ELISA (ензимно-свързан имуносорбентен анализ, ELISA - английски) навлиза в живота на практическата медицина някъде другаде през 60-те години на миналия век. Първоначалната му задача е хистологично изследване за научни цели, което се ограничава до търсене и идентифициране на антигенната структура на клетките на живия организъм.

Методът ELISA се основава на взаимодействието на специфични (AT) и свързани антигени (AG) с образуването на комплекс антиген-антитяло, който се открива с помощта на ензим. Този факт навежда учените на идеята, че методът може да се използва за диагностични цели за идентифициране на специфични имуноглобулини от различни класове, участващи в имунния отговор към определена инфекция. И това беше пробив в клиничната лабораторна диагностика!

Методът започва да се използва активно едва в началото на 80-те години, и то предимно в специализирани институции. Първите анализатори ELISA бяха доставени на центрове и станции за кръвопреливане, инфекциозни и венерически болници, тъй като страховитият СПИН, роден на африканския континент, се появи на хоризонта с нас и веднага се присъедини към „старите“ инфекции, изисква незабавни мерки за диагностициране и търсене на терапевтични лекарства, които му въздействат.

Обхват на метода ELISA

Възможностите на ензимния имуноанализ са наистина обширни.Сега е трудно да си представим как може да се направи без такива изследвания, които се използват буквално във всички отрасли на медицината. Изглежда, че ELISA може да направи в онкологията? Оказва се, че може. И то много. Способността на анализа да открива маркери, характерни за определени видове злокачествени новообразувания, е в основата на ранното откриване на тумор, когато той все още не е открит по друг начин поради малкия си размер.

Съвременната клинична лабораторна диагностика (КЛД), в допълнение към туморните маркери, разполага със значителен арсенал от панели за ELISA и ги използва за диагностициране на различни патологични състояния (инфекциозни процеси, хормонални нарушения) и мониториране на фармацевтични лекарства, за да идентифицира ефекта им върху пациента. тяло и, между другото, не само човек. В момента ензимният имуноанализ се използва широко във ветеринарната служба, тъй като "нашите по-малки братя" също са податливи на много заболявания, от които понякога страдат много.

По този начин, ELISA, поради своята чувствителност и специфичност, може да определи от кръвна проба, взета от вена:

• Хормонален статус (хормони на щитовидната жлеза и надбъбречните жлези, полови хормони);
• Наличието на вирусна и бактериална инфекция (HIV, B и C, хламидия, сифилис и, и, както и много други заболявания, причинени от патогенни микроорганизми);
• Следи от жизнена активност на микроорганизми, които са инициирали инфекциозния процес, който е завършил успешно и е преминал към етапа на формиране на имунен отговор към този патоген. Такива следи, тоест антитела, в много случаи остават да циркулират в кръвта за цял живот, което предпазва човек от повторно заразяване.

Каква е същността на IF?

Методът на ензимния имуноанализ позволява да се определи не само наличието на самия патоген (качествен анализ), но и неговото количествено съдържание в кръвния серум на пациента.

Вирусна или бактериална доза значително влияе върху хода на инфекциозния процес и неговия резултат, следователно количественият анализ играе важна роля в диагностиката и лечението на заболявания в различни форми и етапи.

Познавайки обаче ензимно-свързания имуноанализ като метод ELISA, ние дори не се замисляме как той успява да обхване толкова широк спектър от микроорганизми, обитаващи нашата планета, много от които представляват пряка заплаха за здравето и живота на хората и животни. Факт е, че ELISA има много опции (неконкурентни и конкурентни - директни и косвени), всяка от които решава свой собствен проблем и по този начин дава възможност за целенасочено търсене.

За откриване на имуноглобулини от един или друг клас се използва традиционен 96-ямков панел от полистирол (таблетка), в чиито ямки са концентрирани адсорбирани рекомбинантни протеини в твърда фаза. Антителата или антигените, попаднали в ямката с кръвен серум, намират „познат“ обект и образуват комплекс с него (AG - AT), който, фиксиран от ензимния конюгат, ще се прояви като промяна в цвета на ямката при четене на резултатите.

