Председатели: Т.В. Овчинникова, Н.Ф. Мясоедов

Сесия 1
Председатели: Н.Ф. Мясоедов, Т.В. Овчинникова
Голяма зала
19 септември, 9:30 - 11:30

25 минН.Ф. Мясоедов

Лекарства на базата на пептиди

20 минути S.A. Лимбор Институт по молекулярна генетика РАН, Москва, Русия

Молекулярно-генетични механизми на пептидна регулация

15 минути RU. Островская

Ноопепт - нови механизми на действие и перспективи за употреба

15 минути Т.Н. Соллертинская 1 , М.В. Шорохов 1 , Н.Ф. Мясоедов 2 , л.а. Андреева 2 1 Институт по еволюционна физиология и биохимия. ТЯХ. Сеченов Руска академия на науките, Санкт Петербург; 2 Институт по молекулярна генетика РАН, Москва, Русия

Характеристики на невропептидна корекция на когнитивни и психо-емоционални разстройства при синдром на хронична умора при бозайници (еволюционни аспекти на изследването)

15 минути И.И. Бобинцев, О.И. Сороколетова, А.Е. Бяло Курски държавен медицински университет, Курск, Русия

Изследване на анксиолитичните и аналгетичните ефекти на пептида Gly-His-Lys (GHK) и неговите структурни аналози

Сесия 2
Председатели: С.Н. Кочетков, Т.В. Овчинникова
Голяма зала
19 септември, 16:00 - 18:00 часа

25 минС.Н. Кочетков

Нови инхибитори на развитието на социално значими инфекции

20 минутиТ.В. Овчинникова Институт по биоорганична химия. ММ.

Терапевтичен потенциал на антимикробните пептиди

15 минути В.Н. Кокряков 1.2 , O.V. Шамова 1,2 , Г.М. Алешина 1 , М.Н. Берлов 1,2 , Т.В. Овчинникова 3 1 Институт по експериментална медицина, Санкт Петербург; 2 Санкт Петербургски държавен университет, Санкт Петербург; 3 Институт по биоорганична химия

Постиженията на националната школа на биохимиците в изследването на структурата и функциите на антибиотичните пептиди от животински произход

15 минути О.В. Шамова 1, 2, М.С. Жаркова 1 , П.М. Копейкин 1 , Т.А. Лукянова 1 , А.Ю. Артамонов 1 , С.В. Баландин 3 , Т.А. Филатенкова 1 , А.С. Назаров 1,2 , К.Е. Сафиулина 1 , М.С. Сухарев 1 , Т.Ю. Пазина 1 , Т.М. Гринчук 4 , В.Н. Кокряков 1,2 , Т.В. Овчинникова 3 , Д.С. Орлов 1.2 1 Институт по експериментална медицина, Санкт Петербург; 2 Санкт Петербургски държавен университет, Санкт Петербург; 3 Институт по биоорганична химия ММ. Шемякин и Ю.А. Овчинников РАН, Москва; 4 Институт по цитология РАН, Санкт Петербург, Русия

Богатите на пролин пептиди на вродения имунитет като прототипи на нови антимикробни и противотуморни лекарства

15 минути Т.Е. Елисеев 1, И.Н. Тертеров 1 , О.В. Шамова 2 , М.В. Тояга 1 1 Академичен университет в Санкт Петербург; 2 Институт по експериментална медицина, Санкт Петербург, Русия

Използване на модели на аминокиселинна последователност за проектиране на алфа-спирални антимикробни пептиди

15 минутиМ.Н. Берлов 1,2, E.S. Умнякова 1 , А.В. Соколов 1 , Т.В. Овчинникова 3 , В.Н. Кокряков 1.2 1 Институт по експериментална медицина, Санкт Петербург; 2 Санкт Петербургски държавен университет, Санкт Петербург; 3 Институт по биоорганична химия ММ. Шемякин и Ю.А. Овчинников РАН, Москва, Русия

Взаимодействие на катионни антимикробни пептиди с C1q протеин и техния ефект върху активирането на комплемента

Сесия 3
Председатели: Н.Ф. Мясоедов, Л.П. Овчинников
Голяма зала
20 септември, 9:30 - 11:30

25 мин Л.П. Овчинников 1 , Н.В. Бобкова 2 1 Институт по протеин RAS, Пущино; 2 Институт по биофизика на клетката РАН, Пущино, Русия

Разработване на иновативно лекарство срещу болестта на Алцхаймер на базата на протеина YB-1

20 минути О.М. Волпина 1, Д.О. Короев 1 , Т.Д. Волкова 1 , А.В. Каминина 1 , М.П. Филатова 1 , С.М. Баласанянц 1 , Н.И. Медвинская 2, П.В. Некрасов 2 , И.В. Нестерова 2 , А.Н. Самохин 2 , Н.В. Бобкова 2 1 ММ. Шемякин и Ю.А. Овчинников РАН, Москва; 2 Институт по биофизика на клетката РАН, Пущино, Московска област, Русия

Защитна активност на пептидите при невродегенеративни процеси от типа на Алцхаймер

15 минутиА.В. Талерова Изследователски институт по фармакология. В.В. Закусова, Москва, Русия

Дипептидният миметик на мозъчния невротрофичен фактор GSB-106 е обещаващ антидепресант от ново поколение

15 минути К.Н. Колясникова, Т.А. Гудашева, С.Б. Середенин Изследователски институт по фармакология. В.В. Закусова, Москва, Русия

Заместен глипролин GZK-111 - нов дипептид с анксиолитична и невропротективна активност

15 минути А.В. Аветисян 1 , Р.А. Зиновкин 1 , Р.А. Симонян 1 , П.В. Некрасов 2 , А.Н. Самохин 2 , Д.О. Короев 3 , О.М. Волпина 3 , Н.В. Бобкова 2 1 Изследователски институт по физико-химична биология. А.Н. Белозерски Московски държавен университет, Москва; 2 Институт по клетъчна биофизика РАН, Пущино; 3 Институт по биоорганична химия ММ. Шемякин и Ю.А. Овчинников РАН, Москва, Русия

Синтетичните пептиди към извънклетъчния домен RAGE възстановяват митохондриите в мозъка на мишки с булбектомия

15 минутиПО дяволите. Слободина 1.2, O.I. Болшакова 1 , А.Л. Шварцман 1 , С.В. Саранцева 1 1 Национален изследователски център "Курчатовски институт", Институт по ядрена физика в Санкт Петербург. Б.П. Константинова, Гатчина; 2 Санкт Петербургски политехнически университет Петър Велики, Санкт Петербург, Русия

Комбинирани пептиди като обещаващи съединения за лечение на болестта на Алцхаймер

Сесия 4
Председател: Е.Д. Свердлов
Голяма зала
20 септември, 16:50 - 18:50

15 минути В.А. Миткевич, А.А. Макаров Институт по молекулярна биология. В.А. Engelhardt RAS, Москва, Русия

Разработване на противотуморно лекарство на основата на рибонуклеаза биназа

15 минутиА.В. Степанов 1,2 , A.A. Белогуров 1,2 , А.Г. Гъбибов 1.2 1 Институт по биоорганична химия. ММ. Шемякин и Ю.А. Овчинников РАН, Москва; 2 Казански (Поволжски) федерален университет, Казан, Русия

Използването на химерни Т-клетъчни антигенни рецептори, слети с В-клетъчен рецепторен лиганд за лечение на неходжкинови лимфоми

15 минути В.А. Рихтер 1 , Е.В. Кулигина 1 , О.В. Ковал 1 , Г.В. Кочнева 2 , А.А. Newise 1, A.A. Макарцова 1 , О.С. Троицкая 1 1 Институт по химична биология и фундаментална медицина SB RAS, Новосибирск, Русия 2 Държавен изследователски център по вирусология и биотехнология, Колцово, Новосибирска област, Русия

Начини за повишаване на противотуморната ефикасност на Lactaptin

15 минутиА.А. Розенкрантс, Т.А. Сластникова, А.В. Уласов, КАТО. СоболевИнститут по генна биология RAS; Московски държавен университет М.В. Ломоносов, Москва, Русия

Целенасочена вътреклетъчна доставка на противоракови агенти с помощта на модулни нанотранспортери

15 минутиИ.В. Алексеенко Институт по молекулярна генетика RAS; Институт по биоорганична химия. ММ. Шемякин и Ю.А. Овчинников РАН, Москва, Русия

Проблеми и перспективи на лекарствата за генна терапия за лечение на рак

15 минутиД.В. Сверчински, В.Ф. Лазарев, И.В. Гужова, Б.А. Маргулис Институт по цитология РАН, Санкт Петербург, Русия

Модулатори на активността на шаперона на Hsp70 и техния антитуморен потенциал

15 минутиС.С. Ларин, М.И. Лукашина, А.В. Кибардин, А.В. Посвятенко, Е.Ю. Лисюк, Г.П. Георгиев Институт по генна биология РАН, Москва, Русия

Мембранно свързани и разтворими форми на индуцирани от стрес МНС-подобни молекули като обещаващи маркери в диагностиката и терапията на злокачествени тумори

Сесия 5
Председатели: Н.Ф. Мясоедов, В.А. стоник
Голяма зала
21 септември, 9.30 - 11.30 ч

25 минВ.А. стоник Тихоокеански институт по биоорганична химия. Г. В. Елякова, Далекоизточен клон на Руската академия на науките, Владивосток, Русия

От изследване на морски природни съединения до нови идеи и биологични продукти

20 минути П.В. Сергиев 1.2, I.A. Остерман 1,2, Е.С. Комарова 1,2 , А.А. Богданов 1 , О.А. Донцова 1.2 1 Московски държавен университет М.В. Ломоносова, 2 Сколковски институт за наука и технологии, Москва, Русия

Търсене на нови антибиотици и изследване на механизма им на действие

15 минутиЯ.Р. Паникратова 1 , И.С. Лебедева 1, О.Ю. Соколов 1 , Д.А. Куприянов 2 , А.Д. Румшиская 3, Н.В. Бряг 1 , Н. Ф. Мясоедов 1 1 ФГБНУ НТСПЗ; - 2 OO Philips; 3 FGAU "LRTS" на Министерството на здравеопазването на Руската федерация, Москва, Русия

Изследване на ефекта на Semax върху активността на невронните мрежи на човешкия мозък с помощта на функционален магнитен резонанс (fMRI)

15 минутиЕ.Ф. Колесанова, Е.А. Егорова, В.Н. Прозоровски, О.М. Ипатова Изследователски институт по биомедицинска химия. В.Н. Орехович, Москва, Русия

Синтетични пептиди в иновативни лекарства: пептидни имуногени и транспортни пептиди

15 минутиБ.П. Челобанов 1,2 , А.А. Фокина 1 , А.М. Илина 2 , К.В. Клабенкова 2 , Е.А. Буракова 1 , М. Фуджи 3 , ДА. Стеценко 1,2 1 Институт по химична биология и фундаментална медицина SB RAS, Новосибирск; 2 Новосибирски държавен университет, Новосибирск, Русия; 3 Университет Киндай, Фукуока, Япония

Пептидни конюгати на олигонуклеотидни аналози като потенциални терапевтични средства

15 минутиА.А. Замятнин(ml.) 1.2, A.V. Балакирева 1 , Н.В. Гороховец 1 , Е.Ю. Зерний 2 , Н.В. Кузнецова 1 , V.A. Макаров 1 , А.И. Петушкова 3 , Л.В. Савватеева 1 1 Институт по молекулярна медицина, Първи Московски държавен медицински университет. ТЯХ. Сеченов, Москва; Изследователски институт по физико-химична биология. А.Н. Белозерски Московски държавен университет, Москва; 3 Биологически факултет на Московския държавен университет "Ломоносов". М.В. Ломоносов, Москва, Русия

Създаване на ензимен агент за ефективна детоксикация на глутен

Сесия 6
Председатели: В.М. Липкин, Т.В. Овчинникова
Голяма зала
21 септември, 16.15 - 18.15 часа

15 минути И.А. Гривенников 1 , Е.В. Новосадова 1 , S.A. Антонов 1 , Е.С. Мануилова 1 , Е.Л. Арсеньева 1 , М.А. Grefenshtein 1, A.M. Zykova 1, Kobylyansky A.G. 1, В.В. Симонова 3 , Л.Г. Хаспеков 3 , О.С. Лебедева 2 , М.А. Лагаркова 2 , С.Н.Илариошкин 3 , В.З. Тарантула 1, N.F. Мясоедов 1 1 Институт по молекулярна генетика RAS; 2 Федерален научен и практически център по физико-химическа медицина на Федералната медико-биологична агенция на Русия; 3 Научен център по неврология, Руската академия на медицинските науки, Москва

Тестова система, базирана на индуцирани човешки плурипотентни стволови клетки

15 минути Е.В. Новосадова, Е.Л. Арсеньева, Е.С. Мануилова, М.А. Grefenstein, N.F. Мясоедов, И.А. Гривенников Институт по молекулярна генетика РАН, Москва, Русия

Пептидите от семейството на меланокортин са в състояние да модулират експресията на неврон-специфични гени по време на невронна диференциация на индуцирани човешки плурипотентни стволови клетки.

