Các oligonucleotide antisense. Các phương pháp bảo vệ các chế phẩm dựa trên các oliglenucleotide antisense khỏi bị phá hủy bởi các nuclease nội bào


Chủ tịch: T.V. Ovchinnikova, N.F. Myasoedov

Phiên 1
Chủ tịch: N.F. Myasoedov, T.V. Ovchinnikova
Hội trường lớn
Ngày 19 tháng 9, 9:30 - 11:30

25 phút N.F. Myasoedov

Thuốc dựa trên peptit

20 phút S.A. Limbor Viện di truyền phân tử RAS, Moscow, Nga

Cơ chế di truyền phân tử của cơ chế điều hòa peptit

15 phút RU. Ostrovskaya

Noopept - cơ chế hoạt động mới và triển vọng sử dụng

15 phút T.N. Sollertinskaya 1, M.V. Shorokhov 1, N.F. Myasoedov 2, L.A. Andreeva 2 1 Viện Sinh lý Tiến hóa và Hóa sinh. HỌ. Viện Hàn lâm Khoa học Nga Sechenov, St.Petersburg; 2 Viện Di truyền phân tử RAS, Moscow, Nga

Đặc điểm của việc điều chỉnh neuropeptide rối loạn nhận thức và tâm lý-cảm xúc trong hội chứng mệt mỏi mãn tính ở động vật có vú (khía cạnh tiến hóa của nghiên cứu)

15 phút I.I. Bobyntsev, O.I. Sorokoletova, A.E. Trắng Đại học Y bang Kursk, Kursk, Nga

Nghiên cứu tác dụng giải lo âu và giảm đau của peptit Gly-His-Lys (GHK) và các chất tương tự cấu trúc của nó

Buổi 2
Chủ tịch: S.N. Kochetkov, T.V. Ovchinnikova
Hội trường lớn
19 tháng 9, 16:00 - 18:00

25 phút S.N. Kochetkov

Các chất ức chế mới đối với sự phát triển của các bệnh nhiễm trùng có ý nghĩa xã hội

20 phút TV. Ovchinnikova Viện Hóa học tổ chức sinh học. MM.

Tiềm năng điều trị của peptide kháng khuẩn

15 phút V.N. Kokryakov 1.2, O.V. Shamova 1,2, G.M. Aleshina 1, M.N. Berlov 1,2, T.V. Ovchinnikova 3 1 Viện Y học Thực nghiệm, St.Petersburg; 2 Đại học Quốc gia St.Petersburg, St.Petersburg; 3 Viện Hóa học tổ chức sinh học

Thành tựu của trường quốc gia các nhà hóa sinh trong việc nghiên cứu cấu trúc và chức năng của các peptit kháng sinh có nguồn gốc động vật

15 phút O.V. Shamova 1, 2, M.S. Zharkova 1, P.M. Kopeikin 1, T.A. Lukyanova 1, A.Yu. Artamonov 1, S.V. Balandin 3, T.A. Filatenkova 1, A.S. Nazarov 1,2, K.E. Safiullina 1, M.S. Sukharev 1, T.Yu. Pazina 1, T.M. Grinchuk 4, V.N. Kokryakov 1,2, T.V. Ovchinnikova 3, D.S. Orlov 1.2 1 Viện Y học Thực nghiệm, St.Petersburg; 2 Đại học Quốc gia St.Petersburg, St.Petersburg; 3 Viện Hóa học tổ chức sinh học MM. Shemyakin và Yu.A. Ovchinnikov RAS, Moscow; 4 Viện Tế bào học RAS, St.Petersburg, Nga

Peptide giàu proline của khả năng miễn dịch bẩm sinh là nguyên mẫu của thuốc kháng khuẩn và kháng u mới

15 phút I E. Eliseev 1 TRONG. Terterov 1, O.V. Shamova 2, M.V. Cudgel 1 1 Đại học Học thuật St.Petersburg; 2 Viện Y học Thực nghiệm, St.Petersburg, Nga

Sử dụng các mẫu trình tự axit amin để thiết kế các peptit kháng khuẩn xoắn alpha

15 phútM.N. Berlov 1,2, E.S. Umnyakova 1, A.V. Sokolov 1, T.V. Ovchinnikova 3, V.N. Kokryakov 1.2 1 Viện Y học Thực nghiệm, St.Petersburg; 2 Đại học Quốc gia St.Petersburg, St.Petersburg; 3 Viện Hóa học tổ chức sinh học MM. Shemyakin và Yu.A. Ovchinnikov RAS, Moscow, Nga

Tương tác của peptit kháng khuẩn cation với protein C1q và ảnh hưởng của chúng đối với hoạt hóa bổ thể

Buổi 3
Chủ tịch: N.F. Myasoedov, L.P. Ovchinnikov
Hội trường lớn
20 tháng 9, 9:30 - 11:30

25 phút L.P. Ovchinnikov 1, N.V. Bobkova 2 1 Viện Protein RAS, Pushchino; 2 Viện lý sinh tế bào RAS, Pushchino, Nga

Phát triển một loại thuốc cải tiến chống lại bệnh Alzheimer dựa trên protein YB-1

20 phút O.M. Volpina 1, D.O. Koroev 1, T.D. Volkova 1, A.V. Kamynina 1, M.P. Filatova 1, S.M. Balasanyants 1, N.I. Medvinskaya 2, P.V. Nekrasov 2, I.V. Nesterova 2, A.N. Samokhin 2, N.V. Bobkova 2 1 MM. Shemyakin và Yu.A. Ovchinnikov RAS, Moscow; 2 Viện Lý sinh Tế bào RAS, Pushchino, Vùng Matxcova, Nga

Hoạt động bảo vệ của các peptide trong các quá trình thoái hóa thần kinh của loại bệnh Alzheimer

15 phútA.V. Tallerova Viện nghiên cứu dược lý. V.V. Zakusova, Moscow, Nga

Dipeptide bắt chước yếu tố dinh dưỡng thần kinh có nguồn gốc từ não GSB-106 là một loại thuốc chống trầm cảm đầy hứa hẹn của thế hệ mới

15 phút K.N. Kolyasnikova, T.A. Gudasheva, S.B. Seredenin Viện nghiên cứu dược lý. V.V. Zakusova, Moscow, Nga

Glyproline được thay thế GZK-111 - một dipeptide mới với các hoạt động giải lo âu và bảo vệ thần kinh

15 phút A.V. Avetisyan 1, R.A. Zinovkin 1, R.A. Simonyan 1, P.V. Nekrasov 2, A.N. Samokhin 2, D.O. Koroev 3, O.M. Volpina 3, N.V. Bobkova 2 1 Viện Nghiên cứu Sinh học Hóa lý. MỘT. Đại học quốc gia Belozersky Moscow, Moscow; 2 Viện lý sinh tế bào RAS, Pushchino; 3 Viện Hóa học tổ chức sinh học MM. Shemyakin và Yu.A. Ovchinnikov RAS, Moscow, Nga

Các peptit tổng hợp đến miền ngoại bào RAGE phục hồi các ti thể trong não của chuột cắt bỏ củ

15 phútĐỊA NGỤC. Slobodina 1.2, O.I. Bolshakova 1, A.L. Shvartsman 1, S.V. Sarantseva 1 1 Trung tâm Nghiên cứu Quốc gia "Viện Kurchatov", Viện Vật lý Hạt nhân St. B.P. Konstantinova, Gatchina; 2 Peter Đại học Bách khoa St.Petersburg, St.Petersburg, Nga

Các peptide kết hợp là hợp chất đầy hứa hẹn để điều trị bệnh Alzheimer

Buổi 4
Chủ tịch: E.D. Sverdlov
Hội trường lớn
20 tháng 9, 16:50 - 18:50

15 phút V.A. Mitkevich, A.A. Makarov Viện Sinh học phân tử. V.A. Engelhardt RAS, Moscow, Nga

Phát triển một loại thuốc chống khối u dựa trên binase ribonuclease

15 phútA.V. Stepanov 1,2, A.A. Belogurov 1,2, A.G. Gabibov 1.2 1 Viện Hóa học tổ chức sinh học. MM. Shemyakin và Yu.A. Ovchinnikov RAS, Moscow; 2 Đại học Liên bang Kazan (Vùng Volga), Kazan, Nga

Việc sử dụng các thụ thể kháng nguyên tế bào T chimeric kết hợp với phối tử thụ thể tế bào B để điều trị các u lympho không Hodgkin

15 phút V.A. Độ Richter 1, E.V. Kuligina 1, O.V. Koval 1, G.V. Kochneva 2, A.A. Newise 1, A.A. Makartsova 1, O.S. Troitskaya 1 1 Viện Sinh học Hóa học và Y học Cơ bản SB RAS, Novosibirsk, Trung tâm Nghiên cứu Nhà nước 2 về Vi-rút và Công nghệ Sinh học của Nga, Koltsovo, vùng Novosibirsk, Nga

Các cách để tăng hiệu quả chống khối u của Lactaptin

15 phút A.A. Rosenkrants, T.A. Slastnikova, A.V. Ulasov, BẰNG. SobolevViện sinh học gen RAS; Đại học bang Moscow M.V. Lomonosov, Moscow, Nga

Phân phối nội bào có mục tiêu các chất chống ung thư bằng cách sử dụng các thiết bị vận chuyển nano mô-đun

15 phút I.V. Alekseenko Viện Di truyền Phân tử RAS; Viện Hóa học tổ chức sinh học. MM. Shemyakin và Yu.A. Ovchinnikov RAS, Moscow, Nga

Các vấn đề và triển vọng của thuốc liệu pháp gen trong điều trị ung thư

15 phútD.V. Sverchinsky, V.F. Lazarev, I.V. Guzhova, B.A. Margulis Viện Tế bào học RAS, St.Petersburg, Nga

Bộ điều chỉnh hoạt động của chaperone Hsp70 và tiềm năng chống khối u của chúng

15 phútS.S. Larin, M.I. Lukashina, A.V. Kibardin, A.V. Posvyatenko, E.Yu. Lysyuk, G.P. Georgiev Viện sinh học gen RAS, Moscow, Nga

Các dạng hòa tan và liên kết màng của các phân tử giống MHC do căng thẳng gây ra như các dấu hiệu đầy hứa hẹn trong chẩn đoán và điều trị các khối u ác tính

Buổi 5
Chủ tịch: N.F. Myasoedov, V.A. stonik
Hội trường lớn
Ngày 21 tháng 9, 9h30 - 11h30

25 phút V.A. stonik Viện Hóa học Sinh học Thái Bình Dương. G.V. Elyakova, Chi nhánh Viễn Đông của Viện Hàn lâm Khoa học Nga, Vladivostok, Nga

Từ nghiên cứu về các hợp chất tự nhiên biển đến các ý tưởng và sinh phẩm mới

20 phút P.V. Sergiev 1.2, I.A. Osterman 1,2, E.S. Komarova 1,2, A.A. Bogdanov 1, O.A. Dontsova 1.2 1 Đại học bang Moscow M.V. Lomonosova, 2 Viện Khoa học và Công nghệ Skolkovo, Moscow, Nga

Tìm kiếm kháng sinh mới và nghiên cứu cơ chế hoạt động của chúng

15 phút Ya.R. Panikratova 1, LÀ. Lebedeva 1, O.Yu. Sokolov 1, D.A. Kupriyanov 2, A.D. Rumshiskaya 3, N.V. Bờ biển 1, N.F. Myasoedov 1 1 FGBNU NTSPZ; - 2 OO Philips; 3 FGAU "LRTS" của Bộ Y tế Liên bang Nga, Moscow, Nga

Nghiên cứu về tác động của Semax đối với hoạt động của mạng lưới tế bào thần kinh của não người bằng phương pháp chụp cộng hưởng từ chức năng (fMRI)

15 phútE.F. Kolesanova, E.A. Egorova, V.N. Prozorovsky, O.M. Ipatova Viện Nghiên cứu Hóa học Y sinh. V.N. Orekhovich, Moscow, Nga

Peptide tổng hợp trong các loại thuốc cải tiến: peptide miễn dịch và peptide vận chuyển

15 phút B.P. Chelobanov 1,2, A.A. Fokina 1, A.M. Ilyina 2, K.V. Klabenkova 2, E.A. Burakova 1, M. Fujii 3, VÂNG. Stetsenko 1,2 1 Viện Sinh học Hóa học và Y học Cơ bản SB RAS, Novosibirsk; 2 Đại học Bang Novosibirsk, Novosibirsk, Nga; 3 Đại học Kindai, Fukuoka, Nhật Bản

Các liên hợp peptit của các chất tương tự oligonucleotide làm chất điều trị tiềm năng

15 phútA.A. Zamyatnin(ml.) 1.2, A.V. Balakireva 1, N.V. Gorokhovets 1, E.Yu. Zerniy 2, N.V. Kuznetsova 1, V.A. Makarov 1, A.I. Petushkova 3, L.V. Savvateeva 1 1 Viện Y học Phân tử, Đại học Y bang Matxcova đầu tiên. HỌ. Sechenov, Mátxcơva; Viện Nghiên cứu Sinh học Hóa lý. MỘT. Đại học quốc gia Belozersky Moscow, Moscow; 3 Khoa Sinh học, Đại học Tổng hợp Lomonosov Moscow M.V. Lomonosov, Moscow, Nga

Tạo ra một tác nhân enzym để giải độc gluten hiệu quả

Buổi 6
Chủ tịch: V.M. Lipkin, T.V. Ovchinnikova
Hội trường lớn
21 tháng 9, 16,15 - 18,15

15 phút I.A. Grivennikov 1, E.V. Novosadova 1, S.A. Antonov 1, E.S. Manuilova 1, E.L. Arsen'eva 1, M.A. Grefenshtein 1, A.M. Zykova 1, Kobylyansky A.G. 1, V.V. Simonova 3, L.G. Khaspekov 3, O.S. Lebedeva 2, M.A. Lagarkova 2, S.N. Illarioshkin 3, V.Z. Tarantula 1, N.F. Myasoedov 1 1 Viện Di truyền Phân tử RAS; 2 Trung tâm Khoa học và Thực hành Liên bang về Y học Vật lý và Hóa học của Cơ quan Y tế và Sinh học Liên bang Nga; 3 Trung tâm Khoa học Thần kinh, Viện Hàn lâm Khoa học Y khoa Nga, Matxcova

Hệ thống thử nghiệm dựa trên tế bào gốc đa năng của con người được cảm ứng

15 phút E.V. Novosadova, E.L. Arsenyeva, E.S. Manuilova, M.A. Grefenstein, N.F. Myasoedov, I.A. Grivennikov Viện di truyền phân tử RAS, Moscow, Nga

Các peptit thuộc họ melanocortin có thể điều chỉnh sự biểu hiện của các gen đặc hiệu của tế bào thần kinh trong quá trình biệt hóa tế bào thần kinh của các tế bào gốc đa năng của con người.

