Fagocytoza Komórki nie tylko są zdolne do tworzenia pseudopodiów poprzez kurczenie się, ale wydzielają otaczające je płytki, które wiążą obce cząstki, takie jak cząsteczki kurzu, drobnoustroje, pozostałości martwych, zdegenerowanych komórek. Fakt, że leukocyty i inne ruchome komórki

Odporność Odporność (łac. immunitas - „wyzwolenie od czegoś”) to ochrona organizmu przed genetycznie obcymi organizmami i substancjami, do których należą mikroorganizmy, wirusy, robaki, różne białka, komórki, w tym własne zmienione. UWAGA Dzięki odporności

W literaturze opisano wiele metod ilościowego określania fagocytozy. Objętość tej książki nie pozwala nam szczegółowo opisać ich wszystkich, więc ograniczymy się do opisu tylko kilku.

Materiały i ekwipunek

Do pracy musisz mieć:

Antykoagulant cytrynianowo-dekstrozowy: 8 g kwasu cytrynowego. 22 g trójpodstawionego cytrynianu sodu (dwie wody), 24,5 g glukozy rozpuszcza się w 1 litrze wody;

Roztwór dekstrozodekstranu: 4,5 g NaCl, 25 g glukozy, 30 g dekstranu (względna masa cząsteczkowa 500 000) w 1 litrze;

Roztwór chlorku amonu: 9 części 0,83% chlorku amonu, 1 część buforu Tris-HCl pH 7,2 (20,6 g/l);

Mieszanina ficoll - vizotrast: 9 g ficoll, 20 ml vizotrast, 100 ml podwójnie destylowanej H2O, gęstość 1,077;

Substrat dla β-glukuronidazy: 31,5 mg p-nitrofenylo-β-glukuronidu i 100 µm Triton X 100 rozpuszcza się w 100 ml 0,05 M buforu octanu sodu o pH 5;

Odczynniki niedoboru mieloperoksydazy: utrwalacz (10 ml 37% formaldehydu z 90 ml etanolu absolutnego), roztwór substratu (100 ml 30% EDTA, 0,3 g chlorku benzydyny, 0,038 g ZnS0 4 x 7H 2 0, 1 ml wody destylowanej, 1,0 g CH 3C00Nax3H20, 0,7 ml 3% H202); doprowadzić pH 1,0 M NaOH do 6,0.

Odczynniki handlowe:

FSB, roztwór Hanka i pożywka Eagle-MEM (Państwowy Instytut Preparatów Odpornościowych i Pożywek, Berlin-Weissensee, NRD);

Heparyna (5000 IU/mg) (Gedeon Richter, Węgry);

Surowica z zarodków bydlęcych (Flow Laboratories, USA, można użyć innej firmy);

Visotrast (VEB Fahlberg List, Magdeburg, NRD);

Infucoll (VEB Serumwerk Bernburg, NRD);

Dekstran, ficoll (Pharmacia, Szwecja);

Węgiel koloidalny Cl1/143a (Wagner, Pelikanwerke, Niemcy);

ftalan diizodecylu, paradioksan (Coleman, Matheson and Bell, USA);

Triton X 100 (Serva, Niemcy, możliwa inna firma);

Oil red O (Allied Chemical Corp., Morristown, NY, USA);

Iaranitrofenylo-β-glukuronid (Sigma, USA);

Safranina O (Fischer Scientific Lab., Chicago, USA);

Kulki styropianowe, tuby (Nunc, Dania);

Siatka F 905 (VEB Orvo Wolfen, NRD).

Pozyskiwanie fagocytów

Niezbędne informacje na temat izolacji ludzkich granulocytów można znaleźć w rozdziale „Separacja komórek układu odpornościowego”; w celu uzyskania makrofagów otrzewnowych patrz rozdziały „Hodowla makrofagów i monocytów” oraz „Izolacja makrofagów z zawiesiny spleiocytów”. Kwestia ta jest szczegółowo rozpatrywana w wielu pracach.

Ponadto należy również wspomnieć o następujących metodach:

8 ml krwi miesza się z roztworem dekstranglukozy. Następnie dodać 6% roztwór dekstranu 75 w 0,15 M NaCl (5 ml). Mieszaninę pozostawia się na 45-50 minut w temperaturze pokojowej w celu sedymentacji erytrocytów. Zaaspirować osocze. Resztkowe erytrocyty poddaje się lizie przez dodanie 0,83% chlorku amonu (35 ml do 15 ml osocza). Wirować przez 10 minut przy 80 g, zawiesić osad w 0,15 M NaCl schłodzonym do 0°C. Połączyć kilka osadów i wirować przez 10 minut przy 800 g. Komórki najlepiej przechowywać na lodzie w 0,15 M NaCl (ta pożywka jest bardziej odpowiednia niż pożywka buforowana z dwuwartościowymi kationami, które powodują sklejanie się komórek);

