bakuna sa DNA(din bakuna sa gene, bakuna sa nucleic acid)- isang genetically engineered na konstruksyon na, pagkatapos na maipasok sa isang cell, tinitiyak ang paggawa ng mga pathogen protein o tumor antigens at nagiging sanhi ng immune response. Ang pagpapakilala ng mga bakuna sa DNA sa katawan ay tinatawag na genetic immunization. Ang pagbabakuna sa DNA ay may ilang mga pakinabang kaysa sa mga karaniwang bakuna. Sa partikular, ipinakita na ang mga naturang bakuna ay hindi lamang nagbibigay ng produksyon ng mga antibodies (humoral immunity), kundi pati na rin ng isang tiyak na cytotoxic response (cellular immunity), na dati ay makakamit lamang sa mga live na bakuna. Ngayon, ang mga bakuna sa DNA ay hindi ginagamit upang gamutin ang mga tao, ngunit ang genetic na pagbabakuna ay hinuhulaan na makakatulong sa pagtagumpayan ng isang hanay ng mga sakit.

Kasaysayan ng paglikha

Ang ideya na gumamit ng mga fragment ng DNA para sa pagbabakuna ay lumitaw noong 1950s at 1960s. Matapos ang isang serye ng mga eksperimento, natagpuan na ang genetic na impormasyon ng DNA ay nagpapanatili ng kakayahang ma-transcribe at maisalin pagkatapos mailipat sa isa pang cell. Sa parehong taon, natuklasan na ang pagpapakilala ng genome ng polio virus sa mga hayop ay nagpapasigla sa paggawa ng mga antibodies. Nang maglaon, ipinakita ang pag-activate ng humoral immunity para sa mga molekula ng DNA na nagmula sa mga hindi nakakahawang ahente. Mula noong 1990s, ang mga siyentipikong laboratoryo ay nagsimulang lalong mag-imbestiga sa mga katangian ng immunostimulatory ng DNA. Noong 1992, ipinakita ni Tang at mga kasamahan na ang gene ng human growth hormone na ipinasok sa isang plasmid ay matatag na ipinahayag sa mga daga, at ang synthesized hormone ay kinikilala ng immune system bilang isang antigen at pinasisigla ang paggawa ng mga antibodies. Ang proseso ng pagpapakilala ng plasmid DNA upang pasiglahin ang humoral immunity ay tinatawag na Tango na "genetic immunization". Gayunpaman, sa sumunod na taon, isa pang grupo ng mga siyentipiko ang nagsabi na ang pagpapakilala ng isang plasmid encoding proteins ng influenza virus ay nagdudulot ng parehong humoral at cellular response. Ang induction ng parehong mga sangay ng kaligtasan sa sakit ng parehong taon ay natagpuan din para sa plasmid na naglalaman ng mga gene ng HIV. Mula noong 1995, nagsimulang lumabas ang ebidensya na ang pagbabakuna sa DNA ay maaaring mag-activate ng immune system laban sa kanser. Mga 20 taon na ang nakalilipas, ang mga unang klinikal na pagsubok ng mga bakuna sa DNA ay naganap, na, una sa lahat, ay dapat na ipakita ang kaligtasan ng bagong pamamaraan. Ang mga pasyente ay naturukan ng mga gene para sa HIV, influenza virus, herpes, hepatitis B, ang causative agent ng malaria. Ang mga resulta ng lahat ng mga pagsusuri ay lubos na nakapagpapatibay: Ang mga bakuna sa DNA ay pare-parehong ipinahayag, nagdulot ng immune response at hindi nagdulot ng malubhang epekto, na nagsilbing isang impetus para sa kanilang karagdagang pananaliksik.

Paggawa ng isang bakuna sa DNA

Sa istruktura, ang isang DNA vaccine ay isang nucleotide sequence na naka-embed sa isang vector na nag-encode ng isang partikular na antigen o antigens. Ang vector sa genetic engineering ay isang nucleic acid molecule na nagsisilbing maghatid ng genetic material sa mga cell at tinitiyak ang pagtitiklop o pagpapahayag nito. Dati, ang mga vector na nakabatay sa mga virus ay ginamit upang maghatid ng mga gene sa cell: isang binagong (hinang) variola virus, adenovirus, at retrovirus. Ang mga viral vector ay medyo epektibo, ngunit mayroon silang malaking posibilidad ng mga side effect na nauugnay sa medyo mataas na immunogenicity ng vector mismo. Samakatuwid, ngayon ang isang bacterial plasmid ay kadalasang ginagamit bilang isang vector - isang maliit na stable na pabilog na molekula ng DNA na may kakayahang autonomous replication. Sa sarili nito, ang plasmid ay hindi nagiging sanhi ng nais na tiyak na tugon ng immune; para dito, ang mga gene ng immunogenic na protina ay natahi dito. Gayundin, ang DNA vaccine ay dapat maglaman ng mga regulatory sequence na kinakailangan para sa gene expression sa eukaryotic cells. Ang natapos na konstruksyon ng DNA ay inihahatid sa isang bacterial cell, kung saan ang bilang ng mga kopya nito ay nadagdagan. Sinusundan ito ng paghihiwalay at paglilinis ng mga plasmid na nagdadala ng nais na pagsingit.

Disenyo ng plasmid vector

Ang isang mahalagang yugto sa paglikha ng mga bakuna sa DNA ay ang disenyo (paggawa) ng isang vector. Ang mga obligadong istruktura ng isang plasmid vector ay mga restriction site, isang mapipiling marker, at isang pinagmulan ng pagtitiklop ng isang DNA vaccine sa isang bacterial cell. Para maganap ang antigen synthesis, ang DNA vaccine ay dapat maglaman ng promoter at polyadenylation signal. Ang promoter ay isang mahalagang salik sa pagiging epektibo ng bakuna, dahil tinutukoy nito ang lakas ng immune response: mas maraming expression ng gene na naka-encode sa viral o tumor antigen, mas malakas ang immune response. Ang pinakakaraniwang ginagamit na tagataguyod ay ang SV40 virus o cytomegalovirus (CMV). Upang patatagin ang mga transcript ng mRNA, isang signal ng polyadenylation, na kadalasang nagmula sa gene ng bovine growth hormone, ay ipinasok sa plasmid. (BGH) o ang SV40 virus. Ang mga bacteria na antibiotic resistance genes ay pinili bilang mga mapipiling marker, kadalasan ang kanamycin resistance gene. Kapag nagdidisenyo ng mga bakuna sa DNA, ang pinakasikat na punto ng pinagmulan ng pagtitiklop Escherichia coli.

Pagpili ng gene para sa pagbabakuna

Ang vector ay isang mahalagang bahagi ng bakuna sa DNA, ngunit ang immunogenicity nito ay tiyak na tinutukoy ng insert, ang pagkakasunud-sunod ng DNA na naka-encode sa antigen. Sa mga viral antigens, ang mga fusion protein ay pinakaangkop para sa pagbabakuna; ito ay medyo conserved na mga protina na nagpapahintulot sa virus na makapasok sa cell. Para sa pagbabakuna laban sa gram-positive bacteria, ipinapayong ipasok sa plasmid vector ang mga gene ng mga bacterial protein na tumutukoy sa pathogenesis ng sakit. Kabilang sa mga protina ng gram-negative bacteria, mayroon silang mataas na immunogenicity. Para sa mga therapeutic antitumor DNA vaccines, ginagamit ang mga cancer cell marker protein.

Mga pamamaraan para sa paghahatid ng mga bakuna sa DNA sa mga selula

Ang natapos na bakuna ay dapat maihatid sa katawan ng tao o hayop, kung saan ang patutunguhan nito ay antigen-presenting cells (APC) - macrophage, dendritic cells, B-lymphocytes. Dito, magaganap ang synthesis at post-translational modification ng antigenic, pagkatapos nito ay ipapasok ito sa cell membrane upang maakit ang atensyon ng immune system. Ang pangunahing problema ay ang paghahatid ng sapat na plasmid sa APC. Ang mga pamamaraan para sa paghahatid ng genetic material sa cell ay karaniwang nahahati sa 2 grupo: viral at non-viral. Dahil ang mga viral vector ay may maraming makabuluhang disbentaha, tanging ang mga hindi viral na pamamaraan para sa paghahatid ng mga bakuna sa DNA ang ipinakita sa seksyong ito.

microinjection

Noong unang bahagi ng 1990s, ang intramuscular microinjections ay ang pinakakaraniwang paraan upang maipasok ang DNA sa isang cell, dahil sa pagiging simple ng pamamaraan. Upang gawin ito, ang DNA ay natunaw sa tubig o isotonic na solusyon, kung kinakailangan, isang adjuvant (isang sangkap na nagpapahusay sa immune response) ay idinagdag. Pagkatapos, gamit ang isang manipis na glass tube, ang solusyon ay iniksyon sa tissue ng kalamnan, kung saan ang papel ng APC ay ginagampanan ng mga dendritic na selula. Sa sandaling nasa nucleus ng dendritic cell, ang bakuna ay nagsisimulang ipahayag at ang synthesis ng mga protina ng antigen ay nangyayari. Sa tulong ng mga microinjections, ang DNA ay maaaring iturok nang subcutaneously, sa thymus, atay, at tumor tissue; gayunpaman, nasa tissue ng kalamnan na ang pinakamahabang (hanggang isang taon) na pagpapahayag ng bakuna sa DNA ay sinusunod. Dahil sa mataas na konsentrasyon ng mga selula ng Langerhans (isang subtype ng mga dendritic na selula), ang balat ay isang kaakit-akit na target para sa pagbabakuna ng DNA. Para sa intradermal (subcutaneous) na pangangasiwa, isang hanay ng mga microneedles ang ginagamit, ang haba nito ay ilang daang microns. Mayroong iba't ibang mga opsyon para sa intradermal na pagbabakuna. Mas madaling isama ang pag-loosening gamit ang isang hanay ng microneedles ang stratum corneum ng balat (ang panlabas na layer ng balat, karaniwang 10-20 microns) upang mapataas ang permeability nito para sa karagdagang lokal na iniksyon ng DNA solution. Ang mas epektibo ay ang paggamit ng microneedles na pinahiran ng tuyong bakuna na natutunaw sa ilalim ng balat. Ang kahusayan ng pamamaraang ito ay kadalasang mababa, dahil ang DNA ay unang pumasok sa intercellular space, at pagkatapos lamang ay kasama sa mga selula.

electroporation

Ang electroporation ay isang tradisyunal na diskarte para sa paghahatid ng DNA sa mga bacterial cell at cell culture batay sa paggamit ng electrical impulse. Ang ganitong salpok ay lumilikha ng mga pores sa lamad ng cell, na nagpapadali sa pagpasok ng negatibong sisingilin na DNA. Ang pamamaraang ito ay pinagtibay para sa paghahatid ng mga bakuna sa DNA sa mga hayop at tao at maaaring makabuluhang taasan ang kahusayan ng isang maginoo na iniksyon. Ang aparato para sa electroporation ay naglalaman ng isang pinagmumulan ng electric current at isang disposable grid, na binubuo ng isang syringe at needle electrodes. Ang syringe ay nag-inject ng bakuna sa tissue ng kalamnan, at ang mga electrodes ay lumikha ng isang electric field na nagpapadali sa pagpasok ng DNA sa mga myocytes at dendritic cells. Sa ngayon, ang mga aparato ay binuo na maaaring tumaas ang pagiging epektibo ng pagbabakuna ng 1000 beses kumpara sa isang maginoo na iniksyon. Maaaring gamitin ang electroporation para sa parehong intramuscular at subcutaneous na pangangasiwa ng isang bakuna sa DNA. Ang mga kawalan ay bahagyang pananakit sa lugar ng pag-iiniksyon, ang pangangailangan para sa mga dalubhasang aparato. Sa halip na isang electric field, maaaring gumamit ng magnetic field. Ang ganitong mga aparato ay nagpapatakbo sa parehong prinsipyo, ngunit sa kasong ito, ang pamamaraan ay ganap na walang sakit at hindi gaanong nakakapinsala sa mga selula.

Ang pagkilos ng electric field ay hindi lamang pinahuhusay ang pagsipsip ng bakuna sa DNA ng mga selula, ngunit pinasisigla din ang pagbuo ng isang immune response. Ang paggamit ng electroporation ay humahantong sa menor de edad na pinsala sa tissue - isang lokal na proseso ng pamamaga ay bubuo. Kapag nasira ang mga selula, inilalabas ang mga chemokines, kaya ipinapadala sa kanila ang mga macrophage, lymphocytes, at dendritic na mga selula. Ang pagtaas ng konsentrasyon ng mga immune cell sa lugar ng iniksyon ay nagpapataas ng bisa ng bakuna.

Sonoporation

Ang sonoporation ay isang paraan ng paglilipat ng dayuhang DNA sa mga selula gamit ang ultrasound. Pinatataas ng ultratunog ang pagkamatagusin ng lamad ng cell, bilang isang resulta kung saan ang exogenous DNA ay mas madaling tumagos sa cell. Ang sonoporation ay unang ginamit upang ilipat ang mga gene sa isang cell noong 1986. Ang pamamaraang ito ay ginagamit upang ipasok ang mga molekula ng DNA sa mga selula ng kornea, utak, tissue ng buto, bato, pancreas, embryonic tissue, skeletal at cardiac na kalamnan. Kung ikukumpara sa iba pang mga pamamaraan, ang sonoporation ay hindi gaanong pinag-aralan, mas maraming pagsisikap ang kinakailangan upang mapabuti ang pagiging epektibo nito, lalo na sa antas ng buong organismo.

Ballistic na paglipat

Ang ballistic transfection ay batay sa paghihimay (bombardment) ng mga organo at tisyu na may mga microparticle ng mabibigat na metal (ginto, tungsten) na may diameter na 1-3 microns na pinahiran ng mga molekula ng DNA. Ipinakilala sa ganitong paraan, ang bakuna sa DNA ay ipinahayag sa mga target na selula, at ang kanilang mga produkto ay pumapasok sa daluyan ng dugo. Upang magbigay ng acceleration sa mga particle, ginagamit ang isang aparato na katulad ng maliliit na armas - isang gene gun o isang gene gun. Ang mga microparticle ay dumadaan sa mga lamad ng cell at dinadala ang genetic construct nang direkta sa cell nucleus. Ang lalim ng pagtagos ng microparticle, bilang panuntunan, ay maliit - hanggang sa 1 mm, kaya ang paraan ay pangunahing ginagamit para sa paglipat ng balat o katabing tissue ng kartilago. Ang mga espesyal na kondisyon ng paghihimay ay nagpapahintulot sa mga microparticle na tumagos sa lalim na 4-5 mm at ilipat ang mga gene construct sa mga striated na fiber ng kalamnan. Kadalasan, ang mga cell na matatagpuan nang direkta sa gitna ng shot ay namamatay, habang sa zone na 0.6-1 cm mula sa gitna ay ang pinakamatagumpay na pro-transformed na mga cell. Ang teknolohiyang ito ay tinatawag ding biobalistics o biolistics.

