Gamot para sa mga gene

Ang matagal nang pangarap ng mga manggagamot ay magkaroon ng mga sangkap sa kanilang pagtatapon na gagana sa mga partikular na gene, i.e. ang ugat ng maraming sakit. Sa katunayan, batay sa naturang mga sangkap, posible na lumikha ng mga gamot - tunay na "magic bullet" na maaaring makaapekto sa namamana na materyal ng iba't ibang mga nakakahawang ahente nang hindi sinasaktan ang katawan ng tao, pati na rin ang pagsugpo sa aktibidad ng mga oncogenes na responsable para sa malignant na paglaki ng cell. Ang paglikha ng mga naturang sangkap na may direktang epekto sa genetic na materyal ay isa sa mga pangunahing gawain ng molecular biology, dahil magagamit ang mga ito upang pag-aralan ang mga pag-andar ng mga gene at, sa huli, kontrolin ang gawain ng huli.

Ngunit paano mo mababago ang nais na genetic program? Pagkatapos ng lahat, ang lahat ng mga gene ay may magkatulad na komposisyon at istraktura ng kemikal: ang mga pagkakaiba sa pagitan ng mga ito ay nabawasan lamang sa pagkakasunud-sunod ng paghalili ng apat na monomeric na bloke - nucleotides A, T, G, C. Upang kumilos sa isang tiyak na gene, isang molekula ng sangkap dapat kahit papaano makilala ang pagkakasunud-sunod ng nucleotide na ito - ang gawain, sa unang tingin, hindi malulutas.

Ngunit iba ang iniisip ng isang grupo ng mga chemist ng Siberia na dumating sa Novosibirsk Academgorodok sa mga unang taon ng paglikha nito. Batay sa prinsipyo ng pagkilala sa molekular na ginagamit ng kalikasan mismo, ang mga empleyado ng Institute of Organic Chemistry ng Siberian Branch ng USSR Academy of Sciences (Novosibirsk) N.I. Grineva at D.G. na mga grupo. Ang unang gawain sa oligonucleotides ay inilathala ng mga chemist ng Siberia noong 1967 - ang petsang ito ay itinuturing ngayon na opisyal na petsa ng paglitaw ng isang bagong kalakaran sa molecular biology at pharmacology.

Sila ang nauna

Ang pagpapatupad ng proyektong ito, hindi pangkaraniwan sa katapangan nito (sa oras na iyon, hindi man lang pinlano na magsagawa ng naturang pananaliksik saanman sa mundo) sa paunang yugto ay isinagawa ng isang maliit na grupo ng mga batang empleyado, nagtapos na mga mag-aaral at mga mag-aaral ng NSU. Kinailangan naming magsimula nang praktikal mula sa simula, dahil sa oras na iyon ay hindi pa rin nila alam kung paano mag-synthesize ng oligonucleotides sa kapansin-pansing dami; walang mga teknikal na instrumento na kinakailangan upang gumana sa maliit na halaga ng mga nucleic acid at isang epektibong paraan para sa pagtukoy ng kanilang pagkakasunud-sunod. Nalutas ng aming mga chemist ang mga problemang ito salamat sa interdisciplinarity - isa sa mga prinsipyo na naging batayan ng mga aktibidad ng Siberian Branch.

Inayos ng NIOC ang paggawa ng mga nucleic acid, na binuo ng mga pamamaraan para sa kanilang pagbabago sa kemikal; kasama ang mga empleyado ng Institute of Nuclear Physics, posible na lumikha ng mga aparato para sa pagsusuri ng mga nucleic acid at pagmamanipula sa kanilang maliit na halaga, at kasama ang mga chemist mula sa Moscow State University, nagsimula silang magtrabaho sa paglikha ng mga awtomatikong synthesizer ng oligonucleotides. Bilang resulta, halos lahat ng kinakailangang analytical na pamamaraan at instrumento ay nasa pagtatapon ng mga siyentipiko - maaaring magsimula ang biological research.

Ang mga eksperimento na isinagawa muna sa mga simpleng modelo at pagkatapos ay sa mga natural na nucleic acid ay nagpakita na ang mga oligonucleotides ay talagang nakikipag-ugnayan sa mga target na nucleic acid na may mataas na antas ng selectivity. Sa kaso kapag ang mga reaktibong grupo ay nakakabit sa mga oligonucleotides, nangyayari ang isang naka-target na pagbabago sa kemikal ng mga target na nucleic acid. Bilang karagdagan, ipinakita sa unang pagkakataon na ang mga reagents na ito ay maaaring gamitin upang sugpuin ang mga impeksyon sa viral sa mga hayop, at ang posibilidad na ipasok ang mga ito sa katawan sa pamamagitan ng balat at mauhog na lamad, atbp ay napatunayan.

Ang mga naunang publikasyon tungkol sa mga epekto ng biyolohikal na ginawa ng mga oligonucleotides ay pumukaw ng malaking interes sa mga espesyalista sa buong mundo. Noong 1988, ginanap sa Akademgorodok ang unang symposium sa mundo sa mga sangkap na naka-target sa gene batay sa mga fragment ng nucleic acid. Ang mga siyentipiko mula sa USA, France, at pagkatapos ay iba pang mga bansa ay sumali sa gawain sa paglikha ng mga naturang gamot; Dose-dosenang mga kumpanya ang lumitaw na may layuning lumikha ng mga therapeutic na gamot batay sa oligonucleotides.

Komplementaryong gamot

Ang tinatawag na antisense oligonucleotides, na idinisenyo para sa selective inactivation ng mga viral RNA at ilang cellular RNAs, ang naging una sa mga gene-targeted na gamot. Sa una, ipinapalagay na ang mga reaktibong grupo ay makakabit sa mga oligonucleotides na ito, na dapat na baguhin o sirain ang mga target na nucleic acid. Gayunpaman, napag-alaman na ang pag-attach ng oligonucleotides sa target na RNA mismo ay may napakalakas na epekto dito na maaari itong pukawin ang pagkawasak nito sa pamamagitan ng mga cellular enzymes.