15 минутиА.П. Богачук 1 , З.И. Сторожева 2 , Ю.А. Золотарев 3 , Г.И. Ковалев 4 , В.Н. Азев 5 , А.Н. Мурашев 5 , Д.И. Ржевски 5 , Г.Б. Телегин 5 , В.М. Липкин 1 1 Институт по биоорганична химия. ММ. Шемякин и Ю.А. Овчинников RAS; 2 Федерален медицински изследователски център по психиатрия и наркология. В.П. сръбски; 3 Институт по молекулярна генетика RAS; 4 Изследователски институт по фармакология RAS, Москва, Русия; 5 Филиал на Института по биоорганична химия. ММ. Шемякин и Ю.А. Овчинников РАН, Пущино, Московска област, Русия

Предклинични проучвания на ново невропротективно лекарство на базата на пептид

15 минутиЮ.А. Золотарев 1 , Г.И. Ковалев 2 , Н.В. Кост 3 , О.Ю. Соколов 3 , А.К. Дадаян 1 , V.S. Козик 1 , С.И. Белег 1, E.V. Василиева 2 , А.П. Богачук 4 , В.М. Липкин 4 , Н.Ф. Мясоедов 1 1 Институт по молекулярна генетика RAS; 2 Изследователски институт по фармакология на името на В.В. Закусова; 3 Изследователски център за психично здраве; 4 Институт по биоорганична химия ММ. Шемякин и Ю.А. Овчинников РАН, Москва, Русия

Анксиолитична и невропротективна активност на регулаторния пептид HLDF-6 в модели на болест на Паркинсон и тревожни разстройства

15 минути А.К. Дадаян 1 , Ю.А. Золотарев 1 , В.С. Козик 1 , С.И. Белег 1, И.Ю. Нагаев 1 , В.Н. Азев 2 , А.П. Богачук 3 , В.М. Липкин 3 , Н.Ф. Мясоедов 1 1 Институт по молекулярна генетика РАН, Москва; 2 Филиал на Института по биоорганична химия. ММ. Шемякин и Ю.А. Овчинников RAS, Пущино; 3 Институт по биоорганична химия ММ. Шемякин и Ю.А. Овчинников РАН, Москва, Русия

Фармакокинетика на ацетамидната форма на HLDF-6 пептида в тъканите на лабораторни животни, използващи маркирани с тритий и деутерий производни.

Повечето методи на генна терапия ex vivo и in vivo използват клонирани генетични конструкции, които заместват функционалната форма на протеин, който не се синтезира в тялото на пациента или се синтезира в дефектна форма. Въпреки това, много човешки заболявания (рак, възпаление, вирусни и паразитни инфекции) са свързани, напротив, със свръхпроизводството на нормален протеин. Разработени са терапии за лечение на тези състояния.

системи, използващи специфични олигонуклеотиди. Такъв малък олигонуклеотид може да хибридизира със специфичен ген или иРНК и да намали нивото на транскрипция или транслация, като по този начин намали количеството протеин, отговорен за синтезираната патология. Олигонуклеотид, който хибридизира със самия ген и блокира неговата транскрипция, се нарича "антигенен", а този, който хибридизира със съответната иРНК, се нарича "антисенс" (Antisense RNA). За да се предотврати активирането на транскрипцията на специфични гени, могат да се използват и двойноверижни олигонуклеотиди, които се свързват специфично с ДНК-свързващи протеини (активиращи протеини). И накрая, за да се намали количеството на определена иРНК и протеина, синтезиран върху нея, могат да се използват рибозими – естествени РНК последователности, които се свързват със специфични РНК молекули и ги нарязват.

В бъдеще лекарствата на базата на нуклеинова киселина вероятно ще намерят широко приложение, като различни "антисенс" олигонуклеотиди ще бъдат основният обект на научни изследвания и клинични изпитвания.

3.1 Антисенс олигонуклеотиди като лекарства

"Антисенс" РНК (Antisense RNA), която се предполага, че се използва като лекарство, е къс (15-20 нуклеотида) олигонуклеотид, който може да се свърже с определено място на иРНК, комплементарно към него и да инхибира транслацията на протеина, който кодира, като по този начин се потиска патологичният процес (фиг. 2).

Терапевтичният ефект на синтетичните "антисенс" олигонуклеотиди зависи от спецификата на тяхната хибридизация с достъпното място на таргетната иРНК, устойчивостта към действието на клетъчните нуклеази и наличието на система за доставяне в клетката. 15-20-нуклеотидни последователности хибридизират с уникални тРНК с доста висока специфичност. Потенциалните целеви места се определят чрез тестване на набор от "антисенс" олигонуклеотиди, като се използва клетъчна култура, която синтезира целевата иРНК. За да направите това, се извършва електрофоретично разделяне на клетъчни протеини, в които се включва радиоактивен етикет по време на транслацията и с помощта на радиоавтография се определя в присъствието на кой от "антисенс" олигонуклеотидите се намалява синтезът на определен протеин. Няма общи критерии за избор на най-добрите целеви места в различни РНК транскрипти. Олигонуклеотиди, които са комплементарни на 5' или 3' краищата на иРНК, границите на екзона и интрона и дори двойноверижните региони могат да бъдат ефективни. Антисенс олигонуклеотидите могат да бъдат разградени от вътреклетъчните нуклеази, така че е важно да се предпазят от действието на последните, така че да не загубят способността си да хибридизират с мишената. За тази цел пиримидиновите бази, рибозата или дезоксирибозата могат да бъдат модифицирани по определен начин (фиг. 3). По този начин, в най-широко използваните в момента "антисенс" олигонуклеотиди, свободният кислороден атом на фосфодиестерната връзка е заменен от SH групата (фиг. 3B ), което води до образуването на тиофосфатна връзка. Модифицираните по този начин олигонуклеотиди се разтварят във вода, носят отрицателен заряд и не се разцепват от ендонуклеази. Когато се хибридизират към целево място, те образуват дуплекси, които активират рибонуклеаза (RNase), ендогенен ензим, който разцепва иРНК в такава хибридна молекула. Проведени са първите клинични изпитвания на такива олигонуклеотиди - лекарства от "първо поколение". Мишените са РНК на цитомегаловирус, вирус на човешка имунна недостатъчност, както и иРНК на гени, отговорни за развитието на рак, чревни заболявания и други заболявания.

Синтезирани "антисенс" олигонуклеотиди с фосфорамидитни и полиамидни (пептидни) връзки - пептидни нуклеинови киселини (Peptide nucleicacids, PNAs) (Фиг. 3 V и D ). Такива молекули са много устойчиви на действието на нуклеазите. Химическите групи, прикрепени към 2'-въглеродния атом на захарния остатък и С-5 атома на пиримидините, също защитават антисенс олигонуклеотидите и улесняват тяхното свързване към целевото място (фиг. 3 2ди д ). Всички предимства на тези и други модификации сега се изучават интензивно.

Проникването на "антисенс" олигонуклеотиди в клетката може да бъде значително улеснено чрез поставянето им в липозоми. Тази високоефективна система за доставяне позволява използването на "антисенс" олигонуклеотиди при ниски концентрации. Ако обаче липозомите се конюгират с антитела, специфични за епитопите на определени клетки на определени органи, тогава ще бъде възможно да се извърши целенасочена доставка на "антисенс" олигонуклеотиди.

Проведените предклинични тестове показват, че "антисенс" олигонуклеотидите са много ефективни лекарства. Изследвана е възможността за използването им за лечение на стеноза на коронарните и каротидните артерии, водеща до инфаркти и инсулти. В тези случаи те често прибягват до ангиопластика, разширяване на артериите с помощта на балонен катетър, но при около 40% от пациентите стенозите се появяват отново след 6 месеца, тъй като ангиопластиката стимулира пролиферацията на гладкомускулните клетки и секрецията на междуклетъчно вещество във вътрешността слой на артерията на мястото на нейното разширение. В един от експериментите антисенс олигонуклеотиди с тиофосфатни връзки, комплементарни на тРНК, кодиращи протеини, важни за клетъчния цикъл на бозайниците, бяха инжектирани в каротидните артерии на плъхове след ангиопластика; в резултат на това честотата на рецидивиращите стенози намалява с 90%. Пролиферация на гладкомускулни клетки се наблюдава и при атеросклероза, захарен диабет, усложнения след коронарен байпас. Вероятно всички тези състояния могат да се контролират по подобен начин.

Антисенс олигонуклеотидите могат също да се използват за лечение на вирусни инфекции и малария. В допълнение, резултатите от фаза I клинични изпитвания за лечение на болестта на Crohn с използване на перорално приложение на "антисенс" олигонуклеотида илюстрират ясен терапевтичен ефект без забележими странични ефекти. В този случай целевата иРНК кодира междуклетъчна адхезия тип 1, която се произвежда в излишък при пациенти с болест на Crohn. Предназначено е да се изследва ефективността на същия олигонуклеотид за лечение на други възпалителни заболявания, като ревматоиден артрит, псориазис и улцерозен колит.

По принцип "антисенс" олигонуклеотидите могат да образуват тройна спирала с хромозомна целева ДНК и да блокират транскрипцията. Специфичността на "антигенните" олигонуклеотиди обаче все още не отговаря на стандартите, приети за лекарства.

Резюме

Обзорът разглежда фармакокинетичните характеристики на различни антисенс олигонуклеотидни препарати. Сравнена е фармакокинетиката на лекарства от първо и второ поколение. И също така разгледа ефекта върху фармакокинетиката на химическата модификация на молекулата.

Ключови думиКлючови думи: антисенс олигонуклеотиди, фосфотиоатни олигодезоксинуклеотиди, фармакокинетика

Въведение

Фармакокинетичните свойства на антисенс олигонуклеотидите (ASO) се разбират най-добре, когато се вземат предвид техните физични и химични свойства. Параметри като заряд, молекулно тегло и амфипатична природа на фосфотиоатните ACO имат подчертан ефект върху тяхната фармакокинетика. Химическата структура, по-специално фосфотиоатната група и 2'-метоксиетил (MOE), има особено значим ефект върху фармакокинетичните свойства на ASO.

Абсорбцията, разпределението, метаболизмът и екскрецията на първо поколение фосфотиоатни олигодезоксинуклеотиди (ODNs) са широко изследвани при лабораторни животни и в клинични проучвания. Характеристиките на фармакокинетиката на фосфотиоатните ASO препарати са следните: парентерално приложен фосфотиоат ODN бързо се намират в кръвната плазма, където се свързват с хидрофилните области на плазмените протеини и по този начин избягват гломерулната филтрация. Тези хидрофилни региони се различават от другите хидрофилни региони, към които се свързват липофилните лекарства, и по този начин има малка конкуренция за свързване с плазмен протеин за ASO. Плазмената кинетика се характеризира с кратка фаза на разпределение (от порядъка на няколко часа), последвана от фаза на елиминиране с полуживот дни или седмици. Началната фаза на разпределение задължително включва свързването на ASO с протеини и разпределението на тези комплекси в тъканите на черния дроб, бъбреците, лимфните възли, костния мозък и далака, които са местата на най-активно свързване и натрупване на ASO . Ясно е, че фазата на елиминиране на ASO поради първоначалното свързване на протеина се определя от началния етап на неговото разпределение. Поради възможното насищане на протеини , площта под фармакокинетичната крива (AUC) се увеличава с увеличаване на дозата, тъй като ASO вече не се свързва с протеини след тяхното насищане, а навлиза в кръвния поток в свободна форма. След свързване ASO навлиза в клетките по градиент на концентрация от извънклетъчното пространство през клетъчната мембрана във вътреклетъчното пространство, вероятно с помощта на протеин носител. ASO в клетките се свързват с наличните мишени, но главно ASO в клетките най-вероятно се свързват с вътреклетъчни протеини. В клетката повсеместните нуклеази, но не и ензимите на цитохром Р450, метаболизират ASO препаратите. Тъй като ензимите на цитохром Р450 обикновено метаболизират лекарства с малка молекула, ASO не се конкурират в метаболитните процеси с конвенционалните съединения с малка молекула, намалявайки риска от лекарствени взаимодействия. Екскрецията на ASO в урината в крайна сметка е резултат от метаболизма в тъканите и установяването на равновесие на метаболитите и естествените вещества извън тъканите и в системното кръвообращение. Тези процеси при лабораторни животни и хора са много сходни, поради което не е възможно да се установи междувидова корелация между лабораторни животни и хора.