Ang unang gene gun ay nilikha ng isang pangkat ng mga siyentipiko sa pagitan ng 1983 at 1986 na may layuning baguhin ang mga selula ng halaman. Ito ay isang pistol na binuo mula sa isang aparato para sa awtomatikong pagpapako. Ang DNA mula sa reporter (marker) gene ay inilapat sa isang tungsten ball at binaril sa isang Petri dish. Ang pagpapahayag ng gene ng reporter ay nagpahiwatig ng pagiging epektibo ng pagbabakuna. Ngayon, ang mga particle ng ginto o pilak ay ginagamit upang maghatid ng DNA, dahil hindi ito nakakalason sa cell, hindi tulad ng mga tungsten.

Sa ilalim ng mataas na presyon

Noong 1999, binuo ang mga aparatong iniksyon na may kakayahang magbigay ng bakuna sa DNA nang hindi gumagamit ng karayom. Ang ganitong mga aparato ay gumagana salamat sa puwersa ng Lorentz: ang isang maliit na malakas na magnet ay lumilikha ng makabuluhang presyon, nagpapakilos ng isang piston na naglalabas ng gamot sa bilis ng tunog. Sa pamamagitan ng pagbabago ng kasalukuyang lakas, maaari mong piliin ang lalim ng iniksyon at dosis ang mga gamot. Ang pamamaraan ay ganap na walang sakit at dati ay ginamit upang magbigay ng insulin sa mga pasyenteng may diabetes at para sa malakihang pagbabakuna. Ang isang makabuluhang kawalan ng pamamaraang ito ay ang mataas na presyon ay maaaring theoretically baguhin ang istraktura ng mga molecule na injected. Gayunpaman, ang teknolohiyang ito sa pagpasok ay patuloy na pinapabuti, at ngayon ay may mga device na binuo na maaaring maghatid ng DNA sa lalim na hanggang 16 mm.

Bilang bahagi ng isang live na bacterial vector

Ang mga live na bacterial vector ay mga strain salmonela, Shigella o listeria, na nagdadala ng mutation sa biosynthesis o invasion genes na nag-aalis ng pathogenicity at ang kakayahang mapanatili ang kanilang viability sa host organism o sa kapaligiran. Sa halip, ang mga kinakailangang gene para sa mga immunogenic na protina ay ipinasok sa bacterial genome. Ang attenuated bacterium ay ibinibigay nang pasalita (sa pamamagitan ng bibig, sa pamamagitan ng paglunok) o intranasally (sa pamamagitan ng iniksyon sa butas ng ilong), kaya ang pamamaraang ito ng pagbabakuna ay hindi nangangailangan ng anumang kagamitan. Bilang karagdagan, ang naturang pangangasiwa ay nagpapasigla sa mucosal immune response, na mahalaga dahil karamihan sa mga pathogen ay pumapasok sa katawan sa pamamagitan ng bibig at mga butas ng ilong. Ang pag-bypass sa tiyan, ang mahinang bacterium ay pumapasok sa maliit na bituka. Dagdag pa, ang bacterium ay tumagos sa Peer plaques - mga bituka na lymph node. Sa sandaling nasa gitna ng mga patch ng Peyer, ang bakterya ay nagiging target para sa mga macrophage at sumasailalim sa phagocytosis. Sa macrophage cytoplasm, ang bacterium ay naglalabas ng DNA vaccine, pagkatapos nito ang DNA ay pumapasok sa nucleus, at ang bacterium ay ginawang hindi nakakapinsala ng immune system.

Packaging sa liposomes

Liposomes - spherical formations (mga 100 nm ang lapad), na binubuo ng isang double lipid layer. Ang mga liposome ay guwang sa loob, na kadalasang puno ng solvent, ngunit maaaring gamitin upang maghatid ng iba't ibang mga sangkap, kabilang ang mga bakuna sa DNA. Ang kanilang hydrophobic shell ay nagpapahintulot sa kanila na mag-fuse sa mga lamad ng cell at dalhin ang kanilang mga nilalaman sa cell. Ang paggamit ng mga liposome ay nagsimula noong 1965, at ito ay naging isang makapangyarihang makina para sa pagbuo ng bionanotechnology.

Ang isang promising na paraan para sa direktang pagpapakilala ng isang DNA construct sa mga target na cell ay ang paghahatid ng isang genetic construct bilang bahagi ng cationic liposome na binuo mula sa mga positibong sisingilin na lipid. Ang mga cationic liposome na may negatibong sisingilin na molekula ng DNA ay bumubuo ng isang DNA-lipid complex - lipoplex. Ang mga bentahe ng paggamit ng naturang mga complex ay ang kakayahang magdala ng isang malaking halaga ng impormasyon, hindi nakakahawa, bilang karagdagan, ang mga ito ay simple at mura sa paggawa. Noong 2003, napakaliit, millimicron liposomes ay nilikha na pinahiran ng polyethylene glycol polymer, na may kakayahang magdala ng therapeutic DNA sa pamamagitan ng blood-brain barrier at ihatid ito sa mga neuron ng utak, na dati ay imposible.

Binubuo ng polyplex

Ang mga polyplex, mga system na binubuo ng mga polymer na may positibong charge (polycation) at mga molekula ng DNA na may negatibong charge, ay ginagamit upang ipasok ang malalaking konstruksyon ng DNA (>10 kb) sa cell. Ang laki ng naturang mga complex ay mas mababa sa 100 nm, na, sa isang banda, ay naglalantad sa kanila sa macrophage digestion (habang sila ay tumutugon sa mga particle na mas malaki kaysa sa 200 nm), at sa kabilang banda, ang mga ito ay sapat na malaki upang hindi mai-filter sa ang mga bato.

Ang mga polycation ay nagpapadikit sa molekula ng DNA sa mga kumplikado, kaya tinitiyak ang katatagan at proteksyon nito mula sa pagkilos ng mga nucleases. Ang mga cationic protein, synthetic amino acid homopolymers (polylysines, polyarginines), chitosan polysaccharide, polyethyleneamine ay maaaring magsilbi bilang DNA-binding polymers. Karaniwan, ang polycation ay labis sa komposisyon ng polyplex, bilang isang resulta kung saan ang kumplikadong ito ay natutunaw at positibong sisingilin. Kung ang isang ligand para sa isang partikular na cell receptor ay nakakabit sa polyplex, kung gayon ang DNA vaccine ay maaaring ituro sa isang partikular na uri ng cell. Ang proseso ng paghahatid ng genetic na materyal sa loob ng polyplex ay may kasamang dalawang yugto: extracellular (landas mula sa lugar ng pag-iniksyon hanggang sa mga target na cell) at intracellular (pakikipag-ugnayan sa mga target na cell, endocytosis, paglabas mula sa mga endosom, paghahatid sa nucleus). Ang unang hadlang na malalampasan ng complex ay ang dugo at ang extracellular matrix. Samakatuwid, ang mga pisikal at kemikal na mga parameter ng polyplex ay pinili upang madagdagan ang katatagan nito, maiwasan ang hindi kanais-nais na pakikipag-ugnayan sa mga protina ng dugo at ang immune reaksyon na dulot ng kemikal na kalikasan ng polycation. Sa sandaling nasa target na mga cell, ang polyplex ay nasisipsip sa lamad ng plasma, na hinihigop ng endocytosis, pagkatapos nito ay dapat na umalis sa endosome at maghiwalay sa isang cationic polymer at isang molekula ng DNA. Ang libreng DNA ay ipinapadala sa nucleus, at ang mga polymer cation ay umalis sa cell at pinalabas mula sa katawan.

Mga katangian ng pinakakaraniwang paraan ng paghahatid para sa mga bakuna sa DNA
Pamamaraan	Mga kalamangan	Bahid
Intramuscular o subcutaneous injection	Walang kinakailangang espesyal na kagamitan Permanente o pangmatagalang pagpapahayag Dinadala ang DNA sa mga katabing tissue	Mababang kahusayan Nangangailangan ng medyo malaking halaga ng DNA
electroporation	Mataas na kahusayan	pinsala sa tissue
baril ng gene	Mataas na katumpakan Nangangailangan ng kaunting DNA	Nangangailangan ng inert microparticle Pinsala sa mga cell sa lugar ng pagbaril
Panimula dahil sa mataas na presyon	Medyo simpleng pamamaraan Hindi na kailangan ng microparticle Ang DNA ay maaaring tumagos hanggang sa lalim mula sa ilang mm hanggang 1.5 cm	Nakakaapekto sa istruktura ng DNA Mababang kahusayan ng pagbabakuna Nangangailangan ng malaking halaga ng DNA (hanggang sa 300 mcg)
Packaging sa liposomes	Mataas na kahusayan sa vitro Dali ng paggawa Malaking kapasidad Maaaring pagsamahin sa iba pang mga pamamaraan Kapag ibinibigay sa intravenously, ang bakuna ay may potensyal na maabot ang lahat ng mga tisyu Tinitiyak ng intranasal administration ang pagpapahayag ng bakuna sa nasal mucosa at ang paggawa ng class A immunoglobulins (IgA)	Posibleng toxicity Mababang kahusayan sa vivo

Ang mekanismo ng pag-unlad ng immune response

Ang antigen na na-synthesize sa cell ay sumasailalim sa pagproseso, pagkatapos nito ay ipinakita sa mga immunocompetent na mga cell. Ang pagproseso ay ang paghahati ng isang antigenic na protina sa mga immunogenic peptide fragment. Ang ibig sabihin ng presentasyon ay ang pagsusumite ng isang antigen fragment na konektado sa mga molekula ng major histocompatibility complex (MHC) ng mga immunocompetent na selula. Mayroong dalawang pinakamahalagang klase ng mga molekulang ito: MHC class I (MHC-I) at MHC class II (MHC-II). Upang magbigkis sa mga molekula ng bawat klase, ang antigen ay inihanda sa mga espesyal na kompartamento ng selula. Ang mga endogenous na protina ng antigen ay nakadirekta sa proteasome para sa pagkasira, pagkatapos nito ay ipinakita sa kumplikadong may MHC-I sa ibabaw ng cell. Dito, kapag nagkita sila, kinikilala sila ng CD8 + T-cells (T-killers), na nagpapatupad ng cytotoxic immune response. Ang mga exogenous na protina ay pinuputol ng mga lysomnimal protease, isinasama sa MHC-II, at kinikilala ng mga receptor ng CD4+ T-cell (T-helper). Ang huli ay nagiging sanhi ng parehong cellular at humoral na mga tugon.

Ang pagtatanghal ng antigen sa pamamagitan ng landas ng MHC-I

Ang pagbabakuna sa DNA ay nagsasangkot ng endogenous antigen synthesis, kaya ang pathway na ito ay nangingibabaw. Ang pagpoproseso ng antigen sa kahabaan ng MHC-I pathway ay nangyayari sa ilang hakbang. Ang protina na na-synthesize sa nucleus ay dinadala sa cytoplasm, ang proteasome ay nahahati sa maikling peptides - mga epitope, na inililipat sa endoplasmic reticulum (EPR) ng mga espesyal na antigen transporter proteins (TAP). Sa EPR, ang bawat epitope ay pinagsama sa MHC-I molekula, pagkatapos kung saan ang nabuong complex ay ipinadala sa Golgi apparatus (AG) para sa glycosylation. Mula doon, ang kumplikado sa komposisyon ng vesicle ay may gawi sa lamad ng plasma. Matapos ang pagsasanib ng vesicle sa lamad ng plasma, lumilitaw ang complex sa ibabaw ng cell, kung saan kinikilala ito ng mga T-killer receptors, na may aktibidad na cytotoxic.

Ang pagtatanghal ng antigen sa pamamagitan ng landas ng MHC-II

Ang pangunahing pinagmumulan ng mga peptide na nagbubuklod sa MChS-II ay mga exogenous na protina na pumasok sa cell sa pamamagitan ng endocytosis. Gayunpaman, ipinakita na ang ilang mga intracellular na protina ay maaari ding iharap sa kumplikado sa MChS-II. Sa kasong ito, ang mga bagong synthesize na protina, pagkatapos na makapasok sa cytoplasm, ay inilipat sa lysosomes, kung saan ang antigen ay na-cleaved sa ilalim ng pagkilos ng acidic protease. Pagkatapos nito, ang lysosome na naglalaman ng mga epitope ay nagsasama sa vesicle na nagdadala ng molekula ng MChS-II. Sa loob ng nagkakaisang vesicle, nabuo ang isang epitope-MChS-II complex; pagkatapos ng pagsasanib ng vesicle sa plasmalemma, dinadala ito sa ibabaw ng cell. Dito, ang kumplikadong ito ay kinikilala ng mga T-helper receptor, na nagreresulta sa kanilang pag-activate. Ito ay humahantong sa pagpapasigla ng parehong cellular (activation ng T-killers) at humoral immunity (activation ng B-lymphocytes).

Ang tradisyunal na pagbabakuna na may natutunaw na mga antigen ng protina ay naglalayon sa pagpapakilos ng mga T-helpers. Ang medyo mababang tugon ng mga T-helpers ay isa sa mga disadvantage ng mga bakuna sa DNA. Gayundin, ang kasalukuyang henerasyon ng mga bakuna sa DNA ay hindi may kakayahang mag-udyok sa paggawa ng mataas na titer ng antibody. Upang madagdagan ang pag-activate ng mga T-helper cells, ang antigen ay dapat na mai-redirect sa MChS-II pathway. Upang gawin ito, ang isang senyales ng lysosomal localization ay itinayo sa bakuna ng DNA; ang synthesized antigen ay ipapadala sa lysosomes, na nangangahulugan na ito ay dadaan sa landas ng MChS-II.

Mga Istratehiya para sa Pagpapabuti ng Kahusayan ng isang Bakuna sa DNA

Ang pangunahing tanong tungkol sa hinaharap ng mga bakuna sa DNA ay tungkol sa kung paano pataasin ang pagiging epektibo ng mga ito. Ang isang malaking bilang ng mga pag-aaral ay kasalukuyang isinasagawa upang ma-optimize ang binuo na mga bakuna sa DNA. Ang paghahanap para sa isang solusyon ay isinasagawa sa dalawang direksyon: pagtaas ng pagpapahayag ng bakuna at pagtaas ng immunogenicity ng naka-encode na antigen.