D. G. KNORRE - Academician ng Russian Academy of Sciences, dalubhasa sa larangan ng chemical kinetics, molecular biology at bioorganic chemistry. Pinuno ng Laboratory of Chemistry of Natural Polymers (1960-1984), Department of Biochemistry at Laboratory of Nucleic Acid Chemistry (1970-1984) ng Institute of Organic Chemistry ng Siberian Branch ng USSR Academy of Sciences, Direktor ng Institute ng Bioorganic Chemistry ng Siberian Branch ng USSR Academy of Sciences at ng Siberian Branch ng Russian Academy of Sciences (1984-1996). ) Ang mga diskarte sa antisense batay sa paggamit ng mga nucleotide at nucleic acid upang sugpuin ang biological na aktibidad ng mga nucleic acid ay nag-aalok ng mga kawili-wiling prospect sa mga kaso kung saan kinakailangan upang sugpuin ang pagpapatupad ng hindi kanais-nais na impormasyon sa mga buhay na organismo. Una sa lahat, ang pag-asam ng paglikha ng isang bagong henerasyon ng mga antiviral at antitumor na gamot ay bubukas. Ang mga naturang gamot ay may isang hindi mapag-aalinlanganang kalamangan sa iba... Ang lahat ng oligonucleotides, anuman ang target na kanilang nilalayon, ay maaaring malikha gamit ang isang teknolohiya. Ang pagkakasunud-sunod lamang ng mga nucleotide ang kailangang iba-iba. Sa partikular, sa virology at oncology, madalas na kailangang harapin ng isang tao ang gayong hindi pangkaraniwang bagay tulad ng paglitaw ng paglaban sa droga. Madalas itong nangyayari dahil ang isang particle ng virus o isang cell ng cancer ay may mutation na humahantong sa naturang resistensya. Sa anumang iba pang kaso, dapat magsimula ang isang empirical na paghahanap para sa isang bagong gamot. Sa kaso ng mga epekto ng antisense, kinakailangan lamang upang matukoy kung aling pagbabago sa istruktura ng viral genome o oncogene ang humantong sa paglitaw ng paglaban. Pagkatapos nito, agad na nagiging malinaw kung paano lumikha ng isang bagong gamot gamit ang parehong pinag-isang teknolohiya *.

* Soros Educational Journal. - 1998. - 12. - C. 25-31.

Ang mga nakakasagabal na RNA, maiikling double-stranded complex ng RNA oligonucleotides, ay naging pinakamakapangyarihang paraan ng "pagpatay" ng mga gene. Kapag ang naturang complex ay ipinasok sa isang cell, ang isa sa mga strands ay nagbubuklod sa komplementaryong pagkakasunud-sunod nito sa messenger RNA ng cell. Ito ay nagsisilbing senyales upang simulan ang gawain ng isang pangkat ng mga enzyme na pumutol sa RNA na nauugnay sa oligonucleotides. Bilang isang resulta, ang programa para sa synthesis ng isang tiyak na protina ay nawawala.

Noong 2006, dalawang Amerikanong mananaliksik ang ginawaran ng Nobel Prize sa Physiology o Medicine para sa pagpapaliwanag ng mekanismo ng RNA interference. Ang paglikha ng mga regulator ng expression ng gene batay sa mga nakakasagabal na RNA ay nagbukas ng magagandang pagkakataon para sa pagkuha ng malawak na hanay ng lubos na epektibong hindi nakakalason na mga gamot na pumipigil sa pagpapahayag ng halos lahat ng mga gene, kabilang ang mga tumor at viral.

Tamang Mutation

Ang atensyon ng mga espesyalista ay matagal nang naaakit ng mga pamamaraan ng mutagenic action sa DNA gamit ang oligonucleotides o ang kanilang mga derivatives. Kung matagumpay, ang tila isang pantasya ngayon ay maaaring maging totoo: ang pagwawasto ng mga may sira na genetic program.

Napatunayan na sa eksperimento na ang mga point mutations ay maaaring ipasok sa mga genetic program gamit ang maikling oligonucleotides. Paano ito gagawin? Ang mutagenic oligonucleotides na naglalaman ng "maling" mga bloke ng nucleotide ay ipinapasok sa cell, kung saan sila ay pinagsama sa DNA. Bilang resulta, ang "mali", ibig sabihin, hindi komplementaryo, ang mga pares ng base ay lumilitaw sa ilang bahagi ng mga pagkakasunud-sunod ng nucleotide, na nakikita ng cellular DNA repair ("repair") system bilang pinsala. Ang mga nucleotide sa gayong pares ay pinapalitan ng mga reparative enzymes sa paraang ito ay nagiging "tama", pantulong. Sa kasong ito, ang pagpapalit ay maaaring mangyari pareho sa oligonucleotide sequence at sa cellular DNA mismo.

Sa huling kaso, tayo ay nakikitungo sa isang pagbabago sa genetic program, ibig sabihin, na may isang mutation. At kahit na ang kahusayan ng naturang proseso ng mutation ay karaniwang mababa, maaari itong magamit kaugnay ng mga bagong teknolohiya ng cellular. Halimbawa, ang mga stem cell ng isang pasyente na may ilang hereditary disorder ay maaaring gamutin ng isang selective mutagen, at pagkatapos ay ang mga sa kanila kung saan naganap ang ninanais na mutation (ibig sabihin, mga cell na may "naitama" na genetic program) ay maaaring piliin, i-multiply. at ipinakilala sa katawan.