Jeśli przedmiotem fagocytozy są drożdże, etap traktowania chlorkiem amonu można pominąć, ponieważ krwinki czerwone nie zakłócają tego procesu. Komórki jednojądrzaste można otrzymać w następujący sposób: heparynizowaną krew miesza się z 1/3 objętości pożywki Eagle'a zawierającej 15% glukozy, nawarstwia na warstwę mieszaniny ficoll - visotrast i wiruje przez 20 minut przy 400 g. Frakcję komórek jednojądrzastych odsysa się pipetą Pasteura, przemywa dwukrotnie PBS i przygotowuje zawiesinę w pożywce Eagle'a (1x107 komórek/ml).

Przygotowanie cząstek do fagocytozy

Częściej stosuje się żywe kultury Staphylococcus aureus (SG 511 lub 502 A), Staphylococcus epididermidis SG 475, E. coli i inne enterobakterie, listeria, corynebacteria, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae. Mikroorganizmy hoduje się przez 24 godziny (w razie potrzeby 48 godzin) na stałych i płynnych pożywkach. Zebraną biomasę przemywa się trzykrotnie 0,15 M NaCl. Zbyt gęsta zawiesina jest mierzona przy 640 nm, stężenie jest określane z krzywej kalibracyjnej.

Stężenie mikroorganizmów określa się również metodami przesiewania na gęstych pożywkach; w niektórych przypadkach zliczenie mikroorganizmów można przeprowadzić w komorach zliczeniowych.

Podczas pracy z żywymi kulturami bakteryjnymi należy uważać, aby zawsze używać kultur na tym samym etapie. Dodatek 0,01% albuminy surowicy bydlęcej sprzyja przeżywalności mikroorganizmów. Przygotowana zawiesina pozostaje stabilna przez 1-2 godziny.

Hodowle zabitych mikroorganizmów są zwykle uzyskiwane przez ogrzewanie przez 30 minut w temperaturze 80°C lub przez traktowanie przepływającą parą wodną. Zabite drobnoustroje przemywa się trzykrotnie 0,15 M NaCl, ponownie zawiesza i określa stężenie zawiesiny.

Przygotowanie drożdży piekarskich: 0,5 g drożdży piekarskich zawiesza się w 0,15 M NaCl i umieszcza we wrzącej łaźni wodnej na 30 minut. Przefiltrować przez filtr z gazy bawełnianej. W przypadku żywych drożdży, świeże komórki (hodowla 4-5 dniowa) przemywa się trzykrotnie w pożywce Eagle'a z dodatkiem 1,0% glukozy. Zwykle stosuje się zawiesinę komórek 108 i 109 komórek/ml. Drożdże są używane jako cząstki testowe do wykrywania defektów w składniku C5.

Przy użyciu zawiesiny cząstek polistyrenu: Przygotować 10% wodną zawiesinę cząstek polistyrenu o średnicy 1,091 μm. Rozcieńcza się go w stosunku 1 + 1 0,2% roztworem BSA w 0,15 M NaCl, odwirowuje. Przy długości fali 253 nm zawiesina polistyrenu 1 μg/ml daje absorpcję 1,17x10-3.

Aplikacja zawiesiny lipopolisacharydu - czerwieni olejowej O w oleju mineralnym: 2 g czerwieni olejnej rozciera się w moździerzu porcelanowym w 50 ml ftalanu diizodecylu (lub oleju wazelinowego). Wirować przez 20 min przy 500 g. Dodać 10 μg frakcji supernatantu do 10 ml dioksyny, zmierzyć gęstość optyczną przy długości fali 525 nm. Współczynnik konwersji wynosi 0,92. W drugim etapie 40 mg lipopolisacharydu (E. coli 0,26 B6 itd.) rozpuszcza się w 3 ml 0,15 M NaCl. Następnie do tej mieszaniny dodaje się 1 ml roztworu oleistej czerwieni O w siarczanie diizodecylu i mieszaninę zawiesza się na 90 sekund. Zawiesinę zużywa się natychmiast i można ją zamrozić.

Aby zainicjować reakcję fagocytozy, jako cząstki testowe można użyć sformalizowanych erytrocytów.

