Перша частина (до синьої лінії) це введення в генотерапію, в принципі, щоб краще зрозуміти самі методи, і, мабуть, не бути висловленим викладачем. Якщо немає часу і потрібен конкретний матеріал з питання, прогортайте відразу за синю лінію.

Генна терапія спочатку націлювалася на лікування моногенних спадкових захворювань, але потім область її застосування розширилася, і вона стала розглядатися як потенційно універсальний підхід до лікування всього спектра хвороб, включаючи також інфекційні захворювання, рак, атеросклероз, діабет та інші.

«Лікування генів»- Виправлення дефекту в гені (моногенні хвороби) – на рівні соматичних та статевих клітин – заміна мутантного гена на нормальний.

«Лікування генами»- Корекція дефекту шляхом введення повноцінного працюючого гена (кДНК).

Спочатку трохи загальної теорії:

Вирішальною умовою успішної генотерапії є забезпечення ефективної доставки, тобто трансфекції (у широкому розумінні) або трансдукції (При використанні вірусних векторів) чужорідного гена в клітини-мішені, забезпечення тривалого функціонування його в цих клітинах та створення умов для повноцінної роботи гена (його експресії).

Стратегії корекції генетичних дефектів:

За типом векторної системи:

Вірусна

Переваги вірусних векторів: трансдукція великої кількості клітин; тропізм; стійкість до лізосомної деградації

Недоліки вірусних векторів: імуногенність (зі смертельними наслідками – адено- та герпесвіруси); потенційна канцерогенність (ретровіруси).

Невірусна

· пряма ін'єкція в клітину, тканину, орган (вона ж мікроін'єкція);

· Ліпофекція (за допомогою різних модифікованих ліпосом (ліпідних бульбашок з ДНК усередині);

· Електропорація;

· У складі плазміди;

· Комплексована ДНК (плазмідна ДНК, сполучена з солями, білками тощо);

· Генна рушниця (ДНК приєднано до золотих частинок, що вистрілюються в тканині пацієнта);

· Рецептор-опосередкований ендоцитоз.

Переваги невірусної доставки: відносна безпека; відсутність імунної відповіді; простота застосування.

Недоліки невірусної доставки: низька ефективність трансфекції; низький рівень експресії.

Теоретично найбільш радикальним та ефективним способом є заміна дефектного гена у статевих клітинах (фетальна генотерапія), проте є етичні проблеми. На даний момент усі геннотерапевтичні підходи базуються на генотерапії на рівні соматичних клітин.

За механізмом дії вбудовуваного гена або молекули ДНК, що переноситься, генотерапія ділиться на позитивну (відновлення функції гена (через відновлення його роботи або вставки нової робочої копії) або негативну - придушення функції гена). Плюс існує підхід спрямований на посилення імунної відповіді, яка використовується переважно в генотерапії раку (про це нижче).

Так само нову ген інформацію можна вносити в організм людини, у складі його попередньо трансформованих in vitro клітин г.з. ex vivo підхід. Підхід, при якому ген інформація вводиться безпосередньо в клітини живої людини, називається (раптово) in vivo, локальне введення в певні ділянки називається in situ. На даний момент існують успішні прецеденти введення ген інформації in utero (в ембріон), у Великій Британії, зовсім недавно врятували дитину від мітохондріальної хвороби.

Додаткові генотерапевтичні підходи:

· Антисенс ДНК, РНК (+): специфічність, можна використовувати в будь-якому векторі, неімуногенні; (-): швидка деградація у клітині);

· Рибозими (+): мають властивості ферментів - не витрачаються, здатні до каталізу розщеплення мішені, на відміну від білків неімуногенні, індукують синтез інтерферону; (-): швидка деградація;

· трансдомінантні негативні білки;

· Одноланцюгові антитіла;

· суїцидні гени (замість «лікування» клітини, її можна просто вбити, використовується в антиракових системах, (детальніше буде нижче);

· Введення антиген-специфічних лімфоцитів;

· Хімеропластика (гібриди ДНК/РНК шпилькової структури, що виробляють гомологічну рекомбінацію в ядрі);

Тут йдуть виключно приклади генотерапевтичних методів, опис захворювань дивіться в попередніх по нумеруванні квитках.

Моногенні захворювання:

Недостатність аденозиндезаміназ(ПЕКЛО синдром) – перший відносно вдалий приклад використання генотерапії. Вона була здійснена 14 вересня 1990 року. Ця дата вважається днем ​​народження реальної генної терапії.

За допомогою лейкофорезу з периферичної крові виділяли мононуклеарні клітини, потім їх вирощували в культурі в умовах проліферації Т-клітин. Потім проліферуючі в умовах in vitro клітини вводили ретровірусний вектор, який містив нормальний ген ADA. Через кілька днів трансдуковані клітини крові знову вводили пацієнтці. Процес повторювали 7 разів упродовж 10 місяців. Ефект був позитивним, ліфоцитів ¼ в організмі отримали робочий ген. Раз на 3-5 місяців введення модифікованих клітин повторювали. В даний час генна терапія даного захворювання розвивається у напрямку використання стовбурових клітин пацієнта. Це дозволить значно скоротити кількість введень модифікованих клітин за рахунок їх багаторазових поділів вже в самому організмі та при досягненні селективної та кількісної переваги модифікованих стовбурових клітин над нативними сформує достатній рівень ферменту в організмі.

Спадкова гіперхолестеролеміяВідомо, що гепатоцити, що не діляться, не можуть бути інфіковані ретровірусами. Після гепатоектомії гепатоцити починають проліферувати і набувають здатності інфікуватися ретровірусами. Гепатоцити, отримані з печінки хворого, за допомогою ретровірусного вектора була введена кДНК гена нормального рецептора LDL-R. Після реінфузії рекомбінантних гепатоцитів через ворітну вену в печінку спостерігалося зменшення вмісту в крові ліпопротеїнів низької щільності (зокрема, холестерину) та співвідношення ліпопротеїнів низької щільності до ліпопротеїнів високої щільності. Це означає, що введені клітини функціонували in vivo та здійснювали інтерналізацію та обмін холестеринів.

Гемофілія В –Були проведені успішні досліди на собаках з використанням стратегії ех vivo з
доставкою до гепатоцитів кДНК, що кодує фактор IX. Вдалося досягти синтезу фактора IX у кількостях, що становлять 0,1% від нормальної кількості фактора IX у плазмі крові. При спробі підвищити концентрацію фактора IX були використані аденовірусні вектори, проте ефект був недовготривалим. Кров тварин згорталася, проте ефект повністю пропадав після 2-х місяців (типовий недолік аденовірусних векторів).

Гемофілія A -З'явилися повідомлення про успішне введення мишам укороченого гена фактора VIII у складі ретровірусного вектора. В результаті досягається терапевтичний рівень фактора крові.

Муковісцидоз -Показано, що заміна 6-10% клітин легеневого епітелію трансфекованими клітинами дозволить відновити нормальні транспортні функції трансмембранних каналів, які забезпечують перенесення іонів хлору. Ретровіруси не підходять, тому що не іфікують клітини, що не діляться, аденовіруси підходять з застереженнями, так як в дослідах на мишах викликали запальні реакції. Проблема додатково полягає у бар'єрі з глікоколіксу на поверхні клітин. Один з підходів для вирішення даної проблеми полягає в модифікації вектора, який включає певний ліганд до рецептора на поверхні клітин легеневого епітелію. Взаємодія ліганду з рецептором зазвичай призводить до інтерналізації вектора разом із рецептором усередину клітини. Як такий рецептор був обраний трансмембранний рецептор P2Y2-R. Цей рецептор бере участь у запуску каскаду запальних реакцій у порожнині легень. Як ліганд використовувалися або моноклональні антитіла до цього рецептора, або природний ліганд - біотинУТФ.

М'язова дистрофія ДюшенаХвороба починає виявлятися у дитинстві, і генна терапія має проводитися у цей час. Найбільш перспективним є використання аденовірусних векторів. Через велику довжину гена, дослідники використовують укорочені, але функціональні копії білка. Експерименти на мишачих моделях, які мають дефектний ген дистрофіну, показали, що від 5 до 50% клітин м'язів експресували зрізаний білок дистрофін. Цього було достатньо для мінімізації м'язової дегенерації. Існують дані про клінічні випробування генетичної конструкції, що несе ген дистрофіну, для терапії хворих на м'язову дистрофію Дюшена. Хворі діти після ін'єкції у м'язи такої конструкції набували здатності рухатися. Проте ефект був короткочасним.

Багатофакторні захворювання на прикладі онкологічних захворювань:

Рак це, як правило, наслідок багатоступінчастих змін клітини. Складність, пов'язана з участю безлічі генів та їх продуктів у пухлинному процесі, викликала сумніви щодо ефективності генної терапії ракових захворювань. Однак, існують численні експерименти, що показують, що компенсація єдиного гена-супресора може призводити до пригнічення пухлинних властивостей клітин.

