Phần đầu tiên (đến dòng màu xanh lam) là phần giới thiệu về liệu pháp gen, về nguyên tắc, để hiểu rõ hơn về các phương pháp, và, chỉ một chút, để không bị giáo viên bắt bài. Nếu không có thời gian và bạn cần tài liệu CỤ THỂ về vấn đề này, hãy cuộn phải qua dòng màu xanh lam.

Liệu pháp gen ban đầu nhằm mục đích điều trị các bệnh di truyền đơn gen, nhưng sau đó phạm vi của nó được mở rộng và nó bắt đầu được coi là một phương pháp tiếp cận phổ quát tiềm năng để điều trị toàn bộ các bệnh, bao gồm cả các bệnh truyền nhiễm, ung thư, xơ vữa động mạch, tiểu đường. và một số người khác.

"Điều trị gen"- sửa chữa khiếm khuyết trong gen (bệnh đơn gen) - ở cấp độ tế bào sinh dưỡng và tế bào mầm - thay thế gen đột biến bằng gen bình thường.

"Chữa bệnh bằng gen"- sửa chữa khiếm khuyết bằng cách đưa vào một gen hoạt động chính thức (cDNA).

Đầu tiên, một số lý thuyết chung:

Một điều kiện quan trọng để liệu pháp gen thành công là đảm bảo việc phân phối hiệu quả, tức là sự chuyển giao (theo nghĩa rộng nhất) hoặc sự chuyển giao (khi sử dụng vectơ virut) của gen ngoại lai vào các tế bào đích, đảm bảo hoạt động lâu dài của nó trong các tế bào này và tạo điều kiện cho sự hoạt động đầy đủ của gen (sự biểu hiện của nó).

Các chiến lược để sửa chữa các khiếm khuyết di truyền:

Theo loại hệ thống vectơ:

Lan tỏa

Lợi ích của Vectơ Viral: truyền tải một số lượng lớn tế bào; chủ nghĩa nhiệt đới; khả năng chống lại sự suy thoái của lysosome.

Nhược điểm của Vectơ Viral: khả năng sinh miễn dịch (với kết quả tử vong - adeno- và herpesvirus); khả năng gây ung thư (retrovirus).

Không có tính lan truyền

Tiêm trực tiếp vào tế bào, mô, cơ quan (hay còn gọi là vi tiêm);

Nhiễm mỡ (với sự trợ giúp của các liposome biến đổi khác nhau (các túi lipid có DNA bên trong);

· Cơ điện;

· Là một phần của plasmid;

DNA phức tạp (DNA plasmid kết hợp với muối, protein, v.v.);

· Súng bắn gen (DNA được gắn vào các hạt vàng bắn vào mô của bệnh nhân);

Nội bào qua trung gian thụ thể.

Lợi ích của việc phân phối không vi-rút: độ an toàn tương đối; thiếu phản ứng miễn dịch; dễ sử dụng.

Nhược điểm của phân phối không virut: hiệu suất chuyển nạp thấp; mức độ diễn đạt thấp.

Về mặt lý thuyết, cách triệt để và hiệu quả nhất là thay thế gen khiếm khuyết trong tế bào mầm (liệu pháp gen thai nhi), nhưng có vấn đề về đạo đức. Hiện nay, tất cả các phương pháp điều trị gen đều dựa trên liệu pháp gen ở cấp độ tế bào xôma.

Theo cơ chế hoạt động của gen được chèn vào hoặc phân tử ADN được chuyển, liệu pháp gen được chia thành tích cực (khôi phục chức năng của gen (thông qua khôi phục công việc của nó hoặc chèn một bản sao hoạt động mới) hoặc tiêu cực - ức chế chức năng của gen). Thêm vào đó, có một cách tiếp cận nhằm mục đích tăng cường phản ứng miễn dịch, được sử dụng chủ yếu trong liệu pháp gen ung thư (thêm thông tin bên dưới).

Ngoài ra, thông tin gen mới có thể được đưa vào cơ thể con người, như một phần của các tế bào in vitro đã được biến đổi trước của chính nó. cách tiếp cận ex vivo. Cách tiếp cận mà thông tin gen được đưa trực tiếp vào tế bào của người sống được gọi là (đột ngột) in vivo, giới thiệu cục bộ đến một số khu vực cụ thể được gọi là in situ. Hiện tại, đã có những tiền lệ thành công trong việc đưa thông tin gen vào tử cung (vào phôi thai), ở Anh, gần đây nhất đã cứu một đứa trẻ khỏi bệnh ty lạp thể.

Các phương pháp điều trị gen bổ sung:

· Antisense DNA, RNA (+): đặc hiệu, có thể được sử dụng trong bất kỳ vector nào, không gây miễn dịch; (-): suy thoái nhanh chóng trong tế bào);

Ribozyme (+): có đặc tính của enzyme - chúng không bị tiêu thụ, chúng có khả năng xúc tác sự phân cắt đích, không giống như protein, chúng không gây miễn dịch, chúng cảm ứng tổng hợp interferon; (-): suy thoái nhanh;

các protein âm tính vượt trội;

Kháng thể chuỗi đơn

· Các gen tự sát (thay vì "điều trị" tế bào, nó có thể bị giết một cách đơn giản, nó được sử dụng trong các hệ thống chống ung thư, (chi tiết hơn sẽ ở bên dưới);

Giới thiệu các tế bào lympho đặc hiệu kháng nguyên;

Chimeroplasty (DNA / RNA lai với cấu trúc kẹp tóc tạo ra sự tái tổ hợp tương đồng trong nhân);

Đây chỉ là những ví dụ về phương pháp điều trị gen, xem mô tả về các bệnh ở các phiếu đã đánh số trước.

Các bệnh đơn nguyên:

Thiếu hụt Adenosine deaminase(Hội chứng ADA) là ví dụ tương đối thành công đầu tiên về việc sử dụng liệu pháp gen. Nó được thực hiện vào ngày 14 tháng 9 năm 1990. Ngày này được coi là ngày sinh của liệu pháp gen thực sự.

Sử dụng bạch cầu, tế bào đơn nhân được phân lập từ máu ngoại vi, sau đó chúng được nuôi cấy trong điều kiện tăng sinh tế bào T. Sau đó, một vec tơ retrovirus có chứa gen ADA bình thường được đưa vào các tế bào tăng sinh trong ống nghiệm. Vài ngày sau, các tế bào máu đã được chuyển nạp được tiêm trở lại bệnh nhân. Quá trình này được lặp lại 7 lần trong 10 tháng. Hiệu quả là tích cực, ¼ tế bào bạch huyết trong cơ thể nhận được một gen hoạt động. Cứ 3-5 tháng một lần, việc giới thiệu các tế bào đã được sửa đổi được lặp lại. Hiện tại, liệu pháp gen cho căn bệnh này đang được phát triển theo hướng sử dụng tế bào gốc của bệnh nhân. Điều này sẽ làm giảm đáng kể số lần tiêm các tế bào biến đổi do nhiều phân chia của chúng đã có trong cơ thể, và khi đạt được lợi thế chọn lọc và định lượng của tế bào gốc đã sửa đổi so với tế bào gốc, nó sẽ tạo thành một mức đủ lượng enzyme trong cơ thể. .

Tăng cholesterol máu di truyền - Người ta biết rằng các tế bào gan không phân chia không thể bị nhiễm retrovirus. Sau khi cắt gan, tế bào gan bắt đầu tăng sinh và có khả năng bị nhiễm retrovirus. Gen cDNA cho thụ thể LDL-R bình thường đã được đưa vào tế bào gan thu được từ gan của bệnh nhân bằng cách sử dụng vec tơ retrovirus. Sau khi tái truyền các tế bào gan tái tổ hợp qua tĩnh mạch cửa vào gan, đã quan sát thấy sự giảm nồng độ lipoprotein tỷ trọng thấp trong máu (đặc biệt là cholesterol) và tỷ lệ giữa lipoprotein tỷ trọng thấp với lipoprotein tỷ trọng cao. Điều này có nghĩa là các tế bào được đưa vào thực hiện chức năng in vivo và nội tại hóa và trao đổi cholesterol.

Bệnh máu khó đông B - Các thử nghiệm thành công đã được thực hiện trên chó sử dụng chiến lược ex vivo với
phân phối yếu tố IX mã hóa cDNA vào tế bào gan. Có thể đạt được sự tổng hợp yếu tố IX với lượng chiếm 0,1% lượng yếu tố IX bình thường trong huyết tương. Trong một nỗ lực để tăng nồng độ của yếu tố IX, các vectơ adenoviral đã được sử dụng, nhưng tác dụng chỉ tồn tại trong thời gian ngắn. Máu của động vật đông lại, nhưng hiệu ứng biến mất hoàn toàn sau 2 tháng (sự thiếu hụt điển hình của vectơ adenoviral).

Bệnh máu khó đông A -Đã có báo cáo về việc đưa thành công gen yếu tố VIII cắt ngắn vào chuột như một phần của vector retrovirus. Kết quả là, mức độ điều trị của yếu tố trong máu đạt được.

Bệnh xơ nang - Người ta đã chứng minh rằng việc thay thế 6-10% tế bào của biểu mô phổi bằng các tế bào bị nhiễm sẽ khôi phục các chức năng vận chuyển bình thường của các kênh xuyên màng đảm bảo vận chuyển các ion clorua. Các retrovirus không thích hợp, vì chúng không lây nhiễm sang các tế bào không phân chia, adenovirus thích hợp với các bệnh bảo lưu, vì chúng gây ra các phản ứng viêm trong các thí nghiệm trên chuột. Vấn đề cũng nằm ở hàng rào glycocalyx trên bề mặt tế bào. Một cách tiếp cận để giải quyết vấn đề này là sửa đổi vector, bao gồm một phối tử cụ thể cho thụ thể trên bề mặt tế bào biểu mô phổi. Sự tương tác của phối tử với thụ thể thường dẫn đến nội tại của vector, cùng với thụ thể, vào trong tế bào. Thụ thể xuyên màng P2Y2-R được chọn làm thụ thể như vậy. Thụ thể này có liên quan đến việc kích hoạt một loạt các phản ứng viêm trong khoang phổi. Kháng thể đơn dòng đối với thụ thể này hoặc phối tử tự nhiên, biotinUTP, được sử dụng làm phối tử.

Bệnh teo cơ Duchenne - Bệnh bắt đầu biểu hiện từ thời thơ ấu, và nên tiến hành liệu pháp gen cùng lúc. Triển vọng nhất là việc sử dụng vectơ adenovirus. Do chiều dài lớn của gen, các nhà nghiên cứu sử dụng các bản sao protein bị cắt ngắn nhưng có chức năng. Các thí nghiệm trên mô hình chuột có gen dystrophin bị lỗi đã chỉ ra rằng 5 đến 50% tế bào cơ biểu hiện protein dystrophin bị cắt ngắn. Điều này đủ để giảm thiểu sự thoái hóa cơ. Có dữ liệu về các thử nghiệm lâm sàng về cấu trúc di truyền mang gen dystrophin để điều trị bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne. Trẻ em bị bệnh, sau khi tiêm vào các cơ của thiết kế này, có khả năng di chuyển. Tuy nhiên, hiệu quả chỉ tồn tại trong thời gian ngắn.

Các bệnh đa yếu tố trên ví dụ về các bệnh ung thư:

Ung thư thường là kết quả của những thay đổi tế bào nhiều giai đoạn. Sự phức tạp liên quan đến sự tham gia của nhiều gen và các sản phẩm của chúng trong quá trình tạo khối u đã làm dấy lên nghi ngờ về hiệu quả của liệu pháp gen đối với bệnh ung thư. Tuy nhiên, có rất nhiều thí nghiệm cho thấy sự bù đắp của một gen ức chế duy nhất có thể dẫn đến việc ngăn chặn các đặc tính khối u của tế bào.

Liệu pháp miễn dịch ung thư:

Việc sử dụng liệu pháp gen có tác dụng kích thích phản ứng chống khối u miễn dịch (chủ yếu là tế bào). Để tạo ra cấu trúc gen, các gen được sử dụng: Kháng nguyên (mà hệ thống miễn dịch hoạt động); Phức hợp MHCI (phức hợp tương hợp mô chính); yếu tố B7; Cytokine; Các thụ thể tế bào T. Có thể ức chế sự phát triển của khối u bằng cách nhân bản gen của các cytokine: interleukins IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, cũng như yếu tố hoại tử khối u-α (TNF-α), interferon (INF-α, INF-ϒ)

Ức chế sự phát triển của tế bào ung thư bằng cách đưa vào chúng những gen mà sản phẩm của chúng ức chế sự phát triển của khối u:

Các gen ức chế khối u (RB, P53, mdm2, Cip 1, P16, Cyclin D)

gen tự sát

chất ức chế sinh ung thư.

