Phân tích PCR: nó là gì? Cách thực hiện xét nghiệm PCR. Phản ứng chuỗi polymerase, bản chất và ứng dụng Các loại PCR
Để điều trị đầy đủ và hiệu quả nhiều bệnh truyền nhiễm, cần phải chẩn đoán chính xác kịp thời. Để giải quyết vấn đề này ngày nay, các phương pháp chẩn đoán công nghệ cao dựa trên phương pháp sinh học phân tử được tham gia. Hiện tại, phản ứng chuỗi polymerase (PCR) đã được sử dụng rộng rãi trong y học thực tế như một công cụ chẩn đoán trong phòng thí nghiệm đáng tin cậy nhất.
Điều gì giải thích sự phổ biến của PCR ở thời điểm hiện tại?
Thứ nhất, phương pháp này được sử dụng để xác định mầm bệnh của các bệnh truyền nhiễm khác nhau với độ chính xác cao.Thứ hai, để theo dõi hiệu quả của việc điều trị.
Trong các sách hướng dẫn, bản cáo bạch, bài báo, cũng như các giải thích của các chuyên gia y tế, chúng ta thường gặp việc sử dụng các thuật ngữ và từ ngữ khó hiểu. Thực sự rất khó để nói về các sản phẩm công nghệ cao của khoa học bằng từ ngữ thông thường.
Bản chất và cơ chế của chẩn đoán PCR là gì?
Mỗi cơ thể sống đều có những gen độc đáo của riêng mình. Các gen nằm trong phân tử ADN, thực chất là "thẻ gọi" của từng sinh vật cụ thể. DNA (vật chất di truyền) là một phân tử rất dài được tạo thành từ các khối xây dựng được gọi là nucleotide. Đối với mỗi tác nhân gây bệnh truyền nhiễm, chúng được xác định cụ thể, tức là theo một trình tự và sự kết hợp nhất định. Khi cần tìm hiểu xem một người có mang mầm bệnh cụ thể hay không, người ta sẽ lấy vật liệu sinh học (máu, nước tiểu, nước bọt, vết bẩn) có chứa DNA hoặc các đoạn DNA của vi khuẩn. Nhưng số lượng vật chất di truyền của mầm bệnh rất ít và không thể nói nó thuộc về vi sinh vật nào. Để giải quyết vấn đề này, PCR phục vụ. Bản chất của phản ứng chuỗi polymerase là một lượng nhỏ vật liệu để nghiên cứu có chứa DNA được lấy, và trong quá trình PCR, lượng vật liệu di truyền thuộc về một mầm bệnh cụ thể tăng lên và do đó, nó có thể được xác định.Chẩn đoán PCR là một nghiên cứu di truyền của một vật liệu sinh học.
Ý tưởng về phương pháp PCR thuộc về nhà khoa học người Mỹ K. Mullins, được ông đề xuất vào năm 1983. Tuy nhiên, nó chỉ được sử dụng rộng rãi trên lâm sàng vào giữa những năm 90 của thế kỷ XX. Hãy xem xét thuật ngữ, nó là gì - DNA, v.v. Mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào (động vật, thực vật, con người, vi khuẩn, vi rút) đều có nhiễm sắc thể. Nhiễm sắc thể là người lưu giữ thông tin di truyền chứa toàn bộ chuỗi gen của từng sinh vật cụ thể.
Mỗi nhiễm sắc thể được tạo thành từ hai chuỗi DNA được xoắn lại thành một chuỗi xoắn tương đối với nhau. DNA là axit deoxyribonucleic về mặt hóa học, bao gồm các thành phần cấu trúc - nucleotide. Có 5 loại nucleotide - thymine (T), adenosine (A), guanine (G), cytosine (C) và uracil (U). Các nucleotide được sắp xếp nối tiếp nhau theo một trình tự riêng lẻ chặt chẽ, tạo thành các gen. Một gen có thể bao gồm 20-200 nucleotide như vậy. Ví dụ, gen mã hóa sản xuất insulin dài 60 cặp bazơ.
Nucleotide có đặc tính bổ sung cho nhau. Điều này có nghĩa là adenine (A) đối diện trong một sợi DNA luôn có thymine (T) trong sợi kia, và đối diện với guanine (G) - cytosine (C). Sơ đồ trông như thế này:
G - C
T - A
TẠI
Tính chất bổ sung này là chìa khóa cho PCR.
Ngoài DNA, RNA có cấu trúc tương tự - axit ribonucleic, khác với DNA ở chỗ nó sử dụng uracil thay vì thymine. RNA - là người lưu giữ thông tin di truyền trong một số loại virus, được gọi là retrovirus (ví dụ, HIV).
Các phân tử DNA và RNA có thể "nhân lên" (đặc tính này được sử dụng cho PCR). Điều này xảy ra như sau: hai sợi DNA hoặc RNA di chuyển ra xa nhau về hai phía, một loại enzyme đặc biệt nằm trên mỗi sợi, sẽ tổng hợp một chuỗi mới. Quá trình tổng hợp diễn ra theo nguyên tắc bổ sung, nghĩa là nếu nucleotit A nằm trong chuỗi ADN ban đầu thì T sẽ nằm trong chuỗi mới tổng hợp, nếu G - thì C, v.v. Enzyme "xây dựng" đặc biệt này cần một "hạt giống" - một chuỗi 5-15 nucleotide - để bắt đầu tổng hợp. "Hạt giống" này được xác định cho từng gen (gen chlamydia, mycoplasma, virus) bằng thực nghiệm.
Vì vậy, mỗi chu kỳ PCR bao gồm ba giai đoạn. Trong giai đoạn đầu tiên, cái gọi là sự tháo xoắn của DNA xảy ra - tức là sự tách rời của hai sợi DNA được kết nối với nhau. Trong lần thứ hai, "hạt giống" được gắn vào một phần của sợi DNA. Và cuối cùng, sự kéo dài của các sợi DNA này, được tạo ra bởi enzyme "xây dựng". Hiện tại, toàn bộ quá trình phức tạp này diễn ra trong một ống nghiệm và bao gồm các chu kỳ tái tạo lặp đi lặp lại của DNA đã xác định nhằm thu được một số lượng lớn các bản sao mà sau đó có thể phát hiện được bằng các phương pháp thông thường. Có nghĩa là, từ một sợi DNA, chúng ta nhận được hàng trăm hoặc hàng nghìn.
Các giai đoạn của một nghiên cứu PCR
Sưu tập vật liệu sinh học để nghiên cứu
Các vật liệu sinh học khác nhau dùng làm mẫu: máu và các thành phần của nó, nước tiểu, nước bọt, chất tiết của màng nhầy, dịch não tủy, chất thải từ bề mặt vết thương, chất chứa trong các khoang cơ thể. Tất cả các mẫu sinh học được thu thập bằng các dụng cụ dùng một lần, và vật liệu thu thập được được đặt trong các ống nhựa vô trùng hoặc đặt trên môi trường nuôi cấy, sau đó được vận chuyển đến phòng thí nghiệm.Các thuốc thử cần thiết được thêm vào các mẫu đã lấy và được đặt trong bộ điều chỉnh nhiệt có thể lập trình - bộ tuần hoàn nhiệt (bộ khuếch đại). Trong máy tuần hoàn, chu kỳ PCR được lặp lại 30-50 lần, bao gồm ba giai đoạn (biến tính, ủ và kéo dài). Điều đó có nghĩa là gì? Chúng ta hãy xem xét chi tiết hơn.
Các giai đoạn của phản ứng PCR tức thì, sao chép vật liệu di truyền
TôiGiai đoạn PCR - Chuẩn bị vật liệu di truyền để sao chép.Xảy ra ở nhiệt độ 95 ° C, trong khi các sợi DNA bị ngắt kết nối và "hạt giống" có thể nằm trên chúng.
"Hạt giống" được sản xuất công nghiệp bởi các hiệp hội nghiên cứu và sản xuất khác nhau, và các phòng thí nghiệm mua hạt giống làm sẵn. Đồng thời, “hạt giống” để phát hiện, ví dụ, chlamydia, chỉ hoạt động đối với chlamydia, v.v. Do đó, nếu một vật liệu sinh học được kiểm tra sự hiện diện của nhiễm chlamydia, thì một “hạt giống” cho chlamydia được đặt vào hỗn hợp phản ứng; nếu thử nghiệm vật liệu sinh học cho vi rút Epstein-Barr, thì "hạt giống" cho vi rút Epstein-Barr.