Імунотерапія раку:

Використання генотерапевтичних конструкцій, що стимулюють імунну (в основному клітинну) протипухлинну відповідь. Для створення ген-конструкцій використовують гени: антигенів (на який спрацьовує імунна система); Комплексу MHCI (головний комплекс гістосумісності); фактор B7; Цитокінів; Рецепторів Т-клітин. Пригнічення розвитку пухлини може бути досягнуто клонування генів цитокінів: інтерлейкінів IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, а також фактора некрозу пухлин -α (TNF-α), інтерферонів (INF-α, INF-ϒ)

Пригнічення зростання ракових клітин введенням у них генів, продукти яких пригнічують розвиток пухлини:

· Гени-супресори пухлини (RB, P53, mdm2, Cip 1, P16, Cyclin D)

· Суїцидні гени

· Інгібітори онкогенів

· Фактори антиангіогенезу

· Інгібітори циклінів

· Гени, що підвищують чутливість клітин пухлини до лікарських сполук

· Гени транспортерів лікарських сполук (введення, наприклад, клітини кісткового мозку)

Колосальне значення має в придушенні онкогенів ген p53 (відповідає за апоптоз і здатний зупинити клітинний цикл, запобігаючи безконтрольному поділу), тому його мутація практично завжди веде до злоякісного переродження клітини. Для внесення робочої копії гена p53 в організм використовуються аденовірусні вектори. Після початку експресії гена p53 в ядрі ракової клітини він індукує її апоптоз.

Іншим підходом є придушення роботи онкогенів. Мутація в гені RAS здатна призвести до конститутивної роботи сигнальної системи запуску поділу (MAP кіназний каскад, згадуємо Ніколайчика J). Щоб заблокувати цей ген, 1) можна інгібувати експресії RAS введенням інтактного гена; 2) інгібування RAS рибозимами; 3) інгібування нижчележачих у сигнальному шляху генів; 4) перешкода вбудовування RAS білка в мембрану.

Використання онколітичних вірусів.Вірусний онколізис - це новий підхід до терапії онкологічних захворювань, заснований на природної здатності вірусів вбивати (лізувати) клітини, у яких він розмножується. Для цього використовуються реовіруси, поліовоїруси, еховіруси та віруси Коксакі + деякі модифіковані аденовіруси, які переважно розмножуються в пухлинних клітинах і ведуть їх до апоптозу. В даний час проводяться клінічні випробування препарату REOLYSIN, який випускає компанія Oncolytic Biotech. Дуже перспективними є аденовіруси, що експресують антиангіогенні білки.

Вступ

З кожним роком у наукових журналах з'являється все більше статей про медичні клінічні дослідження, в яких так чи інакше застосовувалося лікування, засноване на введенні різних генів - генна терапія. Цей напрямок виріс з таких розділів біології, що добре розвиваються, як молекулярна генетика і біотехнологія.

Найчастіше, коли звичайні (консервативні) методи перепробовані, саме генна терапія може допомогти пацієнтам вижити і навіть повністю одужати. Наприклад, це стосується спадкових моногенних захворювань, тобто таких, які викликані дефектом в одному-єдиному гені, а також багатьох інших. Або, наприклад, генна терапія може врятувати і врятувати кінцівку тим хворим, у яких звужений просвіт судин у нижніх кінцівках і внаслідок цього розвинулася стійка ішемія навколишніх тканин, тобто ці тканини відчувають сильну нестачу поживних речовин і кисню, які в нормі розносяться кров'ю по організму. Хірургічними маніпуляціями та ліками таких пацієнтів лікувати часто не виходить, зате якщо локально змусити клітини викидати назовні більше білкових факторів, які б вплинули на процес утворення та проростання нових судин, то ішемія стала б набагато менш вираженою і жити хворим стане набагато легше.

Генну терапіюсьогодні можна визначити як лікування захворювань шляхом введення генів у клітини пацієнтів з метою спрямованої зміни генних дефектів або надання клітинам нових функцій. Перші клінічні випробування методів генної терапії було здійснено зовсім недавно - 22 травня 1989 року з метою діагностики раку. Першим спадковим захворюванням, щодо якого були застосовані методи генної терапії, виявився спадковий імунодефіцит.

З кожним роком кількість успішно проведених клінічних випробувань лікування різних захворювань із використанням генної терапії зростає, і до січня 2014 р. досягло 2 тисяч.

Водночас і в сучасних дослідженнях з генної терапії необхідно враховувати, що наслідки маніпулювання генами або «перетасованими» (рекомбінантними) ДНК in vivo(Лат. буквально "в живому") вивчені недостатньо. У країнах із найбільш просунутим рівнем досліджень у цій галузі, особливо у США, медичні протоколи з використанням смислових послідовностей ДНК піддаються обов'язковій експертизі у відповідних комітетах та комісіях. У США такими є Консультативний комітет з рекомбінантних ДНК (Recombinant DNA Advisory Committee, RAC) та Управління з ліків та харчових продуктів (Food and Drug Administration, FDA) з наступним обов'язковим затвердженням проекту директором Національних інститутів здоров'я (National Institutes of Health).

Отже, ми визначилися, що це лікування засноване на тому, що якщо якісь тканини організму відчувають нестачу деяких окремих білкових факторів, то це можна виправити введенням у ці тканини відповідних генів, що кодують білки, і все стане більш менш цікаво. Самі білки вводити не вийде, тому що наш організм відразу зреагує неслабкою імунною реакцією, та й тривалість дії була б недостатньою. Тепер слід визначитися з методом доставки гена до клітин.

Трансфекція клітин

Для початку варто запровадити визначення деяких термінів.

Транспорт генів здійснюється завдяки вектору- Це молекула ДНК, яка використовується як «транспортний засіб» для штучного перенесення генетичної інформації в клітину. Вирізняють безліч різновидів векторів: плазмідні, вірусні, а також косміди, фазміди, штучні хромосоми і т.д. Принципово важливо, що вектори (зокрема, плазмідні) мають характерні для них властивості:

1. Точка початку реплікації (ori)- Послідовність нуклеотидів, з якої починається подвоєння ДНК. Якщо векторна ДНК не зможе подвоюватись (реплікуватися), то необхідний лікувальний ефект не буде досягнутий, тому що вона просто швидко розщепиться внутрішньоклітинними ферментами-нуклеазами, а через нестачу матриць буде у результаті утворено набагато менше молекул білка. Слід зазначити, що ці точки специфічні для кожного біологічного виду, тобто якщо векторну ДНК передбачається отримувати шляхом її розмноження в культурі бактерій (а не просто хімічним синтезом, що зазвичай набагато дорожче), то знадобляться окремо дві точки початку реплікації - для людини та для бактерій;

2. Сайти рестрикції- специфічні короткі послідовності (частіше паліндромні), які впізнаються спеціальними ферментами (ендонуклеази рестрикції) і розрізаються ними певним чином – з утворенням «липких кінців» (рис.1).

Рис.1 Освіта "липких кінців" за участю рестриктаз

Ці сайти необхідні для того, щоб пошити векторну ДНК (яка, по суті, є «болванкою») з потрібними генами терапевтичними в єдину молекулу. Така зшита із двох або декількох частин молекула зветься «рекомбінантною»;

3. Зрозуміло, що нам бажано отримати мільйони копій рекомбінантної молекули ДНК. Знову ж таки, якщо ми маємо справу з культурою клітин бактерій, то далі цю ДНК потрібно виділити. Проблема полягає в тому, що далеко не всі бактерії проковтнуть потрібну нам молекулу, деякі не цього робитимуть. Щоб ці дві групи все-таки розрізнити, у векторну ДНК вставляють. селективні маркери- Ділянки стійкості до певних хімічних речовин; тепер якщо в середу додати ці речовини, то виживуть тільки ті, які мають стійкість до них, а інші загинуть.

Всі ці три складові можна спостерігати і в першій штучно синтезованій плазміді (рис.2).

Рис.2

Сам процес впровадження плазмідного вектора у певні клітини називається трансфекцією. Плазміда - це досить коротка і кільцева молекула ДНК, яка знаходиться в цитоплазмі бактеріальної клітини. Плазміди не пов'язані з бактеріальною хромосомою, вони можуть реплікуватися незалежно від неї, можуть викидатися бактерією в навколишнє середовище або, навпаки, поглинатися (процес поглинання - трансформація). За допомогою плазмід бактерії можуть обмінюватися генетичною інформацією, наприклад, передавати стійкість до певних антибіотиків.

Плазміди існують у бактеріях у природних умовах. Але ніхто не може завадити досліднику штучно синтезувати плазміду, яка матиме необхідні йому властивості, вшити в неї ген-вставку і впровадити в клітину. В ту саму плазміду можна вшивати різні вставки .

Методи генної терапії

Існує два основних підходи, що відрізняються природою клітин-мішеней:

1. Фетальна, при якій чужорідну ДНК вводять у зиготу (запліднену яйцеклітину) або ембріон на ранній стадії розвитку; при цьому очікується, що введений матеріал потрапить у всі клітини реципієнта (і навіть у статеві клітини, забезпечивши цим передачу наступному поколінню). У нашій країні вона фактично заборонена;

2. Соматична, при якій генетичний матеріал вводять вже народженому в нестатеві клітини і він не передається статевим клітинам.

Генна терапія in vivoзаснована на прямому введенні клонованих (розмножених) та певним чином упакованих послідовностей ДНК у певні тканини хворого. Особливо перспективним для лікування генних хвороб in vivo є введення генів за допомогою аерозольних або ін'єкційних вакцин. Аерозольна генотерапія розробляється, як правило, для лікування легеневих захворювань (муковісцидоз, рак легень).

Розробці програми генної терапії передує багато етапів. Це і ретельний аналіз тканеспецифічної експресії відповідного гена (тобто синтезу на матриці гена якогось білка в певній тканині), і ідентифікація первинного біохімічного дефекту, і дослідження структури, функції та внутрішньоклітинного розподілу його білкового продукту, а також біохімічний процесу. Всі ці дані враховуються під час складання відповідного медичного протоколу.