Fagocytoza bakterii, bakteriobójcze

Eksperyment z zawiesiną żywych bakterii: zwykle stosuje się stosunek 3-10 drobnoustrojów/fagocyt. W całkowitej objętości 2 ml miesza się 1x106 fagocytów z 3x106 - 1x107 drobnoustrojów. W praktyce 1 ml zawiesiny bakteryjnej dodaje się do 1 ml zawiesiny fagocytów, do której dodano 8 j.m. heparyny. Czas interakcji to zazwyczaj 30 minut, w niektórych przypadkach jest dłuższy. Po inkubacji pobiera się 0,5 ml mieszaniny, dodaje 1,5 ml 0,1% roztworu żelatyny w roztworze Hanka, schłodzonego do 0°C i wiruje przez 3-4 minuty przy 300 g. Z osadu sporządza się rozmazy, które barwi się metodą Pappenheima. Zobacz 200 komórek (jeśli to możliwe trzy razy). Oblicz procent fagocytozy. Na podstawie liczby bakterii zawartych w komórkach oblicza się wskaźnik aktywności fagocytozy: liczbę fagocytowanych bakterii mnoży się przez procent komórek fagocytujących; intensywność fagocytozy wyraża się liczbami od 1 do 4.

Stopień 1: Fagocytowane bakteriami I-4
Stopień 2: fagocytoza 5-7 bakterii
Stopień 3: fagocytoza 8-10 bakterii
Stopień 4: Ponad 10 bakterii na fagocytozę

Podczas określania poziomu fagocytozy żywych drobnoustrojów osobno sprawdza się osad komórkowy i frakcję supernatantu. Liczbę żywych drobnoustrojów określa się przesiewając na pożywki stałe 0,1 ml badanych frakcji. Inkubowane przez 24 (48) godzin Przy obliczaniu aktywności bakteriobójczej przyjmuje się, że jedna utworzona kolonia odpowiada jednemu żywemu drobnoustrojowi.

W celu ukierunkowanego badania działania bakteriobójczego krew pacjentów i zdrowych dawców jest badana z dodatkiem roztworu antybiotyku (5000 IU penicyliny i streptomycyny / ml) i bez niego, a także przeprowadzana jest kontrola bakteryjna. Skład próbki: 0,3 ml roztworu Hanka + 0,1 ml normalnej surowicy uzyskanej z krwi pobranej od 5 dawców + 0,5 ml zawiesiny leukocytów (10 7 komórek/ml) + 0,1 ml zawiesiny drobnoustrojów (10 6 drobnoustrojów/ml). Dodaje się roztwór antybiotyków w ilości 0,02 ml na próbkę. Inkubować próbki w temperaturze 37°C i określić liczbę drobnoustrojów po 20 minutach, 1,5 godziny i 3 godzinach. W tym celu z każdej próbki należy pobrać 0,1 ml, rozcieńczyć wybrane porcje roztworem Hanka 10, 100 i 1000 razy i nałożyć na ogrzany agar. Czasami, zwłaszcza po dodaniu antybiotyków, przygotowuje się rozcieńczenia pośrednie w celu dokładnego zliczenia drobnoustrojów (na przykład 0,2 ml próbki miesza się z 5 ml roztworu Hanka, wiruje przez 5 minut przy 450 g, osad rozpuszcza się w 1,9 ml PBS, nałożony na agar). Jeśli chcesz skrócić czas trwania badania bakteriologicznego, możesz określić drobnoustroje wewnątrz komórki za pomocą fluorescencji przy użyciu barwienia żółcią akrydynową.

Fagocytoza drożdży piekarskich: przygotować zawiesinę 109 komórek/ml w 0,15 M NaCl. Zmieszać 0,1 ml zawiesiny z 0,1 ml osocza pacjenta, inkubować przez 30 minut w temperaturze 37°C, dodać 0,2 ml (10 6) PMNL, inkubować przez 30 minut. Porcje pobiera się w odstępach od 5 do 30 minut. Zlicza się 100 PMN i określa liczbę wychwyconych cząstek drożdży na komórkę. Znana jest następująca modyfikacja: 50 µl surowicy testowej dodaje się do 50 µl surowicy świnki morskiej (wcześniej rozcieńcza się ją w stosunku 1 + 1 pożywką Eagle'a z glukozą), 50-200 µl zawiesiny leukocytów ( 107 komórek/ml), objętość doprowadza się do 450 ul za pomocą pożywki Needle z glukozą i inkubuje przez 30 min w 37°C. Następnie dodać 50 μl zawiesiny drożdży (10 8 komórek/ml), wymieszać, inkubować przez 40 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 50 μl L-75 Se-metioniny (całkowita aktywność 100 kBq), wymieszać i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Komórki wytrąca się przez wirowanie przez 5 minut przy 1000 g, przemywa się je dwukrotnie PBS, radioaktywność mierzy się na liczniku gamma. Procent fagocytowanych drożdży oblicza się według wzoru:

Fagocytoza przy użyciu roztworu czerwieni olejowej w oleju mineralnym: 0,2 ml zawiesiny cząstek miesza się z 0,8 ml zawiesiny komórek podgrzanej do 37°C. Po 5 minutach inkubacji dodaje się 6 ml 0,15 M roztworu NaCl schłodzonego do 0°C zawierającego 126 μg/l N-etylomaleimidu (aby zatrzymać wychwytywanie cząstek). Wirować przez 10 minut przy 250 g. Frakcję znad osadu odrzuca się, osad ponownie zawiesza w roztworze NaCl i N-etylomaleimidu (patrz powyżej), komórki przemywa się dwukrotnie. Komórki poddaje się lizie za pomocą ultradźwięków, uwalnia się czerwień olejowa. Dodać 1 ml dioksanu. Wirować przez 15 minut przy 500 g, zmierzyć gęstość optyczną przy długości fali 525 nm względem czystego dioksanu. Stopień fagocytozy (IF) określa się jako ilość oleju mineralnego (mg) wchłanianego na minutę przez 107 komórek. Możesz użyć następującego wzoru do obliczenia:

Badanie fagocytozy w monowarstwie makrofagów:

1. Faza: 2 ml zawiesiny komórek (200 000 komórek/ml) dodaje się do sterylnych probówek polistyrenowych. Zaszczepiać przez 5 godzin w temperaturze 37°C, następnie przemyć pożywką Eagle'a. 2 ml pożywki hodowlanej z 10% inaktywowaną (30 min, 56 °C) surowicą zarodków bydlęcych dodaje się do probówek, inkubuje w temperaturze 37 °C.

2. Faza A: wprowadza się zawiesinę drobnoustrojów (3-10/makrofagów), inkubuje przez 30-60 min w temp. 37°C, probówki przepłukuje się 6-krotnie porcjami po 3 ml pożywki w celu usunięcia niesfagocytowanych drobnoustrojów. Natychmiast utrwalić mieszaniną 1 części lodowatego kwasu octowego i 3 części metanolu. Wybarwić preparat wg May - Griinwald, policzyć komórki.

Faza B: oznaczanie żywych bakterii wewnątrzkomórkowych. Kolejność czynności jest taka sama jak w fazie A przed etapem utrwalania. Po umyciu ostrożnie usuń wszelkie ślady pożywki. Komórki poddaje się lizie, do której dodaje się 2 ml 0,01% sterylnego roztworu albuminy surowicy bydlęcej (4°C), wielokrotnie wstrząsając. Większość komórek ulega lizie po 20 minutach. Uwolnione bakterie określa się przez przesiewanie na gęstej pożywce.

Fagocytoza erytrocytów: zmieszać 4x107 fagocytów z 5x107 testowymi erytrocytami w 5 ml PBS. Przenieść 2 ml mieszaniny do 5 mM buforu fosforanowego schłodzonego do 0°C i odwirować. Zmierzyć gęstość optyczną frakcji supernatantu przy długości fali 420 nm. Stopień fagocytozy określa się na podstawie spadku zawartości hemoglobiny w fazie wolnej od komórek za pomocą krzywych kalibracyjnych.

Uproszczona metoda określania luzu

Przykład oznaczania klirensu u szczurów: zwierzętom wstrzykuje się dootrzewnowo 5x107 drobnoustrojów na 100 g wagi (0,1 ml/100 g). Optymalna dawka może wynosić od 10 6 do 10 8 na 100 g wagi. W odstępie 1-2 godzin ubija się 3 osobniki z każdej grupy zwierząt doświadczalnych; całkowity czas trwania eksperymentu 16 godzin. Sterylnie pobrać 0,5 ml krwi z serca, 1 ml płynu otrzewnowego, wydzielić płuca, wątrobę, śledzionę i nerki. Cylindry wycina się z tkanki narządu za pomocą pipety Pasteura. Określ liczbę mikroorganizmów, hodując na płynnych i stałych pożywkach.

Przykład oznaczania klirensu u myszy: stosuje się węgiel koloidalny lub baranowe erytrocyty znakowane 51 [Cr]. Myszom (co najmniej 5 osobników na doświadczenie) wstrzykuje się dożylnie 0,01 ml zawiesiny węgla w dawce 16 mg na 100 g wagi. W ciągu 15 minut w odstępie 2 minut pobiera się 0,025 ml krwi z przestrzeni zaoczodołowej. Wybrane 0,025 ml krwi dodaje się do 2,0 ml 0,1% roztworu Na2C03. Po hemolizie stężenie węgla określa się kolorymetrycznie przy długości fali 675 nm, stosując krzywe kalibracyjne.

t to czas w minutach, C to stężenie węgla w próbce.

Skorygowana wartość fagocytozy:

Funkcjonalne badanie przesiewowe fagocytów

Oznaczanie degranulacji (pomiar aktywności (β-glukuropidaza): 107 leukocytów zawiesza się w 0,8 ml PBS w plastikowych probówkach, wytrząsa przez 5 minut w temperaturze 37°C. Dodać 0,2 ml uczulonego LPS, cząstki fluorochromowe (FC 80), schłodzić 30 minuty na lodzie, wirować przez 10 minut przy 250 g Sprawdzić aktywność enzymu we frakcji supernatantu 0,9 ml mieszaniny substratów inkubować przez 18 godzin z 0,1 ml badanej frakcji Dodać 2 ml 0,1 M NaOH, zmierzyć gęstość optyczną na fali 410 nm.