Имуноензимният анализ се извършва на тест-системи с определена специфичност, направени в специални лаборатории и оборудвани с всички необходими реагиращи компоненти. Изследванията могат да се извършват с помощта на шайби ("шайби") и спектрофотометри за отчитане, където е включен най-много ръчен труд. На напълно автоматични машини, освобождаващи лаборанта от монотонно вливане, измиване и други рутинни задачи, разбира се, е по-бързо и по-удобно да се работи, но не всички лаборатории могат да си позволят такъв лукс и да продължат да работят по старомодния начин - на полуавтоматични устройства.

Тълкуването на резултатите от ELISA е в компетенцията на лекаря по лабораторна диагностика, като задължително се взема предвид свойството, присъщо на почти всички имунохимични реакции, да дават фалшиво положителни или фалшиво отрицателни отговори.

Видео: модерен ензимен имуноанализ

Резултати от ELISA на примера на сифилис

ELISA е подходящ за откриване на всички формии освен това се използва в скринингови изследвания. За анализ се използва венозна кръв на пациента, взета на празен стомах. В работата се използват плаки с определена специфичност (AT класове A, M, G) или общи антитела.

Като се има предвид, че антителата при сифилис се произвеждат в определена последователност, ELISA може лесно да отговори на въпроса кога е настъпила инфекцията и на какъв етап е процесът, а декодирането на получените резултати може да бъде представено в следната форма:

• IgM показват продължителността на инфекциозния процес (може да се появи по време на обостряне на хронични възпалителни заболявания);
• IgA показват, че инфекцията е станала преди повече от месец;
• IgG показват, че инфекцията е в разгара си или скорошно лечение, което лесно се установява при събиране на анамнеза.

При тестване за сифилис, отрицателните ямки (и отрицателната контрола) ще останат безцветни, докато положителните (като положителната контрола) ще покажат ярко жълт цвят поради промяната на цвета на добавения по време на теста хромоген. Но интензивността на цвета не винаги съответства на контролата, тоест може да е малко по-бледа или леко жълтеникава. Това са съмнителни резултати, които по правило подлежат на повторно изследване със задължителното отчитане на количествените показатели, получени на спектрофотометъра, но като цяло цветът е пряко пропорционален на броя на имунните комплекси (свързани антигени и антитела). един на друг).

Най-вълнуващият ензимен имуноанализ - ELISA за HIV

Анализът, може би повече от други, представлява интерес за широк кръг от населението, тъй като все още не е възможно да се каже със сигурност, че много социални проблеми (проституция, наркомания и др.) са изчезнали. За съжаление, ХИВ засяга не само тези части от човешкото общество, можете да се заразите при различни обстоятелства, които не са свързани със сексуална безразборност или употреба на наркотици. Но ако има нужда от тест за ХИВ, тогава не трябва да се страхувате, че всички наоколо ще разберат за посещението на такава лаборатория. Сега ХИВ-инфектираните са защитени от закона и тези, които имат съмнения, могат да се обърнат към анонимни офиси, където могат да разрешат проблема без страх от публичност и осъждане.

Ензимният имуноанализ, използван за диагностициране на ХИВ инфекция, е едно от основните стандартни изследвания, които обаче изискват специални условия, тъй като темата е много чувствителна.

Има смисъл да се провежда ELISA за ХИВ след сексуален контакт, кръвопреливане, други медицински процедури, свързани с инфекция, и в края на инкубационния период („серонегативен прозорец“), но трябва да се има предвид, че този период от време не е постоянен. Може да приключи след 14-30 дни или да продължи до шест месеца, така че средната стойност се счита за интервал от 45 до 90 дни. Кръвта се дарява за ХИВ по същия начин, както при други инфекции - от вена на празен стомах. Резултатите ще бъдат готови в зависимост от натрупването на материал в лабораторията и нейната натовареност (от 2 до 10 дни), въпреки че повечето лаборатории дават отговор на същия ден или на следващия.

Какво може да се очаква от резултатите за ХИВ?

ELISA за HIV инфекция открива антитела срещу два вида вирус: HIV-1 (по-често срещан в Русия и други европейски и азиатски страни) и HIV-2 (по-често срещан в Западна Африка).

