszczeń.

Żadne żywe wirusy nie powinny być usuwane z tych pomieszczeń, chyba że są umieszczone w szczelnie zamkniętych pojemnikach. Należy podjąć środki ostrożności, aby zewnętrzne powierzchnie tych pojemników nie były zanieczyszczone cząsteczkami wirusa.

Podczas pracy z wirusami należy nosić specjalną odzież ochronną (fartuch laboratoryjny). Po pracy ubrania te należy umieścić w specjalnym zbiorniku do autoklawowania.

Wszystkie media i naczynia szklane, które miały kontakt z wirusami, należy traktować chlorami; dopiero potem można je wyjąć z pomieszczenia przeznaczonego do pracy z wirusami.

Wszystkie przybory z tworzywa sztucznego należy umieścić w specjalnym zbiorniku do autoklawowania.

Sprzęt do przechowywania i manipulowania materiałem wirusowym powinien znajdować się na terenie zakładu obróbki wirusów.

Laboratorium powinno być wyposażone w autoklawy dwucyklowe, aby personel laboratorium był chroniony przed szkodliwymi materiałami.

4.1 Wykrywanie wirusów

Wirusy można wykrywać i określać ilościowo za pomocą wielu różnych testów, takich jak:

1) Aktywność wirusową mierzy się określając ilość materiału zawierającego wirusa wymaganego do wywołania specyficznej odpowiedzi u gospodarza. Odpowiedź indukowana przez wirusa może być typu „wszystko albo nic” (tj. obecność lub brak infekcji) lub można ją określić ilościowo, taką jak czas potrzebny do pojawienia się infekcji lub liczba zmian w podatnej komórce warstwa. Ilościowe określenie aktywności wirusa nazywa się miareczkowaniem.

Najmniejsza ilość wirusa, która może wywołać odpowiednią reakcję, nazywana jest jednostką zakaźną, a miano początkowej zawiesiny wirusa wyraża się liczbą jednostek zakaźnych na jednostkę objętości. Na przykład, jeśli minimalna ilość zawiesiny wirusa grypy, która powoduje zapalenie płuc u myszy po donosowym wstrzyknięciu zawiesiny zakażonej tkanki płucnej w rozcieńczeniu 1:106 wynosi 0,1 ml, oznacza to, że miano wirusa grypy w początkowa zawiesina tkanki płucnej wynosi 107 jednostek zakaźnych na 1ml-1/(10~1-10-6)=107.

Z reguły obowiązkowym elementem metody miareczkowania wirusa jest test, który pozwala ocenić wynik inokulacji jako pozytywny lub negatywny. Na przykład podczas miareczkowania wirusów zwierzęcych takim testem może być obecność lub brak widocznych zmian w hodowli komórkowej, reakcja zapalna w miejscu wszczepienia wirusa do skóry lub rogówki, porażenie wynikające z wprowadzenia wirusa do mózg zwierzęcia itp. Czasami reprodukcję wirusa można wykryć nawet przy braku widocznej reakcji z organizmu gospodarza: na przykład zakażenie zarodków kurzych myksowirusami można wykryć przez pojawienie się hemaglutyniny w omoczni płyn.

Najlepsze wyniki uzyskuje się metodami miareczkowania, które polegają na zliczeniu liczby dyskretnych zmian chorobowych na określonym obszarze warstwy komórek zakażonych znaną ilością materiału zawierającego wirusa. W przypadkach, w których liczbę podatnych na wirusy i dostępnych komórek można uznać za praktycznie nieskończenie dużą, jak na przykład, gdy jednowarstwowa hodowla bakterii na agarze odżywczym jest zainfekowana fagiem lub gdy ciągła jednowarstwowa hodowla komórek zwierzęcych jest zainfekowana wirus, uszkodzenia spowodowane przez wirusa lub fagi utworzone przez łysinki, w tym sensie są podobne do kolonii bakteryjnych na gęstym podłożu odżywczym. Tak jak liczba tych kolonii jest proporcjonalna do liczby komórek bakteryjnych zawartych w preparacie do miareczkowania, tak liczba łysinek jest wprost proporcjonalna do ilości wirusa dodanego do hodowli jednowarstwowej, tworzenie cząstek wirusa przez zakażone komórki, które można zidentyfikować na przykład na podstawie charakteru kwasów nukleinowych i symetrii cząstek.