Zapłata:

(OD 410 x 20)/(1,84 x 18) = liczba nmoli substancji uwolnionej w ciągu 1 godziny przez 107 leukocytów, tj. stopień degranulacji jest wyrażony w nanomolach paranitrofenylo-β-glukuronidu.

Metoda oznaczania defektów w mieloperoksydazie: najlepsze wyniki uzyskuje się przez biochemiczne oznaczenie H 2 0 2, wskazujące na zmiany w metabolizmie podczas fagocytozy. Ze względów praktycznych bardzo ważne jest, aby aktywacja przecieku heksozomonofosforanowego, redukcja nitroenu tetrazoliowego i wiązanie egzogennego jodu z białkami PMNL korelowały z tworzeniem H 2 0 2 . Zwykły rozmaz krwi utrwala się przez 30 sekund mieszaniną alkoholu i formaliny. Przemyto wodą destylowaną i barwiono na obecność peroksydazy przez 30 sekund. W komórkach zawierających peroksydazę wykrywa się inkluzje zabarwione na ciemnoniebiesko.

Test redukcji błękitu nitro tetrazoliowego (TNS). THC jest redukowane przez normalny PMNL do formazanu. Zmieszać z 0,1 ml krwi 0,1 ml 0,1% roztworu THC w 0,15 M NaCl, inkubować 20 minut w 37°C, ponownie dokładnie wymieszać. Wbudowanie formazanu do komórek określa się za pomocą mikroskopii. Wynik wyraża się jako procent komórek dodatnich pod względem formazanu.

Następująca metoda jest nieco bardziej skomplikowana: 1 kroplę krwi pacjenta nakłada się na szkiełko nakrywkowe. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37°C w wilgotnej komorze, następnie ostrożnie przemyć szkło sterylnym 0,15 M NaCl. Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku zawierającym 1 kroplę pożywki THC (0,5 ml surowicy + 0,3 ml sterylnego 0,15 M NaCl + 0,6 ml THC, patrz wyżej). Inkubować przez 30 minut w wilgotnej komorze w temperaturze 37°C, zdjąć szkiełko nakrywkowe i wysuszyć na powietrzu. Utrwalić absolutnym metanolem przez 60 sekund i przemyć wodą destylowaną. Barwić przez 5 min safraniną (1 g safraniny + 100 ml wody destylowanej + 40 ml gliceryny), przemyć. Komórki dodatnie pod względem formazanu są duże, podobne do blastów i zawierają niebieskie ziarnistości. Zwykle w preparacie wykrywa się około 30% komórek formazan-dodatnich.

Powyższe metody oceny fagocytozy są podsumowaniem bardzo dużej liczby publikacji. Bardziej szczegółowe informacje na ten temat można znaleźć w odpowiednich pracach.

Fagocytoza (z greckiego phago – pożeram i cytos – komórka) to proces wchłaniania i trawienia substancji antygenowych, w tym mikroorganizmów, przez komórki pochodzenia mezodermalnego, zwane fagocyty. I. I. Miecznikow podzielił fagocyty na makrofagi i mikrofagi. Obecnie makro- i mikrofagi są zjednoczone pojedynczy system makrofagów (SMF). Ten system obejmuje:

• makrofagi tkankowe - komórki nabłonkowe,
• gwiaździste retikuloendoteliocyty (komórki Kupffera),
• makrofagi pęcherzykowe i otrzewnowe zlokalizowane w pęcherzykach płucnych i jamie otrzewnej,
• białe wyrostki naskórkowe skóry (komórki Langerhansa) itp.

Mikrofagi obejmują:

• neutrofile,
• eozynofile,
• bazofile.

Funkcje makrofagów niezwykle zróżnicowane. Jako pierwsze reagują na obcą substancję, będąc wyspecjalizowanymi komórkami, które absorbują i niszczą obce substancje w organizmie (komórki obumierające, komórki nowotworowe, bakterie, wirusy i inne mikroorganizmy, antygeny, niemetabolizowane substancje nieorganiczne). Ponadto makrofagi wytwarzają wiele substancji biologicznie czynnych - enzymy (m.in. lizozym, peroksydaza, esteraza), białka dopełniacza, immunomodulatory, takie jak interleukiny. Obecność na powierzchni makrofagów receptorów dla immunoglobulin (Am) i dopełniacza oraz układu mediatorów zapewnia ich interakcję z limfocytami T i B. Jednocześnie makrofagi aktywują funkcje ochronne limfocytów T. Ze względu na obecność receptorów dla dopełniacza i Am oraz układu zgodności tkankowej Ag (HLA), makrofagi biorą udział w wiązaniu i rozpoznawaniu antygenów. Tak więc fagocyty pełnią trzy funkcje:

• ochronny, związany z oczyszczaniem organizmu z czynników zakaźnych, produktów rozpadu tkanek itp .;
• reprezentowanie, polegające na prezentacji antygenowych epitoli limfocytom na błonie fagocytów;
• wydzielniczy, związany z wydzielaniem enzymów lizosomalnych i innych substancji biologicznie czynnych – cytokin, które odgrywają ważną rolę w immunogenezie.