Задачата на HIV ELISA е да търси антитела от клас G, които се откриват във всички тестови системи, но в по-късен период, и антитела от клас А и М, откривани в рекомбинантни тестови комплекти от ново поколение, което позволява откриването на антитела най-рано етапи (инкубационният период е серонегативен прозорец). От ELISA могат да се очакват следните отговори:

1. Първичен положителен резултат: кръвта подлежи на повторна проверка на тестова система от същия тип, но по възможност от друга серия и от друго лице (лаборант);
2. Повторното (+) включва ново вземане на кръв от пациент с изследване, подобно на първичния анализ;
3. Следващият положителен резултат подлежи на референтен анализ, при който се използват високоспецифични тестови комплекти (2-3 бр.);
4. Положителният резултат и в двете (или три) системи се изпраща за имуноблотинг (същият ELISA, но извършен индивидуално върху тестови комплекти с особено висока специфичност).

Заключението за HIV инфекция се прави само въз основа на имуноблотинг. Със заразения се провежда разговор при пълна конфиденциалност. Разкриването на медицинска тайна в Русия, както и в други страни, подлежи на наказателно наказание.

Анализите за хламидия и цитомегаловирус чрез ензимен имуноанализ също придобиха особена популярност, поради факта, че ви позволяват да определите времето на инфекцията, стадия на заболяването и ефективността на терапевтичните мерки.

По време на въвеждането е възможно също да се наблюдава появата на антитела от различни класове.в различни фази на патологично състояние, причинено от инфекциозен агент:

• IgM може да се открие още седем дни след заразяването;
• IgA показват, че инфекцията живее в тялото повече от месец;
• IgG потвърждава диагнозата хламидия, помага да се наблюдава лечението и да се определи неговата ефективност. Трябва да се отбележи, че антителата от клас G остават и циркулират в тялото независимо от продължителността на заболяването, следователно за правилното тълкуване на анализа трябва да се вземат предвид референтните стойности (норми), които, от начина, са различни за всеки CDL: като се вземе предвид марката на тест системата и спецификата на реагентите, включени в комплекта. Нормалните стойности се въвеждат във формуляра до резултата от ELISA.

Що се отнася до това, тук е малко по-различно:антитела от клас М се появяват след около месец и половина, т.е. положителен резултат (IgM +) става във фазата на първична инфекция или по време на реактивиране на латентна инфекция и остава такъв от 4 месеца до шест месеца.

Наличието на антитела от клас G е характерно за началото на първична остра инфекция или реинфекция. Анализът посочва наличието на вируса, но не дава информация на какъв етап е инфекциозният процес. Междувременно определянето на нормата на титъра на IgG също създава трудности, тъй като зависи изцяло от имунния статус на конкретен човек, който обаче се установява чрез откриване на имуноглобулини от клас G. Като се има предвид това поведение на антителата, при диагностицирането на CMVI, става необходимо да се оцени способността на антителата от клас G да взаимодействат с CMV, за да го „неутрализират“ по-късно (AT авидитет). В началния стадий на заболяването IgG се свързва много слабо с антигените на вируса (нисък авидитет) и едва тогава те започват да проявяват активност, следователно можем да говорим за повишаване на авидитета на антителата.

Можем да говорим за предимствата на ензимния имуноанализ дълго време, тъй като този метод успя да реши много диагностични проблеми, използвайки само венозна кръв. Няма нужда от дълго чакане, притеснения и проблеми с вземането на материал за изследване. В допълнение, тестовите системи за ELISA продължават да се подобряват и денят, в който тестът ще даде 100% надеждност на резултата, не е далеч.

Видео: учебен филм на Московския държавен медицински университет. Сеченов за основите на ELISA

Описание

Подготовка

Показания

Тълкуване на резултатите

Описание

Метод на определяне Ензимен имуноанализ (ELISA).

Проучван материалСерум

Възможност за домашно посещение

Комбинирано откриване на антитела срещу HIV тип 1 и 2 и HIV p24 антиген, качествен тест.