Важливо, що з складанні схем корекції генів оцінюється ефективність трансфекції, ступінь виправлення первинного біохімічного дефекту за умов клітинних культур ( in vitro,"у пробірці") і, що особливо важливо, in vivoна тваринах - біологічних моделях. Тільки після цього можна розпочинати програму клінічних випробувань. .

Пряма доставка та клітинні носії терапевтичних генів

Існує безліч методів впровадження чужорідної ДНК в еукаріотичну клітину: деякі залежать від фізичної обробки (електропорація, магнетофекція тощо), інші – від застосування хімічних матеріалів чи біологічних частинок (наприклад, вірусів), що використовуються як переносники. Відразу варто зазначити, що зазвичай комбінуються хімічні та фізичні методи (наприклад, електропорація + огортання ДНК ліпосомами)

Прямі методи

1. Трансфекція на хімічній основі може бути класифікована на декілька видів: з використанням речовини циклодекстрину, полімерів, ліпосом або наночастинок (з або без хімічної чи вірусної функціоналізації, тобто модифікації поверхні).
а) Один із найдешевших методів – використання фосфату кальцію. Він підвищує ефективність включення ДНК у клітини у 10-100 разів. ДНК утворює із кальцієм міцний комплекс, що забезпечує його ефективне поглинання. Недолік – ядра досягає всього близько 1 – 10% ДНК. Метод використовується in vitroдля перенесення ДНК у клітини людини (рис.3);

Рис.3

б) Застосування сильнорозгалужених органічних молекул - дендрімер для зв'язування ДНК і перенесення її в клітину (рис.4);

Рис.4

в) Дуже ефективним методом для трансфекції ДНК є впровадження її через ліпосоми - малі, оточені мембраною тільця, які можуть зливатися з клітинною цитоплазматичною мембраною (ЦПМ), що є подвійним шаром з ліпідів. Для еукаріотичних клітин трансфекція виробляється ефективніше із застосуванням катіонних ліпосом, тому що клітини до них більш чутливі. Процес має свою назву – ліпофекція. Цей метод сьогодні вважається одним із найбезпечніших. Ліпосоми нетоксичні та неімуногенні. Однак, ефективність переносу генів за допомогою ліпосом обмежена, оскільки внесена ними ДНК у клітинах зазвичай відразу ж захоплюється лізосомами та руйнується. Введення ДНК у клітини людини за допомогою ліпосом сьогодні є головним при терапії in vivo(Рис.5);

Рис.5

г) Ще один метод - використання катіонних полімерів, таких як діетиламіноетил-декстран або поліетиленімін. Негативно заряджені молекули ДНК зв'язуються з позитивно зарядженими полікатіонами, і цей комплекс далі проникає в клітину шляхом ендоцитозу. ДЕАЕ-декстран змінює фізичні властивості плазматичної мембрани та стимулює поглинання цього комплексу клітиною. Головний недолік методу полягає в тому, що ДЕАЕ-декстран у високих концентраціях токсичний. Метод не набув поширення в генотерапії;

д) За допомогою гістонів та інших ядерних білків. Ці білки, що містять багато позитивно заряджених амінокислот (Lys, Arg), у природних умовах допомагають компактно вкласти довгий ланцюг ДНК у порівняно невелике ядро ​​клітини.

2. Фізичні методи:

а) Електропорація – дуже популярний метод; миттєве підвищення проникності мембрани досягається за рахунок того, що клітини зазнають коротких впливів інтенсивного електричного поля. Показано, що в оптимальних умовах кількість трансформантів може досягати 80% клітин, що вижили. На людині нині немає (рис.6).

Рис.6

б) «Cell squeezing» - метод, винайдений у 2013 р. Він дозволяє доставити молекули до клітин шляхом "м'якого стискання" клітинної мембрани. Метод виключає можливість токсичності чи неправильного попадання по мішені, оскільки він залежить від зовнішніх матеріалів чи електричних полів;

в) Сонопорація – метод штучного перенесення чужорідних ДНК у клітини за допомогою впливу на них ультразвуком, що викликає відкривання пір у клітинній мембрані;
г) Оптична трансфекція - метод, при якому проводиться крихітний отвір у мембрані (близько 1 мкм у діаметрі) при використанні сильносфокусованого лазера;
д) Гідродинамічна трансфекція – метод доставки генетичних конструкцій, білків тощо. шляхом контрольованого підвищення тиску в капілярах та міжклітинній рідині, що викликає короткочасне підвищення проникності клітинних мембран та утворення в них часових пір. Здійснюється швидкою ін'єкцією у тканину, доставка при цьому є неспецифічною. Ефективність доставки для скелетного м'яза – від 22 до 60% ;

е) Мікроін'єкція ДНК - введення в ядро ​​клітини тварин за допомогою тонких скляних мікротрубочок (d=0,1-0,5 мкм). Недолік - складність способу, висока можливість руйнації ядра чи ДНК; можна трансформувати обмежену кількість клітин. Чи не використовується для людини.

3. Методи з урахуванням часток.

а) Прямий підхід до трансфекції – генна гармата, при цьому ДНК зчіплюють у наночастинку з інертними твердими речовинами (частіше золото, вольфрам), яка потім «вистрілює» спрямовано в ядра клітин-мішеней. Цей метод застосовується in vitroі in vivoдля введення генів, зокрема, клітини м'язових тканин, наприклад при такому захворюванні, як міодистрофія Дюшена. Розміри частинок золота – 1-3 мкм (рис.7).

Рис.7

б) Магнітофекція - метод, який використовує сили магнетизму для доставки ДНК у клітини-мішені. Спочатку нуклеїнові кислоти (НК) асоціюються з магнітними наночастинками, а далі під дією магнітного поля частинки заганяються в клітину. Ефективність майже 100%, відзначена явна нетоксичність. Вже через 10-15 хв частки реєструються в клітці - це набагато швидше за інші методики.
в) Імпалефекція (impalefection; "impalement", букв. "садження на кіл" + "infection") - метод доставки із застосуванням наноматеріалів, таких як вуглецеві нанотрубки та нановолокна. При цьому клітини буквально протикаються підстилкою з нанофібрил. Приставка «нано» застосовується для позначення їх дуже невеликих розмірів (близько мільярдних часток метра) (рис.8).

Рис.8

Окремо варто виділити такий метод, як РНК-трансфекція: до клітини доставляється не ДНК, а молекули РНК - їх «наступники» в ланцюзі біосинтезу білка; при цьому активізуються спеціальні білки, що розрізають РНК на короткі фрагменти - т.зв. малі інтерферуючі РНК (міРНК). Ці фрагменти зв'язуються з іншими білками і, зрештою, призводить до пригнічення експресії клітиною відповідних генів. Таким чином, можна заблокувати в клітині дію тих генів, які потенційно на даний момент приносять більше шкоди, ніж користі. Широке застосування РНК-трансфекція знайшла, зокрема, в онкології.

Основні принципи доставки генів із використанням плазмідних векторів розглянуті. Наразі можна перейти до розгляду вірусних методів. Віруси - це неклітинні форми життя, що найчастіше являють собою молекулу нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК), оберненої в білкову оболонку. Якщо вирізати з генетичного матеріалу вірусу всі ті послідовності, які викликають виникнення захворювань, весь вірус також можна успішно перетворити на «транспортний засіб» для нашого гена.

Процес впровадження ДНК у клітину, опосередкований вірусом, називається трансдукцією.
На практиці найчастіше використовують ретровіруси, аденовіруси та аденоасоційовані віруси (AAV). Для початку варто розібратися, яким має бути ідеальний кандидат для трансдукції серед вірусів. Критерії такі, що він має бути:

Стабільний;
. ємність, тобто вміщати достатню кількість ДНК;
. інертним щодо метаболічних шляхів клітини;
. точним - в ідеалі, повинен вбудовувати свій геном у конкретний локус геному ядра господаря та ін.

У реальному житті дуже складно скомбінувати хоча б кілька пунктів, тому зазвичай вибір відбувається при розгляді кожного індивідуального випадку окремо (рис.9).

Рис.9

З усіх трьох перелічених найбільш використовуваних вірусів найбезпечнішими і одночасно найточнішими є AAV. Їх майже єдиний недолік - порівняно мала ємність (бл. 4800 п.н.), яка, однак, виявляється достатньою для багатьох генів .

Крім перерахованих методів досить часто генна терапія застосовується в комбінації з клітинною: при цьому спочатку в живильне середовище висаджують культуру певних клітин людини, після цього тим чи іншим способом впроваджують у клітини потрібні гени, якийсь час культивують і знову пересаджують в організм господаря. У результаті клітинам можна повернути їх нормальні властивості. Приміром, модифікували білі клітини крові людини (лейкоцити) при лейкемії (рис.10).

Рис.10

Доля гена після його потрапляння в клітину

Так як з вірусними векторами все більш-менш ясно в силу їхньої властивості більш ефективно доставляти гени до кінцевої мети - ядра, то зупинимося на долі плазмідного вектора.

На цьому етапі ми досягли того, що ДНК пройшла перший великий бар'єр - цитоплазматичну мембрану клітини.

Далі, в комплексі з іншими речовинами, оболонкою або без, їй необхідно досягти клітинного ядра, щоб спеціальний фермент – РНК-полімераза – синтезувала молекулу інформаційної РНК (іРНК) на матриці ДНК (цей процес називається транскрипція). Тільки після цього іРНК вийде в цитоплазму, утворює комплекс з рибосомами і згідно з генетичним кодом синтезується поліпептид - наприклад, фактор зростання судин (VEGF), який почне виконувати певну терапевтичну функцію (в даному випадку - запустить процес утворення розгалужень судин у тканині, що піддається ішемії) .

