Các nguyên tắc cơ bản của liệu pháp phân tử. Thuốc dựa trên oligonucleotide

Thuốc cho gen

Ước mơ lâu nay của các bác sĩ là có được các chất có thể hoạt động trên các gen cụ thể, tức là. căn nguyên của nhiều căn bệnh. Thật vậy, dựa trên những chất như vậy, người ta có thể tạo ra thuốc - những "viên đạn ma thuật" thực sự có thể tác động đến vật chất di truyền của các tác nhân lây nhiễm khác nhau mà không gây hại cho cơ thể con người, cũng như ngăn chặn hoạt động của các ung thư gây ra sự phát triển tế bào ác tính. Việc tạo ra các chất có ảnh hưởng trực tiếp đến vật chất di truyền là một trong những nhiệm vụ chính của sinh học phân tử, vì chúng có thể được sử dụng để nghiên cứu các chức năng của gen và cuối cùng là kiểm soát công việc của gen sau này.

Nhưng làm thế nào bạn có thể thay đổi chương trình di truyền mong muốn? Xét cho cùng, tất cả các gen đều có thành phần và cấu trúc hóa học giống nhau: sự khác nhau giữa chúng chỉ giảm theo thứ tự xen kẽ của 4 khối đơn chất - nucleotit A, T, G, C. Để tác động lên một gen nào đó, một phân tử chất. bằng cách nào đó phải nhận ra trình tự nucleotide này - nhiệm vụ, thoạt nhìn, không thể giải quyết được.

Nhưng một nhóm các nhà hóa học người Siberia đến Novosibirsk Academgorodok trong những năm đầu tiên thành lập nó lại nghĩ khác. Dựa trên nguyên tắc nhận dạng phân tử được sử dụng bởi chính thiên nhiên, các nhân viên của Viện Hóa học Hữu cơ thuộc Chi nhánh Siberi của Viện Hàn lâm Khoa học Liên Xô (Novosibirsk) N.I. Grineva và D.G. Công trình nghiên cứu đầu tiên về oligonucleotide được các nhà hóa học Siberia công bố vào năm 1967 - ngày này được coi là ngày chính thức xuất hiện một hướng mới trong sinh học phân tử và dược học.

Họ là những người đầu tiên

Việc thực hiện dự án này, khác thường ở sự táo bạo của nó (vào thời điểm đó, thậm chí không có kế hoạch thực hiện nghiên cứu như vậy ở bất kỳ đâu trên thế giới) ở giai đoạn đầu được thực hiện bởi một nhóm nhỏ nhân viên trẻ, nghiên cứu sinh và sinh viên của NSU. Chúng tôi phải bắt đầu thực tế lại từ đầu, vì vào thời điểm đó họ vẫn chưa biết cách tổng hợp oligonucleotide với số lượng đáng kể; không có công cụ kỹ thuật cần thiết để làm việc với một lượng nhỏ axit nucleic và một phương pháp hiệu quả để xác định trình tự của chúng. Các nhà hóa học của chúng tôi đã giải quyết được những vấn đề này nhờ tính liên ngành - một trong những nguyên tắc hình thành nền tảng cho các hoạt động của Chi nhánh Siberi.

NIOC đã tổ chức sản xuất axit nucleic, phát triển các phương pháp biến đổi hóa học của chúng; cùng với các nhân viên của Viện Vật lý Hạt nhân, họ đã có thể tạo ra các thiết bị để phân tích axit nucleic và thao tác với một lượng nhỏ của chúng, và cùng với các nhà hóa học từ Đại học Tổng hợp Moscow, họ bắt đầu nghiên cứu việc tạo ra các bộ tổng hợp tự động các oligonucleotide. Kết quả là, trên thực tế, tất cả các phương pháp và dụng cụ phân tích cần thiết đều thuộc quyền sử dụng của các nhà khoa học - nghiên cứu sinh học có thể bắt đầu.

Các thí nghiệm được thực hiện trước tiên trên các mô hình đơn giản và sau đó trên các axit nucleic tự nhiên cho thấy rằng các oligonucleotide thực sự tương tác với các axit nucleic đích với mức độ chọn lọc cao. Trong trường hợp khi các nhóm phản ứng được gắn vào các oligonucleotide, một sự thay đổi hóa học có chủ đích của các axit nucleic đích sẽ xảy ra. Ngoài ra, lần đầu tiên người ta chứng minh rằng những thuốc thử này có thể được sử dụng để ngăn chặn sự lây nhiễm virus ở động vật và khả năng đưa chúng vào cơ thể qua da và màng nhầy, v.v. đã được chứng minh.

Các công bố ban đầu về tác dụng sinh học do oligonucleotide tạo ra đã thu hút sự quan tâm lớn của các chuyên gia trên khắp thế giới. Năm 1988, hội nghị chuyên đề đầu tiên trên thế giới về các chất nhắm vào gen dựa trên các đoạn axit nucleic được tổ chức tại Akademgorodok. Các nhà khoa học từ Hoa Kỳ, Pháp, và sau đó là các quốc gia khác đã tham gia nghiên cứu để tạo ra các loại thuốc như vậy; Hàng chục công ty đã xuất hiện với mục tiêu tạo ra các loại thuốc điều trị dựa trên oligonucleotide.

