Doktryna odporności. Fagocytoza w odpowiedzi immunologicznej organizmu

W literaturze opisano wiele metod ilościowego oznaczania fagocytozy. Objętość tej książki nie pozwala szczegółowo opisać ich wszystkich, więc ograniczymy się do opisu tylko kilku.

Materiały i ekwipunek

Aby pracować, musisz mieć:

Antykoagulant cytrynianowo-dekstrozowy: 8 g kwasu cytrynowego. 22 g trójpodstawionego cytrynianu sodu (dwuwodnego), 24,5 g glukozy rozpuszcza się w 1 litrze wody;

Roztwór dekstrozodekstranu: 4,5 g NaCl, 25 g glukozy, 30 g dekstranu (względna masa cząsteczkowa 500 000) w 1 l;

Roztwór chlorku amonu: 9 części 0,83% chlorku amonu, 1 część buforu Tris-HCl pH 7,2 (20,6 g/l);

Mieszanina ficoll - vizotrast: 9 g ficoll, 20 ml vizotrast, 100 ml bidestylowanej H 2 0, gęstość 1,077;

Substrat dla β-glukuronidazy: 31,5 mg p-nitrofenylo-β-glukuronidu i 100 μm Triton X 100 rozpuszcza się w 100 ml 0,05 M buforu octanu sodu pH 5;

Odczynniki na niedobór mieloperoksydazy: utrwalacz (10 ml 37% formaldehyd z 90 ml absolutnego etanolu), roztwór substratu (100 ml 30% EDTA, 0,3 g chlorku benzydyny, 0,038 g ZnSO 4x7H 2 0, 1 ml wody destylowanej, 1,0 g CH 3C00Nax3H2O, 0,7 ml 3% H2O2); doprowadzić pH 1,0 M NaOH do 6,0.

Odczynniki handlowe:

FSB, roztwór Hanka i pożywka Eagle-MEM (Państwowy Instytut Preparatów Immunologicznych i Pożywek, Berlin-Weissensee, NRD);

Heparyna (5000 IU/mg) (Gedeon Richter, Węgry);

Można użyć surowicy zarodków bydlęcych (Flow Laboratories, USA, inna firma);

Visotrast (Lista VEB Fahlberg, Magdeburg, NRD);

Infucoll (VEB Serumwerk Bernburg, NRD);

Dextran, ficoll (Pharmacia, Szwecja);

Węgiel koloidalny Сl1/143a (Wagner, Pelikanwerke, Niemcy);

ftalan diizodecylu, paradioksan (Coleman, Matheson and Bell, USA);

Triton X 100 (Serva, Niemcy, możliwa inna firma);

Czerwień oleista O (Allied Chemical Corp., Morristown, NY, USA);

Iaranitrofenylo-β-glukuronid (Sigma, USA);

Safranin O (Fischer Scientific Lab., Chicago, USA);

Kulki, rurki z polistyrenu (Nunc, Dania);

Siatka F 905 (VEB Orvo Wolfen, NRD).

Pozyskiwanie fagocytów

Niezbędne informacje na temat izolacji ludzkich granulocytów można uzyskać w rozdziale „Oddzielanie komórek układu odpornościowego”; w celu uzyskania makrofagów otrzewnowych patrz rozdziały „Hodowla makrofagów i monocytów” i „Izolacja makrofagów z zawiesiny spleiocytów”. Kwestia ta została szczegółowo omówiona w wielu pracach.

Ponadto należy również wspomnieć o następujących metodach:

8 ml krwi miesza się z roztworem dekstranoglukozy. Następnie dodać 6% roztwór dekstranu 75 w 0,15 M NaCl (5 ml). Mieszaninę pozostawia się na 45-50 min w temperaturze pokojowej w celu sedymentacji erytrocytów. Zaaspirować plazmę. Resztkowe erytrocyty poddaje się lizie przez dodanie 0,83% chlorku amonu (35 ml do 15 ml osocza). Wirować przez 10 minut przy 80 g, zawiesić osad w 0,15 M NaCl schłodzonym do 0°C. Połącz kilka osadów i wiruj przez 10 minut przy 800 g. Komórki najlepiej przechowywać na lodzie w 0,15 M NaCl (to podłoże jest bardziej odpowiednie niż podłoże buforowane z dwuwartościowymi kationami, które powodują sklejanie się komórek);

Jeśli przedmiotem fagocytozy są drożdże, etap obróbki chlorkiem amonu można pominąć, ponieważ czerwone krwinki nie zakłócają procesu. Komórki jednojądrzaste można otrzymać w następujący sposób: krew heparynizowaną miesza się z 1/3 objętości pożywki Eagle'a zawierającej 15% glukozy, nakłada warstwę mieszaniny ficoll-visotrast i wiruje przez 20 minut przy 400 g. Frakcja komórek jednojądrzastych jest odsysana za pomocą pipety Pasteura, dwukrotnie przemywana PBS i przygotowywana jest zawiesina w pożywce Eagle'a (1x10 7 komórek/ml).

Przygotowanie cząstek do fagocytozy

Częściej stosowane są żywe kultury Staphylococcus aureus (SG 511 lub 502 A), Staphylococcus epididermidis SG 475, E. coli i innych enterobakterii, listerii, maczugowców, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae. Mikroorganizmy hoduje się przez 24 godziny (w razie potrzeby 48 godzin) na pożywkach stałych i płynnych. Zebraną biomasę przemywa się trzykrotnie 0,15 M NaCl. Za gęstą zawiesinę mierzy się przy 640 nm, stężenie określa się z krzywej kalibracyjnej.

Stężenie mikroorganizmów określa się również metodami przesiewania na gęstych pożywkach; w niektórych przypadkach zliczanie mikroorganizmów można prowadzić w komorach liczących.