1967 Ang unang gawa sa oligonucleotides, mga gene-targeted na biologically active substance, ay nai-publish

Kaya, ang kasalukuyang umiiral na mga oligonucleotides ay nakakapag-regulate ng "trabaho" ng mga gene sa iba't ibang antas. Kaya, ang nabanggit na antisense oligonucleotides at nakakasagabal na mga RNA ay gumagana sa yugto ng synthesis ng protina, na kumikilos sa mga messenger RNA - mga molekulang pang-impormasyon kung saan ang mga polypeptide chain ay binuo. Ang mga antigenic oligonucleotides na bumubuo ng mga complex na may DNA ay pinipigilan ang expression ng gene - ang pagbuo ng mga messenger RNA mismo, at ang aptamer oligonucleotides, tulad ng mga antibodies, ay maaaring bumuo ng mga bono sa ilang mga protina, na humaharang sa kanila. Bilang karagdagan, ang ilang mga oligonucleotides ay nagagawang pasiglahin ang immune system - ngayon sila ay ginagamit bilang mga bahagi ng mga bakuna.

Sa kasalukuyan, ang pagbuo at synthesis ng oligonucleotides at ang kanilang mga analogue ay isinasagawa ng malalaking sektor ng pananaliksik at pang-industriya. Kaya, noong nakaraang taon, ang dami ng merkado para sa mga oligonucleotides na inilaan para sa mga layunin ng pananaliksik lamang ay lumampas sa $800 milyon! Dose-dosenang mga bagong uri ng chemically modified oligonucleotides ang na-develop at na-synthesize na ngayon, at sinusuri ang ilang antiviral at anti-inflammatory na gamot batay sa mga ito. Ang ganitong uri ng pananaliksik sa Russia ay kasalukuyang isinasagawa pangunahin sa Institute of Chemical Biology at Fundamental Medicine ng Siberian Branch ng Russian Academy of Sciences, kung saan nagtatrabaho ang mga mag-aaral at tagasunod ng Academician D. G. Knorre.

Ito ay kung paano ang bunga ng ideya na lumitaw sa sangay ng Siberia apatnapung taon na ang nakalilipas ay pinatunayan ng buhay mismo. Gamit ang mga maiikling fragment ng mga nucleic acid bilang mga pangunahing istruktura para sa paglikha ng mga gene-targeted na biologically active substance, posible na mabilis na bumuo at ipasok sa produksyon na mga partikular na gamot laban sa halos anumang virus. Upang gawin ito, kinakailangan lamang na maunawaan ang pagkakasunud-sunod ng nucleotide ng mga viral gene, na madaling gawin sa tulong ng mga modernong teknolohiya. Ang unibersal na diskarte na ito ay may magandang kinabukasan: ang mga resulta ng mga pag-aaral sa mga nagdaang taon, partikular sa site-directed mutagenesis, ay nagbibigay-daan sa amin na umasa sa paglitaw ng mga epektibong gamot sa malapit na hinaharap upang labanan ang mga sakit na itinuturing pa rin na walang lunas.

Ang "Antisense" RNA (Antisense RNA), na dapat gamitin bilang isang gamot, ay isang maikling (15-20 nucleotides) oligonucleotide na maaaring magbigkis sa isang partikular na site ng mRNA na komplementaryo dito at pumipigil sa pagsasalin ng protina na na-encode nito, sa gayon ay pinipigilan ang proseso ng pathological (Larawan 2).

Ang therapeutic effect ng synthetic na "antisense" oligonucleotides ay nakasalalay sa pagtitiyak ng kanilang hybridization sa naa-access na site ng target na mRNA, paglaban sa pagkilos ng mga cellular nucleases, at ang pagkakaroon ng isang sistema ng paghahatid sa cell. Ang 15-20-nucleotide sequence ay nag-hybrid sa mga natatanging mRNA na medyo mataas ang specificity. Ang mga potensyal na target na site ay natutukoy sa pamamagitan ng pagsubok sa isang set ng "antisense" oligonucleotides gamit ang isang cell culture na synthesize ang target na mRNA. Upang gawin ito, ang electrophoretic na paghihiwalay ng mga cellular protein ay isinasagawa, kung saan ang isang radioactive label ay kasama sa panahon ng pagsasalin, at gamit ang radioautography, ito ay tinutukoy sa pagkakaroon ng kung alin sa "antisense" oligonucleotides ang synthesis ng isang tiyak na protina ay nabawasan. Walang pangkalahatang pamantayan para sa pagpili ng pinakamahusay na target na mga site sa iba't ibang mga transcript ng RNA. Ang mga oligonucleotide na pantulong sa 5' o 3' na dulo ng mRNA, exon at intron na mga hangganan, at maging ang mga double-stranded na rehiyon ay maaaring maging epektibo. Ang mga antisense oligonucleotides ay maaaring masira ng mga intracellular nucleases, kaya mahalagang protektahan sila mula sa pagkilos ng huli upang hindi mawala ang kanilang kakayahang mag-hybrid sa target. Para dito, ang mga base ng pyrimidine, ribose o deoxyribose ay maaaring mabago sa isang tiyak na paraan (Larawan 3). Kaya, sa kasalukuyang pinaka-tinatanggap na ginagamit na "antisense" oligonucleotides, ang libreng oxygen atom ng phosphodiester bond ay pinalitan ng SH group (Fig. 3B ), na nagreresulta sa pagbuo ng isang thiophosphate bond. Ang mga oligonucleotide na binago sa ganitong paraan ay natutunaw sa tubig, nagdadala ng negatibong singil, at hindi nabibiyak ng mga endonucleases. Kapag na-hybrid sa isang target na site, bumubuo sila ng mga duplex na nag-a-activate ng ribonuclease (RNase), isang endogenous enzyme na pumuputol sa mRNA sa naturang hybrid na molekula. Ang mga unang klinikal na pagsubok ng naturang oligonucleotides - mga gamot ng "unang henerasyon" ay naisagawa na. Ang mga target ay RNA ng cytomegalovirus, human immunodeficiency virus, pati na rin ang mRNA ng mga gene na responsable para sa pag-unlad ng kanser, mga sakit sa bituka at iba pang mga sakit.