Y học bổ túc

Cái gọi là oligonucleotide antisense, được thiết kế để khử hoạt tính có chọn lọc các RNA của virus và một số RNA của tế bào, đã trở thành loại thuốc đầu tiên trong số các loại thuốc nhắm vào gen. Ban đầu, người ta cho rằng các nhóm phản ứng sẽ được gắn vào các oligonucleotide này, chúng sẽ biến đổi hoặc phá hủy các axit nucleic đích về mặt hóa học. Tuy nhiên, hóa ra việc gắn các oligonucleotide vào bản thân RNA mục tiêu có tác động mạnh đến RNA đến mức có thể gây ra sự phá hủy bởi các enzyme tế bào.

D. G. KNORRE - Viện sĩ Viện Hàn lâm Khoa học Nga, chuyên gia trong lĩnh vực động học hóa học, sinh học phân tử và hóa học hữu cơ sinh học. Trưởng phòng thí nghiệm Hóa học polyme tự nhiên (1960-1984), Khoa Hóa sinh và Phòng thí nghiệm Hóa học axit nucleic (1970-1984) của Viện Hóa học hữu cơ Chi nhánh Siberi thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Liên Xô, Giám đốc Viện của Hóa học sinh học của Chi nhánh Siberi của Viện Hàn lâm Khoa học Liên Xô và Chi nhánh Siberi của Viện Hàn lâm Khoa học Nga (1984-1996).)

Các phương pháp tiếp cận Antisense dựa trên việc sử dụng nucleotide và axit nucleic để ngăn chặn hoạt động sinh học của axit nucleic mang lại những triển vọng thú vị trong những trường hợp cần ngăn chặn việc triển khai thông tin không mong muốn trong cơ thể sống. Trước hết, triển vọng tạo ra một thế hệ thuốc kháng vi-rút và kháng u mới mở ra. Những loại thuốc như vậy có một lợi thế không thể chối cãi so với những loại khác ... Tất cả các oligonucleotide, bất kể mục tiêu mà chúng nhắm đến, đều có thể được tạo ra bằng một công nghệ duy nhất. Chỉ có trình tự các nucleotide cần phải đa dạng. Đặc biệt, trong virus học và ung thư học, người ta thường phải đối mặt với một hiện tượng như sự xuất hiện của tình trạng kháng thuốc. Điều này xảy ra thường xuyên nhất là do một hạt vi rút hoặc một tế bào ung thư đơn lẻ có đột biến dẫn đến khả năng kháng thuốc như vậy. Trong bất kỳ trường hợp nào khác, nên bắt đầu tìm kiếm theo kinh nghiệm cho một loại thuốc mới. Trong trường hợp tác dụng đối kháng, chỉ cần xác định sự thay đổi nào trong cấu trúc của bộ gen virus hoặc gen ung thư đã dẫn đến sự xuất hiện của đề kháng. Sau đó, nó ngay lập tức trở nên rõ ràng về cách tạo ra một loại thuốc mới bằng cách sử dụng cùng một công nghệ thống nhất *.

* Tạp chí Giáo dục Soros. - 1998. - 12. - C. 25-31.

Các RNA can thiệp, phức hợp chuỗi kép ngắn của RNA oligonucleotide, hóa ra lại là phương tiện "tắt" gen mạnh mẽ nhất. Khi một phức hợp như vậy được đưa vào tế bào, một trong các sợi sẽ liên kết với trình tự bổ sung của nó trong RNA thông tin của tế bào. Đây là tín hiệu để bắt đầu công việc của một nhóm enzym cắt RNA liên kết với oligonucleotide. Kết quả là, chương trình tổng hợp một loại protein nhất định biến mất.

Năm 2006, hai nhà nghiên cứu người Mỹ đã được trao giải Nobel Sinh lý học hoặc Y học vì đã giải thích được cơ chế can thiệp của RNA. Việc tạo ra các chất điều hòa biểu hiện gen dựa trên các RNA can thiệp đã mở ra cơ hội lớn để thu được nhiều loại thuốc không độc có hiệu quả cao ngăn chặn sự biểu hiện của hầu hết các gen, bao gồm cả khối u và virus.

Các đột biến chính xác

Sự chú ý của các chuyên gia từ lâu đã bị thu hút bởi các phương pháp gây đột biến trên DNA bằng cách sử dụng oligonucleotide hoặc các dẫn xuất của chúng. Nếu thành công, điều mà ngày nay tưởng như viển vông có thể trở thành hiện thực: việc sửa chữa các chương trình di truyền khiếm khuyết.