Pag-optimize ng elemento ng transkripsyon

Ang isang mahalagang bahagi ng bakuna sa DNA ay ang tagataguyod. Ang mga bacterial promoter ay hindi angkop para sa antigenic expression sa mammalian cells, kaya ang mga promoter ng oncogenic virus ang ginamit sa halip. Ngayon, upang mapabuti ang kaligtasan ng mga bakuna, pinalitan ang mga ito ng mga promotor mula sa mga bagay na hindi nakaka-carcinogenic, tulad ng human cytomegalovirus (CMV). Para sa karamihan ng mga bakuna sa DNA, ang tagataguyod na ito ay ang pinakamainam na pagpipilian: ito ay lubos na ipinahayag sa isang malawak na hanay ng mga cell. Para sa pagpapahayag ng gene sa mga partikular na tisyu, nangangako na gumamit ng mga promotor na partikular para sa uri ng tissue na ito. Halimbawa, ang paggamit ng isang muscle CPK promoter kapag pinangangasiwaan ay humahantong sa isang sampung beses na pagtaas sa antibody synthesis at induction ng isang T-cell na tugon kaysa sa paggamit ng isang katulad na bakuna sa DNA na may isang CMV promoter. Ang tagataguyod ng desmin gene na naka-encode ng isa sa mga cytoskeletal na protina ay nagpakita rin ng mataas na kahusayan sa myocytes. Upang mapataas ang pagpapahayag ng bakuna sa DNA sa mga keratinocytes (mga selula ng epithelial tissue), ang mga tagapagtaguyod ng metalothionein gene (isang protina na nagbubuklod sa mabibigat na metal) o ang bitamina D hydroxylase gene 3 ay ginagamit.

Ang antas ng pagsisimula ng transkripsyon ay may posibilidad na tumaas bawat account sa paggamit makapangyarihang tagasulong at pagpapahusay, at ang mga feature ng pagwawakas ay maaaring maging isang limiting factor. Ang kahusayan ng polyadenylation at pagproseso ng pangunahing RNA transcript ay nag-iiba depende sa pagkakasunud-sunod ng polyA signal. Iyon ay, ang polyadenylation sequence ay nakakaapekto sa antigen synthesis. Halimbawa, ang malawakang ginagamit na polyA signal ng SV40 virus ay hindi gaanong epektibo kaysa sa polyadenylation signal ng rabbit β-globin gene o ang bovine growth hormone gene.

Para sa mahusay na pagsasalin, ang mammalian mRNA ay dapat na may tinatawag na Kozak sequence. Ang pagpasok ng sequence na ito sa isang DNA construct ay maaaring makabuluhang tumaas ang antas ng antigen synthesis. Upang ang RNA polymerase ay HINDI laktawan ang stop codon ng gene at ang synthesis ng isang pinahabang protina ay hindi magaganap, na hindi maaaring makuha ang tamang estilo, ang gene ay maaaring wakasan double stop line.

Kapag nagdidisenyo ng mga bakuna sa DNA, sinisikap din nilang gawin i-optimize ang mga codon nito. Ang pamamaraan ng pag-optimize ay nangangahulugan ng pagpapalit ng mga codon sa pagkakasunud-sunod ng gene sa paraang hindi nagbabago ang pagkakasunud-sunod ng amino acid ng protina, ngunit ang kahusayan ng pagsasalin ng mRNA nito ay tumataas. Ang dahilan ay ang karamihan sa mga amino acid ay naka-code para sa higit sa isang hangganan. Ang bawat codon ay may sariling tRNA at ang representasyon ng iba't ibang tRNA sa cell ay hindi pareho, at nag-iiba din ito depende sa uri ng organismo. Pinipili ang mga codon sa paraang ang pagkakaroon ng ninanais na tRNA sa panahon ng antigen synthesis ay hindi nagiging limiting factor.

Pag-optimize ng Antigen

Bagaman ang lakas ng tugon ng immune ay nauugnay sa antas ng pagpapahayag ng bakuna sa DNA, gayunpaman, para sa bawat antigen mayroong isang tiyak na talampas, pagkatapos kung saan ang pagtaas sa dami ng antigenic na protina ay tataas ang paggawa ng mga antibodies. Kasabay nito, ang isang mas malakas na tugon ng immune ay maaaring makamit sa pamamagitan ng pag-optimize ng antigen. Halimbawa, sa pamamagitan ng pagsasama ng isang antigen na may ligand sa isang tiyak na receptor para sa mga cell na nagpapakita ng antigen. Ang nasabing ligand ay maaaring ang CD40 marker protein, ang extracellular domain ng Fms-shaped tyrosine kinase-3, o ang T-killer antigen-4. Dahil sa pakikipag-ugnayan ng ligand-receptor, ang kahusayan ng pagkuha ng antigenic protein ng APC ay tumataas.

Pinadali ang pagkasira ng antigen sa proteasome o lysosome pasiglahin din ang immune response. Upang mapahusay ang proteoliotic cleavage ng antigen, isang ubiquitination signal ang ipinapasok sa sequence nito. Error sa quote: Hindi magandang tawag: Dapat may input ang isang walang pamagat na ref tag. Ang paggamit ng mga bakuna sa DNA na naka-encode sa halip na ang buong antigen, ilang epitope na may iba't ibang pinagmulan, ay nagbibigay-daan sa iyo upang makabuluhang palawakin ang spectrum ng immune response.

Para sa mga bakunang antitumor DNA, epektibo ang kumbinasyon "tumor antigen + viral o bacterial antigen". Halimbawa, ang kumbinasyon ng isang tumor antigen na may tetanus toxin epitope ay makabuluhang nagpapataas ng activation ng mga killer T cells laban sa mga cancer cells.

Pagsasama ng mga adjuvant

Kapag gumagamit ng mga tradisyunal na bakuna, ang mga adjuvant ay idinaragdag sa kanila upang mapataas ang immune response. Ang bakuna sa DNA ay mula sa bacterial na pinagmulan, kaya ito mismo ay isang immunostimulant. Upang mapahusay ang immune response, ang mga adjuvant genes ay ipinapasok sa DNA vaccine o isang karagdagang plasmid ang ginagamit na nag-encode ng mga immunostimulatory protein.

Immunostimulating effect ng bacterial CpG dinucleotides

Ang pag-andar ng isang plasmid ay hindi limitado sa paghahatid ng mga gene sa mga selula. Noong 1893, napag-alaman na ang pinaghalong bacterial lysate ay nakakabawas sa pag-unlad ng cancerous na mga tumor, ngunit noong 1983 ay itinatag na ang immunostimulatory properties ng lysate ay dahil sa bacterial DNA molecules. Noong 1995, ipinakita na ang immune stimulation ay sanhi ng mga CpG motif sa bacterial DNA. Sa bakterya, pati na rin sa mga virus ng DNA, ang mga motif na ito ay hindi methylated. Sa mga tao at mas mataas na primates, sa kabaligtaran, ang cytosine sa karamihan ng CpG dinucleotides ay naglalaman ng isang methyl group. Samakatuwid, ang mga CpG na non-methylation motif ay nakikita ng katawan ng tao bilang pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). Ang mga compound ng Ramri ay kinikilala ng mga receptor na tulad ng Toll, na, depende sa uri ng ligand, ay nahahati sa ilang uri. Ang CpG unmethylation motifs ay kinikilala ng TLR-9 receptor na matatagpuan sa endoplasmic reticulum membranes ng B lymphocytes, dendritic cells, at natural killer cells. Ang pagbubuklod ng receptor sa mga non-methylated CpG motif ay nagti-trigger ng kaskad ng mga reaksyon na nag-uudyok sa synthesis ng mga pro-inflammatory cytokine—interferon-1 at IL-12.

Pagpapahayag ng mga cytokine at iba pang mga immunomodulators

Para sa pagbabakuna sa DNA, ang mga cytokine genes ay kadalasang ginagamit bilang mga adjuvant. Ang mga cytokine ay isang klase ng mga molekula ng protina na kumokontrol sa intercellular at intersystem na pakikipag-ugnayan sa katawan, lalo na, ang paggana ng immune system. Ang lahat ng mga cytokine, at higit sa 30 sa kanila ay kilala, ay maaaring baguhin ang immune response. Ang mga cytokine na IL2, IL-12, interferon γ, IL-15, IL-18 at IL-23 ay may nakapagpapasiglang epekto sa mga T-helpers ng unang klase. Ang mga cytokine na nagmo-modulate sa pagkilos ng mga T-helpers ng pangalawang klase ay kinabibilangan ng: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 I IL-13. Ang uri ng cytokine ay pinili ayon sa kung anong uri ng immune response ang gustong pahusayin.

Posibleng makamit ang pagtaas ng immune response sa tulong ng mga chemokines. Ang mga chemokines ay isang pamilya ng mga cytokine na maaaring magdulot ng chemotaxis ng mga sensitibong selula, kabilang ang mga immune. Sa partikular, ang mga chemokine receptor ay matatagpuan sa antigen na nagpapakita ng mga selula ng chemokine. Ang pagbubuklod ng chemokine sa receptor nito ay humahantong sa endocytosis ng antigen-chemokine complex sa loob ng APC. Ang diskarte na ito ay epektibong ginagamit kapwa sa pagbuo ng mga bakunang antiviral DNA at mga antitumor.

Ang paggana ng isang adjuvant ay maaari ding gawin ng HSP70 na protina (mga protina ng heat-shock, mga protina ng heat shock). Ang immunostimulatory effect ng HSP70 ay batay sa kakayahang pumasok sa extracellular space at magbigkis sa mga APC receptor. Ang mekanismo ng transportasyon ng HSP70 sa labas ay hindi pa ganap na naipapaliwanag, ngunit malamang na mayroong ilang mga paraan - exocytosis, pagtatago sa labas, o paglabas sa pamamagitan ng channel. Ang pagbubuklod ng HSP70 sa receptor nito ay nagreresulta sa dendritic cell activation, namamagitan sa pagtatanghal ng antigen, at pinasisigla ang paggawa ng chemokine. Dahil ang antigen ay pinagsama sa HSP70, pumapasok din ito sa extracellular space, upang maipakita ito sa pamamagitan ng MES-II pathway at i-activate ang mga B cells. Ginagamit ng mga bakuna sa DNA ang bacterial HSP70 gene upang maiwasan ang mga reaksiyong autoimmune.

Mga kalamangan at kawalan ng mga bakuna sa DNA

Ang paraan ng pagbabakuna ng DNA ay may ilang mga pakinabang, ang pinakamahalaga sa mga ito ay ang pag-trigger ng parehong humoral at cellular immune responses. Ang mga bakunang nakabatay sa DNA ay nagbibigay ng pangmatagalang pagpapahayag ng antigen at, nang naaayon, isang matatag na tugon ng immune. Ang mga karagdagang salik na nagtutulak sa pagbuo ng pagbabakuna sa DNA ay kinabibilangan ng kadalian at mababang halaga ng paggawa ng bakuna.

Mga kalamangan

Bahid

Ang antigen ay nakakakuha ng isang katutubong conformation Pag-activate ng parehong mga sangay ng kaligtasan sa sakit: humoral at cellular Ang synthesized antigen ay maaaring piliing idirekta sa MES-I o MES-II na landas Maaaring piliing kumilos sa iba't ibang populasyon ng mga T-helper Magbigay ng pangmatagalang pagpapahayag ng antigen Simple at mabilis sa paggawa Mababang gastos sa produksyon Hindi nangangailangan ng mga espesyal na kondisyon ng imbakan Maaaring gamitin para sa parehong pag-iwas at paggamot ng mga sakit Potensyal na epektibo laban sa malawak na hanay ng mga sakit: bacterial, viral, autoimmune at cancerous na mga sakit

Mahinang immunogenicity Para sa mga viral vector, may panganib ng dayuhang DNA na sumasama sa genome ng cell Posibleng pag-unlad ng mga reaksyon ng autoimmune Ang mga plasmid at viral vector ay maaaring makakuha ng isang hindi tiyak na tugon ng immune

Ang paggamit ng mga bakuna sa DNA

Ang mga unang klinikal na pag-aaral ng mga bakuna sa DNA, kasama ang kaligtasan ng bagong pamamaraan, ay nagpakita ng mababang kahusayan nito. Napagtanto ang pangako ng pagbabakuna sa DNA, ang mga siyentipikong laboratoryo, kasama ng mga kumpanya ng biotech, ay nagturo sa kanilang mga pagsisikap na i-optimize ang bagong pamamaraan, at sa loob ng ilang taon, nagkaroon ng makabuluhang pag-unlad. Noong 2005, ang unang bakuna sa DNA ay nakatanggap ng pag-apruba ng FDA. Pangangasiwa ng Pagkain at Gamot) para gamitin sa mga hayop. Noong 2013, mahigit sa isang daang bakuna sa DNA ang nasa mga klinikal na pagsubok at apat na bakuna sa DNA ang lisensyado para gamitin sa produksyon ng hayop.

Mga bakuna sa DNA sa gamot sa beterinaryo

Lahat ng apat na bakunang inaprubahan ng FDA ay batay sa plasmids. Para sa tatlo sa kanila, inirerekomenda ng tagagawa ang paraan ng pangangasiwa - intramuscularly, para sa bakuna ng LifeTide® - iniksyon na sinamahan ng electroporation. Kung ang natitirang mga bakuna ay naglalayong i-activate ang immune system, kung gayon para sa LifeTide® na bakuna, ang immunostimulatory effect ay dagdag. Ang produkto ng bakuna ay Somatoliberin, isang hormone na nagpapasigla sa pagpapalabas ng growth hormone at prolactin ng pituitary gland. Ang pagkilos ng huling dalawang hormone sa mga baboy ay humahantong sa isang pagtaas sa masa ng mga hayop at isang pagtaas sa bilang ng mga litters. Kasabay nito, ang pagpapakilala ng isang plasmid na pag-encode ng Somatoliberin sa mga hayop ay nagpapasigla sa paggawa ng T-lymphocytes, natural na mga pumatay, at samakatuwid ay pinapataas ang immune resistance ng katawan.

Brand name ng bakuna	Taon ng lisensya	Target	Hayop	Produkto ng bakuna	Ang layunin ng bakuna
West Nile-Innovator® (USA)	2005	Kanlurang Nile Virus	Mga Kabayo	Structural protein ng PreM-E virus	Proteksyon laban sa virus
Apex-IHN® (Canada)	2005	Ang causative agent ng nakakahawang nekrosis ng hematopoietic tissue	Isda ng pamilya ng salmon	Viral glycoprotein	Pagtaas ng dami at kalidad ng pagkaing isda
LifeTide® SW 5 (Australia)	2008	Isang growth hormone	Baboy at iba pang hayop	Somatoliberin ng baboy	Nadagdagang magkalat sa mga sows; makabuluhang binabawasan ang pagbawas sa perinatal mortality at morbidity
ONCEPT® (USA)	2010	Melanoma	Mga aso	tyrosinase ng tao	Bilang alternatibo sa radiation therapy at operasyon sa paggamot ng melanoma

Mga prospect para sa pagbabakuna ng DNA

Mga bakuna sa DNA ng kanser

Habang ang induction ng cellular at humoral immune responses ay nakakumbinsi na ipinakita para sa mga dayuhang antigen na nauugnay sa mga nakakahawang sakit, ang paggamit ng mga bakuna sa DNA para sa paggamot ng kanser ay hindi gaanong matagumpay. Ang induction ng epektibong antitumor immunity ay isang mahirap na gawain. Kinumpirma ng mga klinikal na pag-aaral ang pangkalahatang kaligtasan at mababang toxicity ng mga bakunang antitumor DNA, gayunpaman, ang pagiging epektibo ng immune response na nakuha nila ay naging mahina, at ang aktibidad ng antitumor, sa ilang mga kaso, ay karaniwang nagdududa.