Các yếu tố chống hình thành mạch

chất ức chế cyclin

Các gen làm tăng độ nhạy cảm của tế bào khối u với các hợp chất thuốc

Các gen vận chuyển thuốc (ví dụ, đưa vào tế bào tủy xương)

Có tầm quan trọng lớn trong việc ngăn chặn ung thư là gen p53 (chịu trách nhiệm cho quá trình apoptosis và có khả năng dừng chu kỳ tế bào, ngăn chặn sự phân chia không kiểm soát), vì vậy đột biến của nó hầu như luôn dẫn đến sự biến đổi ác tính của tế bào. Các vectơ Adenovirus được sử dụng để đưa một bản sao hoạt động của gen p53 vào cơ thể. Sau khi bắt đầu biểu hiện gen p53 trong nhân tế bào ung thư, nó gây ra quá trình chết rụng.

Một cách tiếp cận khác là ngăn chặn ung thư. Một đột biến trong gen RAS có thể dẫn đến hoạt động cấu thành của hệ thống tín hiệu kích hoạt phân chia (thác MAP kinase, hãy nhớ Nikolaichik J). Để ngăn chặn gen này, người ta có thể 1) ức chế sự biểu hiện RAS bằng cách đưa vào gen nguyên vẹn; 2) ức chế RAS bởi ribozyme; 3) sự ức chế của các gen cơ bản trong con đường tín hiệu; 4) ngăn cản sự kết hợp của protein RAS vào màng.

Sử dụng vi rút oncolytic. Vi-rút oncolysis là một cách tiếp cận mới về cơ bản để điều trị các bệnh ung thư, dựa trên khả năng tự nhiên của vi-rút để tiêu diệt (lyse) các tế bào mà chúng sinh sôi. Để làm được điều này, người ta sử dụng các loại virus tái sinh, virus bại liệt, virus echovirus và virus Coxsackie + một số adenovirus đã biến đổi, chủ yếu sinh sôi trong các tế bào khối u và dẫn chúng đến quá trình chết theo phương pháp apoptosis. REOLYSIN, được sản xuất bởi Oncolytic Biotech, hiện đang được thử nghiệm lâm sàng. Adenovirus biểu hiện các protein chống tạo mạch được coi là rất hứa hẹn.

Giới thiệu

Hàng năm, ngày càng có nhiều bài báo xuất hiện trên các tạp chí khoa học về các nghiên cứu lâm sàng y khoa, trong đó, bằng cách này hay cách khác, một phương pháp điều trị dựa trên sự đưa vào các gen khác nhau đã được sử dụng - liệu pháp gen. Hướng này đã phát triển ra khỏi các ngành sinh học phát triển như di truyền phân tử và công nghệ sinh học.

Thông thường, khi các phương pháp thông thường (bảo tồn) đã được thử nghiệm, thì liệu pháp gen có thể giúp bệnh nhân sống sót và thậm chí hồi phục hoàn toàn. Ví dụ, điều này áp dụng cho các bệnh đơn gen di truyền, tức là những bệnh do khiếm khuyết ở một gen đơn lẻ cũng như nhiều gen khác gây ra. Hoặc, ví dụ, liệu pháp gen có thể giúp đỡ và cứu một chi cho những bệnh nhân bị thu hẹp lòng mạch ở chi dưới và kết quả là thiếu máu cục bộ dai dẳng của các mô xung quanh đã phát triển, tức là các mô này bị thiếu hụt nghiêm trọng chất dinh dưỡng và oxy thường được máu vận chuyển qua cơ thể. Thông thường không thể điều trị những bệnh nhân như vậy bằng các biện pháp phẫu thuật và thuốc, nhưng nếu các tế bào bị buộc phải thải ra nhiều yếu tố protein hơn có thể ảnh hưởng đến quá trình hình thành và nảy mầm của các mạch mới, thì chứng thiếu máu cục bộ sẽ trở nên ít rõ rệt hơn nhiều và nó sẽ trở thành người bệnh dễ sống hơn nhiều.

Liệu pháp gen ngày nay có thể được định nghĩa là phương pháp điều trị bệnh bằng cách đưa gen vào tế bào của bệnh nhân với mục đích nhắm vào những khiếm khuyết gen hoặc tạo cho tế bào những chức năng mới. Các thử nghiệm lâm sàng đầu tiên về phương pháp điều trị gen đã được thực hiện gần đây vào ngày 22 tháng 5 năm 1989 để chẩn đoán ung thư. Căn bệnh di truyền đầu tiên mà các phương pháp điều trị gen được áp dụng là suy giảm miễn dịch di truyền.

Hàng năm, số lượng các thử nghiệm lâm sàng được thực hiện thành công để điều trị các bệnh khác nhau bằng liệu pháp gen ngày càng tăng, và đến tháng 1 năm 2014, con số này đã lên tới 2 nghìn người.

Đồng thời, trong nghiên cứu hiện đại về liệu pháp gen, phải tính đến hậu quả của việc thao túng gen hoặc “xáo trộn” (tái tổ hợp) DNA in vivo(lat. nghĩa đen là "còn sống") vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ. Ở các quốc gia có trình độ nghiên cứu tiên tiến nhất trong lĩnh vực này, đặc biệt là ở Hoa Kỳ, các quy trình y tế sử dụng trình tự DNA giác quan phải chịu sự kiểm tra bắt buộc của các ủy ban và ủy ban liên quan. Tại Mỹ, đây là Ủy ban Tư vấn DNA Tái tổ hợp (RAC) và Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) với sự phê duyệt bắt buộc sau đó của dự án bởi giám đốc Viện Y tế Quốc gia (National Institution of Health).

Vì vậy, chúng tôi quyết định rằng phương pháp điều trị này dựa trên thực tế là nếu một số mô của cơ thể thiếu một số yếu tố protein riêng lẻ, thì điều này có thể được sửa chữa bằng cách đưa các gen mã hóa protein thích hợp vào các mô này và mọi thứ sẽ trở nên tuyệt vời hơn. . Bản thân các protein không thể được tiêm vào, bởi vì cơ thể chúng ta sẽ ngay lập tức phản ứng với một phản ứng miễn dịch không yếu và thời gian tác động sẽ không đủ. Bây giờ chúng ta cần quyết định phương pháp chuyển gen vào tế bào.

Sự chuyển giao tế bào

Để bắt đầu, cần giới thiệu định nghĩa của một số thuật ngữ.

Vận chuyển gen được thực hiện bởi vectơ là một phân tử DNA được sử dụng như một "phương tiện" để chuyển nhân tạo thông tin di truyền vào tế bào. Có nhiều loại vectơ: plasmid, virus, cũng như cosmid, phasmid, nhiễm sắc thể nhân tạo, v.v. Điều quan trọng cơ bản là các vectơ (đặc biệt là vectơ plasmid) có các tính chất đặc trưng của chúng:

1. Nguồn gốc của sao chép (ori)- trình tự nucleotit bắt đầu quá trình nhân đôi ADN. Nếu DNA vector không thể được nhân đôi (sao chép), thì hiệu quả điều trị cần thiết sẽ không đạt được, bởi vì nó sẽ nhanh chóng bị phân cắt bởi các enzyme nuclease nội bào, và do thiếu khuôn mẫu, cuối cùng sẽ có ít phân tử protein được hình thành hơn. Cần lưu ý rằng những điểm này là cụ thể cho từng loài sinh học, nghĩa là, nếu DNA vectơ được cho là thu được bằng cách sao chép của nó trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn (và không chỉ bằng tổng hợp hóa học, thường đắt hơn nhiều), thì hai điểm gốc sao chép sẽ được yêu cầu riêng biệt - cho người và cho vi khuẩn;

2. Các trang web hạn chế- các trình tự ngắn cụ thể (thường là palindromic), được nhận biết bởi các enzym đặc biệt (các endonucleaza giới hạn) và được chúng cắt theo một cách nhất định - với sự hình thành các "đầu dính" (Hình 1).

Hình 1 Sự hình thành "các đầu dính" với sự tham gia của các hạn chế

Những vị trí này là cần thiết để liên kết chéo DNA vectơ (thực tế là một "khoảng trống") với các gen trị liệu mong muốn thành một phân tử duy nhất. Một phân tử liên kết chéo từ hai hoặc nhiều phần như vậy được gọi là "tái tổ hợp";

3. Rõ ràng là chúng ta muốn thu được hàng triệu bản sao của phân tử ADN tái tổ hợp. Một lần nữa, nếu chúng ta đang xử lý việc nuôi cấy tế bào vi khuẩn, thì DNA này phải được phân lập thêm. Vấn đề là không phải tất cả vi khuẩn sẽ nuốt phân tử chúng ta cần, một số sẽ không. Để phân biệt giữa hai nhóm này, người ta đưa chúng vào DNA vector điểm đánh dấu chọn lọc- khu vực kháng một số hóa chất; bây giờ, nếu những chất tương tự được thêm vào môi trường, thì chỉ những chất kháng lại chúng sẽ sống sót, và những người còn lại sẽ chết.

Tất cả ba thành phần này có thể được quan sát thấy trong plasmid được tổng hợp nhân tạo đầu tiên (Hình 2).

Hình 2

Quá trình đưa một vector plasmid vào một số tế bào nhất định được gọi là sự chuyển giao. Plasmid là một phân tử DNA khá ngắn và thường hình tròn được tìm thấy trong tế bào chất của tế bào vi khuẩn. Plasmid không liên kết với nhiễm sắc thể vi khuẩn, chúng có thể sao chép độc lập với nó, chúng có thể được vi khuẩn giải phóng vào môi trường hoặc ngược lại, được hấp thụ (quá trình hấp thụ là sự biến đổi). Với sự trợ giúp của plasmid, vi khuẩn có thể trao đổi thông tin di truyền, ví dụ, chuyển tính kháng đối với một số loại kháng sinh.

Plasmid tồn tại trong vi khuẩn in vivo. Nhưng không ai có thể ngăn cản một nhà nghiên cứu tổng hợp nhân tạo một plasmid có các đặc tính mà anh ta cần, khâu một gen chèn vào nó và đưa nó vào tế bào. Các đoạn chèn khác nhau có thể được đưa vào cùng một plasmid .

Phương pháp điều trị gen

Có hai cách tiếp cận chính khác nhau về bản chất của các ô đích:

1. Bào thai, trong đó DNA ngoại lai được đưa vào hợp tử (trứng đã thụ tinh) hoặc phôi ở giai đoạn phát triển ban đầu; trong trường hợp này, người ta mong đợi rằng vật liệu được đưa vào sẽ đi vào tất cả các tế bào của người nhận (và thậm chí cả tế bào mầm, do đó đảm bảo truyền cho thế hệ tiếp theo). Ở nước ta, nó thực sự bị cấm;

2. Xôma, trong đó vật chất di truyền được đưa vào tế bào phi giới tính của sinh vật đã được sinh ra và nó không được truyền sang tế bào mầm.

Liệu pháp gen in vivo dựa trên việc đưa trực tiếp các chuỗi DNA được nhân bản (nhân lên) và được đóng gói cụ thể vào các mô nhất định của bệnh nhân. Đặc biệt hứa hẹn cho việc điều trị các bệnh gen in vivo là việc đưa vào các gen bằng cách sử dụng khí dung hoặc vắc xin tiêm. Liệu pháp gen khí dung đang được phát triển, theo quy luật, để điều trị các bệnh phổi (xơ nang, ung thư phổi).

Sự phát triển của một chương trình liệu pháp gen được thực hiện trước nhiều giai đoạn. Đây là một phân tích kỹ lưỡng về biểu hiện cụ thể của mô của gen tương ứng (tức là tổng hợp trên nền gen của một số protein trong một mô nhất định), và xác định khiếm khuyết sinh hóa cơ bản, đồng thời nghiên cứu cấu trúc, chức năng và phân phối nội bào của sản phẩm protein của nó, cũng như phân tích sinh hóa của quá trình bệnh lý. Tất cả những dữ liệu này đều được tính đến khi lập phác đồ y tế thích hợp.