Thực nghiệm đã chứng minh rằng đột biến điểm có thể được đưa vào các chương trình di truyền bằng cách sử dụng các oligonucleotide ngắn. Làm thế nào để làm nó? Các oligonucleotide gây đột biến có chứa các khối nucleotide "sai" được đưa vào tế bào, nơi chúng được kết hợp với DNA. Kết quả là, các cặp base “sai”, tức là không bổ sung, xuất hiện trong một số phần của trình tự nucleotide, được hệ thống sửa chữa DNA của tế bào (“sửa chữa”) coi là hư hỏng. Các nucleotide trong một cặp như vậy được thay thế bằng các enzym thay thế theo cách mà nó trở nên “chính xác”, bổ sung cho nhau. Trong trường hợp này, sự thay thế có thể xảy ra cả trong trình tự oligonucleotide và trong chính DNA của tế bào.

Trong trường hợp thứ hai, chúng ta đang đối phó với sự thay đổi trong chương trình di truyền, tức là với một đột biến. Và mặc dù hiệu quả của quá trình đột biến như vậy nói chung là thấp, nhưng nó có thể được sử dụng liên quan đến các công nghệ tế bào mới. Ví dụ: tế bào gốc của một bệnh nhân mắc một số rối loạn di truyền có thể được điều trị bằng một chất gây đột biến chọn lọc, và sau đó những tế bào gốc của chúng đã xảy ra đột biến mong muốn (tức là các tế bào có chương trình di truyền “đã sửa chữa”) có thể được chọn lọc, nhân lên và đưa vào cơ thể.

Năm 1967 Công trình đầu tiên về oligonucleotide, các chất có hoạt tính sinh học nhắm vào gen, được xuất bản

Do đó, các oligonucleotide hiện có có thể điều chỉnh “công việc” của các gen ở nhiều cấp độ khác nhau. Do đó, các oligonucleotide đối kháng nói trên và các RNA can thiệp hoạt động ở giai đoạn tổng hợp protein, hoạt động trên RNA thông tin - các phân tử thông tin trong đó các chuỗi polypeptide được lắp ráp. Các oligonucleotide kháng nguyên hình thành phức hợp với DNA ngăn chặn sự biểu hiện gen - bản thân sự hình thành các RNA thông tin, và các oligonucleotide aptamer, giống như kháng thể, có thể tạo liên kết với một số protein nhất định, ngăn chặn chúng. Ngoài ra, một số oligonucleotide có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch - ngày nay chúng được sử dụng làm thành phần của vắc xin.

Hiện nay, việc phát triển và tổng hợp các oligonucleotide và các chất tương tự của chúng được thực hiện bởi các ngành nghiên cứu và công nghiệp lớn. Vì vậy, năm ngoái, khối lượng thị trường cho các oligonucleotide dành riêng cho mục đích nghiên cứu đã vượt quá 800 triệu đô la! Hàng chục loại oligonucleotide biến đổi hóa học mới hiện đã được phát triển và tổng hợp, và một số loại thuốc kháng vi-rút và chống viêm dựa trên chúng đang được thử nghiệm. Nghiên cứu về loại này ở Nga hiện chủ yếu được thực hiện tại Viện Sinh học Hóa học và Y học Cơ bản của Chi nhánh Siberi của Viện Hàn lâm Khoa học Nga, nơi các sinh viên và người theo dõi của Viện sĩ D. G. Knorre làm việc.

Đây là cách thành quả của ý tưởng nảy sinh ở chi nhánh Siberia cách đây bốn mươi năm đã được chứng minh bằng chính cuộc sống. Sử dụng các đoạn ngắn của axit nucleic làm cấu trúc cơ bản để tạo ra các hoạt chất sinh học nhắm vào gen, có thể nhanh chóng phát triển và đưa vào sản xuất các loại thuốc đặc trị chống lại hầu hết mọi loại vi rút. Để làm được điều này, người ta chỉ cần giải mã trình tự nucleotide của gen virus, điều này rất dễ thực hiện với sự hỗ trợ của các công nghệ hiện đại. Phương pháp tiếp cận phổ quát này có một tương lai tuyệt vời: kết quả của các nghiên cứu trong những năm gần đây, đặc biệt là về đột biến gen hướng vào vị trí, cho phép chúng ta tin tưởng vào sự xuất hiện của các loại thuốc hiệu quả trong tương lai gần để chống lại những căn bệnh vẫn được coi là không thể chữa khỏi.

RNA "Antisense" (Antisense RNA), được cho là được sử dụng làm thuốc, là một oligonucleotide ngắn (15-20 nucleotide) có thể liên kết với một vị trí mRNA nhất định bổ sung cho nó và ức chế sự dịch mã của protein mà nó mã hóa, do đó ngăn chặn quá trình bệnh lý (Hình 2).