Następujące sekwencyjnie płyną etapy fagocytozy.

• Chemotaksja– ukierunkowany ruch fagocytów w kierunku gradientu chemicznego chemoatraktantów w środowisku. Zdolność do chemotaksji związana jest z obecnością na błonie swoistych receptorów dla chemoatraktantów (obiektów fagocytozy), którymi mogą być bakterie, produkty degradacji tkanek organizmu itp.
• Przyczepność(przywiązanie) jest również pośredniczone przez odpowiednie receptory, ale może przebiegać zgodnie z prawami nieswoistych oddziaływań fizyko-chemicznych. Cząsteczki są adsorbowane na powierzchni makrofaga.
• Endocytoza(przechwytywanie) - następuje inwazja błony komórkowej, wychwytywanie obcej cząstki i jej zanurzenie w protoplazmie. W wyniku endocytozy powstaje wakuola fagocytarna - fagosom(tj. bańka w protoplazmie wokół zaabsorbowanej cząstki).
• trawienie wewnątrzkomórkowe- rozpoczyna się od wchłonięcia fagocytowanych obiektów. Fagosom łączy się z lizosomem fagocytu, który zawiera dziesiątki enzymów i następuje tworzenie fagolizosomu (zniszczenie) przechwyconej cząstki przez enzymy. Kiedy cząsteczka należąca do samego organizmu zostanie wchłonięta (na przykład martwa komórka lub jej części, własne białka), jest rozkładana przez enzymy fagolizosomów na substancje nieantygenowe (aminokwasy, kwasy tłuszczowe, nukleotydy, monocukry). Jeśli obca cząstka zostanie wchłonięta, enzymy fagolizosomu nie są w stanie rozbić substancji na składniki nieantygenowe. W takich przypadkach fagolizosom wraz z pozostałą częścią antygenu, który zachował swoją obcość, jest przekazywany przez makrofagi do limfocytów T i B, czyli włączane jest specyficzne ogniwo odpornościowe.

funkcja wydzielnicza to wydzielanie przez fagocyty substancji biologicznie czynnych – cytokin – są to interleukina-1 i interleukina-2, które są komórkowymi mediatorami regulującymi proliferację, różnicowanie i funkcję fagocytów, limfocytów, limfoblastów i innych komórek. Makrofagi wytwarzają i wydzielają tak ważne czynniki regulacyjne, jak prostaglandyny, leukotrieny, cykliczne nukleotydy o szerokim zakresie aktywności biologicznej. Ponadto makrofagi syntetyzują i wydzielają szereg produktów o działaniu przeciwbakteryjnym, przeciwwirusowym i cytotoksycznym (rodniki tlenowe O2-H2O2, lizozym, interferon itp.).

Fagocytoza jest wzmacniana przez przeciwciała opsoninowe, ponieważ związany lub antygen jest łatwiej adsorbowany na powierzchni fagocytu, ze względu na obecność receptorów dla tych przeciwciał w tym ostatnim. To wzmocnienie fagocytozy przez przeciwciała nazywa się opsonizacja, tj. przygotowanie mikroorganizmów do wychwytywania przez fagocyty. Fagocytoza opsonizowanych antygenów nazywana jest immunologiczną.

Aby scharakteryzować aktywność fagocytozy wprowadzono indeks fagocytarny. Aby to ustalić, pod mikroskopem zlicza się liczbę bakterii wchłoniętych przez jeden fagocyt. Również cieszyć się indeks opsonofagocytarny reprezentujący stosunek parametrów fagocytarnych uzyskanych dla surowicy immunologicznej i nieimmunologicznej. Indeks fagocytarny i indeks opsonofagocytowy są wykorzystywane w immunologii klinicznej do oceny stanu odporności i statusu immunologicznego.

Fagocytoza odgrywa ważną rolę w ochronie przeciwbakteryjnej, przeciwgrzybiczej i przeciwwirusowej, utrzymując odporność organizmu na obce substancje. Fagocyty działają również aktywująco i supresyjnie na limfocyty, biorą udział w resuscytacji tolerancji immunologicznej, odporności przeciwinfekcyjnej, transplantacyjnej i przeciwnowotworowej oraz niektórych form alergii (HTZ).