2) Wytwarzanie kwasów nukleinowych przez zakażone komórki, które mogą mieć charakterystyczną gęstość za pomocą wirowania w gradiencie gęstości lub charakterystyczną wielkość za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym lub wirowania w gradiencie stężenia sacharozy.

3) Tworzenie przez zakażone komórki lub transformowane komórki charakterystycznych antygenów, które można uwidocznić przez barwienie przeciwciałami specyficznymi dla fluorescencji lub powodować zmiany w błonie komórkowej prowadzące do adsorpcji hemu. W metodzie bezpośredniej przeciwciała wytworzone przeciwko antygenom wirusowym łączy się z fluorochromem i wykorzystuje do barwienia zakażonych komórek. Reakcja dodatnia (żółto-zielona w mikroskopie fluorescencyjnym) wskazuje na obecność antygenów wirusowych w komórkach. Metoda ta może zatem być stosowana do wykrywania transformacji komórkowej, gdy przeciwciała są generowane przeciwko, na przykład, wczesnym antygenom wirusa SV40, lub do wykrywania tworzenia dojrzałych wirusów, gdy przeciwciała są generowane przeciwko białkom kapsydu. W metodzie pośredniej przeciwciała nie są łączone z fluorochromem. Zamiast tego, po interakcji przeciwciał z antygenami w utrwalonych preparatach komórkowych, dodaje się do nich przeciwciała anty-gamma globuliny sprzężone z fluorochromem. Ta metoda jest bardziej czuła i pozwala uniknąć koniugacji każdego pojedynczego przeciwciała z barwnikiem fluorescencyjnym. Tak więc te same przeciwciała fluorescencyjne przeciwko przeciwciałom króliczym (uzyskane u owiec przeciwko gamma globulinom królika) można stosować do barwienia dowolnych przeciwciał wytworzonych u królików i oddziałujących z antygenami wirusowymi w komórkach zakażonych produkcyjnie lub transformowanych. Jeszcze bardziej pośrednią, ale znacznie czulszą metodą niewymagającą użycia mikroskopu fluorescencyjnego jest metoda peroksydazy-antyperoksydazy. Według tej metody przeciwciała królicze oddziałują z utrwalonymi antygenami komórkowymi, a następnie są opłaszczane kozim przeciwciałami przeciwko króliczym immunoglobulinom sprzężonym z kompleksami peroksydazy chrzanowej i króliczej antyperoksydazy. Następnie preparaty traktuje się diaminobenzydyną i nadtlenkiem wodoru; brązowy kolor wskazuje na obecność antygenów.

4) Obecność antygenów na cząsteczkach wirusa może prowadzić do reakcji hemaglutynacji, co pozwala na ocenę ilościową. Wiele wirusów ma antygeny, które mogą być adsorbowane na krwinkach czerwonych i powodować ich sklejanie. W przypadku interakcji dużej liczby cząstek wirusa i erytrocytów powstaje sieć komórek, a zawiesina ulega aglutynacji, tj. erytrocyty wytrącają się. Istnieje pewna swoistość polegająca na tym, że niektóre wirusy powodują aglutynację erytrocytów niektórych zwierząt, ale jeśli zostanie znaleziona aktywna kombinacja, hemaglutynacja staje się szybkim testem określającym miano wirusa. Krew pobiera się do heparynizowanej strzykawki i erytrocyty przemywa się trzykrotnie z ponownym wytrącaniem w 0,85% NaCl przy 200 g przez 10 minut. Ostateczny osad erytrocytów zawiesza się w 200-krotnej objętości 0,85% roztworu NaCl. Najwygodniejszym sposobem testowania hemaglutynacji są płytki do mikromiareczkowania. W serii dołków płytki do mikromiareczkowania dodać 25 µl 0,85% NaCl lub PBS; Do pierwszej studzienki dodaje się 25 µl zawiesiny wirusa i miesza się (rozcieńczenie 1:2). Następnie 25 µl przenosi się z pierwszego dołka do drugiego (rozcieńczenie 1:4) i tak dalej, aż do końcowego rozcieńczenia 1:2048. Następnie do każdego dołka dodaje się 25 µl zawiesiny erytrocytów, mieszaninę miesza się i pozostawia w 4°C, temperaturze pokojowej lub 37°C do wystąpienia hemaglutynacji (1-2 godziny). W studzienkach, w których wystąpiła aglutynacja, osad erytrocytów ma nieregularny kształt, a w studzienkach, w których nie wystąpiła hemaglutynacja, osad komórkowy tworzy zwartą kropkę na dnie studzienki. Rozcieńczenie w ostatnim dołku, w którym wystąpiła hemaglutynacja, jest uważane za miano i temu rozcieńczeniu przypisuje się wartość 1 jednostki hemaglutynacji (HAU). Poprzednie rozcieńczenie zawierało odpowiednio 2 HAU i tak dalej.