15 phútA.P. Bogachuk 1, Z.I. Storozheva 2, Yu.A. Zolotarev 3, G.I. Kovalev 4, V.N. Azev 5, A.N. Murashev 5, D.I. Rzhevsky 5, G.B. Telegin 5, V.M. Lipkin 1 1 Viện Hóa học tổ chức sinh học. MM. Shemyakin và Yu.A. Ovchinnikov RAS; 2 Trung tâm Nghiên cứu Y khoa Liên bang về Tâm thần học và Khoa học. V.P. Tiếng Serbia; 3 Viện Di truyền Phân tử RAS; 4 Viện Nghiên cứu Dược lý RAS, Moscow, Nga; 5 Chi bộ Viện Hóa học tổ chức sinh học. MM. Shemyakin và Yu.A. Ovchinnikov RAS, Pushchino, Vùng Moscow, Nga

Các nghiên cứu tiền lâm sàng về một loại thuốc bảo vệ thần kinh dựa trên peptide mới

15 phútYu.A. Zolotarev 1, G.I. Kovalev 2, N.V. Kost 3, O.Yu. Sokolov 3, A.K. Dadayan 1, V.S. Kozik 1, S.I. Vết sẹo 1, E.V. Vasilyeva 2, A.P. Bogachuk 4, V.M. Lipkin 4, N.F. Myasoedov 1 1 Viện Di truyền Phân tử RAS; 2 Viện Nghiên cứu Dược học mang tên V.V. Zakusova; 3 Trung tâm Nghiên cứu Sức khỏe Tâm thần; 4 Viện Hóa học tổ chức sinh học MM. Shemyakin và Yu.A. Ovchinnikov RAS, Moscow, Nga

Hoạt động giải lo âu và bảo vệ thần kinh của peptit điều hòa HLDF-6 trong các mô hình bệnh Parkinson và rối loạn lo âu

15 phút A.K. Dadayan 1, Yu.A. Zolotarev 1, V.S. Kozik 1, S.I. Vết sẹo 1, I.Yu. Nagaev 1, V.N. Azev 2, A.P. Bogachuk 3, V.M. Lipkin 3, N.F. Myasoedov 1 1 Viện Di truyền Phân tử RAS, Moscow; 2 Chi bộ Viện Hóa học tổ chức sinh học. MM. Shemyakin và Yu.A. Ovchinnikov RAS, Pushchino; 3 Viện Hóa học tổ chức sinh học MM. Shemyakin và Yu.A. Ovchinnikov RAS, Moscow, Nga

Dược động học của dạng axetamit của peptit HLDF-6 trong mô của động vật thí nghiệm sử dụng các dẫn xuất được đánh dấu triti và deuterium.

Hầu hết các phương pháp điều trị gen ex vivo và in vivo sử dụng cấu trúc gen nhân bản thay thế dạng chức năng của protein không được tổng hợp trong cơ thể bệnh nhân hoặc được tổng hợp ở dạng khiếm khuyết. Tuy nhiên, ngược lại, nhiều bệnh ở người (ung thư, viêm nhiễm, nhiễm trùng do vi rút và ký sinh trùng) có liên quan đến việc sản xuất quá mức protein bình thường. Các liệu pháp đã được phát triển để điều trị những tình trạng này.

hệ thống sử dụng các oligonucleotide cụ thể. Một oligonucleotide nhỏ như vậy có thể lai với một gen hoặc mRNA cụ thể và làm giảm mức độ phiên mã hoặc dịch mã, do đó làm giảm lượng protein chịu trách nhiệm về bệnh lý được tổng hợp. Một oligonucleotide lai với chính gen và ngăn chặn quá trình phiên mã của nó được gọi là "kháng nguyên", và một oligonucleotide lai với mRNA tương ứng được gọi là "antisense" (ARN Antisense). Để ngăn chặn sự kích hoạt phiên mã của các gen cụ thể, cũng có thể sử dụng các oligonucleotide sợi kép liên kết đặc biệt với các protein liên kết DNA (protein hoạt hóa). Cuối cùng, để giảm số lượng mRNA nhất định và protein được tổng hợp trên đó, có thể sử dụng ribozyme - các chuỗi RNA tự nhiên liên kết với các phân tử RNA cụ thể và cắt chúng.

Trong tương lai, các loại thuốc dựa trên axit nucleic có khả năng được ứng dụng rộng rãi, với các oligonucleotide "antisense" khác nhau là đối tượng chính của nghiên cứu khoa học và thử nghiệm lâm sàng.

3.1 Các oligonucleotide antisense làm thuốc

RNA "Antisense" (Antisense RNA), được cho là được sử dụng làm thuốc, là một oligonucleotide ngắn (15-20 nucleotide) có thể liên kết với một vị trí mRNA nhất định bổ sung cho nó và ức chế sự dịch mã của protein mà nó mã hóa, do đó ngăn chặn quá trình bệnh lý (Hình 2).

Hiệu quả điều trị của các oligonucleotide "antisense" tổng hợp phụ thuộc vào tính đặc hiệu của quá trình lai của chúng với vị trí có thể tiếp cận của mRNA đích, khả năng chống lại hoạt động của nuclease tế bào và sự hiện diện của hệ thống phân phối vào tế bào. Trình tự 15-20 nucleotide lai với các mRNA duy nhất có tính đặc hiệu khá cao. Các vị trí mục tiêu tiềm năng được xác định bằng cách thử nghiệm một tập hợp các oligonucleotide "antisense" bằng cách sử dụng nuôi cấy tế bào tổng hợp mRNA mục tiêu. Để làm được điều này, người ta tiến hành phân tách điện di của các protein tế bào, trong đó nhãn phóng xạ được đưa vào trong quá trình dịch mã, và sử dụng phương pháp chụp ảnh phóng xạ, nó được xác định khi có sự hiện diện của oligonucleotide “antisense” thì quá trình tổng hợp một protein nhất định bị giảm. Không có tiêu chí chung nào để chọn các vị trí mục tiêu tốt nhất trong các phiên mã RNA khác nhau. Các Oligonucleotide bổ sung cho các đầu 5 'hoặc 3' của ranh giới mRNA, exon và intron, và thậm chí các vùng sợi đôi có thể có hiệu quả. Các oligonucleotide antisense có thể bị phân hủy bởi nuclease nội bào, vì vậy điều quan trọng là phải bảo vệ chúng khỏi tác động của chất sau để chúng không bị mất khả năng lai với mục tiêu. Đối với điều này, các bazơ pyrimidine, ribose hoặc deoxyribose có thể được sửa đổi theo một cách nhất định (Hình 3). Do đó, trong các oligonucleotide “antisense” được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay, nguyên tử oxy tự do của liên kết phosphodiester được thay thế bằng nhóm SH (Hình 3B ), dẫn đến sự hình thành một liên kết thiophosphat. Oligonucleotide được biến đổi theo cách này hòa tan trong nước, mang điện tích âm và không bị phân cắt bởi endonuclease. Khi được lai với vị trí đích, chúng tạo thành song công kích hoạt ribonuclease (RNase), một loại enzyme nội sinh phân cắt mRNA trong một phân tử lai như vậy. Các thử nghiệm lâm sàng đầu tiên của các oligonucleotide như vậy - loại thuốc thuộc "thế hệ đầu tiên" đã được thực hiện. Các mục tiêu là RNA của cytomegalovirus, virus gây suy giảm miễn dịch ở người, cũng như mRNA của các gen gây ra sự phát triển của bệnh ung thư, bệnh đường ruột và các bệnh khác.

Các oligonucleotit "antisense" được tổng hợp với liên kết phosphoramidit và polyamit (peptit) - axit nucleic peptit (peptit nucleicacid, PNA) (Hình 3 V và D ). Các phân tử như vậy rất chống lại tác động của nucleaza. Các nhóm hóa học được gắn vào nguyên tử cacbon 2'của bã đường và nguyên tử C-5 của pyrimidine cũng bảo vệ các oligonucleotide antisense và tạo điều kiện cho chúng liên kết với vị trí đích (Hình 3 2DE ). Tất cả những ưu điểm của những điều này và các sửa đổi khác hiện đang được nghiên cứu chuyên sâu.

Sự thâm nhập của oligonucleotide "antisense" vào tế bào có thể được tạo điều kiện rất nhiều bằng cách đặt chúng vào liposome. Hệ thống phân phối hiệu quả cao này cho phép sử dụng các oligonucleotide "antisense" ở nồng độ thấp. Tuy nhiên, nếu liposome được liên hợp với các kháng thể đặc hiệu cho các biểu mô của một số tế bào của các cơ quan nhất định, thì sẽ có thể thực hiện việc phân phối các oligonucleotide “antisense” có mục tiêu.

Các thử nghiệm tiền lâm sàng được tiến hành đã chỉ ra rằng oligonucleotide "antisense" là những loại thuốc rất hiệu quả. Khả năng sử dụng chúng để điều trị chứng hẹp động mạch vành và động mạch cảnh, dẫn đến các cơn đau tim và đột quỵ, đã được nghiên cứu. Trong những trường hợp này, họ thường dùng đến phương pháp nong mạch, mở rộng động mạch bằng ống thông bóng, nhưng khoảng 40% bệnh nhân chảy máu tái xuất hiện sau 6 tháng, vì nong mạch kích thích tăng sinh tế bào cơ trơn và tiết chất gian bào vào bên trong. lớp của động mạch tại vị trí mở rộng của nó. Trong một trong các thí nghiệm, các oligonucleotide antisense có liên kết thiophosphate, bổ sung cho các protein mã hóa mRNA quan trọng đối với chu kỳ tế bào của động vật có vú, được tiêm vào động mạch cảnh của chuột sau khi nong mạch; Kết quả là tần suất tái phát của các lần tái phát giảm 90%. Tăng sinh tế bào cơ trơn còn gặp trong bệnh lý xơ vữa động mạch, đái tháo đường, biến chứng sau phẫu thuật bắc cầu mạch vành. Có thể, tất cả các trạng thái này có thể được kiểm soát theo những cách tương tự.

Các oligonucleotide antisense cũng có thể được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm trùng do virus và sốt rét. Ngoài ra, kết quả của các thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I để điều trị bệnh Crohn bằng cách uống oligonucleotide "antisense" đã cho thấy hiệu quả điều trị rõ ràng mà không có tác dụng phụ đáng chú ý. Trong trường hợp này, mRNA đích được mã hóa cho loại kết dính gian bào 1, được sản xuất quá mức ở bệnh nhân mắc bệnh Crohn. Nó nhằm mục đích điều tra hiệu quả của cùng một oligonucleotide trong việc điều trị các bệnh viêm nhiễm khác, chẳng hạn như viêm khớp dạng thấp, bệnh vẩy nến và viêm loét đại tràng.

Về nguyên tắc, các oligonucleotide "antisense" có thể tạo thành chuỗi xoắn ba với DNA đích của nhiễm sắc thể và khối phiên mã. Tuy nhiên, tính đặc hiệu của các oligonucleotide "kháng nguyên" vẫn chưa đáp ứng các tiêu chuẩn được áp dụng cho thuốc.

Bản tóm tắt

Tổng quan xem xét các tính năng dược động học của các chế phẩm oligonucleotide antisense khác nhau. Dược động học của thuốc thế hệ thứ nhất và thứ hai đã được so sánh. Và cũng được coi là ảnh hưởng đến dược động học của sự biến đổi hóa học của phân tử.

Từ khóa Từ khóa: antisense oligonucleotides, phosphothioate oligodeoxynucleotides, dược động học

Giới thiệu

Các đặc tính dược động học của các oligonucleotide antisense (ASO) được hiểu rõ nhất khi xem xét các đặc tính vật lý và hóa học của chúng. Các thông số như điện tích, trọng lượng phân tử và bản chất lưỡng tính của phosphothioate ACOs có ảnh hưởng rõ rệt đến dược động học của chúng. Cấu trúc hóa học, đặc biệt, nhóm phosphothioate và 2'-methoxyethyl (MOE), có ảnh hưởng đặc biệt đáng kể đến các đặc tính dược động học của ASO.

Sự hấp thụ, phân phối, chuyển hóa và bài tiết của oligodeoxynucleotide phosphothioate thế hệ thứ nhất (ODN) đã được nghiên cứu rộng rãi trên động vật thí nghiệm và trong các nghiên cứu lâm sàng. Đặc điểm dược động học của các chế phẩm phosphothioate ASO như sau: ODN phosphothioate đường tiêm nhanh chóng tìm thấy chính chúng trong huyết tương, nơi chúng liên kết với các vùng ưa nước của protein huyết tương và do đó tránh được quá trình lọc cầu thận. Các vùng ưa nước này khác biệt với các vùng ưa nước khác mà các thuốc ưa mỡ liên kết với nhau, và do đó có rất ít sự cạnh tranh để gắn kết với protein huyết tương đối với ASO. Động học huyết tương được đặc trưng bởi một giai đoạn phân phối ngắn (theo thứ tự vài giờ) sau đó là một giai đoạn thải trừ với thời gian bán hủy là ngày hoặc tuần. Giai đoạn phân bố ban đầu nhất thiết phải bao gồm sự liên kết của ASO với protein và sự phân bố của các phức hợp này trên các mô của gan, thận, hạch bạch huyết, tủy xương và lá lách, là những vị trí liên kết và tích tụ ASO tích cực nhất. . Rõ ràng là giai đoạn loại bỏ ASO do liên kết với protein ban đầu được xác định bởi giai đoạn đầu của quá trình phân phối của nó. Do khả năng bão hòa của protein , diện tích dưới đường cong dược động học (AUC) tăng lên khi tăng liều, vì ASO không còn liên kết với protein sau khi bão hòa, mà đi vào máu ở dạng tự do. Sau khi liên kết, ASO đi vào tế bào theo một gradient nồng độ từ không gian ngoại bào qua màng tế bào vào không gian nội bào, có lẽ với sự trợ giúp của protein mang. ASO trong tế bào liên kết với các mục tiêu có sẵn, nhưng chủ yếu ASO trong tế bào rất có thể liên kết với protein nội bào. Trong tế bào, các nuclease phổ biến, nhưng không phải là enzym cytochrom P450, chuyển hóa các chế phẩm ASO. Vì các enzym cytochrom P450 thường chuyển hóa các thuốc phân tử nhỏ, các ASO không cạnh tranh trong quá trình trao đổi chất với các hợp chất phân tử nhỏ thông thường, làm giảm nguy cơ tương tác thuốc. Sự bài tiết ASO qua nước tiểu cuối cùng là kết quả của quá trình trao đổi chất trong các mô và thiết lập trạng thái cân bằng của các chất chuyển hóa và chất tự nhiên bên ngoài mô và trong hệ tuần hoàn. Những quá trình này ở động vật thí nghiệm và con người rất giống nhau, đó là lý do tại sao không thể xác định mối tương quan giữa các loài giữa động vật thí nghiệm và con người.