Що ж до експресії введених генів у необхідному типі клітин, це завдання вирішується з допомогою регуляторних елементів транскрипції. Тканина, в якій відбувається експресія, часто визначається комбінацією специфічного для цієї тканини енхансеру («підсилюючої» послідовності) з певним промотором (послідовність нуклеотидів, з якої РНК-полімераза починає синтез), який може бути індукованим . Відомо, що активність генів можна модулювати in vivoзовнішніми сигналами, оскільки енхансери можуть працювати з будь-яким геном, то вектора можна вводити ще інсулятори, які допомагають енхансеру працювати незалежно з його становища і можуть поводитися як функціональні бар'єри між генами. Кожен енхансер містить набір ділянок зв'язування білкових факторів, що активують або супресують. За допомогою промоторів також можна регулювати рівень експресії генів. Наприклад, є металотіонеїнові або температурочутливі промотори; промотори, керовані гормонами

Експресія гена залежить з його становища в геномі. Найчастіше існуючі вірусні методи призводять лише до випадкового вбудовування гена в геном. Щоб унеможливити таку залежність, при конструюванні векторів забезпечують ген відомими нуклеотидними послідовностями, які дозволяють гену експресуватися незалежно від місця його вбудовування в геном.

Найбільш простий шлях регуляції експресії трансгену - забезпечення його індикаторним промотором, який чутливий до фізіологічного сигналу, такого, як виділення глюкози або гіпоксія. Такі «ендогенні» контролюючі системи можуть бути корисними в деяких ситуаціях, таких як здійснення глюкозозалежного контролю продукції інсуліну. Найбільш надійні та універсальні «екзогенні» системи контролю, коли експресія гена контролюється фармакологічно введенням невеликої лікарської молекули. В даний час відомі 4 основні системи контролю - регульовані тетрацикліном (Tet), комах стероїдом, екдизоном або його аналогами, антипрогестиновим препаратом майфпристоном (RU486) і хімічними димеризаторами, такими, як рапаміцин і його аналоги. Усі вони включають лікарсько залежне залучення домену активації транскрипції до основного промотору, що веде потрібний ген, але відрізняються механізмами цього залучення .

Висновок

Огляд даних дозволяє зробити висновок, що, незважаючи на зусилля багатьох лабораторій світу, всі вже відомі та випробувані in vivoі in vitroвекторні системи далекі від досконалості . Якщо проблема доставки чужорідної ДНК in vitroпрактично вирішена, а її доставка в клітини-мішені різних тканин in vivoуспішно вирішується (головним чином шляхом створення конструкцій, що несуть рецепторні білки, у тому числі й антигени, специфічні для тих чи інших тканин), інші характеристики існуючих векторних систем - стабільність інтеграції, регульована експресія, безпека - все ще потребують серйозних доробок.

Насамперед, це стосується стабільності інтеграції. До нашого часу інтеграція в геном досягалася лише за використанні ретровірусних чи аденоасоційованих векторів. Підвищити ефективність стабільної інтеграції можна шляхом вдосконалення генних конструкцій типу рецептор-опосередкованих систем або створення досить стабільних епісомних векторів (тобто ДНК-структур, здатних до тривалого перебування всередині ядер). Останнім часом особлива увага приділяється створенню векторів на основі штучних хромосом ссавців. Завдяки наявності основних структурних елементів звичайних хромосом такі міні-хромосоми довго утримуються в клітинах і здатні нести повнорозмірні (геномні) гени та їх природні регуляторні елементи, які необхідні для правильної роботи гена, у потрібній тканині та в належний час.

Генна та клітинна терапія відкриває блискучі перспективи для відновлення втрачених клітин та тканин та генно-інженерного конструювання органів, що, безсумнівно, суттєво розширить арсенал методів для медико-біологічних досліджень та створить нові можливості для збереження та продовження життя людини.

Сьогодні генна терапія починає виправдовувати надії, що колись на неї покладалися. В останні шість років внаслідок введення специфічних функціональних генів у частині тіла пацієнта вдалося відновити зір у 40 хворих зі спадковою сліпотою. Досягнуто блискучих результатів у боротьбі з різними формами лейкозу: зі 120 піддослідних у кількох хворих досягнуто ремісії, що триває вже три роки. Генна терапія показала свою результативність і у боротьбі з гемофілією – спадковим захворюванням, що іноді призводить до загибелі пацієнта. Тепер хворому не потрібно приймати у високих дозах препарати, що підвищують згортання крові та мають небезпечні побічні ефекти.

Позитивні результати зустріли з великим ентузіазмом ще й тому, що на генній терапії поставили хрест 15 років тому після передчасної смерті Джессі Гелсінгера (Jesse Gelsinger), підлітка з рідкісним розладом системи травлення. Імунна система юнака відреагувала на введення чужорідного гена так бурхливо, що організм не витримав. Успіхи генної терапії, досягнуті в 1990-ті рр. виявилися далеко не такими вражаючими, як очікувалося.

Все це змусило переглянути деякі з методик, що застосовувалися і більш тверезо оцінити можливості використання генної терапії для усунення різних патологій. Довелося розлучитися з ілюзіями та повернутися до фундаментальних досліджень. Насамперед потрібно було встановити причину можливих побічних ефектів (на зразок тих, що призвели до загибелі Гелсінгера) і навчитися їх уникати. Більше уваги слід приділяти спілкуванню з хворими та його родичами, щоб прийняте ними рішення було усвідомленим.

Перелом у ситуації стався шість років тому, після того як за допомогою генної терапії вдалося вилікувати восьмирічного хлопчика на ім'я Корі Хаас (Corey Haas), який страждав на дегенеративне захворювання очей. Спочатку в результаті генних маніпуляцій у ураженій сітківці лівого ока почав вироблятися недостатній білок, і вже через чотири дні після операції хлопчик побував у зоопарку і до свого неймовірного захоплення зрозумів, що він бачить синє небо та різнокольорові повітряні кульки. Через три роки аналогічні маніпуляції були зроблені з правим оком. Тепер Корі бачить так добре, що може ходити на полювання зі своїм дідусем.

Поки що генна терапія не увійшла до арсеналу практикуючих лікарів, але є надія, що в найближчі десять років це станеться. У 2012 р. у Європі було зроблено спробу застосувати її для усунення рідкісної, але надзвичайно болісної патології, так званого сімейного дефіциту ліпопротеїнліпази. Очікується, що в США дозвіл на використання генної терапії в медицині буде отримано в 2016 р. і тоді вона має надолужити те, що було втрачено за десять років бездіяльності.

Жорстоке розчарування

Невдачі, які спіткали дослідників на ранніх етапах застосування генної терапії на практиці, наочно показали, як важко передбачити всі наслідки введення в організм чужорідних генів. Дуже часто найбезпечніші системи їх доставки виявлялися недостатньо ефективними, а деякі найефективніші – небезпечними: виникає надто бурхлива імунна реакція, як це було у випадку з Гелсінгером або розвивається лейкоз.

Щоб зрозуміти, що стає спусковим гачком для побічних ефектів, і з'ясувати, як зменшити ризик їх виникнення, генетики зосередилися на ретельному вивченні найпоширенішої системи доставки генів: конструюванні вірусів, які діють мікроскопічний шприц для ін'єкцій.

Насамперед із вірусної ДНК було видалено значну її частину, щоб звільнити місце для генів, призначених для введення в організм хворого. (Така процедура одночасно позбавляла вірус здатності до розмноження.) Трансформований вірус, що несе цільові гени, ін'єктували в потрібну частину тіла, де він вбудовував їх у відповідні ділянки клітинної ДНК залежно від типу вірусу.

У той період, коли Гелсінгер брав участь як добровольець у клінічних випробуваннях генної терапії, найпоширенішою системою доставки чужорідних генів в організм людини були аденовіруси, які зазвичай викликають легке інфекційне захворювання верхніх дихальних шляхів. За даними дослідників з Пенсільванського університету, оптимальний результат дає ін'єкція вірусу в печінку; саме тут знаходяться клітини, що виробляють травний фермент, який був відсутній у Гелсінгера. Функціональну копію гена цього ферменту ввели в інактивовану вірусну частинку та ін'єктували трильйон таких частинок у печінку хворого.

На жаль, деякі частинки потрапили не тільки в клітини печінки, як їм належало, а й у величезну кількість макрофагів-великих клітин, «сторожових» імунної системи, а також в дендритні клітини, що сповіщають останню про вторгнення чужорідних агентів. Імунна система негайно почала руйнувати всі інфіковані клітини, і цей бурхливий процес зрештою занапастив хворого.

Жорсткість імунної відповіді вразила дослідників. У жодного з 17 інших добровольців нічого подібного не спостерігалося. Було відомо, що аденовірус може викликати імунну реакцію, але якщо не вважати інцидент з однією мавпою, якою ін'єктували аденовірус, що трохи відрізняється від описаного вище, то випадок з Гелсінгер був унікальним. «Людська популяція набагато гетерогенніша, ніж популяція тварин, - каже Джеймс Вілсон (James Wilson) з Пенсільванського університету, який розробив систему доставки цільових генів, яку і використовували в клінічних випробуваннях за участю Гелсінгера. - І в нашому випадку один хворий у чомусь суттєво відрізнявся від інших». Можливо, трагедії не сталося б, якби доза вірусу була меншою – не трильйон частинок, а кілька мільярдів. Ще один недолік полягав у тому, що ні сам хворий, ні його родичі не були проінформовані про загибель мавпи в аналогічних випробуваннях, і ніхто не знав, яке рішення вони ухвалили б, якби знали про інцидент.