внимание. При положителни и съмнителни реакции срокът за издаване на резултата може да бъде удължен до 10 работни дни. HIV (вирус на човешка имунна недостатъчност), който причинява СПИН (синдром на придобита имунна недостатъчност), принадлежи към семейството на ретровирусите. Предава се от човек на човек чрез използване на замърсени игли и спринцовки за интравенозна употреба на наркотици или терапевтични процедури, чрез полов акт, както хетеросексуален, така и хомосексуален. Предаването на вируса може да стане чрез преливане на заразена кръв и нейни продукти, даряване на органи или семенна течност, при здравни работници - при нараняване от заразени игли или инструменти. ХИВ инфекцията е възможна чрез предаването му от заразена майка на дете (вертикален път), въпреки че съвременните методи за превенция с помощта на антиретровирусна терапия, ако се спазват всички препоръки, могат да намалят този риск до минимум.

Процесът на взаимодействие на вируса с клетката включва няколко етапа: свързване на вируса с клетката, освобождаването му от обвивката, проникване в цитоплазмата, синтез на ДНК от вирусна РНК и интегриране на вирусна ДНК в генома на клетката гостоприемник. След това започва латентният стадий на инфекцията. В това състояние провирусната ДНК може да съществува известно време, без да показва активност и без да засяга жизнената активност на клетката гостоприемник. Докато няма експресия на вирусни протеини, няма имунен отговор към вируса. Антителата срещу HIV, които характеризират имунния отговор на организма, се появяват след активирането на вирусната ДНК и началото на активното възпроизвеждане на вируса. Продължителността на латентния период зависи от редица фактори, включително индивидуалните генетични характеристики на организма.

Антителата срещу HIV могат да се появят от втората седмица след заразяването; тяхното съдържание се увеличава в рамките на 2-4 седмици и се запазва в продължение на много години. При 90-95% от заразените те се появяват през първите три месеца след заразяването, при 5-9% - в периода от три до шест месеца, при 0,5-1% - на по-късна дата.

През първите седмици на инфекцията, дори преди появата на антитела срещу вируса (т.е. преди сероконверсия), наличието на HIV антигени, включително неговия р24 капсиден протеин, може да бъде открито в серумни или плазмени проби. По-късно, след сероконверсия, обикновено става неоткриваем.

Комбинирани анализи от четвърто поколение, като теста HIV Ag/Ab Combo (Architect, Abbott), откриват както антитела срещу HIV тип 1 и 2, така и антиген p24 на HIV, което позволява ранно откриване на инфекция. Специалните характеристики на скрининг теста, използван в лабораторията INVITRO за откриване на HIV инфекция, включват високата специфичност на изследването (> 99,5%); 100% чувствителност на анализа към антитела, характерни за периода на сероконверсия, а чувствителността на теста към антигена p24 е около 18 pg/ml.

Процедурата за лабораторно изследване за ХИВ е строго регламентирана от заповедите на Министерството на здравеопазването на Руската федерация и включва етапа на скринингово (скринингово) изследване за наличие на антитела срещу ХИВ чрез одобрени за употреба методи на ензимен имуноанализ (ELISA). , и етапът на проверка (потвърждаване) на по-подробно изследване в лабораторията на градския център за СПИН. Трябва да се отбележи, че дори най-добрите системи за скрининг ELISA не гарантират 100% специфичност, т.е. има известна възможност за получаване на неспецифични, фалшиво положителни резултати, свързани с характеристиките на кръвния серум на пациента. Следователно положителен резултат от скрининг ELISA може да не бъде потвърден при потвърдителни тестове, след което на пациента ще бъде даден отрицателен или неопределен резултат. Ако резултатът от потвърдителното изследване е неопределен, тестването трябва да се повтори в динамика след 2-3 седмици.

Лабораторната диагностика на HIV инфекцията при деца, родени от заразени с HIV майки, има свои собствени характеристики. Майчините антитела срещу HIV (клас IgG) могат да циркулират в кръвта им до 18 месеца от момента на раждането. Липсата на антитела срещу HIV при новородени не означава, че вирусът не е преминал през плацентарната бариера. Деца на HIV-инфектирани майки подлежат на лабораторно диагностично изследване в рамките на 36 месеца след раждането.