Hiện tại, cấu hình ASO “thế hệ thứ hai”, có các nhóm MOE ở vị trí 2 "của nucleotide ở đầu 3" và 5 ", được sử dụng rộng rãi nhất trong các thử nghiệm lâm sàng. Cấu hình này là cấu trúc tiên tiến hơn so với ODN phosphothioate không biến tính ., là thuốc antisense thế hệ thứ nhất, điều này là do nó làm tăng hiệu quả, giảm độc tính và tăng thời gian bán thải.

Đặc điểm cấu trúc hóa học của ASO

Bộ xương phốt pho

Những nỗ lực đầu tiên để tạo ra các loại thuốc có hoạt tính antisense có liên quan đến việc sử dụng DNA chưa được sửa đổi, thật không may, rất dễ bị phân hủy bởi nuclease. Hóa ra, các nuclease ở khắp nơi cắt đứt các liên kết phosphodiesterase của DNA bản địa, dẫn đến thời gian bán hủy của các ASO không bị biến đổi là vài phút. Sự suy thoái nhanh chóng này là một đặc điểm chính của cấu trúc dược động học của các DNA antisense không bị biến đổi. Thay đổi xương sống phosphodiester của DNA thành phosphothioate làm thay đổi mạnh mẽ đặc điểm dược động học của ASO. Trong các chế phẩm này, cấu trúc phosphothioate thay thế một nguyên tử lưu huỳnh trong liên kết phosphodiester bằng một nguyên tử oxy không bắc cầu. Cấu trúc này làm tăng sức đề kháng của ASO đối với các nucleaza và do đó, cải thiện các đặc tính động học của chúng.

Phosphothioate chirality

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự dày lên của bộ xương diester của ACO không chỉ làm tăng khả năng chống lại nuclease của nó mà còn góp phần vào sự xuất hiện của tính không đối xứng, nghĩa là, khả năng tồn tại của các đồng phân lập thể, tại mỗi liên kết phosphothioate, dẫn đến thực tế rằng trong ACO 20-mer bất kỳ có 219 đồng phân lập thể Sp hoặc Rp. Sự kết hợp giữa kháng nuclease và tăng liên kết với protein ảnh hưởng mạnh đến dược động học của ASO. Tăng tính ổn định của phosphothioate ASO dẫn đến thực tế là thời gian bán hủy của thuốc từ huyết tương tăng lên 30-60 phút so với thời gian bán hủy của phosphodiester ASO là 1-2 phút.

Khả năng kháng nucleaza và tính đối xứng do sự thay thế phosphodiester bằng các liên kết phosphothioate là điều đáng bàn vì các đặc tính vật lý liên quan đến đặc điểm cấu trúc này rất quan trọng đối với cả ASO thế hệ thứ nhất và thứ hai. Khả năng chống lại các nucleaza của phosphothioat ASO phát sinh do sự gần gũi của lưu huỳnh với oxy không ngưng kết ở vị trí hoạt động của exonuclease với ion kim loại. Sự gần gũi này có thể gây ra sự dịch chuyển của ion kim loại khỏi vị trí hoạt động. Hiệu ứng này đã được chứng minh trong mô hình exonuclease 3'– 5 'DNA polymerase. Dữ liệu tinh thể học tia X ủng hộ giả thuyết này về sự dịch chuyển của ion kim loại. Sự khác biệt rõ ràng về độ nhạy của đồng phân lập thể đối với hoạt tính exonuclease của DNA polymerase phù hợp với cấu trúc đề xuất của đồng phân lập thể ODN phosphothioate ở vị trí hoạt động. Có khả năng là tính không đối xứng của các liên kết phosphorothioate có thể cản trở các nuclease khác theo cách tương tự, tức là bằng cách dịch chuyển ion kim loại, mặc dù các exonuclease khác nhau có thể cho thấy các ưu tiên khác nhau đối với các liên kết Rp và Sp tùy thuộc vào bản chất của vị trí hoạt động của enzyme.

Ngoài ra, lưu huỳnh có thể đơn giản thay thế oxy trong các liên kết diester. Sự khác biệt về khả năng mang điện tích âm của lưu huỳnh so với oxy, giúp dự đoán những thay đổi ở vị trí hoạt động. Sự thay đổi này rất có thể là do sự thủy phân các liên kết photphodiester, và có thể là do sự hình thành một photpho ngũ giác thoáng qua với hai nguyên tử oxy mang điện tích âm. Việc thay thế một trong những nguyên tử oxy ở xích đạo bằng lưu huỳnh sẽ có những tác động tiêu cực đến hoạt động của enzym: (1) liên kết với nước bị giảm, làm ổn định điện tích âm cục bộ trên các nguyên tử, do đó khó có được điện tích âm thứ hai trên lưu huỳnh; và (2) giảm liên kết của Mg 2+ với lưu huỳnh. Có bằng chứng cho tác dụng sau này trong các nghiên cứu về mức độ phân cắt ribozyme của các thể vùi phosphorothioate không đồng phân đối quang, khi việc bổ sung Mg 2+ sẽ ức chế tác dụng phân cắt của ribozyme phosphorothioate. Ngoài ra, nó đã được chứng minh rằng có một số giảm hoạt động của nuclease trong các vùng xương xa hơn các liên kết phosphothioate, cho thấy sự truyền hiệu ứng chirality. Hiện tượng này được giải thích tốt nhất là do những thay đổi trong sự sắp xếp của các phân tử nước xung quanh xương sống phosphothioate so với xương sống phosphodiester.

Các tác dụng đặc hiệu nổi trên hoạt tính của nuclease ảnh hưởng đáng kể đến dược động học của các ASO phosphorothioate, và điều này được biểu hiện rõ ràng nhất ở tốc độ chuyển hóa của các ASO phosphorothioate thế hệ thứ nhất trong huyết tương. Tỷ lệ đào thải hoàn toàn ASO khỏi huyết tương giảm, cho thấy sự chậm lại trong chuyển hóa. Những thay đổi về tốc độ này không thể được giải thích chỉ về mặt động học bậc nhất, nhưng chúng có thể được giải thích bởi sự khác biệt về tính nhạy cảm của các liên kết Rp và Sp.

Sự khác biệt đặc hiệu nổi trong hoạt tính exonuclease ít quan trọng hơn đối với ASO thế hệ thứ hai. Điều này là do ASO của thế hệ thứ hai có 2 "sửa đổi ở đầu 3" và 5 ", điều này ngăn cản sự phân cắt của chúng bởi exonuclease. Sử dụng endonuclease được phân lập từ mầm bệnh Serratia marcescens, ảnh hưởng của sự liên kết của liên kết phosphorothioate đã được nghiên cứu. Theo cách tương tự như các exonucleases, nó là một trong những oxy không bắc cầu để thủy phân các liên kết phosphodiester. Enzyme giảm, trong khi ở Rp đồng phân đối quang thì không. không được biết. Tuy nhiên, nếu chúng tôi giả định rằng phản ứng diễn ra theo một sơ đồ tương tự như Serratia endonuclease, chúng tôi có thể giả định rằng trang web đang hoạt động sẽ chứa và nó là một kim loại (có thể là Mg 2+) và lưu huỳnh sẽ ảnh hưởng đến hoạt động của nucleaza , khi nó được định hướng cho các ion kim loại. Nếu endonuclease nhạy cảm với sự bất đối xứng, điều này có thể có ý nghĩa quan trọng đối với sự phát triển của vấn đề tạo ra các loại thuốc thế hệ thứ hai hiệu quả. Cũng như ảnh hưởng của chirality đối với các thuốc thế hệ đầu tiên, tác động bất đối xứng trên sự chuyển hóa của các thuốc thế hệ thứ hai có thể dẫn đến sự chuyển hóa của chúng chậm lại. Vì vậy, chẳng hạn, có thể giả định rằng các đồng phân lập thể chuyển hóa nhanh sẽ bị phá hủy một cách chọn lọc, chỉ để lại các đồng phân chuyển hóa chậm hoạt động.

ASO liên kết với protein

Người ta thấy rằng, so với ASO có bộ xương phosphodiester, dược động học của cấu trúc phosphothioate bị ảnh hưởng đáng kể bởi sự liên kết của chúng với protein. Cơ sở hóa học của việc tăng liên kết protein là sự tăng tính ưa béo của liên kết phosphothioate so với liên kết phosphodiester. Vì tương tác phân tử với nước được xác định bởi hình thức và chức năng của các đại phân tử trong dung dịch nước, nên ngay cả những thay đổi nhỏ về tính ưa béo của bộ xương dọc theo toàn bộ chiều dài của ASO cũng có thể gây ra hậu quả cho sự tương tác của oligomer với nước và các đại phân tử như protein.

Theo ước tính đầu tiên, ODN phosphothioate liên kết với protein tế bào ngẫu nhiên hơn ODN phosphodiester. Tại sao các ASO phosphothioate liên kết tốt hơn với protein vẫn chưa được hiểu đầy đủ. Các giải thích có thể cho thấy tăng tính ưa béo và tạo phức với các ion kim loại.

Không thể đánh giá quá cao tầm quan trọng của liên kết với protein huyết tương đối với dược lý học, dược động học và độc tính của các ASO phosphothioate (cả thế hệ thứ nhất và thứ hai). Ở mức nồng độ vi cực, hơn 90% ODN phosphothioate được liên kết trong huyết tương. Có sự khác biệt cụ thể về tỷ lệ phần trăm và độ bền của liên kết protein, cũng như sự khác biệt về chất trong liên kết của ASO với các protein cụ thể ở các loài khác nhau. Sự liên kết của các ASO phosphothioate với protein tuần hoàn giúp các hợp chất này không bị cầu thận lọc và bài tiết qua nước tiểu. Trong trường hợp bão hòa, ví dụ, khi dùng một liều lớn ASO, bài tiết ASO toàn thời gian qua nước tiểu được tăng cường. Do sự khác biệt giữa các loài, độ bão hòa ở các loài khác nhau được xác định bởi các nồng độ ASO khác nhau. Ví dụ, protein huyết tương của chuột có ái lực với ASO thấp hơn so với của chuột hoặc người. Do đó, hiệu ứng bão hòa của quá trình liên kết ASO với protein huyết tương ở chuột xảy ra ở nồng độ thấp hơn so với các loài khác. Sự khác biệt giữa các loài trong liên kết với protein huyết tương là một yếu tố đáng kể dẫn đến sự khác biệt về dược động học giữa các loài.

Kháng nucleaza và liên kết với protein, đặc trưng của ASO với liên kết phosphothioat, cũng làm thay đổi dược động học của liệu pháp ASO. Các cấu trúc hóa học bổ sung, đặc trưng của thế hệ thứ hai của các loại thuốc được tạo ra, tạo ra những thay đổi khác trong dược động học của chúng.

Các dẫn xuất metoxyetyl ​​của ACO

ASO thế hệ thứ hai được phát triển để cải thiện một số đặc điểm của ODN thế hệ đầu tiên. Do đó, các cấu trúc phosphothioate được thêm vào các nhóm MOE ở vị trí 2 "làm tăng khả năng chống lại nuclease của chúng và thay đổi hiệu quả liên kết protein.

MOE kháng nucleaza

Người ta đã chỉ ra rằng cấu trúc của MOE ảnh hưởng đến khả năng kháng nuclease của ASO. Trong khi cấu trúc phosphothioate làm giảm hoạt tính của exonuclease, thì cấu trúc ở vị trí 2 "hầu như loại bỏ hoạt tính của exonuclease. Kháng nucleaza có thể là kết quả của (1) sự thay thế của hydro 2" cho MOE, (2) hiệu ứng thép của MOE, hoặc (3) hình thành lớp vỏ nước cứng xung quanh khung ASO. Dù lý do đề kháng với nuclease là gì, sự hiện diện của nhóm MOE làm cho ASO bị thay đổi ở vị trí 2 "thực tế miễn dịch với các tác động của các nuclease tế bào và tuần hoàn. Vùng trung tâm của khung ASO, bao gồm deoxyphosphothioates, gần như không kháng lại sự phân cắt qua trung gian nuclease. Sự khác biệt về ASO của thế hệ thứ nhất và thứ hai ở các vị trí chịu sự trao đổi chất, sự khác biệt trong các kiểu trao đổi chất cũng xác định.

Khi đánh giá các dạng chuyển hóa bằng điện di gel mao quản (CGE) hoặc sắc ký lỏng / khối phổ (LC / MS), không tìm thấy chất chuyển hóa nào ngắn hơn một nucleotide. Hầu hết, các chất chuyển hóa bị phân cắt ở vị trí deoxy (có lẽ là bởi endonuclease) đã được tìm thấy, con đường chuyển hóa xa hơn là làm giảm kích thước của các sản phẩm phân cắt. Kháng exonuclease và chuyển hóa chậm dưới ảnh hưởng của endonuclease hoạt động dẫn đến sự hình thành các hợp chất được đặc trưng bởi thời gian bán hủy dài .

Liên kết MOE với protein

Các nghiên cứu thực nghiệm đã chỉ ra rằng các ASO phosphothioate có cấu trúc 2'-MOE có ái lực thấp hơn với protein huyết tương so với các ASO phosphothioate không biến tính. Khoảng 18 đến khoảng 40 μM. Đồng thời, trong cấu trúc MOE được thay thế hoàn toàn của ASO, ái lực với protein huyết tương chỉ giảm nhẹ. Tại sao sự gia tăng số lượng cấu trúc MOE trong một oligonucleotide không ảnh hưởng đến việc giảm ái lực hơn nữa với protein huyết tương vẫn chưa được rõ ràng, nhưng điều này có thể là do các đặc điểm của cấu trúc thứ cấp ASO.

Sự giảm ái lực của protein liên quan đến cấu trúc MOE có thể được biện minh bởi một số đặc tính vật lý. Có lẽ yếu tố vật lý quan trọng nhất giúp phân biệt các MOE ASO đã sửa đổi với các ASO không biến đổi là sự hiện diện của lớp vỏ phân tử nước, hình thành từ chuỗi bên MOE. Các nhóm thế MOE trong các phân tử nước "chelate" xương sống hydrocacbon (và có thể là các ion kim loại), tạo thành một lớp vỏ nước và giảm tiếp xúc tiềm năng giữa các phân tử lưu huỳnh "dính" với huyết tương hoặc protein tế bào. Mức độ liên kết của ASO với protein tương quan nghịch với sự bài tiết của chúng qua nước tiểu. Sự ra đời của liên kết phosphothioate và nhóm thế 2'-MOE làm thay đổi liên kết protein và kết quả là làm thay đổi các đặc tính của ASO.