Понастоящем ASO конфигурацията от „второ поколение“, която включва MOE групи на 2" позиция на нуклеотиди в 3" и 5" краища, е най-широко използвана в клиничните изпитвания. Тази конфигурация е по-усъвършенствана структура в сравнение с немодифицираните фосфотиоатни ODNs , които са антисенс лекарства от първо поколение. Това се дължи на неговата повишена ефикасност, намалена токсичност и увеличен полуживот. Много фактори, свързани с прехода от първо към второ поколение на ASO, са пряко свързани с подобряването на тяхната фармакокинетика.

Характеристики на химичната структура на ASO

Фосфотиоатен скелет

Най-ранните опити за създаване на лекарства с антисенс активност бяха свързани с използването на немодифицирана ДНК, която, за съжаление, беше много податлива на разграждане от нуклеаза. Както се оказа, повсеместните нуклеази разцепват фосфодиестеразните връзки на нативната ДНК, което води до времето на полуразпад на немодифицираните ASOs от минути. Това бързо разграждане е основна характеристика на фармакокинетичния профил на немодифицирани антисенс ДНК. Промяната на фосфодиестерния скелет на ДНК до фосфотиоат драстично променя фармакокинетичния профил на ASO. В тези препарати фосфотиоатната структура замества един серен атом във фосфодиестерните връзки с един немостов кислороден атом. Тази структура повишава устойчивостта на ASO към нуклеази и в резултат на това подобрява техните кинетични свойства.

Фосфотиоатна хиралност

Проучванията показват, че тиирането на диестерния скелет на ACO не само повишава неговата устойчивост към нуклеази, но също така допринася за появата на хиралност, тоест възможността за съществуване на стереоизомери, при всяка фосфотиоатна връзка, което води до факта, че че във всеки 20-mer ACO има 219 Sp или Rp стереоизомера. Комбинацията от резистентност към нуклеаза и повишено протеиново свързване оказва силно влияние върху фармакокинетиката на ASO. Увеличаването на стабилността на фосфотиоат ASO води до факта, че полуживотът на лекарството от плазмата се увеличава до 30-60 минути в сравнение с полуживота на фосфодиестер ASO, който е 1-2 минути.

Резистентността към нуклеаза и хиралността, дължащи се на заместването на фосфодиестер с фосфотиоатни връзки, си струва да се обсъдят, тъй като физическите свойства, свързани с тази структурна характеристика, са важни както за ASO от първо, така и за второ поколение. Устойчивостта към нуклеази на фосфотиоат ASO възниква поради близостта на сярата върху немостовия кислород в активното място на екзонуклеазата до металния йон. Тази близост може да причини изместване на металния йон от активния център. Този ефект беше демонстриран в 3'–5' ДНК полимеразен екзонуклеазен модел. Рентгеновите кристалографски данни подкрепят тази хипотеза за изместването на металния йон. Очевидните разлики в чувствителността на стереоизомерите към екзонуклеазната активност на ДНК полимеразата са в съответствие с предложената конформация на ODN фосфотиоатните стереоизомери в активното място. Вероятно хиралността на фосфоротиоатните връзки може да взаимодейства с други нуклеази по същия начин, т.е. чрез изместване на метални йони, въпреки че различните екзонуклеази могат да показват различни предпочитания за Rp и Sp връзки в зависимост от естеството на активното място на ензима.

Алтернативно, сярата може просто да заеме мястото на кислорода в диестерните връзки. Разликите в способността на сярата да поеме отрицателен заряд, в сравнение с кислорода, позволяват да се предвидят промени в активния център. Тази промяна най-вероятно се дължи на хидролизата на фосфодиестерните връзки и може да се дължи на образуването на преходен петвалентен фосфор с два отрицателно заредени кислородни атома. Заместването на един от екваториалните кислородни атоми със сяра ще има отрицателни ефекти върху ензимната активност: (1) свързването на водата е намалено, което стабилизира локалния отрицателен заряд на атомите, което затруднява получаването на втори отрицателен заряд на сярата; и (2) намалено свързване на Mg2+ към сярата. Има доказателства за последния ефект в изследванията на нивото на рибозимно разцепване на диастереомерни фосфоротиоатни включвания, когато добавянето на Mg 2+ инхибира ефектите на разцепване на фосфоротиоатните рибозими. Освен това е показано, че има известно намаляване на нуклеазната активност в скелетните области по-далеч от фосфотиоатните връзки, което предполага предаване на хиралния ефект. Това явление се обяснява най-добре с промените в подреждането на водните молекули около фосфотиоатния скелет в сравнение с фосфодиестерния скелет.

Стереоспецифичните ефекти върху нуклеазната активност значително влияят върху фармакокинетиката на фосфоротиоатните ASO и това се проявява най-ясно в скоростта на метаболизма на фосфоротиоатните ASO от първо поколение в кръвната плазма. Скоростта на пълно елиминиране на ASO от плазмата намалява, което предполага забавяне на метаболизма. Тези промени в скоростта не могат да бъдат обяснени само по отношение на кинетиката от първи ред, но те могат да бъдат обяснени с разликите в чувствителността на Rp и Sp връзките.

Стереоспецифичните разлики в екзонуклеазната активност са по-малко важни за ASO от второ поколение. Това се дължи на факта, че ASO от второ поколение имат 2" модификации в 3" и 5" краищата, които предотвратяват тяхното разцепване от екзонуклеаза. Използвайки ендонуклеаза, изолирана от патогена Serratia marcescens, ефектите от хиралността на фосфоротиоатните връзки По същия начин като екзонуклеазите, той е един от немостовите кислороди за хидролизата на фосфодиестерните връзки.В диастереомера сярата е локализирана в непосредствена близост до Mg 2+, в резултат на което активността на Тъй като ендонуклеазата Serratia има значителни прилики с някои ендонуклеази на бозайници, трябва да се приеме, че този механизъм може да бъде широко приложим. Как стереохимичните характеристики на фосфоротиоатните връзки влияят върху действието на други ендонуклеази е Въпреки това, ако приемем, че реакцията протича по схема, подобна на ендонуклеазата на Serratia, можем да предположим, че активният център ще съдържа и това е метал (вероятно Mg 2+) и сярата ще повлияе на действието на нуклеазите , когато е ориентиран към металния йон. Ако ендонуклеазите са чувствителни към хиралност, това може да има важни последици за развитието на проблема за създаване на ефективни лекарства от второ поколение. Освен ефекта на хиралността върху лекарствата от първо поколение, хиралният ефект върху метаболизма на лекарствата от второ поколение може да доведе до забавяне на техния метаболизъм. Така, например, може да се приеме, че бързо метаболизиращите се стереоизомери ще бъдат селективно унищожени, оставяйки функциониращи само бавно метаболизирани изомери.

ASO свързване с протеини

Установено е, че в сравнение с ASO с фосфодиестерен скелет, фармакокинетиката на фосфотиоатните структури е значително повлияна от тяхното свързване с протеини. Химическата основа за повишено протеиново свързване е повишената липофилност на фосфотиоатните връзки в сравнение с фосфодиестерните връзки. Тъй като молекулярните взаимодействия с водата се определят от формата и функцията на макромолекулите във воден разтвор, дори малки промени в скелетната липофилност по цялата дължина на ASO могат да имат последствия за взаимодействието на олигомера с вода и макромолекули като протеини.

На първо приближение фосфотиоатните ODN се свързват с клетъчните протеини по-произволно от фосфодиестерните ODN. Защо фосфотиоатните ASOs се свързват по-добре с протеините не е напълно разбрано. Възможните обяснения предполагат повишена липофилност и комплексообразуване с метални йони.

Значението на свързването с плазмените протеини за фармакологията, фармакокинетиката и токсикологията на фосфотиоатните ASO (както първо, така и второ поколение) не може да бъде надценено. На ниво микромоларна концентрация, повече от 90% от фосфотиоатните ODN са свързани в плазмата. Съществуват специфични разлики в процента и силата на свързване с протеини, както и качествени разлики в свързването на ASO със специфични протеини при различните видове. Свързването на фосфотиоатните ASO с циркулиращите протеини предпазва тези съединения от филтриране от бъбречните гломерули и екскретиране в урината. В случай на насищане, например, когато се прилага голяма доза ASO, уринарната екскреция на ASO с пълна дължина се засилва. Поради разликите във видовете насищането при различните видове се определя от различни концентрации на ASO. Например, миши плазмени протеини имат по-нисък афинитет към ASO от тези на плъхове или хора. Следователно ефектът на насищане на процеса на свързване на ASO с плазмените протеини при мишки се проявява при по-ниски концентрации в сравнение с други видове. Видовите разлики в свързването с плазмените протеини са важен фактор за различията в междувидовата фармакокинетика.

Нуклеазната резистентност и протеиновото свързване, които са характерни за ASO с фосфотиоатни връзки, също променят фармакокинетиката на ASO терапията. Допълнителните химични структури, характерни за второто поколение създадени лекарства, внасят други промени в тяхната фармакокинетика.

Метоксиетил производни на ACO

ASO от второ поколение са разработени, за да подобрят някои от характеристиките на ODN от първо поколение. По този начин фосфотиоатните структури, добавени към MOE групите в позиции 2", повишават тяхната устойчивост към нуклеази и променят ефективността на свързване с протеини.

MOE резистентност към нуклеази

Показано е, че структурата на MOE влияе на устойчивостта на ASO към нуклеази. Докато фосфотиоатните структури намаляват екзонуклеазната активност, структурата на 2" позиция на практика елиминира екзонуклеазната активност. Нуклеазната резистентност може да бъде резултат от (1) заместване на 2" водород с MOE, (2) пространствени ефекти на MOE или (3) образуване на твърда водна обвивка около скелета на ASO. Каквито и да са причините за резистентност към нуклеази, присъствието на групата MOE прави ASO, променени в позиция 2", практически имунизирани срещу ефектите на циркулиращите и повечето клетъчни нуклеази. Централната област на скелета на ASO, състояща се от дезоксифосфотиоати, не е почти толкова устойчиви на нуклеазно-медиирани разцепвания.Разликите в ASO от първо и второ поколение в местата, подложени на метаболизъм, също определят разликите в метаболитните модели.

При оценка на метаболитни модели с помощта на капилярна гел електрофореза (CGE) или течна хроматография/масспектрометрия (LC/MS), не са открити метаболити, които са по-къси с един нуклеотид. Най-вече са открити метаболити, разцепени в дезокси мястото (вероятно от ендонуклеази), по-нататъшният път на метаболизма е да се намали размерът на продуктите на разцепване. Резистентността към екзонуклеаза и бавният метаболизъм под въздействието на активни ендонуклеази води до образуването на съединения, характеризиращи се с дълъг полуживот .

Свързване на MOE с протеини

Експериментални проучвания показват, че фосфотиоатните ASOs с 2'-MOE структури имат по-нисък афинитет към плазмените протеини в сравнение с немодифицираните фосфотиоатни ASOs около 18 до около 40 μM. В същото време, в напълно заместената MOE структура на ASO, афинитетът към плазмените протеини само леко намалява. Защо увеличаването на броя на MOE структурите в олигонуклеотид не засяга по-нататъшното намаляване на афинитета към плазмените протеини не е ясно, но това може да се дължи на характеристиките на вторичната структура на ASO.

Намаляването на протеиновия афинитет, свързан с MOE структурите, може да бъде оправдано от някои физични свойства. Вероятно най-значимият физически фактор, който отличава модифицираните MOE ASO от немодифицираните, е наличието на водна молекулярна обвивка, която възниква от страничната верига на MOE. MOE заместителите във въглеводородния скелет "хелират" водните молекули (и евентуално метални йони), образувайки водна обвивка и намалявайки потенциалния контакт между "лепкавите" серни молекули и плазмените или клетъчните протеини. Степента на свързване на ASO с протеините е обратно пропорционална на тяхната екскреция в урината. Въвеждането на фосфотиоатни връзки и 2'-MOE заместители променя протеиновото свързване и в резултат на това променя свойствата на ASO.