Điều quan trọng là khi lập sơ đồ chỉnh sửa gen, hiệu quả của quá trình chuyển nạp, mức độ sửa chữa khuyết tật sinh hóa sơ cấp trong điều kiện nuôi cấy tế bào ( trong ống nghiệm,"trong ống nghiệm") và, quan trọng nhất, in vivo trên các mô hình sinh học động vật. Chỉ khi đó, chương trình thử nghiệm lâm sàng mới có thể bắt đầu. .

Phân phối trực tiếp và mang gen trị liệu trong tế bào

Có nhiều phương pháp để đưa DNA ngoại lai vào tế bào nhân thực: một số phụ thuộc vào quá trình xử lý vật lý (điện phân, nhiễm từ, v.v.), một số khác dựa vào việc sử dụng các vật liệu hóa học hoặc các phần tử sinh học (ví dụ như virus) được sử dụng làm chất mang. Điều đáng nói ngay là các phương pháp hóa học và vật lý thường được kết hợp (ví dụ, kết hợp điện + quấn DNA bằng liposome)

Phương pháp trực tiếp

1. Chuyển nạp dựa trên hóa học có thể được phân thành một số loại: sử dụng chất cyclodextrin, polyme, liposome hoặc hạt nano (có hoặc không có chức năng hóa học hoặc virus, tức là biến đổi bề mặt).
a) Một trong những phương pháp rẻ nhất là sử dụng canxi photphat. Nó làm tăng hiệu quả kết hợp DNA vào tế bào lên 10-100 lần. DNA tạo thành một phức hợp mạnh với canxi, đảm bảo sự hấp thụ hiệu quả của nó. Điểm bất lợi là chỉ có khoảng 1 - 10% DNA đến được nhân. Phương pháp được sử dụng trong ống nghiệmđể chuyển DNA vào tế bào người (Hình 3);

Hình 3

b) Việc sử dụng các phân tử hữu cơ phân nhánh cao - dendrimer, để liên kết DNA và chuyển nó vào tế bào (Hình 4);

Hình 4

c) Một phương pháp rất hiệu quả để truyền DNA là đưa nó vào qua liposome - những cơ thể nhỏ, có màng bao quanh, có thể dung hợp với màng tế bào chất (CPM), là một lớp kép của lipid. Đối với tế bào nhân thực, quá trình chuyển nạp hiệu quả hơn với liposome cation vì tế bào nhạy cảm hơn với chúng. Quá trình này có tên riêng - nhiễm mỡ. Phương pháp này được coi là một trong những phương pháp an toàn nhất hiện nay. Liposome không độc và không gây miễn dịch. Tuy nhiên, hiệu quả của việc chuyển gen bằng cách sử dụng liposome bị hạn chế, vì DNA do chúng đưa vào tế bào thường bị lysosome bắt giữ ngay lập tức và bị phá hủy. Việc đưa DNA vào tế bào người với sự trợ giúp của liposome là phương pháp điều trị chính ngày nay. in vivo(hình 5);

Hình 5

d) Một phương pháp khác là sử dụng các polyme cation như dietylaminoetyl-dextran hoặc polyetylenimin. Các phân tử DNA tích điện âm liên kết với các polycation tích điện dương, và phức hợp này sau đó đi vào tế bào bằng quá trình nội bào. DEAE-dextran thay đổi các đặc tính vật lý của màng sinh chất và kích thích tế bào hấp thu phức hợp này. Nhược điểm chính của phương pháp này là DEAE-dextran gây độc ở nồng độ cao. Phương pháp chưa nhận được phân phối trong liệu pháp gen;

e) Với sự trợ giúp của histon và các protein nhân khác. Những protein này, chứa nhiều axit amin tích điện dương (Lys, Arg), trong điều kiện tự nhiên giúp gói gọn một chuỗi DNA dài vào một nhân tế bào tương đối nhỏ.

2. Phương pháp vật lý:

a) Đốt điện là một phương pháp rất phổ biến; Sự gia tăng tức thời tính thấm của màng đạt được do thực tế là các tế bào phải tiếp xúc ngắn với điện trường cường độ cao. Người ta đã chỉ ra rằng trong điều kiện tối ưu số lượng chất biến nạp có thể đạt tới 80% số tế bào sống sót. Nó hiện không được sử dụng trên người (Hình 6).

Hình 6

b) "Ép chặt tế bào" - một phương pháp được phát minh vào năm 2013. Nó cho phép bạn cung cấp các phân tử đến các tế bào bằng cách "ép mềm" màng tế bào. Phương pháp này loại bỏ khả năng gây độc hoặc trúng mục tiêu, vì nó không phụ thuộc vào vật liệu bên ngoài hoặc điện trường;

c) Kết hợp - một phương pháp chuyển nhân tạo DNA ngoại lai vào tế bào bằng cách cho chúng tiếp xúc với sóng siêu âm, làm mở các lỗ trên màng tế bào;
d) Truyền quang - một phương pháp trong đó tạo ra một lỗ nhỏ trên màng (đường kính khoảng 1 µm) bằng cách sử dụng tia laser hội tụ cao;
e) Chuyển nạp thủy động lực học - một phương pháp để cung cấp các cấu trúc di truyền, protein, v.v. bởi sự gia tăng có kiểm soát của áp suất trong các mao mạch và dịch kẽ, gây ra sự gia tăng tính thấm của màng tế bào trong thời gian ngắn và hình thành các lỗ chân lông tạm thời trong đó. Nó được thực hiện bằng cách tiêm nhanh vào mô, trong khi phân phối không đặc hiệu. Hiệu quả phân phối cho cơ xương - 22 đến 60% ;

f) Vi tiêm DNA - đưa vào nhân tế bào động vật bằng cách sử dụng các vi ống thủy tinh mỏng (d = 0,1-0,5 µm). Nhược điểm là độ phức tạp của phương pháp, khả năng phá hủy nhân hoặc DNA cao; một số lượng giới hạn các tế bào có thể được biến đổi. Không được sử dụng cho con người.

3. Phương pháp dựa trên hạt.

a) Phương pháp tiếp cận trực tiếp để chuyển gen là súng bắn gen, trong đó ADN được ghép nối thành một hạt nano với chất rắn trơ (thường là vàng, vonfram), sau đó "bắn" trực tiếp vào nhân của tế bào đích. Phương pháp này được áp dụng trong ống nghiệm và in vivođể đưa các gen, đặc biệt, vào các tế bào của mô cơ, ví dụ, trong một căn bệnh như chứng loạn dưỡng cơ Duchenne. Kích thước của các hạt vàng là 1-3 micron (Hình 7).

Hình 7

b) Từ tính - một phương pháp sử dụng lực từ tính để cung cấp DNA đến các tế bào đích. Đầu tiên, axit nucleic (NA) được liên kết với các hạt nano từ tính, sau đó, dưới tác dụng của từ trường, các hạt sẽ được đưa vào tế bào. Hiệu quả gần như là 100%, không có độc tính rõ ràng được ghi nhận. Sau 10-15 phút, các hạt đã được đăng ký trong tế bào - điều này nhanh hơn nhiều so với các phương pháp khác.
c) Không hoàn hảo (không hoàn hảo; "impalement", lit. "impaling" + "nhiễm trùng") - một phương pháp phân phối sử dụng vật liệu nano như ống nano carbon và sợi nano. Trong trường hợp này, các tế bào thực sự bị xuyên thủng bởi một lớp các sợi nano. Tiền tố "nano" được sử dụng để biểu thị kích thước rất nhỏ của chúng (trong phần tỷ mét) (Hình 8).

Hình 8

Riêng biệt, cần làm nổi bật một phương pháp như chuyển nạp RNA: không phải DNA được chuyển đến tế bào, mà là các phân tử RNA - “người kế vị” của chúng trong chuỗi sinh tổng hợp protein; đồng thời, các protein đặc biệt được kích hoạt để cắt RNA thành các đoạn ngắn - cái gọi là. RNA can thiệp nhỏ (siRNA). Những đoạn này liên kết với các protein khác và cuối cùng, điều này dẫn đến sự ức chế sự biểu hiện của các gen tương ứng của tế bào. Do đó, có thể ngăn chặn hoạt động của các gen trong tế bào có khả năng gây hại nhiều hơn lợi vào lúc này. Chuyển nạp RNA đã được tìm thấy ứng dụng rộng rãi, đặc biệt, trong ung thư học.

Các nguyên tắc cơ bản của việc phân phối gen bằng cách sử dụng vectơ plasmid được xem xét. Bây giờ chúng ta có thể chuyển sang việc xem xét các phương pháp lan truyền. Virus là dạng sống không tế bào, thường là một phân tử axit nucleic (DNA hoặc RNA) được bọc trong một lớp áo protein. Nếu chúng ta loại bỏ khỏi vật chất di truyền của vi rút tất cả các trình tự gây ra sự xuất hiện của bệnh tật, thì toàn bộ vi rút cũng có thể được biến thành “phương tiện” cho gen của chúng ta.

Quá trình đưa DNA vào tế bào, qua trung gian của vi rút, được gọi là sự chuyển giao.
Trong thực tế, retrovirus, adenovirus và virus liên quan đến adeno (AAV) được sử dụng phổ biến nhất. Để bắt đầu, cần phải tìm ra đâu là ứng cử viên lý tưởng cho quá trình truyền tải giữa các virus. Tiêu chí là nó phải là:

ổn định;
. khả năng chứa một lượng DNA đủ lớn;
. trơ liên quan đến các con đường trao đổi chất của tế bào;
. chính xác - lý tưởng nhất là nó nên tích hợp bộ gen của mình vào một vị trí cụ thể của bộ gen của nhân vật chủ, v.v.

Trong cuộc sống thực, rất khó để kết hợp ít nhất một vài điểm, do đó, sự lựa chọn thường xảy ra khi xem xét từng trường hợp riêng biệt (Hình 9).

Hình 9

Trong ba loại virus được sử dụng nhiều nhất được liệt kê, AAV là an toàn nhất và đồng thời là chính xác nhất. Hầu như nhược điểm duy nhất của chúng là công suất tương đối nhỏ (khoảng 4800 bp), tuy nhiên, hóa ra lại đủ cho nhiều gen .

Ngoài các phương pháp trên, liệu pháp gen thường được sử dụng kết hợp với liệu pháp tế bào: đầu tiên, nuôi cấy một số tế bào người nhất định được đưa vào môi trường dinh dưỡng, sau đó các gen cần thiết được đưa vào tế bào bằng cách này hay cách khác, nuôi cấy để một thời gian và lại được cấy vào cơ thể vật chủ. Kết quả là, các tế bào có thể trở lại đặc tính bình thường của chúng. Vì vậy, ví dụ, các tế bào bạch cầu của con người (bạch cầu) đã được sửa đổi trong bệnh bạch cầu (Hình 10).

Hình 10

Số phận của gen sau khi nó xâm nhập vào tế bào

Vì mọi thứ đều rõ ràng hơn hoặc ít hơn với các vectơ virut do khả năng phân phối gen hiệu quả hơn đến mục tiêu cuối cùng - hạt nhân, chúng ta sẽ dựa vào số phận của vectơ plasmid.

Ở giai đoạn này, chúng ta đã đạt được rằng DNA đã vượt qua rào cản lớn đầu tiên - màng tế bào chất của tế bào.

Hơn nữa, khi kết hợp với các chất khác, có hoặc không có vỏ, nó cần đến được nhân tế bào để một loại enzyme đặc biệt - RNA polymerase - tổng hợp phân tử RNA thông tin (mRNA) trên khuôn mẫu DNA (quá trình này được gọi là phiên mã). Chỉ sau đó, mRNA sẽ đi vào tế bào chất, tạo thành một phức hợp với ribosome, và theo mã di truyền, một polypeptide được tổng hợp - ví dụ, yếu tố tăng trưởng mạch máu (VEGF), sẽ bắt đầu thực hiện một chức năng điều trị nhất định ( trong trường hợp này, nó sẽ bắt đầu quá trình hình thành phân nhánh mạch máu trong mô dễ bị thiếu máu cục bộ).