Hiệu quả điều trị của các oligonucleotide "antisense" tổng hợp phụ thuộc vào tính đặc hiệu của quá trình lai của chúng với vị trí có thể tiếp cận của mRNA đích, khả năng chống lại hoạt động của nuclease tế bào và sự hiện diện của hệ thống phân phối vào tế bào. Trình tự 15-20 nucleotide lai với các mRNA duy nhất có tính đặc hiệu khá cao. Các vị trí mục tiêu tiềm năng được xác định bằng cách thử nghiệm một tập hợp các oligonucleotide "antisense" bằng cách sử dụng nuôi cấy tế bào tổng hợp mRNA mục tiêu. Để làm được điều này, người ta tiến hành phân tách điện di của các protein tế bào, trong đó nhãn phóng xạ được đưa vào trong quá trình dịch mã, và sử dụng phương pháp chụp ảnh phóng xạ, nó được xác định khi có sự hiện diện của oligonucleotide “antisense” thì quá trình tổng hợp một protein nhất định bị giảm. Không có tiêu chí chung nào để chọn các vị trí mục tiêu tốt nhất trong các phiên mã RNA khác nhau. Các Oligonucleotide bổ sung cho các đầu 5 'hoặc 3' của ranh giới mRNA, exon và intron, và thậm chí các vùng sợi đôi có thể có hiệu quả. Các oligonucleotide antisense có thể bị phân hủy bởi nuclease nội bào, vì vậy điều quan trọng là phải bảo vệ chúng khỏi tác động của chất sau để chúng không bị mất khả năng lai với mục tiêu. Đối với điều này, các bazơ pyrimidine, ribose hoặc deoxyribose có thể được sửa đổi theo một cách nhất định (Hình 3). Do đó, trong các oligonucleotide “antisense” được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay, nguyên tử oxy tự do của liên kết phosphodiester được thay thế bằng nhóm SH (Hình 3B ), dẫn đến sự hình thành một liên kết thiophosphat. Oligonucleotide được biến đổi theo cách này hòa tan trong nước, mang điện tích âm và không bị phân cắt bởi endonuclease. Khi được lai với vị trí đích, chúng tạo thành song công kích hoạt ribonuclease (RNase), một loại enzyme nội sinh phân cắt mRNA trong một phân tử lai như vậy. Các thử nghiệm lâm sàng đầu tiên của các oligonucleotide như vậy - loại thuốc thuộc "thế hệ đầu tiên" đã được thực hiện. Các mục tiêu là RNA của cytomegalovirus, virus gây suy giảm miễn dịch ở người, cũng như mRNA của các gen gây ra sự phát triển của bệnh ung thư, bệnh đường ruột và các bệnh khác.

Các oligonucleotit "antisense" được tổng hợp với liên kết phosphoramidit và polyamit (peptit) - axit nucleic peptit (peptit nucleicacid, PNA) (Hình 3 V và D ). Các phân tử như vậy rất chống lại tác động của nucleaza. Các nhóm hóa học được gắn vào nguyên tử cacbon 2'của bã đường và nguyên tử C-5 của pyrimidine cũng bảo vệ các oligonucleotide antisense và tạo điều kiện cho chúng liên kết với vị trí đích (Hình 3 2D và E ). Tất cả những ưu điểm của những điều này và các sửa đổi khác hiện đang được nghiên cứu chuyên sâu.

Sự thâm nhập của oligonucleotide "antisense" vào tế bào có thể được tạo điều kiện rất nhiều bằng cách đặt chúng vào liposome. Hệ thống phân phối hiệu quả cao này cho phép sử dụng các oligonucleotide "antisense" ở nồng độ thấp. Tuy nhiên, nếu liposome được liên hợp với các kháng thể đặc hiệu cho các biểu mô của một số tế bào của các cơ quan nhất định, thì sẽ có thể thực hiện việc phân phối các oligonucleotide “antisense” có mục tiêu.

Các thử nghiệm tiền lâm sàng được tiến hành đã chỉ ra rằng oligonucleotide "antisense" là những loại thuốc rất hiệu quả. Khả năng sử dụng chúng để điều trị chứng hẹp động mạch vành và động mạch cảnh, dẫn đến các cơn đau tim và đột quỵ, đã được nghiên cứu. Trong những trường hợp này, họ thường dùng đến phương pháp nong mạch, mở rộng động mạch bằng ống thông bóng, nhưng khoảng 40% bệnh nhân chảy máu tái xuất hiện sau 6 tháng, vì nong mạch kích thích tăng sinh tế bào cơ trơn và tiết chất gian bào vào bên trong. lớp của động mạch tại vị trí mở rộng của nó. Trong một trong các thí nghiệm, các oligonucleotide antisense có liên kết thiophosphate, bổ sung cho các protein mã hóa mRNA quan trọng đối với chu kỳ tế bào của động vật có vú, được tiêm vào động mạch cảnh của chuột sau khi nong mạch; Kết quả là tần suất tái phát của các lần tái phát giảm 90%. Tăng sinh tế bào cơ trơn còn gặp trong bệnh lý xơ vữa động mạch, đái tháo đường, biến chứng sau phẫu thuật bắc cầu mạch vành. Có thể, tất cả các trạng thái này có thể được kiểm soát theo những cách tương tự.