Абсорбция, разпределение, метаболизъм и екскреция на ASO

Всмукване

Парентерален начин на приложение на ASO

Проучванията установяват, че поради молекулното тегло (около 7000 D) и отрицателните заряди на ASO, абсорбцията на тези лекарства от стомашно-чревния тракт е ограничена. Ето защо обикновено се използва парентералният път на тяхното приложение. Подкожна, интравенозна инфузия или интравитреална инжекция се използва за прилагане на лекарства от първо поколение. По-ниската провъзпалителна активност на ASO от второ поколение ги прави по-подходящи за подкожно приложение. Фармакокинетиката на тези лекарства в плазмата при подкожни инжекции и интравенозни инфузии е сравнима. Изследвания върху лабораторни животни показват, че в крайна сметка разпределението на ASO също е сравнимо в различни органи, с изключение на мястото на инжектиране и лимфните възли.

След подкожно приложение както първото, така и второто поколение ASO се абсорбират бързо от мястото на инжектиране в системното кръвообращение. В клинични проучвания, след подкожно приложение на ASO от второ поколение, времето за достигане на максимална концентрация (Tmax) варира от 1,5 до 4,7 часа в дозовия диапазон от 25 до 200 mg при постоянен обем от 1 ml. Бионаличността на подкожната доза варира от 36 до 82% от приложената доза. Предклиничните и клиничните проучвания показват, че бионаличността на ASO нараства с концентрация.

Кинетиката на ASO на мястото на инжектиране може да повлияе на локалния отговор, както и на тяхната системна кинетика и разпределение. Намаляването на концентрацията на ASO на мястото на инжектиране хипотетично намалява локалния отговор на инжектирането. Един подход за намаляване на концентрацията на ASO на мястото на инжектиране е разреждането на разтвора и в резултат на това увеличаване на повърхността на абсорбция от подкожното депо. Теоретично, разреждането на разтворите и голямата повърхност на засмукване трябва да намалят локалната концентрация и да намалят локалните реакции. Същите ефекти могат да се очакват при повишаване на системната абсорбция. Следователно промените в дозата и обема могат да се разглеждат като потенциални променливи. Но дори и днес подкожните инжекции с малки обеми и относително високи концентрации демонстрират висока бионаличност на приложения материал.

Местна администрация на ASO

Проучване на различни методи за приложение на ASO показва, че техните аерозолни форми, ректално приложение и интравитреални инжекции се използват като средства за локално приложение. За лечение на белодробни заболявания е възможно да се създадат относително високи концентрации на ASO в белите дробове с помощта на аерозоли.

Кинетиката на първо поколение ODN е изследвана при мишки. Установено е, че кинетиката на такива лекарства е дозозависима, клирънсът е белодробен с полуживот около 2 часа. За разлика от това, проучванията на модифицирани MOE ASO от второ поколение показват полуживот от повече от 4 дни. Както при други локални лечения, предимството на инхалацията е способността да се създават високи локални концентрации в тъкани, които обикновено не натрупват приложените вещества. В белите дробове ASO обикновено не се натрупва след парентерално приложение. Локалното приложение също рядко причинява системни ефекти. Например, когато ASO се прилага на маймуни в доза от 0,1 mg/kg чрез инхалация (три дози за 1 седмица), концентрацията на лекарството в белите дробове е приблизително 1 μg/g. Но при същите тези маймуни концентрацията в черния дроб и бъбреците е приблизително 5% от концентрацията в белите дробове, което показва значително по-малък системен ефект.

Литературните данни показват, че ректалното приложение на ASO се използва успешно за лечение на улцерозен колит. За разлика от инхалациите, при които могат да се използват малки количества от инжектираното вещество, използваната за лечение клизма може да съдържа до 240 mg от веществото (аликафорсен) от първо поколение. В този случай ректалният епител е изложен на инжектираната субстанция, но поради лошата пропускливост на силно заредените ODN има минимална абсорбция на лекарството, както и общ системен ефект. Изчисленията показват, че концентрацията на ASO в чревния епител 12 часа след приложението е 20 µg/g. Бионаличността при хора варира от 0,03 до 2,14%, а максималната концентрация на ASO, определена в плазмата, е само 0,126 µg/ml. Липсата на значителна системна абсорбция и високата локална концентрация на лекарството имат положителен ефект върху лечението.

Изследвани са интравитреални инжекции на ASO препарати от първо и второ поколение. В този случай веществата се инжектират в окото в много малки количества. Благодарение на изолирането на мястото на инжектиране, системните ефекти на лекарството са намалени в още по-голяма степен. В окото, стъкловидното тяло и ретината ASO навлиза с различни скорости: той навлиза в стъкловидното тяло по-бързо в сравнение с ретината. Както локалният метаболизъм, така и дифузията от окото допринасят за елиминирането на лекарството. Както вече беше отбелязано, поради малките количества, системният ефект на приложеното лекарство е минимален. Механизмът на системно разпределение обаче е подобен на повечето други лекарства.

Ентерално приложение на ASO

Отбелязаната стабилност на ASO от второ поколение към нуклеази осигурява стабилността на лекарството в червата, което прави възможно по-нататъшното му усвояване. Въпреки това, размерът на молекулата и зарядите на ACO ограничават абсорбцията на лекарството. След абсорбция от червата кинетиката на ASO е подобна на тази при парентералното му приложение. Въпреки че черният дроб е едно от основните места за натрупване на ASO, ефектът на първото преминаване през черния дроб не е важен фактор, влияещ върху кинетиката на лекарството ASO.

Разпределение на ASO в тялото

Ролята на перфузията и тъканния афинитет

Разпределението на ASO и други лекарства зависи от пропускливостта, интензивността на кръвоснабдяването, свързването с плазмените протеини, тъканите и клетките. Доказано е, че разпределението на фосфотиоатните ASO от първо и второ поколение в тъканите с техните множество отрицателни заряди и свързването им с протеини е най-малко зависимо от кръвоснабдяването и много повече зависи от факторите, влияещи върху транспорта им в клетката.

Вътрешното разпределение от плазмата към тъканите е относително бързо, елиминационният полуживот е 30-90 минути след интравенозно приложение. Полуживотът на ASO след подкожно приложение е по-дълъг отколкото след интравенозно приложение. Тази разлика се дължи на времето, необходимо за абсорбция, а не на други разлики във фармакокинетиката.

Проучването на кинетиката на лекарства от първо и второ поколение отбеляза леките разлики. По-голямата стабилност към второ поколение ASO нуклеази се компенсира от по-ниското им свързване с протеини. Заедно с това, фармакокинетичните профили на лекарства от 1-во и 2-ро поколение са подобни или почти неразличими, когато сумата от нативния ASO и неговите метаболити (общ ASO) от първото поколение се сравнява с интактното лекарство от второ поколение (ISIS 13650). В противен случай по-бързото унищожаване на ASO от екзонуклеази би съкратило полуживота на лекарствата от първо поколение в сравнение с тези от второ поколение. Разпределението на лекарствата от двете поколения зависи от дозата.

Както е отбелязано по-горе, след абсорбция от мястото на инжектиране или червата, ASOs се свързват с плазмените протеини. Два плазмени протеина, които специфично се свързват с фосфотиоатни ASO, са албумин и алфа-2-макроглобулин. Друг общ протеин, киселинният гликопротеин, не свързва ASO. Свързването с протеини е много важно за разпределението на ASO в прицелната тъкан. Химическите структури, които намаляват свързването, водят до значително намаляване на концентрацията на лекарството в тъканите, повишават степента на неговата филтрация през бъбречните гломерули и екскреция в урината. Това явление може да се наблюдава при използване на ASO с диестерни връзки в скелета на препарата или в присъствието на MOE структура. Намаляването на афинитета на диестери и MOE структури (или и двете) към протеини позволява на ASO да циркулира по-свободно в кръвния поток, което води до интензифициране на неговата екскреция в урината.

Във всички проучвания с парентерални ASO от първо и второ поколение не наблюдавахме линеен клирънс на ASO от плазмата. Клирънсът намалява с увеличаване на дозата на лекарството и следователно неговата бионаличност е по-голяма, отколкото би се очаквало от приложената доза. Тъй като първоначалният клирънс се дължи на разпределението на ASO в тъканите и в същото време се наблюдава абсорбцията на лекарството от тъканите, може да се предположи възможността за тяхното насищане с ASO. Изследването на процеса на насищане в резултат на въвеждането на ASO може да се извърши с помощта на чернодробни фагоцити. Когато свързването на ASO към клетките на Купфер достигне насищане, ще започне намаляване на афинитета. Последващото приложение на ASO на мишки подобрява разпределението на ASO към нефагоцитни чернодробни клетки и в резултат на това фармакологичната активност в хепатоцитите се подобрява в сравнение с контролата. Обратно, при плазмени концентрации под 1 µg/ml, ASO се свързва по-активно с клетките на Купфер и се натрупва по-малко в хепатоцитите.

Изследването на процеса на свързване на ASO с плазмените протеини показа, че този ефект е придружен от бързо разпределение на комплекса в тъканите по клетъчната повърхност. Въпреки че точните механизми на клетъчно свързване не са установени, може да се приеме, че ASO се свързват с плазмените протеини или с клетъчните протеини, докато има свободни места на свързване. След това свързаните ASOs се разпределят по градиента на концентрация през клетъчната мембрана чрез обмен на извънклетъчен протеин с вътреклетъчен.

По този начин движещата сила на навлизането на ASO в клетките е концентрационният градиент. Описано е совалковото движение на ASO между цитоплазмата и ядрото. Като цяло е ясно, че протеиновото свързване улеснява движението на ACO през бариери, които обикновено инхибират движението на силно заредени хидрофилни молекули. Този мембранен совалков механизъм остава хипотеза за ASO, но преди това е описан за органометални съединения. Транспортът на ASO от екстрацелуларния матрикс към вътреклетъчното пространство се визуализира в черния дроб на мишки с помощта на имунохистохимични методи и в бъбреците на плъхове с помощта на витална микроскопия с флуоресцентен етикет за второ поколение ASO (S. Henry, B. Molitoris).

Идентичността на протеините, които контролират транспорта на ASO от извънклетъчното към вътреклетъчното пространство, не е известна, но се смята, че свързването на комплекса протеин-ASO към клетката се осъществява с помощта на фагоцитния рецептор. Тъй като фагоцитите, като клетките на Купфер, тъканните макрофаги и клетките на проксималните тубули, имат висок афинитет към ASO, може да се мисли за възможността за намиране на такива рецептори на тяхната клетъчна повърхност.

Въпреки това, клетъчното разпределение и фармакодинамиката на ASO в трансгенни мишки без SR-A I/II фагоцитен рецептор не се различават от тези на контролните сингенни животни. По този начин този рецептор, известен като Scavenger рецептор, изглежда не е отговорен за усвояването на комплекса от черния дроб и бъбреците. Ролята на други акцепторни структури, участващи в процесите на ендоцитоза на ACO-протеиновия комплекс, не е проучена.

Мембранни протеини, които функционират като носители , присъстват във всички организми. Основните носители на лекарства са: ABC ( ATP-свързващи касетни транспортери)и SLC (семейство носители на разтворени вещества). Известно е, че скоростта на пренос на вещества през биологични мембрани с помощта на процеси, медиирани от транспортери, се характеризира с насищане. Описани са няколко члена на семейството SLC с известни характеристики , главно за транспортиране на нуклеозиди, нуклеозидни захари и фосфатни захари. Има мнение, че бъдещите изследвания най-вероятно ще се отнасят до процесите на междумембранен транспорт на ASO.

Ясно е, че в допълнение към горните разлики в натрупването на структури, създадени от различни органи и тъкани и зависимостта на клирънса и разпределението на такива съединения от тяхната доза, разпределението на ASO в тъканите се влияе от транспортните системи, характеристики на кръвния поток на индивидите, възможното време на престой на лекарството в тялото и накрая насищането на тъканите с ASO. Въпреки значителната роля на тези фактори в процесите на тъканно разпределение на ASO, се смята, че първоначалното свързване на ASO към клетъчната повърхност е един от определящите фактори в анализираните механизми. Това заключение се основава на факта, че черният дроб и бъбреците са първоначалните места на свързване на ASO с известно допълнително натрупване през първите 24 часа след приложението на ASO. При изследване на параметрите на разпределение на ASO в черния дроб и бъбреците е показано частично увеличение на концентрацията на лекарството в органите през първите 24 часа. Това се случва по време на период на клетъчно и субклетъчно преразпределение на ASO, но вероятно органите за първично разпределение трябва да натрупат повече материал с течение на времето поради по-големия афинитет на тези органи към ASO. Протеините, отговорни за този афинитет, може да съдържат хепарин-подобни свързващи места за ламинин и фибриноген и фибробластен растежен фактор (FGF). Ранното взаимодействие на ASO с клетката може да се дължи на свързването на тези протеини, но природата на тези протеини, както е отбелязано по-горе, е малко проучена.