Synthesized "antisense" oligonucleotides na may phosphoramidite at polyamide (peptide) bonds - peptide nucleic acids (Peptide nucleicacids, PNAs) (Fig. 3 V at D ). Ang ganitong mga molekula ay napaka-lumalaban sa pagkilos ng mga nucleases. Ang mga grupong kemikal na nakakabit sa 2'-carbon atom ng sugar residue at ang C-5 atom ng pyrimidines ay nagpoprotekta rin sa antisense oligonucleotides at pinapadali ang kanilang pagbubuklod sa target na site (Fig. 3 2D at E ). Ang lahat ng mga pakinabang ng mga ito at iba pang mga pagbabago ay masinsinang pinag-aaralan ngayon.

Ang pagtagos ng "antisense" oligonucleotides sa cell ay maaaring lubos na mapadali sa pamamagitan ng paglalagay sa kanila sa mga liposome. Ang napakahusay na sistema ng paghahatid ay nagbibigay-daan sa paggamit ng "antisense" oligonucleotides sa mababang konsentrasyon. Kung, gayunpaman, ang mga liposome ay pinagsama sa mga antibodies na tiyak sa mga epitope ng ilang mga cell ng ilang mga organo, kung gayon posible na isagawa ang naka-target na paghahatid ng "antisense" oligonucleotides.

Ang mga isinagawang preclinical na pagsusuri ay nagpakita na ang "antisense" oligonucleotides ay napakaepektibong gamot. Ang posibilidad ng kanilang paggamit para sa paggamot ng stenosis ng coronary at carotid arteries, na humahantong sa mga atake sa puso at mga stroke, ay pinag-aralan. Sa mga kasong ito, madalas silang gumamit ng angioplasty, pagpapalawak ng mga arterya gamit ang isang balloon catheter, ngunit sa humigit-kumulang 40% ng mga pasyente ay muling lumitaw ang stenoses pagkatapos ng 6 na buwan, dahil pinasisigla ng angioplasty ang paglaganap ng makinis na mga selula ng kalamnan at ang pagtatago ng intercellular substance sa panloob. layer ng arterya sa lugar ng pagpapalawak nito. Sa isa sa mga eksperimento, ang mga antisense oligonucleotides na may mga thiophosphate bond, na pantulong sa mRNA na nag-encode ng mga protina na mahalaga para sa mammalian cell cycle, ay na-injected sa carotid arteries ng mga daga pagkatapos ng angioplasty; bilang isang resulta, ang dalas ng paulit-ulit na stenoses ay nabawasan ng 90%. Ang paglaganap ng makinis na mga selula ng kalamnan ay nangyayari din sa atherosclerosis, diabetes mellitus, mga komplikasyon pagkatapos ng coronary bypass surgery. Marahil, ang lahat ng mga estadong ito ay maaaring kontrolin sa magkatulad na paraan.

Maaari ding gamitin ang antisense oligonucleotides upang gamutin ang mga impeksyon sa viral at malaria. Bilang karagdagan, ang mga resulta ng phase I na mga klinikal na pagsubok para sa paggamot ng Crohn's disease gamit ang oral administration ng "antisense" oligonucleotide ay naglalarawan ng isang malinaw na therapeutic effect na walang kapansin-pansin na mga side effect. Sa kasong ito, ang target na mRNA ay naka-code para sa intercellular adhesion type 1, na ginagawa nang labis sa mga pasyenteng may Crohn's disease. Nilalayon nitong imbestigahan ang bisa ng parehong oligonucleotide para sa paggamot ng iba pang mga nagpapaalab na sakit, tulad ng rheumatoid arthritis, psoriasis at ulcerative colitis.

Sa prinsipyo, ang "antisense" oligonucleotides ay maaaring bumuo ng isang triple helix na may chromosomal target na DNA at block transcription. Gayunpaman, ang pagtitiyak ng "antigenic" oligonucleotides ay hindi pa nakakatugon sa mga pamantayang pinagtibay para sa mga gamot.

04.07.2013 - 31.12.2013

Isang sistematikong pagsusuri ng modernong panitikan sa paksa ng pananaliksik ang isinagawa. Ang mga pagkakasunud-sunod ng pinaka-maaasahan, mula sa punto ng view ng mga nagpapatupad ng proyekto, ang mga derivatives ng oligonucleotide at ang kanilang mga analogue, na dapat magpakita ng aktibidad na antiviral at antibacterial, ay naitatag.
Ang mga pamamaraan ay binuo para sa synthesis ng binagong oligonucleotides at ang kanilang mga conjugates gamit ang awtomatikong DNA/RNA synthesizer o sa manual synthesis mode sa isang solidong suporta. Ang iba't ibang mga diskarte ay iminungkahi para sa disenyo ng mga derivatives ng oligonucleotide na may isang ibinigay na pag-andar, kabilang ang mga batay sa predictive analysis ng istraktura at katatagan ng mga nabuong duplex gamit ang molecular dynamics method. Ang isang pamamaraan ay iminungkahi para sa synthesis ng bago, dati nang hindi natukoy na mga derivatives ng oligonucleotides na nagdadala ng mga pagbabago sa phosphorus atom ng internucleotide phosphodiester group.
Ang isang pamamaraan ay binuo para sa pagsusuri ng kahusayan ng pagtagos ng mga compound na may label na fluorescein sa mga bacterial cell. Ipinakita na ang mga derivative na may positibong charge ng Flu-(LR)4G-amide peptide ay epektibong tumagos at nag-iipon sa Pseudomonas aeruginosa, habang ang kahusayan ng pagtagos ng oligonucleotides dito nang walang transport peptide ay mababa.
Ang lahat ng mga pamamaraan na binuo sa panahon ng pananaliksik, parehong sintetiko at analytical, ay ipinatupad sa gawain ng Laboratory of Biomedical Chemistry ng ICBFM SB RAS. Ang natanggap na mga teoretikal na pag-unlad ay ginagamit sa mga kursong pang-edukasyon.
Ang sintetikong base na nilikha sa laboratoryo para sa pagkuha, paghihiwalay at pagkilala sa mga oligonucleotides ay natatangi para sa Russian Federation at malapit sa antas ng pinakamahusay na mga laboratoryo ng pananaliksik sa mundo ng kaukulang espesyalisasyon. Ang paglahok ng mga biological na espesyalista ay ginagawang kakaiba ang laboratoryo sa mga tuntunin ng potensyal ng pagpapatupad ng pananaliksik nito sa direksyon ng pagbuo ng mga antiviral at antibacterial na gamot na naka-target sa RNA.

