Обща характеристика на цитокините. Цитокините са най-многобройната, най-важната и функционално универсална група хуморални фактори на имунната система, еднакво важни за осъществяването на вроден и адаптивен имунитет. Цитокините участват в много процеси; те не могат да бъдат наречени фактори, свързани изключително с имунната система, тъй като играят важна роля в хемопоезата, тъканната хомеостаза и междусистемното сигнализиране.

Цитокините могат да бъдат дефинирани като протеинови или полипептидни фактори без антигенна специфичност, продуцирани предимно от активирани клетки на хематопоетичната и имунната системи и медииращи междуклетъчните взаимодействия в хематопоезата, възпалението, имунните процеси и междусистемните комуникации.

Цитокините се различават по структура, биологична активност и други свойства. Въпреки това, заедно с различията, цитокините имат общи свойства, характерни за този клас биорегулаторни молекули:

• · Цитокините са, като правило, гликозилирани полипептиди със средно молекулно тегло (по-малко от 30 kD).
• Цитокините се произвеждат от клетки на имунната система и други клетки (например ендотелиум, фибробласти и др.) в отговор на активиращ стимул (свързани с патогени молекулярни структури, антигени, цитокини и др.) и участват във вродения и адаптивен имунитет реакции, като регулира тяхната сила и продължителност . Някои цитокини се синтезират конститутивно.
• · Секрецията на цитокини е кратък процес. Цитокините не се съхраняват като предварително формирани молекули и техният синтез винаги започва с генна транскрипция. Клетките произвеждат цитокини в ниски концентрации (пикограми на милилитър).
• В повечето случаи цитокините се произвеждат и действат върху таргетните клетки, които са в непосредствена близост (действие на къси разстояния). Основното място на действие на цитокините е междуклетъчният синапс.
• · Излишъкът на цитокиновата система се проявява във факта, че всеки тип клетка е в състояние да произвежда няколко цитокина и всеки цитокин може да се секретира от различни клетки.
• Всички цитокини се характеризират с плейотропия или полифункционалност на действие. По този начин, проявата на признаци на възпаление се дължи на влиянието на IL-1, TNFb, IL-6, IL-8. Дублирането на функции осигурява надеждността на цитокиновата система.
• · Действието на цитокините върху прицелните клетки се медиира от силно специфични мембранни рецептори с висок афинитет, които са трансмембранни гликопротеини, обикновено състоящи се от повече от една субединица. Извънклетъчната част на рецепторите е отговорна за свързването на цитокини. Има рецептори, които елиминират излишните цитокини в патологичния фокус. Това са така наречените рецептори за примамка. Разтворимите рецептори са извънклетъчният домен на мембранен рецептор, отделен от ензим. Разтворимите рецептори са в състояние да неутрализират цитокините, да участват в транспортирането им до фокуса на възпалението и в екскрецията от тялото.
• · Цитокините работят на принципа на мрежата. Те могат да действат съвместно. Много от функциите, първоначално приписвани на един цитокин, изглежда се дължат на съгласуваното действие на няколко цитокини (синергизъм на действие). Примери за синергично взаимодействие на цитокините са стимулирането на възпалителни реакции (IL-1, IL-6 и TNFa), както и синтеза на IgE (IL-4, IL-5 и IL-13).

Класификация на цитокините. Има няколко класификации на цитокини, базирани на различни принципи. Традиционната класификация отразява историята на изследването на цитокините. Идеята, че цитокините играят ролята на фактори, медииращи функционалната активност на клетките на имунната система, възниква след откриването на хетерогенността на лимфоцитната популация и разбирането на факта, че само някои от тях - В-лимфоцитите - са отговорни за образуване на антитела. Опитвайки се да разберат дали хуморалните продукти на Т-клетките играят роля в изпълнението на техните функции, те започнаха да изучават биологичната активност на факторите, съдържащи се в културалната среда на Т-лимфоцитите (особено активираните). Разрешаването на този проблем, както и въпросът, който скоро възникна за хуморалните продукти на моноцитите/макрофагите, доведе до откриването на цитокините. Първоначално те са били наричани лимфокини и монокини в зависимост от това кои клетки ги произвеждат - Т-лимфоцити или моноцити. Скоро стана ясно, че е невъзможно да се направи ясна разлика между лимфокини и монокини и беше въведен общият термин "цитокини". През 1979 г. на симпозиум по лимфокини в Интерлакен (Швейцария) бяха установени правилата за идентифициране на факторите от тази група, които получиха името на групата „интерлевкини“ (IL). По същото време първите два члена на тази група молекули, IL-1 и IL-2, получават имената си. Оттогава всички нови цитокини (с изключение на хемокините - вижте по-долу) са получили обозначението IL и сериен номер.