Mga bakuna sa DNA laban sa mga viral at bacterial pathogens

Ang bakuna sa DNA laban sa mga karies

Ang sanhi ng mga karies ay isang lokal na pagbabago sa pH bilang resulta ng pagbuburo (glycolysis) ng mga carbohydrates na isinasagawa ng bakterya. Ang mga siyentipiko mula sa Wuhan Institute of Virology (China) ay nakagawa ng isang bakuna sa DNA na nakadirekta laban sa isa sa mga pathogens ng karies - Streptococcus mutans. Ang bakuna ay batay sa isang plasmid at nag-encode ng dalawang protina: isang protina sa ibabaw St. mutans PAc at flagellin, na nagmula sa bacterium Salmonella na nagsisilbing adjuvant. Sa yugto ng mga preclinical na pag-aaral, ang bakuna ay pinangangasiwaan sa pamamagitan ng ilong sa mga rodent ng laboratoryo, pagkatapos kung saan ang antas ng immunoglobulins G sa serum ng dugo at secretory immunoglobulins A sa laway ay nasuri sa mga hayop. Matapos ang mga pag-aaral, natuklasan ng mga siyentipiko na ang antas ng immune protein sa parehong dugo at laway ay tumaas, ngunit, higit na mahalaga, ang paglago ng mga kolonya ay napigilan. Streptococcus mutans sa enamel ng ngipin. Iyon ay, ang mga ngipin ng mga nabakunahang hayop ay mas mahusay na protektado mula sa mga karies.

Mga bakuna sa DNA at paggamot para sa mga sakit na autoimmune

Type 1 diabetes na bakuna sa DNA

Ang type 1 diabetes mellitus ay nailalarawan sa pagkawala ng mga beta cell na gumagawa ng insulin na matatagpuan sa pancreatic islets ng Langerhans. Ang pangunahing sanhi ng pagkawala ng beta cell ay ang pagkasira ng autoimmune ng mga killer T cells. Upang maprotektahan ang mga beta cell mula sa sobrang aktibong immune system, binuo ng mga siyentipiko mula sa mga unibersidad ng Stanford (USA) at Leiden (Netherlands) ang BHT-3021 DNA vaccine. Ang bakuna ay nilikha batay sa isang plasmid at ini-encode ang insulin precursor, proinsulin. Ito ay isang retroactive na bakuna: kung ang mga kumbensyonal na bakuna ay dapat na mag-activate ng mga immune response, kung gayon ang BHT-3021, sa kabaligtaran, ay neutralisahin ang cytotoxic effect ng mga T-killer na nakadirekta laban sa mga islet ng Langerhans.

Sa unang yugto ng mga klinikal na pagsubok, ipinakita ng BHT-3021 ang pagiging epektibo nito sa isang grupo ng 80 katao. Kalahati sa kanila ay nakatanggap ng intramuscular injection ng BHT-3021 tuwing pitong araw sa loob ng 12 linggo, at ang kalahati ay nakatanggap ng placebo. Pagkatapos ng panahong ito, ang grupo na nakatanggap ng bakuna ay nagpakita ng pagtaas sa antas ng C-peptides sa dugo, na nagpapahiwatig ng pagpapanumbalik ng beta-cell function. Walang malubhang epekto ang naitala sa isa sa mga kalahok. Ang epekto ng bakuna ay napanatili sa loob ng 2 buwan.

Panimula

1 Mga pangunahing grupo ng genetic engineering enzymes

1.1 Restriction enzymes

1.1.1 Mekanismo ng pagkilos ng mga paghihigpit

1.1.2 Konstruksyon ng mga mapa ng paghihigpit

1.3 Ligase

2 Pagpapakilala ng isang bagong gene sa isang cell

2.1 Regulasyon ng pagpapahayag ng gene sa mga prokaryote

2.2 Mga pamamaraan para sa direktang pagpapasok ng isang gene sa isang cell

2.3 Pagpapakilala ng mga gene sa mga selulang mammalian

2.4 Genetic transformation ng mammalian somatic cells

2.5 Gene therapy

2.6 Pagkuha ng mga transgenic na hayop

Konklusyon

Bibliograpiya

Panimula

Ang genetic engineering ay ang in vitro construction ng functionally active genetic structures (recombinant DNA), o sa madaling salita, ang paglikha ng mga artipisyal na genetic programs (Baev A. A.). Ayon kay E. S. Piruzyan, ang genetic engineering ay isang sistema ng mga eksperimentong pamamaraan na ginagawang posible na bumuo ng mga artipisyal na istrukturang genetic sa laboratoryo (sa isang test tube) sa anyo ng tinatawag na recombinant o hybrid na mga molekula ng DNA.

Pinag-uusapan natin ang tungkol sa nakadirekta, ayon sa isang paunang natukoy na programa, ang pagtatayo ng mga molecular genetic system sa labas ng katawan kasama ang kanilang kasunod na pagpapakilala sa isang buhay na organismo. Sa kasong ito, ang recombinant DNA ay nagiging mahalagang bahagi ng genetic apparatus ng recipient organism at nagbibigay ng bagong kakaibang genetic, biochemical, at pagkatapos ay physiological properties dito.

Ang layunin ng inilapat na genetic engineering ay ang magdisenyo ng mga naturang recombinant na molekula ng DNA na, kapag ipinakilala sa genetic apparatus, ay magbibigay ng mga katangian ng katawan na kapaki-pakinabang para sa mga tao.

Ang teknolohiya ng recombinant DNA ay gumagamit ng mga sumusunod na pamamaraan:

Tukoy na cleavage ng DNA sa pamamagitan ng restriction nucleases, nagpapabilis sa paghihiwalay at pagmamanipula ng mga indibidwal na gene;

Mabilis na pagkakasunud-sunod ng lahat ng mga nucleotide ng isang purified DNA fragment, na nagbibigay-daan sa iyo upang matukoy ang mga hangganan ng gene at ang pagkakasunud-sunod ng amino acid na naka-encode nito;

Konstruksyon ng recombinant DNA;

Nucleic acid hybridization, na nagbibigay-daan sa pagtuklas ng mga partikular na RNA o DNA sequence na may higit na katumpakan at sensitivity batay sa kanilang kakayahang magbigkis ng mga pantulong na nucleic acid sequence;

Pag-clone ng DNA: in vitro amplification sa pamamagitan ng polymerase chain reaction o pagpapakilala ng isang fragment ng DNA sa isang bacterial cell, na, pagkatapos ng naturang pagbabago, ay nagpaparami ng fragment na ito sa milyun-milyong kopya;

Pagpapasok ng recombinant DNA sa mga cell o organismo.

Kasaysayan ng genetic engineering

Lumitaw ang genetic engineering salamat sa gawain ng maraming mananaliksik sa iba't ibang sangay ng biochemistry at molecular genetics. Sa loob ng maraming taon, ang mga protina ay itinuturing na pangunahing klase ng macromolecules. Nagkaroon pa nga ng pagpapalagay na ang mga gene ay may likas na protina. Noong 1944 lamang ipinakita nina Avery, McLeod at McCarthy na ang DNA ang tagapagdala ng namamana na impormasyon. Mula noon, nagsimula ang masinsinang pag-aaral ng mga nucleic acid. Pagkaraan ng isang dekada, noong 1953, lumikha sina J. Watson at F. Crick ng double-stranded na modelo ng DNA. Ang taong ito ay itinuturing na taon ng kapanganakan ng molecular biology.

Sa pagliko ng 1950s at 1960s, ang mga katangian ng genetic code ay napaliwanagan, at sa pagtatapos ng 1960s, ang pagiging pangkalahatan nito ay nakumpirma sa eksperimentong paraan. Nagkaroon ng masinsinang pag-unlad ng molecular genetics, ang mga bagay na kung saan ay E. coli, ang mga virus at plasmids nito. Ang mga pamamaraan ay binuo upang ihiwalay ang lubos na nalinis na paghahanda ng mga buo na molekula ng DNA, plasmid, at mga virus. Ang DNA ng mga virus at plasmids ay ipinakilala sa mga cell sa isang biologically active form, na tinitiyak ang pagtitiklop nito at pagpapahayag ng kaukulang mga gene. Noong dekada 70, natuklasan ang isang bilang ng mga enzyme na nagpapagana sa mga reaksyon ng pagbabagong-anyo ng DNA. Ang mga restriction enzymes at DNA ligases ay gumaganap ng isang espesyal na papel sa pagbuo ng mga pamamaraan ng genetic engineering.

Ang kasaysayan ng pag-unlad ng genetic engineering ay maaaring nahahati sa tatlong yugto. Ang unang yugto ay konektado sa patunay ng pangunahing posibilidad ng pagkuha ng mga recombinant na molekula ng DNA sa vitro. Ang mga gawaing ito ay may kinalaman sa paggawa ng mga hybrid sa pagitan ng iba't ibang mga plasmid. Ang posibilidad ng paglikha ng mga recombinant na molekula gamit ang orihinal na mga molekula ng DNA mula sa iba't ibang mga species at strain ng bakterya, ang kanilang kakayahang mabuhay, katatagan at paggana ay napatunayan.

Ang ikalawang yugto ay nauugnay sa pagsisimula ng trabaho sa pagkuha ng mga recombinant na molekula ng DNA sa pagitan ng mga chromosomal genes ng prokaryotes at iba't ibang mga plasmid, na nagpapatunay ng kanilang katatagan at posibilidad na mabuhay.

Ang ikatlong yugto ay ang simula ng trabaho sa pagsasama ng mga eukaryotic genes, pangunahin ang mga gene ng hayop, sa vector DNA molecules (DNA na ginagamit para sa paglipat ng gene at may kakayahang maisama sa genetic apparatus ng recipient cell).

Pormal, ang petsa ng kapanganakan ng genetic engineering ay dapat isaalang-alang noong 1972, nang nilikha ni P. Berg, S. Cohen, H. Boyer at mga katrabaho ang unang recombinant na DNA na naglalaman ng mga fragment ng DNA ng SV40 virus, bacteriophage, at E. coli sa Stanford. Unibersidad.

1 Mga pangunahing grupo ng genetic engineering enzymes

Ang genetic engineering ay isang inapo ng molecular genetics, ngunit utang nito ang mga tagumpay ng genetic enzymology at nucleic acid chemistry, dahil ang mga enzyme ay mga instrumento ng molecular manipulation. Kung minsan ay maaari tayong magtrabaho kasama ang mga cell at cellular organelle na may mga micromanipulator, kung gayon hindi, kahit na ang pinakamaliit na microsurgical na instrumento, ay makakatulong kapag nagtatrabaho sa DNA at RNA macromolecules. Anong gagawin? Ang mga enzyme ay kumikilos bilang "scalpel", "gunting" at "mga sinulid para sa pagtahi".

Sila lamang ang makakahanap ng ilang mga pagkakasunud-sunod ng mga nucleotide, "pumutol" ng isang molekula doon, o, sa kabaligtaran, "mapahamak" ng isang butas sa kadena ng DNA. Ang mga enzyme na ito ay gumagana sa cell sa loob ng mahabang panahon, gumaganap ng gawain ng pagkopya (pagdodoble) ng DNA sa panahon ng cell division, pag-aayos ng pinsala (pagpapanumbalik ng integridad ng molekula), sa mga proseso ng pagbabasa at paglilipat ng genetic na impormasyon mula sa cell patungo sa cell o sa loob ng cell. Ang gawain ng isang genetic engineer ay pumili ng isang enzyme na tutuparin ang mga gawain na itinakda, iyon ay, maaari itong gumana sa isang partikular na seksyon ng nucleic acid.

Dapat pansinin na ang mga enzyme na ginagamit sa genetic engineering ay hindi partikular sa mga species, kaya ang eksperimento ay maaaring pagsamahin ang mga fragment ng DNA ng anumang pinagmulan sa isang solong kabuuan sa pagkakasunud-sunod na pinili niya. Nagbibigay-daan ito sa genetic engineering na malampasan ang mga hadlang ng species na itinatag ng kalikasan at magsagawa ng interspecific crossing.

Ang mga enzyme na ginamit sa pagbuo ng recombinant DNA ay maaaring nahahati sa ilang mga grupo:

Mga enzyme na gumagawa ng mga fragment ng DNA (restriction enzymes);

Mga enzyme na nag-synthesize ng DNA sa isang template ng DNA (polymerase) o RNA (reverse transcriptase);

Mga enzyme na nag-uugnay sa mga fragment ng DNA (ligases);

Mga enzyme na ginagawang posible na baguhin ang istraktura ng mga dulo ng mga fragment ng DNA.

1.1 Restriction enzymes

Karaniwang tinatanggap na ang mga terminong "restriction enzyme", "restriction endonuclease" at "site specific endodeoxyribonuclease" ay itinuturing na magkasingkahulugan.

Ang lahat ng bacterial restriction endonucleases ay kinikilala ang mga tiyak, sa halip maikli ang mga pagkakasunud-sunod ng DNA at nagbubuklod sa kanila. Ang prosesong ito ay sinamahan ng pagputol ng molekula ng DNA sa mismong lugar ng pagkilala o sa ibang lugar, na tinutukoy ng uri ng enzyme. Kasama ng aktibidad ng paghihigpit, ang bacterial strain ay may kakayahang mag-methylate ng DNA; ang prosesong ito ay nailalarawan sa pamamagitan ng parehong pagtitiyak para sa mga pagkakasunud-sunod ng DNA tulad ng para sa paghihigpit. Ang methylase ay nagdaragdag ng mga methyl group sa adenine o cytosine residues sa parehong lugar kung saan nagbubuklod ang restriction enzyme. Bilang resulta ng methylation, ang site ay nagiging lumalaban sa paghihigpit. Samakatuwid, pinoprotektahan ng methylation ang DNA mula sa pagkaputol.

Mayroong 3 pangunahing klase ng mga paghihigpit: 1, 2 at 3.

Kinikilala ng lahat ng mga restriction enzyme ang mahigpit na tinukoy na mga pagkakasunud-sunod sa double-stranded na DNA, ngunit ang mga restriction enzymes ng 1st class ay nagsasagawa ng mga break sa mga arbitrary na punto ng molekula ng DNA, at ang mga restriction enzymes ng 2nd at 3rd class ay kinikilala at pinuputol ang DNA sa mahigpit na tinukoy na mga punto sa loob ng mga site ng pagkilala o sa isang nakapirming distansya mula sa kanila.distansya.

Ang mga enzyme ng mga uri 1 at 3 ay may isang kumplikadong istraktura ng subunit at may dalawang uri ng mga aktibidad - pagbabago (methylating) at ATP-dependent endonuclease.

Ang mga enzyme ng pangalawang klase ay binubuo ng 2 magkahiwalay na protina: isang restriction endonuclease at isang modifying methylase, samakatuwid, ang class 2 enzymes lamang ang ginagamit sa genetic engineering. Kailangan nila ng mga ion ng magnesium bilang mga cofactor.