IIgiai đoạn - Kết hợp vật chất di truyền của tác nhân lây nhiễm và "hạt giống".
Nếu có DNA của vi rút hoặc vi khuẩn được xác định, thì "hạt giống" sẽ nằm trên DNA này. Quá trình bổ sung mồi này là bước thứ hai của PCR. Giai đoạn này diễn ra ở nhiệt độ 75 ° C.
IIIgiai đoạn - Sao chép vật chất di truyền của tác nhân lây nhiễm.
Đây là quá trình kéo dài hoặc tái tạo thực tế của vật liệu di truyền, xảy ra ở 72 ° C. Một nhà xây dựng enzyme tiếp cận "hạt giống" và tổng hợp một chuỗi DNA mới. Khi kết thúc quá trình tổng hợp một sợi DNA mới, chu kỳ PCR cũng kết thúc. Có nghĩa là, trong một chu kỳ PCR, số lượng vật chất di truyền tăng gấp đôi. Ví dụ, trong mẫu ban đầu có 100 phân tử ADN của một loại vi rút, sau chu kỳ PCR đầu tiên sẽ có 200 phân tử ADN của vi rút được kiểm tra trong mẫu. Một chu kỳ kéo dài 2-3 phút.
Để tạo ra đủ vật liệu di truyền để xác định, 30-50 chu kỳ PCR thường được thực hiện, mất 2-3 giờ.
Giai đoạn xác định vật liệu di truyền được nhân giống
Bản thân PCR kết thúc ở đây và sau đó đến giai đoạn xác định quan trọng không kém. Để xác định, điện di hoặc "hạt giống" được dán nhãn được sử dụng. Khi sử dụng điện di, các sợi DNA tạo thành được phân tách theo kích thước và sự hiện diện của các đoạn DNA có độ dài khác nhau cho thấy kết quả phân tích dương tính (nghĩa là sự hiện diện của một loại vi rút, vi khuẩn cụ thể, v.v.). Khi sử dụng "hạt" được dán nhãn, chất màu (thuốc nhuộm) được thêm vào sản phẩm cuối cùng của phản ứng, kết quả là phản ứng enzym đi kèm với sự hình thành màu sắc. Sự phát triển của màu sắc chỉ ra trực tiếp rằng vi rút hoặc tác nhân có thể phát hiện khác có trong mẫu ban đầu. Ngày nay, bằng cách sử dụng "hạt giống" được dán nhãn, cũng như phần mềm thích hợp, có thể "đọc" ngay kết quả PCR. Đây được gọi là PCR thời gian thực.
Tại sao chẩn đoán PCR lại có giá trị như vậy?
Một trong những ưu điểm đáng kể của phương pháp PCR là độ nhạy cao - từ 95 đến 100%. Tuy nhiên, những lợi thế này phải dựa trên sự tuân thủ tất yếu các điều kiện sau:
- lấy mẫu chính xác, vận chuyển vật liệu sinh học;
- sự sẵn có của các dụng cụ vô trùng, dùng một lần, các phòng thí nghiệm đặc biệt và nhân viên được đào tạo;
- tuân thủ nghiêm ngặt phương pháp luận và vô trùng trong quá trình phân tích
Các khả năng vốn có trong phân tích PCR cho phép bạn đạt được độ đặc hiệu phân tích vượt trội. Điều này có nghĩa là xác định chính xác vi sinh vật được tìm kiếm, không phải là vi sinh vật tương tự hoặc có liên quan chặt chẽ.
Độ nhạy và độ đặc hiệu chẩn đoán của phương pháp PCR thường vượt quá so với phương pháp nuôi cấy, được gọi là "tiêu chuẩn vàng" để phát hiện các bệnh truyền nhiễm. Xem xét thời gian nuôi cấy (từ vài ngày đến vài tuần), ưu điểm của phương pháp PCR trở nên rõ ràng.
PCR trong chẩn đoán nhiễm trùng
Những ưu điểm của phương pháp PCR (độ nhạy và độ đặc hiệu) quyết định một loạt các ứng dụng trong y học hiện đại.
Các lĩnh vực ứng dụng chính của chẩn đoán PCR:
- chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm cấp tính và mãn tính của các địa phương khác nhau
- theo dõi hiệu quả của liệu pháp
- làm rõ loại mầm bệnh
Việc sử dụng chẩn đoán PCR được thực hiện cùng với các phương pháp nghiên cứu khác (ELISA, PIF, RIF, v.v.). Sự kết hợp và hiệu quả của chúng được xác định bởi bác sĩ chăm sóc.
Các tác nhân truyền nhiễm được phát hiện bằng PCR
Vi rút:
- HIV-1 và HIV-2 retrovirus
- vi rút herpetiform
- virus herpes simplex loại 1 và 2
Phản ứng chuỗi polymerase (PCR)- phương pháp thực nghiệm sinh học phân tử, đó là sự khuếch đại cụ thể của axit nucleic được tạo ra bởi các đoạn mồi oligonucleotit tổng hợp trong ống nghiệm.
Ý tưởng phát triển phương pháp PCR thuộc về nhà nghiên cứu người Mỹ Kary Mullis, người vào năm 1983 đã tạo ra một phương pháp giúp khuếch đại DNA trong quá trình nhân đôi theo chu kỳ bằng cách sử dụng enzyme DNA polymerase trong điều kiện nhân tạo. Vài năm sau khi công bố ý tưởng này, vào năm 1993, K. Mullis đã nhận được giải Nobel cho nó.
Khi bắt đầu sử dụng phương pháp này, sau mỗi chu kỳ gia nhiệt - làm lạnh, cần phải thêm DNA polymerase vào hỗn hợp phản ứng, vì nó nhanh chóng bị bất hoạt ở nhiệt độ cao. Quy trình này rất kém hiệu quả, đòi hỏi nhiều thời gian và enzym. Năm 1986, nó đã được sửa đổi đáng kể bằng cách sử dụng DNA polymerase từ vi khuẩn ưa nhiệt. Các enzym này có thể chịu được nhiều chu kỳ phản ứng, điều này cho phép bạn tự động hóa PCR. Một trong những DNA polymerase ổn định nhiệt được sử dụng phổ biến nhất đã được phân lập từ vi khuẩn. Thermus aquus và được đặt tên Taq-DNA polymerase.
Thực chất của phương pháp. Phương pháp này dựa trên việc sao chép nhiều lần có chọn lọc một vùng DNA nhất định bằng cách sử dụng enzyme Taq-DNA polymerase. Phản ứng chuỗi polymerase làm cho nó có thể thu được các bộ khuếch đại có chiều dài lên đến vài nghìn cặp bazơ. Để tăng chiều dài của sản phẩm PCR lên 20-40 nghìn cặp bazơ, người ta sử dụng hỗn hợp nhiều polymerase khác nhau, nhưng nó vẫn ít hơn nhiều so với chiều dài của DNA nhiễm sắc thể của tế bào nhân thực.
Phản ứng được thực hiện trong bộ điều nhiệt có thể lập trình (bộ khuếch đại) - một thiết bị có thể thực hiện đủ nhanh
làm nguội và làm nóng ống nghiệm (thường có độ chính xác ít nhất là 0,1 ° C). Bộ khuếch đại cho phép bạn thiết lập các chương trình phức tạp, bao gồm cả những chương trình có khả năng "khởi động nóng" và lưu trữ tiếp theo. Đối với PCR thời gian thực, các thiết bị được trang bị máy dò huỳnh quang được sản xuất. Các thiết bị cũng có sẵn với một nắp tự động và ngăn vi tấm, cho phép chúng được tích hợp vào các hệ thống tự động.
Thông thường, trong quá trình PCR, 20-45 chu kỳ được thực hiện, mỗi chu kỳ bao gồm ba giai đoạn: biến tính, ủ mồi, kéo dài (Hình 6.1 và 6.2). Trên hình. 6.1 cho thấy động thái của sự thay đổi nhiệt độ trong ống nghiệm trong chu kỳ PCR.