Palawakin

01.01.2014 - 31.12.2014

i) Pagsusuri ng aktibidad na antibacterial ng oligonucleotide analogs/oligonucleotide conjugates laban sa Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium; Staphylococcus aureus;
ii) Pagsusuri ng aktibidad ng antiviral ng oligonucleotide analogs/oligonucleotide conjugates laban sa influenza virus WSN33/A/H1N1.
iii) Pagpili ng mga sequence ng oligonucleotide leader analogs na nagpapakita ng antibacterial o antiviral na aktibidad sa nais na antas;
iv) Pagbuo ng mga protocol para sa synthesis ng oligonucleotide conjugates na naglalaman ng mga grupo na nagpapataas ng kahusayan ng kanilang akumulasyon sa eukaryotic o bacterial cells
iv) Pagsusuri ng kahusayan ng pagtagos at akumulasyon ng mga nabuong compound sa bacterial at eukaryotic cells.
v) Inihanda na laboratoryo;
vi) Mga artikulo sa siyentipikong peryodiko na na-index ng Web of Science.
vii) Abstract ng mga ulat sa mga kumperensya;
viii) Katibayan ng pakikilahok sa mga kursong pang-edukasyon;
ix) Kumperensya;

Palawakin

01.01.2015 - 31.12.2015

3.1 Antibacterial na aktibidad ng mga compound na naglalaman ng mga leader sequence laban sa Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium; Staphylococcus aureus sa vitro (sa cell culture);
3.2 Antiviral na aktibidad ng mga compound na naglalaman ng mga leader sequence laban sa influenza virus sa vitro;

3.3. Mga teknolohikal at therapeutic na katangian ng mga piling oligonucleotide analogues at conjugates, na isinasaalang-alang ang mga paraan ng komersyalisasyon ng mga gamot, kabilang ang:

3.3.1 Listahan ng mga standardized na eksperimentong pamamaraan para sa pagsusuri ng antibacterial at antiviral na aktibidad ng oligonucleotide analog na paghahanda sa vitro (sa cell culture) at in vivo (sa mga modelo ng hayop);

3.3.3 Mga piling oligonucleotide analogues at conjugates, na, kasama ang pagpapakita ng mataas na aktibidad na antibacterial at antiviral, ay may kakayahang mabisang pagtagos at akumulasyon sa mga selula, kabilang ang:

3.3.2.1 Cell entry at delivery data para sa binagong oligonucleotide analogs at conjugates;
3.3.2.2 Na-optimize na semi-preparative synthesis, pre- at post-synthetic na mga pagbabago, paghihiwalay at quantitative control ng oligonucleotide analogs na nagpapakita ng antibacterial at antiviral na aktibidad;
3.3.2.3. Pagsusuri ng mga nabuong compound na may aktibidad na antibacterial at antiviral sa mga tuntunin ng komersyal na paggamit.

3.4 Inihanda ang huling ulat ng proyekto;
3.5 Inihanda na laboratoryo;

3.6 Abstract ng mga ulat sa mga kumperensya;
3.7 Mga sertipiko ng pakikilahok sa mga kursong pang-edukasyon;

3.8 3mga artikulo sa siyentipikong peryodiko na na-index sa Web of Science

Karamihan sa mga paraan ng gene therapy ex vivo at in vivo ay gumagamit ng mga naka-clone na genetic construct na pumapalit sa functional form ng isang protina na hindi na-synthesize sa katawan ng pasyente o na-synthesize sa isang depektong anyo. Gayunpaman, maraming mga sakit ng tao (kanser, pamamaga, impeksyon sa viral at parasitiko) ang nauugnay, sa kabaligtaran, sa sobrang produksyon ng isang normal na protina. Ang mga therapy ay binuo upang gamutin ang mga kondisyong ito.

sistema gamit ang mga tiyak na oligonucleotides. Ang ganitong maliit na oligonucleotide ay maaaring mag-hybrid sa isang partikular na gene o mRNA at bawasan ang antas ng transkripsyon o pagsasalin, sa gayon ay binabawasan ang dami ng protina na responsable para sa patolohiya na na-synthesize. Ang isang oligonucleotide na nag-hybrid sa gene mismo at hinaharangan ang transkripsyon nito ay tinatawag na "antigenic", at ang isa na nag-hybrid sa katumbas na mRNA ay tinatawag na "antisense" (Antisense RNA). Upang maiwasan ang pag-activate ng transkripsyon ng mga partikular na gene, maaari ding gamitin ang double-stranded oligonucleotides na partikular na nagbubuklod sa mga DNA-binding proteins (activator proteins). Sa wakas, upang mabawasan ang dami ng isang partikular na mRNA at ang protina na na-synthesize dito, maaaring gamitin ang mga ribozymes - mga natural na sequence ng RNA na nagbubuklod sa mga partikular na molekula ng RNA at pinuputol ang mga ito.

Sa hinaharap, ang mga gamot na nakabatay sa nucleic acid ay malamang na makakahanap ng malawak na aplikasyon, na may iba't ibang "antisense" na oligonucleotides bilang pangunahing layunin ng siyentipikong pananaliksik at mga klinikal na pagsubok.

3.1 Antisense oligonucleotides bilang mga gamot

Ang "Antisense" RNA (Antisense RNA), na dapat gamitin bilang isang gamot, ay isang maikling (15-20 nucleotides) oligonucleotide na maaaring magbigkis sa isang partikular na site ng mRNA na komplementaryo dito at pumipigil sa pagsasalin ng protina na na-encode nito, sa gayon ay pinipigilan ang proseso ng pathological (Larawan 2).