Като се има предвид значението на комбинацията от специфични места за свързване на ASO с клетки в разпределението на лекарството в тялото, трябва да се отбележи и такъв важен фактор като различно кръвоснабдяване на различни органи, чиято възможност да повлияе на различното разпределение на фосфотиоат ASO е очевидно. Според различни автори работата с десетки серии от вещества както от първо, така и от второ поколение показва тяхното сходно разпределение и забележимо подобно разпределение при индивиди от различни видове. Бъбреците, черният дроб, лимфните възли, далака и костния мозък са органите, които натрупват най-голямо количество ASO и техните метаболити. Фактът, че белите дробове и сърцето не натрупват ASO показва, че за да се обясни изразеното натрупване на ASO в черния дроб и бъбреците не е достатъчно само едно обяснение за тяхното добро кръвоснабдяване. Например, зоните с най-добро кръвообращение в бъбреците са гломерулите и те не са зоните, съдържащи повече ASO. Напротив, в проксималните тубули кръвообращението е по-малко активно. Въпреки това, клетките на проксималните тубули се характеризират с голям брой активно фагоцитни клетки, натрупват свободни ASO, както и ASO, свързани с протеини, които обикновено се реабсорбират в проксималните тубули. В резултат на това бъбречната кора и проксималния тубуларен епител съдържат най-високата концентрация на фосфотиоатни ASO, както първо, така и второ поколение.

Трябва също така да се отбележи, че кръвоснабдяването (ml/g тъкан) на черния дроб е приблизително 20% от това на бъбреците. 4-5-кратни разлики в перфузията между бъбреците и черния дроб не водят до 4-5-кратни разлики в концентрацията на ASO в тези органи. Фенестрираните капиляри увеличават площта на контакт между ASO и кръвния поток и следователно това може да компенсира недостатъчната перфузия на черния дроб спрямо бъбреците.

Свързване на ASO с плазмените протеини по време на разпределение

Въпреки че насищането на клетките с ASO в крайна сметка засяга тяхното разпределение в органите, свързването на ASO с плазмените протеини може да промени разпределението в бъбреците и черния дроб в различни серии. Има серийни разлики в протеиновото свързване. С намаляване на свързването на ASO с плазмените протеини, натрупването им в черния дроб намалява и натрупването им в бъбреците се увеличава. Обратно, при по-високо свързване, концентрацията на ASO в свободна форма в кръвния поток ще бъде в по-малко количество, ще се натрупва по-малко в бъбреците и повече в други органи. Съществува обратна връзка между степента на свързване на ASO с протеина и тяхното натрупване в бъбреците на плъхове и маймуни след многократно интравенозно и подкожно приложение.

Свързването с протеин може да се използва като критерий за избор на ASO за клинични изпитвания. Към днешна дата определянето на свързването с протеини е емпиричен процес без начин да се предвиди коя серия ще се свърже повече или по-малко с протеините.

Разпределение на ASO в други органи

Независимо от последователността на разпределение на фосфотиоатните ASO от първо и второ поколение, се наблюдава характерен модел на локализиране на тези лекарства в бъбреците и черния дроб, както и в далака и лимфните възли, костите и в цитоплазмата на адипоцитите. Натрупването на ASO в лимфоидната тъкан може да се обясни отчасти с фагоцитната активност на хистиоцити и други мононуклеарни клетки. Възможно е да се визуализира ASO в хистиоцитни фаголизозоми и тъкани на макрофаги, като се използва оцветяване с хематоксилин. Доказано е, че ASO претърпяват ендоцитоза, локализират се в ендозоми и остават в тези структури. Концентрацията на ASO във фаголизозомите често е такава, че може да се определи чрез оцветяване с хематоксилин (почти като ядрена ДНК). ASO във фаголизозомите вероятно съставлява по-голямата част от ASO, натрупан в далака и лимфоидните органи. В допълнение, фагоцитно активните клетки на костите и костния мозък натрупват ASO в тези тъкани, което се потвърждава от наличието на базофилни гранули в техните клетки.

Мускулите (както скелетните, така и сърдечните) не съдържат значителни количества ASO. Въпреки това, внимателното изследване на мускулите с помощта на имунохистохимични или авторадиографски методи разкрива съдържание на ASO във фаголизозомите на макрофагите на мускулната строма и това натрупване може частично да повлияе на измерването на концентрацията на ASO в мускулите и сърцето.

Натрупването на ASO в цитоплазмата на адипоцитите е значимо от терапевтична гледна точка. Особено защото, за разлика от повечето вещества, натрупани в адипоцитите, ASO са хидрофилни. Имунохистохимичните методи ясно показват, че ASO се намира в цитоплазмената фракция на адипоцитите, докато ASO почти липсва в мастната вакуола. Интензитетът на оцветяване показва значително натрупване на веществото в цитоплазмата. Например, при маймуни след 13 седмици лечение с ISIS 113715 в доза от 10 mg/kg/седмично, концентрацията в черния дроб е 301 ± 88,1 μg/g, но само 37,3 ± 14,4 μg/g в мастната тъкан в същите животни.

Като се има предвид, че немасленият компонент съставлява 10% от общата мастна маса, корекцията на концентрацията на ASO, като се вземе предвид този показател, показва сравнимостта на концентрацията му с тази в черния дроб. Значителни концентрации на ASO в адипоцитите показват, че те могат да се използват за лечение на генетични заболявания на този тип клетки: източници на хормони и цитокини. Така беше установено, че фармакологично активните концентрации на ASO се регистрират в адипоцитите на мишки, когато ISIS 113715 се прилага в доза от 25 mg/kg два пъти седмично и намаляват експресията на PTP-1B целевия ген както в черния дроб, така и в адипоцити. Подобни наблюдения са направени при маймуни, третирани с ASO ISIS 113715. Тъй като биопсията на подкожната мазнина може да се извърши клинично и тъй като активните ASO се натрупват в мазнините, мазнините могат да се използват за биопсия и директно измерване на фармакологичните ефекти (намаляване на иРНК) и тъканната концентрация на лекарството в човешки тъкани.

Фосфотиоатните ASO също се разпределят в други тъкани. Имунохистохимичните изследвания показват, че ендотелните клетки натрупват ASO в концентрации, достатъчни да намалят нивата на иРНК, което ги прави потенциална цел за фармакологична интервенция. В някои тъкани техните концентрации не са достатъчно високи за фармакологичен ефект. Например, зрелите лимфоцити не натрупват ASO и антисенс активността е ограничена от Т клетките.

Костните клетки, особено фагоцитно активните остеобласти, могат да натрупват ASO и този ефект може да се използва за терапевтични цели. В допълнение, островните клетки на панкреаса също натрупват ASO. Както първото, така и второто поколение ASO са силно заредени, хидрофилни молекули, които не преминават кръвно-мозъчните или кръвно-тестикуларните бариери. Въпреки това, както в мускулите, макрофагите, съдържащи откриваеми ASO, са локализирани в интерстициалната област на тестисите. Яйчниците не са разделени от бариера, така че ASO може да бъде количествено измерен в яйчниците и визуализиран чрез имунохистохимия в стромата.

Ограниченото разпределение на плазмения ASO в мозъчни клетки и кардиомиоцити прави тези тъкани малко вероятни мишени за антисенс интерференция, въпреки че селективното инхибиране или експресия на определени протеини на йонни канали в мозъка и мускулите може да бъде терапевтично полезно. Въпреки това, ограниченото разпространение на ASO в тези тъкани може да се разглежда като предимство. Липсата на значителни концентрации на ASO в мозъка и сърцето намалява риска от увреждане на централната нервна система (ЦНС) и намалява проявата на нежелани сърдечни ефекти. Както беше отбелязано по-рано, директното прилагане към структурите на ЦНС, по-специално мозъка, чрез интратекална, интравентрикуларна инфузия или инжекция причинява разпределение на ASO в централната нервна система и може да бъде полезно терапевтично.

По време на бременност плодът е доста добре защитен от ефектите на антисенс лекарствата. Проучването на трансплацентарната кинетика на ASO не разкрива натрупването му в плода; при гризачи в плацентата е отбелязано ниско ниво на ASO. Тези резултати са последователно повторени в изследване за тератогенност на различни ASO от второ поколение при мишки, плъхове и зайци. Плацентата, въпреки че е силно перфузирана, не е орган с високо натрупване на ASO.

Като цяло представените факти показват, че разпространението на ASO е един от ключовите фактори, които определят тежестта на активността на ASO. Разликите в разпределението на ASO изглежда са свързани до голяма степен с тъканния тропизъм за тези лекарства и, в по-малка степен, с перфузията.

Метаболизъм

Антисенс лекарствата от първо и второ поколение се метаболизират от нуклеази, а не от оксидазни системи от тип цитохром Р450, които се използват за метаболизиране на конвенционалните липофилни лекарства с малка молекула. ASO не е нито субстрат за изоензимите на цитохром Р450, нито индуцира или инхибира тяхната активност при клинично значими концентрации. Медиираното от екзонуклеаза ASO разцепване, което е основният път за метаболизъм и изчистване на фосфотиоатни ODN от първо поколение, е вторично спрямо ASO от второ поколение. Екзонуклеазната активност е ограничена от два фрагмента: един MOE в 3' края и друг MOE в 5' края.

Ензими, отговорни за метаболизма на ASO

Не са известни специфични ензими, които метаболизират ASO от второ поколение. Нуклеазите са повсеместни и е възможно да се открият разградени метаболити на ASO в повечето тъкани. Чернодробните и бъбречните хомогенати са в състояние да метаболизират второ поколение ASO in vitro без добавяне на екзогенни енергийни източници като никотинамид аденин динуклеотид фосфат (NADPH) или аденозин 5-трифосфат (ATP). Първоначалното разцепване води до два продукта, всеки характеризиращ се с 5" и 3" MOE защитен край. Тези метаболити не се свързват с протеини и по този начин се екскретират от тъканите. Тъй като метаболитите се отстраняват по-бързо, отколкото се образуват, практически няма натрупване на метаболити в тъканите. По този начин не е възможно да се използва определянето на количеството на метаболитите в тъканите като индекс на ASO метаболизма в тъканите.

Тъй като скоростта на елиминиране на ASO от тъканите зависи от техния метаболизъм, разликите в метаболизма на ASO в различни тъкани могат да бъдат оценени въз основа на полуживота на тези лекарства от характеризираните тъкани. Въз основа на данни за четири ASO от второ поколение се заключава, че поведението на членовете на този клас е подобно, но има леки разлики в техния полуживот от черния дроб и бъбреците на маймуни, третирани с лекарството в продължение на 4-13 седмици . Доказано е, че полуживотът на препаратите ACO ISIS 104838 и 112989 от черния дроб и бъбреците е много сходен. Тези данни предполагат, че за някои серии от ASO няма значителни разлики в скоростта на метаболизма в различните органи. Въпреки това, разликите в тъканния полуживот са идентифицирани за ISIS 107248, 113715 и 301012. Наблюдаваните разлики в скоростта на метаболизъм на ASO лекарства в черния дроб и бъбреците показват, че може да има разлики в скоростта на метаболизъм в различните тъкани , или по-сложна кинетика за някои продуктови серии или резултатите просто отразяват малък брой проби, взети за ограничен период от време.

Подробно изследване на процеса на екскреция на ASO от второ поколение показва наличието на различна скорост на екскрецията им от различни видове чернодробни клетки. Тъй като някои видове клетки, като проксималните тубулни клетки на бъбречната кора, са склонни да съдържат ASO във фаголизозомите, този тип поглъщане вероятно обяснява разликите в скоростите на метаболизма на лекарствата в различните тъкани. В допълнение, вероятно е специфични последователности в структурата на ASO скелета да се характеризират с различна чувствителност към разцепване от ендонуклеази.