Sa kasalukuyan, higit sa 500 class 2 restrictases ang nahiwalay, gayunpaman, sa mga enzyme na nakahiwalay sa iba't ibang microorganism, may mga nakakakilala sa parehong mga sequence sa DNA. Ang ganitong mga pares o grupo ay tinatawag na isoschizomer. Nakikilala ang tunay na isoschizomerism, kapag kinikilala ng mga enzyme ang parehong pagkakasunud-sunod ng nucleotide at sinira ang DNA sa parehong mga punto, at hindi totoo, kapag ang mga enzyme, na kinikilala ang parehong site sa DNA, ay gumagawa ng mga break sa iba't ibang mga punto sa loob ng parehong site.

Karamihan sa mga class 2 restrictases ay kinikilala ang mga sequence na naglalaman ng mula 4 hanggang 6 na pares ng nucleotide, kaya ang mga restrictases ay nahahati sa small- at large-cut. Kinikilala ng mga small-cutting restriction enzymes ang tetranucleotide at nagpapakilala ng higit pang mga break sa mga molecule kaysa sa large-cutting restriction enzymes na kumikilala sa isang sequence ng anim na pares ng nucleotide. Ito ay dahil sa ang katunayan na ang posibilidad ng paglitaw ng isang tiyak na pagkakasunud-sunod ng apat na nucleotides ay mas mataas kaysa sa pagkakasunud-sunod ng anim na nucleotides. Halimbawa, ang 40,000 bp DNA ng bacteriophage T7 ay walang sequence na kinikilala ng R1 mula sa E. coli.

Kasama sa mga small-splitting restrictases ang Hpa II at Alu (mula sa Arthrobacter luteus), large-splitting - Eco R I (mula sa Escherichia coli) at Hind III. Kung ipagpalagay natin na ang mga restriction enzyme recognition sites ay random na ipinamamahagi sa kahabaan ng DNA chain, kung gayon ang target para sa mga enzyme na kinikilala ang isang sequence (site) ng apat na nucleotides ay dapat mangyari sa average na 1 beses bawat 256 base pairs, at para sa mga enzyme na kinikilala ang anim na nucleotides, pagkatapos 4096 base pairs. Kung ang lugar ng paghihigpit ay nasa loob ng gene, ang paggamot na may DNA restriction enzyme ay hahantong sa hindi aktibo nito. Ang posibilidad ng naturang kaganapan ay napakataas kapag ginagamot sa maliliit na pagputol ng mga paghihigpit at hindi gaanong mahalaga kapag gumagamit ng malalaking-cutting endonucleases. Samakatuwid, upang makakuha ng isang buo na gene, ang cleavage ay isinasagawa nang halili sa pamamagitan ng ilang malalaking pag-cutting restrictases, o ang "underrestriction" na paraan ay ginagamit, i.e. ang paghihigpit ay isinasagawa sa ilalim ng mga kondisyon kung saan ang cleavage ay nangyayari sa isang site lamang.

Ang recombinant DNA ay ipinapasok sa mga cell ng tatanggap. Sa genetic engineering, ang naturang mga cell ng tatanggap ay gumaganap ng dalawang papel. 1. Ginagawa nilang posible na maghanap ng mga clone ng synthesized recombinant DNA sa gene bank. 2 Kasunod nito, maaaring gamitin ang mga naturang recipient cell upang makakuha ng mga target na produkto.

Ang paraan ng pagpapakilala ng recombinant DNA ay isinasaalang-alang batay sa kung anong uri ng vector ang naturang recombinant na DNA ay nakuha at sa mga cell kung saan ang mga organismo ay kinakailangan upang ipakilala ito sa pamamagitan ng pagbabago ng cell o protoplast, o gamit ang electroporation method. Kung ang recombinant DNA ay nakuha batay sa mga phage, maaari itong ipasok sa nakahiwalay na DNA - ito ay transvection. Posibleng ipakilala ang mga buo na particle ng phage - ito ay isang impeksiyon (cosmids, phasmids).

Sinabi ni Dr. pamamaraan ng genetic exchange - conjugation, transduction.

Sa mga selula ng halaman - pagbabago ng mga protoplast ng halaman, paggamot ng mga selula ng halaman o mga tisyu na may recombinant na DNA; malawakang ginagamit ang mga iniksyon ng recombinant DNA sa nucleus; ang paggamit ng liposomes. Ang mga liposome ay mga spherical na istruktura na mayroong isang lipid shell, sa loob nito ay recombinant DNA. Para sa pagpapakilala sa mga selula ng hayop - mga impeksyon sa viral, paraan ng electroporation, microinjections sa nucleus. Kung, pagkatapos ng pagpapakilala ng recombinant DNA, ang lahat ng mga selula sa katawan ay nagmamana nito, kung gayon ang isa ay nagsasalita ng pagkuha ng isang transgenic na organismo.

Electroporation - ang mga cell o protoplast ay nakalantad sa isang mataas na boltahe na kasalukuyang (2000-4000 volts) sa maikling panahon. Bilang resulta, ang mga pores ay nabuo sa cell membrane approx. 30 nm, na maaaring umiral sa loob ng 1-2 minuto at kung saan maaaring makapasok ang recombinant DNA sa cell. Ang mga pores pagkatapos ay magsasara at ang DNA ay nananatili sa cell. Ito ay isang unibersal na paraan.

ballistic na pamamaraan- pangunahing ginagamit sa mga eukaryote. Ang mga ballistic na baril ay ginagamit kung saan ipinapasok ang mga particle ng AK o W, kung saan ini-spray ang recombinant na DNA. Pagkatapos, sa tulong ng mga inert gas sa P, ang mga naturang particle ay pinaputok mula sa baril patungo sa kultura ng cell. Ayon sa iba't ibang mga pattern, ang ilan sa mga particle ay pumapasok sa nucleus at ang recombinant DNA ay nananatili doon.

Maghanap ng mga clone na may recombinant DNA.

Ang yugtong ito ay mahirap at hindi mahuhulaan.

Ang pinakasimpleng paraan ay ang paghahanap ng mga clone ayon sa phenotype pagkatapos ng pagpapakilala ng recombinant DNA(hal. pigmentation). Maaaring gamitin ang mga pagsubok sa komplementasyon, ngunit kinakailangan na magkaroon ng mga mutant cell na may depekto sa synthesis ng aktibong produkto.

Mga pamamaraan ng hybridization - ang pagkakaroon ng partikular na may label na DNA o RNA probes ay kinakailangan. Mas madalas ang mga ito ay may label na P 32. Probes m. maikling oligonucleotide sequence na tumutugma sa pinakakonserbatibong bahagi ng hinanap na gene. Ang mga conserved sequence na ito ay maaaring magsama ng hanggang 100 nucleotides para sa prokaryotes at hanggang 1000 para sa eukaryotes.

Matapos ang pagpapakilala ng recombinant DNA, ang mga kolonya na nabuo sa daluyan ay inililipat sa isang espesyal na filter ng nitrocellulose. Sila ay sumasailalim sa lysis at kasunod na DNA denaturation gamit ang alkali. Ang DNA ay malakas na nagbubuklod sa filter. Ang filter ay hinuhugasan at pinoproseso gamit ang isang radioactive na may label na probe at ang clone kung saan nakipag-ugnayan ang probe na ito ay tinutukoy.

Mga pamamaraan ng immunochemical - ang mga clone pagkatapos ng pagpapakilala ng recombinant DNA ay lysed at ginagamot sa mga antibodies sa kaukulang produkto. Ang mga antibodies na ito ay may label.

Ang proseso ng pagpasok ng recombinant DNA sa isang bacterial cell ay tinatawag pagbabagong-anyo. Ang resulta ng pagbabago ay ang pagkuha ng host cell ng mga bagong sequence ng DNA at, dahil dito, ang mga bagong phenotypic na katangian, halimbawa, paglaban sa ilang mga antibiotics. Ang host cell na ginamit sa naturang mga eksperimento ay dapat na may partikular na phenotype, sa partikular r-, ibig sabihin. hindi ito dapat maglaman ng mga restriction enzymes; ito ay dapat na hindi kaya ng pangkalahatang recombination ( recA-) upang ang exogenous DNA ay hindi mabago ng homologous recombination. Ang isa sa mga pinaka-tinatanggap na ginagamit na kultura para sa layuning ito ay isang laboratoryo strain ng bakterya. E.coli- strain K12.

Ang mga cell na maaaring sumipsip ng dayuhang DNA ay tinatawag may kakayahan. Kakayahan E. coli ito ay kinakailangan upang ibuyo, at ang ilang iba pang mga bakterya ay may ganitong katangian sa simula. Ang proporsyon ng mga karampatang selula ay maaaring tumaas gamit ang isang espesyal na nutrient medium o mga kondisyon ng kultura. Para sa bacteria na lumalaban sa mga kemikal na inducers ng kakayahan o kulang sa natural na kakayahan, iba pang mga sistema ng paghahatid ng DNA ang ginagamit.

Ang pinakakaraniwang ginagamit na mga pamamaraan para sa pagbabago ng mga selula ng bakterya sa pagsasanay sa laboratoryo ay:

Pagbabago E.coli sa pamamagitan ng paggamot na may calcium chloride;

electroporation– pagtaas sa cell permeability sa ilalim ng impluwensya ng kasalukuyang pulso na may tagal na ~4.5 ms;

Ang mga resulta ng pagbabago ay maaaring mabilang: sa pamamagitan ng pagtukoy sa alinman dalas, o kahusayan mga pagbabagong-anyo.

Dalas ng pagbabago ay ang proporsyon ng mga selula sa populasyon ng cell na nakatanggap ng dayuhang DNA; ipinahayag bilang bilang ng mga transformant sa kabuuang bilang ng mga cell.

Episyente ng pagbabago- bilang ng mga transformant bawat 1 µg ng DNA na kinuha para sa pagbabago.

Ang impormasyon sa pag-clone ng recombinant na DNA gamit ang pBR322 plasmid vector na ipinakita sa seksyong ito ay buod sa anyo ng isang eksperimentong pamamaraan at ipinakita sa Figure 20.

kanin. 20. Pag-clone ng DNA sa plasmid vector pBR322

1, 2, 3, 4 at 5 - mga yugto ng pamamaraan ng pag-clone (tingnan ang teksto).

1. Ang pBR322 DNA ay pinutol na may restriction na endonuclease PstI sa lugar na lumalaban sa ampicillin.

2. Ang mga fragment ng donor DNA, na nakuha din gamit ang PstI at may mga malagkit na dulo, tulad ng linearized na pBR322 vector, ay pinagkakabitan ng vector DNA gamit ang DNA ligase. Ang kinahinatnan ng pagbuo ng naturang konstruksyon ay ang pagkasira ng gene na nagbibigay ng paglaban sa ampicillin. Kaya, ang nilikha recombinant DNA, kapag ipinakilala sa mga cell E.coli ay hindi masisiguro ang kanilang kaligtasan sa daluyan na may ampicillin.

3. Mga cell E.coli pagbabago sa recombinant DNA.

4. Pagkatapos ng pamamaraan ng pagbabagong-anyo, ang cell suspension ay nilagyan ng mga agar plate at nutrient medium na naglalaman ng antibiotic tetracycline. Sa yugtong ito, nangyayari ang pagpili, i.e. pagpili ng mga cell na maaaring lumaki sa isang medium na may tetracycline. Ang mga cell na lumaki sa agar na ito ay naglalaman ng recombinant na DNA at pBR322 DNA, na hindi isinama ang donor DNA insert; naibalik ang orihinal na istraktura ng vector.

5. Mga indibidwal na kolonya ng cell E.coli lumaki sa isang tasa na may tetracycline subculture dalawang tasa sa mga tasa, ang isa ay naglalaman ng agar na may ampicillin, at ang pangalawa ay may tetracycline. Ang mga cell na naglalaman ng recombinant plasmid DNA ay lumalaki lamang sa tetracycline agar, dahil ang gene na nagbibigay ng paglaban sa ampicillin ay nasisira dahil sa pagpasok ng donor DNA. Habang ang mga cell mula sa orihinal, i.e. ng nakuhang pBR322 vector DNA ay lumalaki sa parehong mga plato, dahil ang mga gene para sa paglaban sa parehong antibiotics ay nasa katutubong, i.e. sa orihinal na kondisyon.

Mula sa mga cell ng mga napiling clone E.coli kunin ang plasmid DNA at pag-aralan ang istraktura nito.

Iba pang mga plasmid vectors

Ang panahon ng pBR322 vector, na sinimulan nina Bolivar at Rodriguez sa pinakadulo simula ng 1980s, ay nagpapatuloy hanggang ngayon. Gayunpaman, para sa lahat ng pagiging maaasahan at klasikong pagsunod nito sa lahat ng mga kinakailangan para sa mga vector, ang vector na ito ay mayroon lamang ilang mga maginhawang site para sa pag-clone. Bilang karagdagan, ang pagpili ng mga nabagong selula sa mga eksperimento na may recombinant na DNA batay dito ay tumatagal ng mahabang panahon. Nagkaroon ng pangangailangan upang bumuo ng alternatibo, mas advanced, cloning system. Kaya, nilikha ang isang pangkat ng mga vectors ng pamilya ng pUC. Sa pangalan ng mga vector ng pamilyang ito, ang mga titik na "U" at "C" ay ang mga unang titik mula sa mga salita Unibersidad ng California. Ang mga mananaliksik ng unibersidad na ito ay lumikha ng isang serye ng mga vector na may mahalagang katangian - ang presensya sa istruktura ng DNA ng isang pinagsamang sintetikong polylinker, na isang nucleotide sequence na binubuo ng mga recognition site para sa ilang restriction endonucleases na natatangi sa vector na ito - MCS (Multiple Cloning Sites). Ang mga pangalan ng mga indibidwal na vector mula sa pamilya ng pUC ay naiiba sa pamamagitan ng isang dalawang-digit na numero, at ang pangunahing istraktura ng iba't ibang mga vector ay naiiba sa komposisyon ng mga MCS site MCS - Maramihang Cloning Site sa isang polylinker.

Isaalang-alang natin nang mas detalyado ang mga tampok ng mga vector na kasama sa pangkat na ito, gamit ang pUC19 vector bilang isang halimbawa (Larawan 21).

Ang plasmid pUC19 ay 2686 bp ang haba. at naglalaman ng: ampicillin resistance gene; regulated segment ng β-galactosidase gene (lacZ") lactose operon E. coli gene lacI, coding repressor na kumokontrol sa expression ng gene lacZ"; polylinker - isang maikling sequence na may maraming natatanging site ng pagkilala para sa mga endonucleases (EcoRI, SacI, KrpI, XmaI, SmaI, BamHI, XbaI, SalI, HincII, AccI, BspMI, PstI, SphI at HindIII); pinagmulan ng pagtitiklop ng ColE1 plasmid.

kanin. 21. Plasmid vector pUC19

Ang mapa ay ipinaliwanag sa teksto.

Ang presensya sa pUC19 plasmid ng isang gene na nagbibigay ng resistensya sa ampicillin ay ginagawang posible na pumili ng E. coli clones na naglalaman ng vector na ito o recombinant na DNA batay dito sa nutrient media na may antibiotic na ito. Ang nasabing mga modular na elemento ng istraktura ng itinuturing na vector bilang lacZ", lacI at ginagawang posible ng MCS na mapabilis at paigtingin ang pagpili ng mga clone na may recombinant na DNA.