Podczas pracy z żywymi kulturami bakterii należy zachować ostrożność, aby zawsze używać kultur na tym samym etapie. Dodatek 0,01% albuminy surowicy bydlęcej sprzyja przeżyciu mikroorganizmów. Przygotowana zawiesina pozostaje stabilna przez 1-2 godziny.

Zabite kultury mikroorganizmów uzyskuje się zwykle przez ogrzewanie przez 30 minut w temperaturze 80°C lub przez działanie przepływającą parą. Uśmiercone drobnoustroje przemywa się trzykrotnie 0,15 M NaCl, ponownie zawiesza i określa się stężenie zawiesiny.

Przygotowanie drożdży piekarskich: 0,5 g drożdży piekarskich zawiesza się w 0,15 M NaCl i umieszcza we wrzącej łaźni wodnej na 30 minut. Przefiltruj przez filtr z gazy bawełnianej. Przy użyciu żywych drożdży, świeże komórki (4-5 dniowa hodowla) przemywa się trzykrotnie pożywką Eagle'a z dodatkiem 1,0% glukozy. Zwykle stosuje się zawiesinę komórek 108 i 109 komórek/ml. Drożdże są używane jako cząstki testowe w wykrywaniu defektów składnika C5.

Stosowanie zawiesiny cząstek polistyrenu: Przygotować 10% wodną zawiesinę cząstek polistyrenu o średnicy 1,091 μm. Rozcieńcza się w stosunku 1 + 1 0,2% roztworem BSA w 0,15 M NaCl, odwirowuje. Przy długości fali 253 nm zawiesina polistyrenu 1 μg/ml daje absorpcję 1,17x10 -3 .

Zastosowanie zawiesiny lipopolisacharydu - czerwieni olejowej O w oleju mineralnym: 2 g czerwieni olejowej rozciera się w 50 ml ftalanu diizodecylu (lub oleju wazelinowego) w porcelanowym moździerzu. Wiruj przez 20 min przy 500 g. Dodać 10 μg frakcji supernatantu do 10 ml dioksyny, zmierzyć gęstość optyczną przy długości fali 525 nm. Współczynnik konwersji wynosi 0,92. W drugim etapie 40 mg lipopolisacharydu (E. coli 0,26 B6, itd.) rozpuszcza się w 3 ml 0,15 M NaCl. Następnie do tej mieszaniny dodaje się 1 ml roztworu czerwieni oleistej O w siarczanie diizodecylu i mieszaninę zawiesza się na 90 sekund. Zawiesinę stosuje się natychmiast i można ją zamrozić.

Aby wywołać reakcję fagocytozy, jako cząstki testowe można użyć sformalizowanych erytrocytów.

Fagocytoza bakterii, bakteriobójcza

Eksperyment z zawiesiną żywych bakterii: Zwykle stosuje się stosunek 3-10 drobnoustrojów/fagocyt. W całkowitej objętości 2 ml 1x106 fagocytów miesza się z 3x106 - 1x107 drobnoustrojów. W praktyce 1 ml zawiesiny bakteryjnej dodaje się do 1 ml zawiesiny fagocytów, do której dodano 8 IU heparyny. Czas interakcji wynosi zwykle 30 minut, w niektórych przypadkach jest dłuższy. Po inkubacji pobiera się 0,5 ml mieszaniny, dodaje 1,5 ml 0,1% roztworu żelatyny w roztworze Hanka, ochłodzonego do 0°C i odwirowuje przez 3-4 minuty przy 300 g. Z osadu przygotowuje się rozmazy, które są barwione według Pappenheima. Wyświetl 200 komórek (jeśli to możliwe trzy razy). Oblicz procent fagocytozy. W zależności od liczby bakterii zawartych w komórkach oblicza się wskaźnik aktywności fagocytozy: liczbę fagocytowanych bakterii mnoży się przez procent komórek fagocytujących; intensywność fagocytozy wyraża się liczbami od 1 do 4.

Stopień 1: fagocytoza z bakteriami I-4
Stopień 2: fagocytowane 5-7 bakterii
Stopień 3: fagocytowane 8-10 bakterii
Stopień 4: Więcej niż 10 bakterii na fagocytowaną komórkę

Przy określaniu poziomu fagocytozy żywych drobnoustrojów osobno sprawdza się osad komórkowy i frakcję supernatantu. Liczbę żywych drobnoustrojów określa się przesiewając na stałe pożywki 0,1 ml badanych frakcji. Inkubacja przez 24 (48) godzin Przy obliczaniu aktywności bakteriobójczej przyjmuje się, że jedna utworzona kolonia odpowiada jednemu żywemu drobnoustrojowi.

W celu ukierunkowanego badania działania bakteriobójczego krew pacjentów i zdrowych dawców bada się z dodatkiem roztworu antybiotyku (5000 jm penicyliny i streptomycyny / ml) i bez niego, a także przeprowadza się kontrolę bakterii. Skład próbki: 0,3 ml roztworu Hanka + 0,1 ml normalnej surowicy z krwi pobranej od 5 dawców + 0,5 ml zawiesiny leukocytów (10 7 komórek/ml) + 0,1 ml zawiesiny drobnoustrojów (106 drobnoustrojów/ml). Dodaje się roztwór antybiotyków w 0,02 ml na próbkę. Inkubować próbki w 37°C i określić liczbę drobnoustrojów po 20 minutach, 1,5 godziny i 3 godzinach. W tym celu z każdej próbki należy pobrać 0,1 ml, wybrane porcje rozcieńczyć roztworem Hanka 10, 100 i 1000 razy i nałożyć na podgrzany agar. Czasami, zwłaszcza jeśli dodano antybiotyki, przygotowuje się pośrednie rozcieńczenia w celu dokładnego zliczenia drobnoustrojów (na przykład 0,2 ml próbki miesza się z 5 ml roztworu Hanka, odwirowuje przez 5 minut przy 450 g, osad rozpuszcza się w 1,9 ml PBS nałożony na agar). Jeśli chcesz skrócić czas trwania badania bakteriologicznego, możesz określić drobnoustroje wewnątrz komórki za pomocą fluorescencji za pomocą barwienia żółcią akrydynową.