Các oligonucleotide antisense cũng có thể được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm trùng do virus và sốt rét. Ngoài ra, kết quả của các thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I để điều trị bệnh Crohn bằng cách uống oligonucleotide "antisense" đã cho thấy hiệu quả điều trị rõ ràng mà không có tác dụng phụ đáng chú ý. Trong trường hợp này, mRNA đích được mã hóa cho loại kết dính gian bào 1, được sản xuất quá mức ở bệnh nhân mắc bệnh Crohn. Nó nhằm mục đích điều tra hiệu quả của cùng một oligonucleotide trong việc điều trị các bệnh viêm nhiễm khác, chẳng hạn như viêm khớp dạng thấp, bệnh vẩy nến và viêm loét đại tràng.

Về nguyên tắc, các oligonucleotide "antisense" có thể tạo thành chuỗi xoắn ba với DNA đích của nhiễm sắc thể và khối phiên mã. Tuy nhiên, tính đặc hiệu của các oligonucleotide "kháng nguyên" vẫn chưa đáp ứng các tiêu chuẩn được áp dụng cho thuốc.

04.07.2013 - 31.12.2013

Một phân tích có hệ thống các tài liệu hiện đại về chủ đề nghiên cứu đã được thực hiện. Theo quan điểm của những người thực hiện dự án, trình tự của những chất hứa hẹn nhất, theo quan điểm của những người thực hiện dự án, các dẫn xuất oligonucleotide và các chất tương tự của chúng, cần thể hiện hoạt tính kháng vi-rút và kháng khuẩn, đã được thiết lập.
Các phương pháp đã được phát triển để tổng hợp các oligonucleotide biến đổi và các liên hợp của chúng bằng cách sử dụng bộ tổng hợp DNA / RNA tự động hoặc ở chế độ tổng hợp thủ công trên một giá đỡ vững chắc. Các phương pháp tiếp cận khác nhau đã được đề xuất để thiết kế các dẫn xuất oligonucleotide với một chức năng nhất định, bao gồm các phương pháp dựa trên phân tích dự đoán về cấu trúc và độ ổn định của các chất song hình được tạo thành bằng phương pháp động lực học phân tử. Một phương pháp được đề xuất để tổng hợp các dẫn xuất mới, chưa được mô tả trước đây của các oligonucleotide mang các sửa đổi ở nguyên tử phốt pho của nhóm internucleotide phosphodiester.
Một kỹ thuật đã được phát triển để phân tích hiệu quả thâm nhập của các hợp chất được đánh dấu huỳnh quang vào tế bào vi khuẩn. Nó đã được chỉ ra rằng các dẫn xuất tích điện dương của peptit 4G-amide Flu- (LR) thâm nhập và tích lũy hiệu quả trong Pseudomonas aeruginosa, trong khi hiệu quả thâm nhập của oligonucleotide vào nó mà không có peptit vận chuyển là thấp.
Tất cả các phương pháp được phát triển trong quá trình nghiên cứu, cả tổng hợp và phân tích, đều được thực hiện trong công việc của Phòng thí nghiệm Hóa học Y sinh của ICBFM SB RAS. Những phát triển lý thuyết nhận được được sử dụng trong các khóa học giáo dục.
Cơ sở tổng hợp được tạo ra trong phòng thí nghiệm để thu nhận, phân lập và đặc trưng các oligonucleotide là duy nhất cho Liên bang Nga và gần với cấp độ của các phòng thí nghiệm nghiên cứu tốt nhất thế giới về chuyên ngành tương ứng. Sự tham gia của các chuyên gia sinh học làm cho phòng thí nghiệm trở nên độc đáo về tiềm năng triển khai nghiên cứu theo hướng phát triển các loại thuốc kháng vi-rút và kháng khuẩn nhắm mục tiêu RNA.

Mở rộng

01.01.2014 - 31.12.2014

i) Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các chất tương tự oligonucleotide / liên hợp oligonucleotide chống lại Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium; Staphylococcus aureus;
ii) Đánh giá hoạt tính kháng vi rút của các chất tương tự oligonucleotide / liên hợp oligonucleotide chống lại vi rút cúm WSN33 / A / H1N1.
iii) Lựa chọn trình tự của các chất dẫn đầu oligonucleotide thể hiện hoạt tính kháng khuẩn hoặc kháng vi rút ở mức độ cần thiết;
iv) Phát triển các quy trình tổng hợp các liên hợp oligonucleotide có chứa các nhóm làm tăng hiệu quả tích lũy chúng trong tế bào nhân thực hoặc vi khuẩn
iv) Đánh giá hiệu quả thâm nhập và tích lũy của các hợp chất đã phát triển trong tế bào vi khuẩn và tế bào nhân thực.
v) Phòng thí nghiệm đã được chuẩn bị;
vi) Các bài báo trên tạp chí khoa học được lập chỉ mục bởi Web of Science.
vii) Tóm tắt báo cáo tại hội nghị;
viii) Bằng chứng về việc tham gia các khóa học giáo dục;
ix) Hội nghị;