Ang therapeutic effect ng synthetic na "antisense" oligonucleotides ay nakasalalay sa pagtitiyak ng kanilang hybridization sa naa-access na site ng target na mRNA, paglaban sa pagkilos ng mga cellular nucleases, at ang pagkakaroon ng isang sistema ng paghahatid sa cell. Ang 15-20-nucleotide sequence ay nag-hybrid sa mga natatanging mRNA na medyo mataas ang specificity. Ang mga potensyal na target na site ay natutukoy sa pamamagitan ng pagsubok sa isang set ng "antisense" oligonucleotides gamit ang isang cell culture na synthesize ang target na mRNA. Upang gawin ito, ang electrophoretic na paghihiwalay ng mga cellular protein ay isinasagawa, kung saan ang isang radioactive label ay kasama sa panahon ng pagsasalin, at gamit ang radioautography, ito ay tinutukoy sa pagkakaroon ng kung alin sa "antisense" oligonucleotides ang synthesis ng isang tiyak na protina ay nabawasan. Walang pangkalahatang pamantayan para sa pagpili ng pinakamahusay na target na mga site sa iba't ibang mga transcript ng RNA. Ang mga oligonucleotide na pantulong sa 5' o 3' na dulo ng mRNA, exon at intron na mga hangganan, at maging ang mga double-stranded na rehiyon ay maaaring maging epektibo. Ang mga antisense oligonucleotides ay maaaring masira ng mga intracellular nucleases, kaya mahalagang protektahan sila mula sa pagkilos ng huli upang hindi mawala ang kanilang kakayahang mag-hybrid sa target. Para dito, ang mga base ng pyrimidine, ribose o deoxyribose ay maaaring mabago sa isang tiyak na paraan (Larawan 3). Kaya, sa kasalukuyang pinaka-tinatanggap na ginagamit na "antisense" oligonucleotides, ang libreng oxygen atom ng phosphodiester bond ay pinalitan ng SH group (Fig. 3B ), na nagreresulta sa pagbuo ng isang thiophosphate bond. Ang mga oligonucleotide na binago sa ganitong paraan ay natutunaw sa tubig, nagdadala ng negatibong singil, at hindi nabibiyak ng mga endonucleases. Kapag na-hybrid sa isang target na site, bumubuo sila ng mga duplex na nag-a-activate ng ribonuclease (RNase), isang endogenous enzyme na pumuputol sa mRNA sa naturang hybrid na molekula. Ang mga unang klinikal na pagsubok ng naturang oligonucleotides - mga gamot ng "unang henerasyon" ay naisagawa na. Ang mga target ay RNA ng cytomegalovirus, human immunodeficiency virus, pati na rin ang mRNA ng mga gene na responsable para sa pag-unlad ng kanser, mga sakit sa bituka at iba pang mga sakit.

Synthesized "antisense" oligonucleotides na may phosphoramidite at polyamide (peptide) bonds - peptide nucleic acids (Peptide nucleicacids, PNAs) (Fig. 3 V at D ). Ang ganitong mga molekula ay napaka-lumalaban sa pagkilos ng mga nucleases. Ang mga grupong kemikal na nakakabit sa 2'-carbon atom ng sugar residue at ang C-5 atom ng pyrimidines ay nagpoprotekta rin sa antisense oligonucleotides at pinapadali ang kanilang pagbubuklod sa target na site (Fig. 3 2D at E ). Ang lahat ng mga pakinabang ng mga ito at iba pang mga pagbabago ay masinsinang pinag-aaralan ngayon.

Ang pagtagos ng "antisense" oligonucleotides sa cell ay maaaring lubos na mapadali sa pamamagitan ng paglalagay sa kanila sa mga liposome. Ang napakahusay na sistema ng paghahatid ay nagbibigay-daan sa paggamit ng "antisense" oligonucleotides sa mababang konsentrasyon. Kung, gayunpaman, ang mga liposome ay pinagsama sa mga antibodies na tiyak sa mga epitope ng ilang mga cell ng ilang mga organo, kung gayon posible na isagawa ang naka-target na paghahatid ng "antisense" oligonucleotides.

Ang mga isinagawang preclinical na pagsusuri ay nagpakita na ang "antisense" oligonucleotides ay napakaepektibong gamot. Ang posibilidad ng kanilang paggamit para sa paggamot ng stenosis ng coronary at carotid arteries, na humahantong sa mga atake sa puso at mga stroke, ay pinag-aralan. Sa mga kasong ito, madalas silang gumamit ng angioplasty, pagpapalawak ng mga arterya gamit ang isang balloon catheter, ngunit sa humigit-kumulang 40% ng mga pasyente ay muling lumitaw ang stenoses pagkatapos ng 6 na buwan, dahil pinasisigla ng angioplasty ang paglaganap ng makinis na mga selula ng kalamnan at ang pagtatago ng intercellular substance sa panloob. layer ng arterya sa lugar ng pagpapalawak nito. Sa isa sa mga eksperimento, ang mga antisense oligonucleotides na may mga thiophosphate bond, na pantulong sa mRNA na nag-encode ng mga protina na mahalaga para sa mammalian cell cycle, ay na-injected sa carotid arteries ng mga daga pagkatapos ng angioplasty; bilang isang resulta, ang dalas ng paulit-ulit na stenoses ay nabawasan ng 90%. Ang paglaganap ng makinis na mga selula ng kalamnan ay nangyayari din sa atherosclerosis, diabetes mellitus, mga komplikasyon pagkatapos ng coronary bypass surgery. Marahil, ang lahat ng mga estadong ito ay maaaring kontrolin sa magkatulad na paraan.

Maaari ding gamitin ang antisense oligonucleotides upang gamutin ang mga impeksyon sa viral at malaria. Bilang karagdagan, ang mga resulta ng phase I na mga klinikal na pagsubok para sa paggamot ng Crohn's disease gamit ang oral administration ng "antisense" oligonucleotide ay naglalarawan ng isang malinaw na therapeutic effect na walang kapansin-pansin na mga side effect. Sa kasong ito, ang target na mRNA ay naka-code para sa intercellular adhesion type 1, na ginagawa nang labis sa mga pasyenteng may Crohn's disease. Nilalayon nitong imbestigahan ang bisa ng parehong oligonucleotide para sa paggamot ng iba pang mga nagpapaalab na sakit, tulad ng rheumatoid arthritis, psoriasis at ulcerative colitis.