Трагедія, що сталася з Гелсінгером, не була останньою. Незабаром була спроба усунути за допомогою генної терапії іншу патологію - важкий комбінований імунодефіцит XI (SCID-X1). У випробуваннях брали участь 20 дітей; у п'яти з них розвинувся лейкоз, одна дитина померла. І знову винна була система доставки, хоча в даному випадку використовувався інший вектор - ретровірус, що вбудовує цільові гени безпосередньо в клітинну ДНК. Точне їхнє положення в геномі трохи варіює, і іноді вони включаються поблизу онкогену, що за певних умов призводить до раку.

Перегляд технології

Трагічні наслідки застосування ретро- та аденовірусів як вектори змусили звернутися до інших переносників. В результаті було обрано два віруси.

Перший, аденоасоційований вірус (AAV), не викликає в людини ніяких інфекцій. Більшість із нас у той чи інший період свого життя стають його носіями, і саме завдяки цьому на нього навряд чи відреагує імунна система, коли він виконуватиме функцію вектора. У AAV є ще одна особливість, що допомагає мінімізувати ризик побічних ефектів: він представлений безліччю різновидів (серотипів), кожен з яких воліє інфікувати клітини свого органу або тканини. Так, для AAV2 це очі, для AAV8-печінка, для AAV9-серцевий м'яз і мозок. Можна вибрати різновид вірусу, оптимальну для цільової частини тіла, і мінімізувати імунну відповідь та інші небажані ефекти. Крім того, AAVue включає свій генетичний матеріал у геном клітини-господаря, а тому не може викликати рак, випадково активувавши онкогени.

Аденоасоційований вірус вперше проходив тестування на здатність доставляти генетичний матеріал у необхідні тканини в 1996 р. Випробування проводилися на добровольцях, які страждають на муковісцидоз. З того часу було ідентифіковано 11 серотипів даного вірусу, а з їх компонентів сконструйовано сотні безпечних, селективно діючих векторів. Наразі проходять випробування переносники на основі AAV-вірусів для застосування генної терапії при таких патологіях, як хвороби Паркінсона та Альцгеймера, а також при гемофілії, м'язовій дистрофії, серцевій недостатності та сліпоті.

Другий вірус, як не дивно, – ослаблений варіант вірусу імунодефіциту людини, збудника СНІДу. Забудемо на якийсь час про його погану репутацію і зупинимося на його перевагах як вектора. ВІЛ - член роду Lentivirus сімейства рстровірусів. Він уражає клітини імунної системи і – що дуже важливо – не активує онкогени.

Якщо видалити гени, які відповідають за летальну дію ВІЛ, ми отримаємо чудовий вектор із широкими можливостями. Так вважає Стюарт Нейлор (Stuart Naylor), колишній науковий керівник англійської компанії Oxford Biomedica. На відміну від дрібнішого AAV, «знешкоджений» ВІЛ придатний для перенесення відразу кількох генів. Він нетоксичний і не викликає імунної реакції. Позбавлені здібності викликати інфекцію лентивіруси проходять тестування на можливість застосування для усунення різних патологій, зокрема аденолейкодистрофії. На сьогодні вже кілька хлопчиків із таким діагнозом завдяки генній терапії змогли повернутися до школи.

Паралельно з клінічними випробуваннями із застосуванням AAVn ВІЛ ведеться робота з модифікації старих вірусних векторів для того, щоб їх можна було використовувати за певних обставин. Так, ретровіруси (за винятком ВІЛ) генетично модифікують, щоб вони не викликали лейкозу.

Не відкинуто навіть аденовірус, застосування якого призвело до загибелі Гелсінгера. Його вводять тепер лише ті частини тіла, де він навряд чи викличе імунну реакцію. Одне з можливих його застосувань - генна терапія ксеротомії (сухості у роті) у пацієнтів, які зазнавали опромінення у зв'язку з раком областей голови та шиї. при якому ушкоджуються слинні залози.

Національні інститути охорони здоров'я проводять клінічне випробування (із залученням невеликої кількості добровольців) підходу, заснованого на введенні у відповідні клітини генів, що опосередковують утворення каналів для проходження води у слинні залози. Оскільки останні невеликі за розмірами і більш-менш ізольовані, а доза вірусу в 1 тис. разів менша за ту, що колись отримав Гелсінгер, ймовірність надмірно сильної імунної реакції зведена до мінімуму. Вірусні частинки, які не досягли клітин-мішеней, на думку розробників, повинні руйнуватися в слині, випльовуватися разом з нею або проковтуватися, що зменшує ризик розвитку імунної реакції. За період з 2006 р. у такий спосіб вдалося суттєво покращити стан 11 пацієнтів.

Нові мішені

Натхненні успіхом, медичні генетики розширили сферу застосування генної терапії та спробували з її допомогою усувати генетичні дефекти неспадкового характеру.

Так, у Пенсільванському університеті вже використовують цей підхід у боротьбі з одним з онкологічних захворювань, що найчастіше зустрічаються у дітей, - гострим лімфобластним лейкозом (ALL). Приблизно 20% дітей із таким діагнозом традиційна хіміотерапія не допомагає.

Генна терапія в таких випадках особливо складна і ґрунтується на застосуванні химерних рецепторів антигенів (CAR). Подібно до химерів з давньогрецької міфології, що складаються з частин тіла різних тварин, ці рецептори є комплексом з двох компонентів імунної системи, що в нормі в організмі не зустрічається. Т-клітини, до яких його приєднують, набувають здатності відшукувати специфічні білки, що містяться в лейкозних клітинах у більшій кількості, ніж у нормальних, і руйнувати аномальні клітини. Першими випробуваними були дорослі пацієнти з хронічним лейкозом: отримані результати викликали оптимізм. Результат випробувань на хворих дітях перевершив усі очікування.

Коли в травні 2010 р. Емілі Уайтхед (Emily Whitehead) виявили лейкоз, їй було дев'ять років. Два курси хіміотерапії результату не дали. Навесні 2012 р. провели третій курс, який міг би вбити дорослого, але дівчинка вижила, хоча у неї виникли порушення у нирках, печінці та селезінці. За словами лікаря Брюса Левіна (Bruce Levine). «Емілі була на волосину від смерті».

Тоді в неї взяли кров, виділили Т-клітини та ввели в них лентивірус. геном якого попередньо включили цільові гени. Після ін'єкції химерних Т-клітин назад в організм пацієнтки її стан швидко покращувався. Через три тижні 25% Т-клітин її кісткового мозку були генетично модифіковані та почали «полювання» на ракові клітини. «У квітні дівчинка повністю облисіла. - Згадує Левін, - а до серпня набула колишній вигляд і була готова до школи ».

Модифіковані Т-клітини навряд чи працюватимуть до кінця її життя, але процедуру завжди можна повторити. А поки ця симпатична дівчинка з густим каштановим волоссям позбавлена ​​ракових клітин. Восени 2013 року відразу кілька груп медичних генетиків повідомили про використання CAR-методики для лікування 120 хворих з тією ж формою лейкозу, що в Емілі Уайтхед, а також з іншими формами. У п'ятьох дорослих та 19 з 22 дітей настала ремісія.

Перспективи

Тепер перед фахівцями з генної терапії стоїть чергове завдання: їм потрібно отримати дозвіл Управління з контролю якості харчових продуктів та лікарських препаратів (FDA) на застосування своєї безпечнішої, ніж усі колишні векторної системи в клініці. Необхідно організувати ІІІ фазу клінічних випробувань за участю великої групи добровольців. Зазвичай на це йде від одного до п'яти років. Станом на кінець 2013 р. приблизно 5% із 2 тис. випробувань дійшли до цієї фази. Далі за інших просунулися творці методики лікування за допомогою генної терапії пацієнтів, які страждають на хворобу Лебера (двосторонньою втратою зору, обумовленою мутацією в мітохондріальній ДНК: дана патологія була у восьмирічного Хаасу). Вже кільком десяткам хворих вдалося повернути зір за допомогою генної терапії.

Стаття на конкурс «біо/мол/текст»: « Мишко народився 12 лютого здоровою дитиною. Але в 1,5 місяця я помітила, що на всіх фотографіях малюк займає одну і ту ж позу, ніби його ніжки нерухомі. Вже за кілька тижнів нам поставили діагноз, поспівчували і порадили почати планувати другу, здорову дитину». Через фатальну комбінацію генів Мишко, як і інші діти з цим захворюванням, був змушений все своє коротке життя боротися за кожен рух. Боротися відчайдушно, щосили, але зрештою програти. Спинальна м'язова атрофія (СМА) належить до генетичних аномалій, перед якими людство поки що безсиле. Однак успіхи генної терапії, за якими сьогодні спостерігає медичний світ, можуть перевести і СМА, й інші тяжкі спадкові патології до виліковних. Більше того – виліковних ще внутрішньоутробно.

Генеральний спонсор конкурсу - компанія «Діаем»: найбільший постачальник обладнання, реагентів та витратних матеріалів для біологічних досліджень та виробництв.

Спонсором призу глядацьких симпатій виступив медико-генетичний центр.