Cơm. 6.1.Đồ thị sự thay đổi nhiệt độ trong ống nghiệm trong một chu kỳ của chuỗi phản ứng polymerase
Biến tính mẫu DNAđược thực hiện bằng cách đun nóng hỗn hợp phản ứng đến 94-96 ° C trong 5-90 s để các chuỗi DNA phân tán. Cần lưu ý rằng trước chu kỳ đầu tiên, hỗn hợp phản ứng được làm nóng trước trong 2–5 phút để làm biến tính hoàn toàn chất nền ban đầu, điều này có thể làm giảm lượng sản phẩm phản ứng không đặc hiệu.
Cơm. 6.2. Sơ đồ chu kỳ đầu tiên của phản ứng chuỗi polymerase
Giai đoạn ủ sơn lót. Với sự giảm dần nhiệt độ, các mồi liên kết bổ sung với khuôn mẫu. Nhiệt độ ủ phụ thuộc vào thành phần của mồi và thường thấp hơn nhiệt độ nóng chảy tính toán từ 4-5 ° C. Thời gian của giai đoạn là 5-60 s.
Trong giai đoạn tiếp theo - kéo dài- có sự tổng hợp chuỗi ADN con trên chất nền mẹ. Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc vào polymerase. Taq và Pfu DNA polymerase thường được sử dụng hoạt động mạnh nhất ở 72 ° C. Thời gian kéo dài, chủ yếu phụ thuộc vào độ dài của sản phẩm PCR, thường là 1 phút trên 1000 cặp bazơ.
Điều này cho phép bạn phát hiện trong vật liệu sinh học một lượng nhỏ, chính xác hơn là các mảnh vỡ nhất định của nó và nhân chúng lên nhiều lần. Sau đó, chúng được xác định trực quan bằng điện di trên gel. Phản ứng được phát triển vào năm 1983 bởi K. Mullis và được đưa vào danh sách những khám phá nổi bật trong những năm gần đây.
Cơ chế của PCR là gì
Toàn bộ kỹ thuật dựa trên khả năng tự sao chép của các axit nucleic, trong trường hợp này được thực hiện nhân tạo trong phòng thí nghiệm. Quá trình tái tạo DNA không thể bắt đầu ở bất kỳ vùng nào của phân tử, mà chỉ ở những vùng có trình tự nucleotide nhất định - các đoạn khởi đầu. Để phản ứng chuỗi polymerase bắt đầu, cần có mồi (hoặc mẫu dò DNA). Đây là những đoạn ngắn của chuỗi DNA với một trình tự nucleotide nhất định. Chúng bổ sung (có nghĩa là, tương ứng) với các vị trí bắt đầu
Tất nhiên, để tạo ra mồi, các nhà khoa học phải nghiên cứu trình tự nucleotide của loại có liên quan đến kỹ thuật. Chính những đầu dò DNA này cung cấp tính đặc hiệu của phản ứng và sự khởi đầu của nó. sẽ không hoạt động nếu ít nhất một phân tử của DNA mong muốn không được tìm thấy trong mẫu. Nói chung, các đoạn mồi trên, một bộ nucleotide, một DNA polymerase chịu nhiệt là cần thiết để phản ứng diễn ra. Sau đó là một enzym xúc tác quá trình tổng hợp các phân tử axit nucleic mới dựa trên mẫu. Tất cả các chất này, bao gồm cả vật liệu sinh học cần thiết để phát hiện DNA, được kết hợp thành một hỗn hợp phản ứng (dung dịch). Nó được đặt trong một bộ điều chỉnh nhiệt đặc biệt có chức năng làm nóng và làm lạnh rất nhanh trong một thời gian nhất định - một chu kỳ. Thông thường có 30-50 người trong số họ.
Phản ứng này diễn ra như thế nào?
Bản chất của nó là trong một chu kỳ, các đoạn mồi được gắn vào các đoạn DNA mong muốn, sau đó nó được nhân đôi dưới tác dụng của enzyme. Dựa trên các sợi DNA tạo thành, các đoạn mới giống hệt nhau của phân tử được tổng hợp trong các chu kỳ tiếp theo.
Phản ứng chuỗi polymerase tiến hành tuần tự, các giai đoạn sau của nó được phân biệt. Loại thứ nhất được đặc trưng bởi lượng sản phẩm tăng gấp đôi trong mỗi chu kỳ làm nóng và làm lạnh. Trong giai đoạn thứ hai, phản ứng chậm lại, do enzym bị hư hỏng và cũng mất hoạt tính. Ngoài ra, nguồn dự trữ nucleotide và mồi bị cạn kiệt. Ở giai đoạn cuối - bình nguyên - các sản phẩm không còn tích tụ nữa, vì thuốc thử đã hết.
Nó được sử dụng ở đâu
Không nghi ngờ gì nữa, phản ứng chuỗi polymerase tìm thấy ứng dụng rộng rãi nhất trong y học và khoa học. Nó được sử dụng trong sinh học nói chung và tư nhân, y học thú y, dược phẩm và thậm chí cả sinh thái học. Hơn nữa, sau này họ làm điều này để giám sát chất lượng của các sản phẩm thực phẩm và các đối tượng môi trường. Phản ứng chuỗi polymerase được sử dụng tích cực trong thực hành pháp y để xác nhận quan hệ cha con và xác định một người. Trong pháp y, cũng như cổ sinh vật học, kỹ thuật này thường là lối thoát duy nhất, vì thường rất ít DNA có sẵn để nghiên cứu. Tất nhiên, phương pháp đã được tìm thấy một ứng dụng rất rộng rãi trong y học thực tế. Nó cần thiết trong các lĩnh vực như di truyền, bệnh truyền nhiễm và ung thư.
Trang web cung cấp thông tin tham khảo chỉ cho mục đích thông tin. Việc chẩn đoán và điều trị bệnh cần được thực hiện dưới sự giám sát của bác sĩ chuyên khoa. Tất cả các loại thuốc đều có chống chỉ định. Cần có sự tư vấn của chuyên gia!
Phương pháp chuỗi phản ứng polymeraseđược phát hiện ra gần ba mươi năm trước bởi một nhà khoa học người Mỹ tên là Carrie Mullis. Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong y học như một công cụ chẩn đoán và bản chất của nó là sao chép một đoạn DNA bằng cách sử dụng một loại enzyme đặc biệt ( polymerase) nhân tạo trong ống nghiệm.Phương pháp này được sử dụng trong những lĩnh vực y học nào?
Sao chép DNA để làm gì và nó có thể phục vụ y học như thế nào?Kỹ thuật này cho phép:
- Phân lập và nhân bản gen.
- Chẩn đoán các bệnh di truyền và truyền nhiễm.
- Xác định quan hệ cha con. Đứa trẻ thừa hưởng một số đặc điểm di truyền từ cha mẹ ruột của mình, nhưng có bản sắc di truyền độc đáo của riêng mình. Sự hiện diện trong anh ta của một số gen giống với gen của cha mẹ - cho phép chúng ta nói về việc thiết lập quan hệ họ hàng.
Tại hiện trường vụ án, các nhà khoa học pháp y thu thập các mẫu vật liệu di truyền. Chúng bao gồm: tóc, nước bọt, máu. Sau đó, nhờ kỹ thuật phản ứng polymerase, có thể khuếch đại DNA và so sánh danh tính của mẫu được lấy với vật liệu di truyền của người bị nghi ngờ.
Trong y học, phản ứng chuỗi polymerase được sử dụng hiệu quả:
- Trong thực hành mô học - để phân biệt các loại vi khuẩn và vi rút của bệnh viêm phổi, bệnh lao.
- Trong thực hành phụ khoa và tiết niệu - để xác định nhiễm trùng ureaplasmosis, chlamydia, mycoplasma, bệnh lang ben, mụn rộp, bệnh lậu.
- trong thực hành tiêu hóa.
- Trong huyết học - để xác định nhiễm trùng oncovirus và cytomegalovirus.
- Trong chẩn đoán nhanh các bệnh truyền nhiễm như viêm gan virus, bệnh bạch hầu, bệnh nhiễm khuẩn salmonella.
Hiện nay, phương pháp này được sử dụng rộng rãi nhất trong chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm ( viêm gan do nguyên nhân virus, HIV, các bệnh lây truyền qua đường tình dục, bệnh lao, viêm não do ve).
Điều gì xảy ra trong một phản ứng?