Fagocytoza drożdży piekarskich: przygotować zawiesinę 109 komórek/ml w 0,15 M NaCl. Zmieszać 0,1 ml zawiesiny z 0,1 ml osocza pacjenta, inkubować 30 minut w 37°C, dodać 0,2 ml (10 6) PMNL, inkubować 30 minut. Próbki pobiera się w odstępach od 5 do 30 minut. Zlicza się 100 PMN i określa liczbę wychwyconych cząstek drożdży na komórkę. Znana jest następująca modyfikacja: 50 µl badanej surowicy dodaje się do 50 µl surowicy świnki morskiej (uprzednio rozcieńcza się ją w stosunku 1 + 1 pożywką Eagle'a z glukozą), 50-200 µl zawiesiny leukocytów ( 107 komórek/ml), objętość doprowadzono do 450 µl pożywką Igła z glukozą i inkubowano przez 30 min w 37°C. Następnie dodać 50 μl zawiesiny drożdży (10 8 komórek/ml), wymieszać, inkubować przez 40 minut w 37 °C. Dodać 50 μl L-75 Se-metioniny (aktywność całkowita 100 kBq), wymieszać i inkubować przez 1 godzinę w 37 °C. Komórki wytrąca się przez wirowanie przez 5 minut przy 1000 g, przemywa dwukrotnie PBS, radioaktywność mierzy się licznikiem gamma. Procent fagocytowanych drożdży oblicza się według wzoru:

Fagocytoza przy użyciu roztworu czerwonego oleju w oleju mineralnym: 0,2 ml zawiesiny cząstek miesza się z 0,8 ml zawiesiny komórek wstępnie ogrzanej do 37°C. Po 5 minutach inkubacji dodaje się 6 ml 0,15 M roztworu NaCl ochłodzonego do 0°C zawierającego 126 μg/l N-etylomaleimidu (w celu zatrzymania wychwytywania cząstek). Wiruj przez 10 minut przy 250 g. Frakcję supernatantu odrzuca się, osad ponownie zawiesza się w roztworze NaCl i N-etylomaleimidu (patrz wyżej), komórki przemywa się dwukrotnie. Komórki są lizowane za pomocą ultradźwięków, uwalniany jest olejek czerwony. Dodaj 1 ml dioksanu. Odwirować przez 15 minut przy 500 g, zmierzyć gęstość optyczną przy długości fali 525 nm względem czystego dioksanu. Stopień fagocytozy (IF) definiuje się jako ilość oleju mineralnego (mg) wchłoniętego na minutę przez 107 komórek. Do obliczenia możesz użyć następującego wzoru:

Badanie fagocytozy w monowarstwie makrofagów:

1. Faza: 2 ml zawiesiny komórek (200 000 komórek/ml) dodaje się do sterylnych probówek polistyrenowych. Inokulować przez 5 godzin w 37°C, następnie przemyć pożywką Eagle'a. 2 ml pożywki hodowlanej z 10% inaktywowaną (30 min, 56°C) surowicą zarodków bydlęcych dodaje się do probówek testowych, inkubuje w 37°C.

2. Faza A: wprowadza się zawiesinę drobnoustrojów (3-10/makrofag), inkubuje przez 30-60 min w 37°C, probówki przepłukuje się 6 razy 3 ml porcjami pożywki w celu usunięcia niefagocytowanych drobnoustrojów. Natychmiast utrwalić mieszaniną 1 części lodowatego kwasu octowego i 3 części metanolu. Wybarwić preparat wg May - Griinwald, policzyć komórki.

Faza B: oznaczanie wewnątrzkomórkowych żywych bakterii. Kolejność operacji jest taka sama jak w fazie A przed etapem utrwalania. Po umyciu ostrożnie usuń wszelkie ślady pożywki. Komórki poddaje się lizie, do których dodaje się 2 ml 0,01% sterylnego roztworu albuminy surowicy bydlęcej (4°C), kilkakrotnie wstrząsając. Większość komórek ulega lizie po 20 minutach. Uwolnione bakterie są określane przez przesiewanie na gęstych pożywkach.

Fagocytoza erytrocytów: zmieszać 4x107 fagocytów z 5x107 testowych erytrocytów w 5 ml PBS. Przenieść 2 ml mieszaniny do 5 mM buforu fosforanowego ochłodzonego do 0°C i odwirować. Zmierzyć gęstość optyczną frakcji supernatantu przy długości fali 420 nm. Stopień fagocytozy określa spadek zawartości hemoglobiny w fazie bezkomórkowej za pomocą krzywych kalibracyjnych.

Uproszczona metoda określania luzu

Przykład określania klirensu u szczurów: zwierzętom wstrzykuje się dootrzewnowo 5x10 7 drobnoustrojów na 100 g wagi (0,1 ml//100 g). Optymalna dawka może wynosić od 106 do 108 na 100 g wagi. W odstępie 1-2 godzin ubija się 3 osobniki z każdej grupy zwierząt doświadczalnych; całkowity czas trwania eksperymentu 16 godzin. Sterylnie pobrać 0,5 ml krwi z serca, 1 ml płynu otrzewnowego, wydzielać płuca, wątrobę, śledzionę i nerki. Cylindry wycina się z tkanki organu za pomocą pipety Pasteura. Określ liczbę drobnoustrojów poprzez hodowlę na pożywkach płynnych i stałych.