«Книжковий» спонсор конкурсу – «Альпіна нон-фікшн»

Природа помиляється, людина виправляє

Концепція генної терапії елегантна і красива, як і все геніальне. Вона полягає у доставці за допомогою векторних систем здорового генетичного матеріалу до клітини з метою замінити їм «помилкові» гени, з якими пов'язані різні захворювання (рис. 1).

«Біомолекула» вже писала докладно про те, які можливості відкриває генна терапія у лікуванні раку та спадкових аномалій, зокрема пігментного ретиніту.

І якщо у 80-х роках минулого століття, коли про генну терапію заговорили досить голосно, її теорія багатьом здавалася продовженням сценарію стрічки «Назад у майбутнє», то сьогодні вона стала реальністю, що відкриває нові, справді безмежні перспективи.

Проте очевидно, що генна терапія має низку обмежень, особливо коли йдеться про спадкові захворювання. Насамперед, патологічний процес у таких випадках може розпочатися ще внутрішньоутробно. До моменту, коли захворювання нарешті діагностують, - а це часом відбувається через роки після народження дитини, - можуть розвинутися незворотні ушкодження клітин та органів, що значно звужує терапевтичні можливості або взагалі зводить їх нанівець.

Шанс вирішити цю проблему виник завдяки сучасній пренатальній діагностиці, яка дозволяє виявити хромосомні дефекти вже на ранніх стадіях вагітності. Отримавши будь-який фетальний матеріал за допомогою інвазивних методик, можна швидко та достовірно діагностувати генетичні захворювання. А у випадках з гемоглобінопатіями необхідність в інвазивних маніпуляціях зовсім відпадає: щоб їх виявити, достатньо дослідити фетальні ДНК, отримані з клітин крові матері.

Сучасні пренатальні діагностичні методики у комбінації з досягненнями генної терапії надають унікальну можливість виправити «помилку» природи та втрутитися у патологічний процес ще до незворотного пошкодження клітин. Забезпечити лікування різних захворювань дитини в утробі матері або, принаймні, стримати прогресування хвороби, ймовірно, може фетальна генна терапія, або генна терапія плода.

Ідея фетальної генної терапії далеко не нова: лише через кілька років після першої спроби проведення генної терапії у дорослих, 1994 року дослідники почали серйозно обговорювати застосування інноваційної методики внутрішньоутробно. Сьогодні, коли лікування генетичних захворювань в утробі матері вже практично перетворилося з фантастичної перспективи на реальність, опубліковано безліч робіт, де докладно вивчено фетальну генну терапію та її переваги в порівнянні з генною терапією дорослих.

Пренатально vsпостнатально

Попереджаючи питання щодо доцільності внутрішньоутробної корекції генетичної аномалії, відразу ж зупинимося на перевагах генної терапії плода порівняно з постнатальною генною терапією.

Широкі можливості впливу на органи та системи

Відомо, що з багатьох генетичних захворюваннях (наприклад, бульозному епідермолізі чи кістозному фіброзі) буває досить складно спричинити основні ланки патологічного процесу майже відразу після народження. Корекція ж мутантних генів у плода, що розвивається, дозволяє швидко збільшити популяцію стовбурових клітин, забезпечивши великий пул трансфікованих клітин і, як наслідок, виражений терапевтичний ефект.

Спрощене виробництво клінічного вектора, що переносить генетичний матеріал

Дозування вірусного вектора за допомогою якого переносять генетичний матеріал залежить від маси тіла. Завдяки малому розміру плоду вдається досягти набагато більш високого біорозподілу вектора при тій же дозуванні, що в ході генної терапії дорослого. Це дозволяє заощадити час і кошти. Уявити, наскільки істотною є економія, допомагають прості порівняльні дані: так, плід у 14–16 тижнів вагітності (оптимальний термін індукування вектора) важить близько 100 г, тоді як середня маса тіла дорослого становить близько 60 кг.

Підвищення ефективності терапії за рахунок неповноцінної імунної відповіді

Ряд досліджень продемонстрував, що гуморальний імунітет до аденовірусів та аденоасоційованих вірусів (AAV) (рис. 2) певних серотипів, які зазвичай використовуються як вектори, може призводити до невдачі при експресії трансгену. Це може стати одним із критичних бар'єрів для успішної трансплантації.

До групи ризику потрапляють близько 50% дорослих, які мають набуту імунну відповідь до цих вірусних векторів. Але навіть за відсутності чутливості введення вектора у дорослих нерідко призводить до розвитку імунної відповіді, що знижує тривалість та рівень трансгенної експресії. Так, після внутрішньом'язової ін'єкції аденовірусного вектора з геном білка дистрофінудорослим мишам з міодистрофією Дюшенна утворюються антитіла до дистрофіну, що пов'язано зі значним зниженням ефективності експресії. У той же час плід в утробі матері імунологічно незрілий, що дозволяє доставляти вірусний вектор і трансгенний продукт без обмеження, яке накладає імунну відповідь.

Очевидні переваги фетальної терапії в порівнянні з постнатальною корекцією забезпечують її більш високу ефективність та доцільність, особливо при тяжких, небезпечних для життя захворюваннях. Навіть у випадках, коли повного лікування неможливо досягти, фетальна генна терапія може впливати на патологічні ланки захворювання, полегшуючи його перебіг і покращуючи прогноз. Отже, саме вона може стати єдиною терапевтичною альтернативою припиненню вагітності для тисяч сімей. Тим більше що кількість захворювань, які потенційно можуть опинитися під контролем при впровадженні генної терапії плода в клінічну практику, воістину величезна.

Перспективи та можливості

Генна терапія плода, ймовірно, здатна взяти під контроль безліч небезпечних патологій. Лише мала їх частка представлена ​​таблиці 1.

Таблиця 1. Захворювання, які можуть контролюватись за допомогою фетальної генної терапії .

Захворювання	Геннотерапевтичний препарат	Цільові клітини та/або орган	Вік маніфестації захворювання	Поширеність	Тривалість життя
Кістозний фіброз	CFTR (трансмембранний регулятор)	Епітеліальні клітини дихальних шляхів та кишечника	Третій триместр вагітності	1:4000	Близько 35 років
М'язова дистрофія Дюшенна	Дистрофін	Міоцити	2 роки	1:4500	25 років
Спинальна м'язова атрофія	Білок SMN	Мотонейрони	6 місяців (тип I)	1:10 000	2 роки
Гемофілія	Чинник згортання крові VIII або IX	Гепатоцити	1 рік	1:6000
Бета-таласемія	Глобін	Прекурсори еритроцитів	До року	1:2700	До 20 років
Хвороба Гоше	Глюкоцереброзідаза	Гепатоцити	9,5 років	1:59 000	Менш 2 років
Дефекти циклу сечовини	Орнітіна транскарбамілаза	Гепатоцити	2 дні	1:30 000	2 дні
Бульозний епідермоліз	Колаген тип VII	Кератиноцити	Народження	1:40 000	При коректній терапії нормальна тривалість життя
Гіпоксична ішемічна енцефалопатія	Нейротрофічні фактори	Кортикальні нейрони	Народження	1:1000	При коректній терапії нормальна тривалість життя
Тяжка внутрішньоматкова затримка зростання	Плацентарні фактори зростання	Трофобласт	Плід	1:500	Кілька днів

Крім того, до патологій, які, імовірно, можуть піддаватися контролю за допомогою фетальної терапії, відносяться:

• Імунодефіцитні розлади- синдром «голих» лімфоцитів, гіпоплазія хряща, синдром Чедіака-Хігаші, хронічна гранулематозна хвороба, синдром Костмана, дефіцит адгезії лейкоцитів, синдром Оменна, синдром Віскотта-Олдріча.
• Гемоглобінопатії- резус-хвороба, вроджена еритропоетична порфірія.
• Захворювання, пов'язані з дефіцитом активності ферментів, - хвороба Гоше, хвороба Краббе, метахроматична лейкодистрофія, мукополісахаридози, хвороба Волмана, хвороба Німанна-Піка.
• Інші- конгенітальний дискератоз, сімейний гемафагоцитичний лімфогістіоцистоз, інфантильний остеопетроз, синдром Швахмана-Даймонда та ін.

Список захворювань, які можуть виявитися «під плечима» фетальної генної терапії, вражає уяву: імовірно, ця методика дозволить втрутитися в раніше непідвладні людині патологічні процеси, зумовлені моногенними захворюваннями. Їхня кількість, за даними Всесвітньої організації охорони здоров'я, сягає десяти тисяч. Проте важливо враховувати існування ряду обмежень, і в першу чергу ризиків для матері та плода, пов'язаних із проведенням внутрішньоутробної генної терапії.

Страхи та ризики

Специфічні ризики пренатального перенесення генів кардинально відрізняються від ризиків постнатальної генної терапії. Вони включають короткострокові несприятливі реакції та довгострокові постнатальні ефекти. Їхня актуальність загострюється у зв'язку з тим, що гіпотетично експресія генів плоду може надавати непередбачувану дію як на пренатальний, так і на постнатальний розвиток.

Насамперед, безпосередньо сама процедура перенесення пов'язана зі збільшенням ймовірності викидня, хоріоамніоніту та передчасних пологів. У дослідженнях зафіксовано запальні реакції на вектор, зокрема, інфільтрацію печінки та некроз печінки при фетальній генній терапії овець.