Proces fagocytozy (wchłaniania ciała stałego) składa się z pięciu etapów.

• 1. Aktywacja (zwiększony metabolizm energetyczny). Czynnikami aktywacji i chemotaksji są produkty bakteryjne (LPS, peptydy), składniki dopełniacza (C3 i C5), cytokiny i przeciwciała.
• 2. Chemotaksja.
• 3. Przyczepność.
• 4. Wchłanianie.
• 5. Wynik fagocytozy.

Adhezja związana jest z obecnością na powierzchni fagocytów szeregu receptorów (dla fragmentów Fc przeciwciał, składników dopełniacza, fibronektyny), które zapewniają siłę oddziaływań receptorowych opsonin, które otaczają mikroorganizmy i ograniczają ich ruchliwość (przeciwciała, C3b, fibronektyna).

Fagocyty posiadają pseudopodia podobne do ameby. Po wchłonięciu tworzy się fagosom z wchłoniętym obiektem (bakterią), lizosom zawierający enzymy lityczne łączy się z nim i tworzy fagolizosom.

Istnieją trzy możliwe wyniki fagocytozy:

• - pełna fagocytoza;
• - niepełna fagocytoza;
• - przetwarzanie antygenów.

Zakończona fagocytoza to całkowite trawienie mikroorganizmów w komórce fagocytującej.

W procesie fagocytozy dochodzi do „eksplozji oksydacyjnej” z wytworzeniem reaktywnych form tlenu, co zapewnia efekt bakteriobójczy.

Jedną z najważniejszych funkcji makrofagów (obok chemotaksji, fagocytozy, wydzielania substancji biologicznie czynnych) jest przetwarzanie (przetwarzanie) antygenu i jego prezentacja komórkom immunokompetentnym z udziałem białek klasy głównego układu zgodności tkankowej (MHC) 2.

Fagocytoza to nie tylko niszczenie obcego, ale także prezentacja antygenu w celu wywołania reakcji immunologicznych oraz wydzielanie mediatorów reakcji immunologicznych i zapalnych. System makrofagów jest centralnym ogniwem nie tylko naturalnej odporności (odporności gatunkowej), ale także odgrywa ważną rolę w odporności nabytej, współpracy komórek w odpowiedzi immunologicznej.

Zapalenie jako reakcja obronna organizmu na różnego rodzaju uszkodzenia tkanek powstało na wyższym etapie ewolucji niż fagocytoza i jest charakterystyczne dla organizmów wysoko zorganizowanych z układem krwionośnym i nerwowym.

Zapaleniu zakaźnemu towarzyszą różne reakcje naczyniowe i komórkowe (w tym fagocytoza), a także uruchomienie szeregu mediatorów reakcji zapalnych (histamina, serotonina, kininy, białka ostrej fazy zapalenia, leukotrieny i prostaglandyny, cytokiny, system).

Wiele produktów bakteryjnych aktywuje komórki układu makrofagowo-monocytowego oraz limfocyty, które reagują na nie uwalniając produkty aktywne biologicznie – cytokiny, w szczególności interleukiny. Można je scharakteryzować jako mediatory komórkowej odpowiedzi immunologicznej. Główną rolę w reakcjach zapalnych odgrywa interleukina-1 (IL-1), która pobudza gorączkę, zwiększa przepuszczalność naczyń i właściwości adhezyjne śródbłonka oraz aktywuje fagocyty.

Gorączka. Wzrost temperatury ciała jest reakcją obronną organizmu, która pogarsza warunki rozmnażania się wielu mikroorganizmów, aktywuje makrofagi, przyspiesza przepływ krwi i nasila procesy metaboliczne w organizmie.

Funkcja barierowa węzłów chłonnych. Według P.F. Zdrodovsky'ego (1969) węzły chłonne są rodzajem filtra biologicznego dla patogenów przenoszonych z limfą. Tutaj mikroorganizmy, które przeniknęły przez skórę lub błony śluzowe i są przenoszone przez prąd limfy, są zatrzymywane i narażone na działanie makrofagów i aktywowanych limfocytów.

Układ dopełniacza to kompleks białek i glikoprotein w surowicy krwi ludzi i kręgowców (jest ich ponad 20). Poszczególne składniki pośredniczą w procesach zapalnych, opsonizacji obcych fragmentów do późniejszej fagocytozy, uczestniczą wraz z makrofagami w bezpośrednim niszczeniu mikroorganizmów i innych obcych komórek (liza bakterii i wirusów). W warunkach fizjologicznych składniki układu dopełniacza występują w postaci nieaktywnej. Istnieją trzy sposoby aktywacji układu dopełniacza – klasyczna, alternatywna i za pomocą bocznika C1.