Przykład oznaczenia klirensu u myszy: zastosowano węgiel koloidalny lub znakowane 51 [Cr] erytrocyty barana. Myszom (co najmniej 5 osobników na doświadczenie) wstrzykuje się dożylnie 0,01 ml zawiesiny węgla w ilości 16 mg na 100 g wagi. W ciągu 15 minut w odstępie 2 minut z przestrzeni zaoczodołowej pobiera się 0,025 ml krwi. Wybrane 0,025 ml krwi dodaje się do 2,0 ml 0,1% roztworu Na2CO3. Po hemolizie stężenie węgla określa się kolorymetrycznie przy długości fali 675 nm przy użyciu krzywych kalibracyjnych.

t to czas w minutach, C to stężenie węgla w próbce.

Skorygowana wartość fagocytozy:

Funkcjonalne badanie przesiewowe fagocytów

Oznaczenie degranulacji (pomiar aktywności (β-glukuropidaza): 107 leukocytów zawieszono w 0,8 ml PBS w plastikowych probówkach, wytrząsano przez 5 minut w 37 ° C. Dodać 0,2 ml uczulonego LPS, cząstki fluorochromowe (FC 80), ochłodzić 30 minut na lodzie, wirować przez 10 minut przy 250 g Sprawdzić aktywność enzymu we frakcji supernatantu Inkubować 0,9 ml mieszaniny substratów przez 18 godzin z 0,1 ml badanej frakcji Dodać 2 ml 0,1 M NaOH, zmierzyć gęstość optyczną na fali 410 nm.

Obliczenie:

(OD 410 x20)/(1,84x18) = liczba nmoli substancji uwolnionej w ciągu 1 godziny przez 107 leukocytów, czyli stopień degranulacji wyrażony w nanomolach paranitrofenylo-β-glukuronidu.

Metoda oznaczania defektów mieloperoksydazy: najlepsze wyniki uzyskuje się przez biochemiczne oznaczenie H 2 0 2, wskazujące na zmiany metabolizmu podczas fagocytozy. Ze względów praktycznych bardzo ważne jest, aby aktywacja przecieku heksozowo-monofosforanowego, redukcja nitroenu tetrazoliowego oraz wiązanie egzogennego jodu z białkami PMNL korelowały z tworzeniem H 2 O 2 . Regularny rozmaz krwi jest utrwalany przez 30 sekund mieszaniną alkoholu i formaliny. Przemyty wodą destylowaną i wybarwiony na peroksydazę przez 30 sekund. W komórkach zawierających peroksydazę wykrywane są wtrącenia zabarwione na ciemnoniebiesko.

Test redukcji nitro błękitu tetrazoliowego (TNS). THC jest redukowane przez normalny PMNL do formazanu. Wymieszać z 0,1 ml krwi 0,1 ml 0,1% roztworu THC w 0,15 M NaCl, inkubować 20 minut w temperaturze 37°C, ponownie dokładnie wymieszać. Wbudowanie formazanu do komórek określa się za pomocą mikroskopii. Wynik jest wyrażony jako procent komórek formazan-dodatnich.

Poniższa metoda jest nieco bardziej skomplikowana: 1 kroplę krwi pacjenta nakłada się na szkiełko nakrywkowe. Inkubować przez 20 minut w 37°C w wilgotnej komorze, następnie ostrożnie przemyć szkło sterylnym 0,15 M NaCl. Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku zawierającym 1 kroplę pożywki THC (0,5 ml surowicy + 0,3 ml sterylnego 0,15 M NaCl + 0,6 ml THC, patrz powyżej). Inkubować przez 30 minut w wilgotnej komorze w 37°C, zdjąć szkiełko nakrywkowe i wysuszyć na powietrzu. Utrwalić absolutnym metanolem przez 60 sekund i przemyć wodą destylowaną. Wybarwić przez 5 min safraniną (1 g safraniny + 100 ml wody destylowanej + 40 ml gliceryny), przemyć. Komórki Formazano-dodatnie są duże, blastopodobne i zawierają niebieskie granulki. Zwykle w preparacie wykrywa się około 30% komórek formazan-dodatnich.

Powyższe metody oceny fagocytozy są podsumowaniem bardzo dużej liczby publikacji. Bardziej szczegółowe informacje na ten temat można znaleźć w odpowiednich pracach.

Odporność- to sposób na ochronę ciała przed żywymi ciałami i substancjami niosącymi oznaki genetycznie obcej informacji.

Odporność- integralny system biologicznych mechanizmów samoobrony organizmu.

Za pomocą odporności wszystko, co obce, jest rozpoznawane i niszczone. Obcy - nie własne, genetyczne podziały między substancjami.

Zadania - utrzymanie integralności strukturalnej ciała. Zapewnia

Zachowanie homeostazy
Zachowanie funkcjonalnej integralności strukturalnej organizmu
Zachowanie biologicznej indywidualności organizmu.
Komórki, które są genetycznie różne od komórek ciała, są niszczone.

Immunologia- nauka o organizmach, molekułach układu odpornościowego. Bada strukturalną funkcję odporności i odpowiedź immunologiczną na obce przeciwciała. Bada sekwencję odpowiedzi immunologicznej i jak na nią wpływać.

Rozwój immunologii

Założycielem jest dzieło Miecznikowa w 1883 roku. Stworzył fagocytarną teorię odporności, 1897 - Ehrlich stworzył humoralną teorię odporności, 1908 - otrzymał nob. Nagrody teoretyczne.

Empirycznie zaproponowano szczepionki (przedtem).

Gener - szczepionka przeciwko ospie krowiej

1974 – zwalczenie ospy.