Bản thân phản ứng này đơn giản về mặt hóa học. Một giọt máu, một sợi tóc, một mảnh da, v.v. có thể đóng vai trò là nguồn DNA cho phản ứng. Về lý thuyết, một phản ứng cần đúng thuốc thử, một ống nghiệm, một mẫu vật liệu sinh học và một nguồn nhiệt. Phản ứng polymerase giúp phát hiện nhiễm trùng, ngay cả khi chỉ có một hoặc một vài phân tử DNA của mầm bệnh có mặt trong mẫu cùng với vật liệu sinh học.
Trong quá trình phản ứng, do enzim ADN pôlimeraza, sự nhân đôi xảy ra ( nhân rộng) đoạn DNA. Chính axit deoxyribonucleic Viết tắt là DNA) quan trọng đối với chúng tôi ở chỗ nó đảm bảo việc lưu trữ và truyền thông tin di truyền đến các tế bào con. DNA có dạng xoắn ốc, bao gồm các khối lặp lại. Các khối này tạo nên nucleotide, là đơn vị nhỏ nhất của DNA. Nucleotide được hình thành từ các axit amin.
Quá trình sao chép các đoạn của DNA xảy ra trong các chu kỳ lặp đi lặp lại. Trong mỗi chu kỳ như vậy, không chỉ đoạn DNA ban đầu được sao chép và nhân đôi, mà còn cả những đoạn đã nhân đôi trong chu kỳ khuếch đại trước đó. Tất cả điều này giống như quá trình của một quá trình hình học.
Tồn tại:
- khuếch đại tự nhiên ( đó là quá trình sao chép và nhân lên DNA), xảy ra trong cơ thể chúng ta và là một quá trình xác định, được xác định trước.
- Khuếch đại nhân tạo, xảy ra do phản ứng chuỗi polymerase. Trong trường hợp này, quá trình sao chép được kiểm soát và có thể sao chép ngay cả những đoạn ngắn của axit nucleic.
Sau ba mươi đến bốn mươi chu kỳ, số lượng mảnh vỡ lên đến vài tỷ.
Để khuếch đại trong ống nghiệm (trong ống nghiệm) cần thiết phải có một đoạn DNA ngoại lai cụ thể trong y sinh được lấy để chẩn đoán ( nghĩa là, không phải DNA của bệnh nhân, mà là mầm bệnh). Nếu không có mảnh cụ thể trong dung dịch được tạo ra, phản ứng dây chuyền dưới tác dụng của polymerase sẽ không bắt đầu. Điều này giải thích thực tế là độ đặc hiệu cao của PCR.
Các giai đoạn chẩn đoán PCR
1. DNA được phân lập từ vật liệu thử nghiệm.2. DNA được thêm vào một dung dịch nucleotide đặc biệt.
3. Dung dịch được đun nóng đến nhiệt độ 90 - 95 độ C để protein DNA gấp lại.
4. Giảm nhiệt độ xuống 60 độ.
5. Khi chu kỳ tăng và giảm nhiệt độ được lặp lại, số lượng các phân đoạn axit nucleic tăng lên.
6. Bằng cách tiến hành điện di, kết quả được tổng hợp, và kết quả của việc nhân đôi được tính toán.
Những lợi ích của chẩn đoán này là gì?
- Tính đa dụng: Bất kỳ mẫu axit nucleic nào cũng phù hợp với phương pháp này.
- Tính đặc hiệu cao: mầm bệnh có các chuỗi DNA độc nhất đặc trưng cho nó. Do đó, kết quả PCR được thực hiện sẽ đáng tin cậy, không thể nhầm lẫn gen của mầm bệnh này với gen của mầm bệnh khác.
- Nhạy cảm với sự hiện diện của dù chỉ một phân tử của mầm bệnh.
- Một lượng nhỏ tài liệu cần thiết cho nghiên cứu. Ngay cả một giọt máu cũng sẽ làm được. Khả năng thu được kết quả bằng cách sử dụng một lượng mẫu tối thiểu là rất quan trọng đối với nghiên cứu nhi khoa, sơ sinh, thần kinh, cũng như trong thực hành pháp y.
- Khả năng xác định nhiễm trùng chậm, mãn tính, và không chỉ cấp tính.
- Nhiều mẫu cấy gây bệnh rất khó nuôi cấy trong ống nghiệm bằng các phương pháp khác, và phản ứng polymerase cho phép nuôi cấy với số lượng thích hợp.
Những nhược điểm của chẩn đoán này là gì?
- Nếu vật liệu dành cho PCR không chỉ chứa DNA của mầm bệnh còn sống mà còn của mầm bệnh đã chết, thì cả hai DNA sẽ được khuếch đại. Theo đó, điều trị sau khi chẩn đoán có thể không hoàn toàn chính xác. Sau một thời gian, tốt hơn là nên vượt qua sự kiểm soát về hiệu quả của việc điều trị.
- Quá mẫn cảm với sự hiện diện của vi sinh vật, theo một cách nào đó, cũng có thể được coi là một bất lợi. Rốt cuộc, bình thường trong cơ thể con người có một hệ vi sinh gây bệnh có điều kiện, đó là những vi sinh vật sống trong ruột, dạ dày và các cơ quan nội tạng khác. Những vi sinh vật này chỉ có thể gây hại cho một người trong những điều kiện bất lợi nhất định - không tuân thủ các yêu cầu vệ sinh, nước uống bị ô nhiễm, v.v. Kỹ thuật PCR khuếch đại DNA của ngay cả những vi sinh vật này, mặc dù chúng không dẫn đến bệnh lý.
- PCR của các hệ thống xét nghiệm khác nhau có thể cho kết quả khác nhau. Có nhiều sửa đổi của kỹ thuật này: lồng vào nhau», « không đối xứng», « đảo ngược», « định lượng»PCR và các loại khác.
Cơ quan Liên bang về Giáo dục
Cơ sở giáo dục nhà nước
Giáo dục chuyên nghiệp cao hơn
"Học viện sư phạm bang Karelian"
Bài tập về chủ đề:
Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và ứng dụng của nó
Hoàn thành bởi: sinh viên Koryagina Valeria Alexandrovna
Kiểm tra bởi: Karpikova Natalya Mikhailovna
Petrozavodsk 2013
Giới thiệu
Chương 1 Tổng quan Văn học
1.5.4 Hiệu ứng cao nguyên
1.5.6 Khuếch đại
Sự kết luận
Giới thiệu
Hai mươi năm qua đã được đánh dấu bằng sự ra đời rộng rãi của các phương pháp di truyền phân tử vào khoa học sinh học, y tế và nông nghiệp.
Đến đầu những năm 1970, dường như sinh học phân tử đã đạt đến một mức độ hoàn thiện nhất định. Trong thời kỳ này, vi sinh vật là đối tượng chính của nghiên cứu di truyền phân tử. Quá trình chuyển đổi sang sinh vật nhân chuẩn đã đặt ra cho các nhà nghiên cứu những vấn đề hoàn toàn mới mà không thể giải quyết được bằng các phương pháp phân tích di truyền tồn tại vào thời điểm đó. Một bước đột phá trong sự phát triển của di truyền học phân tử đã trở nên khả thi do sự xuất hiện của một công cụ thí nghiệm mới - endonucleases giới hạn. Trong những năm tiếp theo, số lượng các phương pháp phân tích DNA trực tiếp dựa trên các cách tiếp cận khác nhau về chất lượng bắt đầu tăng lên nhanh chóng.
Trong nhiều trường hợp, các công nghệ hiện đại đã giúp chúng ta có thể bắt đầu nghiên cứu cấu trúc và tổ chức chức năng tốt của bộ gen hạt nhân và ngoại nhân của các sinh vật khác nhau ở mức độ sâu hơn. Điều này có tầm quan trọng đặc biệt đối với việc phát triển các phương pháp mới để chẩn đoán và điều trị các bệnh khác nhau. Không kém phần quan trọng là khả năng sử dụng các thành tựu của di truyền phân tử trong sinh học quần thể và chọn giống để xác định và phân tích sự biến đổi di truyền của các quần thể, giống và chủng, xác định và chứng nhận các cá thể có giá trị kinh tế, tạo ra các sinh vật biến đổi gen và giải quyết các vấn đề khác.
Mỗi phương pháp đều có những ưu nhược điểm riêng. Không có phương pháp chung nào có thể giải quyết tất cả các vấn đề nảy sinh. Vì vậy, việc lựa chọn một phương pháp cụ thể cho nghiên cứu đang diễn ra là một trong những giai đoạn quan trọng nhất của bất kỳ công trình khoa học nào.