Hấp thụ, phân phối, chuyển hóa và bài tiết ASO

Hút

Đường tiêm ASO

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng do trọng lượng phân tử (khoảng 7000 D) và các điện tích âm của ASO, sự hấp thu của các thuốc này qua đường tiêu hóa bị hạn chế. Đó là lý do tại sao đường tiêm của họ thường được sử dụng. Truyền dưới da, tiêm tĩnh mạch hoặc tiêm trong da được sử dụng để quản lý các loại thuốc thế hệ đầu tiên. Hoạt tính chống viêm thấp hơn của ASO thế hệ thứ hai làm cho chúng thích hợp hơn để tiêm dưới da. Dược động học của các thuốc này trong huyết tương khi tiêm dưới da và truyền tĩnh mạch là tương đương nhau. Các nghiên cứu trên động vật thí nghiệm cho thấy, cuối cùng, sự phân bố ASO cũng có thể so sánh được trên các cơ quan khác nhau, ngoại trừ vị trí tiêm và các hạch bạch huyết.

Sau khi tiêm dưới da, cả ASO thế hệ thứ nhất và thứ hai được hấp thu nhanh chóng từ vị trí tiêm vào hệ tuần hoàn. Trong các nghiên cứu lâm sàng, sau khi tiêm dưới da ASO thế hệ thứ hai, thời gian để đạt nồng độ tối đa (T max) trong khoảng từ 1,5 đến 4,7 giờ trong khoảng liều từ 25 đến 200 mg với thể tích không đổi là 1 ml. Khả dụng sinh học của liều tiêm dưới da từ 36 đến 82% liều dùng. Các nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng cho thấy sinh khả dụng của ASO tăng lên khi cô đặc.

Động học của ASO tại vị trí tiêm có thể ảnh hưởng đến phản ứng cục bộ cũng như động học toàn thân và sự phân bố của chúng. Giảm nồng độ ASO tại vị trí tiêm theo giả thuyết làm giảm đáp ứng tại chỗ với tiêm. Một cách tiếp cận để giảm nồng độ ASO tại vị trí tiêm là pha loãng dung dịch và do đó, tăng diện tích bề mặt hấp thụ từ kho dưới da. Về mặt lý thuyết, sự pha loãng của các dung dịch và diện tích bề mặt hút lớn nên làm giảm nồng độ cục bộ và giảm các phản ứng cục bộ. Tác dụng tương tự có thể được mong đợi với sự gia tăng hấp thu toàn thân. Do đó, những thay đổi về liều lượng và thể tích có thể được coi là những biến số tiềm ẩn. Tuy nhiên, ngay cả ngày nay, việc tiêm dưới da với thể tích thấp và nồng độ tương đối cao chứng tỏ khả dụng sinh học cao của vật liệu được áp dụng.

Quản lý địa phương của ASO

Một nghiên cứu về các phương pháp quản lý ASO khác nhau chứng minh rằng các dạng khí dung, tiêm trực tràng và tiêm trong dạ dày của chúng được sử dụng như các phương tiện quản lý tại chỗ. Để điều trị các bệnh phổi, có thể tạo ra nồng độ ASO tương đối cao trong phổi bằng cách sử dụng khí dung.

Động học của ODN thế hệ đầu tiên đã được nghiên cứu trên chuột. Người ta đã chứng minh rằng động học của các thuốc này phụ thuộc vào liều lượng, độ thanh thải qua phổi với thời gian bán thải khoảng 2 giờ. Ngược lại, các nghiên cứu về MOE ASO thế hệ thứ hai được sửa đổi cho thấy thời gian bán hủy kéo dài hơn 4 ngày. Cũng như các phương pháp điều trị tại chỗ khác, ưu điểm của đường hô hấp là khả năng tạo ra nồng độ cục bộ cao trong các mô thường không tích tụ các chất được bôi. Trong phổi, ASO thường không tích tụ sau khi dùng đường tiêm. Chính quyền địa phương cũng hiếm khi gây ra các ảnh hưởng toàn thân. Ví dụ, khi ASO được dùng cho khỉ với liều 0,1 mg / kg qua đường hô hấp (ba liều trong 1 tuần), nồng độ của thuốc trong phổi xấp xỉ 1 μg / g. Nhưng ở những con khỉ này, nồng độ trong gan và thận xấp xỉ 5% nồng độ trong phổi, cho thấy tác dụng toàn thân nhỏ hơn đáng kể.

Dữ liệu tài liệu chỉ ra rằng việc sử dụng ASO qua đường trực tràng được sử dụng thành công để điều trị viêm loét đại tràng. Ngược lại với đường hít, nơi có thể sử dụng một lượng nhỏ chất được tiêm vào, thuốc xổ được sử dụng để điều trị có thể chứa tới 240 mg chất (alicaforsen) của thế hệ đầu tiên. Trong trường hợp này, biểu mô trực tràng tiếp xúc với chất được tiêm, tuy nhiên, do tính thẩm thấu kém của các ODN tích điện cao, nên có rất ít sự hấp thu thuốc cũng như tác dụng toàn thân nói chung. Tính toán cho thấy nồng độ ASO trong biểu mô ruột 12 giờ sau khi dùng thuốc là 20 µg / g. Sinh khả dụng ở người dao động từ 0,03 đến 2,14% và nồng độ tối đa của ASO xác định được trong huyết tương chỉ là 0,126 µg / ml. Việc không có sự hấp thu toàn thân đáng kể và nồng độ thuốc tại chỗ cao có ảnh hưởng tích cực đến việc điều trị.

Một nghiên cứu đã được thực hiện về việc tiêm các chế phẩm ASO vào cơ thể ở cả thế hệ thứ nhất và thứ hai. Trong trường hợp này, các chất được tiêm vào mắt với một lượng rất nhỏ. Do cách ly vị trí tiêm, tác dụng toàn thân của thuốc giảm đến mức thậm chí còn lớn hơn. Trong mắt, thể thủy tinh và võng mạc, ASO xâm nhập với tốc độ khác nhau: nó đi vào thể thủy tinh nhanh hơn so với võng mạc. Cả chuyển hóa tại chỗ và khuếch tán từ mắt đều góp phần đào thải thuốc. Như đã lưu ý, do lượng nhỏ, tác dụng toàn thân của thuốc được sử dụng là tối thiểu. Tuy nhiên, cơ chế phân phối toàn thân tương tự như hầu hết các thuốc khác.

Quản lý đường ruột của ASO

Sự ổn định được ghi nhận của ASO thế hệ thứ hai đối với nuclease đảm bảo sự ổn định của thuốc trong ruột, giúp thuốc có thể được hấp thu hơn nữa. Tuy nhiên, kích thước của phân tử và điện tích của ACO hạn chế sự hấp thu của thuốc. Sau khi hấp thu từ ruột, động học của ASO tương tự như động học của nó khi dùng đường tiêm. Mặc dù gan là một trong những vị trí chính của sự tích tụ ASO, tác động đầu tiên qua gan không phải là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến động học của thuốc ASO.

Phân phối ASO trong cơ thể

Vai trò của tưới máu và ái lực của mô

Sự phân bố của ASO và các thuốc khác phụ thuộc vào độ thẩm thấu, cường độ cung cấp máu, liên kết với protein huyết tương, mô và tế bào. Người ta đã chỉ ra rằng sự phân bố của các ASO phosphothioate thế hệ thứ nhất và thứ hai trong các mô có nhiều điện tích âm và liên kết của chúng với protein ít phụ thuộc nhất vào nguồn cung cấp máu và phụ thuộc nhiều hơn vào các yếu tố ảnh hưởng đến sự vận chuyển của chúng vào tế bào.

Sự phân bố bên trong từ huyết tương đến các mô tương đối nhanh, thời gian bán thải từ 30-90 phút sau khi tiêm tĩnh mạch. Thời gian bán thải của ASO sau khi tiêm dưới da dài hơn sau khi tiêm tĩnh mạch. Sự khác biệt này là do thời gian hấp thu cần thiết chứ không phải do sự khác biệt khác về dược động học.

Nghiên cứu về động học của thuốc thế hệ thứ nhất và thứ hai đã ghi nhận những khác biệt nhỏ của nó. Độ ổn định cao hơn đối với các nuclease ASO thế hệ thứ hai được bù đắp bằng khả năng liên kết thấp hơn của chúng với protein. Cùng với đó, cấu trúc dược động học của thuốc thế hệ thứ nhất và thứ hai tương tự hoặc gần như không thể phân biệt được khi tổng ASO bản địa và các chất chuyển hóa của nó (ASO tổng số) của thế hệ đầu tiên được so sánh với thuốc thế hệ thứ hai còn nguyên vẹn (ISIS 13650). Nếu không, sự phá hủy ASO nhanh hơn bởi các exonucleases sẽ rút ngắn thời gian bán hủy của thuốc thế hệ thứ nhất so với thuốc thế hệ thứ hai. Sự phân bố thuốc của cả hai thế hệ phụ thuộc vào liều lượng.

Như đã lưu ý ở trên, sau khi hấp thụ từ vị trí tiêm hoặc ruột, ASO liên kết với protein huyết tương. Hai protein huyết tương liên kết đặc biệt với các ASO phosphothioate là albumin và alpha-2-macroglobulin. Một protein phổ biến khác, axit glycoprotein, không liên kết ASO. Liên kết với protein rất quan trọng đối với sự phân bố ASO trong mô đích. Các cấu trúc hóa học giảm liên kết dẫn đến giảm rõ rệt nồng độ của thuốc trong mô, làm tăng mức độ lọc qua cầu thận và bài tiết qua nước tiểu. Hiện tượng này có thể được quan sát thấy khi sử dụng ASO với các liên kết diester trong khung của chế phẩm hoặc khi có cấu trúc MOE. Sự giảm ái lực của diesters và cấu trúc MOE (hoặc cả hai) đối với protein cho phép ASO lưu thông tự do hơn trong máu, dẫn đến tăng cường bài tiết qua nước tiểu.

Trong tất cả các nghiên cứu với ASO thế hệ thứ nhất và thứ hai đường tiêm, chúng tôi không quan sát thấy sự thanh thải tuyến tính của ASO khỏi huyết tương. Độ thanh thải giảm khi tăng liều lượng thuốc, và do đó, khả dụng sinh học của nó lớn hơn mong đợi từ liều dùng. Vì độ thanh thải ban đầu là do sự phân bố của ASO trong các mô và đồng thời, sự hấp thụ thuốc của các mô đã được quan sát thấy, nên người ta có thể giả định khả năng bão hòa của chúng với ASO. Việc nghiên cứu quá trình bão hòa do sự ra đời của ASO có thể được thực hiện bằng cách sử dụng các tế bào gan. Khi liên kết của ASO với các tế bào Kupffer đạt đến độ bão hòa, sự giảm ái lực sẽ bắt đầu. Việc sử dụng ASO sau đó cho chuột cải thiện sự phân bố ASO đến các tế bào gan không thực bào, và kết quả là hoạt tính dược lý trong tế bào gan được cải thiện so với đối chứng. Ngược lại, ở nồng độ huyết tương dưới 1 µg / ml, ASO liên kết tích cực hơn với tế bào Kupffer và tích lũy ít hơn trong tế bào gan.

Nghiên cứu quá trình liên kết ASO với protein huyết tương cho thấy tác dụng này đi kèm với sự phân bố nhanh chóng của phức hợp trong các mô trên bề mặt tế bào. Mặc dù cơ chế chính xác của liên kết tế bào chưa được thiết lập, có thể giả định rằng ASO liên kết với protein huyết tương hoặc với protein tế bào miễn là có các vị trí liên kết tự do. Các ASO liên kết sau đó được phân phối dọc theo gradient nồng độ trên màng tế bào bằng cách trao đổi một protein ngoại bào lấy một protein nội bào.

Do đó, động lực của ASO xâm nhập vào tế bào là gradient nồng độ. Chuyển động con thoi của ASO giữa tế bào chất và nhân đã được mô tả. Nói chung, rõ ràng là liên kết protein tạo điều kiện thuận lợi cho sự di chuyển của ACO qua các rào cản thường ức chế sự chuyển động của các phân tử ưa nước tích điện cao. Cơ chế tàu con thoi màng này vẫn là một giả thuyết đối với ASO, nhưng trước đây đã được mô tả cho các hợp chất cơ kim. Sự vận chuyển ASO từ chất nền ngoại bào vào không gian nội bào được hình dung trong gan của chuột bằng phương pháp hóa mô miễn dịch và trong thận của chuột bằng kính hiển vi quan trọng có nhãn huỳnh quang cho ASO thế hệ thứ hai (S. Henry, B. Molitoris).

Người ta vẫn chưa biết danh tính của các protein kiểm soát sự vận chuyển ASO từ ngoại bào vào không gian nội bào, nhưng người ta tin rằng sự gắn kết của phức hợp protein-ASO với tế bào được thực hiện bằng cách sử dụng thụ thể thực bào. Vì các tế bào thực bào, chẳng hạn như tế bào Kupffer, đại thực bào mô và tế bào ống lượn gần, có ái lực cao với ASO, người ta có thể nghĩ đến khả năng tìm thấy các thụ thể như vậy trên bề mặt tế bào của chúng.

Tuy nhiên, sự phân bố tế bào và dược lực học của ASO ở chuột chuyển gen thiếu thụ thể thực bào SR-A I / II không khác với ở động vật phối hợp đối chứng. Do đó, thụ thể này, được gọi là thụ thể Scavenger, dường như không chịu trách nhiệm về sự hấp thu phức hợp của gan và thận. Vai trò của các cấu trúc chất nhận khác liên quan đến quá trình nội bào của phức hợp ACO-protein vẫn chưa được nghiên cứu.

Các protein màng có chức năng như chất mang , có mặt trong tất cả các sinh vật. Các chất vận chuyển ma túy chính là: ABC ( Bộ vận chuyển cassette liên kết ATP) và SLC (họ chất mang chất tan). Người ta đã biết rằng tốc độ truyền các chất qua màng sinh học sử dụng các quá trình được trung gian bởi các chất vận chuyển được đặc trưng bởi độ bão hòa. Một số thành viên của gia đình SLC với các tính năng đã biết được mô tả , chủ yếu để vận chuyển nucleoside, đường nucleoside và đường phosphate. Có ý kiến ​​cho rằng các nghiên cứu trong tương lai rất có thể sẽ liên quan đến các quá trình vận chuyển nội màng ASO.

Rõ ràng rằng, ngoài sự khác biệt ở trên về sự tích tụ của các cấu trúc được tạo ra bởi các cơ quan và mô khác nhau và sự phụ thuộc của độ thanh thải và phân bố của các hợp chất đó vào liều lượng của chúng, sự phân bố ASO trong mô bị ảnh hưởng bởi các hệ thống vận chuyển, đặc điểm của lưu lượng máu của các cá nhân, thời gian lưu trú có thể có của thuốc trong cơ thể, và cuối cùng, độ bão hòa của mô với ASO. Mặc dù vai trò quan trọng của các yếu tố này trong quá trình phân bố ASO ở mô, người ta tin rằng sự gắn kết ban đầu của ASO với bề mặt tế bào là một trong những yếu tố quyết định trong các cơ chế được phân tích. Kết luận này dựa trên thực tế là gan và thận là những vị trí ban đầu của ASO liên kết với một số tích lũy bổ sung trong 24 giờ đầu tiên sau khi sử dụng ASO. Khi nghiên cứu các thông số phân bố của ASO trong gan và thận, nồng độ của thuốc trong các cơ quan trong 24 giờ đầu tiên đã được chỉ ra. Điều này xảy ra trong thời kỳ phân phối lại tế bào và dưới tế bào của ASO, nhưng có lẽ, các cơ quan phân phối sơ cấp sẽ tích lũy nhiều vật chất hơn theo thời gian do ái lực của các cơ quan này đối với ASO lớn hơn. Các protein chịu trách nhiệm về ái lực này có thể chứa các vị trí liên kết giống như heparin đối với laminin và fibrinogen, và yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (FGF). Tương tác ban đầu của ASO với tế bào có thể là do sự liên kết của các protein này, nhưng bản chất của các protein này, như đã nói ở trên, còn rất ít được nghiên cứu.