Mở rộng

01.01.2015 - 31.12.2015

3.1 Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất chứa trình tự thủ lĩnh chống lại Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium; Staphylococcus aureus in vitro (trong nuôi cấy tế bào);
3.2 Hoạt tính kháng vi rút của các hợp chất chứa trình tự thủ lĩnh chống lại vi rút cúm in vitro;

3.3. Đặc điểm công nghệ và điều trị của các chất tương tự và liên hợp oligonucleotide đã chọn, có tính đến các cách thương mại hóa thuốc, bao gồm:

3.3.1 Danh sách các phương pháp thực nghiệm tiêu chuẩn hóa để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng vi rút của các chế phẩm tương tự oligonucleotide in vitro (trong nuôi cấy tế bào) và in vivo (trên mô hình động vật);

3.3.3 Các chất tương tự và liên hợp oligonucleotide chọn lọc, cùng với biểu hiện của hoạt tính kháng khuẩn và kháng vi rút cao, có khả năng thâm nhập và tích tụ hiệu quả trong tế bào, bao gồm:

3.3.2.1 Dữ liệu nhập và phân phối tế bào cho các chất tương tự và liên hợp oligonucleotide đã sửa đổi;
3.3.2.2 Tối ưu hóa tổng hợp bán điều chế, sửa đổi trước và sau tổng hợp, phân lập và kiểm soát định lượng các chất tương tự oligonucleotide thể hiện hoạt tính kháng khuẩn và kháng vi rút;
3.3.2.3. Đánh giá các hợp chất được phát triển có hoạt tính kháng khuẩn và kháng vi rút trong điều kiện sử dụng thương mại.

3.4 Lập báo cáo dự án cuối cùng;
3.5 Phòng thí nghiệm chuẩn bị;

3.6 Tóm tắt báo cáo tại hội nghị;
3.7 Giấy chứng nhận tham gia các khóa học giáo dục;

3.8 3 hạt trong các tạp chí khoa học định kỳ được lập chỉ mục trong Web of Science

Hầu hết các phương pháp điều trị gen ex vivo và in vivo sử dụng cấu trúc gen nhân bản thay thế dạng chức năng của protein không được tổng hợp trong cơ thể bệnh nhân hoặc được tổng hợp ở dạng khiếm khuyết. Tuy nhiên, ngược lại, nhiều bệnh ở người (ung thư, viêm nhiễm, nhiễm trùng do vi rút và ký sinh trùng) có liên quan đến việc sản xuất quá mức protein bình thường. Các liệu pháp đã được phát triển để điều trị những tình trạng này.

hệ thống sử dụng các oligonucleotide cụ thể. Một oligonucleotide nhỏ như vậy có thể lai với một gen hoặc mRNA cụ thể và làm giảm mức độ phiên mã hoặc dịch mã, do đó làm giảm lượng protein chịu trách nhiệm về bệnh lý được tổng hợp. Một oligonucleotide lai với chính gen và ngăn chặn quá trình phiên mã của nó được gọi là "kháng nguyên", và một oligonucleotide lai với mRNA tương ứng được gọi là "antisense" (ARN Antisense). Để ngăn chặn sự kích hoạt phiên mã của các gen cụ thể, cũng có thể sử dụng các oligonucleotide sợi kép liên kết đặc biệt với các protein liên kết DNA (protein hoạt hóa). Cuối cùng, để giảm số lượng mRNA nhất định và protein được tổng hợp trên đó, có thể sử dụng ribozyme - các chuỗi RNA tự nhiên liên kết với các phân tử RNA cụ thể và cắt chúng.

Trong tương lai, các loại thuốc dựa trên axit nucleic có khả năng được ứng dụng rộng rãi, với các oligonucleotide "antisense" khác nhau là đối tượng chính của nghiên cứu khoa học và thử nghiệm lâm sàng.

3.1 Các oligonucleotide antisense làm thuốc

5507 0

Điều này có thể đạt được bằng một số cách: lai oligonucleotide tương ứng với một gen hoặc mRNA cụ thể, ngăn chặn yếu tố phiên mã protein, giảm số lượng mRNA do quá trình phân cắt bởi các enzym RNA, v.v. Hãy xem xét các nguyên tắc của một số chúng.

Một ribooligonucleotide liên kết với mRNA cụ thể và do đó ức chế sự dịch mã của protein mà nó mã hóa được gọi là mRNA "antisense". Cơ chế này được một số vi khuẩn sử dụng để điều chỉnh gen (Hình 3.20). Trong thực tế, các gen được thiết kế nhân tạo được sử dụng, trong đó đoạn chèn DNA được định hướng sao cho các bản sao của chúng là ngược âm so với mRNA đích (Hình 3.21).