Chương 1 Tổng quan Văn học
1.1 Lịch sử phát hiện ra phản ứng chuỗi polymerase (PCR)
Năm 1983 K.B. Mullis và các cộng sự đã xuất bản và cấp bằng sáng chế cho phương pháp phản ứng chuỗi polymerase (PCR), phương pháp được dự định sẽ có tác động sâu sắc đến tất cả các lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng của axit nucleic. Ý nghĩa của phương pháp này đối với sinh học phân tử và di truyền học trở nên to lớn và hiển nhiên đến nỗi bảy năm sau, tác giả đã được trao giải Nobel Hóa học.
Khi bắt đầu sử dụng phương pháp này, sau mỗi chu kỳ gia nhiệt-làm lạnh, DNA polymerase phải được thêm vào hỗn hợp phản ứng, vì nó bị bất hoạt ở nhiệt độ cao cần thiết để tách các chuỗi xoắn DNA. Quy trình phản ứng tương đối kém hiệu quả, đòi hỏi nhiều thời gian và enzyme. Năm 1986, phương pháp phản ứng chuỗi polymerase đã được cải tiến đáng kể. Người ta đã đề xuất sử dụng DNA polymerase từ vi khuẩn ưa nhiệt. Các enzym này được chứng minh là bền nhiệt và có thể chịu được nhiều chu kỳ phản ứng. Việc sử dụng chúng giúp đơn giản hóa và tự động hóa PCR. Một trong những DNA polymerase có thể ổn định nhiệt đầu tiên được phân lập từ vi khuẩn Thermus aquusvà được đặt tên Taq-polymeraza.
Khả năng khuếch đại bất kỳ đoạn DNA nào mà trình tự nucleotide đã biết và thu được nó sau khi PCR ở dạng đồng nhất và số lượng chuẩn bị, làm cho PCR trở thành một phương pháp thay thế để nhân bản phân tử các đoạn DNA ngắn. Trong trường hợp này, không cần áp dụng các kỹ thuật phương pháp luận phức tạp được sử dụng trong kỹ thuật di truyền trong nhân bản thông thường. Sự phát triển của phương pháp PCR đã mở rộng đáng kể khả năng phương pháp luận của di truyền học phân tử, và đặc biệt là công nghệ gen, đến mức nó đã thay đổi hoàn toàn và tăng cường tiềm năng khoa học trong nhiều lĩnh vực của nó.
1.2 Các loại phản ứng chuỗi polymerase (PCR)
· PCR lồng nhau- dùng để giảm số lượng sản phẩm phụ của phản ứng. Dùng hai cặp mồi và thực hiện hai phản ứng liên tiếp. Cặp mồi thứ hai khuếch đại vùng DNA trong sản phẩm của phản ứng đầu tiên.
· PCR đảo ngược- được sử dụng khi chỉ biết một khu vực nhỏ trong trình tự mong muốn. Phương pháp này đặc biệt hữu ích khi cần xác định các trình tự lân cận sau khi DNA đã được đưa vào bộ gen. Để thực hiện PCR đảo ngược, một loạt các lần cắt DNA được thực hiện với các enzym giới hạn<#"justify">mồi phản ứng chuỗi polymerase
· PCR dành riêng cho nhóm- PCR cho người thân<#"center">1.3 Phản ứng chuỗi polymerase
Được phát hiện vào giữa những năm 1980, phản ứng chuỗi polymerase (PCR) có thể tăng số lượng bản sao của một mẫu ban đầu lên hàng triệu lần trong vòng vài giờ. Trong mỗi chu kỳ của phản ứng, hai bản sao được hình thành từ phân tử ban đầu. Mỗi bản sao DNA được tổng hợp có thể dùng làm khuôn để tổng hợp các bản sao DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Do đó, sự lặp lại nhiều lần của các chu kỳ dẫn đến sự gia tăng số lượng bản sao theo cấp số nhân. Kết quả là từ các tính toán rằng ngay cả khi có 30 chu kỳ, số bản sao của phân tử ban đầu sẽ nhiều hơn 1 tỷ. Ngay cả khi chúng ta tính đến việc không phải tất cả amplicon đều được sao chép trong mỗi chu kỳ, tổng số bản sao, mặc dù vậy, là một con số khá lớn.
Mỗi chu kỳ của phản ứng chuỗi polymerase (PCR) bao gồm các bước sau:
· Sự biến tính - Sự gia tăng nhiệt độ làm cho một phân tử ADN sợi kép bị xoắn lại và tách thành hai sợi đơn;
· Ủ - Giảm nhiệt độ cho phép các đoạn mồi gắn vào các vùng bổ sung của phân tử ADN;
· Kéo dài - Enzyme DNA polymerase hoàn thành sợi bổ sung.
Để khuếch đại đoạn đã chọn, hai đoạn mồi oligonucleotide (hạt) nằm cạnh một vùng DNA nhất định được sử dụng. Mồi định hướng 3 - kết thúc về phía nhau và theo hướng của trình tự cần được khuếch đại. DNA polymerase thực hiện quá trình tổng hợp (hoàn thiện) chuỗi DNA bổ sung lẫn nhau, bắt đầu bằng mồi. Trong quá trình tổng hợp DNA, các đoạn mồi được đưa vào chuỗi các phân tử DNA mới được tổng hợp một cách vật lý. Mỗi sợi của phân tử DNA được hình thành bằng cách sử dụng một trong các đoạn mồi có thể dùng làm khuôn để tổng hợp một sợi DNA bổ sung bằng cách sử dụng đoạn mồi kia.
1.4 Tiến hành phản ứng chuỗi polymerase (PCR)
Phản ứng chuỗi polymerase được thực hiện trong các ống nghiệm polypropylene thành mỏng đặc biệt, có kích thước tương thích với bộ xử lý nhiệt (bộ khuếch đại) đã sử dụng - một thiết bị kiểm soát nhiệt độ và đặc điểm thời gian của các giai đoạn của phản ứng chuỗi polymerase (PCR) .
1.5 Nguyên tắc của phương pháp phản ứng chuỗi polymerase
Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là một phương pháp khuếch đại DNA trong ống nghiệm có thể phân lập và nhân lên một chuỗi DNA cụ thể hàng tỷ lần trong vòng vài giờ. Khả năng thu được một số lượng lớn các bản sao của một vùng xác định nghiêm ngặt của bộ gen giúp đơn giản hóa rất nhiều việc nghiên cứu một mẫu ADN hiện có.
Để thực hiện phản ứng chuỗi polymerase, một số điều kiện phải được đáp ứng:
1.5.1 Sự có mặt của một số thành phần trong hỗn hợp phản ứng
Thành phần chính của hỗn hợp phản ứng (PCR) là: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, hỗn hợp các nucleotide triphosphat (ATP, GTP, CTP, TTP), mồi (oligonucleotide), chuẩn bị DNA được phân tích, DNA polymerase nhiệt. Mỗi thành phần của hỗn hợp phản ứng đều tham gia trực tiếp vào phản ứng chuỗi polymerase (PCR), và nồng độ của thuốc thử ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình khuếch đại.
· Tris-HCl - xác định độ pH của hỗn hợp phản ứng, tạo dung lượng đệm. Hoạt động của DNA polymerase phụ thuộc vào pH của môi trường, vì vậy giá trị của pH ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình của phản ứng chuỗi polymerase. Thông thường giá trị pH nằm trong khoảng 8 - 9,5. Độ pH cao là do khi nhiệt độ tăng, độ pH của dung dịch đệm Tril-HCl giảm xuống.
· KCl - nồng độ kali clorua lên đến 50 mm ảnh hưởng đến quá trình biến tính và ủ, nồng độ trên 50 mm ức chế DNA polymerase.
· MgCl 2- vì DNA polymerase là Mg 2+- phụ thuộc vào enzym, khi đó nồng độ của các ion magie ảnh hưởng đến hoạt động của enzym (Mg 2+tạo phức với NTP - chính những phức này là chất nền cho polymerase). Nồng độ cao dẫn đến tăng khuếch đại không đặc hiệu và nồng độ thấp dẫn đến ức chế phản ứng, mức tối ưu (đối với các polymerase khác nhau) là trong vùng 0,5 - 5 mM. Ngoài ra, nồng độ của muối magie ảnh hưởng đến quá trình biến tính và quá trình ủ - sự gia tăng nồng độ của Mg 2+làm tăng nhiệt độ nóng chảy của DNA (tức là nhiệt độ mà 50% sợi DNA mạch kép bị đứt thành các sợi đơn).