Xem xét ý nghĩa của sự kết hợp các vị trí liên kết ASO cụ thể với các tế bào trong việc phân phối thuốc trong cơ thể, người ta cũng cần lưu ý một yếu tố quan trọng như nguồn cung cấp máu khác nhau cho các cơ quan khác nhau, khả năng ảnh hưởng đến sự phân bố khác nhau của phosphothioate ASO là hiển nhiên. Theo các tác giả khác nhau, nghiên cứu với hàng chục loạt chất của cả thế hệ thứ nhất và thứ hai cho thấy sự phân bố tương tự của chúng, và sự phân bố tương tự đáng chú ý ở các cá thể thuộc các loài khác nhau. Thận, gan, hạch bạch huyết, lá lách và tủy xương là những cơ quan tích tụ lượng ASO lớn nhất và các chất chuyển hóa của chúng. Thực tế là phổi và tim không tích tụ ASO chỉ ra rằng để giải thích sự tích tụ rõ rệt của ASO trong gan và thận, chỉ một lời giải thích về khả năng cung cấp máu tốt của chúng là không đủ. Ví dụ, các khu vực lưu thông máu tốt nhất trong thận là cầu thận, và chúng không phải là khu vực chứa nhiều ASO hơn. Ngược lại, ở các ống lượn gần, tuần hoàn máu kém hoạt động hơn. Tuy nhiên, các tế bào của ống lượn gần được đặc trưng bởi một số lượng lớn các tế bào thực bào tích cực, tích lũy các ASO tự do, cũng như các ASO liên kết với các protein thường được tái hấp thu ở các ống gần. Kết quả là, vỏ thận và biểu mô ống gần chứa nồng độ phosphothioate ASO cao nhất, cả thế hệ thứ nhất và thứ hai.

Cũng cần lưu ý rằng nguồn cung cấp máu (ml / g mô) của gan xấp xỉ 20% lượng máu của thận. Sự khác biệt 4-5 lần về tưới máu giữa thận và gan không dẫn đến sự khác biệt 4-5 lần về nồng độ ASO trong các cơ quan này. Các mao mạch nóng lên làm tăng diện tích tiếp xúc giữa ASO và lưu lượng máu, do đó, điều này có thể bù đắp cho sự tưới máu không đủ của gan so với thận.

ASO liên kết với protein huyết tương trong quá trình phân phối

Mặc dù sự bão hòa của các tế bào với ASO cuối cùng ảnh hưởng đến sự phân bố của chúng trong các cơ quan, sự gắn kết của ASO với protein huyết tương có thể thay đổi sự phân bố trong thận và gan theo từng loạt khác nhau. Có sự khác biệt nối tiếp trong liên kết protein. Với sự giảm liên kết ASO với protein huyết tương, sự tích tụ của chúng trong gan giảm và sự tích tụ của chúng trong thận tăng lên. Ngược lại, với tính liên kết cao hơn, nồng độ ASO ở dạng tự do trong máu sẽ ít hơn, tích tụ ít hơn ở thận và nhiều hơn ở các cơ quan khác. Có một mối quan hệ nghịch đảo giữa mức độ liên kết ASO với protein và sự tích tụ của chúng trong thận của chuột và khỉ sau khi tiêm tĩnh mạch và tiêm dưới da lặp đi lặp lại.

Sự gắn kết với protein có thể được sử dụng như một tiêu chí lựa chọn ASO cho các thử nghiệm lâm sàng. Cho đến nay, việc xác định liên kết protein là một quá trình thực nghiệm không có cách nào để dự đoán chuỗi nào sẽ liên kết nhiều hay ít với protein.

Phân phối ASO đến các cơ quan khác

Bất kể trình tự phân bố các ASO phosphothioate của thế hệ thứ nhất và thứ hai, mô hình khu trú đặc trưng của các thuốc này trong thận và gan, cũng như trong lá lách và các hạch bạch huyết, xương và trong tế bào chất của tế bào mỡ được quan sát thấy. Sự tích tụ ASO trong mô bạch huyết có thể được giải thích một phần do hoạt động thực bào của tế bào mô và các tế bào đơn nhân khác. Có thể hình dung ASO trong các phagolysosome của tế bào mô và các mô đại thực bào bằng phương pháp nhuộm hematoxylin. Nó đã được chứng minh rằng ASO trải qua quá trình nội bào, khu trú trong các nội bào, và vẫn nằm trong các cấu trúc này. Nồng độ ASO trong các phagolysosome thường đến mức có thể xác định được bằng cách nhuộm hematoxylin (gần giống như DNA nhân). ASO trong các phagolysosome có thể tạo nên phần lớn ASO được tích lũy trong lá lách và các cơ quan bạch huyết. Ngoài ra, các tế bào hoạt động thực bào của xương và tủy xương tích tụ ASO trong các mô này, điều này được xác nhận bởi sự hiện diện của các hạt ưa bazơ trong tế bào của chúng.

Cơ bắp (cả xương và tim) không chứa một lượng ASO đáng kể. Tuy nhiên, việc kiểm tra kỹ các cơ bằng các phương pháp hóa mô miễn dịch hoặc tự ghi cho thấy hàm lượng ASO trong các phagolysosome của đại thực bào mô đệm cơ và sự tích tụ này có thể ảnh hưởng một phần đến việc đo nồng độ ASO trong cơ và tim.

Sự tích tụ ASO trong tế bào chất của tế bào mỡ là rất quan trọng theo quan điểm điều trị. Đặc biệt là bởi vì, không giống như hầu hết các chất được tích lũy trong tế bào mỡ, ASO có tính ưa nước. Các phương pháp hóa mô miễn dịch cho thấy rõ ràng ASO được tìm thấy trong phần tế bào chất của tế bào mỡ, trong khi ASO hầu như không có trong không bào mỡ. Cường độ của sự nhuộm màu cho thấy sự tích tụ đáng kể của chất trong tế bào chất. Ví dụ, ở khỉ sau 13 tuần điều trị với ISIS 113715 với liều 10 mg / kg / tuần, nồng độ trong gan là 301 ± 88,1 μg / g, nhưng chỉ có 37,3 ± 14,4 μg / g trong mô mỡ ở động vật giống nhau.

Xem xét rằng thành phần không chất béo chiếm 10% tổng khối lượng chất béo, việc hiệu chỉnh nồng độ ASO, có tính đến chỉ số này, cho thấy khả năng so sánh của nồng độ của nó với thành phần trong gan. Nồng độ đáng kể của ASO trong tế bào mỡ cho thấy chúng có thể được sử dụng để điều trị các bệnh di truyền của loại tế bào này: nguồn hormone và cytokine. Do đó, người ta thấy rằng nồng độ hoạt tính dược lý của ASO được ghi lại trong tế bào mỡ của chuột khi ISIS 113715 được sử dụng với liều 25 mg / kg hai lần một tuần và làm giảm sự biểu hiện của gen đích PTP-1B cả ở gan và ở tế bào mỡ. Các quan sát tương tự cũng được thực hiện trên những con khỉ được điều trị bằng ASO ISIS 113715. Vì sinh thiết mỡ dưới da có thể được thực hiện trên lâm sàng và vì ASO hoạt động tích tụ trong chất béo, chất béo có thể được sử dụng để sinh thiết và đo trực tiếp tác dụng dược lý (giảm mRNA) và nồng độ mô của thuốc trong mô người.

Phosphothioate ASO cũng được phân phối đến các mô khác. Các nghiên cứu hóa mô miễn dịch cho thấy các tế bào nội mô tích tụ ASO ở nồng độ đủ để làm giảm mức mRNA, khiến chúng trở thành mục tiêu tiềm năng cho can thiệp dược lý. Trong một số mô, nồng độ của chúng không đủ cao để có tác dụng dược lý. Ví dụ, các tế bào lympho trưởng thành không tích tụ ASO, và hoạt động antisense bị giới hạn bởi các tế bào T.

Các tế bào xương, đặc biệt là các nguyên bào xương hoạt động thực bào, có thể tích tụ ASO và hiệu ứng này có thể được sử dụng cho các mục đích điều trị. Ngoài ra, các tế bào đảo tụy cũng tích tụ ASO. Cả ASO thế hệ thứ nhất và thứ hai đều là những phân tử ưa nước, tích điện cao và không vượt qua hàng rào máu não hoặc máu tinh hoàn. Tuy nhiên, cũng như trong cơ, các đại thực bào chứa ASO có thể phát hiện được khu trú ở vùng kẽ của tinh hoàn. Buồng trứng không bị ngăn cách bởi một hàng rào, vì vậy ASO có thể được đo định lượng trong buồng trứng và hiển thị bằng hóa mô miễn dịch trong chất đệm.

Sự phân bố hạn chế của ASO huyết tương đến các tế bào não và tế bào cơ tim khiến các mô này không có khả năng trở thành mục tiêu của nhiễu đối âm, mặc dù sự ức chế hoặc biểu hiện có chọn lọc của một số protein kênh ion trong não và cơ có thể có lợi về mặt điều trị. Tuy nhiên, sự phân bố hạn chế của ASO trong các mô này có thể được coi là một lợi thế. Việc không có nồng độ ASO đáng kể trong não và tim làm giảm nguy cơ tổn thương hệ thần kinh trung ương (CNS) và giảm biểu hiện của các tác dụng không mong muốn trên tim. Như đã đề cập trước đó, việc sử dụng trực tiếp đến các cấu trúc thần kinh trung ương, đặc biệt là não, bằng cách tiêm truyền hoặc tiêm trong não, não thất gây phân bố ASO trong hệ thần kinh trung ương và có thể hữu ích trong điều trị.

Trong thời kỳ mang thai, thai nhi được bảo vệ khá tốt khỏi tác động của các loại thuốc trị rối loạn tiền đình. Nghiên cứu về động học xuyên nhau thai của ASO không cho thấy sự tích tụ của nó trong bào thai; một mức độ thấp của ASO đã được ghi nhận ở loài gặm nhấm trong nhau thai. Những kết quả này đã được lặp lại một cách nhất quán trong một nghiên cứu về khả năng gây quái thai của các ASO thế hệ thứ hai khác nhau ở chuột nhắt, chuột cống và thỏ. Nhau thai, mặc dù được tưới máu cao, nhưng không phải là cơ quan tích tụ nhiều ASO.

Nhìn chung, các dữ kiện được trình bày cho thấy sự phân bố ASO là một trong những yếu tố chính quyết định mức độ nghiêm trọng của hoạt động ASO. Sự khác biệt về sự phân bố ASO dường như liên quan phần lớn đến tính dinh dưỡng của mô đối với các loại thuốc này và ở mức độ thấp hơn là sự truyền dịch.

Sự trao đổi chất

Thuốc Antisense thế hệ thứ nhất và thứ hai được chuyển hóa bởi nuclease, chứ không phải bởi hệ thống oxy hóa loại cytochrome P450, được sử dụng để chuyển hóa các loại thuốc phân tử nhỏ ưa mỡ thông thường. ASO không phải là chất nền cho các isoenzyme cytochrome P450, cũng không gây ra hoặc ức chế hoạt động của nó ở nồng độ đáng kể về mặt lâm sàng. Sự phân cắt ASO qua trung gian exonuclease, là con đường chính để chuyển hóa và thanh thải ODN phosphothioate thế hệ thứ nhất, là con đường thứ yếu của ASO thế hệ thứ hai. Hoạt động exonuclease bị giới hạn bởi hai đoạn: một MOE ở đầu 3 'và một MOE khác ở đầu 5'.

Các enzym chịu trách nhiệm cho quá trình chuyển hóa ASO

Các enzym cụ thể chuyển hóa ASO thế hệ thứ hai chưa được biết đến. Các nucleaza có mặt ở khắp nơi và có thể phát hiện các chất chuyển hóa ASO bị phân hủy trong hầu hết các mô. Các chất đồng nhất ở gan và thận đều có thể chuyển hóa ASO thế hệ thứ hai trong ống nghiệm mà không cần bổ sung các nguồn năng lượng ngoại sinh như nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) hoặc adenosine 5-triphosphate (ATP). Sự phân tách ban đầu dẫn đến hai sản phẩm, mỗi sản phẩm được đặc trưng bởi một đầu được bảo vệ MOE 5 "và 3". Các chất chuyển hóa này không liên kết với protein và do đó được đào thải ra khỏi mô. Vì các chất chuyển hóa được loại bỏ nhanh hơn so với thời gian hình thành, nên thực tế không có sự tích tụ chất chuyển hóa trong các mô. Vì vậy, không thể sử dụng việc xác định lượng chất chuyển hóa trong mô làm chỉ số chuyển hóa ASO trong mô.

Vì tốc độ đào thải ASO khỏi các mô phụ thuộc vào quá trình chuyển hóa của chúng, nên sự khác biệt về chuyển hóa của ASO trong các mô khác nhau có thể được ước tính dựa trên thời gian bán hủy của các thuốc này từ các mô đặc trưng. Dựa trên dữ liệu của bốn ASO thế hệ thứ hai, người ta kết luận rằng hành vi của các thành viên của lớp này là tương tự nhau, nhưng có sự khác biệt nhỏ về thời gian bán hủy của chúng từ gan và thận của những con khỉ được điều trị bằng thuốc trong 4-13 tuần. . Người ta đã chứng minh rằng thời gian bán hủy của các chế phẩm ACO ISIS 104838 và 112989 từ gan và thận là rất giống nhau. Những dữ liệu này cho thấy rằng đối với một số loạt ASO không có sự khác biệt đáng kể về tốc độ trao đổi chất ở các cơ quan khác nhau. Tuy nhiên, sự khác biệt về thời gian bán hủy của mô đã được xác định đối với ISIS 107248, 113715 và 301012. Sự khác biệt quan sát được về tốc độ chuyển hóa của thuốc ASO ở gan và thận cho thấy có thể có sự khác biệt về tốc độ chuyển hóa ở các mô khác nhau hoặc động học phức tạp hơn đối với một số loạt sản phẩm hoặc kết quả chỉ phản ánh một số lượng nhỏ mẫu được lấy trong một khung thời gian giới hạn.