Kung ang mga cell na naglalaman ng hindi nabagong pUC19 plasmid ay lumaki sa pagkakaroon ng isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG), na isang inducer kulang- operon, pagkatapos ay ang produkto ng gene lacI, tinatawag na panunupil, ay hindi makakagapos sa promoter-operator na rehiyon ng gene lacZ", at bilang resulta, magaganap ang transkripsyon at pagsasalin ng plasmid fragment ng gene lacZ". Ang produkto ng fragment na ito ay magbubuklod sa isang protina na naka-encode ng chromosomal DNA ( α-complementation), at bilang resulta, nabuo ang aktibong ß-galactosidase. Ang isang sequence na may maraming restriction site (polylinker) ay ipinasok sa isang gene lacZ" upang hindi ito makaapekto sa produksyon ng functional β-galactosidase, at kung ang substrate nito 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) ay naroroon sa medium, kung gayon ito ay magiging hydrolyzed sa ilalim ng pagkilos ng enzyme na ito upang makabuo ng isang asul na produkto na nagbahiran ng mga kolonya ng mga cell na naglalaman ng hindi nabago, i.e. nang walang pagpasok ng dayuhang DNA, pUC19 plasmid (Larawan 22).

kanin. 22. Ang pagkakasunud-sunod ng mga pamamaraan ng pag-clone ng DNA sa pUC19 vector.

1, 2, 3 at 4 - mga yugto ng pag-clone (tingnan ang teksto)

1. Ang donor DNA ay ginagamot gamit ang isa sa mga restriction endonucleases kung saan mayroong isang site sa polylinker. Ang pUC19 vector DNA ay ginagamot ng parehong enzyme

2. Ligation ng linearized vector at ipasok na may T4 DNA ligase.

3. Pagkatapos ng pamamaraan ng ligation na may pinaghalong incubation, ang mga cell na may kakayahang α-complementation ay nababago, na maaaring synthesize ang bahaging iyon ng ß-galactosidase (LacZα), na konektado sa gene product lacZ" sa pagbuo ng isang aktibong enzyme.

4. Ang ginagamot na mga cell ay ibinuhos sa isang nutrient medium na may ampicillin, IPTG at isang substrate para sa ß-galactosidase. Ang mga non-transformed na selula ay hindi maaaring lumaki sa pagkakaroon ng ampicillin, at ang mga selulang nagdadala ng buo na plasmid ay bumubuo ng mga asul na kolonya sa daluyan na may ampicillin. Mga host cell na nagdadala ng hybrid, i.e. recombinant, plasmid, bumubuo ng mga puting kolonya sa parehong daluyan. Ito ay dahil sa ang katunayan na kadalasan kapag ang isang dayuhang DNA ay ipinasok sa isang polylinker, ang isang kumpletong produkto ng gene ay hindi maaaring mabuo. lacZ", at, dahil dito, sa proseso ng α-complementation, ang aktibong ß-galactosidase ay hindi nabubuo, na humahati sa X-Gal substrate sa isang produkto na nagbibigay ng asul na paglamlam ng mga selula ng kolonya.

Mga vector batay sa bacteriophage λ

Ginagawang posible ng mga plasmid vector na i-clone ang mga fragment ng DNA na ang laki ay hindi lalampas sa 10 kb. Gayunpaman, upang malutas ang problema ng pag-clone ng chromosomal DNA ng kahit na isang maliit na organismo, halimbawa, isang bacterium, kinakailangan upang lumikha ng mga kumpletong koleksyon ng mga fragment ng DNA na ito; samakatuwid, madalas na kinakailangan upang gumana sa mas malalaking fragment. Para dito, ang mga vectors batay sa bacteriophage λ E. coli.

Kapag ang phage λ ay tumagos sa E. coli cells. Mayroong dalawang alternatibong landas para sa pagbuo ng mga kaganapan:

1. lytic cycle- ang phage ay nagsisimulang dumami nang aktibo at pagkatapos ng humigit-kumulang 20 minuto ang cell ay nawasak sa paglabas ng hanggang 100 bagong phage particle.

2. Ang estado ng lysogeny– Ang Phage DNA ay kasama sa E. coli chromosome bilang prophage at umuulit sa cell kasama ng mga normal na bacterial cell. Gayunpaman, sa ilalim ng masamang kondisyon (kakulangan ng nutrisyon), magsisimula ang lytic cycle (Larawan 23):

1. Sa panahon ng pagtitiklop ng bacteriophage λ cDNA, nabuo ang isang linear na molekula, na binubuo ng paulit-ulit na mga segment na humigit-kumulang 50 kb ang haba. Ang bawat isa sa mga segment na ito ay full-length na phage DNA na nasa gilid ng malagkit cos-sites - single-stranded 5 "-"tails" ng 12 nucleotides. Tinatawag silang malagkit ( cos) ay nagtatapos dahil magkatugma ang mga ito at maaaring ipares sa isa't isa tulad ng malagkit na dulo ng mga fragment ng paghihigpit.

2. Ang phage head ay naglalaman ng isang ganoong segment, pagkatapos ay ang naka-assemble na proseso ay naka-attach sa ulo.

kanin. 23. Lytic pathway ng pag-unlad ng bacteriophage λ

1 - packaging sa phage head ng isang segment ng full-length na phage DNA; 2 - pagpupulong ng isang ganap na particle ng phage.

Ang sukat ng DNA ng phage λ ay humigit-kumulang 50 kb, at isang makabuluhang bahagi nito (mga 20 kb) ay hindi mahalaga para sa pagpaparami ng phage at responsable para sa pagsasama nito sa host DNA. Kaugnay nito, lumitaw ang ideya na maaari itong mapalitan ng isang fragment ng isa pang DNA na may katumbas na laki. Ang magreresultang recombinant molecule ay magre-replika sa cell bilang DNA ng isang "recombinant" phage na "pumasok" sa lytic path ng pag-unlad. Ang mga recombinant molecule ay nakabalot sa bacteriophage λ heads sa vitro at pagkatapos idagdag ang mga proseso, ang mga nakakahawang particle ng phage ay nakuha (Larawan 24).

kanin. 24. Paggamit ng λ-phage vectors para sa pag-clone ng mga fragment ng DHA sa mga cell E. coli.

Ang paghahanda ng mga extract para sa in vitro packaging ng phage λ DNA ay isinasagawa gamit ang dalawang strain E.coli, bawat isa ay lysogenic laban sa isang tiyak na mutant strain ng phage λ (Larawan 25). Ang isa sa mga mutant ay hindi makapag-synthesize ng protina A (isa sa phage terminase polypeptides), ang isa ay hindi makapag-synthesize ng protina E (isang phage head protein). Pareho sa mga protina na ito ay kinakailangan para sa packaging ng phage λ DNA. Ang "A"- at "E" -na mga extract ay pinaghalo at ang concatemeric ay idinagdag (mga segment ng full-length phage DNA polymerized ayon sa cos-sites) phage DNA na nagbubuklod upang wakasan bago ito maputol cos mga site at nakabalot sa mga phage head.

kanin. 25. Pag-iimpake sa vitro Phage λ DNA

Kapag nag-iimpake ng isang molekula ng DNA na may haba na mas mababa sa 38 kb. isang non-infectious phage particle ay nakuha, at mga fragment na may haba na higit sa 52 tonelada, b.p. hindi kasya sa ulo. Mga segment na 50 kb ang haba. sa isang linear na molekula ng DNA, ang mga ito ay pinaghihiwalay ng mga site ng cos, at sa mga site na ito ay pinuputol ang molekula kapag napuno ng susunod na segment ang ulo. Ang pagputol ay isinasagawa ng isang enzyme na matatagpuan sa pasukan sa ulo.

Ang proseso ng pagpapakilala ng recombinant phage DNA na may naka-embed na fragment ng dayuhang genetic na impormasyon sa mga cell ng tatanggap ay batay sa isang natural na phenomenon - phage DNA transduction.

transduction(lat. transduction- paggalaw) ay ang proseso ng paglilipat ng bacterial DNA mula sa isang cell patungo sa isa pa sa pamamagitan ng isang bacteriophage. Kaya, ang pagbabagong-anyo ng mga bacterial cell gamit ang recombinant DNA batay sa phage DNA ay hindi nangangailangan ng espesyal na paghahanda ng mga cell ng tatanggap o anumang espesyal na instrumentasyon.

Ang molecular hybridization at immunological screening na mga pamamaraan ay ginagamit upang maghanap ng mga cell na naglalaman ng mga phage na may recombinant na DNA, na tatalakayin sa susunod na seksyon.

Ang imbensyon ay nauugnay sa larangan ng biotechnology, partikular sa isang paraan para sa naka-target na paghahatid ng DNA sa mga tumor at stem cell na nagpapahayag ng CXCR4 receptor. Ang kasalukuyang imbensyon ay maaaring gamitin para sa naka-target na paghahatid ng mga genetic construct sa stem at malignant na mga tumor cell upang itama ang mga depekto ng gene at maiwasan ang mga sakit. Kasama sa pamamaraan ang paghahanda ng mga carrier ng genetic constructs sa pamamagitan ng pagsasama ng mga sequence ng signal sa komposisyon ng mga molecule ng carrier, na isang DNA-binding sequence ng walong amino acid residues ng lysine - KKKKKKKKK. Ang attachment ng sequence ng signal sa DNA-binding sequence ay isinasagawa gamit ang isang linker section ng dalawang molekula ng ε-aminohexanoic acid. Pagkatapos nito, nabuo ang mga DNA/carrier complex. Pagkatapos ang paglipat ay isinasagawa sa vitro. Ginagawang posible ng iminungkahing imbensyon na mapataas ang kahusayan ng paghahatid ng gene na interesado sa mga tumor at stem cell. 2 w.p. f-ly, 4 na may sakit.

Ang imbensyon ay nauugnay sa gene medicine, gene therapy, biotechnology at pharmaceuticals at maaaring gamitin para sa naka-target na paghahatid ng mga genetic construct sa stem at malignant na mga tumor cell upang maitama ang mga depekto ng gene at maiwasan ang mga sakit. Ang paghahatid ng tukoy sa tissue ng mga gene construct ay sinisiguro sa pamamagitan ng paggamit ng mga sequence ng signal para sa CXCR4 receptor, na ipinahayag sa mga cell ng ganitong uri.

Ang pinagkaiba ng gene therapy mula sa conventional medicine approach ay ang pagtutok nito sa paglaban sa sanhi ng sakit, sa halip na sa mga sintomas at kahihinatnan. Ang mga diskarte sa gene therapy upang gamutin o maiwasan ang isang malawak na hanay ng mga sakit ng tao ay kasalukuyang binuo. Ang mga pamamaraang ito ay maaaring naaangkop sa in vivo at ex vivo therapy. Ang in vivo therapy ay batay sa direktang pagpapakilala ng mga genetic construct nang direkta sa mga tisyu ng katawan. Ang paghahatid ay maaaring gawin sa intravenously gamit ang mga aerosol dispenser o iniksyon sa mga partikular na tisyu. Ang ex vivo gene therapy ay batay sa paghihiwalay ng isang partikular na uri ng mga cell mula sa katawan, ang pagpapakilala ng isang "therapeutic" gene construct sa mga ito, ang pagpili ng mga inilipat na cell, at ang kasunod na reimplantation sa isang pasyente.

Mayroong tatlong pangunahing direksyon sa kasalukuyang binuo na mga diskarte sa paghahatid ng mga genetic na konstruksyon:

1) pag-clone bilang bahagi ng mga viral vector;

2) paggamit ng mga pisikal na paraan ng paglipat;

3) ang paggamit ng mga complex ng plasmid expression vectors at non-viral carrier molecules.

Ang virus-mediated transfer ay isang napakahusay na paraan para sa paghahatid ng DNA sa mga target na cell, dahil ang pagpasok ng isang binagong viral vector ay katulad ng proseso na natural na nangyayari kapag ang genome ng virus ay inilipat sa mga host cell. Ang pinaka-pinag-aralan ay mga vector na nilikha batay sa retro-, adeno-, adeno-associated na mga virus. Kabilang sa mga bentahe ng mga virus, una sa lahat, ang kumbinasyon ng mga katangian ng expression na vector at ang carrier, ang posibilidad ng tiyak na paghahatid, ang kakayahang maglipat ng naghahati at hindi naghahati na mga cell, ang posibilidad ng pag-embed ng DNA sa chromosome upang matiyak pangmatagalang pagpapahayag. Dahil sa mga kalamangan na ito, ang pamamaraang ito ay malawakang ginagamit sa mga pag-aaral sa paghahatid ng gene, bagama't mayroon itong ilang mga disadvantages. Ang mga virus na nauugnay sa retro at adeno ay may limitadong laki ng naka-clone na fragment ng DNA at ang panganib ng insertional mutagenesis kapag ang virus ay ipinasok sa host genome. Ang isang malubhang kawalan ng adenoviral vectors ay isang binibigkas na immune response sa mataas na dosis at paulit-ulit na pag-iniksyon ng mga adenoviral constructs (Walther W., Stein U. Viral vectors para sa paglilipat ng gene: isang pagsusuri ng kanilang paggamit sa paggamot ng sakit ng tao // Gamot. - 2000. - v. 60. - P. 249-271, RF patent No. 2252255, C12N 15/37, C12N 15/86, C12N 15/861, C12N 15/867, na-publish 2005.05.20).

Ang pag-iniksyon ng mga hubad na plasmid DNA construct ay isa sa mga unang diskarte sa pagbuo ng mga diskarte sa paggamot sa gene therapy. Ang mababang kahusayan ng paglipat gamit ang "hubad" na DNA ay nagbigay ng lakas sa pagbuo ng mga bagong pamamaraan para sa paghahatid ng mga genetic na konstruksyon. Ang iba't ibang pisikal na pamamaraan para sa paghahatid ng DNA sa mga selula ng katawan ay pinag-aralan. Ang pinakasikat sa kanila ay ang paraan ng ballistic transfection at electroporation, na malawakang ginagamit para sa paglipat ng mga selula ng balat at kalamnan. Ang paraan ng ballistic transfection ay batay sa pagtagos sa cell ng DNA na idineposito sa ginto o tungsten microparticle. Ang paglipat ay nangyayari sa ilalim ng presyon ng isang stream ng naka-compress na gas o likido. Ang pamamaraan ng electroporation ay batay sa isang lokal na pagbabago sa potensyal na elektrikal ng lamad ng cell dahil sa pagkilos ng isang electric current. Ang mga electrical impulses ay humahantong sa pagbuo ng mga pores sa lamad ng cell, sa gayon ginagawa itong natatagusan sa biomolecules. Upang malampasan ang mababang kahusayan ng hubad na paglipat ng DNA sa vivo, ginagamit din ang hydrodynamic shock method - intravenous o intra-arterial injection ng isang plasmid vector sa isang malaking volume na solusyon. Ang mga pangunahing disadvantage ng mga umiiral na pisikal na pamamaraan ng paglipat ay ang mababang kahusayan at lokalidad ng epekto ng paghahatid ng DNA. Pinapayagan nila ang plasmid na pagtagumpayan ang lamad ng cell at maiwasan ang pagsasama sa mga endosom, kaya pinipigilan ang pagkasira ng enzymatic, ngunit, bilang isang panuntunan, ay hindi nagbibigay ng pangmatagalang pagtitiyaga ng ipinakilala na genetic constructs (Wells D.J. Gene therapy progress and prospects: electroporation at iba pa pisikal na pamamaraan // Gene Ther. - 2004. - v.11, No. 18. - P.1363-1369; Wang S., Joshi S, Lu S. Paghahatid ng DNA sa balat sa pamamagitan ng particle bombardment // Methods Mol Biol. - 2004. - v.245. - P.185-196; Herweijer H., Wolff J.A. Pag-unlad at mga prospect: hubad na DNA gene transfer at therapy // Gene therapy. - 2003. - v.10, No. 6. - P .453-458).