· NTP - nucleotide triphosphat là đơn phân trực tiếp của axit nucleic. Để ngăn chặn sự kết thúc chuỗi, nên sử dụng một tỷ lệ bằng nhau của tất cả bốn nucleotide triphosphat. Nồng độ thấp của các thành phần này trong hỗn hợp phản ứng làm tăng xác suất sai sót trong việc xây dựng sợi DNA bổ sung.
· Sơn lót - Tối ưu nhất là sử dụng sơn lót có chênh lệch nhiệt độ nóng chảy không quá 2 - 4 o C. Đôi khi bảo quản lâu dài ở nhiệt độ 4 o Với, hoặc sau một số lượng lớn đông lạnh - tan băng, các mồi hình thành cấu trúc thứ cấp - chất dimer, làm giảm hiệu quả của PCR. Việc loại bỏ vấn đề này được giảm xuống khi ủ trong nồi cách thủy (T = 95 o C) trong 3 phút và làm lạnh nhanh sau đó đến 0o TỪ.
· Các chế phẩm DNA - số lượng và chất lượng của việc chuẩn bị DNA (chất nền) ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình và các thông số của phản ứng chuỗi polymerase. Mẫu DNA dư thừa ức chế phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Tạp chất của các chất khác nhau trong quá trình chuẩn bị DNA cũng có thể làm giảm hiệu quả của phản ứng chuỗi polymerase (PCR): natri axetat, natri clorua, isopropanol, etanol, heparin, phenol, urê, haemoglobin, v.v.
· DNA polymerase - khi sử dụng một lượng nhỏ DNA polymerase, sự giảm tổng hợp sản phẩm cuối cùng được quan sát thấy tỷ lệ thuận với kích thước của các đoạn. Sự dư thừa polymerase 2–4 lần sẽ dẫn đến sự xuất hiện của phổ khuếch tán, và gấp 4–16 lần là phổ không đặc hiệu có trọng lượng phân tử thấp. Phạm vi nồng độ được sử dụng là 0,5 - 1,5 đơn vị hoạt tính đối với 25 µl hỗn hợp PCR.
Ngoài các thành phần chính của hỗn hợp PCR, một số chất bổ sung được sử dụng để cải thiện các chỉ tiêu định tính và định lượng của PCR: acetamide (5%) - tăng độ hòa tan của các thành phần chính; betaine (muối natri) - ổn định DNA polymerase, hạ thấp điểm nóng chảy của DNA, cân bằng điểm nóng chảy; albumin bò (10-100 μg / ml) - ổn định DNA polymerase; dimethyl sulfoxide (1-10%) - tăng độ hòa tan của các thành phần chính; formamide (2-10%) - tăng độ đặc hiệu của quá trình ủ; glycerol (15-20%) - tăng độ bền nhiệt của enzyme, giảm nhiệt độ biến tính của mẫu DNA; amoni sulfat - hạ nhiệt độ biến tính và ủ.
1.5.2 Chu kỳ và nhiệt độ
Quan điểm chung của chương trình phản ứng chuỗi polymerase (PCR) như sau:
sân khấu. Sự biến tính cơ bản kéo dài của quá trình chuẩn bị DNA. 1 chu kỳ
sân khấu. Biến tính nhanh chóng của quá trình chuẩn bị DNA. Ủ lớp sơn lót. Kéo dài. 30 - 45 chu kỳ.
sân khấu. Kéo dài thời gian. Làm lạnh hỗn hợp phản ứng.1 chu kỳ.
Mỗi phần tử của giai đoạn - biến tính, ủ, kéo dài - có các đặc điểm nhiệt độ và thời gian riêng. Các thông số về nhiệt độ và thời gian chảy của từng phần tử được lựa chọn theo kinh nghiệm, phù hợp với các chỉ tiêu định tính và định lượng của sản phẩm khuếch đại.
Biến tính. Trong phần tử này của phản ứng chuỗi polymerase, một phân tử DNA sợi đôi được tách thành hai sợi đơn. Thông số nhiệt độ của biến tính nằm trong khoảng 90 - 95 o C, nhưng trong trường hợp mẫu ADN có hàm lượng guanin và xitôzin cao thì phải tăng nhiệt độ lên 98 o C. Nhiệt độ biến tính phải đủ để làm biến tính hoàn toàn - phân cắt các sợi DNA và tránh "làm lạnh đột ngột" hoặc ủ nhanh, tuy nhiên, DNA polymerase chịu nhiệt kém bền hơn ở nhiệt độ cao. Như vậy, việc lựa chọn các thông số nhiệt độ biến tính tối ưu cho tỷ lệ mồi / mẫu (chuẩn bị DNA) là điều kiện quan trọng để khuếch đại. Nếu nhiệt độ biến tính trong bước đầu tiên trên 95 o C, nên thêm DNA polymerase vào hỗn hợp phản ứng sau khi biến tính sơ cấp. Thời gian của phần tử này của giai đoạn này trong quá trình phản ứng chuỗi polymerase (PCR) phải đủ để biến tính DNA hoàn toàn, nhưng đồng thời không ảnh hưởng đáng kể đến hoạt động của DNA polymerase ở một nhiệt độ nhất định.
Ủ. Nhiệt độ ủ (T một ) là một trong những thông số quan trọng nhất của phản ứng chuỗi polymerase. Nhiệt độ ủ cho từng loại sơn lót cụ thể được chọn riêng. Nó phụ thuộc vào chiều dài và thành phần nucleotide của mồi. Thông thường nó thấp hơn từ 2 - 4 o Từ giá trị điểm nóng chảy (T m ) lót. Nếu nhiệt độ ủ của hệ thống dưới mức tối ưu, thì số lượng các đoạn khuếch đại không đặc hiệu sẽ tăng lên và ngược lại, nhiệt độ cao hơn sẽ làm giảm số lượng các sản phẩm được khuếch đại. Trong trường hợp này, nồng độ của các amplicon cụ thể có thể giảm mạnh, đến mức ức chế phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Tăng thời gian ủ cũng dẫn đến tăng số lượng amplicon không đặc hiệu.
Độ giãn dài. Thông thường, mỗi loại DNA polymerase có thể điều nhiệt có một nhiệt độ hoạt động tối ưu nhất. Tốc độ tổng hợp một sợi DNA bổ sung bởi một enzyme cũng là một giá trị đặc trưng cho mỗi polymerase (trung bình, nó là 30–60 nucleotide mỗi giây, hoặc 1–2 nghìn base mỗi phút), do đó, thời gian kéo dài được lựa chọn tùy thuộc. trên loại DNA polymerase và chiều dài của vùng khuếch đại.
1.5.3 Các nguyên tắc cơ bản của việc chọn mồi
Khi tạo một hệ thống thử nghiệm PCR, một trong những nhiệm vụ chính là lựa chọn đúng các mồi phải đáp ứng một số tiêu chí:
Sơn lót phải cụ thể. Đặc biệt chú ý đến 3 - phần cuối của đoạn mồi, vì chính từ chúng mà Taq polymerase bắt đầu hoàn thành chuỗi ADN bổ sung. Nếu tính đặc hiệu của chúng không đủ, thì có khả năng các quá trình không mong muốn sẽ xảy ra trong ống nghiệm có hỗn hợp phản ứng, cụ thể là quá trình tổng hợp DNA không đặc hiệu (đoạn ngắn hoặc đoạn dài). Nó có thể nhìn thấy trên điện di dưới dạng các dải bổ sung nặng hoặc nhẹ. Điều này gây khó khăn cho việc đánh giá kết quả của phản ứng, vì rất dễ nhầm lẫn giữa sản phẩm khuếch đại cụ thể với DNA ngoại lai được tổng hợp. Một phần của mồi và dNTP được sử dụng để tổng hợp DNA không đặc hiệu, dẫn đến mất độ nhạy đáng kể.
Các lớp sơn lót không được tạo thành dimer và vòng lặp, tức là không có sợi kép ổn định nào được hình thành bằng cách ủ các mồi với chính chúng hoặc với nhau.