Szczepionka Pasteura jest szczepionką przeciwko wściekliźnie.

odporność gatunkowa.

Odporność wynikająca z wrodzonych cech biologicznych organizmu.

Różni się właściwościami

1. Znak gatunku (zwierzęta nie cierpią na choroby ludzkie)

2. Genetycznie zdeterminowane - przez dziedziczenie

3. Niespecyficzny - nie ma selektywnego kierunku, ale przejawia się przeciwko różnym infekcjom

4. wytrwały, ale nie absolutny

Mechanizmy odporności gatunków.

Bariery zewnętrzne odporność gatunkowa.

Skóra stanowi mechaniczną barierę dla czynników zakaźnych – patogenów. Działa bakteriobójczo, ponieważ sekrety gruczołów potowych i łojowych zawierają nadtlenek wodoru, a także mocznik, nienasycone kwasy tłuszczowe, barwniki żółci, amoniak
Błona śluzowa. Sekret błon śluzowych zmywa patogeny z powierzchni. Zawiera lizozym, przeciwciała sekrecyjne, inhibitory bakterii i wirusów.
Anatomiczne i fizjologiczne cechy organizmu. Rzęsy nabłonka walcowatego górnych dróg oddechowych. Sposoby. Opóźnione patogeny, a także wymioty, kaszel, kichanie - to akty fizjologiczne. Rzęsy, brwi oczu zapobiegają przedostawaniu się patogenów

Bariery wewnętrzne

Prawidłowa mikroflora organizmu, zasiedlająca błonę śluzową, skórę, różne biotopy. Jest antagonistą organizmów chorobotwórczych i warunkowo patogennych. Działa uodparniająco. Dzięki temu indukuje powstawanie przeciwciał. Synteza witamin - K, B.
błony komórkowe
Funkcja barier histohematycznych. Przeprowadzić ochronę mózgu, układu rozrodczego, oczu.
układ limfatyczny. Uwzględniono system węzłów i formacji limfatycznych
Gorączka - wzrost temperatury poprawia procesy metaboliczne, przepływ krwi, aktywność enzymów, makrofagów, hamuje reprodukcję wirusów i bakterii.
Zapalenie występuje, gdy tkanki są uszkodzone. Fagocyty pędzą do ogniska stanu zapalnego. Aktywowane są substancje biologicznie czynne (BAS) - serotonina i histomina, które zwiększają przepuszczalność naczyń, co prowadzi do rozwoju obrzęku, zaczerwienienia, gromadzenia się substancji - przeciwciał i komplementu, które zapewniają zniszczenie patogenu.
funkcja układu wydalniczego. Pozbywa się zniszczonych patogenów poprzez przewód pokarmowy, drogi oddechowe i układ moczowy.

Komórkowe mechanizmy odporności gatunków.

Fagocytoza i funkcje komórek NK NK.

Fagocytoza- proces wychwytywania i niszczenia obcych antygenów przez fagocyty.

Fagocytoza obejmuje komórki, które dzielą się na następujące typy - mikrofagi. Są to neutrofile wielojądrzaste we krwi obwodowej. Makrofagi - monocyty, makrofagi fagowe, zwane histiocytami. Miedziane komórki wątroby, osteoklasty - tkanka kostna, a także komórki mikrogleju tkanki nerwowej. Makro i mikrofagi na błonach mają wiele receptorów, enzymów i wyraźny aparat lizosomalny.

Etapy fagocytozy

Ruch fagocytu w kierunku obiektu odbywa się za pomocą chemotaksji. Jest to ukierunkowany ruch komórki na określoną substancję chemiczną. Grupy zdefiniowane przez receptory.
Adhezja obiektu do fagocytów, zwana adhezją i absorpcją, które zachodzą poprzez interakcję z receptorami
Wchłanianie przez fagocyt obiektu. W miejscu przyłączenia wkracza ściana komórkowa. Obiekt jest zanurzony w fagocycie. Powstaje fagosom, który łączy się z lizosomem, tworząc kompleks fagolizosomów.
Wynik jest inny. Opcje wyników 1. Trawienie obiektu. 2. Reprodukcja obiektu w fagocycie 3. Wypychanie obiektu z fagocytu

Mechanizmy trawienia

Zależne od O. Fagocyt aktywnie absorbuje tlen, dochodzi do wybuchu oksydacyjnego, powstają reaktywne formy tlenu, takie jak hydroksylion, ponadoksydanion, nadtlenek wodoru, który ma szkodliwy wpływ na bakterię
Niezależny od tlenu. Przeprowadzany przez białka kationowe i enzymy lizosomalne.

Rodzaje fagocytozy

Ukończone - obiekt jest trawiony
Niekompletny - bakterie nie są trawione

Mechanizmy niepełnej fagocytozy.

Bakterie mogą być oporne na enzymy lizosomalne, takie jak gonokoki
Mikroorganizmy mogą wychodzić z fagocytów i namnażać się, co jest typowe dla riketsji.
Bakterie mogą zakłócać tworzenie fagolizosomów - prątka gruźlicy.

Ocena fagocytozy.

Do oceny aktywności fagocytarnej stosuje się następujące wskaźniki:

-Procent fagocytozy (PF)- liczba fagocytów na 100, wykazujących aktywność funkcjonalną.

Normalny przeciwko gronkowcom lub jakimkolwiek ciałkom - 60-80%

-Wskaźnik fagocytozy (IF)- liczba bakterii wyłapanych przez jeden fagocyt na 100. Około 6-8 bakterii jest wychwytywanych przez 1 fagocyt.