Liên quan đến sự biểu hiện của các gen được giới thiệu trong loại tế bào mong muốn, vấn đề này được giải quyết với sự trợ giúp của các yếu tố điều hòa phiên mã. Mô mà sự biểu hiện xảy ra thường được xác định bằng sự kết hợp của chất tăng cường đặc hiệu của mô (trình tự "tăng cường") với trình tự khởi đầu cụ thể (trình tự nucleotide mà từ đó RNA polymerase bắt đầu tổng hợp), có thể cảm ứng được. . Người ta biết rằng hoạt động của gen có thể được điều chỉnh in vivo tín hiệu bên ngoài và vì chất tăng cường có thể hoạt động với bất kỳ gen nào, chất cách điện cũng có thể được đưa vào các vectơ giúp chất tăng cường hoạt động bất kể vị trí của nó và có thể hoạt động như hàng rào chức năng giữa các gen. Mỗi chất tăng cường chứa một tập hợp các vị trí liên kết để kích hoạt hoặc ngăn chặn các yếu tố protein. Các chất kích thích cũng có thể điều chỉnh mức độ biểu hiện của gen. Ví dụ, có metallothionein hoặc chất xúc tiến nhạy cảm với nhiệt độ; kích thích tố thúc đẩy điều khiển.

Sự biểu hiện của một gen phụ thuộc vào vị trí của nó trong bộ gen. Trong hầu hết các trường hợp, các phương pháp virut hiện có chỉ dẫn đến việc chèn ngẫu nhiên một gen vào bộ gen. Để loại bỏ sự phụ thuộc như vậy, khi xây dựng vectơ, gen được cung cấp các trình tự nucleotit đã biết cho phép gen được biểu hiện bất kể vị trí chèn của nó vào bộ gen.

Cách đơn giản nhất để điều chỉnh sự biểu hiện của gen chuyển là cung cấp cho nó một chất xúc tiến chỉ thị nhạy cảm với một tín hiệu sinh lý như giải phóng glucose hoặc thiếu oxy. Hệ thống kiểm soát "nội sinh" như vậy có thể hữu ích trong một số trường hợp, chẳng hạn như kiểm soát sản xuất insulin phụ thuộc vào glucose. Đáng tin cậy và linh hoạt hơn là các hệ thống kiểm soát "ngoại sinh", khi sự biểu hiện gen được kiểm soát về mặt dược lý bằng cách đưa vào cơ thể một phân tử thuốc nhỏ. Hiện tại, 4 hệ thống kiểm soát chính được biết đến - được điều chỉnh bởi tetracycline (Tet), một loại steroid côn trùng, ecdysone hoặc các chất tương tự của nó, thuốc antiprogestin maifpristone (RU486) và dimerizer hóa học như rapamycin và các chất tương tự của nó. Tất cả chúng đều liên quan đến việc tuyển dụng phụ thuộc vào thuốc của miền kích hoạt phiên mã tới trình tự khởi động chính dẫn đầu gen mong muốn, nhưng khác nhau về cơ chế tuyển dụng này. .

Sự kết luận

Việc xem xét lại dữ liệu dẫn đến kết luận rằng, bất chấp nỗ lực của nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới, tất cả các phòng thí nghiệm đều đã được biết đến và thử nghiệm. in vivo và trong ống nghiệm hệ thống vectơ còn lâu mới hoàn hảo . Nếu vấn đề phân phối DNA ngoại lai trong ống nghiệm thực tế đã được giải quyết và phân phối của nó đến các tế bào đích của các mô khác nhau in vivođã giải quyết thành công (chủ yếu bằng cách tạo ra các cấu trúc mang các protein thụ thể, bao gồm các kháng nguyên đặc hiệu cho một số mô nhất định), thì các đặc điểm khác của hệ thống vectơ hiện có - tính ổn định tích hợp, biểu hiện được điều chỉnh, tính an toàn - vẫn cần được cải thiện nghiêm túc.

Trước hết, nó liên quan đến sự ổn định của hội nhập. Cho đến nay, việc tích hợp vào hệ gen chỉ đạt được bằng cách sử dụng các vectơ liên kết với virus hoặc adeno. Hiệu quả của tích hợp ổn định có thể được cải thiện bằng cách cải thiện cấu trúc gen chẳng hạn như hệ thống trung gian thụ thể hoặc bằng cách tạo ra các vectơ tầng sinh đủ ổn định (nghĩa là, cấu trúc DNA có khả năng cư trú lâu dài bên trong nhân). Gần đây, người ta đặc biệt chú ý đến việc tạo ra các vector dựa trên nhiễm sắc thể nhân tạo của động vật có vú. Do sự hiện diện của các yếu tố cấu trúc cơ bản của nhiễm sắc thể thường, các nhiễm sắc thể nhỏ như vậy được giữ lại trong tế bào trong một thời gian dài và có thể mang các gen kích thước đầy đủ (bộ gen) và các yếu tố điều hòa tự nhiên của chúng, cần thiết cho hoạt động chính xác của gen, ở đúng mô và vào đúng thời điểm.

Liệu pháp gen và tế bào mở ra triển vọng rực rỡ cho việc phục hồi các tế bào và mô đã mất và thiết kế kỹ thuật di truyền của các cơ quan, chắc chắn sẽ mở rộng đáng kể kho phương pháp nghiên cứu y sinh và tạo ra những cơ hội mới để bảo tồn và kéo dài tuổi thọ con người.

Ngày nay, liệu pháp gen cuối cùng cũng bắt đầu chứng minh cho những hy vọng từng được đặt vào nó. Trong sáu năm qua, kết quả của việc đưa các gen chức năng cụ thể vào các bộ phận của cơ thể bệnh nhân, có thể khôi phục thị lực ở 40 bệnh nhân bị mù di truyền. Kết quả đáng kể đã đạt được trong cuộc chiến chống lại các dạng bệnh bạch cầu khác nhau: trong số 120 đối tượng, một số bệnh nhân đã thuyên giảm, kéo dài trong ba năm. Liệu pháp gen đã cho thấy hiệu quả của nó trong cuộc chiến chống lại bệnh ưa chảy máu - một căn bệnh di truyền, đôi khi dẫn đến cái chết của bệnh nhân. Giờ đây người bệnh không cần dùng đến các loại thuốc làm tăng quá trình đông máu và có tác dụng phụ nguy hiểm.

Kết quả khả quan đã được chào đón một cách nhiệt tình cũng bởi vì liệu pháp gen đã được đưa vào yên nghỉ cách đây 15 năm sau cái chết không đúng lúc của Jesse Gelsinger, một thiếu niên mắc chứng rối loạn tiêu hóa hiếm gặp. Hệ thống miễn dịch của một thanh niên đã phản ứng với sự xâm nhập của một gen lạ đến mức cơ thể không thể chịu đựng được. Thành công của liệu pháp gen trong những năm 1990 gần như không ấn tượng như mong đợi.

Tất cả những điều này đã khiến chúng tôi xem xét lại một số phương pháp được sử dụng và đánh giá tỉnh táo hơn khả năng sử dụng liệu pháp gen để loại bỏ các bệnh lý khác nhau. Tôi phải chia tay với ảo tưởng và quay trở lại nghiên cứu cơ bản. Trước hết, cần phải xác định nguyên nhân của các tác dụng phụ có thể xảy ra (như những tác dụng phụ dẫn đến cái chết của Gelsinger) và học cách tránh chúng. Cần chú ý nhiều hơn đến việc giao tiếp với bệnh nhân và thân nhân của họ, để họ đưa ra quyết định là có ý thức.

Bước ngoặt xảy ra cách đây 6 năm sau khi liệu pháp gen chữa khỏi cho một cậu bé 8 tuổi tên là Corey Haas bị bệnh thoái hóa mắt. Ban đầu, do thao tác gen, protein bị thiếu bắt đầu được tạo ra trong võng mạc mắt trái bị ảnh hưởng, và 4 ngày sau ca phẫu thuật, cậu bé đã đến thăm sở thú và trong niềm vui sướng khôn tả, cậu bé nhận ra rằng mình đang nhìn thấy bầu trời xanh và những quả bóng bay đầy màu sắc. Ba năm sau, các thao tác tương tự đã được thực hiện với mắt phải. Bây giờ Corey có thể nhìn rõ đến mức anh ấy có thể đi săn với ông của mình.

Cho đến nay, liệu pháp gen vẫn chưa đi vào kho vũ khí của các học viên, nhưng có hy vọng rằng điều này sẽ xảy ra trong mười năm tới. Vào năm 2012, một nỗ lực đã được thực hiện ở châu Âu nhằm sử dụng nó để loại bỏ một bệnh lý hiếm gặp nhưng vô cùng đau đớn, cái gọi là thiếu hụt lipoprotein lipase gia đình. Hoa Kỳ dự kiến ​​sẽ nhận được sự chấp thuận cho việc sử dụng liệu pháp gen trong y học vào năm 2016, và sau đó họ sẽ phải bắt kịp những gì đã mất trong mười năm không hoạt động.

Thất vọng kinh khủng

Những thất bại đối với các nhà nghiên cứu trong giai đoạn đầu áp dụng liệu pháp gen vào thực tế đã cho thấy rõ ràng rằng việc đưa gen lạ vào cơ thể là khó khăn như thế nào. Thông thường, hệ thống phân phối an toàn nhất không đủ hiệu quả và một số hệ thống phân phối hiệu quả nhất không an toàn: phản ứng miễn dịch hoạt động quá mức, như trường hợp của Gelsinger, phát triển hoặc bệnh bạch cầu phát triển.

Để hiểu những gì gây ra tác dụng phụ và làm thế nào để giảm nguy cơ mắc chúng, các nhà di truyền học đã tập trung nghiên cứu kỹ lưỡng hệ thống phân phối gen phổ biến nhất: thiết kế virus hoạt động giống như một ống tiêm siêu nhỏ.

Trước hết, một phần đáng kể DNA của virus đã bị loại bỏ để nhường chỗ cho các gen dự định đưa vào cơ thể bệnh nhân. (Quy trình này đồng thời khiến vi rút không thể tái tạo.) Vi rút đã biến đổi mang các gen mục tiêu được tiêm vào phần chính xác của cơ thể, nơi nó chèn chúng vào các vùng thích hợp của DNA tế bào, tùy thuộc vào loại vi rút.

Trong thời gian Gelsinger tình nguyện tham gia các thử nghiệm lâm sàng về liệu pháp gen, hệ thống phân phối gen ngoại lai phổ biến nhất ở người là adenovirus, thường gây nhiễm trùng đường hô hấp trên nhẹ. Theo các nhà nghiên cứu từ Đại học Pennsylvania, kết quả tốt nhất là tiêm vi rút vào gan; đây là nơi chứa các tế bào sản xuất enzym tiêu hóa mà Gelsinger thiếu. Một bản sao chức năng của gen cho enzym này đã được đưa vào một hạt virus bất hoạt và hàng nghìn tỷ hạt như vậy đã được tiêm vào gan của bệnh nhân.

Thật không may, một số hạt không chỉ xâm nhập vào các tế bào gan, như chúng được cho là, mà còn vào một số lượng lớn các đại thực bào - các tế bào lớn, "lính canh" của hệ thống miễn dịch, cũng như vào các tế bào đuôi gai, thông báo cho tế bào sau. của sự xâm lược của các tác nhân nước ngoài. Hệ thống miễn dịch ngay lập tức bắt đầu tiêu diệt tất cả các tế bào bị nhiễm bệnh, và quá trình bạo lực này cuối cùng đã giết chết bệnh nhân.

Các nhà nghiên cứu phải kinh ngạc về mức độ nghiêm trọng của phản ứng miễn dịch. Không ai trong số 17 tình nguyện viên khác có bất cứ điều gì như thế này. Người ta đã biết rằng adenovirus có thể tạo ra phản ứng miễn dịch, nhưng ngoài một con khỉ được tiêm adenovirus hơi khác với con được mô tả ở trên, trường hợp của Gelsinger là duy nhất. James Wilson thuộc Đại học Pennsylvania, người đã phát triển hệ thống phân phối gen mục tiêu được sử dụng trong các thử nghiệm lâm sàng của Gelsinger cho biết: “Dân số con người không đồng nhất hơn nhiều so với quần thể động vật. từ những người khác." Có lẽ thảm kịch sẽ không xảy ra nếu liều lượng vi rút ít hơn - không phải một nghìn tỷ hạt, mà là vài tỷ. Một thiếu sót khác là cả bản thân bệnh nhân và người thân của anh ta đều không được thông báo về cái chết của con khỉ trong các xét nghiệm tương tự, và không ai biết họ sẽ đưa ra quyết định gì nếu biết về vụ việc.