5) Tworzenie przez zakażone komórki charakterystycznych enzymów lub enzymów, które można łatwo odróżnić swoimi właściwościami od odpowiednich enzymów komórek gospodarza.

4.2 Hodowla pikornawirusów na przykładzie pozyskiwania wirusa polio typu 3 w hodowli komórkowej HeLa

Jako specyficzną technikę hodowli wirusów można przytoczyć metodę hodowli wirusa polio w ciągłych komórkach.

Wszystkie zabiegi przeprowadzane są w sterylnych warunkach.

Niektóre podlinie komórek HeLa (np. HeLa S3) mogą rosnąć w pożywkach o niskiej zawartości jonów wapnia (np. CaS2MEM). Aby infekcja była skuteczna, ważne jest, aby komórki dobrze rosły w jednorodnej zawiesinie. Komórki osadza się przez wirowanie z małą prędkością (15 min przy 900 g) i ponownie zawiesza w CaS2MEM do stężenia ~2. 10 7 komórek/ml (~1/20 pierwotnej objętości).

Wirus dodaje się do zawiesiny komórek w stężeniu 10-50 PFU na komórkę; inkubować na mieszadle magnetycznym przez 1 godzinę w 35°C.

Zawiesinę rozcieńcza się tym samym medium do stężenia 2. 106 komórek/ml i dodać 100 μCi [3H]-urydyny.

Zawiesinę komórek inkubuje się przez 8 godzin, po czym komórki osadza się przez wirowanie z małą prędkością (15 minut przy 900 g) i przemywa raz roztworem buforu fosforanowego (PBS) wolnym od jonów magnezu i wapnia.

Komórki ponownie zawiesza się w PBS (5-10 7 komórek/ml) i poddaje trzem cyklom zamrażania-rozmrażania.

Resztki komórek usuwa się przez odwirowanie.

Supernatant przechowuje się do dalszego oczyszczania.

Bibliografia

1. Adams R. Metody hodowli komórkowych dla biochemików. - M.: Mir, 1983, 263 s.

2. Wirusologia. Metody. / Wyd. B. Meikhi. - M.: Mir, 1988, 344 s.

3. Golubev D.B., Sominina A.A., Medvedeva M.N. Wytyczne dotyczące wykorzystania kultur komórkowych w wirusologii. - L .: Medycyna, 1976, 224 s.

4. Dyakonov L.P., Glukhov V.F., Pozdnyakov A.A., Denisenko G.F., Kalmykova T.P. Hodowla komórek i tkanek zwierząt. - Stawropol: Stawrop. Prawda, 1988, część 2, 91 s.