Aktywność fagocytów może wzrosnąć pod wpływem cytokin, komplementów, przeciwciał, wśród których znajdują się opsoniny. Są to przeciwciała, które przygotowują bakterię do fagocytozy. W ich obecności fagocytoza jest bardziej aktywna. Zsyntetyzowane opsoniny w immunizowanym organizmie.

Obecność opsonin jest określana przez wskaźnik opson-fagocytarny (OPI)

OFI = PF surowicy odpornościowej / FP normalnej surowicy. Jeśli > 1, to istnieją opsoniny. Pacjent z brucelozą rozwija opsoniny. Antietla przygotowuje fagocyty do schwytania Brucelli. 80/20=4. Jeśli< 1 человек болен.

Funkcje fagocytów

Zapewnienie fagocytozy
Przetwarzanie antygenów
Prezentacja antygenu komórkom układu odpornościowego i wywołanie późniejszej odpowiedzi immunologicznej.
Wydzielanie BAS - substancji biologicznie czynnych. Więcej niż 5-. Cytokiny, składniki dopełniacza, prostaglandyny,

Naturalni zabójcy.

Są to naturalni zabójcy należący do limfocytów, które nie mają właściwości limfocytów T i B, mają działanie cytotoksyczne na komórki nowotworowe, komórki zawierające wirusy. Mają specjalne białko, które szybko polimeryzuje w obecności jonów wapnia, tworzą się podjednostki osadzone w błonie komórkowej i tworzy się kanał, przez który woda wpada do komórki. Komórka pęcznieje, pęka, co nazywa się cytolizą.

Humoralne czynniki odporności gatunku

Komplement to wieloskładnikowy system białek surowicy krwi, który utrzymuje homeostazę. Łączy 9 składników-frakcji i jest oznaczony przez łacińskie C z indeksem 1,2,3,4,5 itd. System zawiera podkomponenty С1R, C1S, C5A, C5B. Białka regulatorowe, czynniki zaangażowane w aktywację dopełniacza – gamma globuliny, jony magnezu i wapnia. Komponenty komplementu są w stanie nieaktywnym, a aktywacja systemu komplementu jest konieczna do manifestacji funkcjonalnego działania. Istnieją następujące sposoby aktywacji:

Klasyczny
Alternatywny
Lektyna.

Aktywacja typu klasycznego. Aktywacja przebiega coraz bardziej kaskadowo.

1 molekuła rozpada się, aktywuje 2 molekuły i tak dalej. Inicjowane przez kompleks antygen-przeciwciało, który oddziałuje z pierwszą frakcją C1, która rozpada się na podskładniki. Oddziałuje z C4, który oddziałuje z C2, który aktywuje C3, który rozkłada się na podskładniki C3A i C3B, prowadząc do aktywacji C5, który rozkłada się na podskładniki C5a i C5b, aktywuje C6 i tak dalej aż do C9. Kompleks C6-C9 jest kompleksem atakującym błonę, który jest osadzony w błonie, tworzy się kanał, przez który wchodzi woda i komórka ulega lizie.

Aktywacja według typu alternatywnego. Wywoływane jest przez LPS i antygeny drobnoustrojów, które natychmiast aktywują frakcję C3. Dalej C5 i do C9.

Aktywacja przez lektyny Typ jest wyzwalany przez białka wiążące monozę, które wiążą się z resztami monozy na komórkach bakteryjnych, aktywowana jest proteaza, która rozszczepia czwartą frakcję dopełniacza. Następnie C2,3 i tak dalej aż do C9. W rezultacie komplement jest aktywowany.

Komplement w wyniku aktywacji spełnia następujące funkcje:

liza komórek
Stymulacja fagocytozy np. frakcja C5 wzmaga chemotaksję
Zwiększona przepuszczalność naczyń, którą zapewniają podkomponenty
Wzmacnia proces stanu zapalnego

Humoralne czynniki odporności gatunków obejmują enzym lizozym, który niszczy peptydoglikan ściany komórkowej, powodując śmierć bakterii i jest syntetyzowany przez makrofagi i monocyty. Wysoka zawartość krwi, płynów ustrojowych, śliny i płynu łzowego

Białka ostrej fazy, takie jak białko C reaktywne. Jest to duża cząsteczka białka z 5 identycznymi podjednostkami - pentroksyna. Wykazuje powinowactwo do substancji ściany komórkowej bakterii. Zapewnia opsonizację bakterii, aktywację komplementu na szlaku klasycznym

Peptydy endogenne o działaniu antybiotycznym mogą zabijać bakterie

Interferon, białka ochronne surowicy krwi, wśród których oprócz białek ostrej fazy wyróżnia się properdyna, beta lizyna, białka monowiążące.

Istotę fagocytozy można opisać w kilku słowach. W tym procesie specjalne komórki fagocytów „obliczają”, pożerają i trawią szkodliwe cząstki, które dostały się do organizmu, głównie infekcje. Celem tego zjawiska jest ochrona nas przed potencjalnymi patogenami, toksynami i tak dalej. A jak dokładnie przebiega mechanizm fagocytozy? Przechodzi przez kilka etapów, które zostaną omówione bardziej szczegółowo poniżej.

Etapy fagocytozy:

Chemotaksja

Złośliwy przedmiot dostaje się do ciała i przez krótki czas pozostaje tam niezauważony. Ten obiekt, czy to bakteria, ciało obce, czy coś innego, uwalnia specjalne substancje (chemoatraktanty) i bezpośrednio wchodzi w kontakt z krwią lub tkankami. Wszystko to uświadamia ciału obecność w nim agresora.

Następuje kaskada reakcji biochemicznych. W pierwszym etapie fagocytozy komórki tuczne uwalniają do krwiobiegu specjalne związki, które wywołują reakcję zapalną. Początek procesu zapalnego „budzi” makrofagi i inne komórki fagocytujące ze stanu spoczynku. Neutrofile, wyłapując obecność chemoatraktantów, szybko opuszczają krew do tkanek i pędzą do migracji do ogniska zapalnego.