Bi kịch xảy đến với Gelsinger không phải là cuối cùng. Ngay sau đó, một nỗ lực đã được thực hiện để loại bỏ một bệnh lý khác với sự trợ giúp của liệu pháp gen - suy giảm miễn dịch kết hợp nghiêm trọng XI (SCID-X1). Các bài kiểm tra có sự tham gia của 20 trẻ em; năm người trong số họ phát triển bệnh bạch cầu và một trẻ em đã chết. Và một lần nữa, hệ thống phân phối lại là nguyên nhân, mặc dù trong trường hợp này, một vector khác đã được sử dụng - một loại retrovirus chèn các gen mục tiêu trực tiếp vào DNA của tế bào. Vị trí chính xác của chúng trong bộ gen thay đổi một chút, và đôi khi chúng bật ra gần gen ung thư, trong những điều kiện nhất định, dẫn đến sự xuất hiện của ung thư.

Sửa đổi công nghệ

Hậu quả bi thảm của việc sử dụng retrovirus và adenovirus làm vector đã buộc chúng ta phải chuyển sang các chất mang khác. Kết quả là hai loại virus đã được chọn.

Loại đầu tiên trong số này, virus liên quan đến adeno (AAV), không gây ra bất kỳ bệnh nhiễm trùng nào ở người. Hầu hết chúng ta vào lúc này hay lúc khác trong cuộc đời đều trở thành vật mang mầm bệnh, và chính vì điều này mà hệ thống miễn dịch không có khả năng phản ứng với nó khi nó hoạt động như một vật trung gian. AAV có một tính năng khác giúp giảm thiểu nguy cơ tác dụng phụ: nó được đại diện bởi nhiều loại (serotype), mỗi loại thích lây nhiễm các tế bào của cơ quan hoặc mô “riêng” của nó. Vì vậy, đối với AAV2, đây là đôi mắt, đối với AAV8 là gan, đối với AAV9, cơ tim và não. Có thể lựa chọn chủng vi rút tối ưu cho bộ phận cơ thể đích và giảm thiểu đáp ứng miễn dịch và các tác dụng không mong muốn khác. Ngoài ra, AAVue kết hợp vật liệu di truyền của nó vào bộ gen của tế bào chủ và do đó không thể gây ung thư bằng cách kích hoạt ngẫu nhiên các tế bào sinh ung thư.

Lần đầu tiên vi rút liên quan đến Adeno được thử nghiệm về khả năng cung cấp vật chất di truyền đến các mô đích vào năm 1996. Các thử nghiệm được tiến hành trên những người tình nguyện bị bệnh xơ nang. Kể từ đó, 11 kiểu huyết thanh của vi rút đã được xác định, và hàng trăm vectơ chọn lọc, an toàn đã được xây dựng từ các thành phần của chúng. Các vectơ dựa trên AAV hiện đang được thử nghiệm cho liệu pháp gen trong các bệnh lý như bệnh Parkinson và bệnh Alzheimer, cũng như bệnh ưa chảy máu, loạn dưỡng cơ, suy tim và mù lòa.

Loại vi rút thứ hai, đáng ngạc nhiên, là một phiên bản suy yếu của vi rút suy giảm miễn dịch ở người, tác nhân gây ra bệnh AIDS. Hãy quên một chút về danh tiếng xấu của nó và tập trung vào những lợi thế của nó như một vector. HIV là một thành viên của chi Lentivirus của họ rstrovirus. Nó ảnh hưởng đến các tế bào của hệ thống miễn dịch và - điều rất quan trọng - không kích hoạt các tế bào sinh ung thư.

Nếu chúng ta loại bỏ các gen chịu trách nhiệm về tác động gây chết người của HIV, thì chúng ta sẽ có được một vector tuyệt vời với nhiều khả năng. Stuart Naylor, cựu giám đốc khoa học của công ty Anh ngữ Oxford Biomedica, nói. Ngược lại với AAV nhỏ hơn, HIV "vô hiệu hóa" thích hợp cho việc chuyển một số gen cùng một lúc. Nó không độc và không gây ra phản ứng miễn dịch. Không còn khả năng gây nhiễm trùng, các vi khuẩn đậu lăng đang được kiểm tra khả năng sử dụng chúng để loại bỏ các bệnh lý khác nhau, đặc biệt là chứng loạn dưỡng mỡ. Cho đến nay, một số nam sinh mắc bệnh chẩn đoán này đã có thể trở lại trường học nhờ liệu pháp gen.

Song song với các thử nghiệm lâm sàng sử dụng HIV AAVn, công việc đang được tiến hành để sửa đổi các vectơ virut cũ để chúng có thể được sử dụng trong một số trường hợp nhất định. Vì vậy, retrovirus (ngoại trừ HIV) được biến đổi gen để chúng không gây ra bệnh bạch cầu.

Ngay cả adenovirus, việc sử dụng chúng đã dẫn đến cái chết của Gelsinger, cũng sẽ không bị bác bỏ hoàn toàn. Hiện nó chỉ được tiêm vào các bộ phận của cơ thể, nơi nó không có khả năng tạo ra phản ứng miễn dịch. Một ứng dụng tiềm năng là liệu pháp gen cho bệnh khô miệng (khô miệng) ở những bệnh nhân tiếp xúc với bức xạ đối với bệnh ung thư đầu và cổ. trong đó tuyến nước bọt bị tổn thương.

Viện Y tế Quốc gia đang tiến hành một thử nghiệm lâm sàng (với một số lượng nhỏ tình nguyện viên) về một phương pháp dựa trên việc đưa vào các tế bào thích hợp của các gen làm trung gian hình thành các kênh dẫn nước đến các tuyến nước bọt. Vì loại thứ hai nhỏ và ít nhiều bị cô lập, và liều lượng vi rút ít hơn 1.000 lần so với Gelsinger đã nhận, khả năng xảy ra phản ứng miễn dịch quá mạnh được giảm thiểu. Theo các nhà phát triển, các hạt vi rút chưa đến được tế bào đích nên bị tiêu diệt trong nước bọt, nhổ ra cùng với nó hoặc nuốt vào, điều này một lần nữa làm giảm nguy cơ phát triển phản ứng miễn dịch. Kể từ năm 2006, phương pháp này đã cải thiện đáng kể tình trạng của 11 bệnh nhân.

Mục tiêu mới

Được khích lệ bởi thành công này, các nhà di truyền y học đã mở rộng phạm vi của liệu pháp gen và cố gắng loại bỏ các khuyết tật di truyền không di truyền với sự trợ giúp của nó.

Ví dụ, Đại học Pennsylvania đã sử dụng phương pháp này trong cuộc chiến chống lại một trong những bệnh ung thư phổ biến nhất ở trẻ em - bệnh bạch cầu nguyên bào lympho cấp tính (ALL). Khoảng 20% ​​trẻ em với chẩn đoán này không được hỗ trợ bởi hóa trị liệu thông thường.

Liệu pháp gen trong những trường hợp như vậy đặc biệt phức tạp và phụ thuộc vào việc sử dụng các thụ thể kháng nguyên chimeric (CAR). Giống như chimeras trong thần thoại Hy Lạp cổ đại, bao gồm các bộ phận cơ thể của các loài động vật khác nhau, các thụ thể này là một phức hợp của hai thành phần của hệ thống miễn dịch mà bình thường không có trong cơ thể. Các tế bào T mà nó được gắn vào có khả năng tìm kiếm các protein cụ thể được tìm thấy trong các tế bào bệnh bạch cầu với số lượng lớn hơn các tế bào bình thường và tiêu diệt các tế bào bất thường. Đối tượng đầu tiên là bệnh nhân người lớn mắc bệnh bạch cầu mãn tính: kết quả rất đáng khích lệ. Kết quả của các thử nghiệm trên trẻ em bị bệnh vượt quá mọi mong đợi.

Khi Emily Whitehead được chẩn đoán mắc bệnh bạch cầu vào tháng 5 năm 2010, cô ấy mới 9 tuổi. Hai đợt hóa trị không thành công. Vào mùa xuân năm 2012, một liệu trình thứ ba đã được đưa ra có thể giết chết một người lớn, nhưng cô gái vẫn sống sót, mặc dù cô ấy phát triển các vấn đề về thận, gan và lá lách. Theo bác sĩ tham dự Bruce Levine. "Emily đang ở bên bờ vực của cái chết."

Sau đó, họ lấy máu của cô ấy, phân lập tế bào T và tiêm virut vào chúng. trong bộ gen đã bao gồm các gen mục tiêu trước đó. Sau khi tiêm trở lại tế bào T chimeric vào cơ thể bệnh nhân, tình trạng của cô bắt đầu cải thiện nhanh chóng. Ba tuần sau, 25% tế bào T trong tủy xương của cô đã được biến đổi gen và bắt đầu “săn lùng” tế bào ung thư. “Vào tháng 4, cô gái trở nên hoàn toàn hói đầu. - Levin nhớ lại, - và đến tháng 8, nó đã có được hình dáng cũ và sẵn sàng đi học.

Các tế bào T đã được sửa đổi không có khả năng hoạt động trong suốt quãng đời còn lại của cô ấy, nhưng quy trình này luôn có thể được lặp lại. Trong khi đó, cô gái xinh xắn với mái tóc nâu dày này lại không có tế bào ung thư. Vào mùa thu năm 2013, một số nhóm các nhà di truyền học y học đã báo cáo về việc sử dụng kỹ thuật CAR để điều trị 120 bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu tương tự như Emily Whitehead, cũng như các dạng khác. Năm người lớn và 19 trong số 22 trẻ em đã thuyên giảm.

tương lai

Giờ đây, các chuyên gia trị liệu gen phải đối mặt với một thách thức khác: họ cần được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) chấp thuận để sử dụng hệ thống véc tơ an toàn hơn tất cả mọi người trong phòng khám. Cần tổ chức thử nghiệm lâm sàng giai đoạn III với sự tham gia của một nhóm lớn tình nguyện viên. Quá trình này thường mất từ ​​một đến năm năm. Tính đến cuối năm 2013, khoảng 5% trong số 2.000 thử nghiệm đã đạt đến giai đoạn này. Những người sáng tạo ra phương pháp điều trị cho bệnh nhân mắc bệnh Leber (mất thị lực hai bên do đột biến DNA ty thể: Haas 8 tuổi mắc bệnh lý này) đã tiến xa hơn những người khác. Vài chục bệnh nhân đã tìm cách phục hồi thị lực với sự trợ giúp của liệu pháp gen.

Bài viết cho cuộc thi "bio / mol / text": « Misha sinh ngày 12 tháng 2 là một đứa trẻ khỏe mạnh. Nhưng khi được 1,5 tháng, tôi bắt đầu nhận thấy rằng trong tất cả các bức ảnh, em bé đều ở cùng một vị trí, như thể chân của em bất động. Trong vòng vài tuần, chúng tôi được chẩn đoán, thông cảm và khuyên nên bắt đầu lên kế hoạch sinh con thứ hai khỏe mạnh.". Do sự kết hợp gây tử vong của các gen, Misha, giống như những đứa trẻ khác mắc căn bệnh này, buộc phải chiến đấu cho mọi cử động trong suốt cuộc đời ngắn ngủi của mình. Chiến đấu một cách tuyệt vọng, với tất cả sức mạnh của bạn, nhưng cuối cùng bị thua. teo cơ tủy sống (SMA) là một trong những dị thường di truyền mà trước mắt nhân loại vẫn bất lực. Tuy nhiên, những tiến bộ trong liệu pháp gen mà thế giới y học đang theo dõi có thể làm cho cả bệnh SMA và các bệnh di truyền nghiêm trọng khác có thể điều trị được. Hơn nữa, chúng vẫn có thể chữa khỏi trong tử cung.

Nhà tài trợ chung của cuộc thi là công ty Diaem: nhà cung cấp thiết bị, thuốc thử và vật tư tiêu hao lớn nhất cho nghiên cứu và sản xuất sinh học.

Nhà tài trợ của Giải Bình chọn của Khán giả là Trung tâm Di truyền Y học.

Nhà tài trợ "Sách" của cuộc thi - "Alpina non-hư cấu"

Thiên nhiên mắc sai lầm, con người sửa sai

Khái niệm liệu pháp gen là thanh lịch và đẹp đẽ, giống như tất cả các thiên tài. Nó bao gồm việc cung cấp vật chất di truyền khỏe mạnh vào tế bào với sự trợ giúp của các hệ thống vectơ để thay thế bằng các gen “sai lầm” liên quan đến các bệnh khác nhau (Hình 1).