Бактериалните екзонуклеази показват висока степен на специфичност за нуклеотидната последователност в ASO гръбнака, вероятно за защита срещу вируси. Голяма част от активността на нуклеазите в клетките на бозайниците е свързана с механизмите на транскрипция и възстановяване на ДНК и по този начин видовата специфичност на бозайниците може да се различава от тази на бактериалните ендонуклеази. Не е известно дали процесите на репликация и действието на ензимите, свързани с феномена на възстановяване, са еднакво отговорни за катаболизма на тези синтетични ASO. При високи концентрации на ssDNA, ASO могат ефективно да се конкурират с естествения субстрат. Много ензими от семейството на нуклеазите са способни да катаболизират ASO. Определянето на специфични ензими, участващи в метаболизма на ASO, не е критично за разработването на антисенс лекарства, но по-доброто разбиране на метаболитните пътища ще бъде полезно за разработването на нови технологии.

ASO метаболити

Разликите в метаболизма на ASO от първо и второ поколение са доста очевидни при сравняване на метаболитния профил с CGE. Когато проби от тъкан или урина се анализират в LC/MS детектор, природата на метаболитните процеси става по-ясна. Обикновено фосфоротиоатните ODN от първо поколение се метаболизират в каскада от ASO метаболити, всеки от които се различава с един нуклеотид в резултат на разцепване на единичен нуклеотид от екзонуклеаза. По този начин, след въвеждането на 20-mer, тоест състоящ се от 20 нуклеотида, ODN от първо поколение, плазмата и тъканите съдържат семейства от последователно съкратени ASO, като се започне от 19-mer и по-нататък до кратък ASO.

Първоначално разцепване в метаболизма на ASO от второ поколение, медиирано от
ендонуклеази, води до образуването на две ASO, едната с 3' края на MOE, а другата с 5' края на MOE. Разцепването на продукти с незащитени краища може да се извърши или от 5'-екзонуклеаза, или от 3'-екзонуклеаза. Резултатите от комбинираната ендо- и екзонуклеазна активност са каскада от верижно съкратени продукти на разцепване, много, ако не всички, от които могат да бъдат открити в урината, събрана от опитни животни или хора. Урината на третирани животни или пациенти, лекувани с ASO от второ поколение, може да съдържа метаболити, които варират от два възможни 15-mer до два възможни 5-mer MOE и множество комбинации от всеки от междинните метаболити.

Метаболити, по-къси от дължината на краищата на MOE, ще присъстват в тъканите, ако самите краища на MOE са субстрати за нуклеази. Тези метаболити обикновено не се откриват чрез масов спектрален анализ, което предполага, че по правило няма MOE мононуклеотиди, освободени по време на метаболизма. Има обаче някои изключения от това обобщение. За ограничен брой нуклеотидни последователности , второ поколение ASO единични нуклеотидни подстригвания, наблюдавани в тъкани и плазма – или CGE, или LC/MS: метаболитите изглежда са резултат от екзонуклеазно смилане. Тези метаболити могат да се наблюдават при първоначалното разпределение. Предполага се, че те бързо се появяват в кръвната плазма. MOE мононуклеотидите, които се образуват по време на метаболизма, не са субстрати за фосфорилиране и следователно е малко вероятно да бъдат включени в нуклеотидните трифосфати и в крайна сметка в ендогенните нуклеотиди. MOE мононуклеотидите не инхибират ензимите, отговорни за синтеза на ДНК. По този начин, MOE мононуклеотидите, ако се образуват, не трябва да се включват в ендогенни нуклеотиди.

Централната част на дезоксинуклеотидите от второ поколение ASO е обект на екзонуклеазно разцепване, което води до освобождаване на един нуклеотид. Монодезоксинуклеотидите, които се получават чрез екзонуклеазно разцепване, са идентични с ендогенните нуклеотиди, с изключение на тиофосфатната група, която теоретично може да присъства. Въпреки това, тиофосфатната група е лабилна към окисление и загуба на сяра, което прави крайната фосфатна група идентична с ендогенните нуклеотиди. Следователно, за разлика от MOE мононуклеотидите, всеки освободен дезоксинуклеотид ще бъде естествено включен във вътреклетъчното депо на ендогенни нуклеотиди. Нуклеотиди, които задържат тиофосфатни групи, ще бъдат субстрати за добавяне на една или две фосфатни групи, което води до смесени нуклеотидни тиофосфатни ди- или трифосфати. Фосфорилирането е възможно, но наличието на алфа тиофосфат прави реакциите термодинамично неблагоприятни.

Заключение

Значението на изследването на фармакокинетиката на данни и лекарства, подобни на описаните, както и създаването на модели върху различни животински видове за пълно разбиране на процесите, протичащи в организма след приема на лекарствата, е очевидно. В Русия също се провеждат проучвания на такива лекарства.

Литература

1. Adjei A.A., Dy G.K., Erlichman C. et al. Изпитване фаза I на ISIS 2503, антисенсивен инхибитор на H-ras, в комбинация с гемцитабин при пациенти с напреднал рак. // клиника. Cancer Res. 2003 том. 9, #1. стр. 115.

2. Benimetskaya L., Loike J.D., Loike G. et al. Mac-1 (CD11b/CD18) е ODN-свързващ протеин. // Nat. Med. 1997 том. 3, № 4. С. 414.

3. Benimetskaya L., Tonkinson J.L., Koziolkiewicz M. et al. Свързване на фосфоротиоатни ODN с основен фибробластен растежен фактор, рекомбинантен разтворим CD4, ламинин и фибронектин независимо от P-хиралността. // Nucl. Киселини Res. 1995 том. 23, № 21. С. 4239.

4. Bijsterbosch M.K., Manoharan M., Rump E.T. et al. In vitro съдба на фосфоротиоатни антисенс ODNs: преобладаващо поглъщане от рецептори за почистване на ендотелни клетки. // Nucl. Киселини Res. 1997 том. 25, № 16. С. 3290.

5. Bijsterbosch M.K., Rump E.T., De Vrueh R.L. et al. Модулиране на свързването с плазмени протеини и in vitro усвояване на фосфоротиоатни ODN от чернодробни клетки чрез конюгиране на холестерол. // Nucl. Киселини Res. 2000 том. 28, № 14. С. 2717.

6. Браун D.A., Kang S.H., Грязнов S.M. et al. Ефект на фосфоротиоатна модификация на ODNs върху специфично протеиново свързване. // J. Biol. Chem. 1994 том. 269, № 43. Р. 26801.

7. Бътлър М., Крук Р.М., Греъм М.Дж. et al. Фосфоротиоатните ODNs се разпределят по подобен начин в мишки с нокаут на рецептора на чистач клас А и мишки от див тип. // J. Pharmacol. Exp. Там. 2000 том. 292, № 2. С. 489.

8. Бътлър М., Хейс К.С., Чапел А., Мъри С.Ф., Якш Т.Л., Хуа X.Y. Спинално разпределение и метаболизъм на 2_-O-(2-метоксиетил)-модифицирани ASO след интратекално приложение при плъхове. // Неврология. 2005 том. 131, № 3. С. 705.

9. Бътлър М., Стекър К., Бенет К.Ф. Клетъчно разпределение на фосфоротиоатни ODN в нормални тъкани на гризачи. //Лаборатория. Инвестирам. 1997 том. 77, № 4. С. 379.

10. Cossum P.A., Sasmor H., Dellinger D. et al. Изхвърляне на 14C-маркирания фосфоротиоат ASO ISIS 2105 след интравенозно приложение на плъхове. // J. Pharmacol. Exp. Там. 1993 том. 267, № 3. С. 1181.

11. Cossum P.A., Troung L., Owens S.R. et al. Фармакокинетика на 14C-маркиран фосфоротиоат ASO, ISIS 2105, след интрадермално приложение на плъхове. // J. Pharmacol. Exp. Там. 1994 том. 269, № 1. стр. 89.

12. Crooke S.T., Graham M.J., Zuckerman J.E. et al. Фармакокинетични свойства на няколко нови ASO аналози при мишки. // J. Pharmacol. Exp. Там. 1996 том. 277, № 2. С. 923.

13. Драйвър С.Е., Робинсън Г.С., Фланаган Дж., Шен У., Смит Л.Е.Х., Томас Д.У., Робъртс П.К. Базирано на ASO инхибиране на експресията на ембрионален ген. // Nat. Биотехнология. 1999 том. 17. С. 1184.

14. Eckstein F. Phosphorothioate ODNs: какъв е техният произход и какво е уникалното за тях? // Антисенс Nucl. Acid Drug Dev. 2000 том. 10, #2. Р. 117.

15. Gaus H.J., Owens S.R., Winniman M., Cooper S., Cummins L.L. Он-лайн HPLC електроспрей масспектрометрия на фосфоротиоатни ASO метаболити. // Анален. Chem. 1997 том. 69, № 3. С. 313.

16. Гиъри Р.С. Текуща оценка на PK/PD връзките за антисенс терапевтици. // Световен конгрес по фармация и фармацевтични науки, Ница, Франция, 2002 г.

17. Geary R.S., Bradley J.D., Watanabe T. et al. Липса на фармакокинетично взаимодействие за ISIS 113715, 2_-O-метоксиетил модифициран антисенс олигонуклеотид, насочен към протеинова тирозин фосфатаза 1B информационна РНК, с перорални антидиабетни съединения метформин, глипизид или розиглитазон. // клиника. Pharmacokinet. 2006 том. 45, № 8. С. 789.

18. Geary R.S., Leeds J.M., Fitchett J. et al. Фармакокинетика и метаболизъм при мишки на фосфоротиоатен ASO антисенс инхибитор на експресията на C-raf-1 киназа.// Drug Metab. Dispos. 1997 том. 25, № 11. Р. 1272.

19. Гиъри Р.С., Лийдс Дж.М., Хенри С.П., Монтейт Д.К., Левин А.А. Антисенс олигонуклеотидни инхибитори за лечение на рак: 1. Фармакокинетични свойства на фосфоротиоатни ODN. // Противораково лекарство Des. 1997 том. 12, № 5. Р. 383.

20. Geary R.S., Leeds J.M., Shanahan W. et al. Независима от последователността плазмена и тъканна фармакокинетика за 3 антисенс фосфоротиоатни ASO: мишка към човек. // в Американската асоциация на фармацевтичните учени, Pharm. Изследвания, Plenum Press, Сиатъл, Вашингтон. 1996. Р. С.

21. Geary R.S., Teng C.L., Truong L. et al. Първо преминаване на чернодробна екстракция на частично модифицирани химерни антисенс олигонуклеотиди при кучета Бийгъл. // в годишната среща на Американската асоциация на фармацевтичните учени, Индианаполис, IN, 2000 г. P. 216.

22. Geary R.S., Ushiro-Watanabe T., Truong L et al. Фармакокинетични свойства на 2_-О-(2-метоксиетил)-модифицирани ASO аналози при плъхове. // J. Pharmacol. Exp. Там. 2001 том. 296, № 3. R. 890.

23. Гири Р.С., Ю Р.З., Левин А.А. Фармакокинетика на фосфоротиоатни антисенс ODN. // Curr. мнение Инвестирам. лекарства. 2001 том. 2, #4. Р. 562.

24. Geary R.S., Yu R.Z., Watanabe T. et al. Фармакокинетика на тумор некрозис фактор-алфа фосфоротиоат 2_-O-(2-метоксиетил) модифицирани антисенс олигонуклеотиди: сравнение между видовете. // Drug Metab. Dispos. 2003 том. 31, № 11. С. 1419.

25. Giacomini K.M., Sugiyama Y. Мембранни транспортери и лекарствен отговор, в Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th ed., Brunton, LL, ed., McGraw-Hill, Ню Йорк, 2006. P. 41.

26. Gleave M., Chi K.N. Нокдаун на цитопротективния ген, клъстерин, за подобряване на хормоналната и хемочувствителността при рак на простатата и други видове рак. // Ann. NY Acad. наука 2005. Том 1058. P.1.

27. Gleave M., Miyake H. Използване на антисенс олигонуклеотиди, насочени към цитопротективния ген, клъстерин, за повишаване на андроген- и химио-чувствителността при рак на простатата. // World J. Urol. 23. 2005. № 1. стр. 38.

28. Глоувър Дж.М., Лийдс Дж.М., Мант Т.Г. et al. Фаза I на безопасност и фармакокинетичен профил на междуклетъчна адхезионна молекула-1 антисенс ODN (ISIS 2302). // J. Pharmacol. Exp. Там. 1997 том. 282, № 3. Р. 1173.

29. Греъм M.J., Crooke S.T., Monteith D.K. et al. In vitro разпределение и метаболизъм на фосфоротиоат ASO в черния дроб на плъх след интравенозно приложение. // J. Pharmacol. Exp. Там. 1998 том. 286, № 1. С. 447.