5. Komórka zwierzęca w hodowli pod. wyd. L.P. Dyakonova, V.I. Sitkowa. - M.: 2000.

6. Hodowla komórek zwierzęcych. Metody. / Wyd. R. Freshni. - M.: Mir, 1989, 333 s.

7. Przewodnik po wirusologii weterynaryjnej. / Wyd. V.N. Shurin. - M.: Kolos, 1965, 687 s.

8. Siergiejew V.A. Rozmnażanie i hodowla wirusów zwierzęcych. - M.: Kołos, 1976, 303 s.

9. Fenner F., McOslen B., Mims S., Sambrook J., White D. Biologia wirusów zwierzęcych. - M.: Mir, 1977, t. 1, 447 s.

Hostowane na Allbest.ru

...

Podobne dokumenty

Główne sposoby infekcji zarodków kurzych wirusem. Etapy pozyskiwania podhodowli: usunięcie warstwy komórkowej, separacja i wysiew komórek, metoda infekcji kultur komórkowych wirusem, rejestracja wyników. Półtrwałe kultury komórek ludzkich i zwierzęcych.

prezentacja, dodano 29.01.2015


Pożywki w mikrobiologii, ich klasyfikacja i odmiany, obszary i cechy zastosowania. Hodowla mikroorganizmów tlenowych i beztlenowych. Metody ilościowego rozliczania mikroorganizmów, podstawowe zasady i warunki przechowywania ich kultur.

streszczenie, dodane 25.03.2013


Flawany w roślinach wyższych: budowa, główni przedstawiciele, lokalizacja, rola funkcjonalna. Charakterystyka morfofizjologiczna i biochemiczna kultur komórkowych i kalusa roślin herbacianych. Oznaczanie zawartości flawan i proantocyjanidyn.

praca dyplomowa, dodana 02.02.2018


Rodzaje nośników do immobilizacji komórek i enzymów. Kultury immobilizowane i możliwość ich zastosowania w różnych gałęziach przemysłu. Rodzaje reaktorów wykorzystujących kultury immobilizowane. Zalety i wady stosowania kultur immobilizowanych.

praca semestralna, dodano 15.01.2012


Badanie procesu tworzenia sztucznych skojarzeń komórkowych, za pomocą których można prowadzić żywotną aktywność organizmów wiążących azot w komórkach i tkankach roślin uprawnych. Asocjacje typu endo- i egzosymbiotycznego. Cel tworzenia populacji.

prezentacja, dodana 18.03.2015


Wartość wilgotności środowiska w uprawie enzymów na podłożach sypkich. Wpływ stopnia napowietrzenia kultur mikroskopijnych grzybów. Wpływ składu podłoża i czasu hodowli na biosyntezę lipazy. Metody przetwarzania i uprawy zbóż.

prezentacja, dodana 19.03.2015


prezentacja, dodano 23.02.2014


Metody izolacji czystych kultur mikroalg i metody ich identyfikacji. Izolacja czystej kultury Euglena glacilis; rozważenie metod określania żywotności komórek. Zbadanie wpływu rozprzęgaczy oddychania i syntezy ATP na ruchliwość komórek.

praca dyplomowa, dodana 24.05.2012


Specyficzne czynniki odporności przeciwwirusowej i synteza przeciwciał na określony antygen. Komórki pamięci i wydawanie odpowiedzi immunologicznej w postaci biosyntezy przeciwciał. Rozprzestrzenianie się zakaźnego zapalenia oskrzeli ptaków i łuskowców. Hodowla wirusów w komórkach.

test, dodany 17.11.2010


Zastosowanie technologii komórkowych w hodowli roślin. Zastosowanie metod in vitro w hybrydyzacji odległej. Pracuje nad uprawą kalusa w celu uzyskania nowego materiału hodowlanego. Hybrydyzacja komórek somatycznych i jej główne wyniki.

1966).

Techniki hodowli komórkowych rozwinęły się znacząco w latach 40. i 50. w związku z badaniami w dziedzinie wirusologii. Hodowla wirusów w hodowlach komórkowych umożliwiła uzyskanie czystego materiału wirusowego do produkcji szczepionek. Szczepionka przeciw polio była jednym z pierwszych leków, które były produkowane masowo przy użyciu technologii hodowli komórkowej. W 1954 Enders, Weller i Robbins otrzymali Nagrodę Nobla „za odkrycie zdolności wirusa polio do wzrostu w kulturach różnych tkanek”. W 1952 roku opracowano dobrze znaną ludzką linię komórkową raka HeLa.