1.5.4 Hiệu ứng cao nguyên
Cần lưu ý rằng quá trình tích lũy các sản phẩm khuếch đại cụ thể theo cấp số nhân chỉ mất một thời gian giới hạn, và sau đó hiệu quả của nó giảm xuống nghiêm trọng. Điều này là do cái gọi là hiệu ứng "cao nguyên".
hiệu lực kỳ hạn cao nguyên được sử dụng để mô tả quá trình tích lũy các sản phẩm PCR trong các chu kỳ cuối cùng của quá trình khuếch đại.
Tùy thuộc vào điều kiện và số chu kỳ của phản ứng khuếch đại, tại thời điểm hiệu ứng đạt được cao nguyên việc sử dụng chất nền (dNTP và mồi), độ ổn định của chất phản ứng (dNTP và enzyme), lượng chất ức chế, bao gồm pyrophosphat và song công DNA, cạnh tranh chất phản ứng với các sản phẩm không đặc hiệu hoặc mồi-dimer, nồng độ của một sản phẩm cụ thể , và biến tính không hoàn toàn ở nồng độ cao của các sản phẩm khuếch đại.
Nồng độ ban đầu của DNA mục tiêu càng thấp, nguy cơ xảy ra phản ứng càng cao ". Điểm này có thể xảy ra trước khi đủ số lượng sản phẩm khuếch đại cụ thể để phân tích. Chỉ những hệ thống thử nghiệm được tối ưu hóa tốt mới có thể tránh được điều này.
1.5.5 Chuẩn bị mẫu vật liệu sinh học
Các kỹ thuật khác nhau được sử dụng để tách chiết DNA, tùy thuộc vào nhiệm vụ. Bản chất của chúng nằm ở việc tách (chiết) DNA từ một sản phẩm sinh học và loại bỏ hoặc trung hòa các tạp chất lạ để thu được chế phẩm DNA có độ tinh khiết phù hợp với PCR.
Phương pháp thu được một sự chuẩn bị DNA tinh khiết, được Marmur mô tả, được coi là tiêu chuẩn và đã trở thành cổ điển. Nó bao gồm quá trình phân giải protein bằng enzym, sau đó là quá trình khử protein và tái kết tủa DNA bằng rượu. Phương pháp này có thể thu được một chế phẩm DNA tinh khiết. Tuy nhiên, nó khá tốn công sức và liên quan đến việc làm việc với các chất mạnh và hăng như phenol và chloroform.
Một trong những phương pháp phổ biến hiện nay là phương pháp tách chiết DNA do Boom et al đề xuất. Phương pháp này dựa trên việc sử dụng tác nhân chaotropic mạnh, guanidine thiocyanate (GuSCN), để ly giải tế bào và hấp thụ DNA tiếp theo trên chất mang (hạt thủy tinh, đất tảo cát, sữa thủy tinh, v.v.). Sau khi rửa, DNA vẫn còn trong mẫu được hấp phụ trên chất mang, từ đó có thể dễ dàng loại bỏ nó bằng cách sử dụng dung dịch đệm rửa giải. Phương pháp này thuận tiện, công nghệ tiên tiến và thích hợp cho việc chuẩn bị mẫu để khuếch đại. Tuy nhiên, sự mất mát DNA có thể xảy ra do sự hấp thụ không thể đảo ngược trên chất mang, cũng như trong nhiều lần rửa. Điều này đặc biệt quan trọng khi làm việc với một lượng nhỏ DNA trong mẫu. Hơn nữa, ngay cả một lượng nhỏ của GuSCN cũng có thể ức chế phản ứng PCR. Do đó, khi sử dụng phương pháp này, việc lựa chọn chính xác chất hấp phụ và tuân thủ cẩn thận các sắc thái công nghệ là rất quan trọng.
Một nhóm phương pháp chuẩn bị mẫu khác dựa trên việc sử dụng chất trao đổi ion kiểu Chilex, không giống như thủy tinh, không hấp phụ DNA, mà ngược lại, các tạp chất cản trở phản ứng. Theo quy định, công nghệ này bao gồm hai giai đoạn: đun sôi mẫu và hấp phụ tạp chất trên thiết bị trao đổi ion. Phương pháp này cực kỳ hấp dẫn do thực hiện đơn giản. Trong hầu hết các trường hợp, nó phù hợp để làm việc với vật liệu lâm sàng. Thật không may, đôi khi có những mẫu có tạp chất mà không thể loại bỏ bằng thiết bị trao đổi ion. Ngoài ra, một số vi sinh vật không thể bị tiêu diệt bằng cách đun sôi đơn giản. Trong những trường hợp này, cần phải giới thiệu thêm các giai đoạn xử lý mẫu.
Do đó, việc lựa chọn phương pháp chuẩn bị mẫu cần được xem xét với sự hiểu biết về mục đích của các phép phân tích dự kiến.
1.5.6 Khuếch đại
Để thực hiện phản ứng khuếch đại, cần chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và thêm mẫu DNA đã phân tích vào đó. Trong trường hợp này, điều quan trọng là phải tính đến một số tính năng của quá trình ủ sơn lót. Thực tế là, theo quy luật, trong mẫu sinh học được phân tích có nhiều phân tử DNA khác nhau, mà các đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng có một phần, và trong một số trường hợp, có ý nghĩa tương đồng. Ngoài ra, các mồi có thể ủ với nhau để tạo thành mồi-dimer. Cả hai đều dẫn đến việc tiêu thụ đáng kể mồi cho quá trình tổng hợp các sản phẩm phản ứng phụ (không đặc hiệu) và kết quả là làm giảm đáng kể độ nhạy của hệ thống. Điều này gây khó khăn hoặc không thể đọc kết quả của phản ứng trong quá trình điện di.
1.6 Thành phần của hỗn hợp phản ứng PCR tiêu chuẩn
x đệm PCR (dung dịch Tris-HCl 100 mM, pH 9,0, dung dịch KCl 500 mM, dung dịch MgCl2 25 mM ) ……. 2,5 µl
Nước (MilliQ) ……………………………………………………… .18,8 µl
Hỗn hợp các nucleotide triphosphat (dNTPs)
mM dung dịch của mỗi …………………………………………. ……… .0,5 µl
Lớp sơn lót 1 (dung dịch 10 mM) ………………………………………….… .1 µl
Lớp sơn lót 2 (dung dịch 10 mM) ………………………………………….… .1 µl
DNA polymerase (5 đơn vị / µl) …………………………………………… 0,2 µl
Mẫu DNA (20 ng / µl) ………………………………………… ..1 µl
1.7 Đánh giá kết quả phản ứng
Để đánh giá chính xác kết quả của PCR, điều quan trọng là phải hiểu rằng phương pháp này không phải là định lượng. Về mặt lý thuyết, các sản phẩm khuếch đại của các phân tử DNA mục tiêu đơn có thể được phát hiện bằng điện di sau 30-35 chu kỳ. Tuy nhiên, trên thực tế điều này chỉ được thực hiện trong trường hợp phản ứng diễn ra trong điều kiện gần với lý tưởng, điều này không thường gặp trong cuộc sống. Mức độ tinh khiết của quá trình chuẩn bị DNA có ảnh hưởng đặc biệt lớn đến hiệu quả của quá trình khuếch đại; sự hiện diện của một số chất ức chế trong hỗn hợp phản ứng, mà trong một số trường hợp có thể rất khó loại bỏ. Đôi khi, do sự hiện diện của chúng, không thể khuếch đại thậm chí hàng chục nghìn phân tử DNA đích. Do đó, thường không có mối quan hệ trực tiếp giữa lượng DNA mục tiêu ban đầu và lượng sản phẩm khuếch đại cuối cùng.
Chương 2: Các ứng dụng của phản ứng chuỗi polymerase
PCR được sử dụng trong nhiều lĩnh vực để phân tích và trong các thí nghiệm khoa học.
Hình sự học
PCR được sử dụng để so sánh cái gọi là "dấu vân tay di truyền". Chúng tôi cần một mẫu vật liệu di truyền từ hiện trường vụ án - máu, nước bọt, tinh dịch, tóc, v.v. Nó được so sánh với vật liệu di truyền của nghi phạm. Về mặt lý thuyết, một lượng rất nhỏ DNA là đủ - một bản sao. DNA được cắt thành các đoạn, sau đó được khuếch đại bằng PCR. Các đoạn được phân tách bằng phương pháp điện di DNA. Hình ảnh thu được về vị trí của các dải DNA được gọi là dấu vân tay di truyền.