Sa prinsipyo, ang "antisense" oligonucleotides ay maaaring bumuo ng isang triple helix na may chromosomal target na DNA at block transcription. Gayunpaman, ang pagtitiyak ng "antigenic" oligonucleotides ay hindi pa nakakatugon sa mga pamantayang pinagtibay para sa mga gamot.

5507 0

Ito ay maaaring makamit sa maraming paraan: hybridization ng kaukulang oligonucleotide na may isang tiyak na gene o mRNA, pagharang sa protina transcription factor, pagbabawas ng dami ng mRNA bilang resulta ng cleavage ng RNA enzymes, atbp. Isaalang-alang ang mga prinsipyo ng ilan sa mga ito.

Ang isang ribooligonucleotide na nagbubuklod sa isang tiyak na mRNA at sa gayon ay pumipigil sa pagsasalin ng protina na na-encode nito ay tinatawag na isang "antisense" mRNA. Ang mekanismong ito ay ginagamit ng ilang bakterya upang ayusin ang mga gene (Larawan 3.20). Sa pagsasagawa, ginagamit ang mga artipisyal na idinisenyong gene, kung saan ang pagsingit ng DNA ay nasa ganoong oryentasyon na ang kanilang mga transcript ay antisense na may paggalang sa target na mRNA (Fig. 3.21).

kanin. 3.20. Regulasyon ng bacterioferritin (bfr) gene sa pamamagitan ng antisense RNA

kanin. 3.21. Pagbabawal sa Pagsasalin ng mRNA ng isang Synthetic Antisense Oligonucleotide

Ipinakita na ang synthetic antisense oligonucleotides ay maaaring gamitin, gayunpaman, ang kanilang therapeutic effect ay lubos na nakasalalay sa kanilang paglaban sa pagkilos ng mga cellular nucleases, ang sistema ng paghahatid at ang pagtitiyak ng kanilang hybridization. Upang matukoy ang pinakaepektibong target na mga site sa isang partikular na mRNA, isang hanay ng mga antisense oligonucleotides na 15-20 base ang haba ay sinubok gamit ang kultura ng mga cell na nagsi-synthesize ng target na mRNA. Ang komposisyon ng mga synthesized na protina ay tinutukoy ng electrophoresis at itinatag kung aling pagpapakilala ng oligonucleotide ang humahantong sa pagbawas sa synthesis ng target na protina.

Upang maprotektahan laban sa nuclease cleavage, ang binagong oligonucleotides ay synthesize, habang hindi nawawala ang kakayahang mag-hybridize. Sa fig. Ipinapakita ng 3.22 ang mga istruktura ng binagong nucleotides, ang pagiging epektibo nito ay masinsinang pinag-aaralan. Halimbawa, ipinakita na ang mga oligonucleotides na may kapalit ng libreng oxygen ng phosphodiester bond na may sulfur (istraktura b) ay epektibong nag-hybrid sa komplementaryong target na RNA at ang nagresultang RNA-DNA duplexes ay nagpapagana ng intracellular ribonuclease H.

Ang endogenous enzyme na ito ay nag-hydrolyze ng RNA sequence sa naturang mga hybrid. Sa ganitong mga oligonucleotides, ang mga promising clinical trials ay naisagawa na, kung saan ang mga target ay RNA ng cytomegalovirus, HIV, at ilang RNA na responsable para sa pag-unlad ng cancer.

kanin. 3.22. Mga pagbabago sa oligonucleotide: a - normal na phosphodiester bond; b - thiophosphate bond; c - phosphamide bond; d - 2"-0-methylribose; e - C-5-propynylcytosine

Para sa epektibong paghahatid ng mga antisense oligonucleotides, madalas silang nakabalot sa mga liposome, na binago naman ng mga partikular na ligand na nagbibigay ng naka-target na paghahatid (nakita na natin ang pamamaraang ito nang isaalang-alang namin ang mga pamamaraan ng hindi-viral na paghahatid ng mga therapeutic gene). Sa ngayon, ang isang bilang ng mga pagsubok ay isinagawa at isang mataas na therapeutic efficacy ng antisense oligonucleotides ay ipinakita upang sugpuin ang hindi gustong paglaganap ng makinis na mga selula ng kalamnan (mga komplikasyon pagkatapos ng angioplasty, coronary bypass surgery, atherosclerosis), para sa paggamot ng mga impeksyon sa viral at malaria .

Ang prinsipyo ng pagkilos at istraktura ng ribozymes - natural na RNA na may aktibidad ng nuclease, ay ipinapakita sa Fig. 3.23.
Napag-alaman na ang mga short-stranded na RNA na ito ay epektibong sugpuin ang pagpapahayag ng mga viral genes, oncogenes, growth factor, at iba pang therapeutically important genes sa pamamagitan ng pag-clear ng kanilang mRNA. Sa pamamagitan ng pagbabago sa pagkakasunud-sunod na nagbubuklod ng substrate, posible na makakuha ng mga ribozymes na tiyak sa isang partikular na mRNA. Ang mga ribozymes ay maaaring direktang ma-synthesize sa cell sa pamamagitan ng transkripsyon ng isang sintetikong oligodeoxyribonucleotide na naka-encode sa catalytic domain at nag-hybridize na mga rehiyon na nasa gilid nito.

kanin. 3.23. Pag-cleavage ng mRNA sa pamamagitan ng ribozymes. Ipinapakita ng arrow ang cleavage site.