30. Гувакова M.A., Якубов L.A., Влодавски I., Tonkinson J.L., Stein C.A. Фосфоротиоатните ODNs се свързват с основния фибробластен растежен фактор, инхибират свързването му с рецепторите на клетъчната повърхност и го отстраняват от местата на свързване с нисък афинитет върху извънклетъчния матрикс. // J. Biol. Chem. 1995 том. 270. P.2620.

31. Хенри С.П., Дени К.Х., Темплин М.В., Ю Р.З., Левин А.А. Ефекти на човешки и миши антисенс олигонуклеотидни инхибитори на ICAM-1 върху репродуктивната способност, феталното развитие и постнаталното развитие при мишки. // Вродени дефекти Res. Бдев. размножаване. Токсикол. 2004 том. 71, бр.6. С. 359.

32. Hua XY, Moore A., Malkmus S. et al. Инхибирането на експресията на спинална протеин киназа С алфа от антисенс олигонуклеотид отслабва толерантността, предизвикана от инфузия на морфин. // Неврология. 2002 том. 113, № 1. стр. 99.

33. Джаксън J.K., Gleave M.E., Gleave J., Burt H.M. Инхибирането на ангиогенезата от антисенс олигонуклеотиди към клъстерин. // Ангиогенеза. 2005 том. 8, № 3. стр. 229.

34. Kastelein J.J.P., Wedel M.K., Baker B.F. et al. Мощно намаляване на аполипопротеин B и липопротеин холестерол с ниска плътност чрез краткотрайно приложение на антисензивен инхибитор на аполипопротеин B. // Circulation. 2006 том. 114, № 16. С. 1729.

35. Koziolkiewicz M., Krakoviak A., Kwinkowski M., Boczkowska M., Stec W.J. Стереодиференция – ефектът на P хиралността на олиго(нуклеозидни фосфоротиоати) върху активността на бактериалната РНКаза Н. // Nucl. Киселини Res. 1995. Том 23, № 24. 5000 р.

36. Leeds J.M., Geary R.S. Фармакокинетични свойства на фосфоротиоатни ASOs при хора, в Antisense Research and Applications, 1-во издание, Crooke, S.T., ed., Springer, Heidelberg, 1998. P. 217.

37. Leeds J.M., Henry S.P., Geary R.S., Burckin T.A., Levin A.A. Сравнение на фармакокинетиката на подкожно и интравенозно приложение на фосфоротиоатен олигодезоксинуклеотид при маймуни cynomolgus. // Антисенс Nucl. Acid Drug Dev. 2000. Том 10, № 6. Р. 435.

38. Левин А.А. Преглед на проблемите във фармакокинетиката и токсикологията на фосфоротиоатни антисенс олигонуклеотиди. // Biochim. Biophys. акта. 1999. Vol.1489, No.1. Р. 69.

39. Левин А.А., Гири Р.С., Лийдс Дж.М. et al. Фармакокинетиката и токсичността на фосфоротиоатните ASOs, в Biotechnology and Safety Assessment, 2nd ed., Thomas, JA, ed., Taylor & Francis, Philadelphia, PA, 1998. P. 151.

40. Левин А.А., Хенри С.П., Бенет К.Ф. et al. Предклинично развитие на антисенс терапевтици, в Нова терапия от съвременната биотехнология: от лабораторно до тестване на хора, 1-во издание, Oxender D.L. и Post L.E., изд., Springer-Verlag, Хайделберг, Германия, 1998 г., стр. 131.

41. Левин А.А., Хенри С.П., Монтейт Д., Темплин М. Токсичност на антисенс олигонуклеотиди. // в Antisense Drug Technology, Crooke, S. T., ed., Marcel Dekker, Ню Йорк, 2001. P. 201.

42. Loke S.L., Stein C.A., Zhang X.H. et al. Характеризиране на транспорта на ASO в живи клетки. //Процес. Natl. акад. наука САЩ. 1989 том. 86. С. 3474.

43. Лоренц П., Мистели Т., Бейкър Б.Ф., Бенет К.Ф., Спектор Д.Л. Нуклеоцитоплазмено преместване: ново in vitro свойство на антисенс фосфоротиоатни ODN. // Nucl. Киселини Res. 2000 том. 28, № 2. С. 582.

44. Miner P.B., Geary R.S., Matson J. et al. Бионаличността и терапевтичната активност на alicaforsen (ISIS 2302) се прилага като ректална задържаща клизма на пациенти с активен улцерозен колит. // Ailment Pharmacol. Там. 2006 том. 23, № 10. Р. 1427.

45. Mou T.C., Грей D.M. Високият афинитет на свързване на фосфоротиоат-модифицирани олигомери за Ff ген 5 протеин се модерира чрез добавяне на С-5 пропин или 2_-О-метил модификации. // Nucl. Киселини Res. 2002 том. 30, № 3. Р. 749.

46. ​​​​Никлин П.Л., Крейг С.Дж., Филипс Дж.А. Фармакокинетични свойства на фосфоротиоати при животни - абсорбция, разпределение, метаболизъм и елиминиране, в Antisense Research and Applications, 1-во издание, Crooke, S.T., ed., Springer, Berlin, 1998. P. 141.

47. Peng B., Andrews J., Nestorov I. et al. Тъканно разпределение и физиологично базирана фармакокинетика на антисенс фосфоротиоат ASO ISIS 1082 при плъх. // Антисенс Nucl. Acid Drug Dev. 2001 том. 11, #1. стр. 15.

48. Phillips JA, Craig S.J., Bayley D. et al. Фармакокинетика, метаболизъм и елиминиране на 20-мерен фосфоротиоат ODN (CGP 69846A) след интравенозно и подкожно приложение. // Biochem. Pharmacol. 1997 том. 54, бр.6. Р. 657.

49. Sawai K., Mahato R.I., Oka Y., Takakura Y., Hashida M. Разполагане на ASOs в изолиран перфузиран бъбрек на плъх: участие на рецептори за почистване в тяхното бъбречно поглъщане. // J. Pharmacol. Exp. Там. 1996 том. 279, № 1. стр. 284.

50. Sewell L.K., Geary R.S., Бейкър B.F. et al. Фаза I на изпитване на ISIS 104838, 2_-метоксиетил модифицирани антисенс олигонуклеотиди, насочени към тумор некрозис фактор-алфа. // J. Pharmacol. Exp. Там. 2002 том. 303, № 3. Р. 1334.

51 Slim G., Gait M.J. Конфигурационно дефинирани фосфоротиоат-съдържащи олигорибонуклеотиди при изследване на механизма на разцепване на рибозими с глава на чук. // Nucl. Киселини Res. 1991 том. 19, № 6. Р. 1183.

52. Снайдер Р.М., Мирабели К.К., Крук С.Т. Клетъчна асоциация, вътреклетъчно разпределение и изтичане на ауранофин чрез последователни реакции на обмен на лиганд. // Biochem. Pharmacol. 1986 том. 35, № 6. С. 923.

53. Soucy N.V., Riley J.P., Templin M.V. et al. Майчино и фетално разпределение на фосфоротиоат ASO при плъхове след интравенозна инфузия. // Вродени дефекти Res. Бдев. размножаване. Токсикол. 2006 том. 77, № 1. стр. 22.

54. Spitzer S., Eckstein F. Инхибиране на дезоксирибонуклеази от фосфоротиоатни групи в олигодезоксирибонуклеотиди. // Nucl. Киселини Res. 1988 том. 16, #24. Р. 11691.

55. Stavchansky S., Geary R.S., Cho M. Фармакокинетика и ефект на първо преминаване през черния дроб на антисенс олигонуклеотид (ISIS 2302) при плъхове. // в годишната среща на Американската асоциация на фармацевтичните учени, Индианаполис, IN, 2000 г. P. 216.

56. Темплин М.В., Левин А.А., Греъм М.Дж. et al. Фармакокинетичен и токсичен профил на фосфоротиоат ASO след инхалационно доставяне в белия дроб при мишки. // Антисенс Nucl. Acid Drug Dev. 2000 том. 10, № 5. Р. 359.

57. Теплова М., Минасов Г., Терешко В. и др. Кристална структура и подобрени антисенс свойства на 2_-O-(2-метоксиетил)-РНК. // Nat. Структура. Biol. 1999. Том 6, № 6. R.535.

58. Villalona-Calero M.A., Ritch P., Figueroa J.A. et al. Проучване фаза I/II на LY900003, антисенс инхибитор на протеин киназа С-алфа, в комбинация с цисплатин и гемцитабин при пациенти с напреднал недребноклетъчен рак на белия дроб. // клиника. Cancer Res. 2004 том. 10, № 18 Pt 1. P. 6086.

59. Уатанабе Т.А., Гири Р.С., Левин А.А. Свързване с плазмен протеин на антисенс олигонуклеотид, насочен към човешки ICAM-1 (ISIS 2302). // ASO. 2006 том. 16, № 2. стр. 169.

60. White A.P., Reeves K.K., Snyder E. et al. Хидратация на едноверижни фосфодиестерни и фосфоротиоатни олигодезоксирибонуклеотиди. // Nucl. Киселини Res. 1996 том. 24, № 16. Р. 3261.

61. Уилсън Д.М. Трето, абазичната ендонуклеазна активност на Ape1 се регулира от концентрациите на магнезий и калий и е устойчива на алтернативни ДНК структури. // J. Mol. Biol. 2005 том. 345, № 5. С. 1003.

62. Yu D., Kandimalla E.R., Roskey A. et al. Стереообогатени фосфоротиоатни ODN: синтез, биофизични и биологични свойства. // Bioorg. Med. Chem. 2000. Т.8, №1. Р. 275.

63. Yu R.Z., Baer B., Chappel A. et al. Разработване на ултрачувствителен неконкурентен хибридизационно-лигиращ ензимно-свързан имуносорбентен анализ за определяне на фосфоротиоат ODN в плазма. // Анален. Biochem. 2002 том. 304, № 1. стр. 19.

64. Ю Р.З., Гиъри Р.С., Лийдс Дж.М. et al. Сравнение на фармакокинетиката и тъканното разположение на антисенс фосфоротиоат ASO, насочен към човешка Haras иРНК при мишка и маймуна. // J. Pharm. наука 2001 том. 90, #2. стр. 182.

65. Ю Р.З., Гири Р.С., Левин А.А. Приложение на нови количествени биоаналитични методи за фармакокинетични и фармакокинетични/фармакодинамични оценки на антисенс олигонуклеотиди. // Curr. мнение наркотици дисков. разработка 2004 том. 7, #2. Р. 195.

66. Yu R.Z., Kim T.W., Hong A. et al. Кръстосано видово фармакокинетично сравнение от мишка към човек на второ поколение антисенс олигонуклеотид ISIS 301012, насочен към човешки аполипопротеин B-100. // Drug Metab. Dispos. 2007 том. 35. С. 460.

67. Ю Р.З., Джан Х., Гири Р.С. et al. Фармакокинетика и фармакодинамика на антисенс фосфоротиоат ASO, насочен към Fas mRNA при мишки. // J. Pharmacol. Exp. Там. 2001 том. 296, № 2. С. 388.

68. Zinker B.A., Rondinone C.M., Trevillyan J.M. et al. PTP1B антисенс олигонуклеотид понижава PTP1B протеина, нормализира кръвната глюкоза и подобрява инсулиновата чувствителност при мишки с диабет. //Процес. Natl. акад. наука САЩ. 2002 том. 99, #17. С. 1137.

5507 0

Това може да се постигне по няколко начина: хибридизация на съответния олигонуклеотид със специфичен ген или иРНК, блокиране на протеиновия транскрипционен фактор, намаляване на количеството на иРНК в резултат на разцепване от РНК ензими и др. Помислете за принципите на някои от тях.

Рибоолигонуклеотид, който се свързва със специфична иРНК и по този начин инхибира транслацията на протеина, който кодира, се нарича "антисенс" иРНК. Този механизъм се използва от някои бактерии за регулиране на гените (фиг. 3.20). На практика се използват изкуствено проектирани гени, в които ДНК инсертът е в такава ориентация, че техните транскрипти са антисенс по отношение на таргетната иРНК (фиг. 3.21).

Ориз. 3.20. Регулиране на гена за бактериоферитин (bfr) чрез антисенс РНК

Ориз. 3.21. Инхибиране на транслацията на иРНК от синтетичен антисенс олигонуклеотид

Доказано е, че могат да се използват синтетични антисенс олигонуклеотиди, но техният терапевтичен ефект ще зависи силно от тяхната устойчивост към действието на клетъчните нуклеази, системата за доставяне и спецификата на тяхната хибридизация. За определяне на най-ефективните целеви места върху специфична иРНК, набор от антисенс олигонуклеотиди с дължина 15-20 бази се тества с култура от клетки, синтезиращи целевата иРНК. Чрез електрофореза се определя съставът на синтезираните протеини и се установява въвеждането на кой олигонуклеотид води до намаляване на синтеза на целевия протеин.