Trudno to opisać, a jeszcze trudniej sobie wyobrazić, ale wnikanie patogenu do organizmu prowadzi do uruchomienia prawdziwego efektu domina, który obejmuje setki (!) różnych zjawisk fizjologicznych zachodzących na poziomie komórkowym i subkomórkowym poziomy. Stan układu odpornościowego na tym etapie fagocytozy można porównać do stanu zaburzonego ula pszczelego, gdy jego liczni mieszkańcy przygotowują się do ataku na sprawcę.

Neutrofil - migrujący fagocyt

Sekwencja fagocytozy jest kontynuowana w drugim etapie, reakcji adhezyjnej. Fagocyty, które zbliżyły się do właściwego miejsca, rozszerzają swoje procesy na patogen, wchodzą z nim w kontakt i rozpoznają go. Nie spieszą się z natychmiastowym atakiem i wolą najpierw upewnić się, że nie mylą się z „nieznajomym”. Rozpoznanie szkodliwego czynnika następuje za pomocą specjalnych receptorów na powierzchni błon fagocytów.

Aktywacja błony

W trzecim etapie fagocytozy w komórkach obrońcy zachodzą niewidoczne reakcje, które przygotowują je do wychwycenia i zniszczenia patogenu.

Zanurzenie

Błona fagocytów jest płynną, plastyczną substancją, która może zmieniać kształt. Co robi, gdy komórka napotka złośliwy obiekt. Zdjęcie pokazuje, że fagocyt rozciąga swoje „macki” do obcej cząstki. Potem stopniowo rozprzestrzenia się wokół niej, czołga się po niej i całkowicie ją chwyta.

Fagocyt rozszerza procesy na patogen

Tworzenie fagosomów

Gdy fagocyt pokrywa cząsteczkę ze wszystkich stron, jego błona zamyka się od zewnątrz, a wewnątrz komórki pozostaje zamknięty bańka z zaatakowanym obiektem w środku. Tak więc komórka wydaje się połykać cząsteczkę. Ten pęcherzyk nazywa się fagosomem.

Tworzenie fagolizosomu (fuzja)

Podczas gdy zachodziły inne etapy fagocytozy, wewnątrz fagocytu przygotowywano do użycia jego broń - organelle lizosomalne zawierające „trawienne” enzymy komórki. Jak tylko bakteria lub inny szkodliwy obiekt zostanie przechwycony przez komórkę obrońcy, zbliżają się do niej lizosomy. Ich membrany łączą się z otoczką otaczającą cząsteczkę, a ich zawartość wlewa się do tego „worka”.

To najbardziej dramatyczny moment w całym mechanizmie fagocytozy. Schwytany obiekt jest trawiony i rozkładany przez fagocyt.

Usuwanie produktów z dekoltu

To, co pozostało z zabitej bakterii lub innej strawionej cząstki, jest usuwane z komórki. Dawny fagolizosom, który jest workiem z produktami degradacji, zbliża się do zewnętrznej błony fagocytu i łączy się z nią. Tak więc resztki wchłoniętego obiektu są usuwane z komórki. Sekwencja fagocytozy kończy się

Etapy fagocytozy:

Chemotaksja

Przyczepność

Aktywacja błony

W trzecim etapie fagocytozy w komórkach obrońcy zachodzą niewidoczne reakcje, które przygotowują je do wychwycenia i zniszczenia patogenu.

Zanurzenie

Tworzenie fagosomów

Tworzenie fagolizosomu (fuzja)

Zabicie

To najbardziej dramatyczny moment w całym mechanizmie fagocytozy. Schwytany obiekt jest trawiony i rozkładany przez fagocyt.

Usuwanie produktów z dekoltu

Co decyduje o powodzeniu fagocytozy?

Niestety, nie zawsze cały opisany proces przebiega jak w zegarku. W niektórych przypadkach patogen jest silniejszy niż fagocytarne ogniwo odporności, pokonuje obronę i osoba zachoruje. Miecznikow zauważył również, że jeśli zbyt wiele komórek grzybów działa na larwy i robaki, zarażone organizmy umierają.

Inną możliwą przyczyną niepowodzenia jest niepełna fagocytoza. Niektóre (często bardzo niebezpieczne i zakaźne) patogeny są chronione przed strawieniem przez fagocyty. W efekcie po prostu dostają się do nich, żyją tam i rozwijają się, niedostępne dla innych czynników chroniących przed odpornością. Przecież „normalny” układ odpornościowy nie zaatakuje własnych komórek, nie wie, że w ich wnętrzu kryje się niebezpieczny patogen…

Aby uniknąć „nieudanej” fagocytozy i zapewnić najlepszą ochronę immunologiczną, zaleca się przyjmowanie leku Współczynnik transferu. Jego cząsteczki informacyjne przekazują komórkom odpornościowym informacje o tym, jak zachowywać się z różnymi patogenami i jak się ich pozbyć. W efekcie poprawia się praca układu odpornościowego, a to zwiększa jego odporność na choroby, które jeszcze nie powstały oraz skuteczność leczenia tych, które już się rozwinęły.

Fagocytoza jest filogenetycznie najstarszym procesem ochronnym realizowanym przez wyspecjalizowane komórki układu odpornościowego (Mechnikov 1883, 1892; Greenberg, 1999). To właśnie I. I. Miecznikow po raz pierwszy w porównawczych badaniach morfofizjologicznych udowodnił kluczową rolę tego mechanizmu obrony immunologicznej w tworzeniu odporności zwierząt na infekcje.