Успіх фетальної генної терапії може бути нейтралізований імунною відповіддю плода, і це несе певні ризики кінцевого результату. Гуморальна та клітинна відповіді на введення вектора або трансгенного білка за допомогою трансдукторних систем клітин може елімінувати продукти переносу або нівелювати трансгенну експресію. При цьому у дослідженнях продемонстровано залежність сили імунної відповіді від терміну гестації. Значних імунних реакцій на введення лентивірусного вектора на ранніх та середніх термінах вагітності зареєстровано не було, тоді як при введенні аденовірусного вектора на пізніх термінах спостерігалася потужна гуморальна відповідь проти капсидного антигену.

Одна з надзвичайно важливих проблем фетальної генної терапії полягає в потенційному ризику, який виникає при передачі донорських плодів послідовностей ДНК. Оскільки векторна інтеграція в зародкові клітини, ймовірно, матиме випадковий характер, вона теоретично може мати катастрофічні наслідки для плода. По суті, дитина, яка отримала внутрішньоутробно-донорський генетичний матеріал, народжується мутантом. Етична складова генної терапії турбує уми вчених та богословів. Останні ще з часів народження найвідомішої в історії науки овечки попереджають про небезпеки, які несе людству втручання у Божий задум.

Ще один важливий аспект обумовлений ймовірністю мутагенезу в клітинах плода, що призводить до дефекту будь-якого функціонального гена, що в кінцевому рахунку може стати причиною тепер уже нового, набутого генетичного захворювання або злоякісної пухлини. Її ймовірність виглядає ще реальнішою з урахуванням даних дослідження на мишах, у ході якого експресія генів у зародків мишей дала поштовх розвитку пухлини печінки.

У цьому контексті можуть виявитися далеко не випадковими результати двох досліджень, що продемонстрували розвиток серйозних побічних ефектів після успішної генної терапії Х-зчепленого комбінованого імунодефіциту: у першому випадку було зафіксовано маніфестацію моноклонального лімфопроліферативного захворювання, а в другому - альфа/бета Т-клітинної. І в першому, і в другому випадках ретровірусний вектор інтегрувався в безпосередній близькості від гена LMO2у проліферуючих Т-клітинах.

Теоретично генна терапія ex vivoможе бути більш безпечною в порівнянні з in vivoфетальним запровадженням вектора. Хоча це і не виключає ймовірність мутагенезу у клітинах, які ретровірально трансдукуються. in vitro, Введення мутагену можна легше визначати та контролювати. Проте повністю виключити ці ускладнення, на жаль, не можна.

І, нарешті, фетальна генна терапія підвищує сприйнятливість клітин зародка до трансдукції. Низькорівнева ретровірусна трансдукція у попередники зародкових клітин спостерігалася у чоловічих та жіночих гонадах після внутрішньочеревного введення вектора ембріонам овець та мавп відповідно. Аналіз факторів, що призводять до ненавмисної трансдукції, показав, що сприйнятливість зародкової тканини до неї залежить від гестаційного віку з вищими показниками трансдукції на ранній стадії вагітності.

З погляду потенційних ризиків, очевидно, що фетальна генна терапія може бути обґрунтованим методом лікування лише тяжких генетичних захворювань, інших варіантів корекції яких не існує. І серед них, безумовно, хвороба Гоше, можливість внутрішньоутробної генної терапії якої продемонстрували у дослідженні, опублікованому зовсім недавно.

Перший пішов: хвороба Гоше

У липні 2018 року журнал Nature Medicineопублікував результати дослідження на мишах, проведеного під керівництвом Симона Уоддінгтона ( Simon Waddington) з лондонського Інституту жіночого здоров'я. Результати роботи продемонстрували ефективність фетальної генної терапії у лікуванні нейродегенеративних захворювань та, зокрема, хвороби Гоше. Це найчастіша форма серед рідкісних спадкових ферментопатій, в основі якої лежить дефіцит активності лізосомного ферменту глюкозоцереброзідази(рис. 3), обумовлений мутаціями у гені глюкозилцерамідази. Залежно від характеру мутацій, може розвиватися важка нейропатична форма захворювання, що маніфестує з дитинства, або форма з поступовим початком і менш вираженими симптомами. У той час як легші форми хвороби Гоше добре піддаються замісній терапії, важка форма поки що залишається летальною. Ознаки невиліковної форми хвороби Гоше з'являються у перші місяці життя і включають прогресуючу м'язову гіпотонію, затримку та регрес психомоторного розвитку та інші неврологічні ознаки.

В ході дослідження Уоддінгтон із співавторами продемонстрував, що інтракраніальне введення аденоасоційованого вірусного вектора 9 (AAV9) ембріону мишей на 16 день гестації призводило до підвищення експресії глюкозоцереброзідази, що зупиняло нейродегенерацію. При цьому активність ферменту в головному мозку була порівнянна з такою у здорових мишей. Незважаючи на те, що у хворих гризунів все ж таки діагностувався запальний процес у головному мозку, вони розвивалися достовірно краще, ніж миші з групи контролю, яких довелося приспати через два тижні після лікування через тяжкість захворювання.

Миші, що зазнали фетальної генної терапії, жили принаймні 18 тижнів, були фертильними та мобільними. Цікаво, що введення вектора постнатально також полегшував перебіг захворювання, проте був менш ефективним, ніж пренатальна експресія.

Оскільки AAV9 був здатний проникати в мозок з кровотоку, команда Уоддінгтона провела ще один експеримент, в ході якого ввели значно вищу дозу вектора не в головний мозок, а безпосередньо в зародків крові мишей. Миші після експресії були в основному не відрізняються від здорових особин, але, оскільки за умовами експерименту тривалість їхнього життя становила лише 55 днів, вчені не змогли зробити висновки про довгострокову ефективність внутрішньовенної генної терапії.

Експеримент Уоддінгтона став найскладнішою на сьогодні роботою, в ході якої було проведено фетальну генну терапію у тварин. Сьогодні команда працює із корпорацією Apollo Therapeutics, що об'єднала зусилля трьох британських університетів та трьох найбільших фармацевтичних компаній Уоддінгтон із колегами переслідують нову мету: цього разу перед ними стоїть завдання отримати доклінічні дані та потенційно протестувати лікування людей. І поки скептики розмірковують над колом можливостей застосування фетальної генної терапії у людини, яка може значно звужуватися через те, що хвороба Гоше не входить до пренатальних тестів, команда Уоддінгтона впевненою ходою крокує у майбутнє. Майбутнє, де зможуть одужувати діти із хворобою Гоше, міодистрофією Дюшенна, СМА та багатьма іншими рідкісними, але сьогодні, на жаль, невиліковними захворюваннями.

Література

1. 12 методів у картинках: генна інженерія. Частина II: інструменти та техніки;
Immune responses to gene therapy vectors: influence on vector function and effector mechanisms . Gene Ther. 11 , S10-S17;
2. Soyoung C. Gilchrist, Martin P. Ontel, Stefan Kochanek, Paula R. Clemens. (2002). Immune Response to Full-Length Dystrophin Delivered to Dmd Muscle by a High-Capacity Adenoviral Vector . Molecular Therapy. 6 , 359-368;
3. Heather A. Hartman, Avery C. Rossidis, William H. Peranteau. (2018). In Utero Gene Therapy and Genome Editing. Curr Stem Cell Rep. 4 , 52-60;
4. Anna L. David, Donald Peebles. (2008). . Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology. 22 , 203-218;
5. Зведення з генотерапевтичних фронтів. Нова стратегія нейтралізації гемофілії;
6. Charles Coutelle. (2008). Why Bother?: Is In Utero Gene Therapy Worth the Effort? . Molecular Therapy. 16 , 219-220;
7. Mike Themis, Simon N. Waddington, Manfred Schmidt, Christof von Kalle, Yoahe Wang, et. al.. (2005). Oncogenesis Following Delivery of Nonprimate Lentiviral Gene Therapy Vector to Fetal і Neonatal Mice . Molecular Therapy. 12 , 763-771;
8. European Society of Gene Therapy (ESGT) Press release, Bernd Gansbacher. (2003). Report of second serious adverse event in a clinic trial of gene therapy for X-linked severe combined immune deficiency (X-SCID) . J. Gene Med.. 5 , 261-262;
9. Giulia Massaro, Citra N. Z. Mattar, Andrew M. S. Wong, Ernestas Sirka, Suzanne M. K. Buckley, et. al.. (2018). Fetal gene therapy for neurodegenerative disease of infants. Nat Med. 24 , 1317-1323.

Міодистрофія Дюшенна - одне з нечасто зустрічаються, але все ж таки щодо поширених генетичних захворювань. Хвороба діагностується в трьох-п'ятирічному віці, зазвичай у хлопчиків, виявляючись спочатку лише в утруднених рухах, до десяти років страждає на таку міодистрофію вже не може ходити, до 20-22 років його життя закінчується. Вона викликана мутацією гена дистрофіну, що знаходиться у Х-хромосомі. Він кодує білок, що з'єднує мембрану м'язової клітини зі скоротливими волокнами. Функціонально це своєрідна пружина, що забезпечує плавне скорочення та цілісність клітинної мембрани. Мутації в гені призводять до дистрофії скелетних м'язових тканин, діафрагми та серця. Лікування захворювання носить паліативний характер і дозволяє лише трохи полегшити страждання. Проте з розвитком генної інженерії з'явилося світло наприкінці тунелю.