"Phân tử sinh học" đã viết chi tiết về những cơ hội mà liệu pháp gen mở ra trong điều trị ung thư và các dị tật di truyền, đặc biệt là bệnh viêm võng mạc sắc tố.

Và nếu như những năm 80 của thế kỷ trước, khi họ bàn tán khá rầm rộ về liệu pháp gen, lý thuyết của bà với nhiều người dường như là sự tiếp nối kịch bản cho cuốn băng “Back to the Future” thì ngày nay nó đã trở thành hiện thực mở ra triển vọng mới, thực sự vô biên.

Tuy nhiên, rõ ràng là liệu pháp gen có một số hạn chế, đặc biệt là đối với các bệnh di truyền. Trước hết, quá trình bệnh lý trong những trường hợp như vậy có thể bắt đầu ngay cả trong tử cung. Vào thời điểm căn bệnh cuối cùng được chẩn đoán - và điều này đôi khi xảy ra nhiều năm sau khi sinh con - tổn thương không thể phục hồi đối với các tế bào và cơ quan có thể phát triển, điều này thu hẹp đáng kể các lựa chọn điều trị hoặc thậm chí vô hiệu hóa chúng.

Cơ hội giải quyết vấn đề này xuất hiện nhờ vào phương pháp chẩn đoán trước sinh hiện đại, cho phép phát hiện các dị tật nhiễm sắc thể đã có trong giai đoạn đầu của thai kỳ. Sau khi nhận bất kỳ vật liệu bào thai nào bằng kỹ thuật xâm lấn, có thể chẩn đoán nhanh chóng và đáng tin cậy các bệnh di truyền. Và trong những trường hợp mắc bệnh hemoglobin, sự cần thiết của các thao tác xâm lấn hoàn toàn biến mất: để xác định chúng, chỉ cần kiểm tra DNA của thai nhi thu được từ các tế bào máu của mẹ là đủ.

Các kỹ thuật chẩn đoán trước sinh hiện đại kết hợp với những tiến bộ trong liệu pháp gen mang lại cơ hội duy nhất để sửa chữa "sai lầm" của tự nhiên và can thiệp vào quá trình bệnh lý ngay cả trước khi tổn thương tế bào không thể phục hồi. Cung cấp phương pháp điều trị các bệnh khác nhau của đứa trẻ trong bụng mẹ, hoặc ít nhất là ngăn chặn sự tiến triển của bệnh, trong tất cả các khả năng, có thể liệu pháp gen thai nhi, hoặc liệu pháp gen thai nhi.

Ý tưởng về liệu pháp gen thai nhi còn xa mới: chỉ vài năm sau nỗ lực đầu tiên về liệu pháp gen ở người lớn, vào năm 1994, các nhà nghiên cứu bắt đầu thảo luận nghiêm túc về việc sử dụng một kỹ thuật cải tiến trong tử cung. Ngày nay, khi việc điều trị các bệnh di truyền trong bụng mẹ gần như biến từ một viễn cảnh kỳ diệu thành hiện thực, rất nhiều bài báo đã được xuất bản, nơi liệu pháp gen thai nhi và những ưu điểm của nó so với liệu pháp gen người lớn đã được nghiên cứu chi tiết.

tiền phẫu thuật đấu với hậu phẫu

Dự đoán các câu hỏi về khả năng tư vấn của việc chỉnh sửa bất thường di truyền trong tử cung, chúng ta hãy ngay lập tức xem xét những ưu điểm của liệu pháp gen thai nhi so với liệu pháp gen sau khi sinh.

Nhiều cơ hội để ảnh hưởng đến các cơ quan và hệ thống

Người ta đã biết rằng trong nhiều bệnh di truyền (ví dụ, bệnh u nang bì hoặc bệnh xơ nang), có thể khá khó khăn để tác động đến các liên kết chính của quá trình bệnh lý gần như ngay lập tức sau khi sinh. Việc chỉnh sửa các gen đột biến ở thai nhi đang phát triển cho phép tăng nhanh dân số tế bào gốc, cung cấp một lượng lớn các tế bào được chuyển gen và kết quả là mang lại hiệu quả điều trị rõ rệt.

Đơn giản hóa sản xuất vector lâm sàng mang vật liệu di truyền

Liều lượng của vector virut mà vật liệu di truyền được chuyển giao phụ thuộc vào trọng lượng cơ thể. Do kích thước của bào thai nhỏ, có thể đạt được sự phân bố sinh học của vector cao hơn nhiều ở cùng liều lượng như trong quá trình điều trị gen trưởng thành. Điều này giúp tiết kiệm cả thời gian và tiền bạc. Dữ liệu so sánh đơn giản giúp hình dung khoản tiết kiệm đáng kể như thế nào: ví dụ, một thai nhi ở tuần thai 14–16 (thời kỳ tối ưu để cảm ứng véc tơ) nặng khoảng 100 g, trong khi trọng lượng cơ thể trung bình của một người trưởng thành là khoảng 60 kg.

Tăng hiệu quả của liệu pháp do đáp ứng miễn dịch kém

Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng miễn dịch dịch thể đối với adenovirus và virus liên kết với adeno (AAV) (Hình 2) của một số kiểu huyết thanh nhất định thường được sử dụng làm vectơ có thể dẫn đến sự biểu hiện gen chuyển không thành công. Điều này có thể trở thành một trong những rào cản quan trọng để cấy ghép thành công.

Khoảng 50% người lớn có đáp ứng miễn dịch mắc phải với các vectơ vi rút này có nguy cơ mắc bệnh. Nhưng ngay cả khi không có độ nhạy, việc đưa vector vào ở người lớn thường dẫn đến sự phát triển của phản ứng miễn dịch làm giảm thời gian và mức độ biểu hiện gen chuyển. Vì vậy, sau khi tiêm bắp một vectơ virut adenoviral với một gen protein dystrophin chuột trưởng thành mắc chứng loạn dưỡng cơ Duchenne phát triển các kháng thể đối với dystrophin, có liên quan đến việc giảm đáng kể hiệu quả biểu hiện. Đồng thời, thai nhi trong bụng mẹ chưa trưởng thành về mặt miễn dịch, điều này có thể cung cấp véc tơ virus và sản phẩm chuyển gen mà không bị giới hạn bởi phản ứng miễn dịch.

Những ưu điểm rõ ràng của liệu pháp bào thai so với điều chỉnh sau sinh đảm bảo hiệu quả và hiệu quả cao hơn, đặc biệt là trong các bệnh nặng, đe dọa tính mạng. Ngay cả trong trường hợp không thể chữa khỏi hoàn toàn, liệu pháp gen thai nhi có thể ảnh hưởng đến các liên kết bệnh lý của bệnh, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình của bệnh và cải thiện tiên lượng. Và do đó, chính cô ấy là người có thể trở thành phương pháp điều trị thay thế duy nhất để chấm dứt thai kỳ cho hàng nghìn gia đình. Hơn nữa, số lượng bệnh có thể được kiểm soát bằng cách đưa liệu pháp gen thai nhi vào thực hành lâm sàng thực sự rất lớn.

Triển vọng và cơ hội

Liệu pháp gen thai nhi được cho là có thể kiểm soát nhiều bệnh lý nguy hiểm. Chỉ một phần nhỏ trong số chúng được trình bày trong Bảng 1.

Bảng 1. Các bệnh có thể được kiểm soát bằng liệu pháp gen thai nhi .

Bệnh	Thuốc điều trị gen	Tế bào đích và / hoặc cơ quan	Tuổi biểu hiện bệnh	Mức độ phổ biến	Tuổi thọ
bệnh xơ nang	CFTR (bộ điều chỉnh xuyên màng)	Tế bào biểu mô của đường hô hấp và ruột	Ba tháng cuối của thai kỳ	1:4000	Khoảng 35 tuổi
Bệnh teo cơ Duchenne	Dystrophin	myocytes	2 năm	1:4500	25 năm
teo cơ tủy sống	Protein SMN	Motoneurons	6 tháng (loại I)	1:10 000	2 năm
Bệnh máu khó đông	Yếu tố đông máu VIII hoặc IX	Tế bào gan	1 năm	1:6000
bệnh beta thalassemia	Globin	Tiền chất hồng cầu	Lên đến một năm	1:2700	Lên đến 20 tuổi
Bệnh Gaucher	Glucocerebrosidase	Tế bào gan	9,5 năm	1:59 000	Dưới 2 năm
Khuyết tật chu trình urê	Ornithine transcarbamylase	Tế bào gan	2 ngày	1:30 000	2 ngày
Epidermolysis bullosa	collagen loại VII	Tế bào sừng	Sinh	1:40 000	Với liệu pháp chính xác, tuổi thọ bình thường
Bệnh não do thiếu máu cục bộ thiếu oxy	Yếu tố dinh dưỡng thần kinh	Tế bào thần kinh vỏ não	Sinh	1:1000	Với liệu pháp chính xác, tuổi thọ bình thường
Chậm phát triển trong tử cung nghiêm trọng	các yếu tố tăng trưởng nhau thai	nguyên bào nuôi dưỡng	Thai nhi	1:500	Vài ngày

Ngoài ra, một số bệnh lý có thể được kiểm soát bằng liệu pháp bào thai bao gồm:

• Rối loạn suy giảm miễn dịch- Hội chứng bạch cầu trần, giảm sản sụn, hội chứng Chediak-Higashi, bệnh u hạt mãn tính, hội chứng Kostman, thiếu kết dính bạch cầu, hội chứng Omenn, hội chứng Wiskott-Aldrich.
• Hemoglobinopathies- Bệnh Rh, rối loạn chuyển hóa hồng cầu bẩm sinh.
• Các bệnh liên quan đến sự thiếu hụt hoạt động của enzym- Bệnh Gaucher, bệnh Krabbe, loạn dưỡng bạch cầu metachromatic, mucopolysaccharidoses, bệnh Volman, bệnh Niemann-Pick.
• Khác- rối loạn sừng hóa bẩm sinh, tăng bạch cầu lympho bào gia đình, bệnh hoại tử xương ở trẻ sơ sinh, hội chứng Shwachman-Diamond, v.v.

Danh sách các bệnh có thể “gánh vác” liệu pháp gen thai nhi thật đáng kinh ngạc: có lẽ, kỹ thuật này sẽ cho phép can thiệp vào các quá trình bệnh lý gây ra bởi các bệnh đơn gen trước đây nằm ngoài tầm kiểm soát của con người. Số lượng của họ, theo Tổ chức Y tế Thế giới, lên đến mười nghìn. Tuy nhiên, điều quan trọng là phải tính đến sự tồn tại của một số hạn chế, và trước hết là những rủi ro cho người mẹ và thai nhi liên quan đến liệu pháp gen trong tử cung.

Nỗi sợ hãi và rủi ro

Những rủi ro cụ thể của chuyển gen trước khi sinh về cơ bản khác với những rủi ro của liệu pháp gen sau sinh. Chúng bao gồm các phản ứng có hại ngắn hạn và các ảnh hưởng lâu dài sau khi sinh. Mức độ liên quan của chúng càng trở nên trầm trọng hơn bởi thực tế là, theo giả thuyết, biểu hiện gen của thai nhi có thể có tác động không thể đoán trước đến sự phát triển trước khi sinh và sau khi sinh.

Trước hết, bản thân thủ tục chuyển viện có liên quan trực tiếp đến việc tăng khả năng sẩy thai, viêm màng đệm và sinh non. Các nghiên cứu đã ghi nhận các phản ứng viêm đối với véc tơ, đặc biệt là xâm nhập gan và hoại tử gan trong liệu pháp gen thai cừu.

Sự thành công của liệu pháp gen thai nhi có thể bị vô hiệu hóa bởi phản ứng miễn dịch của thai nhi, và điều này mang lại những rủi ro nhất định cho kết quả cuối cùng. Các phản ứng của tế bào và dịch thể đối với việc đưa vectơ hoặc protein chuyển gen qua hệ thống đầu dò của tế bào có thể loại bỏ các sản phẩm chuyển gen hoặc mức độ biểu hiện chuyển gen. Đồng thời, các nghiên cứu đã chứng minh sự phụ thuộc của sức mạnh của phản ứng miễn dịch vào tuổi thai. Các phản ứng miễn dịch đáng kể đối với sự ra đời của vec tơ ngoại vi rút trong giai đoạn đầu và giai đoạn giữa của thai kỳ không được ghi nhận, trong khi với sự xuất hiện của vec tơ adenovirus trong các giai đoạn sau, một phản ứng dịch thể mạnh mẽ chống lại kháng nguyên capsid đã được quan sát thấy.