Ang mga non-viral carriers ay isang alternatibo sa virus-mediated transfer ng genetic constructs sa mammalian cells. Ang mga di-viral na carrier ay madaling na-synthesize, ang kadalian ng kanilang pagbabago ay ginagawang posible na gumawa ng mga pagbabago sa istraktura at komposisyon ng mga molekula, sa gayon ay nagpapabuti sa paraan ng paghahatid. Kapag gumagamit ng non-viral na media, walang mga paghihigpit sa laki ng naihatid na expression vector. Bilang karagdagan, ang mga ito ay hindi gaanong nakakalason, sa karamihan ng mga kaso ay hindi nagiging sanhi ng isang partikular na immune response, at mas ligtas na gamitin sa vivo kaysa sa mga viral vector. Samakatuwid, ang pagpapakilala ng isang genetic construct na nakabalot sa mga di-viral na carrier ay maaaring ulitin. Ang pag-aaral ng mga di-viral na carrier ay umuunlad sa direksyon ng pagpapabuti ng mga katangian ng paglipat ng plasmid DNA sa pamamagitan ng pagbuo ng mga DNA complex na may iba't ibang sintetikong compound (lipids, oligo- at polypeptides, polymers, atbp.) (halimbawa, RF patent No. 2336090 , A61K 39/00, A61K 47/00, na-publish noong 2008.10.20). Ang pagpapabuti ng mga hindi viral na sasakyan sa paghahatid ay higit na nakasalalay sa isang detalyadong pag-unawa sa mga hadlang sa pagpasok ng DNA sa mga selula ng katawan (Schmidt-Wolf G.D., Schmidt-Wolf I.G. Non-viral at hybrid na mga vector sa human gene therapy: isang update // Trends Mol Med. - 2003. - v.9, No. 2. - P.67-72; Gardlic R, Palffy R, Hodosy J., Turna J., Celec P. Mga vector at delivery system sa gene therapy // Med Sci Monit . - 2005. - v .11, No. 4. - P.110-121; Wiethoff C.M., Middaugh C.R. Mga hadlang sa paghahatid ng nonviral gene // J Pharm Sci. - 2003. - v.92, No. 2. - P .203-217).

Ito ay pinaniniwalaan na ang isang non-viral carrier ay dapat magkaroon ng mga sumusunod na katangian:

1) maging non-toxic, compact at protektahan ang plasmid DNA mula sa enzymatic degradation, ma-excreted mula sa katawan pagkatapos gamitin;

2) tiyakin ang pagtagos ng plasmid sa cell sa pamamagitan ng tiyak na pagbubuklod sa plasma membrane ng cell:

3) may kakayahang maglabas ng DNA mula sa endosomal compartment;

tiyakin ang dissociation ng DNA mula sa complex para sa kasunod na transportasyon ng plasmid sa nucleus.

Para sa mga layunin ng gene therapy, ang pinakagustong paraan ng paghahatid ng mga genetic na konstruksyon ay ang kanilang paglipat na tukoy sa tissue sa mga selula at tisyu ng katawan.

Ang unang hadlang sa intracellular penetration ng mga complex ay ang plasma membrane. Karamihan sa mga complex ay nakikipag-ugnayan sa ibabaw ng cell gamit ang mga puwersang electrostatic. Ang isang posibleng mekanismo para sa pagbubuklod ng mga complex sa cell ay ang kanilang pakikipag-ugnayan sa mga protina sa ibabaw ng cell, glycosaminoglycans. Gayunpaman, sa mekanismong ito ng pagtagos ng mga complex, walang paglilipat na tukoy sa tisyu ng mga konstruksyon ng gene. Kasabay nito, ang problema ng paghahatid ng tukoy na tissue ng mga genetic construct ay may kaugnayan para sa gene therapy para sa isang bilang ng mga sakit. Para sa partikular na pakikipag-ugnayan sa ibabaw ng cell, ang mga complex ay kinabibilangan ng mga ligand sa mga receptor sa ibabaw ng cell. Sa ngayon, ang isang bilang ng mga integrin peptide ligand ay nailalarawan. Kabilang dito, sa partikular, ang tripeptide fragment RGD (ang mga integrin ay naroroon sa ibabaw ng maraming mga cell), transferrin (ang receptor nito ay may mas mataas na expression sa proliferating cells), asialorosomucoid (asialoglycoprotein receptor ay may isang tiyak na expression sa hepatocytes ng atay).

Para sa partikular na paghahatid ng genetic material sa mga nerve cell, iminungkahi ni Zeng at ng mga kasamahan ang paggamit ng carrier na binubuo ng signal region sa TrkA receptor (80-108 amino acids mula sa nerve growth factor) at isang DNA-binding sequence ng 10 lysine amino acid residues. . Ang carrier na ito, sa pagkakaroon ng endosomolytic agent chloroquine, na nagpapadali sa pagpapalabas ng mga complex mula sa endosomal compartment ng cell, ay nakapaghatid ng tissue-partikular na naghahatid ng marker gene lamang sa mga cell na nagpapahayag ng TrkA receptor. Maaaring gamitin ang carrier na ito para sa gene therapy na paggamot ng iba't ibang sakit sa neurological tulad ng epilepsy, Parkinson's at Alzheimer's disease. Gayunpaman, hindi ito angkop para sa paghahatid ng genetic na materyal sa iba pang mga uri ng cell (Zeng J, Too HP, Ma Y, Luo E, Wang SA synthetic peptide na naglalaman ng loop 4 ng nerve growth factor para sa target na paghahatid ng gene // J Gene Med 2004; 6 : 1247 -1256).

Ang mga stem cell ng tao ay itinuturing na mga promising agent para sa cell at gene therapy para sa iba't ibang sakit ng tao. Kasabay nito, sila ay kabilang sa mga pinakamahirap na ilipat ang mga uri ng cell. Sa paggamot ng gene therapy ng kanser, kinakailangan upang matiyak ang paghahatid ng mga gene nang direkta sa mga selula ng tumor.

Ang CXCR4 ay isang stem cell migration factor receptor para sa chemokine SDF-1α. Ang CXCR4 ay ipinahayag sa mga hematopoietic na selula, vascular endothelium, at mga selula ng satellite ng kalamnan. Ang isang mataas na antas ng pagpapahayag ng gene na ito ay nabanggit sa higit sa 20 uri ng mga cancerous na tumor (kanser sa suso, kanser sa prostate, atbp.), pati na rin sa paglipat ng mga stem cell. Ang CXCR4 receptor ay nagagawa ring magbigkis sa viral chemokine vMIP-II (Kaposi's sarcoma virus). Kaya, ang pagsasama ng mga pagkakasunud-sunod ng signal para sa pagbubuklod sa CXCR4 receptor sa mga molekula ng carrier ay isang promising na paraan upang lumikha ng mga sistema para sa naka-target na paghahatid ng gene sa mga tumor at stem cell.

Para maghatid ng genetic material sa mga cell na nagpapahayag ng CXCR4 receptor, gumamit si Le Bon at mga kasamahan ng synthetic ligand para sa receptor na ito, AMD3100, na isinama sa polyethyleneimine o cationic lipids. Ang mga complex ng genetic na materyal na may mga compound na ito ay hindi humantong sa isang makabuluhang pagtaas sa kahusayan ng paghahatid ng marker gene sa mga CXCR4+ cells kumpara sa mga compound na walang signal. Ang mga carrier na ginamit ng Le Bon ay hindi epektibo, dahil ang partikular na paghahatid sa kanilang tulong ay posible lamang kapag ang isang sangkap na nagtataguyod ng internalization ng CXCR4 receptor (phorbol ester) ay idinagdag sa transfection medium. (Le Bon B, Van Craynest N, Daoudi JM, Di Giorgio C, Domb AJ, Vierling P. AMD3100 Conjugates bilang Mga Bahagi ng Target na Nonviral Gene Delivery System: Synthesis at in Vitro Transfection Efficiency ng CXCR4-Expressing Cells. // Bioconjugate Chem 2004 , 15: 413-423).

Kaya, may pangangailangan na lumikha ng carrier ng genetic constructs na maaaring magbigay ng partikular na paghahatid sa CXCR4(+) cells at hindi makakaapekto sa mga kalapit na tissue. Ang ganitong paraan ay ibinigay ng kasalukuyang imbensyon.

Ang imbensyon ay batay sa gawain ng pagbuo ng isang paraan para sa tiyak na paghahatid ng mga genetic construct sa mga cell na nagpapahayag ng CXCR4 receptor, kung saan, sa pamamagitan ng paggamit ng mga carrier ng genetic constructs na naglalaman ng mga sequence ng signal para sa CXCR4 receptor, isang pagtaas sa kahusayan ng paghahatid ng ang "interes" na gene ay nakamit. Mahalagang tandaan na ang synthesis ng mga sinasabing carrier ay maaaring isagawa gamit ang alinman sa mga kilalang pamamaraan ng solid-phase peptide synthesis.

Ang solusyon ng teknikal na problema ay ibinibigay ng katotohanan na sa paraan ng naka-target na paghahatid ng DNA sa mga tumor at stem cell na nagpapahayag ng CXCR4 receptor, kabilang ang paghahanda ng mga carrier ng genetic constructs sa pamamagitan ng pagsasama sa komposisyon ng mga molekula ng carrier, na kung saan ay isang DNA-binding sequence ng walong lysine amino acid residues - KKKKKKKK, signal sequence, ang pagbuo ng DNA/carrier complexes, nagsasagawa ng transfection in vitro, ang signal sequence ay pinili mula sa grupo: isang fragment mula 1 hanggang 8 amino acids ng pagkakasunud-sunod ng N-terminus ng protina ng SDF-1α - KPVSLSYR; isang fragment mula 1 hanggang 17 amino acids ng sequence ng N-terminus ng SDF-1α protein - KPVSLSYRCPCRFFESH, kung saan 9 at 11 amino acids ay pinalitan ng serine; o isang fragment mula 1 hanggang 10 amino acids ng N-terminal sequence ng viral chemokine vMIP-II - LGASWHRPDK; ang attachment ng sequence ng signal sa DNA-binding sequence ay isinasagawa gamit ang isang linker site ng dalawang molekula ng ε-aminohexanoic acid.

Sa kasong ito, ang sequence ng signal ay maaaring isang fragment mula sa amino acids 1 hanggang 8 ng sequence ng N-terminus ng SDF-1α-KPVSLSYR protein.

Bilang kahalili, ang sequence ng signal ay maaaring isang fragment mula sa amino acids 1 hanggang 17 ng N-terminal sequence ng SDF-1α protein - KPVSLSYRCPCRFFESH, kung saan ang mga amino acid 9 at 11 ay pinapalitan ng serine.

Ang isang fragment mula sa amino acids 1 hanggang 10 ng N-terminal sequence ng viral chemokine vMIP-II - LGASWHRPDK, na synthesize mula sa D-amino acids, ay maaari ding gamitin bilang signal region.

Maaaring gamitin ang gliserol o chloroquine bilang isang sangkap na nagbibigay ng paglabas mula sa mga endosom ng mga complex na binubuo ng mga carrier at genetic na materyal.

Ang plasmid DNA ay maaaring gamitin bilang genetic material para sa mga carrier.

Ang tinukoy na teknikal na resulta sa kasalukuyang imbensyon ay nakakamit sa pamamagitan ng paggamit ng oligolysin molecules - KKKKKKKK (K8) conjugated na may signal sequence sa CXCR4 receptor mula sa SDF-1 o vMIP-II na mga protina, katulad ng N-terminal sequence ng SDF-1 chemokine (na may 1 hanggang 8 aa) o ang N-terminal sequence ng SDF-1 chemokine (mula 1 hanggang 17 aa, na may kapalit na 9 at 11 aa na may serine) o ang N-terminal sequence ng vMIP-II viral chemokine (mula 1 hanggang 10 aa sa D-conformation ). Ang pagkakaroon ng oligolysin KKKKKKKK sa komposisyon ng carrier ay nagpapahintulot sa mga conjugates na bumuo ng mga complex na may mga nucleic acid, lalo na sa plasmid DNA, dahil sa electrostatic interaction.

Ang tinukoy na teknikal na resulta ay nakakamit ng tatlong variant ng iminungkahing media.

Ang tinukoy na teknikal na resulta ayon sa unang variant ay nakamit sa pamamagitan ng katotohanan na sa maikling carrier ng CDP batay sa mga sintetikong analogue ng SDF-1 chemokine, na kinabibilangan ng isang cationic component, na K8 oligolysin, na ginagamit upang i-condense ang plasmid DNA, at isang sangkap ng ligand para sa pakikipag-ugnayan sa CXCR4 receptor, alinsunod sa ayon sa imbensyon, isang fragment (1-8 aa) ng pagkakasunud-sunod ng N-terminus ng SDF-1 na protina, na may istraktura na KPVSLSYR at pagkakaroon ng aktibidad ng mga agonist ng CXCR4 receptor, ay ginagamit bilang isang ligand component, at ang cationic component ng conjugate ay may istraktura KKKKKKKK at naka-attach sa ligand component sa pamamagitan ng spacer - dalawang molekula ε-aminohexanoic acid (Ahx).

Ang tinukoy na teknikal na resulta ayon sa pangalawang variant ay nakamit sa pamamagitan ng katotohanan na sa carrier (mahabang CDP) batay sa synthetic analogues ng SDF-1 chemokine, na kinabibilangan ng isang cationic component, na K8 oligolysin na ginagamit para sa plasmid DNA condensation, at isang sangkap ng ligand para sa pakikipag-ugnayan sa CXCR4 receptor, alinsunod sa inaangkin na imbensyon, isang fragment (1-17 aa; aa9 at aa11 na pinalitan ng serine) ng sequence ng N-terminus ng SDF-1 na protina, na mayroong istraktura KPVSLSYRSPSRFFESH at pagkakaroon ng aktibidad ng mga agonist ng CXCR4 receptor, ay ginagamit bilang isang ligand component, at ang cationic component ng conjugate ay may istraktura KKKKKKKK at naka-attach sa ligand component sa pamamagitan ng isang spacer - dalawang molekula ng ε-aminohexanoic acid.