Một nghiên cứu chi tiết về quá trình bài tiết của ASO thế hệ thứ hai cho thấy sự hiện diện của tốc độ bài tiết khác nhau từ các loại tế bào gan khác nhau. Vì một số loại tế bào, chẳng hạn như tế bào ống gần của vỏ thận, có xu hướng chứa ASO trong các phagolysosome, loại hấp thu này có thể dẫn đến sự khác biệt về tốc độ chuyển hóa thuốc trong các mô khác nhau. Ngoài ra, có khả năng là các trình tự cụ thể trong cấu trúc của khung ASO có thể được đặc trưng bởi độ nhạy khác nhau đối với sự phân cắt bởi endonuclease.

Các exonuclease của vi khuẩn thể hiện mức độ đặc hiệu cao đối với trình tự nucleotide trong xương sống ASO, có lẽ là để bảo vệ chống lại vi rút. Phần lớn hoạt động của nucleaza trong tế bào động vật có vú liên quan đến cơ chế phiên mã và sửa chữa DNA, do đó tính đặc hiệu của loài của động vật có vú có thể khác với đặc tính của endonucleaza của vi khuẩn. Người ta không biết liệu các quá trình sao chép và hoạt động của các enzym liên quan đến hiện tượng sửa chữa đều chịu trách nhiệm như nhau đối với quá trình dị hóa của các ASO tổng hợp này. Ở nồng độ ssDNA cao, ASO có thể cạnh tranh hiệu quả với chất nền tự nhiên. Nhiều enzym thuộc họ nuclease có thể dị hóa ASO. Việc xác định các enzym cụ thể tham gia vào quá trình chuyển hóa ASO không quan trọng đối với sự phát triển của thuốc antisense, nhưng hiểu rõ hơn về các con đường chuyển hóa sẽ hữu ích cho sự phát triển của công nghệ mới.

Chất chuyển hóa ASO

Sự khác biệt về chuyển hóa của ASO thế hệ thứ nhất và thứ hai là khá rõ ràng khi so sánh cấu hình trao đổi chất với CGE. Khi các mẫu mô hoặc nước tiểu được phân tích trong máy dò LC / MS, bản chất của các quá trình trao đổi chất trở nên rõ ràng hơn. Thông thường, ODN phosphorothioate thế hệ đầu tiên được chuyển hóa thành một loạt các chất chuyển hóa ASO, mỗi chất khác nhau bởi một nucleotide do kết quả của sự phân cắt nucleotide đơn bởi một exonuclease. Do đó, sau khi giới thiệu 20-mer, nghĩa là, bao gồm 20 nucleotide, ODN thế hệ thứ nhất, huyết tương và mô chứa các họ ASO được viết tắt liên tiếp, bắt đầu từ 19-mer và xa hơn nữa là ASO ngắn.

Sự phân cắt ban đầu trong chuyển hóa ASO thế hệ thứ hai qua trung gian
endonucleases, dẫn đến sự hình thành hai ASO, một có đầu 3 'của MOE và một có đầu 5' của MOE. Việc phân cắt các sản phẩm có đầu không được bảo vệ có thể được thực hiện bằng 5'-exonuclease hoặc 3'-exonuclease. Kết quả của hoạt tính endo- và exonuclease kết hợp là một chuỗi các sản phẩm phân cắt được viết tắt theo chuỗi, nhiều, nếu không phải tất cả, có thể được phát hiện trong nước tiểu lấy từ động vật thử nghiệm hoặc người. Nước tiểu của động vật được điều trị hoặc bệnh nhân được điều trị bằng ASO thế hệ thứ hai có thể chứa các chất chuyển hóa nằm trong khoảng từ hai MOE 15-mer có thể đến hai MOE 5-mer có thể có và nhiều sự kết hợp của từng chất chuyển hóa trung gian.

Các chất chuyển hóa ngắn hơn chiều dài của các đầu MOE sẽ có trong các mô nếu các đầu của MOE chính là chất nền cho các nucleaza. Các chất chuyển hóa này thường không được phát hiện bằng phân tích khối phổ, cho thấy rằng, theo quy luật, không có mononucleotide MOE được giải phóng trong quá trình trao đổi chất. Tuy nhiên, có một số ngoại lệ đối với sự khái quát này. Đối với một số trình tự nucleotide hạn chế , ASO thế hệ thứ hai các mảnh nucleotide đơn được quan sát thấy trong mô và huyết tương CGE hoặc LC / MS: các chất chuyển hóa dường như là kết quả của quá trình tiêu hóa exonuclease. Các chất chuyển hóa này có thể được quan sát thấy trong lần phân phối ban đầu. Người ta cho rằng chúng nhanh chóng xuất hiện trong huyết tương. Các mononucleotide MOE, được hình thành trong quá trình trao đổi chất, không phải là chất nền cho quá trình phosphoryl hóa, do đó khó có thể được bao gồm trong các nucleotide triphosphat và cuối cùng là trong các nucleotide nội sinh. Các mononucleotide MOE không ức chế các enzym chịu trách nhiệm tổng hợp DNA. Do đó, các mononucleotide MOE, nếu được hình thành, sẽ không được kết hợp vào các nucleotide nội sinh.

Phần trung tâm của deoxynucleotide của ASO thế hệ thứ hai chịu sự phân cắt exonuclease, dẫn đến giải phóng một nucleotide. Monodeoxynucleotide, được tạo ra bởi sự phân cắt exonuclease, giống với nucleotide nội sinh, ngoại trừ nhóm thiophosphate, về mặt lý thuyết có thể có. Tuy nhiên, nhóm thiophosphat không bền với quá trình oxy hóa và mất lưu huỳnh, điều này làm cho nhóm photphat cuối giống với nucleotide nội sinh. Do đó, không giống như mononucleotide MOE, bất kỳ deoxynucleotide nào được giải phóng sẽ được đưa vào kho nội bào của các nucleotide nội sinh một cách tự nhiên. Các nucleotide giữ lại các nhóm thiophosphat sẽ là chất nền để bổ sung một hoặc hai nhóm phosphat, dẫn đến hỗn hợp nucleotide thiophosphat di- hoặc triphosphat. Có thể phosphoryl hóa, nhưng sự hiện diện của alpha thiophosphat làm cho các phản ứng không thuận lợi về mặt nhiệt động lực học.

Sự kết luận

Sự liên quan của việc nghiên cứu dược động học của dữ liệu và các loại thuốc tương tự như được mô tả, cũng như việc tạo ra các mô hình trên các loài động vật khác nhau để hiểu rõ về các quá trình xảy ra trong cơ thể sau khi dùng thuốc là rõ ràng. Ở Nga, các nghiên cứu về các loại thuốc như vậy cũng đang được tiến hành.

Văn chương

1. Adjei A.A., Dy G.K., Erlichman C. et al. Một thử nghiệm giai đoạn I của ISIS 2503, một chất ức chế antisense của H-ras, kết hợp với gemcitabine ở bệnh nhân ung thư giai đoạn cuối. // phòng khám. Ung thư Res. 2003 tập. 9, # 1. P. 115.

2. Benimetskaya L., Loike J.D., Loike G. et al. Mac-1 (CD11b / CD18) là một protein liên kết ODN. // Nat. Med. 1997 Vol. 3, số 4. P. 414.

3. Benimetskaya L., Tonkinson J.L., Koziolkiewicz M. et al. Liên kết các ODN phosphorothioate với yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi cơ bản, CD4 hòa tan tái tổ hợp, laminin và fibronectin trong độc lập P-chirality. // Không. Axit Res. 1995 Tập. 23, số 21. P. 4239.

4. Bijsterbosch M.K., Manoharan M., Rump E.T. et al. Số phận in vitro của ODN phosphorothioate antisense: sự hấp thu chủ yếu của các thụ thể xác thối trên tế bào nội mô. // Không. Axit Res. 1997 Vol. 25, số 16. P. 3290.

5. Bijsterbosch M.K., Rump E.T., De Vrueh R.L. et al. Điều chế sự gắn kết với protein huyết tương và sự hấp thu của tế bào gan trong ống nghiệm của ODN phosphorothioate bằng cách liên hợp với cholesterol. // Không. Axit Res. 2000 Vol. 28 Đường Số 14. P. 2717.

6. Brown D.A., Kang S.H., Gryaznov S.M. et al. Ảnh hưởng của sự thay đổi phosphorothioate của ODN đối với liên kết protein cụ thể. // J. Biol. Chèm. 1994 tập. 269, số 43. R. 26801.

7. Butler M., Crooke R.M., Graham M.J. et al. Các ODN photphorothioate phân phối tương tự ở chuột loại A của cơ quan ăn xác thối và chuột hoang dã. // J. Pharmacol. Hết hạn. Họ. 2000 Vol. 292, số 2. P. 489.

8. Butler M., Hayes C.S., Chappell A., Murray S.F., Yaksh T.L., Hua X.Y. Sự phân bố và chuyển hóa ở tủy sống của các ASO đã được biến đổi 2_-O- (2-methoxyethyl) sau khi tiêm trong khoang ở chuột. // Khoa học thần kinh. 2005 tập. 131, số 3. P. 705.

9. Butler M., Stecker K., Bennett C.F. Sự phân bố tế bào của ODN phosphorothioate trong các mô bình thường của động vật gặm nhấm. // Phòng thí nghiệm. Đầu tư. 1997 Vol. 77, số 4. P. 379.

10. Cossum P.A., Sasmor H., Dellinger D. et al. Vứt bỏ phosphorothioate ASO ISIS 2105 được dán nhãn 14C sau khi tiêm tĩnh mạch cho chuột. // J. Pharmacol. Hết hạn. Họ. 1993 Vol. 267, số 3. P. 1181.

11. Cossum P.A., Troung L., Owens S.R. et al. Dược động học của phosphorothioate ASO được đánh dấu 14C, ISIS 2105, sau khi tiêm trong da cho chuột. // J. Pharmacol. Hết hạn. Họ. 1994 tập. 269, số 1. P. 89.

12. Crooke S.T., Graham M.J., Zuckerman J.E. et al. Đặc tính dược động học của một số chất tương tự ASO mới ở chuột. // J. Pharmacol. Hết hạn. Họ. 1996 tập. 277, số 2. P. 923.

13. Tài xế S.E., Robinson G.S., Flanagan J., Shen W., Smith L.E.H., Thomas D.W., Roberts P.C. Ức chế biểu hiện gen phôi dựa trên ASO. // Nat. Công nghệ sinh học. 1999 Tập. 17. P. 1184.

14. Eckstein F. Phosphorothioate ODN: nguồn gốc của chúng là gì và điểm độc đáo ở chúng là gì? // Antisense Nucl. Thuốc Acid Dev. 2000 Vol. 10, # 2. R. 117.

15. Gaus H.J., Owens S.R., Winniman M., Cooper S., Cummins L.L. Phổ khối lượng điện cực HPLC trực tuyến của các chất chuyển hóa phosphorothioate ASO. // Hậu môn. Chèm. 1997 Vol. 69, số 3. P. 313.

16. Geary R.S. Đánh giá hiện tại về mối quan hệ PK / PD để điều trị antisense. // Đại hội Dược phẩm và Khoa học Dược phẩm Thế giới, Nice, Pháp, 2002.

17. Geary R.S., Bradley J.D., Watanabe T. và cộng sự. Thiếu tương tác dược động học đối với ISIS 113715, một oligonucleotide antisense được sửa đổi 2_-O-methoxyethyl nhắm mục tiêu RNA thông tin tyrosine phosphatase 1B của protein, với các hợp chất chống đái tháo đường metformin, glipizide hoặc rosiglitazone đường uống. // phòng khám. Dược phẩm. 2006 Vol. 45, số 8. P. 789.

18. Geary R.S., Leeds J.M., Fitchett J. và cộng sự. Dược động học và chuyển hóa ở chuột của chất ức chế antisense phosphorothioate ASO biểu hiện C-raf-1 kinase.// Thuốc Metab. Thùng rác. 1997 Vol. 25, số 11. R. 1272.

19. Geary R.S., Leeds J.M., Henry S.P., Monteith D.K., Levin A.A. Các chất ức chế oligonucleotide Antisense để điều trị ung thư: 1. Đặc tính dược động học của ODN phosphorothioate. // Thuốc chống ung thư Des. 1997 Vol. 12, số 5. R. 383.

20. Geary R.S., Leeds J.M., Shanahan W. và cộng sự. Dược động học mô và huyết tương độc lập theo trình tự đối với 3 ASO antisense phosphorothioate: từ chuột sang người. // trong Hiệp hội các nhà khoa học dược phẩm Hoa Kỳ, Pharm. Nghiên cứu, Plenum Press, Seattle, Washington. Năm 1996. R. S.

21. Geary R.S., Teng C.L., Truong L. và cộng sự. Đầu tiên vượt qua quá trình chiết xuất ở gan của oligonucleotide antisense dạng chimeric đã được biến đổi một phần ở chó Beagle. // trong Hội nghị thường niên của Hiệp hội các nhà khoa học dược phẩm Hoa Kỳ, Indianapolis, IN, 2000. Tr 216.

22. Geary R.S., Ushiro-Watanabe T., Truong L et al. Đặc tính dược động học của các chất tương tự ASO biến đổi 2_-O- (2-methoxyethyl) ở chuột. // J. Pharmacol. Hết hạn. Họ. 2001 Vol. 296, số 3. R. 890.

23. Geary R.S., Yu R.Z., Levin A.A. Dược động học của ODN phosphorothioate antisense. // Curr. Opin. Đầu tư. ma túy. 2001 Vol. 2, # 4. R. 562.

24. Geary R.S., Yu R.Z., Watanabe T. và cộng sự. Dược động học của một yếu tố hoại tử khối u-alpha phosphorothioate 2_-O- (2-methoxyethyl) các oligonucleotide biến đổi antisense: so sánh giữa các loài. // Metab thuốc. Thùng rác. 2003 tập. 31, số 11. P. 1419.

25. Giacomini K.M., Sugiyama Y. Chất vận chuyển qua màng và phản ứng với thuốc, trong Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11 ed., Brunton, L.L., ed., McGraw-Hill, New York, 2006. Tr 41.

26. Gleave M., Chi K.N. Knock-down gen bảo vệ tế bào, clusterin, để tăng cường hormone và độ nhạy với hóa chất trong ung thư tuyến tiền liệt và các bệnh ung thư khác. // Ann. NY Acad. khoa học. 2005. Quyển.1058. P.1.

27. Gleave M., Miyake H. Sử dụng các oligonucleotide antisense nhắm vào gen bảo vệ tế bào, clusterin, để tăng cường độ nhạy cảm với androgen và hóa trị trong ung thư tuyến tiền liệt. // Thế giới J. Urol. 23. 2005. số 1. P. 38.

28. Glover J.M., Leeds J.M., Mant T.G. et al. Cấu hình dược động học và an toàn giai đoạn I của phân tử kết dính gian bào-1 antisense ODN (ISIS 2302). // J. Pharmacol. Hết hạn. Họ. 1997 Vol. 282, số 3. R. 1173.