Подготовка

Не се изисква специална подготовка. Вземането на кръв се препоръчва не по-рано от 4 часа след последното хранене. Можете да намерите общи препоръки за подготовка за изследване. Препоръчително е да се проведе тест за откриване на антиген и антитела срещу HIV не по-рано от две седмици след възможна инфекция, като се повтори след три и шест седмици в случай на отрицателен резултат. Регистрацията на заявления за изследване в INVITRO LLC се извършва съгласно паспорт или документ, който го замества (миграционна карта, временна регистрация по местоживеене, военнослужещо свидетелство, удостоверение от паспортната служба в случай на загуба на паспорт, регистрационна карта от хотела). Представеният документ трябва да съдържа информация за временна или постоянна регистрация на територията на Руската федерация и снимка. При липса на паспорт (документ, който го замества), пациентът има право да подаде анонимно заявление за доставка на биоматериал. При анонимно изследване на заявлението и получената от клиента проба от биоматериал се присвоява номер, известен само на пациента и медицинския персонал, който е поръчал. ! Резултатите от анонимно извършени изследвания не могат да се предоставят за хоспитализация, професионални прегледи и не подлежат на регистрация в ORUIB.

Индикации за назначаване

• Увеличаване на лимфните възли в повече от две области.
• Левкопения с лимфопения.
• Нощно изпотяване.
• Внезапна загуба на тегло по неизвестна причина.
• Диария за повече от три седмици с неизвестна причина.
• Треска с неизвестна причина.
• Планиране на бременност.
• Предоперативна подготовка, хоспитализация.
• Идентифициране на следните инфекции или техните комбинации: туберкулоза, открита токсоплазмоза, често рецидивираща херпесвирусна инфекция, кандидоза на вътрешните органи, повтаряща се херпес-зостер невралгия, причинена от микоплазми, пневмоцисти или легионелна пневмония.
• Сарком на Капоши в млада възраст.
• Случаен секс.

Тълкуване на резултатите

Тълкуването на резултатите от изследването съдържа информация за лекуващия лекар и не е диагноза. Информацията в този раздел не трябва да се използва за самодиагностика или самолечение. Точната диагноза се поставя от лекаря, като се използват както резултатите от това изследване, така и необходимата информация от други източници: история, резултати от други изследвания и др.

Мерни единици в Независима лаборатория ИНВИТРО: качествен тест. Формата на представяне на резултатите: при липса на антитела срещу HIV 1 и 2 и p24 антиген, отговорът е „отрицателен“. В случай на откриване на антитела срещу ХИВ или антиген при скрининговия тест ELISA, серумната проба се изпраща за анализ чрез потвърдителен имуноблот метод в градския център за СПИН, който проверява положителни и неопределени резултати.

Положителен резултат:

1. HIV инфекция;
2. фалшив положителен резултат, изискващ повторни или допълнителни изследвания*);
3. изследването не е информативно при деца на възраст под 18 месеца, родени от HIV-инфектирани майки.

*Специфичността на системата за скрининг тест HIV 1 и 2 антитела и HIV 1 и 2 антиген (HIV Ag/Ab Combo, Abbott) е оценена от производителя на реагента на около 99,6% както в общата популация, така и в групата пациенти с потенциални смущения (инфекции HBV, HCV, рубеола, HAV, EBV, HNLV-I, HTLV-II, E.coli, Chl.trach. и др., автоимунни патологии (включително ревматоиден артрит, наличие на антинуклеарни антитела), бременност, повишени нива на IgG, IgM, моноклонална гамапатия, хемодиализа, многократни кръвопреливания).

Обща информация за изследването

ХИВ (вирус на човешката имунна недостатъчност) е вирус от семейството на ретровирусите, който инфектира клетките на човешката имунна система (CD4, Т-хелпери). Причинява СПИН.

HIV-1 е най-разпространеният тип вирус, най-често срещан в Русия, САЩ, Европа, Япония и Австралия (обикновено подтип B).

ХИВ-2 е рядък тип, често срещан в Западна Африка.