Szlak klasyczny – kaskada reakcji proteazy ze składnika C1q do C9 – jest realizowany w obecności przeciwciał przeciwko odpowiedniemu antygenowi. Składnik C1q oddziałuje z kompleksem „antygen-przeciwciało”, następnie C4, a następnie C2. Tworzy się kompleks „antygen-przeciwciało-C1C4C2”, z którym łączy się C3 (centralny składnik układu) i uruchamia łańcuch aktywacji z funkcjami efektorowymi (opsonizacja i liza bakterii, aktywacja układu makrofagów, stan zapalny) .

Alternatywna droga jest realizowana podczas pierwszego kontaktu z patogenem (kiedy nie ma jeszcze przeciwciał). Jest indukowany przez LPS i inne antygeny drobnoustrojów. C1, C4, C2 nie są zaangażowane, ścieżka alternatywna i klasyczna łączą się na poziomie C3.

układ interferonowy.

Interferony to syntetyzowane przez różne komórki organizmu glikoproteiny o szerokim zakresie aktywności biologicznej (głównie przeciwwirusowej), stanowiące szybką reakcję organizmu na otrzymanie przez komórki niespecyficznego sygnału obcości. Istnieje cały system interferonów, które są podzielone na podtypy alfa, beta i gamma o wyraźnej heterogeniczności właściwości. Działanie przeciwwirusowe przejawia się w zdolności do hamowania wewnątrzkomórkowego namnażania się wirusów DNA i RNA (głównie w wyniku zablokowania syntezy makrocząsteczek wirusowych). Indukcję syntezy interferonu wywołują wirusy, bakterie, riketsje, pierwotniaki, związki syntetyczne.

komórki zabójcze.

W zapewnieniu odporności gatunkowej istotną rolę odgrywają limfocyty T-cytotoksyczne (T-killery) oraz główny układ zgodności tkankowej (więcej szczegółów w kolejnych wykładach).

T-killery, prezentując antygeny głównego układu zgodności tkankowej klasy 1, rozpoznają wszelkie obce antygeny (w tym zmutowane, np. komórki nowotworowe), atakują je i niszczą.

Komórki NK (naturalni zabójcy) są ważne w utrzymaniu homeostazy genetycznej i ochronie przeciwnowotworowej, ich funkcje rozpoznawania nie zależą od prezentacji antygenów MHC klasy 1 (główny kompleks zgodności tkankowej).

Systemy odporności nieswoistej i odporności gatunkowej przyczyniają się do utrzymania integralności strukturalnej i funkcjonalnej organizmu oraz są podstawą do kształtowania się odporności nabytej (swoistej). Dokując na tym wyższym poziomie, systemy swoistej i nabytej odporności tworzą jeden i najskuteczniejszy system samoobrony organizmu przed wszystkim obcym.

Układ odpornościowy.

Układ odpornościowy to zestaw narządów, tkanek i komórek, które zapewniają komórkową i genetyczną stałość organizmu. Zasady czystości antygenowej (genetycznej) opierają się na rozpoznawaniu „własnego obcego” i są w dużej mierze zdeterminowane przez system genów i glikoprotein (produktów ich ekspresji) – główny kompleks zgodności tkankowej (MHC), często nazywany HLA (ludzki antygeny leukocytów) u ludzi. Białka MHC ulegają wyraźnej ekspresji na ludzkich leukocytach, antygeny MHC są typowane przy użyciu badania leukocytów.

narządy układu odpornościowego.

Istnieją centralne (szpik kostny - narząd krwiotwórczy, grasica lub grasica, tkanka limfatyczna jelita) i obwodowe (śledziona, węzły chłonne, nagromadzenie tkanki limfatycznej we własnej warstwie błon śluzowych typu jelitowego) narządy odporności.

Komórki progenitorowe komórek immunokompetentnych są wytwarzane przez szpik kostny. Niektórzy potomkowie komórek macierzystych stają się limfocytami. Limfocyty dzielą się na dwie klasy - T i B. Prekursory limfocytów T migrują do grasicy, gdzie dojrzewają do komórek, które mogą uczestniczyć w odpowiedzi immunologicznej. U ludzi limfocyty B dojrzewają w szpiku kostnym. U ptaków niedojrzałe komórki B migrują do kaletki Fabrycjusza, gdzie osiągają dojrzałość. Dojrzałe limfocyty B i T kolonizują obwodowe węzły chłonne. Tak więc centralne narządy układu odpornościowego przeprowadzają tworzenie i dojrzewanie komórek immunokompetentnych, narządy obwodowe zapewniają odpowiednią odpowiedź immunologiczną na stymulację antygenową - „przetwarzanie” antygenu, jego rozpoznawanie i klonalną proliferację limfocytów – różnicowanie zależne od antygenu.