Фагоцитоза Клетките не само са в състояние да образуват псевдоподии чрез свиване, те отделят обвиващи пластини, за да фиксират чужди частици, като частици прах, микроби, останки от мъртви, дегенерирали клетки.Фактът, че левкоцитите и други подвижни

Имунитет Имунитетът (лат. immunitas - „освобождаване от нещо“) е защитата на тялото от генетично чужди организми и вещества, които включват микроорганизми, вируси, червеи, различни протеини, клетки, включително техните собствени променени. ВНИМАНИЕ Благодарение на имунитета

В литературата са описани голям брой методи за количествено определяне на фагоцитозата. Обемът на тази книга не ни позволява да опишем подробно всички, затова ще се ограничим да опишем само няколко.

Материали и оборудване

За да работите, трябва да имате:

Цитратдекстрозен антикоагулант: 8 g лимонена киселина. 22 g тризаместен натриев цитрат (двуводен), 24,5 g глюкоза се разтварят в 1 литър вода;

Разтвор на декстрозодекстран: 4,5 g NaCl, 25 g глюкоза, 30 g декстран (отн. мол. тегло 500 000) в 1 l;

Разтвор на амониев хлорид: 9 части 0,83% амониев хлорид, 1 част Tris-HCl буфер pH 7,2 (20,6 g/l);

Смес от фикол - визотраст: 9 g фикол, 20 ml визотраст, 100 ml бидестилирана Н 2 0, плътност 1,077;

Субстрат за β-глюкуронидаза: 31,5 mg р-нитрофенил-β-глюкуронид и 100 μm Triton X 100 се разтварят в 100 ml 0,05 М натриев ацетатен буфер рН 5;

Реагенти за дефицит на миелопероксидаза: фиксатор (10 ml 37% формалдехид с 90 ml абсолютен етанол), субстратен разтвор (100 ml 30% EDTA, 0,3 g бензидин хлорид, 0,038 g ZnS0 4 x7H 2 0, 1 ml дестилирана вода, 1,0 g CH 3C00Nax3H20, 0.7 ml 3% H202); доведете рН на 1.0 М NaOH до 6.0.

Търговски реактиви:

FSB, разтвор на Ханк и среда Eagle-MEM (Държавен институт за имунни препарати и хранителни среди, Берлин-Вайсензее, ГДР);

Хепарин (5000 IU/mg) (Gedeon Richter, Унгария);

Серум от говежди ембриони (Flow Laboratories, САЩ, може да се използва друга фирма);

Visotrast (VEB Fahlberg List, Магдебург, ГДР);

Infucoll (VEB Serumwerk Bernburg, ГДР);

Декстран, фикол (Pharmacia, Швеция);

Колоиден въглерод Сl1/143a (Wagner, Pelikanwerke, Германия);

Диизодецил фталат, парадиоксан (Coleman, Matheson и Bell, САЩ);

Triton X 100 (Serva, Германия, възможна е друга компания);

Oil red O (Allied chemical corp., Morristown, NY, USA);

Яранитрофенил-β-глюкуронид (Sigma, САЩ);

Safranin O (Fischer Scientific Lab., Чикаго, САЩ);

Полистиренови перли, тръби (Nunc, Дания);

Решетка F 905 (VEB Orvo Wolfen, ГДР).

Получаване на фагоцити

Необходимата информация за изолирането на човешки гранулоцити може да бъде получена в глава "Разделяне на клетки на имунната система"; за получаване на перитонеални макрофаги, вижте разделите "Култивиране на макрофаги и моноцити" и "Изолиране на макрофаги от суспензия на сплейоцити". Този въпрос е разгледан подробно в редица трудове.