Cơm. 3,20. Điều hòa gen bacterioferritin (bfr) bằng ARN đối kháng

Cơm. 3,21. Ức chế dịch mRNA bởi một Oligonucleotide Antisense tổng hợp

Người ta đã chứng minh rằng có thể sử dụng các oligonucleotide antisense tổng hợp, tuy nhiên, hiệu quả điều trị của chúng sẽ phụ thuộc mạnh mẽ vào khả năng chống lại hoạt động của nuclease tế bào, hệ thống phân phối và tính đặc hiệu của quá trình lai tạo của chúng. Để xác định các vị trí đích hiệu quả nhất trên mRNA cụ thể, một tập hợp các oligonucleotide antisense dài 15-20 bazơ được thử nghiệm với quá trình nuôi cấy các tế bào tổng hợp mRNA đích. Thành phần của các protein được tổng hợp được xác định bằng phương pháp điện di và nó được thiết lập để đưa oligonucleotide vào dẫn đến giảm tổng hợp protein đích.

Để bảo vệ chống lại sự phân cắt nuclease, các oligonucleotide biến đổi được tổng hợp, đồng thời không làm mất khả năng lai. Trên hình. 3.22 cho thấy cấu trúc của các nucleotide đã được sửa đổi, hiệu quả của chúng đang được nghiên cứu chuyên sâu. Ví dụ, người ta đã chỉ ra rằng các oligonucleotide với sự thay thế oxy tự do của liên kết phosphodiester bằng lưu huỳnh (cấu trúc b) lai có hiệu quả với RNA mục tiêu bổ sung và kết quả là song công RNA-DNA kích hoạt ribonuclease H. nội bào.

Enzyme nội sinh này thủy phân chuỗi RNA trong các giống lai như vậy. Với các oligonucleotide như vậy, các thử nghiệm lâm sàng đầy hứa hẹn đã được thực hiện, trong đó các mục tiêu là RNA của cytomegalovirus, HIV và một số RNA chịu trách nhiệm cho sự phát triển của ung thư.

Cơm. 3,22. Các biến đổi của Oligonucleotide: a - liên kết phosphodiester bình thường; b - liên kết thiophotphat; c - liên kết phosphamide; d - 2 "-0-metylribose; e - C-5-propynylcytosine

Để phân phối hiệu quả các oligonucleotide antisense, chúng thường được đóng gói thành các liposome, đến lượt chúng được biến đổi với các phối tử cụ thể để cung cấp phân phối có mục tiêu (chúng ta đã thấy kỹ thuật này khi xem xét các phương pháp phân phối gen trị liệu không do virus). Cho đến nay, một số thử nghiệm đã được thực hiện và hiệu quả điều trị cao của antisense oligonucleotide đã được chứng minh là ngăn chặn sự tăng sinh không mong muốn của các tế bào cơ trơn (biến chứng sau nong mạch, phẫu thuật bắc cầu mạch vành, xơ vữa động mạch), để điều trị nhiễm virut và sốt rét .

Nguyên tắc hoạt động và cấu trúc của ribozyme - RNA tự nhiên với hoạt tính nuclease, được trình bày trong Hình. 3,23.
Người ta đã phát hiện ra rằng những RNA sợi ngắn này có thể ngăn chặn hiệu quả sự biểu hiện của các gen virus, gen sinh ung thư, các yếu tố tăng trưởng và các gen quan trọng trong điều trị khác bằng cách phân cắt mRNA của chúng. Bằng cách sửa đổi trình tự liên kết cơ chất, có thể thu được ribozyme đặc trưng cho mRNA cụ thể. Ribozyme có thể được tổng hợp trực tiếp trong tế bào bằng cách phiên mã một oligodeoxyribonucleotide tổng hợp mã hóa vùng xúc tác và vùng lai bên cạnh nó.

Cơm. 3,23. Sự phân cắt mRNA bởi ribozyme. Mũi tên cho thấy vị trí phân cắt.

Một oligonucleotide như vậy được đưa vào vector biểu hiện của sinh vật nhân chuẩn và được đặt vào tế bào. RNA kết quả thu được một cách tự nhiên một cấu trúc hoạt động, cái gọi là hình dạng đầu búa. Nhiều ribozyme có cấu trúc và hoạt động khác nhau đã được tổng hợp hóa học. Ví dụ, trong phòng thí nghiệm axit nucleic của Viện Sinh học Hóa học và Y học Thực nghiệm thuộc Chi nhánh Siberi của Viện Hàn lâm Khoa học Nga (Novosibirsk), nhiều năm nghiên cứu đang được thực hiện để thu được các ribozyme tổng hợp có hoạt tính và độ ổn định tăng lên.