Про війну та мир

Генна терапія - це доставка клітини конструкцій на основі нуклеїнових кислот для лікування генетичних захворювань. За допомогою такої терапії можна виправити генетичну проблему на рівні ДНК та РНК, змінюючи процес експресії потрібного білка. Наприклад, клітину можна доставити ДНК з виправленою послідовністю, з якою синтезується функціональний білок. Або, навпаки, можливе видалення певних генетичних послідовностей, що також допоможе зменшити шкідливі наслідки мутації. У теорії це просто, проте на практиці генна терапія базується на найскладніших технологіях роботи з об'єктами мікросвіту і є сукупністю передових ноу-хау в галузі молекулярної біології.

Ін'єкція ДНК в пронуклеус зиготи - одна з найраніших і традиційних технологій створення трансгенів. Ін'єкція проводиться вручну за допомогою надтонких голок під мікроскопом із 400-кратним збільшенням.

«Ген дистрофіну, мутації якого породжують міодистрофію Дюшенна, величезний, — розповідає директор розвитку біотехнологічної компанії «Марлін Біотех», кандидат біологічних наук Вадим Жерновков. — Він включає 2,5 млн пар нуклеотидів, що можна було б порівняти з кількістю літер у романі «Війна і мир». І ось уявімо, що ми вирвали з епопеї кілька якихось важливих сторінок. Якщо на цих сторінках описуються суттєві події, то розуміння книги було б утруднене. Але з геном дедалі складніше. Знайти іншу копію «Війни та миру» нескладно, і тоді сторінки, які бракують, можна було б прочитати. Але ген дистрофіну знаходиться у X-хромосомі, а у чоловіків вона одна. Таким чином, у статевих хромосомах у хлопчиків при народженні зберігається лише одна копія гена. Іншу взяти нема де.

Нарешті, при синтезі білка з РНК важливим є збереження рамки зчитування. Рамка зчитування визначає, яка група трьох нуклеотидів зчитується як кодон, що відповідає одній амінокислоті в білку. Якщо відбулося видалення в гені фрагмента ДНК, не кратне трьом нуклеотидам, відбувається зсув рамки зчитування кодування змінюється. Це можна було б порівняти з ситуацією, коли після вирваних сторінок у всій книзі всі літери заміняться на наступні за алфавітом. Вийде абракадабра. Ось те саме відбувається з неправильно синтезованим білком».

Біомолекулярний пластир

Один із ефективних методів генної терапії для відновлення нормального синтезу білка – пропуск екзонів за допомогою коротких нуклеотидних послідовностей. У «Марлін Біотех» вже відпрацьовано технологію роботи з геном дистрофіну за допомогою такого методу. Як відомо, у процесі транскрипції (синтезу РНК) спочатку формується так звана прематрична РНК, що містить як діючі ділянки (екзони), що кодують білок, так і некодуючі (інтрони). Далі починається процес сплайсингу, в ході якого інтрони та екзони роз'єднуються та формується «зріла» РНК, що складається тільки з екзонів. У цей момент деякі екзони можна заблокувати, заліпити за допомогою особливих молекул. У результаті в зрілій РНК не виявиться тих кодуючих ділянок, яких ми воліли б позбутися, і таким чином відновиться рамка зчитування, білок синтезуватиметься.

«Цю технологію ми налагодили in vitro, — розповідає Вадим Жерновков, тобто на клітинних культурах, вирощених із клітин пацієнтів із міодистрофією Дюшенна. Але окремі клітини – це не організм. Вторгаючись у процеси клітини, ми повинні спостерігати наслідки наживо, проте залучити до випробувань людей неможливо з різних причин — від етичних до організаційних. Тому виникла потреба одержання моделі міодистрофії Дюшенна з певними мутаціями на основі лабораторної тварини».

Як вколоти мікросвіт

Трансгенні тварини - це отримані в лабораторії тварини, геном яких цілеспрямовано, усвідомлено внесені зміни. Ще в 70-х роках минулого століття стало зрозуміло, що створення трансгенів - це найважливіший метод дослідження функцій генів і білків. Одним з ранніх методів отримання повністю генно-модифікованого організму стала ін'єкція ДНК в пронуклеус («попередник ядра») зигот запліднених яйцеклітин. Це логічно, тому що модифікувати геном тварини найпростіше на самому початку її розвитку.

На схемі продемонстровано процес CRISPR/Cas9, у якому беруть участь субгеномна РНК (sgRNA), її ділянку, що працює як РНК-гід, а також білок-нуклеаза Cas9, який розсікає обидві нитки геномної ДНК у вказаному РНК-гідному місці.

Ін'єкція в ядро ​​зиготи — вельми нетривіальна процедура, адже йдеться про мікромасштаби. Яйцеклітина миші має діаметр 100 мкм, а пронуклеус – 20 мкм. Операція відбувається під мікроскопом з 400-кратним збільшенням, проте ін'єкція - це сама що не є ручна робота. Зрозуміло, для «уколу» застосовується не традиційний шприц, а спеціальна голка з порожнистим каналом усередині, куди набирається генний матеріал. Один її кінець можна тримати в руці, а інший - надтонкий і гострий - практично не видно неозброєним оком. Звичайно, така тендітна конструкція з боросилікатного скла не може зберігатися довго, тому в розпорядженні лабораторії є набір заготовок, які безпосередньо перед роботою витягуються на спеціальному верстаті. Використовується спеціальна система контрастної візуалізації клітини без фарбування — втручання у пронуклеус саме собою травматично і є чинником ризику для виживання клітини. Фарба стала б ще одним таким чинником. На щастя, яйцеклітини досить живучі, проте кількість зигот, які дають початок трансгенним тваринам, становлять лише кілька відсотків від загальної кількості яйцеклітин, в які було зроблено ін'єкцію ДНК.

Наступний етап – хірургічний. Проводиться операція з трансплантації мікроін'єцованих зигот у вирву яйцеводи миші-реципієнта, яка стане сурогатною матір'ю майбутнім трансгенам. Далі лабораторна тварина природним шляхом проходить цикл вагітності, і світ з'являється потомство. Зазвичай у посліді знаходиться близько 20% трансгенних мишенят, що також говорить про недосконалість методу, бо в ньому є великий елемент випадковості. При ін'єкції дослідник неспроможна контролювати, як саме впроваджені фрагменти ДНК вбудуються геном майбутнього організму. Висока ймовірність таких комбінацій, які призведуть до загибелі тварини ще на ембріональній стадії. Проте метод працює і цілком придатний низки наукових цілей.

Розвиток трансгенних технологій дозволяє виробляти тваринні білки, потрібні фармацевтичній промисловістю. Ці білки екстрагуються з молока трансгенних кіз та корів. Також є технології отримання специфічних білків із курячого яйця.

Ножиці для ДНК

Але є ефективніший спосіб на основі цільового редагування геному за технологією CRISPR/Cas9. «Сьогодні молекулярна біологія в чомусь подібна до епохи далеких морських експедицій під вітрилами, — каже Вадим Жерновков. — Майже щороку в цій науці відбуваються значні відкриття, які можуть змінити наше життя. Наприклад, кілька років тому мікробіологи виявили у давно здавалося б вивченого виду бактерій імунітет до вірусних інфекцій. В результаті подальших досліджень з'ясувалося, що ДНК бактерій містять особливі локуси (CRISPR), з яких синтезуються фрагменти РНК, які вміють комплементарно зв'язуватися з нуклеїновими кислотами чужорідних елементів, наприклад з ДНК або РНК вірусів. З такою РНК зв'язується білок Cas9, що є фермент-нуклеазою. РНК служить для Cas9 гідом, що позначає певну ділянку ДНК, в якому нуклеаза робить розріз. Приблизно три-п'ять років тому з'явилися перші наукові праці, в яких розроблялася технологія CRISPR/Cas9 для редагування геному».

Трансгенні миші дозволяють створювати живі моделі важких генетичних захворювань людини. Люди повинні бути вдячні цим крихітним істотам.

Порівняно зі способом введення конструкції для випадкового вбудовування, новий метод дозволяє підібрати елементи системи CRISPR/Cas9 таким чином, щоб точно націлити РНК-гіди на потрібні ділянки геному і досягти цілеспрямованої делеції або вставки потрібної послідовності ДНК. У цьому методі також можливі помилки (РНК-гід іноді з'єднується не з тією ділянкою, на яку його націлюють), проте при використанні CRISPR/Cas9 ефективність створення трансгенів становить близько 80%. «Цей метод має широкі перспективи, і не тільки для створення трансгенів, а й в інших областях, зокрема генної терапії, — каже Вадим Жерновков. — Проте технологія перебуває лише на початку шляху, і уявити, що найближчим часом виправляти генний код людей за допомогою CRISPR/Cas9 досить складно. Поки є ймовірність помилки, є й небезпека, що людина втратить якусь важливу частину геному, що кодує».

Молоко-ліки

Російській компанії «Марлін Біотех» вдалося створити трансгенну мишу, в якій повністю відтворено мутацію, що призводить до міодистрофії Дюшенна, і наступним етапом стануть випробування технологій генної терапії. Натомість створення моделей генетичних захворювань людини на основі лабораторних тварин — не єдине можливе застосування трансгенів. Так, у Росії та західних лабораторіях ведуться роботи в галузі біотехнологій, що дозволяють отримувати важливі для фарміндустрії лікарські білки тваринного походження. Як продуценти можуть виступати корови або кози, у яких можна змінювати клітинний апарат виробництва білків, що містяться в молоці. З молока можна екстрагувати лікарський білок, отриманий не хімічним способом, а з допомогою природного механізму, що підвищить ефективність ліків. В даний час розроблено технології отримання таких лікарських білків, як лактоферин людини, проурокіназа, лізоцим, атрін, антитромбін та інші.