Podstawowe zasady uprawy[ | ]

Izolacja komórek[ | ]

Do hodowli poza ciałem żywe komórki można pozyskać na kilka sposobów. Komórki można izolować z krwi, ale w hodowli mogą rosnąć tylko leukocyty. Komórki jednojądrzaste można izolować z tkanek miękkich za pomocą enzymów, takich jak kolagenaza, trypsyna i pronaza, które degradują macierz zewnątrzkomórkową. Ponadto w pożywce można umieścić kawałki tkanek i materiałów.

Kultury komórek pobranych bezpośrednio z obiektu (ex vivo) nazywane są pierwotnymi. Większość komórek pierwotnych, z wyjątkiem komórek nowotworowych, ma ograniczoną żywotność. Po określonej liczbie podziałów komórki takie starzeją się i przestają się dzielić, chociaż nadal mogą pozostać żywotne.

Istnieją unieśmiertelnione („nieśmiertelne”) linie komórkowe, które mogą się rozmnażać w nieskończoność. W większości komórek nowotworowych zdolność ta jest wynikiem przypadkowej mutacji, ale w niektórych laboratoryjnych liniach komórkowych jest ona nabyta sztucznie, poprzez aktywację genu telomerazy.

Hodowlę komórkową[ | ]

Komórki hoduje się w specjalnej pożywce w stałej temperaturze. Do hodowli komórek roślinnych stosuje się zmienne oświetlenie, podczas gdy komórki ssaków zwykle wymagają również specjalnej atmosfery utrzymywanej w inkubatorze do hodowli komórkowych. Z reguły regulowane jest stężenie dwutlenku węgla i pary wodnej w powietrzu, ale czasem także tlenu. Pożywki dla różnych kultur komórkowych różnią się składem, stężeniem glukozy, składem czynników wzrostu itp. Czynniki wzrostu stosowane w pożywkach do hodowli komórek ssaków są najczęściej dodawane wraz z surowicą krwi. Jednym z czynników ryzyka w tym przypadku jest możliwość zakażenia hodowli komórkowej prionami lub wirusami. W uprawie jednym z ważnych zadań jest unikanie lub minimalizowanie stosowania skażonych składników. Jednak w praktyce nie zawsze jest to osiągane. Najlepszym, ale i najdroższym sposobem jest suplementacja oczyszczonymi czynnikami wzrostu zamiast serum.

Zanieczyszczenie krzyżowe linii komórkowych[ | ]

Pracując z kulturami komórkowymi, naukowcy mogą zmierzyć się z problemem zanieczyszczenia krzyżowego.

Cechy rosnących komórek[ | ]

Podczas wzrostu komórek, ze względu na ciągły podział, może wystąpić ich nadmiar w hodowli, a w efekcie pojawiają się następujące problemy:

Aby utrzymać normalne funkcjonowanie kultur komórkowych, a także zapobiegać negatywnym zjawiskom, okresowo przeprowadza się wymianę pożywki, starzenie się komórek i transfekcję. Aby uniknąć zanieczyszczenia kultur bakteriami, drożdżami lub innymi liniami komórkowymi, wszystkie manipulacje są zwykle przeprowadzane w warunkach aseptycznych w sterylnym pudełku. Do pożywki hodowlanej można dodać antybiotyki (penicylina, streptomycyna) i środki przeciwgrzybicze (amfoterycyna B) w celu zahamowania mikroflory.

Hodowla ludzkich komórek jest nieco sprzeczna z zasadami bioetyki, ponieważ komórki hodowane w izolacji mogą przeżyć organizm rodzicielski, a następnie wykorzystać je do przeprowadzenia eksperymentów lub opracowania nowych metod leczenia i czerpania z tego korzyści. Pierwsze orzeczenie sądu w tej dziedzinie zapadło w Sądzie Najwyższym Kalifornii w sprawie John Moore przeciwko University of California, zgodnie z którą pacjenci nie mają własności linii komórkowych pochodzących z narządów usuniętych za ich zgodą.

hybrydoma [ | ]

Wykorzystanie kultur komórkowych[ | ]

Hodowla komórek masowych jest podstawą przemysłowej produkcji szczepionek wirusowych i różnorodnych produktów biotechnologicznych.