Để tăng khả năng bảo vệ chống lại sự phân cắt sớm bởi các nuclease nội bào, người ta thu được các dẫn xuất khác nhau của ribozyme - với nhóm 2 "-hydroxyl được methyl hóa (xem Hình 3.22, d), cấu trúc nhị phân, v.v. Cấu trúc của phân tử ribozyme ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả của nó. Hình 3.24 cho thấy động học của sự phân cắt mRNA mdr1 với các ribozyme tổng hợp có cấu trúc khác nhau.

Cơm. 3,24. Sự phân cắt đoạn đầu 190-mer 5'của mRNA MDR1 với các ribozyme nhị phân (1,3) và chiều dài đầy đủ (2,4) được sửa đổi: a - Cấu trúc RNA với một vị trí cụ thể biệt lập; b - tích lũy các sản phẩm phân cắt ( tài liệu do A.G. Venyaminova, IBKhiFM, Novosibirsk cung cấp)

Một vị trí đặc biệt trong liệu pháp phân tử bị chiếm giữ bởi cái gọi là phương pháp kích hoạt tiền dược chất. Ví dụ, một trong những phương pháp điều trị gen cho bệnh ung thư là tiêu diệt các tế bào khối u bằng cách sử dụng dẫn xuất hoạt hóa của ganciclovir (GCV, một dẫn xuất của guanosine), một sản phẩm của gen thymidine kinase, từ virus herpes simplex HSVtk đã được đề cập bởi chúng ta.

Tế bào khối u được truyền gen HSVtk in vivo dưới một promoter hoạt động và sau một vài ngày, ganciclovir được sử dụng, nó được phosphoryl hóa bởi thymidine kinase của virus thành monophosphat và sau đó là các kinase của tế bào chủ thành triphosphat. Dẫn xuất này ức chế DNA polymerase và ngừng tổng hợp DNA, dẫn đến cái chết của các tế bào tăng sinh. Thông qua các tiếp xúc giữa các tế bào, ganciclovir triphosphat thâm nhập vào các tế bào không bị biến đổi lân cận và do đó phá hủy thêm 10 tế bào khối u.

Gen dẫn đến cái chết của tế bào của chính mình được gọi là gen "tự sát" (trong trường hợp của chúng tôi là gen thymidine kinase), và thuật ngữ "tiền dược" đề cập đến dạng không hoạt động của thuốc (trong trường hợp này là ganciclovir). Cách tiếp cận này đã được sử dụng để tạo ra các biến thể khác của tổ hợp tiền chất hoạt hóa gen, nhưng hiệu quả của hệ thống GCV-HSVtk đã được chứng minh trong một số thử nghiệm tiền lâm sàng.

Liệu pháp gen là một ngành y học mới, sự hình thành của nó đang diễn ra trước mắt chúng ta. Mặc dù có một số thành công và triển vọng đầy hứa hẹn, vẫn còn một số thách thức phải vượt qua.

Một số vấn đề nằm ngoài y học và sinh học phân tử. Đây là những vấn đề đạo đức và chính trị. Như bạn đã nhận thấy, chúng tôi coi các phương pháp điều trị di truyền chỉ dành cho tế bào xôma. Điều này có nghĩa là các chỉnh sửa được thực hiện chỉ giới hạn ở một cơ quan hoặc mô nhất định, các gen được "sửa" sẽ không được truyền lại cho thế hệ tiếp theo. Những thay đổi trong kiểu gen của tế bào mầm (tinh trùng hoặc trứng) hoặc tế bào thụ tinh phải được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác.

Hiện nay, liệu pháp gen của tế bào soma được xếp vào loại phương pháp can thiệp y tế tiêu chuẩn. Ngược lại, liệu pháp gen tế bào mầm về mặt công nghệ phức tạp hơn nhiều, có nhiều vấn đề và không thể đoán trước được. Do đó, các thí nghiệm trong lĩnh vực này bị cấm ở nhiều quốc gia.

Cuối những năm 80. Tại Hoa Kỳ, các quy định đã được thiết lập để điều chỉnh các thử nghiệm trong lĩnh vực liệu pháp di truyền tế bào soma. Họ đảm bảo sự lựa chọn khách quan và đại diện cho bệnh nhân và nhận thức của họ (mức độ nguy hiểm của phương pháp điều trị, khả năng thành công của nó là bao nhiêu, v.v.), tính bảo mật của thông tin về bệnh nhân và các nghiên cứu được thực hiện, việc thực hiện tất cả các thao tác đúng cách mà không gây hại , cho cả những bệnh nhân cụ thể và dân số nói chung.

Vì việc điều trị các tế bào soma dẫn đến cải thiện tình trạng và kéo dài đáng kể tuổi thọ của bệnh nhân mắc bệnh di truyền, nhưng gen “cải thiện” không được di truyền, người ta tin rằng điều này sẽ dẫn đến sự tích tụ của các bệnh di truyền trong dân số loài người. Tuy nhiên, theo di truyền học quần thể, phải mất hàng nghìn năm để tần số của một gen có hại gia tăng đáng kể do kết quả của việc điều trị hiệu quả.

VÀO. Voinov, T.G. Volova