Освен това трябва да се споменат следните методи:

8 ml кръв се смесват с разтвор на декстранглюкоза. След това добавете 6% разтвор на декстран 75 в 0,15 М NaCl (5 ml). Сместа се оставя за 45-50 минути при стайна температура за утаяване на еритроцитите. Аспирирайте плазма. Остатъчните еритроцити се лизират чрез добавяне на 0,83% амониев хлорид (35 ml към 15 ml плазма). Центрофугирайте за 10 минути при 80 g, суспендирайте утайката в 0,15 М NaCl, охладен до 0°C. Комбинирайте няколко утайки и центрофугирайте за 10 минути при 800 g. Клетките се държат най-добре върху лед в 0,15 М NaCl (тази среда е по-подходяща от буферирана среда с двувалентни катиони, които карат клетките да се слепват);

Ако обектът на фагоцитоза са дрожди, етапът на третиране с амониев хлорид може да бъде пропуснат, тъй като червените кръвни клетки не пречат на процеса. Мононуклеарните клетки могат да бъдат получени по следния начин: хепаринизираната кръв се смесва с 1/3 от обема на средата на Eagle, съдържаща 15% глюкоза, наслоява се върху слой от смес от фикол - визотраст и се центрофугира 20 минути при 400 g. Фракцията от мононуклеарни клетки се аспирира с пипета на Pasteur, промива се два пъти с PBS и се приготвя суспензия в среда на Eagle (1x107 клетки/ml).

Подготовка на частици за фагоцитоза

По-често се използват живи култури от Staphylococcus aureus (SG 511 или 502 A), Staphylococcus epididermidis SG 475, E. coli и други ентеробактерии, листерии, коринебактерии, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae. Микроорганизмите се отглеждат 24 часа (при необходимост 48 часа) върху твърди и течни хранителни среди. Събраната биомаса се промива три пъти с 0.15 М NaCl. Твърде гъстата суспензия се измерва при 640 nm, концентрацията се определя от калибровъчната крива.

Концентрацията на микроорганизмите се определя и от методите на пресяване върху плътни хранителни среди; в някои случаи преброяването на микроорганизмите може да се извърши в камери за преброяване.

Когато работите с живи бактериални култури, трябва да се внимава винаги да се използват култури на един и същи етап. Добавянето на 0,01% говежди серумен албумин насърчава оцеляването на микроорганизмите. Приготвената суспензия остава стабилна за 1-2 часа.

Културите на убити микроорганизми обикновено се получават чрез нагряване в продължение на 30 минути при 80°C или чрез третиране с течаща пара. Убитите микроби се промиват три пъти с 0,15 М NaCl, ресуспендират се и се определя концентрацията на суспензията.

Приготвяне на хлебна мая: 0,5 g хлебна мая се суспендира в 0,15 M NaCl и се поставя на кипяща водна баня за 30 минути. Филтрира се през филтър от памучна марля. Когато се използват живи дрожди, пресни клетки (4-5 дневна култура) се промиват три пъти в среда на Eagle с добавяне на 1,0% глюкоза. Обикновено се използва клетъчна суспензия от 10 8 и 10 9 клетки/ml. Дрождите се използват като тестови частици при откриването на дефекти в компонент C5.

Използване на суспензия от полистиренови частици: Пригответе 10% водна суспензия от полистиренови частици с диаметър 1,091 μm. Разрежда се в съотношение 1 + 1 с 0,2% разтвор на BSA в 0,15 М NaCl, центрофугира се. При дължина на вълната 253 nm, суспензия от полистирол 1 μg/ml дава абсорбция от 1,17x10 -3.

Приложение на суспензия от липополизахарид - маслено червено О в минерално масло: 2 g маслено червено се стриват в 50 ml диизодецил фталат (или вазелиново масло) в порцеланово хаванче. Центрофугирайте за 20 минути при 500 g. Добавете 10 μg от супернатантната фракция към 10 ml диоксин, измерете оптичната плътност при дължина на вълната 525 nm. Коефициентът на преобразуване е 0,92. На втория етап 40 mg липополизахарид (Е. coli 0.26 B6 и др.) се разтварят в 3 ml 0.15 М NaCl. След това към тази смес се добавя 1 ml разтвор на маслообразно червено О в диизодецилсулфат и сместа се суспендира за 90 секунди. Суспензията се използва веднага и може да се замразява.

За да се настрои реакцията на фагоцитоза, формализираните еритроцити могат да се използват като тестови частици.