Produkty biotechnologiczne[ | ]

Przemysłowa metoda z kultur komórkowych wytwarza produkty takie jak enzymy, syntetyczne hormony, przeciwciała monoklonalne, interleukiny, limfokiny, leki przeciwnowotworowe. Chociaż wiele prostych białek można stosunkowo łatwo uzyskać przy użyciu kultur bakteryjnych, bardziej złożone białka, takie jak glikoproteiny, można obecnie uzyskać tylko z komórek zwierzęcych. Jednym z tych ważnych białek jest hormon erytropoetyna. Koszt hodowli kultur komórek ssaków jest dość wysoki, dlatego obecnie prowadzone są badania nad możliwością wytwarzania złożonych białek w kulturach owadzich lub wyższych komórek roślinnych.

kultury tkankowe[ | ]

Hodowla komórkowa jest integralną częścią technologii hodowli tkankowej i inżynierii tkankowej, ponieważ określa podstawę hodowli komórek i utrzymywania ich w stanie żywym ex vivo.

Szczepionki [ | ]

Przy użyciu technik hodowli komórkowych produkowane są obecnie szczepionki przeciwko poliomyelitis, odrze, śwince, różyczce i ospie wietrznej. Ze względu na zagrożenie pandemią grypy H5N1 rząd Stanów Zjednoczonych finansuje obecnie badania nad szczepionką przeciwko ptasiej grypie przy użyciu kultur komórkowych.

Hodowle komórek innych niż ssaki[ | ]

Hodowle komórek roślinnych[ | ]

Hodowle komórek roślinnych są zwykle hodowane jako zawiesina w płynnej pożywce lub jako kultura kalusa na stałym podłożu odżywczym. Hodowla niezróżnicowanych komórek i kalusa wymaga utrzymania pewnej równowagi auksyn i cytokinin hormonów wzrostu roślin.

Kultury bakteryjne, drożdżowe[ | ]

Główny artykuł:

W celu hodowli niewielkiej liczby komórek bakteryjnych i drożdżowych, komórki umieszcza się na pożywce stałej na bazie żelatyny lub agaru. Do produkcji masowej stosuje się hodowlę w pożywkach płynnych (buliony).

kultury wirusów[ | ]

I. Kultury komórkowe

Najczęściej spotykane są jednowarstwowe hodowle komórkowe, które można podzielić na 1) pierwotne (głównie trypsynizowane), 2) półprzeszczepialne (diploidalne) i 3) przeszczepialne.

Początek dzieli się je na organizmy embrionalne, nowotworowe i pochodzące z organizmów dorosłych; przez morfogenezę- na fibroblasty, nabłonki itp.

Podstawowy kultury komórkowe to komórki dowolnej tkanki ludzkiej lub zwierzęcej, które mają zdolność wzrostu w postaci monowarstwy na plastikowej lub szklanej powierzchni pokrytej specjalną pożywką. Żywotność takich upraw jest ograniczona. W każdym przypadku uzyskuje się je z tkanki po mechanicznym rozdrobnieniu, obróbce enzymami proteolitycznymi i standaryzacji liczby komórek. Hodowle pierwotne pochodzące z nerek małpy, nerek ludzkich zarodków, owodni człowieka, zarodków kurzych są szeroko stosowane do izolacji i akumulacji wirusa, a także do produkcji szczepionek wirusowych.

półprzeszczepialne(lub diploidalny ) kultury komórkowe - komórki tego samego typu, zdolne do wytrzymania do 50-100 pasaży in vitro, przy zachowaniu oryginalnego diploidalnego zestawu chromosomów. Diploidalne szczepy ludzkich zarodkowych fibroblastów są wykorzystywane zarówno do diagnozowania infekcji wirusowych, jak i do produkcji szczepionek wirusowych.

przeszczepione linie komórkowe charakteryzują się potencjalną nieśmiertelnością i heteroploidalnym kariotypem.