Một trong những vấn đề cực kỳ quan trọng của liệu pháp gen thai nhi là nguy cơ tiềm ẩn phát sinh khi chuỗi DNA của người hiến tặng được chuyển sang thai nhi. Vì sự tích hợp vector vào tế bào mầm có thể là ngẫu nhiên, nên về mặt lý thuyết, nó có thể gây ra những hậu quả thảm khốc cho thai nhi. Trên thực tế, một đứa trẻ nhận vật liệu di truyền của người hiến tặng trong tử cung được sinh ra là một dị nhân. Thành phần đạo đức của liệu pháp gen làm xáo trộn tâm trí của các nhà khoa học và thần học. Kể từ sự ra đời của chú cừu nổi tiếng nhất trong lịch sử khoa học, chú cừu cuối cùng cảnh báo về những nguy hiểm mà sự can thiệp vào kế hoạch của Chúa mang lại cho nhân loại.

Một khía cạnh quan trọng khác là khả năng gây đột biến trong các tế bào của thai nhi, dẫn đến khiếm khuyết trong một số gen chức năng, cuối cùng có thể gây ra một căn bệnh di truyền mới mắc phải hoặc khối u ác tính. Khả năng của nó thậm chí còn thực tế hơn dựa trên dữ liệu từ một nghiên cứu trên chuột, trong đó sự biểu hiện của các gen ở chuột phôi thai đã tạo động lực cho sự phát triển của khối u gan.

Trong bối cảnh này, kết quả của hai nghiên cứu chứng minh sự phát triển của các tác dụng phụ nghiêm trọng sau khi điều trị gen thành công đối với bệnh suy giảm miễn dịch kết hợp liên kết X có thể không phải là ngẫu nhiên: trong trường hợp đầu tiên, biểu hiện của bệnh tăng sinh bạch huyết đơn dòng được ghi nhận, và trong trường hợp thứ hai , tăng sinh tế bào T alpha / beta. Trong cả trường hợp thứ nhất và thứ hai, vector retrovirus tích hợp gần với gen LMO2 trong tế bào T tăng sinh.

Liệu pháp gen về mặt lý thuyết ex vivo có thể an toàn hơn in vivo véc tơ giới thiệu thai nhi. Mặc dù điều này không loại trừ khả năng gây đột biến trong các tế bào được chuyển nạp vi-rút trở lại trong ống nghiệm, sự ra đời của chất gây đột biến có thể được xác định và kiểm soát dễ dàng hơn. Tuy nhiên, không thể loại trừ hoàn toàn những biến chứng này.

Cuối cùng, liệu pháp gen thai nhi làm tăng tính nhạy cảm của tế bào thai nhi đối với việc truyền tải. Sự tải nạp retrovirus mức độ thấp vào tế bào mầm đã được quan sát thấy ở các tuyến sinh dục nam và nữ sau khi tiêm vec tơ này vào phôi cừu và phôi khỉ trong phúc mạc, tương ứng. Một phân tích về các yếu tố dẫn đến sự truyền máu không chủ ý đã chỉ ra rằng tính nhạy cảm của mô bào thai phụ thuộc vào tuổi thai, với tỷ lệ truyền tải sớm cao hơn trong thai kỳ.

Từ quan điểm về những rủi ro tiềm ẩn, rõ ràng liệu pháp gen thai nhi có thể là một phương pháp điều trị hợp lý chỉ đối với các bệnh di truyền nghiêm trọng mà không có lựa chọn nào khác để điều chỉnh chúng. Và trong số đó, tất nhiên phải kể đến bệnh Gaucher, khả năng điều trị bằng gen trong tử cung đã được chứng minh trong một nghiên cứu được công bố gần đây.

Lần đầu tiên đi: bệnh Gaucher

Vào tháng 7 năm 2018, tạp chí thuốc tự nhiênđã công bố kết quả của một nghiên cứu trên chuột do Simon Waddington dẫn đầu ( Simon Waddington) từ Viện Sức khỏe Phụ nữ London. Kết quả của công trình đã chứng minh hiệu quả của liệu pháp gen thai nhi trong điều trị các bệnh thoái hóa thần kinh và đặc biệt là bệnh Gaucher. Đây là dạng phổ biến nhất trong số các bệnh lý lên men di truyền hiếm gặp, dựa trên sự thiếu hụt hoạt động của enzym lysosome. glucose cerebrosidase(Hình 3), do đột biến gen glucosylceramidase. Tùy thuộc vào bản chất của các đột biến, dạng bệnh thần kinh nặng có thể phát triển, biểu hiện từ giai đoạn sơ sinh hoặc dạng khởi phát dần dần và các triệu chứng ít nghiêm trọng hơn. Trong khi các dạng nhẹ hơn của bệnh Gaucher đáp ứng tốt với liệu pháp thay thế, dạng nặng vẫn gây tử vong. Các dấu hiệu của một dạng bệnh Gaucher không thể chữa khỏi xuất hiện trong những tháng đầu đời và bao gồm hạ huyết áp cơ tiến triển, chậm phát triển tâm thần vận động và các dấu hiệu thần kinh khác.

Trong nghiên cứu của họ, Waddington và cộng sự đã chứng minh rằng việc sử dụng nội sọ của vector virus liên kết adeno 9 (AAV9) cho phôi chuột ở ngày thứ 16 của thai kỳ dẫn đến tăng biểu hiện của glucose cerebrosidase, ngăn chặn quá trình thoái hóa thần kinh. Đồng thời, hoạt động của enzym trong não tương đương với hoạt động của enzym ở những con chuột khỏe mạnh. Mặc dù thực tế là những con gặm nhấm bị bệnh vẫn được chẩn đoán là có quá trình viêm trong não, chúng phát triển tốt hơn đáng kể so với những con chuột từ nhóm đối chứng, chúng phải được cho chết hai tuần sau khi điều trị do mức độ nghiêm trọng của bệnh.

Những con chuột được điều trị bằng liệu pháp gen bào thai sống ít nhất 18 tuần, có khả năng sinh sản và di động. Điều thú vị là sự ra đời của vector sau sinh cũng tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình phát triển của bệnh, nhưng kém hiệu quả hơn so với biểu hiện trước khi sinh.

Vì AAV9 có thể xâm nhập vào não từ dòng máu, nhóm của Waddington đã thực hiện một thí nghiệm khác, trong đó họ tiêm một liều cao hơn đáng kể vector không vào não mà trực tiếp vào máu của thai nhi chuột. Những con chuột này phần lớn không thể phân biệt được với những con chuột khỏe mạnh sau khi biểu hiện, nhưng vì tuổi thọ của chúng chỉ là 55 ngày trong điều kiện thí nghiệm, các nhà khoa học không thể đưa ra kết luận về hiệu quả lâu dài của liệu pháp gen tĩnh mạch.

Thí nghiệm của Waddington là phức tạp nhất cho đến nay, trong đó liệu pháp gen bào thai được thực hiện trên động vật. Hôm nay nhóm làm việc với tập đoàn Liệu pháp Apollo, nơi quy tụ ba trường đại học của Anh và ba công ty dược phẩm lớn. Waddington và các đồng nghiệp đang theo đuổi một mục tiêu mới: lần này, họ phải đối mặt với thách thức thu thập dữ liệu tiền lâm sàng và có khả năng thử nghiệm các phương pháp điều trị ở người. Và trong khi những người hoài nghi suy nghĩ về phạm vi điều trị gen thai nhi ở người, có thể bị thu hẹp đáng kể bằng cách không đưa bệnh Gaucher vào các xét nghiệm trước khi sinh, nhóm của Waddington đang sẵn sàng cho tương lai. Một tương lai mà những đứa trẻ mắc bệnh Gaucher, Duchenne, SMA và nhiều bệnh hiếm gặp khác, nhưng than ôi, những căn bệnh nan y ngày nay có thể phục hồi.

Văn chương

1. 12 phương pháp trong hình: kỹ thuật gen. Phần II: công cụ và kỹ thuật;
Đáp ứng miễn dịch đối với vectơ liệu pháp gen: ảnh hưởng đến chức năng vectơ và cơ chế tác động. Gene Ther. 11 , S10-S17;
2. Soyoung C. Gilchrist, Martin P. Ontell, Stefan Kochanek, Paula R. Clemens. (Năm 2002). Đáp ứng miễn dịch đối với Dystrophin có chiều dài đầy đủ được cung cấp cho cơ Dmd bởi một vectơ Adenoviral dung lượng cao. Liệu pháp phân tử. 6 , 359-368;
3. Heather A. Hartman, Avery C. Rossidis, William H. Peranteau. (2018). Trong liệu pháp gen Utero và chỉnh sửa bộ gen. Đại diện tế bào gốc Curr. 4 , 52-60;
4. Anna L. David, Donald Peebles. (2008). . Thực hành & Nghiên cứu Tốt nhất Sản phụ khoa & Phụ khoa. 22 , 203-218;
5. Tóm tắt từ mặt trận liệu pháp gen. Một chiến lược mới để trung hòa bệnh máu khó đông;
6. Charles Coutelle. (2008). Tại sao lại làm phiền ?: Liệu pháp điều trị gen Utero có đáng để nỗ lực không? . Liệu pháp phân tử. 16 , 219-220;
7. Mike Themis, Simon N. Waddington, Manfred Schmidt, Christof von Kalle, Yoahe Wang, et. al. (2005). Sự phát sinh ung thư sau khi cung cấp một vectơ trị liệu gen không đúng chủng loại vi rút cho thai nhi và chuột sơ sinh. Liệu pháp phân tử. 12 , 763-771;
8. Thông cáo báo chí của Hiệp hội Liệu pháp Gen Châu Âu (ESGT), Bernd Gansbacher. (2003). Báo cáo về sự kiện bất lợi nghiêm trọng thứ hai trong một thử nghiệm lâm sàng về liệu pháp gen đối với bệnh thiếu hụt miễn dịch kết hợp nghiêm trọng liên quan đến X (X-SCID). J. Gene Med.. 5 , 261-262;
9. Giulia Massaro, Citra N. Z. Mattar, Andrew M. S. Wong, Ernestas Sirka, Suzanne M. K. Buckley, et. al. (2018). Liệu pháp gen bào thai cho bệnh thoái hóa thần kinh ở trẻ sơ sinh. Nat Med. 24 , 1317-1323.

Chứng loạn dưỡng cơ Duchenne là một trong những bệnh di truyền hiếm gặp, nhưng vẫn tương đối phổ biến. Bệnh được chẩn đoán ở độ tuổi từ ba đến năm, thường là ở trẻ trai, biểu hiện lúc đầu chỉ ở những cử động khó khăn, đến mười tuổi, một người mắc chứng loạn dưỡng này không đi lại được nữa, đến tuổi 20–22 của anh ta. cuộc sống kết thúc. Nguyên nhân là do đột biến gen dystrophin nằm trên nhiễm sắc thể X. Nó mã hóa một loại protein kết nối màng tế bào cơ với các sợi co bóp. Về mặt chức năng, đây là một loại lò xo đảm bảo sự co bóp trơn tru và tính toàn vẹn của màng tế bào. Các đột biến trong gen dẫn đến chứng loạn dưỡng mô cơ xương, cơ hoành và tim. Điều trị bệnh có tính chất giảm nhẹ và chỉ có thể làm giảm nhẹ sự đau khổ. Tuy nhiên, với sự phát triển của kỹ thuật gen, có ánh sáng ở cuối đường hầm.

Về chiến tranh và hòa bình

Liệu pháp gen là việc đưa các cấu trúc dựa trên axit nucleic vào tế bào để điều trị các bệnh di truyền. Với sự trợ giúp của liệu pháp như vậy, có thể sửa chữa một vấn đề di truyền ở cấp độ DNA và RNA bằng cách thay đổi quá trình biểu hiện của protein mong muốn. Ví dụ, DNA với một trình tự đã sửa chữa có thể được chuyển đến một tế bào, từ đó một protein chức năng được tổng hợp. Hoặc ngược lại, có thể xóa bỏ một số trình tự di truyền nhất định, điều này cũng sẽ giúp giảm tác hại của đột biến. Về lý thuyết, điều này đơn giản, nhưng trên thực tế, liệu pháp gen dựa trên những công nghệ phức tạp nhất để làm việc với các vật thể siêu nhỏ và đại diện cho một bộ bí quyết tiên tiến trong lĩnh vực sinh học phân tử.