Фагоцитоза на бактерии, бактерицидно

Експеримент със суспензия на живи бактерии: Обикновено се използва съотношение 3-10 микроби/фагоцит. В общ обем от 2 ml се смесват 1x106 фагоцити с 3x106 - 1x106 микроби. На практика 1 ml бактериална суспензия се добавя към 1 ml суспензия от фагоцити, към която са добавени 8 IU хепарин. Времето за взаимодействие обикновено е 30 минути, в някои случаи е по-дълго. След инкубацията се вземат 0,5 ml от сместа, добавят се 1,5 ml 0,1% разтвор на желатин в разтвор на Hank, охладен до 0°C, и се центрофугира 3-4 минути при 300 g. От утайката се приготвят петна, които се оцветяват по Pappenheim. Вижте 200 клетки (ако е възможно три пъти). Изчислете процента на фагоцитоза. Според броя на бактериите, съдържащи се в клетките, се изчислява индексът на фагоцитната активност: броят на фагоцитираните бактерии се умножава по процента на фагоцитните клетки; интензивността на фагоцитозата се изразява с числа от 1 до 4.

Степен 1: Фагоцитиран с I-4 бактерии
Степен 2: фагоцитирани 5-7 бактерии
Степен 3: фагоцитирани 8-10 бактерии
Степен 4: Повече от 10 фагоцитирани бактерии на клетка

При определяне на нивото на фагоцитоза на живи микроби, клетъчната утайка и фракцията на супернатантата се проверяват отделно. Броят на живите микроби се определя чрез пресяване върху твърда хранителна среда на 0,1 ml от изследваните фракции. Инкубира се 24 (48) часа При изчисляване на бактерицидната активност се приема, че една образувана колония съответства на един жив микроб.

За насочено изследване на бактерицидната активност се изследва кръвта на пациенти и здрави донори с добавяне на антибиотичен разтвор (5000 IU пеницилин и стрептомицин / ml) и без него, като се извършва и бактериален контрол. Състав на пробата: 0,3 ml разтвор на Hank + 0,1 ml нормален серум, получен от кръв, взета от 5 донора + 0,5 ml левкоцитна суспензия (10 7 клетки / ml) + 0,1 ml микробна суспензия (10 6 микроби / ml). Добавя се разтвор на антибиотици по 0,02 ml на проба. Инкубирайте пробите при 37°C и определете броя на микробите след 20 минути, 1,5 часа и 3 часа. За да направите това, вземете 0,1 ml от всяка проба, разредете избраните аликвоти с разтвор на Hank 10, 100 и 1000 пъти и нанесете върху загрят агар. Понякога, особено ако са добавени антибиотици, се приготвят междинни разреждания за точно преброяване на микробите (например 0,2 ml от пробата се смесват с 5 ml разтвор на Hank, центрофугират се 5 минути при 450 g, утайката се разтваря в 1,9 ml PBS, приложен към агар). Ако искате да съкратите продължителността на бактериологичното изследване, можете да определите микробите вътре в клетката чрез флуоресценция, като използвате акридиново жълто оцветяване.

Фагоцитоза на хлебни дрожди: приготвя се суспензия от 10 9 клетки/ml в 0,15 М NaCl. Смесете 0,1 ml от суспензията с 0,1 ml плазма на пациента, инкубирайте 30 минути при 37 ° C, добавете 0,2 ml (10 6) PMNL, инкубирайте 30 минути. Аликвотни части се вземат на интервали от 5 до 30 минути. Преброяват се 100 PMN и се определя броят на уловените частици дрожди на клетка. Известна е следната модификация: 50 µl от тестовия серум се добавят към 50 µl серум от морско свинче (предварително се разрежда в съотношение 1 + 1 със среда на Eagle с глюкоза), 50-200 µl суспензия от левкоцити ( 107 клетки/ml) се добавят, обемът се регулира до 450 µl със среда Игла с глюкоза и се инкубира за 30 min при 37 °C. След това добавете 50 μl суспензия от дрожди (10 8 клетки/ml), разбъркайте, инкубирайте за 40 минути при 37 °C. Добавете 50 μl L-75 Se-метионин (обща активност 100 kBq), разбъркайте и инкубирайте за 1 час при 37 °C. Клетките се утаяват чрез центрофугиране за 5 минути при 1000 g, промиват се два пъти с PBS, радиоактивността се измерва на гама брояч. Процентът на фагоцитираните дрожди се изчислява по формулата:

Фагоцитоза с използване на разтвор на маслено червено в минерално масло: 0,2 ml суспензия от частици се смесват с 0,8 ml клетъчна суспензия, предварително загрята до 37°C. След 5 минути инкубация се добавят 6 ml 0,15 М разтвор на NaCl, охладен до 0°C, съдържащ 126 μg/l N-етилмалеимид (за спиране на улавянето на частици). Центрофугирайте за 10 минути при 250 g. Супернатантната фракция се изхвърля, утайката се ресуспендира в разтвор на NaCl и N-етилмалеимид (виж по-горе), клетките се промиват два пъти. Клетките се лизират с ултразвук, отделя се маслено червено. Добавете 1 ml диоксан. Центрофугира се за 15 минути при 500 g, измерва се оптичната плътност при дължина на вълната 525 nm спрямо чист диоксан. Степента на фагоцитоза (IF) се определя като количеството минерално масло (mg), абсорбирано на минута от 10 7 клетки. Можете да използвате следната формула за изчисляване:

Изследване на фагоцитозата в монослоя на макрофагите:

1. Фаза: 2 ml клетъчна суспензия (200 000 клетки/ml) се добавят към стерилни полистиренови епруветки. Инокулирайте за 5 часа при 37°C, след това промийте със среда на Eagle. 2 ml културална среда с 10% инактивиран (30 минути, 56 °C) серум от говежди ембриони се добавя към тестови епруветки, инкубирани при 37 °C.

2. Фаза А: въвежда се суспензия от микроби (3-10/макрофаг), инкубира се 30-60 минути при 37 °C, епруветките се изплакват 6 пъти с порции от 3 ml от средата за отстраняване на нефагоцитираните микроби. Фиксирайте незабавно със смес от 1 част ледена оцетна киселина и 3 части метанол. Оцветете препарата по May - Grinwald, пребройте клетките.

Фаза B: определяне на вътреклетъчни живи бактерии. Последователността на операциите е същата като във фаза А преди етапа на фиксиране. След измиване внимателно отстранете всички следи от средата. Клетките се лизират, за което се добавят 2 ml 0,01% стерилен разтвор на говежди серумен албумин (4°C), като се разклаща многократно. Повечето от клетките се лизират след 20 минути. Освободените бактерии се определят чрез пресяване върху плътни хранителни среди.

Фагоцитоза на еритроцити: смесете 4x107 фагоцити с 5x107 тестови еритроцити в 5 ml PBS. Прехвърлете 2 ml от сместа в 5 mM фосфатен буфер, охладен до 0°C и центрофугирайте. Измерете оптичната плътност на супернатантната фракция при дължина на вълната 420 nm. Степента на фагоцитоза се определя от намаляването на съдържанието на хемоглобин в безклетъчната фаза, като се използват калибровъчни криви.

Опростен метод за определяне на клирънс

Пример за определяне на клирънса при плъхове: животни се инжектират интраперитонеално при 5x107 микроби на 100 g тегло (0,1 ml/100 g). Оптималната доза може да варира от 10 6 до 10 8 на 100 g тегло. С интервал от 1-2 часа се колят по 3 индивида от всяка група опитни животни; обща продължителност на експеримента 16 часа. Вземете стерилно 0,5 ml кръв от сърцето, 1 ml перитонеална течност, секретирайте белите дробове, черния дроб, далака и бъбреците. Цилиндрите се изрязват от тъканта на органа с пипета на Пастьор. Определяне на броя на микроорганизмите чрез култивиране върху течни и твърди хранителни среди.

Пример за определяне на клирънс при мишки: използват се колоиден въглен или маркирани с 51 [Cr] еритроцити на овен. Мишките (най-малко 5 индивида на опит) се инжектират интравенозно с 0,01 ml суспензия от въглища в размер на 16 mg на 100 g тегло. В рамките на 15 минути с интервал от 2 минути се вземат 0,025 ml кръв от ретроорбиталното пространство. Избраните 0,025 ml кръв се добавят към 2,0 ml 0,1% разтвор на Na 2 C0 3. След хемолиза концентрацията на въглища се определя колориметрично при дължина на вълната 675 nm, като се използват калибровъчни криви.

t е времето в минути, C е концентрацията на въглерод в пробата.