Xác lập quan hệ cha con
Kết quả điện di đoạn DNA khuếch đại bằng PCR. Bố. Đứa trẻ. Mẹ. Đứa trẻ thừa hưởng một số đặc điểm của dấu ấn di truyền của cả bố và mẹ, điều này mang lại một dấu ấn mới, độc đáo.
Mặc dù "dấu vân tay di truyền" là duy nhất, mối quan hệ gia đình vẫn có thể được thiết lập bằng cách tạo ra một số dấu vân tay như vậy. Phương pháp tương tự có thể được áp dụng, với những sửa đổi nhỏ, để thiết lập các mối quan hệ tiến hóa giữa các sinh vật.
Chẩn đoán y tế
PCR giúp tăng tốc đáng kể và tạo điều kiện thuận lợi cho việc chẩn đoán các bệnh di truyền và virus. Gen quan tâm được khuếch đại bằng PCR sử dụng các đoạn mồi thích hợp và sau đó được giải trình tự để xác định các đột biến. Nhiễm virus có thể được phát hiện ngay sau khi nhiễm bệnh, vài tuần hoặc vài tháng trước khi các triệu chứng của bệnh xuất hiện.
Y học cá nhân
Đôi khi thuốc gây độc hoặc gây dị ứng cho một số bệnh nhân. Lý do cho điều này một phần là do sự khác biệt của từng cá nhân về tính nhạy cảm và chuyển hóa của thuốc và các dẫn xuất của chúng. Những khác biệt này được xác định ở cấp độ di truyền. Ví dụ, ở một bệnh nhân, một cytochrome nhất định có thể hoạt động nhiều hơn, ở một bệnh nhân khác - ít hơn. Để xác định loại cytochrome mà một bệnh nhân nhất định có, người ta đề xuất thực hiện phân tích PCR trước khi sử dụng thuốc. Phân tích này được gọi là phân tích kiểu gen sơ bộ.
Nhân bản gen
Nhân bản gen là quá trình phân lập các gen và là kết quả của các thao tác kỹ thuật di truyền, thu được một lượng lớn sản phẩm của một gen nhất định. PCR được sử dụng để khuếch đại một gen, sau đó được đưa vào một vector, một đoạn DNA mang gen ngoại lai vào cùng một sinh vật hoặc một sinh vật dễ phát triển khác. Ví dụ như vectơ, plasmid hoặc DNA của virus được sử dụng. Việc đưa gen vào một sinh vật lạ thường được sử dụng để thu được sản phẩm của gen này - ARN hoặc thường là protein. Bằng cách này, nhiều protein thu được với số lượng công nghiệp để sử dụng trong nông nghiệp, y học, v.v.
xét nghiệm DNA
Trong phương pháp giải trình tự sử dụng dideoxynucleotide được đánh dấu phóng xạ hoặc huỳnh quang, PCR là một phần không thể thiếu, vì trong quá trình trùng hợp, các dẫn xuất nucleotide có nhãn huỳnh quang hoặc phóng xạ được chèn vào chuỗi DNA. Điều này làm dừng phản ứng, cho phép xác định vị trí của các nucleotide cụ thể sau khi tách các sợi tổng hợp trong gel.
Gây đột biến
Hiện nay, PCR đã trở thành phương pháp gây đột biến chính. Việc sử dụng PCR giúp đơn giản hóa và tăng tốc quy trình gây đột biến, cũng như làm cho nó trở nên đáng tin cậy và có thể tái tạo được.
Phương pháp PCR có thể phân tích sự hiện diện của trình tự papillomavirus ở người trong các phần sinh thiết của khối u cổ tử cung ở người được nhúng trong parafin 40 năm trước nghiên cứu này. Hơn nữa, với sự trợ giúp của PCR, người ta đã có thể khuếch đại và nhân bản các đoạn DNA ty thể từ phần còn lại hóa thạch của não người có tuổi đời 7 nghìn năm!
Trên các dịch tách của tinh trùng người riêng lẻ, khả năng phân tích đồng thời hai locus nằm trên các nhiễm sắc thể khác nhau đã được chứng minh. Phương pháp này cung cấp cơ hội duy nhất để phân tích di truyền tốt và nghiên cứu tái tổ hợp nhiễm sắc thể, đa hình ADN, v.v. Phương pháp phân tích tinh trùng riêng lẻ ngay lập tức được ứng dụng thực tế trong y học pháp y, vì việc đánh máy HLA của các tế bào đơn bội giúp xác định quan hệ cha con hoặc xác định tội phạm (phức hợp HLA là một tập hợp các gen của phức hợp tương thích mô cơ chính của con người; các locus của phức hợp HLA là đa hình nhất được biết đến ở động vật có xương sống bậc cao: trong một loài, tại mỗi vị trí, có một số lượng lớn bất thường alen khác nhau - dạng thay thế của cùng một gen).
Sử dụng PCR, có thể xác định tính đúng đắn của sự tích hợp các cấu trúc gen ngoại lai trong một vùng xác định trước của bộ gen của các tế bào được nghiên cứu. Tổng số DNA của tế bào được ủ với hai đoạn mồi oligonucleotide, một trong số đó bổ sung cho vị trí của DNA vật chủ gần điểm chèn và đoạn còn lại với trình tự của đoạn tích hợp trong sợi DNA đối cực. Phản ứng chuỗi polymerase trong trường hợp cấu trúc ADN nhiễm sắc thể không thay đổi tại vị trí chèn được đề xuất dẫn đến sự hình thành các đoạn ADN sợi đơn có kích thước không xác định và trong trường hợp chèn theo kế hoạch, các đoạn ADN sợi kép của một đoạn đã biết kích thước, được xác định bởi khoảng cách giữa các vị trí ủ của hai mồi. Hơn nữa, mức độ khuếch đại của vùng được phân tích của bộ gen trong trường hợp đầu tiên sẽ phụ thuộc tuyến tính vào số chu kỳ và trong trường hợp thứ hai - theo cấp số nhân. Sự tích lũy theo cấp số nhân của một đoạn khuếch đại có kích thước xác định trước giúp bạn có thể quan sát trực quan nó sau khi phân đoạn điện di của một chế phẩm DNA và đưa ra kết luận rõ ràng về việc chèn một trình tự ngoại lai vào một vùng nhất định của DNA nhiễm sắc thể.
Sự kết luận
Phương pháp PCR hiện đang được sử dụng rộng rãi nhất như một phương pháp chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm khác nhau. PCR cho phép bạn xác định căn nguyên của nhiễm trùng, ngay cả khi mẫu được lấy để phân tích chỉ chứa một vài phân tử DNA của mầm bệnh. PCR được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán sớm các trường hợp nhiễm HIV, viêm gan vi rút, v.v. Cho đến nay, hầu như không có tác nhân lây nhiễm nào mà không thể phát hiện bằng PCR.
Danh sách tài liệu đã sử dụng
1.Padutov V.E., Baranov O.Yu., Voropaev E.V. Phương pháp phân tích phân tử - di truyền. - Minsk: Unipol, 2007. - 176 tr.
2.PCR "trong thời gian thực" / Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Yu. và vân vân.; ed. b. N. D.V. Rebrikov; lời tựa L.A. Osterman và acad. RAS và RAAS E.D. Sverdlov; Lần xuất bản thứ 2, phiên bản sửa đổi. và bổ sung - M.: BINOM. Phòng thí nghiệm Tri thức, 2009. - 223 tr.
.Patrushev L.I. Hệ thống di truyền nhân tạo. - M.: Nauka, 2005. - 2 tấn
.B. Glick, J. Pasternak Công nghệ sinh học phân tử. Nguyên tắc và ứng dụng 589 trang, 2002
5.Shchelkunov S.N.
Biên tập bởi A.A. Vorbyeva
Http: // ru. wikipedia.org
http: // học giả. google.ru
.
.
http://www.med2000.ru/n1/n12. htm
12.http: // prizvanie. su /
Dạy kèm
Cần trợ giúp để tìm hiểu một chủ đề?
Các chuyên gia của chúng tôi sẽ tư vấn hoặc cung cấp dịch vụ gia sư về các chủ đề mà bạn quan tâm.
Gửi đơn đăng ký cho biết chủ đề ngay bây giờ để tìm hiểu về khả năng nhận được tư vấn.