Tiêm DNA vào nhân hợp tử là một trong những công nghệ truyền thống và sớm nhất để tạo gen chuyển. Việc tiêm được thực hiện thủ công bằng cách sử dụng kim siêu mỏng dưới kính hiển vi với độ phóng đại 400x.

Vadim Zhernovkov, giám đốc phát triển của công ty công nghệ sinh học Marlin Biotech, ứng cử viên của khoa học sinh học, cho biết: “Gen dystrophin, những đột biến làm phát sinh chứng loạn dưỡng cơ Duchenne, là rất lớn. - Nó bao gồm 2,5 triệu cặp cơ sở, có thể được so sánh với số lượng chữ cái trong cuốn tiểu thuyết Chiến tranh và Hòa bình. Và bây giờ hãy tưởng tượng rằng chúng ta đã xé bỏ một số trang quan trọng từ sử thi. Nếu những sự kiện quan trọng được mô tả trên những trang này, thì việc hiểu cuốn sách đã trở nên khó khăn. Nhưng với gen, mọi thứ phức tạp hơn. Không khó để tìm thấy một bản khác của Chiến tranh và Hòa bình, và sau đó có thể đọc những trang còn thiếu. Nhưng gen dystrophin nằm trên nhiễm sắc thể X, và nam giới chỉ có một gen này. Do đó, chỉ có một bản sao của gen được lưu trữ trong nhiễm sắc thể giới tính của trẻ trai khi sinh ra. Không có nơi nào khác để lấy nó.

Cuối cùng, trong quá trình tổng hợp protein từ RNA, điều quan trọng là phải bảo tồn khung đọc. Khung đọc xác định nhóm ba nucleotide nào được đọc dưới dạng codon, tương ứng với một axit amin trong protein. Nếu có sự mất đoạn trong gen của một đoạn ADN không phải là bội số của ba nucleotit, thì sẽ xảy ra sự thay đổi trong khung đọc - quá trình mã hóa sẽ thay đổi. Điều này có thể được so sánh với tình huống, sau khi các trang bị rách trong toàn bộ cuốn sách còn lại, tất cả các chữ cái sẽ được thay thế bằng các chữ cái tiếp theo theo thứ tự bảng chữ cái. Lấy abracadabra. Đây là điều tương tự xảy ra với một loại protein không được tổng hợp chính xác ”.

Miếng dán phân tử sinh học

Một trong những phương pháp hiệu quả của liệu pháp gen để khôi phục sự tổng hợp protein bình thường là bỏ qua exon bằng cách sử dụng các trình tự nucleotide ngắn. Marlin Biotech đã phát triển một công nghệ để làm việc với gen dystrophin bằng phương pháp này. Như đã biết, trong quá trình phiên mã (tổng hợp RNA), cái gọi là RNA tiền hôn nhân đầu tiên được hình thành, bao gồm cả vùng mã hóa protein (exon) và vùng không mã hóa (intron). Tiếp theo, quá trình nối bắt đầu, trong đó các intron và exon được tách ra và một RNA "trưởng thành" được hình thành, chỉ bao gồm các exon. Tại thời điểm này, một số exon có thể bị chặn lại, "dán lại" với sự trợ giúp của các phân tử đặc biệt. Kết quả là, RNA trưởng thành sẽ không có những vùng mã hóa mà chúng ta muốn loại bỏ, và do đó khung đọc sẽ được phục hồi, protein sẽ được tổng hợp.

Vadim Zhernovkov cho biết: “Chúng tôi đã gỡ lỗi công nghệ này trong ống nghiệm, tức là trên tế bào nuôi cấy từ tế bào của bệnh nhân mắc chứng loạn dưỡng Duchenne. Nhưng các tế bào riêng lẻ không phải là một sinh vật. Khi xâm nhập vào các quá trình của tế bào, chúng ta phải quan sát trực tiếp hậu quả, nhưng không thể để mọi người tham gia vào các cuộc kiểm tra vì nhiều lý do khác nhau - từ đạo đức đến tổ chức. Do đó, cần thiết phải có được một mô hình về chứng loạn dưỡng cơ Duchenne với một số đột biến nhất định dựa trên động vật thí nghiệm. ”

Làm thế nào để chích microworld

Động vật chuyển gen là động vật thu được trong phòng thí nghiệm, trong đó bộ gen của chúng được thực hiện có mục đích, có ý thức. Trở lại những năm 1970, rõ ràng rằng việc tạo ra gen chuyển là phương pháp quan trọng nhất để nghiên cứu chức năng của gen và protein. Một trong những phương pháp sớm nhất để thu được một sinh vật biến đổi gen hoàn toàn là tiêm DNA vào nhân ("tiền thân nhân") của các hợp tử của trứng đã thụ tinh. Điều này là hợp lý, vì nó là dễ dàng nhất để sửa đổi bộ gen của động vật khi mới bắt đầu phát triển.

Sơ đồ cho thấy quá trình CRISPR / Cas9, bao gồm RNA phụ (sgRNA), vùng của nó hoạt động như một RNA dẫn đường và protein Cas9 nuclease, cắt cả hai sợi DNA bộ gen tại vị trí được chỉ định bởi RNA dẫn đường.

Tiêm vào nhân của hợp tử là một thủ tục rất không tầm thường, bởi vì chúng ta đang nói về microcales. Trứng chuột có đường kính 100 µm và nhân là 20 µm. Quá trình hoạt động diễn ra dưới kính hiển vi với độ phóng đại 400x, nhưng việc tiêm thuốc là công việc thủ công nhất. Tất nhiên, không phải một ống tiêm truyền thống được sử dụng để "tiêm", mà là một kim thủy tinh đặc biệt với một rãnh rỗng bên trong, nơi vật liệu gen được thu thập. Một đầu có thể cầm trên tay, trong khi đầu kia siêu mỏng và sắc nét - thực tế không thể nhìn thấy bằng mắt thường. Tất nhiên, một cấu trúc mỏng manh làm bằng thủy tinh borosilicat như vậy không thể bảo quản được lâu, vì vậy phòng thí nghiệm có sẵn một bộ mẫu trắng, được vẽ trên một máy đặc biệt ngay trước khi làm việc. Một hệ thống chụp ảnh tương phản tế bào đặc biệt mà không cần nhuộm được sử dụng - việc can thiệp vào nhân tự thân là chấn thương và là một yếu tố nguy cơ đối với sự tồn tại của tế bào. Sơn sẽ là một yếu tố khác như vậy. May mắn thay, những quả trứng có khả năng phục hồi khá tốt, nhưng số lượng hợp tử sinh ra động vật chuyển gen chỉ chiếm một vài phần trăm trong tổng số trứng đã được tiêm DNA.

Bước tiếp theo là phẫu thuật. Một cuộc phẫu thuật đang được tiến hành để cấy các hợp tử được bơm vi mô vào phễu của ống dẫn trứng của chuột nhận, chuột sẽ trở thành mẹ thay thế cho các gen chuyển gen trong tương lai. Tiếp theo, động vật thí nghiệm trải qua chu kỳ mang thai một cách tự nhiên và con cái được sinh ra. Thông thường có khoảng 20% ​​chuột chuyển gen trong ổ đẻ, điều này cũng cho thấy sự không hoàn hảo của phương pháp này, vì nó chứa một yếu tố may rủi lớn. Khi được tiêm, nhà nghiên cứu không thể kiểm soát chính xác cách thức các đoạn DNA được chèn vào sẽ được tích hợp vào bộ gen của sinh vật tương lai. Khả năng cao là những sự kết hợp như vậy sẽ dẫn đến cái chết của con vật ở giai đoạn phôi thai. Tuy nhiên, phương pháp này hoạt động và khá phù hợp cho một số mục đích khoa học.

Sự phát triển của công nghệ chuyển gen giúp sản xuất các protein động vật đang được ngành dược phẩm yêu cầu. Các protein này được chiết xuất từ ​​sữa của dê và bò chuyển gen. Ngoài ra còn có các công nghệ để thu nhận các protein cụ thể từ trứng gà.

Kéo DNA

Nhưng có một cách hiệu quả hơn dựa trên việc chỉnh sửa bộ gen được nhắm mục tiêu bằng cách sử dụng công nghệ CRISPR / Cas9. Vadim Zhernovkov nói: “Ngày nay, sinh học phân tử tương tự như kỷ nguyên của những chuyến thám hiểm biển đường dài dưới cánh buồm. - Hầu như hàng năm trong ngành khoa học này đều có những khám phá đáng kể có thể thay đổi cuộc sống của chúng ta. Ví dụ, vài năm trước, các nhà vi sinh vật học đã phát hiện ra khả năng miễn dịch đối với các bệnh nhiễm virus ở một loài vi khuẩn dường như đã được nghiên cứu từ lâu. Kết quả của các nghiên cứu sâu hơn, hóa ra rằng DNA của vi khuẩn có chứa các locus đặc biệt (CRISPR), từ đó các đoạn RNA được tổng hợp có thể liên kết bổ sung với các axit nucleic của các yếu tố lạ, ví dụ, DNA hoặc RNA của vi rút. Protein Cas9, là một enzym nuclease, liên kết với RNA như vậy. RNA đóng vai trò là hướng dẫn cho Cas9, đánh dấu một đoạn DNA cụ thể trong đó nuclease tạo ra vết cắt. Khoảng ba đến năm năm trước, các bài báo khoa học đầu tiên xuất hiện đã phát triển công nghệ CRISPR / Cas9 để chỉnh sửa bộ gen ”.

Chuột chuyển gen có thể tạo ra các mô hình sống về các bệnh di truyền nghiêm trọng của con người. Mọi người nên biết ơn những sinh vật nhỏ bé này.

So với phương pháp xây dựng chèn ngẫu nhiên, phương pháp mới giúp bạn có thể chọn các phần tử của hệ thống CRISPR / Cas9 theo cách nhắm mục tiêu chính xác các đường dẫn RNA đến các vùng mong muốn của bộ gen và đạt được mục tiêu xóa hoặc chèn DNA mong muốn sự phối hợp. Phương pháp này cũng có thể xảy ra lỗi (RNA dẫn đường đôi khi kết nối với sai vị trí mà nó được nhắm mục tiêu), nhưng khi sử dụng CRISPR / Cas9, hiệu quả tạo ra các gen chuyển đã là khoảng 80%. Vadim Zhernovkov cho biết: “Phương pháp này có triển vọng rộng rãi, không chỉ để tạo ra gen chuyển mà còn trong các lĩnh vực khác, đặc biệt là trong liệu pháp gen. “Tuy nhiên, công nghệ này mới chỉ ở giai đoạn đầu và khá khó để tưởng tượng rằng trong tương lai gần, người ta có thể sửa mã gen của những người sử dụng CRISPR / Cas9. Miễn là có khả năng xảy ra sai sót, thì cũng có nguy cơ là một người sẽ mất một số phần mã hóa quan trọng của bộ gen ”.

Thuốc sữa

Công ty Marlin Biotech của Nga đã thành công trong việc tạo ra một con chuột chuyển gen, trong đó đột biến dẫn đến chứng loạn dưỡng cơ Duchenne được tái tạo hoàn toàn, và giai đoạn tiếp theo sẽ là thử nghiệm các công nghệ liệu pháp gen. Tuy nhiên, việc tạo ra các mô hình bệnh tật di truyền ở người dựa trên động vật thí nghiệm không phải là ứng dụng duy nhất có thể thực hiện được của gen chuyển. Do đó, ở Nga và các phòng thí nghiệm phương Tây, công việc đang được tiến hành trong lĩnh vực công nghệ sinh học, giúp thu được các protein dược liệu có nguồn gốc động vật rất quan trọng cho ngành dược phẩm. Bò hoặc dê có thể đóng vai trò là nhà sản xuất, trong đó có thể thay đổi bộ máy tế bào để sản xuất protein có trong sữa. Có thể chiết xuất protein dược liệu từ sữa thu được không phải bằng phương pháp hóa học mà theo cơ chế tự nhiên sẽ làm tăng hiệu quả của thuốc. Hiện nay, các công nghệ đã được phát triển để thu được các protein y học như lactoferrin ở người, prourokinase, lysozyme, atrin, antithrombin, và những loại khác.