Profesjonalne fagocyty u kręgowców obejmują przede wszystkim neutrofile (leukocyty wielojądrzaste, mikrofagi) oraz monocyty/makrofagi (fagocyty jednojądrzaste, jednojądrzaste). Komórki te są przystosowane morfofizjologicznie i biochemicznie do wchłaniania i inaktywacji ciał i cząstek drobnoustrojów o średnicy większej niż 0,5 µm (wielkości najmniejszych bakterii z grupy Mycoplasma). Różnica między fagocytozą a innymi formami reakcji endocytarnych komórek sugeruje obowiązkowy udział w tym procesie cytoszkieletu aktynowego, który w postaci mikrowłókien penetruje pseudopodia wychwytujące mikroorganizmy i cząstki. Fagocytoza wymaga do swojego przebiegu określonych warunków temperaturowych (t> +13-18°C) i nie występuje w niższych temperaturach u kręgowców. Wraz z neutrofilami i monocytami/makrofagami w fagocytozie biorą udział niedojrzałe komórki dendrytyczne, eozynofile, komórki tuczne, komórki nabłonkowe, płytki krwi, a nawet niektóre limfocyty.

Kontakt fagocyta z mikroorganizmem inicjuje reakcje komórkowe związane z błoną cytoplazmatyczną, cytoszkielet, aktywację mechanizmów zabijania patogenów, produkcję cytokin, chemokin i cząsteczek, które odgrywają kluczową rolę w prezentacji antygenów (Underhill i Ozinsky, 2002) .

Receptory fagocytozy

Komórki	Chwytnik	Cel	ligand
Leukocyty	FcyRs	kompleksy immunologiczne zymosan opsonizowany pentraksyną (drożdże)	CH-domeny immunoglobulin SAP, SRV
neutrofile, monocyty/ makrofagi	CR1 (CD35)	Bakterie i grzyby opsonizowane przez dopełniacz	C3b, C4b,
Także	CR3 (CD1 lb- CD18, oMP2, Maci)	Bakterie i grzyby opsonizowane przez dopełniacz Bakterie Gram-ujemne Bordetella pertussis	NPS, C3d LPS nici hemaglutyniny P-glikan
makrofagi, komórki dendrytyczne	CR4 (CD1lc-CD18)	M. gruźlica	Niezidentyfikowany
Makrofagi	CD43 (leukosialina/sialoforyna)	M. gruźlica	Także
otyły	CD48	Jelitowy bakteria	FimH
Makrofagi	mannoza chwytnik	Pneumocystis candida albicans	Pozostałości mannozy lub fukozy
»	Receptor oczyszczający AI/I1	Limfocyty apoptotyczne ziarniaki Gram-dodatnie	? kwasy fosfatydyloseryny lipotejchojowe
Ser-komórki	Zmiatacz ponownie	Apoptotyczny	Fosforan-
filce dachowe, komórki nabłonka grasicy	receptor B 1	komórki	dilseryna

Komórki	Chwytnik	Cel	ligand
Makrofagi	MARCO	E. co/i, S. aureus	Niezidentyfikowany
»	MER	Apoptotyczny tymocyty	? Gas6Apoc-fatydylo-seryna
Wiele	PSR	Apoptotyczny	Fosfaty- dilseryna
Makrofagi	CD36	Apoptotyczny neutrofile	Fosfaty- dilseryna
»	CD14	Pseudomonas apoptotyczny	?lps? niezidentyfikowany wyposażone
Wiele	pi-integryny	Yersinia spp.	plagi
komórki
Makrofagi	opfZ	Apoptotyczny	? trombospondyna
Dendrytyczny	sofZ	Podobnie	Niezidentyfikowany
glin
Nabłonkowy	E-kadheryna	Listeria spp.	1p1A
komórki
Podobnie	Spotkał	Podobnie	1p1B

Główne etapy fagocytozy: chemotaksja, kontakt fagocyta z drobnoustrojem, wchłanianie (internalizacja) mikroorganizmów (fagocytoza w wąskim znaczeniu tego słowa), inaktywacja (zabijanie) i późniejsze trawienie patogenów w aparacie wakuolarnym fagocytów (ukończenie fagocytozy). Wraz z tymi funkcjonalnymi objawami fagocytozie z reguły towarzyszą reakcje wydzielnicze fagocytów, zwłaszcza monocytów / makrofagów i komórek dendrytycznych, podczas których uwalniane są różne fizjologicznie aktywne substancje, które zapewniają ochronny charakter przebiegu i kończą cały proces jako cały.

W rozpoznawanie, kontakt i wchłanianie drobnoustrojów przez fagocyty zaangażowane są różne receptory (Tabela 7) (Greenberg, 78

Grinstein, 2002). Stosując nowoczesne metody genetyki molekularnej ustalono, że zmiany w ekspresji ponad 200 genów obserwuje się w fagocytach podczas fagocytozy cząstek lateksu przez mysie makrofagi, a około 600 genów podczas fagocytozy Mycobacterium tuberculosis (Ehrt i wsp., 2001). . Wszystko to świadczy o złożonej i złożonej naturze zmian strukturalnych i funkcjonalnych w makrofagach związanych z procesem fagocytarnym. Zrozumienie ich podstaw molekularnych umożliwi w przyszłości stworzenie środków farmakologicznych, które specyficznie regulują proces fagocytozy. Różnorodność receptorów zapewnia skuteczność rozpoznawania patogenów („nienatywnych”) i jest niezbędnym warunkiem późniejszej celowanej inaktywacji czynników zakaźnych. W jednej z nowoczesnych koncepcji odporności wrodzonej połączenie tych receptorów jest powszechnie określane jako system receptorów (cząsteczek), które rozpoznają wzorce molekularne związane z patogenami (Janeway, 1992, 2002). "