29. Graham M.J., Crooke S.T., Monteith D.K. et al. Sự phân phối và chuyển hóa in vitro của gan chuột phosphorothioate ASOwithin sau khi tiêm tĩnh mạch. // J. Pharmacol. Hết hạn. Họ. 1998 Vol. 286, số 1. P. 447.

30. Guvakova M.A., Yakubov L.A., Vlodavsky I., Tonkinson J.L., Stein C.A. Phosphorothioate ODN liên kết với yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi cơ bản, ức chế sự liên kết của nó với các thụ thể bề mặt tế bào và loại bỏ nó khỏi các vị trí liên kết có ái lực thấp trên chất nền ngoại bào. // J. Biol. Chèm. 1995 Tập. 270. Tr.2620.

31. Henry S.P., Denny K.H., Templin M.V., Yu R.Z., Levin A.A. Ảnh hưởng của các chất ức chế oligonucleotide antisense của ICAM-1 ở người và chuột đối với khả năng sinh sản, sự phát triển của bào thai và sự phát triển sau sinh ở chuột. // Các khiếm khuyết bẩm sinh Res. Bdev. sinh sản. Toxicol. 2004 Tập. 71, số 6. P. 359.

32. Hua X.Y., Moore A., Malkmus S. và cộng sự. Sự ức chế biểu hiện của protein kinase C alpha ở tủy sống bởi một oligonucleotide antisense làm giảm khả năng dung nạp morphin do truyền. // Khoa học thần kinh. 2002 Tập. 113, số 1. P. 99.

33. Jackson J.K., Gleave M.E., Gleave J., Burt H.M. Sự ức chế hình thành mạch bởi các oligonucleotide antisense thành clusterin. // Hình thành mạch. 2005 tập. 8, số 3. P. 229.

34. Kastelein J.J.P., Wedel M.K., Baker B.F. et al. Giảm mạnh apolipoprotein B và cholesterol lipoprotein tỷ trọng thấp bằng cách sử dụng ngắn hạn chất ức chế antisense của apolipoprotein B. // Tuần hoàn. 2006 Vol. 114, số 16. P. 1729.

35. Koziolkiewicz M., Krakoviak A., Kwinkowski M., Boczkowska M., Stec W.J. Sự khác biệt lập thể - ảnh hưởng của tính bất đối P của oligo (nucleoside phosphorothioates) trên hoạt động của vi khuẩn RNase H. // Nucl. Axit Res. 1995. Tập 23, Số 24. R. 5000.

36. Leeds J.M., Geary R.S. Các đặc tính dược động học của phosphorothioate ASO ở người, trong Nghiên cứu và Ứng dụng Antisense, ấn bản 1, Crooke, S. T., ed., Springer, Heidelberg, 1998. P. 217.

37. Leeds J.M., Henry S.P., Geary R.S., Burckin T.A., Levin A.A. So sánh dược động học của việc tiêm dưới da và tiêm tĩnh mạch một oligodeoxynucleotide phosphorothioate ở khỉ cynomolgus. // Antisense Nucl. Thuốc Acid Dev. 2000. Tập 10, số 6. R. 435.

38. Levin A.A. Đánh giá các vấn đề về dược động học và độc tính của oligonucleotide phosphorothioate antisense. // Biochim. Lý sinh. acta. 1999. Vol.1489, No.1. R. 69.

39. Levin A.A., Geary R.S., Leeds J.M. et al. Dược động học và độc tính của các ASO phosphorothioate, trong Đánh giá An toàn và Công nghệ Sinh học, ấn bản thứ 2, Thomas, J. A., ed., Taylor & Francis, Philadelphia, PA, 1998. P. 151.

40. Levin A.A., Henry S.P., Bennett C.F. et al. Sự phát triển tiền lâm sàng của phương pháp điều trị antisense, trong Phương pháp điều trị mới lạ từ Công nghệ sinh học hiện đại: Từ phòng thí nghiệm đến thử nghiệm trên người, xuất bản lần 1, Oxender D.L. và Post L.E., eds., Springer-Verlag, Heidelberg, Germany, 1998, trang 131.

41. Levin A.A., Henry S.P., Monteith D., Templin M. Độc tính của các oligonucleotide antisense. // trong Antisense Drug Technology, Crooke, S. T., ed., Marcel Dekker, New York, 2001. P. 201.

42. Loke S.L., Stein C.A., Zhang X.H. et al. Đặc điểm của quá trình vận chuyển ASO vào tế bào sống. // Proc. Natl. Acad. khoa học. HOA KỲ. 1989 Vol. 86. P. 3474.

43. Lorenz P., Misteli T., Baker B.F., Bennett C.F., Spector D.L. Nucleocytoplasmic shuttling: một thuộc tính mới trong ống nghiệm của các ODN antisense phosphorothioate. // Không. Axit Res. 2000 Vol. 28, số 2. P. 582.

44. Thợ mỏ P.B., Geary R.S., Matson J. và cộng sự. Khả dụng sinh học và hoạt tính điều trị của alicaforsen (ISIS 2302) được sử dụng như một loại thuốc xổ giữ lại trực tràng cho những đối tượng bị viêm loét đại tràng hoạt động. // Ailment Pharmacol. Họ. 2006 Vol. 23, số 10. R. 1427.

45. Mou T.C., Grey D.M. Ái lực liên kết cao của các oligome biến đổi phosphorothioate đối với protein Ff gen 5 được điều chỉnh bằng cách bổ sung các biến đổi C-5 propyne hoặc 2_-O-methyl. // Không. Axit Res. 2002 Tập. 30, số 3. R. 749.

46. ​​Nicklin P.L., Craig S.J., Phillips J.A. Các đặc tính dược động học của phosphorothioates ở động vật-hấp thụ, phân phối, chuyển hóa và thải trừ, trong Nghiên cứu và Ứng dụng Antisense, ấn bản 1, Crooke, S. T., ed., Springer, Berlin, 1998. P. 141.

47. Peng B., Andrews J., Nestorov I. và cộng sự. Sự phân bố mô và dược động học dựa trên sinh lý của antisense phosphorothioate ASO ISIS 1082 ở chuột. // Antisense Nucl. Thuốc Acid Dev. 2001 Vol. 11, # 1. P. 15.

48. Phillips J.A., Craig S.J., Bayley D. và cộng sự. Dược động học, chuyển hóa và thải trừ ODN 20-mer phosphorothioate (CGP 69846A) sau khi tiêm tĩnh mạch và tiêm dưới da. // Hóa sinh. Pharmacol. 1997 Vol. 54, số 6. R. 657.

49. Sawai K., Mahato R.I., Oka Y., Takakura Y., Hashida M. Xử lý ASO trong thận chuột được tưới máu cô lập: sự tham gia của các thụ thể xác thối trong quá trình hấp thu ở thận của chúng. // J. Pharmacol. Hết hạn. Họ. 1996 tập. 279, số 1. P. 284.

50. Sewell L.K., Geary R.S., Baker B.F. et al. Thử nghiệm giai đoạn I của ISIS 104838, một oligonucleotide antisense được sửa đổi 2_-methoxyethyl nhắm vào yếu tố hoại tử khối u-alpha. // J. Pharmacol. Hết hạn. Họ. 2002 Tập. 303, số 3. R. 1334.

51 Slim G., Gait M.J. Các oligoribonucleotide chứa phosphorothioate được xác định cấu hình trong nghiên cứu cơ chế phân cắt của ribozyme đầu búa. // Không. Axit Res. 1991 Tập. 19, số 6. R. 1183.

52. Snyder R.M., Mirabelli C.K., Crooke S.T. Sự liên kết tế bào, sự phân bố nội bào và dòng chảy của auranofin thông qua các phản ứng trao đổi phối tử tuần tự. // Hóa sinh. Pharmacol. 1986 Vol. 35, số 6. P. 923.

53. Soucy N.V., Riley J.P., Templin M.V. et al. Sự phân bố của ASO phosphorothioate cho bà mẹ và thai nhi ở chuột sau khi truyền tĩnh mạch. // Các khiếm khuyết bẩm sinh Res. Bdev. sinh sản. Toxicol. 2006 Vol. 77, số 1. P. 22.

54. Spitzer S., Eckstein F. Sự ức chế deoxyribonucleases bởi các nhóm phosphorothioate trong oligodeoxyribonucleotide. // Không. Axit Res. 1988 tập. 16, # 24. R. 11691.

55. Stavchansky S., Geary R.S., Cho M. Dược động học và tác dụng vượt qua đầu tiên trên gan của antisense oligonucleotide (ISIS 2302) ở chuột. // trong Hội nghị thường niên của Hiệp hội các nhà khoa học dược phẩm Hoa Kỳ, Indianapolis, IN, 2000. Tr 216.

56. Templin M.V., Levin A.A., Graham M.J. et al. Hồ sơ độc tính và dược động học của một ASO phosphorothioate sau khi hít vào phổi ở chuột. // Antisense Nucl. Thuốc Acid Dev. 2000 Vol. 10, số 5. R. 359.

57. Teplova M., Minasov G., Tereshko V. và cộng sự. Cấu trúc tinh thể và các đặc tính antisense được cải thiện của 2_-O- (2-methoxyethyl) -RNA. // Nat. Kết cấu. Biol. 1999. Tập 6, Số 6. R.535.

58. Villalona-Calero M.A., Ritch P., Figueroa J.A. et al. Một nghiên cứu giai đoạn I / II về LY900003, một chất ức chế antisense của protein kinase C-alpha, kết hợp với cisplatin và gemcitabine ở những bệnh nhân bị ung thư phổi không tế bào nhỏ tiến triển. // phòng khám. Ung thư Res. 2004 Tập. 10, Số 18 Pt 1. P. 6086.

59. Watanabe T.A., Geary R.S., Levin A.A. Liên kết với protein huyết tương của một oligonucleotide antisense nhắm vào ICAM-1 ở người (ISIS 2302). // ASO. 2006 Vol. 16, số 2. P. 169.

60. White A.P., Reeves K.K., Snyder E. et al. Hydrat hóa phosphodiester sợi đơn và phosphorothioate oligodeoxyribonucleotide. // Không. Axit Res. 1996 tập. 24, số 16. R. 3261.

61. Wilson D.M. Thứ 3, Ape1 abasic endonuclease hoạt động được điều chỉnh bởi nồng độ magiê và kali và mạnh mẽ trên các cấu trúc DNA thay thế. // J. Mol. Biol. 2005 tập. 345, số 5. P. 1003.

62. Yu D., Kandimalla E.R., Roskey A. và cộng sự. ODN phosphorothioate được làm giàu lập thể: tính chất tổng hợp, lý sinh và sinh học. // Bioorg. Med. Chèm. 2000. Vol.8, No.1. R. 275.

63. Yu R.Z., Baer B., Chappel A. và cộng sự. Phát triển một thử nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme lai ghép không cạnh tranh siêu nhạy để xác định ODN phosphorothioate trong huyết tương. // Hậu môn. Hóa sinh. 2002 Tập. 304, số 1. P. 19.

64. Yu R.Z., Geary R.S., Leeds J.M. et al. So sánh dược động học và sự bố trí mô của một ASO antisense phosphorothioate nhắm vào mRNA Haras của người ở chuột và khỉ. // J. Pharm. khoa học. 2001 Vol. 90, # 2. P. 182.

65. Yu R.Z., Geary R.S., Levin A.A. Ứng dụng các phương pháp phân tích sinh học định lượng mới để đánh giá dược động học và dược động học / dược lực học của các oligonucleotide antisense. // Curr. Opin. vũ trường ma túy. nhà phát triển. 2004 Tập. 7, # 2. R. 195.

66. Yu R.Z., Kim T.W., Hong A. và cộng sự. So sánh dược động học giữa các loài từ chuột với người của oligonucleotide ISIS 301012 antisense thế hệ thứ hai, nhắm vào apolipoprotein B-100 của người. // Metab thuốc. Thùng rác. 2007 tập. 35. P. 460.

67. Yu R.Z., Zhang H., Geary R.S. et al. Dược động học và dược lực học của một ASO antisense phosphorothioate nhắm mục tiêu mRNA Fas ở chuột. // J. Pharmacol. Hết hạn. Họ. 2001 Vol. 296, số 2. P. 388.

68. Zinker B.A., Rondinone C.M., Trevillyan J.M. et al. PTP1B antisense oligonucleotide làm giảm protein PTP1B, bình thường hóa đường huyết và cải thiện độ nhạy insulin ở chuột mắc bệnh tiểu đường. // Proc. Natl. Acad. khoa học. HOA KỲ. 2002 Tập. 99, # 17. P. 1137.

5507 0

Điều này có thể đạt được bằng một số cách: lai oligonucleotide tương ứng với một gen hoặc mRNA cụ thể, ngăn chặn yếu tố phiên mã protein, giảm số lượng mRNA do quá trình phân cắt bởi các enzym RNA, v.v. Hãy xem xét các nguyên tắc của một số trong số chúng.

Một ribooligonucleotide liên kết với mRNA cụ thể và do đó ức chế sự dịch mã của protein mà nó mã hóa được gọi là mRNA "antisense". Cơ chế này được một số vi khuẩn sử dụng để điều chỉnh gen (Hình 3.20). Trong thực tế, các gen được thiết kế nhân tạo được sử dụng, trong đó đoạn chèn DNA được định hướng sao cho các bản sao của chúng là ngược âm so với mRNA đích (Hình 3.21).


Cơm. 3,20. Điều hòa gen bacterioferritin (bfr) bằng ARN đối kháng




Cơm. 3,21. Ức chế dịch mRNA bởi một Oligonucleotide Antisense tổng hợp


Người ta đã chứng minh rằng có thể sử dụng các oligonucleotide antisense tổng hợp, tuy nhiên, hiệu quả điều trị của chúng sẽ phụ thuộc mạnh mẽ vào khả năng chống lại hoạt động của nuclease tế bào, hệ thống phân phối và tính đặc hiệu của quá trình lai tạo của chúng. Để xác định các vị trí đích hiệu quả nhất trên mRNA cụ thể, một tập hợp các oligonucleotide antisense dài 15-20 bazơ được thử nghiệm với quá trình nuôi cấy các tế bào tổng hợp mRNA đích. Thành phần của các protein được tổng hợp được xác định bằng phương pháp điện di và nó được thiết lập để đưa oligonucleotide vào dẫn đến giảm tổng hợp protein đích.

Để bảo vệ chống lại sự phân cắt nuclease, các oligonucleotide biến đổi được tổng hợp, đồng thời không làm mất khả năng lai. Trên hình. 3.22 cho thấy cấu trúc của các nucleotide đã được sửa đổi, hiệu quả của chúng đang được nghiên cứu chuyên sâu. Ví dụ, người ta đã chỉ ra rằng các oligonucleotide với sự thay thế oxy tự do của liên kết phosphodiester bằng lưu huỳnh (cấu trúc b) lai có hiệu quả với RNA mục tiêu bổ sung và kết quả là song công RNA-DNA kích hoạt ribonuclease H. nội bào.