Ang nasabing oligonucleotide ay ipinasok sa isang eukaryotic expression vector at inilagay sa isang cell. Ang nagreresultang RNA ay kusang nakakakuha ng aktibong conformation, ang tinatawag na hammerhead shape. Maraming mga ribozyme ng iba't ibang mga istraktura at aktibidad ang na-synthesize ng kemikal. Halimbawa, sa laboratoryo ng mga nucleic acid ng Institute of Chemical Biology at Experimental Medicine ng Siberian Branch ng Russian Academy of Sciences (Novosibirsk), maraming taon ng pananaliksik ang isinasagawa upang makakuha ng mga sintetikong ribozymes na may mas mataas na aktibidad at katatagan.

Upang madagdagan ang proteksyon laban sa napaaga na cleavage sa pamamagitan ng intracellular nucleases, ang iba't ibang derivatives ng ribozymes ay nakuha - na may methylated 2 "-hydroxyl (tingnan ang Fig. 3.22, d) na mga grupo, binary structures, atbp. Ang istraktura ng ribozyme molecule ay makabuluhang nakakaapekto sa pagiging epektibo nito. Figure Ipinapakita ng 3.24 ang kinetics ng mdr1 mRNA cleavage na may synthesized ribozymes ng iba't ibang mga istraktura.

kanin. 3.24. Cleavage ng 190-mer 5'-terminal fragment ng MDR1 mRNA na may binagong binary (1,3) at full-length (2,4) ribozymes: a - RNA structure na may nakahiwalay na partikular na site; b - akumulasyon ng mga produkto ng cleavage ( mga materyales na ibinigay ng A.G. Venyaminova, IBKhiFM, Novosibirsk)

Ang isang espesyal na lugar sa molecular therapy ay inookupahan ng tinatawag na prodrug activation method. Halimbawa, ang isa sa mga paraan ng gene therapy para sa cancer ay ang pagkasira ng mga tumor cells gamit ang isang activated derivative ng ganciclovir (GCV, isang derivative ng guanosine), isang produkto ng thymidine kinase gene, mula sa herpes simplex virus HSVtk na nabanggit na ng sa amin.

Ang mga selula ng tumor ay inilipat sa vivo kasama ang HSVtk gene sa ilalim ng isang aktibong tagataguyod at pagkatapos ng ilang araw, ang ganciclovir ay pinangangasiwaan, na kung saan ay phosphorylated ng viral thymidine kinase sa monophosphate at pagkatapos ay sa pamamagitan ng host cell kinases sa triphosphate. Pinipigilan ng derivative na ito ang DNA polymerase at pinipigilan ang synthesis ng DNA, na humahantong sa pagkamatay ng dumadami na mga cell. Sa pamamagitan ng mga intercellular contact, ang ganciclovir triphosphate ay tumagos sa mga kalapit na hindi nabagong mga cell at sa gayon ay sumisira ng karagdagang sampung tumor cells.

Ang gene na humahantong sa pagkamatay ng sariling cell ay tinatawag na "suicide" gene (sa aming kaso ito ay ang thymidine kinase gene), at ang terminong "prodrug" ay tumutukoy sa hindi aktibong anyo ng gamot (sa kasong ito ito ay ganciclovir). Ang diskarte na ito ay ginamit upang lumikha ng iba pang mga variant ng kumbinasyon ng gene activator-prodrug, ngunit ang pagiging epektibo ng GCV-HSVtk system ay napatunayan na sa isang bilang ng mga preclinical na pagsubok.

Ang gene therapy ay isang bagong medikal na disiplina, ang pagbuo nito ay nangyayari sa harap ng ating mga mata. Sa kabila ng ilang mga tagumpay at inaasahang mga prospect, may ilang mga hamon na nananatiling malagpasan.

Ang ilan sa mga problema ay higit pa sa medisina at molecular biology. Ito ay mga isyung etikal at pampulitika. Tulad ng napansin mo na, isinasaalang-alang namin ang mga pamamaraan ng genetic therapy para lamang sa mga somatic cell. Nangangahulugan ito na ang mga ginawang pagwawasto ay limitado sa isang partikular na organ o tissue, ang "naitama" na mga gene ay hindi maipapasa sa susunod na henerasyon. Ang mga pagbabago sa genotype ng mga selulang mikrobyo (sperm o itlog) o mga fertilized na selula ay dapat na maipasa mula sa henerasyon hanggang sa henerasyon.

Sa kasalukuyan, ang gene therapy ng mga somatic cell ay inuri bilang isang karaniwang paraan ng interbensyong medikal. Sa kaibahan, ang germ cell gene therapy ay mas kumplikado sa teknolohiya, may problema at hindi mahuhulaan. Samakatuwid, ang mga eksperimento sa lugar na ito ay ipinagbabawal sa maraming bansa.

Sa pagtatapos ng 80s. Sa Estados Unidos, ang mga regulasyon ay naitatag na namamahala sa mga pagsubok sa larangan ng somatic cell genetic therapy. Ginagarantiyahan nila ang isang walang kinikilingan at kinatawan na pagpili ng mga pasyente at ang kanilang kamalayan (kung gaano mapanganib ang paggamot, ano ang posibilidad ng tagumpay nito, atbp.), ang pagiging kompidensiyal ng impormasyon tungkol sa mga pasyente at mga pag-aaral na isinagawa, ang pagpapatupad ng lahat ng mga manipulasyon nang maayos nang hindi nagdudulot ng pinsala , kapwa sa mga partikular na pasyente at sa populasyon ng tao sa pangkalahatan.

Dahil ang paggamot ng mga somatic cells ay humahantong sa isang pagpapabuti sa kondisyon at isang makabuluhang pagpapahaba ng buhay ng mga pasyente na may genetic na sakit, ngunit ang "pinabuting" gene ay hindi minana, pinaniniwalaan na ito ay hahantong sa akumulasyon ng mga genetic na sakit sa ang populasyon ng tao. Gayunpaman, ayon sa genetics ng populasyon, ito ay tumatagal ng libu-libong taon para sa isang makabuluhang pagtaas sa dalas ng isang nakakapinsalang gene bilang resulta ng mabisang paggamot.

SA. Voinov, T.G. Volova