Коригирана стойност на фагоцитозата:

Функционален скрининг на фагоцити

Определяне на дегранулация (измерване на активността (β-глюкуропидаза): 107 левкоцити се суспендират в 0,8 ml PBS в пластмасови епруветки, разклащат се в продължение на 5 минути при 37 °C. Добавят се 0,2 ml сенсибилизиран LPS, флуорохромни частици (FC 80), охлаждат се 30°С минути върху лед, центрофугирайте за 10 минути при 250 g Проверете активността на ензима във фракцията на супернатанта Инкубирайте 0,9 ml от субстратната смес за 18 часа с 0,1 ml от изследваната фракция Добавете 2 ml 0,1 М NaOH, измерете оптичната плътност на вълна 410 nm.

Плащане:

(OD 410 x20)/(1,84x18) = брой nmol вещество, освободено за 1 час от 107 левкоцити, т.е. степента на дегранулация се изразява в наномоли паранитрофенил-β-глюкуронид.

Метод за определяне на дефекти в миелопероксидазата: най-добри резултати се получават чрез биохимично определяне на H 2 0 2, което показва промени в метаболизма по време на фагоцитоза. За практически цели е много важно активирането на хексозо-монофосфатния шънт, редукцията на тетразолиев нитроен и свързването на екзогенен йод към PMNL протеини да корелира с образуването на H 2 0 2 . Обикновена кръвна натривка се фиксира за 30 секунди със смес от алкохол и формалин. Промива се с дестилирана вода и се оцветява за пероксидаза за 30 секунди. В клетките, съдържащи пероксидаза, се откриват включвания, оцветени в тъмно синьо.

Тест за редукция на тетразолиево нитро синьо (TNS). THC се редуцира от нормален PMNL до формазан. Смесете с 0,1 ml кръв 0,1 ml 0,1% разтвор на THC в 0,15 M NaCl, инкубирайте 20 минути при 37 ° C, разбъркайте отново добре. Инкорпорирането на формазан в клетките се определя чрез микроскопия. Резултатът се изразява като процент на формазан-положителни клетки.

Следният метод е малко по-сложен: 1 капка от кръвта на пациента се нанася върху покривно стъкло. Инкубирайте за 20 минути при 37°C във влажна камера, след това внимателно измийте стъклото със стерилен 0,15 М NaCl. Поставете покривно стъкло върху предметно стъкло, съдържащо 1 капка THC среда (0,5 ml серум + 0,3 ml стерилен 0,15 М NaCl + 0,6 ml THC, вижте по-горе). Инкубирайте за 30 минути във влажна камера при 37°C, отстранете покривното стъкло и изсушете на въздух. Фиксирайте с абсолютен метанол за 60 секунди и измийте с дестилирана вода. Оцветете за 5 минути със сафранин (1 g сафранин + 100 ml дестилирана вода + 40 ml глицерин), измийте. Формазан-позитивните клетки са големи, подобни на бласт и съдържат сини гранули. Обикновено в препарата се откриват около 30% от формазан-позитивните клетки.

Горните методи за оценка на фагоцитозата са обобщение на много голям брой публикации. По-подробна информация по тези въпроси можете да намерите в съответните трудове.

Фагоцитоза (от гръцки phago - поглъщам и cytos - клетка) е процес на усвояване и смилане на антигенни вещества, включително микроорганизми, от клетки от мезодермален произход, т.нар. фагоцити. И. И. Мечников разделя фагоцитите на макрофаги и микрофаги. В момента макро- и микрофагите са обединени в единна система от макрофаги (SMF). Тази система включва:

• тъканни макрофаги - епителни клетки,
• звездовидни ретикулоендотелиоцити (клетки на Купфер),
• алвеоларни и перитонеални макрофаги, разположени в алвеолите и перитонеалната кухина,
• бели процесни епидермоцити на кожата (Лангерхансови клетки) и др.

Микрофагите включват:

• неутрофили,
• еозинофили,
• базофили.

Функции на макрофагитеизключително разнообразен. Те са първите, които реагират на чуждо вещество, като са специализирани клетки, които абсорбират и унищожават чужди вещества в тялото (умиращи клетки, ракови клетки, бактерии, вируси и други микроорганизми, антигени, неметаболизиращи се неорганични вещества). В допълнение, макрофагите произвеждат много биологично активни вещества - ензими (включително лизозим, пероксидаза, естераза), протеини на комплемента, имуномодулатори като интерлевкини. Наличието на повърхността на макрофагите на рецептори за имуноглобулини (Am) и комплемент, както и система от медиатори, осигурява тяхното взаимодействие с Т- и В-лимфоцитите. В същото време макрофагите активират защитните функции на Т-лимфоцитите. Поради наличието на рецептори за комплемент и Am, както и системата за хистосъвместимост Ag (HLA), макрофагите участват в свързването и разпознаването на антигените. Следователно фагоцитите имат три функции:

• защитно, свързано с прочистване на тялото от инфекциозни агенти, продукти от разпадане на тъканите и др .;
• представляваща, състояща се в представянето на антигенни епитоли на лимфоцитите върху фагоцитната мембрана;
• секреторни, свързани със секрецията на лизозомни ензими и други биологично активни вещества - цитокини, които играят важна роля в имуногенезата.

Има следните последователни течения етапи на фагоцитоза.

• Хемотаксис– целенасочено движение на фагоцитите по посока на химичния градиент на хемоатрактантите в околната среда. Способността за хемотаксис се свързва с наличието върху мембраната на специфични рецептори за хемоатрактанти (обекти на фагоцитоза), които могат да бъдат бактерии, продукти на разграждане на телесни тъкани и др.
• Адхезия(прикрепване) също се медиира от съответните рецептори, но може да протича в съответствие със законите на неспецифичното физико-химично взаимодействие. Частиците се адсорбират на повърхността на макрофага.
• Ендоцитоза(улавяне) - възниква инвагинация на клетъчната мембрана, улавяне на чужда частица и нейното потапяне в протоплазмата. В резултат на ендоцитозата се образува фагоцитна вакуола - фагозома(т.е. балон в протоплазмата около абсорбираната частица).
• вътреклетъчно храносмилане- започва с абсорбция на фагоцитирани обекти. Фагозомата се слива с лизозомата на фагоцита, която съдържа десетки ензими, и възниква образуването на фаголизозома (разрушаване) на уловената частица от ензими. Когато частица, принадлежаща на самия организъм, се абсорбира (например мъртва клетка или нейни части, собствени протеини), тя се разделя от фаголизозомни ензими на неантигенни вещества (аминокиселини, мастни киселини, нуклеотиди, монозахари). Ако се абсорбира чужда частица, тогава ензимите на фаголизозомата не са в състояние да разградят веществото до неантигенни компоненти. В такива случаи фаголизозомата с останалата част от антигена, която е запазила своята чуждост, се предава от макрофага на Т- и В-лимфоцитите, т.е. включва се специфична връзка на имунитета.

секреторна функцияе отделянето от фагоцитите на биологично активни вещества - цитокини - това са интерлевкин-1 и интерлевкин-2, които са клетъчни медиатори, оказващи регулаторен ефект върху пролиферацията, диференциацията и функцията на фагоцитите, лимфоцитите, лимфобластите и други клетки. Макрофагите произвеждат и секретират такива важни регулаторни фактори като простагландини, левкотриени, циклични нуклеотиди с широк спектър на биологична активност. В допълнение, макрофагите синтезират и секретират редица продукти с антибактериална, антивирусна и цитотоксична активност (кислородни радикали O2-H2O2, лизозим, интерферон и др.).

Фагоцитозата се засилва от опсонинови антитела, тъй като свързаният или антигенът се адсорбира по-лесно на повърхността на фагоцита, поради наличието на рецептори за тези антитела в последния. Това усилване на фагоцитозата от антитела се нарича опсонизация, т.е. подготовка на микроорганизми за улавяне от фагоцити. Фагоцитозата на опсонизирани антигени се нарича имунна.

За да се характеризира активността на въведената фагоцитоза фагоцитен индекс.За да се определи, броят на бактериите, абсорбирани от един фагоцит, се преброява под микроскоп. Също така се наслаждавайте опсонофагоцитен индекспредставляващ съотношението на фагоцитните параметри, получени с имунен и неимунен серум. Фагоцитният индекс и опсонофагоцитният индекс се използват в клиничната имунология за оценка на състоянието на имунитета и имунния статус.

Фагоцитозата играе важна роля в антибактериалната, противогъбичната и антивирусната защита, поддържайки устойчивостта на организма към чужди вещества. Фагоцитите също имат активиращ и супресивен ефект върху лимфоцитите, участват във възстановяването на имунологичния толеранс, антиинфекциозен, трансплантационен и противотуморен имунитет и някои форми на алергия (ХЗТ).