За защита срещу нуклеазно разцепване се синтезират модифицирани олигонуклеотиди, без да се губи способността за хибридизация. На фиг. 3.22 показва структурите на модифицирани нуклеотиди, чиято ефективност се изследва интензивно. Например, беше показано, че олигонуклеотидите със заместване на свободния кислород на фосфодиестерната връзка със сяра (структура b) ефективно хибридизират с комплементарната целева РНК и получените дуплекси РНК-ДНК активират вътреклетъчната рибонуклеаза Н.

Този ендогенен ензим хидролизира РНК последователността в такива хибриди. С такива олигонуклеотиди вече са проведени обещаващи клинични изпитвания, в които целите са РНК на цитомегаловирус, ХИВ и някои РНК, отговорни за развитието на рак.

Ориз. 3.22. Олигонуклеотидни модификации: а - нормална фосфодиестерна връзка; b - тиофосфатна връзка; c - фосфамидна връзка; d - 2"-0-метилрибоза; e - С-5-пропинилцитозин

За ефективно доставяне на антисенс олигонуклеотиди, те често се опаковат в липозоми, които от своя страна са модифицирани със специфични лиганди, които осигуряват целево доставяне (вече видяхме тази техника, когато разглеждахме методи за невирусно доставяне на терапевтични гени). До момента са проведени редица тестове и е доказана висока терапевтична ефикасност на антисенс олигонуклеотидите за потискане на нежеланата пролиферация на гладкомускулни клетки (усложнения след ангиопластика, коронарен байпас, атеросклероза), за лечение на вирусни инфекции и малария .

Принципът на действие и структурата на рибозимите - естествена РНК с нуклеазна активност, е показан на фиг. 3.23.
Установено е, че тези късоверижни РНК са способни ефективно да потискат експресията на вирусни гени, онкогени, растежни фактори и други терапевтично важни гени чрез разцепване на тяхната иРНК. Чрез модифициране на субстрат-свързващата последователност е възможно да се получат рибозими, специфични за определена иРНК. Рибозимите могат да бъдат синтезирани директно в клетката чрез транскрипция на синтетичен олигодезоксирибонуклеотид, кодиращ каталитичния домен и хибридизиращи региони, които го фланкират.

Ориз. 3.23. Разцепване на иРНК от рибозими. Стрелката показва мястото на разцепване.

Такъв олигонуклеотид се вмъква в еукариотен експресионен вектор и се поставя в клетка. Получената РНК спонтанно придобива активна конформация, така наречената форма на глава на чук. Химически са синтезирани много рибозими с различна структура и активност. Например, в лабораторията за нуклеинови киселини на Института по химическа биология и експериментална медицина на Сибирския клон на Руската академия на науките (Новосибирск) се провеждат многогодишни изследвания за получаване на синтетични рибозими с повишена активност и стабилност.

За да се увеличи защитата срещу преждевременно разцепване от вътреклетъчни нуклеази, се получават различни производни на рибозими - с метилирани 2 "-хидроксилни (виж Фиг. 3.22, d) групи, бинарни структури и др. Структурата на рибозимната молекула значително влияе върху нейната ефективност. Фигура 3.24 показва кинетиката на разцепването на mdr1 mRNA със синтезирани рибозими с различни структури.

Ориз. 3.24. Разцепване на 190-мерния 5'-терминален фрагмент на MDR1 иРНК с модифицирани бинарни (1,3) и рибозими с пълна дължина (2,4): a - РНК структура с изолирано специфично място; b - натрупване на продукти на разцепване ( материали, предоставени от A.G. Venyaminova, IBKhiFM, Новосибирск)

Особено място в молекулярната терапия заемат т. нар. методи за пролекарствено активиране. Например, един от методите на генна терапия за рак е унищожаването на туморни клетки с помощта на активирано производно на ганцикловир (GCV, производно на гуанозин), продукт на гена на тимидин киназата, от вируса на херпес симплекс HSVtk, вече споменат от нас.

Туморните клетки се трансфектират in vivo с HSVtk гена под активен промотор и след няколко дни се прилага ганцикловир, който се фосфорилира от вирусна тимидин киназа до монофосфат и след това от кинази на гостоприемникова клетка до трифосфат. Това производно инхибира ДНК полимеразата и спира синтеза на ДНК, което води до смъртта на пролифериращи клетки. Чрез междуклетъчните контакти ганцикловир трифосфатът прониква в съседните немодифицирани клетки и по този начин унищожава още десет туморни клетки.

Генът, който води до смъртта на собствената клетка, се нарича "самоубийствен" ген (в нашия случай това е генът на тимидин киназата), а терминът "пролекарство" се отнася за неактивната форма на лекарството (в случая това е ганцикловир). Този подход е използван за създаване на други варианти на комбинацията генен активатор-пролекарство, но ефективността на системата GCV-HSVtk вече е доказана в редица предклинични проучвания.

Генната терапия е нова медицинска дисциплина, чието формиране се случва пред очите ни. Въпреки някои успехи и обещаващи перспективи, има редица предизвикателства, които остават за преодоляване.

Някои от проблемите са далеч отвъд медицината и молекулярната биология. Това са етични и политически въпроси. Както вече забелязахте, разгледахме методите на генетична терапия само за соматични клетки. Това означава, че направените корекции са ограничени до определен орган или тъкан, „коригираните“ гени няма да бъдат предадени на следващото поколение. Промените в генотипа на зародишните клетки (сперма или яйцеклетки) или оплодените клетки трябва да се предават от поколение на поколение.

Понастоящем генната терапия на соматични клетки се класифицира като стандартен метод за медицинска намеса. За разлика от това, генната терапия със зародишни клетки е технологично много по-сложна, проблематична и непредвидима. Поради това експериментите в тази област са забранени в много страни.

В края на 80-те години. В Съединените щати са установени разпоредби, регулиращи изпитванията в областта на генетичната терапия на соматичните клетки. Те гарантират безпристрастен и представителен подбор на пациентите и тяхната информираност (колко опасно е лечението, каква е вероятността за успех и др.), конфиденциалността на информацията за пациентите и извършените изследвания, правилното извършване на всички манипулации, без да причиняват вреда , както за конкретни пациенти, така и за човешката популация като цяло.

Тъй като лечението със соматични клетки води до подобряване на състоянието и значително удължаване на живота на пациенти с генетични заболявания, но „подобреният“ ген не се наследява, се смята, че това ще доведе до натрупване на генетични заболявания в човешката популация. Въпреки това, според популационната генетика са необходими хиляди години за значително увеличаване на честотата на вредния ген в резултат на ефективно лечение.

НА. Войнов, Т.Г. Волова

нуклеотиди- Фосфорни естери на нуклеозиди, нуклеозидни фосфати. Свободните нуклеотиди, по-специално ATP, cAMP, ADP, играят важна роля в енергийните и информационни вътреклетъчни процеси, а също така са съставни части на нуклеиновите киселини и много коензими.

Нар. съединения, състоящи се от две нуклеотидни молекули динуклеотиди, от три тринуклеотиди, от малък брой - олигонуклеотиди, и от много полинуклеотиди, или нуклеинови киселини.

морфолино(Английски) Морфолино) са синтетични олигонуклеотиди, използвани в молекулярната биология за промяна на генната експресия. Антисенс олигомерните морфолинози се използват за блокиране на достъпа на други молекули до специфични последователности на нуклеинова киселина. Морфолиновите олигонуклеотиди блокират малки едноверижни региони (около 25 нуклеотида) на повърхността на РНК молекулите.

Антисенс олигонуклеотидиса дълги последователности от ДНК нуклеотиди в хромозомите. Ако трябва да се експресира ген, тогава се стартира процесът на транскрипция на този ген, в резултат на което се синтезира иРНК.

Терапевтичният ефект на синтетичните антисенс олигонуклеотиди зависи от спецификата на тяхната хибридизация с достъпното място на целевата иРНК, устойчивостта на действието на клетъчните нуклеази и наличието на система за доставяне в клетката.

Към днешна дата най-ефективното целенасочено спиране на активността на определени региони на генома се извършва от антисенс олигонуклеотиди (AON). Стратегията за използване на AON се основава на взаимодействието на Watson-Crick на ДНК молекули с целевата иРНК. Образуването на хетеродуплекс ДНК-иРНК води до инактивиране на М-РНК и последващо спиране на протеиновия синтез.

С други думи, антисенс механизмът се отнася до свързването на олигонуклеотида към комплементарното място на целевата РНК и потискането на вътреклетъчната функция на тази РНК.

Този прост и привлекателен теоретичен модел обаче се оказа много по-сложен в действителност. Известни са три вида антисенс молекули: относително къси синтетични олигонуклеотиди; антисенс РНК, експресирана в клетката след трансфекция с антисенс рибозимен ген, имаща каталитична активност.

Създаването на лекарства на базата на антисенс олигонуклеотиди е едно от най-новите направления в разработването на лекарства. Тази технология дава възможност на изследователя да повлияе директно на почти всеки процес в клетката с най-висока специфичност. Ако определен протеин стимулира растежа на ракова клетка, тогава чрез използване на подходящ антисенс олигонуклеотид може да се гарантира, че този протеин никога повече няма да бъде синтезиран в клетката. Антисенс олигонуклеотидите са толкова специфични, че е практически невъзможно някой друг протеин в клетката да бъде засегнат. Тази специфика ще намали страничните ефекти, често наблюдавани при традиционното лечение на рак.

Механизмът на инактивиране все още не е напълно ясен. Но може би това се дължи на факта, че двойноверижната РНК не е характерна за нормалните клетки. Тъй като сигналът за синтеза на всеки протеин е единична иРНК, такъв сигнал за конкретен протеин може да бъде изключен или "нокаутиран" с помощта на такава комплементарна последователност.

Фиг.4 Механизмът на действие на антисенс олигонуклеотида

Важен проблем при лечението с лекарства на базата на антисенс олигонуклеотиди е разрушаването на такива лекарства от клетъчни ензими - нуклеази. Олигодезоксинуклеотидите се разграждат от нуклеазите, така че е много важно да ги защитим от действието на последните, за да не загубят способността си да се хибридизират с мишената. За да направите това, се извършва електрофоретично разделяне на клетъчни протеини, в които се включва радиоактивен етикет по време на транслацията и с помощта на радиоавтография се определя в присъствието на кой от "антисенс" олигонуклеотидите се намалява синтезът на определен протеин. Няма общи критерии за избор на най-добрите целеви места в различни РНК транскрипти. Олигонуклеотиди, които са комплементарни на 5'- или 3'-konp иРНК, граници на екзон и интрон и дори двойноверижни региони могат да бъдат ефективни. Олигодезоксинуклеотидите се разграждат от вътреклетъчни нуклеази, поради което е важно да се предпазят от действието на последните, така че да не загубят способността си да хибридизират с мишената. За тази цел пиримидиновите бази и дезоксирибозата могат да бъдат модифицирани по определен начин.

По този начин, в понастоящем най-широко използваните "антисенс" олигонуклеотиди, свободният кислороден атом на фосфодиестерната връзка е заменен със сулфо група, което води до образуването на тиофосфатна връзка. Модифицираните по този начин олигонуклеотиди се разтварят във вода, носят отрицателен заряд и не се разцепват от ендонуклеази. При хибридизация с целевото място те образуват РНК-ДНК дуплекси, които активират рибонуклеаза (РНаза) Н, ендогенен ензим, който разцепва иРНК в хибридната молекула. Проведени са първите клинични изпитвания на такива олигонуклеотиди, лекарства от първо поколение. Мишените са РНК на цитомегаловирус, вирус на човешка имунна недостатъчност, както и иРНК на гени, отговорни за развитието на рак, чревни заболявания и други заболявания.

Синтезирани "антисенс" олигонуклеотиди с фосфорамидитни и полиамидни (пептидни) връзки. Такива молекули са много устойчиви на действието на нуклеазите. Химическите групи, прикрепени към 2' въглеродния атом на захарния остатък и С-5 атома на пиримидините, също защитават антисенс олигонуклеотидите и улесняват тяхното свързване към целевото място. ). Всички предимства на тези и други модификации сега се изучават интензивно.