Ang tinukoy na teknikal na resulta ayon sa ikatlong variant ay nakamit sa pamamagitan ng katotohanan na sa carrier (viral CDP) batay sa synthetic analogs ng protina ng Kaposi sarcoma virus vMIP-II, na kinabibilangan ng isang cationic component, na K8 oligolysin, ginamit. upang paikliin ang plasmid DNA, at isang bahagi ng ligand para sa pakikipag-ugnayan sa receptor na CXCR4, alinsunod sa inaangkin na imbensyon, isang fragment (1-10 Daa - synthesize mula sa D-amino acids) ng pagkakasunud-sunod ng N-terminus ng vMIP- II protina, na may istrakturang LGASWHRPDK at pagkakaroon ng aktibidad ng mga antagonist ng CXCR4 receptor, ay ginagamit bilang isang ligand component, at ang cationic component ng conjugate ay may istraktura KKKKKKKKK at nakakabit sa ligand component sa pamamagitan ng isang spacer - dalawang molekula ng ε -aminohexanoic acid.

Ang lahat ng tatlong variant ng inaangkin na carrier ay maaaring i-synthesize gamit ang mga kilalang pamamaraan ng peptide synthesis, halimbawa, ang solid phase na Boc method (Merrifield, R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide // Journal of the American Chemical Society. 1963. V.85 (14), pp.2149-2154).

Mga Halimbawa ng Tiyak na Pagpapatupad

Ang imbensyon ay inilalarawan gamit ang figure 1, na nagpapakita ng pagbabago sa intensity ng ethidium bromide fluorescence na may pagtaas ng carrier/DNA charge ratios sa maikling CDP/DNA, mahabang CDP/DNA at viral CDP/DNA complex. Ang pagbawas sa intensity ng fluorescence ay nagpapahiwatig ng pagtaas sa density ng nabuo na mga complex. Ang talampas ng mga fluorescence curves ay nagpapahiwatig na ang mga complex ay umabot sa isang density na sapat upang pawiin ang ethidium bromide fluorescence.

Ipinapakita ng Figure 2 ang pag-asa ng aktibidad ng luciferase sa HeLa (CXCR4+) na mga cell pagkatapos ng paglipat na may maikling CDP/DNA, mahabang CDP/DNA at viral CDP/DNA complex sa pagkakaroon ng endosomolytic agent glycerol. Sa kasong ito, ginamit ang mga complex na nabuo sa sumusunod na carrier/DNA charge ratios: 3/1, 6/1, 9/1, 12/1. Ang buo na molekula, DNA, PEI/DNA 1/8 complexes (positibong kontrol ng eksperimento - commercial carrier branched polyethyleneimine 25 kDa - PEI) at mga complex na naglalaman ng DNA at control peptide (CP) ay nagsilbing pang-eksperimentong kontrol. Ang CP ay naiiba sa mga carrier sa kasalukuyang imbensyon dahil ito ay kulang sa isang CXCR4 receptor binding signal at sa istruktura ay isang oligolysin KKKKKKKK. Ang kahusayan ng paghahatid ng marker gene ng mga carrier ng maikling CDP, mahabang CDP, at viral CDP ay 10-100 beses na mas mataas kaysa sa control CP.

Ipinapakita ng Figure 3 ang pag-asa ng aktibidad ng luciferase sa A172 (CXCR4+) na mga cell pagkatapos ng paglipat na may maikling CDP/DNA, mahabang CDP/DNA at viral CDP/DNA complex sa pagkakaroon ng endosomolytic agent glycerol. Dito ginamit namin ang mga complex na nabuo sa sumusunod na carrier/DNA charge ratios: 9/1, 12/1. Ang isang buo na molekula ng DNA, mga PEI/DNA 1/8 complex, at mga complex na naglalaman ng DNA at CP peptide ay nagsilbing pang-eksperimentong kontrol. Ang kahusayan ng paghahatid ng marker gene ng mga carrier ng maikling CDP, mahabang CDP, at viral CDP ay 10 beses na mas mataas kaysa sa control CP.

Ang mga resulta sa Figure 2 at Figure 3 ay sumusuporta sa pagiging tiyak ng mga carrier sa kasalukuyang imbensyon para sa CXCR4 receptor.

Ipinapakita ng Figure 4 ang pag-asa ng aktibidad ng luciferase sa CHO (CXCR4-) na mga cell pagkatapos ng paglipat na may maikling CDP/DNA, mahabang CDP/DNA at viral CDP/DNA complex sa pagkakaroon ng endosomolytic agent glycerol. Ang mga complex na nabuo sa sumusunod na carrier/DNA charge ratios ay ginamit: 9/1, 12/1. Ang isang buo na molekula ng DNA, mga PEI/DNA 1/8 complex, at mga complex na naglalaman ng DNA at CP peptide ay nagsilbing pang-eksperimentong kontrol. Ang kahusayan ng paghahatid ng marker gene sa pamamagitan ng maikling CDP, mahabang CDP, at viral CDP carrier ay halos pareho sa paggamit ng control CP.

Ang mga carrier na may signal ay hindi makakapagbigay ng mas mataas na antas ng paghahatid ng genetic material sa mga cell na walang expression ng receptor kumpara sa control.

Ang pagpapatupad ng imbensyon ay maaaring ipaliwanag tulad ng sumusunod. Ang layunin ng kasalukuyang imbensyon ay magbigay ng naka-target na paghahatid ng mga genetic construct sa mga cell na nagpapahayag ng CXCR4 receptor gamit ang mga carrier ng genetic material na naglalaman ng mga sequence ng signal para sa receptor na ito.

Sa unang yugto, ang pagbuo ng mga complex ng isa sa mga embodiments ng carrier na may genetic construct na naglalaman ng "interes" na gene ay isinasagawa. Ang mga nabuong complex ay ginagamit upang maihatid ang genetic na materyal sa naaangkop na mga target na cell. Ang pagtatasa ng kahusayan sa pagtagos ng cell ay tinasa ng mga pamamaraang enzymatic o immunohistochemical.

Ang pagbuo ng mga complex ay isinasagawa sa isang isotonic solution. Ang walang asin na buffer na HBM (Hepes-buffered mannitol) ay mas gusto. Ang laki ng mga nagresultang complex ay 170-230 nm.

Bilang genetic constructs sa isa sa mga embodiments gamit ang plasmid DNA.

Ang Plasmid DNA ay naglalaman ng isang marker (luc, lacZ) o therapeutic gene (depende sa sakit), sa ilalim ng kontrol ng mga naaangkop na promoter at enhancer (CMV, SV40, atbp.) at iba pang mga elemento na kinakailangan, halimbawa, para sa pagtitiklop sa host. cell o pagsasama sa genome. Sa paggamot sa gene therapy ng cancer, maaaring gamitin ang mga gene para sa HLA-B7, IL-2, IL-4, TNF, IFN, P53, thymidine kinase, at iba pa.

Sa isa pang embodiment, ang mga oligonucleotide na binubuo ng maliit na DNA o RNA na komplementaryo sa isang partikular na sequence sa mRNA o ang precursor nito ay ginagamit bilang genetic construct upang sugpuin ang synthesis ng isang produkto ng protina o upang itapon ang isang exon na nagdadala ng mutation mula sa mRNA. Ang mga nabuong complex ay ginagamit upang maghatid ng genetic material sa mga cell na nagpapahayag ng CXCR4 receptor. Ang pagtagos ng mga carrier complex ng kasalukuyang imbensyon ay nangyayari nang nakararami sa pamamagitan ng receptor-mediated transport sa pamamagitan ng pagbubuklod sa mga extracellular domain ng CXCR4 receptor at kasunod na internalization ng receptor.

Ang dosis ng mga carrier at genetic na materyal ay indibidwal na tinutukoy at depende sa uri ng mga cell, ang dami ng CXCR4 receptor sa kanilang ibabaw, at ang pagiging kumplikado ng paglipat ng mga cell na ito.

Upang mapataas ang kahusayan ng mga carrier na ito, ang paglipat ng mga cell ay mas mainam na isagawa gamit ang isang endosomolytic agent. Kabilang dito ang glycerol, chloroquine, at iba pa. Ang mga sangkap na ito ay idinaragdag sa transfection medium kaagad bago idagdag ang mga complex sa mga cell. Nananatili silang hindi nakatali sa mga complex, at samakatuwid ay hindi nakakaapekto sa kanilang istraktura.

Ang mga peptide, iba pang polymeric compound, mga liposome na may kakayahang mag-compact ng mga nucleic acid ay maaaring gamitin bilang bahaging nagbubuklod ng DNA ng carrier. Bilang karagdagan, maaari silang magkaroon ng mga katangian ng endosomolytic (hindi na kailangang gumamit ng karagdagang ahente ng endosomolytic) at, kung kinakailangan (halimbawa, para sa paghahatid ng mga therapeutic o marker genes), maghatid ng genetic na materyal sa nucleus.

Kapag pumipili ng mga kondisyon ng paglipat, idinisenyo ang mga ito upang magbigay ng pinakamataas na kahusayan sa paghahatid. Mas mainam na i-incubate ang mga complex na may mga cell sa loob ng 4 na oras. Gayunpaman, maaari kang mag-iba sa oras na ito mula 3 hanggang 6 na oras. Matapos lumipas ang oras ng pagpapapisa ng itlog, binago ang daluyan at ang mga cell ay naiwan sa loob ng 24-48 na oras (depende sa uri ng cell at genetic na materyal) para sa pagpapahayag ng mga ipinakilala na konstruksyon na may gene ng interes o ang pagpapakita ng therapeutic effect. ng oligonucleotides.

Ang pagsusuri ng kahusayan sa paghahatid ay isinasagawa sa pamamagitan ng mga enzymatic o immunohistochemical na pamamaraan, depende sa uri ng ipinakilala na pagbuo ng gene.

Halimbawa 1 Pagbuo ng DNA/Carrier Complex at Pag-aaral ng Proseso ng Complexation.

Ang pCLUC4 plasmid na naglalaman ng firefly luciferase gene sa ilalim ng kontrol ng cytomegalovirus promoter ay ginamit bilang genetic material para sa naka-target na paghahatid ng mga gene sa mga cell. Ang isa sa mga embodiments ng carrier ay ginamit.

Ang mga solusyon ng 1 μg ng DNA sa 40 μl ng 1X HBM buffer (5% w/v mannitol, 5 mM Hepes, pH 7.5) at mga solusyon sa carrier na naaayon sa iba't ibang mga ratio ng singil ng DNA/carrier ay inihanda sa pantay na dami ng buffer. Ang solusyon sa carrier ay unti-unting idinagdag sa Eppendorf tube na may solusyon sa DNA at masiglang hinalo sa loob ng 20 segundo. Ang nagresultang timpla ay naiwan sa loob ng 30 minuto sa temperatura ng silid upang makumpleto ang pagbuo ng mga complex.

Ang mga resulta ng complexation ay sinusuri ng ethidium bromide displacement method. Ang ethidium bromide fluorescence ay sinusukat gamit ang Varioscan Flash spectral scanning multi-mode reader (Thermo, Finland). Ang displacement ng ethidium bromide ay naobserbahan sa 590 nm (excitation sa 544 nm) pagkatapos ng pagdaragdag ng carrier sa DNA (20 μg/ml) na na-preincubated na may intercalating agent na ethidium bromide (400 ng/ml). Ang displacement ay kinakalkula gamit ang formula (F-Ff)/(Fb-Ff), kung saan ang Ff at Fb ay ang ethidium bromide fluorescence intensities sa kawalan at presensya ng DNA, ayon sa pagkakabanggit. Ang mga resulta ay ipinapakita sa FIG.

Halimbawa 2 Pagsasagawa ng in vitro transfection.

Ang HeLa, A172, at CHO cells ay nilagyan ng 48-well culture plates (Nunc) 24 na oras bago ang paglipat sa 50,000 cells bawat balon na naglalaman ng 500 µl ng standard culture mixture na binubuo ng DMEM culture medium (GIBCO), 10% fetal bovine serum. (GIBCO), 2 mM glutamine, pupunan ng penicillin (50 U/ml), streptomycin (50 µg/ml) at 1 mM sodium pyruvate. Ang suspensyon ng mga complex ay inihanda ayon sa pamamaraan na inilarawan sa halimbawa 1 sa rate ng 2 μg ng DNA bawat balon ng plate ng kultura. 10 minuto bago ang pagdaragdag ng suspensyon ng DNA/carrier complex, ang mga cell ay hinugasan ng maraming beses gamit ang DMEM at 500 µl ng medium na naglalaman ng 15% glycerol at 1.5% ethanol ay idinagdag sa bawat balon. Ang paglipat ay isinagawa sa pamamagitan ng pagdaragdag ng suspensyon ng mga DNA/carrier complex sa medium. Pagkatapos gawin ang mga complex, ang mga plato na may mga cell ay inilagay sa isang termostat na may temperatura na 37°C at 5% CO 2 sa loob ng 4 na oras. Matapos ang oras ng pagpapapisa ng itlog, ang mga cell ay hugasan ng DMEM medium at 500 µl ng karaniwang pinaghalong kultura ay idinagdag sa bawat balon. Ang plate ng kultura ay natupok sa isang termostat sa temperatura na 37 ° C at 5% CO 2 sa loob ng 48 oras, pagkatapos ay nakita ang expression ng marker gene.

Halimbawa 3 Detection ng luciferase gene expression pagkatapos ng paglipat sa vitro.

Ang daluyan ay tinanggal mula sa mga plato ng kultura, ang mga cell ay hugasan sa 1x PBS (pH 7.2). Ang 80 μl lysis buffer (25 M Gly-Gly, 15 mM MgSO 4, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF; pH 7.8) ay idinagdag sa bawat balon. Ang 50 μl ng lysate ay inilipat sa mga polystyrene plate na may mga opaque na pader upang masukat ang aktibidad ng luciferase. Ang pagsukat ay isinagawa gamit ang isang spectral scanning multi-mode reader na Varioscan Flash (Thermo, Finland). Ang pagsukat ay isinagawa gamit ang isang solusyon ng luciferase flash mix (20 mM Tricine, 1.07 mM (MgCO 3) 4 Mg(OH) 2 × 5 H 2 O, 2.67 mM MgSO 4, 0 1 mM EDTA, 33.3 mM DTT, 530 μM ATP , 270 μM acetyl coenzyme A, 470 μM luciferin). Ang bawat pagsukat ay isinagawa sa loob ng 10 segundo. Ang mga pagbabasa ng instrumento ay nakuha sa mga relatibong light unit (RLU). Ang mga resulta ng eksperimento ay nasuri sa mga relatibong light unit bawat 1 mg ng kabuuang protina mula sa mga cell extract sa balon ng culture plate. Ang kabuuang halaga ng protina sa bawat balon ay sinusukat gamit ang isang protina assay kit (Bio-Rad), laban sa isang karaniwang curve para sa bovine serum albumin. Ang mga resulta ay ipinakita sa figure 2, 3, 4.