Źródłem przeszczepianych linii są pierwotne hodowle komórkowe (na przykład SOC, PES, VNK-21 - z nerek jednodniowych chomików syryjskich; PMS - z nerek świnki morskiej itp.), których poszczególne komórki wykazują skłonność do niekończącego się rozmnażania in vitro. Zespół zmian prowadzących do pojawienia się takich cech z komórek nazywamy transformacją, a komórki przeszczepionych kultur tkankowych nazywamy transformowanymi.

Innym źródłem przeszczepionych linii komórkowych są nowotwory złośliwe. W tym przypadku transformacja komórek zachodzi in vivo. W praktyce wirusologicznej najczęściej wykorzystywane są następujące linie przeszczepionych komórek: HeLa – pozyskane z raka szyjki macicy; Ner-2 - z raka krtani; Detroit-6 - od przerzutów raka płuc do szpiku kostnego; RH - z ludzkiej nerki.

Do hodowli komórek potrzebne są pożywki, które zgodnie z przeznaczeniem dzielą się na wzrostowe i wspomagające. Skład pożywki wzrostowej powinien zawierać więcej składników odżywczych, aby zapewnić aktywne rozmnażanie komórek w celu utworzenia monowarstwy. Podłoża podtrzymujące powinny zapewniać przeżycie komórek tylko w już uformowanej monowarstwie podczas reprodukcji wirusów w komórce.

Powszechnie stosowane są standardowe nośniki syntetyczne, takie jak nośniki syntetyczne 199 i nośniki igłowe. Niezależnie od celu, wszystkie pożywki do hodowli komórkowych są projektowane na bazie zrównoważonego roztworu soli. Najczęściej jest to rozwiązanie Hanka. Integralnym składnikiem większości pożywek wzrostowych jest surowica krwi zwierząt (cielęca, byka, konia), bez której 5-10% nie występuje reprodukcja komórek i tworzenie się monowarstwy. Serum nie jest zawarte w mediach pielęgnacyjnych.

I. Kultury komórkowe - pojęcie i rodzaje. Klasyfikacja i cechy kategorii „I. Kultury komórkowe” 2017, 2018.

- III. Komunikacja radiowa

II. Łączność bezprzewodowa I. Łączność przewodowa Miejska łączność telefoniczna Bezpośrednia łączność telefoniczna (selektor) Łączność radiotelefoniczna („Ałtaj”) Łączność indukcyjna (komunikacja EKV „Diston”, „Nalmes”) Ø... .

- Zużycie materiałów na 1 km drogi o nawierzchni asfaltobetonowej typu IV

Tablica 15 Tablica 14 Tablica 13 Tablica 12 Tablica 11 Drogi Ruch oprocentowany składany w różnych latach eksploatacji Wartości współczynników m, K0, K0m przy rosnącym natężeniu Tablica... .

- III. Czas 90 minut.

Lekcja nr 5 Układ hamulcowy Temat nr 8 Mechanizmy sterujące Zgodnie z rozmieszczeniem sprzętu samochodowego Przeprowadzenie lekcji grupowej Plan - streszczenie ppłk Fedotov S.A. "____"... .

- Wyznaczenie Zmin i Xmin z warunku braku podcięcia

Rys.5.9. O wycinaniu zębów kół. Zastanówmy się, jak współczynnik ścinania zębatki x ma się do liczby zębów, które może przeciąć zębatka na kole. Niech szyna zostanie zamontowana w pozycji 1 (rys. 5.9.). W takim przypadku prosta głowa stojaka przekroczy linię zazębienia N-N w t. I ....

- Verbos que terminan en -it, -et

Los verbos nieregularne Idź - ir Jedz - comer Śpij - dormir Chce - querer Idę Śpij Śpij Chcesz ty Śpij Śpij Czy On, Ona Idź Śpij Śpij Śpij Śpij Śpij Śpij Śpij Śpij Śpij Śpij ... Śpij Śpij Śpij Śpij ...