За диагностика на вируса на човешката имунна недостатъчност се използва комбинирана тестова система от четвърто поколение, която е в състояние да открие ХИВ инфекция още 2 седмици след навлизането на вируса в кръвта, докато тестовите системи от първо поколение правят това само 6-12 седмици след заразяване.

Предимството на този комбиниран тест за HIV е откриването, благодарение на използването на антитела срещу HIV-1 p24 като реагенти, специфичния антиген p24 (вирусен капсиден протеин), който може да бъде открит чрез този тест още 1-4 седмици след инфекцията, дори преди сероконверсия, което значително намалява "периода на прозореца".

В допълнение, такъв тест за HIV открива антитела срещу HIV-1 и HIV-2 в кръвта (използвайки реакцията антиген-антитяло), които се произвеждат в достатъчни количества, за да бъдат определени от тестовата система след 2-8 седмици от момента на инфекция.

След сероконверсия, антителата започват да се свързват с антигена p24, което води до положителен тест за HIV антитяло и отрицателен тест за p24. След известно време обаче в кръвта ще бъдат открити едновременно антитела и антиген. В терминалния етап тестът за СПИН за антитела срещу ХИВ може да даде отрицателен резултат, тъй като механизмът за производство на антитела е нарушен.

Етапи на HIV инфекция

1. Инкубационният период или „периодът на серонегативния прозорец“ е времето от момента на заразяването до производството на защитни антитела срещу вируса в кръвта, когато тестовете за антитела срещу ХИВ са отрицателни, но човекът вече може да предаде вируса на други хора. Продължителността на този период е от 2 седмици до 6 месеца.
2. Периодът на остра ХИВ инфекция настъпва средно 2-4 седмици след инфекцията и продължава приблизително 2-3 седмици. На този етап някои хора могат да развият неспецифични грипоподобни симптоми поради активното размножаване на вируса.
3. Латентният стадий е асимптоматичен, но по време на него има постепенно намаляване на имунитета и увеличаване на количеството на вируса в кръвта.
4. СПИН (синдром на придобита имунна недостатъчност) е последният стадий на HIV инфекцията, който се характеризира с тежко потискане на имунната система, както и съпътстващи заболявания, енцефалопатия или рак.

Въпреки факта, че HIV инфекцията е нелечима, днес има високоактивна антиретровирусна терапия (ART), която може значително да удължи живота на HIV-инфектиран човек и да подобри неговото качество.

Този тест има особено висока диагностична стойност, ако ХИВ инфекцията е настъпила малко преди момента на изследването (2-4 седмици).

За какво се използват изследванията?

Анализът се използва за ранна диагностика на ХИВ, което помага за предотвратяване на по-нататъшно предаване на вируса на други хора, както и за навременно започване на антиретровирусна терапия и лечение на заболявания, които допринасят за прогресирането на ХИВ инфекцията.

Кога е насрочено изследването?

• С персистиращи симптоми (за 2-3 седмици) с неясна етиология: субфебрилна температура, диария, нощно изпотяване, внезапна загуба на тегло, подути лимфни възли.
• При рецидивираща херпесна инфекция, вирусен хепатит, пневмония, туберкулоза, токсоплазмоза.
• Ако пациентът страда от полово предавани болести (сифилис, хламидия, гонорея, генитален херпес, бактериална вагиноза).
• Ако пациентът е имал незащитен вагинален, анален или орален секс с множество сексуални партньори, нов партньор или партньор, за чийто ХИВ статус пациентът не е сигурен.
• Когато пациентът е претърпял процедура за кръвопреливане (въпреки че случаите на инфекция по този начин са практически изключени, тъй като кръвта се тества внимателно за наличие на вирусни частици и се подлага на специална топлинна обработка).
• Ако пациентът е инжектирал наркотици с помощта на нестерилни инструменти.
• По време на бременност/планиране на бременност (AZT по време на бременност, цезарово сечение, за да се избегне предаването на вируса на детето по време на преминаване през родовия канал, и липсата на кърмене намаляват риска от предаване на ХИВ от майка на дете от 30% до 1%).
• Случайно инжектиране със спринцовка или друг предмет (като медицински инструмент), съдържащ заразена кръв (в такива случаи вероятността от инфекция е изключително ниска).