Enzyme nội sinh này thủy phân chuỗi RNA trong các giống lai như vậy. Với các oligonucleotide như vậy, các thử nghiệm lâm sàng đầy hứa hẹn đã được thực hiện, trong đó các mục tiêu là RNA của cytomegalovirus, HIV và một số RNA chịu trách nhiệm cho sự phát triển của ung thư.



Cơm. 3,22. Các biến đổi của Oligonucleotide: a - liên kết phosphodiester bình thường; b - liên kết thiophotphat; c - liên kết phosphamide; d - 2 "-0-metylribose; e - C-5-propynylcytosine


Để phân phối hiệu quả các oligonucleotide antisense, chúng thường được đóng gói thành các liposome, đến lượt chúng được biến đổi với các phối tử cụ thể để cung cấp phân phối có mục tiêu (chúng ta đã thấy kỹ thuật này khi xem xét các phương pháp phân phối gen trị liệu không do virus). Cho đến nay, một số thử nghiệm đã được thực hiện và hiệu quả điều trị cao của antisense oligonucleotide đã được chứng minh là ngăn chặn sự tăng sinh không mong muốn của các tế bào cơ trơn (biến chứng sau nong mạch, phẫu thuật bắc cầu mạch vành, xơ vữa động mạch), để điều trị nhiễm virus và sốt rét .

Nguyên tắc hoạt động và cấu trúc của ribozyme - RNA tự nhiên với hoạt tính nuclease, được trình bày trong Hình. 3,23.
Người ta đã phát hiện ra rằng những RNA sợi ngắn này có thể ngăn chặn hiệu quả sự biểu hiện của các gen virus, gen sinh ung thư, các yếu tố tăng trưởng và các gen quan trọng trong điều trị khác bằng cách phân cắt mRNA của chúng. Bằng cách sửa đổi trình tự liên kết cơ chất, có thể thu được ribozyme đặc trưng cho mRNA cụ thể. Ribozyme có thể được tổng hợp trực tiếp trong tế bào bằng cách phiên mã oligodeoxyribonucleotide tổng hợp mã hóa vùng xúc tác và vùng lai bên cạnh nó.



Cơm. 3,23. Sự phân cắt mRNA bởi ribozyme. Mũi tên cho thấy vị trí phân cắt.


Một oligonucleotide như vậy được đưa vào vector biểu hiện của sinh vật nhân chuẩn và được đặt vào tế bào. RNA kết quả thu được một cách tự nhiên một cấu trúc hoạt động, cái gọi là hình dạng đầu búa. Nhiều ribozyme có cấu trúc và hoạt động khác nhau đã được tổng hợp hóa học. Ví dụ, trong phòng thí nghiệm axit nucleic của Viện Sinh học Hóa học và Y học Thực nghiệm thuộc Chi nhánh Siberi của Viện Hàn lâm Khoa học Nga (Novosibirsk), nhiều năm nghiên cứu đang được thực hiện để thu được các ribozyme tổng hợp có hoạt tính và độ ổn định tăng lên.

Để tăng khả năng bảo vệ chống lại sự phân cắt sớm bởi các nuclease nội bào, người ta thu được các dẫn xuất khác nhau của ribozyme - với nhóm 2 "-hydroxyl được methyl hóa (xem Hình 3.22, d), cấu trúc nhị phân, v.v. Cấu trúc của phân tử ribozyme ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả của nó. Hình 3.24 cho thấy động học của sự phân cắt mRNA mdr1 với các ribozyme tổng hợp có cấu trúc khác nhau.



Cơm. 3,24. Sự phân cắt đoạn 190-mer 5 'của mRNA MDR1 với các ribozyme nhị phân (1,3) và chiều dài đầy đủ (2,4) được sửa đổi: a - Cấu trúc RNA với một vị trí cụ thể biệt lập; b - tích lũy các sản phẩm phân cắt ( tài liệu do A.G. Venyaminova, IBKhiFM, Novosibirsk cung cấp)


Một vị trí đặc biệt trong liệu pháp phân tử bị chiếm giữ bởi cái gọi là phương pháp kích hoạt tiền dược chất. Ví dụ, một trong những phương pháp điều trị gen cho bệnh ung thư là tiêu diệt các tế bào khối u bằng cách sử dụng dẫn xuất hoạt hóa của ganciclovir (GCV, một dẫn xuất của guanosine), một sản phẩm của gen thymidine kinase, từ virus herpes simplex HSVtk đã được đề cập bởi chúng ta.

Tế bào khối u được truyền gen HSVtk in vivo dưới một promoter hoạt động và sau một vài ngày, ganciclovir được sử dụng, nó được phosphoryl hóa bởi thymidine kinase của virus thành monophosphat và sau đó là các kinase của tế bào chủ thành triphosphat. Dẫn xuất này ức chế DNA polymerase và ngừng tổng hợp DNA, dẫn đến cái chết của các tế bào tăng sinh. Thông qua các tiếp xúc giữa các tế bào, ganciclovir triphosphat thâm nhập vào các tế bào không bị biến đổi lân cận và do đó phá hủy thêm 10 tế bào khối u.

Gen dẫn đến cái chết của tế bào của chính mình được gọi là gen "tự sát" (trong trường hợp của chúng tôi là gen thymidine kinase), và thuật ngữ "tiền dược" đề cập đến dạng không hoạt động của thuốc (trong trường hợp này là ganciclovir). Cách tiếp cận này đã được sử dụng để tạo ra các biến thể khác của tổ hợp tiền chất hoạt hóa gen, nhưng hiệu quả của hệ thống GCV-HSVtk đã được chứng minh trong một số thử nghiệm tiền lâm sàng.

Liệu pháp gen là một ngành y học mới, sự hình thành của nó đang diễn ra trước mắt chúng ta. Mặc dù có một số thành công và triển vọng đầy hứa hẹn, vẫn còn một số thách thức phải vượt qua.

Một số vấn đề nằm ngoài y học và sinh học phân tử. Đây là những vấn đề đạo đức và chính trị. Như bạn đã nhận thấy, chúng tôi coi các phương pháp điều trị di truyền chỉ dành cho tế bào xôma. Điều này có nghĩa là các chỉnh sửa được thực hiện chỉ giới hạn ở một cơ quan hoặc mô nhất định, các gen được "sửa" sẽ không được truyền lại cho thế hệ tiếp theo. Những thay đổi trong kiểu gen của tế bào mầm (tinh trùng hoặc trứng) hoặc tế bào thụ tinh phải được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác.

Hiện nay, liệu pháp gen của tế bào soma được xếp vào loại phương pháp can thiệp y tế tiêu chuẩn. Ngược lại, liệu pháp gen tế bào mầm về mặt công nghệ phức tạp hơn nhiều, có nhiều vấn đề và không thể đoán trước được. Do đó, các thí nghiệm trong lĩnh vực này bị cấm ở nhiều quốc gia.

Cuối những năm 80. Tại Hoa Kỳ, các quy định đã được thiết lập để điều chỉnh các thử nghiệm trong lĩnh vực liệu pháp di truyền tế bào soma. Họ đảm bảo sự lựa chọn khách quan và đại diện cho bệnh nhân và nhận thức của họ (mức độ nguy hiểm của phương pháp điều trị, khả năng thành công của nó là bao nhiêu, v.v.), tính bảo mật của thông tin về bệnh nhân và các nghiên cứu được thực hiện, việc thực hiện tất cả các thao tác đúng cách mà không gây hại , cho cả những bệnh nhân cụ thể và dân số nói chung.

Vì việc điều trị các tế bào soma dẫn đến cải thiện tình trạng và kéo dài đáng kể tuổi thọ của bệnh nhân mắc bệnh di truyền, nhưng gen “cải thiện” không được di truyền, người ta tin rằng điều này sẽ dẫn đến sự tích tụ của các bệnh di truyền trong dân số loài người. Tuy nhiên, theo di truyền học quần thể, phải mất hàng nghìn năm để tần số của một gen có hại gia tăng đáng kể do kết quả của việc điều trị hiệu quả.

VÀO. Voinov, T.G. Volova

nucleotide- Este photphoric của nucleoside, nucleoside photphat. Các nucleotide tự do, đặc biệt là ATP, cAMP, ADP, đóng một vai trò quan trọng trong các quá trình nội bào cung cấp thông tin và năng lượng, đồng thời cũng là thành phần cấu tạo của axit nucleic và nhiều coenzyme.

Hợp chất gồm hai phân tử nuclêôtit được gọi là dinucleotides, trong số ba trinucleotide, từ một số nhỏ - oligonucleotide, và trong số nhiều polynucleotide, hoặc axit nucleic.

morpholino(Tiếng Anh) Morpholino) là các oligonucleotide tổng hợp được sử dụng trong sinh học phân tử để thay đổi biểu hiện gen. Antisense oligomeric morpholinos được sử dụng để ngăn chặn các phân tử khác truy cập vào các trình tự axit nucleic cụ thể. Các oligonucleotide Morpholine chặn các vùng sợi đơn nhỏ (khoảng 25 nucleotide) trên bề mặt phân tử RNA.

Antisense oligonucleotide là những chuỗi nucleotide DNA dài trong nhiễm sắc thể. Nếu một gen được biểu hiện, thì quá trình phiên mã của gen này sẽ được bắt đầu, do đó mRNA được tổng hợp.

Hiệu quả điều trị của các oligonucleotide antisense tổng hợp phụ thuộc vào tính đặc hiệu của quá trình lai của chúng với vị trí có thể tiếp cận của mRNA đích, khả năng chống lại hoạt động của nuclease tế bào và sự hiện diện của hệ thống phân phối vào tế bào.

Cho đến nay, việc ngừng hoạt động có mục tiêu hiệu quả nhất của một số vùng nhất định trong bộ gen được thực hiện bởi các oligonucleotide antisense (AON). Chiến lược sử dụng AON dựa trên sự tương tác Watson-Crick của các phân tử DNA với mRNA đích. Sự hình thành phức hợp DNA-mRNA dẫn đến sự bất hoạt của M-RNA và ngừng tổng hợp protein sau đó.

Nói cách khác, cơ chế antisense đề cập đến sự liên kết của oligonucleotide vào vị trí bổ sung của RNA mục tiêu và sự ngăn chặn chức năng nội bào của RNA này.

Tuy nhiên, mô hình lý thuyết đơn giản và hấp dẫn này hóa ra lại phức tạp hơn nhiều trong thực tế. Ba loại phân tử antisense được biết đến: oligonucleotide tổng hợp tương đối ngắn; ARN antisense, được biểu hiện trong tế bào sau khi chuyển nạp với gen ribozyme antisense, có hoạt tính xúc tác.

Việc tạo ra các loại thuốc dựa trên các oligonucleotide antisense là một trong những hướng mới nhất trong quá trình phát triển thuốc. Công nghệ này cho nhà nghiên cứu cơ hội tác động trực tiếp đến hầu hết mọi quá trình trong tế bào với độ đặc hiệu cao nhất. Nếu một loại protein nhất định thúc đẩy sự phát triển của tế bào ung thư, thì bằng cách sử dụng antisense oligonucleotide thích hợp, có thể đảm bảo rằng protein này sẽ không bao giờ được tổng hợp trong tế bào nữa. Các oligonucleotide antisense đặc biệt đến mức hầu như không thể có bất kỳ protein nào khác trong tế bào bị ảnh hưởng. Tính đặc hiệu này sẽ làm giảm các tác dụng phụ thường thấy với các phương pháp điều trị ung thư truyền thống.

Cơ chế của sự bất hoạt vẫn chưa hoàn toàn rõ ràng. Nhưng có lẽ điều này là do thực tế là RNA sợi đôi không giống với các tế bào bình thường. Vì tín hiệu tổng hợp mỗi protein là một mRNA duy nhất, tín hiệu như vậy cho một protein cụ thể có thể bị tắt hoặc bị "loại bỏ" bằng cách sử dụng một trình tự bổ sung như vậy.

Hình 4 Cơ chế hoạt động của oligonucleotide antisense

Một vấn đề quan trọng của việc điều trị bằng thuốc dựa trên các oligonucleotide antisense là sự phá hủy các loại thuốc này bởi các enzym tế bào - nuclease. Oligodeoxynucleotide bị phân giải bởi nuclease, vì vậy điều rất quan trọng là phải bảo vệ chúng khỏi tác động của chất sau để chúng không bị mất khả năng lai với mục tiêu. Để làm được điều này, người ta tiến hành phân tách điện di của các protein tế bào, trong đó nhãn phóng xạ được đưa vào trong quá trình dịch mã, và sử dụng phương pháp chụp ảnh phóng xạ, nó được xác định khi có sự hiện diện của oligonucleotide “antisense” thì quá trình tổng hợp một protein nhất định bị giảm. Không có tiêu chí chung nào để chọn các vị trí mục tiêu tốt nhất trong các phiên mã RNA khác nhau. Các Oligonucleotide bổ sung cho mRNA 5'- hoặc 3'-konp, ranh giới exon và intron, và thậm chí các vùng sợi đôi có thể có hiệu quả. Oligodeoxynucleotide bị phân giải bởi nuclease nội bào; do đó, điều quan trọng là phải bảo vệ chúng khỏi tác động của chất sau để chúng không bị mất khả năng lai với mục tiêu. Đối với điều này, cơ sở pyrimidine và deoxyribose có thể được sửa đổi theo một cách nhất định.

Do đó, trong các oligonucleotide "đối kháng" được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay, nguyên tử oxy tự do của liên kết phosphodiester được thay thế bằng nhóm sulfo, dẫn đến sự hình thành liên kết thiophosphate. Oligonucleotide được biến đổi theo cách này hòa tan trong nước, mang điện tích âm và không bị phân cắt bởi endonuclease. Sau khi lai với vị trí đích, chúng tạo thành song công RNA-DNA kích hoạt ribonuclease (RNase) H, một loại enzyme nội sinh phân cắt mRNA trong phân tử lai. Các thử nghiệm lâm sàng đầu tiên của các oligonucleotide như vậy, thuốc thế hệ đầu tiên, đã được thực hiện. Các mục tiêu là RNA của cytomegalovirus, virus gây suy giảm miễn dịch ở người, cũng như mRNA của các gen gây ra sự phát triển của bệnh ung thư, bệnh đường ruột và các bệnh khác.

Các oligonucleotide "antisense" được tổng hợp với các liên kết phosphoramidite và polyamide (peptide). Các phân tử như vậy rất chống lại tác động của nucleaza. Các nhóm hóa học được gắn vào nguyên tử cacbon 2 'của bã đường và nguyên tử C-5 của pyrimidin cũng bảo vệ các oligonucleotide antisense và tạo điều kiện cho chúng liên kết với vị trí đích. ). Tất cả những ưu điểm của những điều này và các sửa đổi khác hiện đang được nghiên cứu chuyên sâu.