Традиционно, в съответствие с биологичните ефекти, е обичайно да се разграничават следните групи цитокини:

• · Интерлевкини (IL-1-IL-33) - секреторни регулаторни протеини на имунната система, осигуряващи медиаторни взаимодействия в имунната система и връзката й с други системи на тялото. Интерлевкините се разделят според тяхната функционална активност на про- и противовъзпалителни цитокини, растежни фактори на лимфоцитите, регулаторни цитокини и др.
• Интерферони (IFN) - цитокини, участващи в антивирусната защита, с изразен имунорегулиращ ефект (IFN тип 1 - IFN b, c, d, k, ?, f; групи IFN-подобни цитокини - IL-28A, IL-28B и IL -29 IFN тип 2 - IFNg).
• · Тумор некротизиращи фактори (TNF) - цитокини с цитотоксично и регулаторно действие: TNF-a и лимфотоксини (LT).
• Фактори на растеж на хематопоетични клетки - растежен фактор на стволови клетки (Kit-лиганд), IL-3, IL-7, IL-11, еритропоетин, тробопоетин, гранулоцитно-макрофагов колониестимулиращ фактор - GM-CSF, гранулоцитен CSF - G-CSF, макрофаг KSF - M-CSF).
• · Хемокини - С, СС, СХС (IL-8), СХ3С - регулатори на хемотаксиса на различни видове клетки.
• Нелимфоидни клетъчни растежни фактори - регулатори на растежа, диференциацията и функционалната активност на клетки от различни тъканни принадлежности (фибробластен растежен фактор - FGF, ендотелен клетъчен растежен фактор, епидермален растежен фактор - епидермален EGF) и трансформиращи растежни фактори (TGFv, TGFb).

Понятието "цитокини" е доста трудно да се разграничи от понятието "растежни фактори". По-точното разбиране на понятието "интерлевкин" (всъщност съвпадащо с понятието "цитокин") беше улеснено от въвеждането от Комитета по номенклатурата на Международния съюз на имунологичните дружества през 1992 г. на критерии, управляващи определянето на нови интерлевкини на следващ номер: това изисква молекулярно клониране, секвениране и експресия на интерлевкин гена, удостоверяващ уникалността на неговата нуклеотидна последователност, както и производството на неутрализиращи моноклонални антитела. За да се установят разликите между интерлевкини и подобни фактори, са важни данните за производството на тази молекула от клетки на имунната система (левкоцити) и доказателства за нейната роля в регулирането на имунните процеси. Така се подчертава задължителното участие на интерлевкините във функционирането на имунната система. Ако приемем, че всички цитокини, открити след 1979 г. (с изключение на хемокините), се наричат ​​интерлевкини и следователно тези понятия всъщност са идентични, тогава можем да приемем, че такива растежни фактори като епидермален, фибробластен, тромбоцитен не са цитокини, а от трансформиращи растежни фактори ( TGF) въз основа на функционално участие в имунната система, само TGF може да бъде класифициран като цитокин. Този въпрос обаче не е строго регламентиран в международни научни документи.

Няма ясна структурна класификация на цитокините. Въпреки това, според характеристиките на тяхната вторична структура, се разграничават няколко групи:

• · Молекули с преобладаване на b-спирални вериги. Те съдържат 4 6-спирални домена (2 двойки 6-спирали, разположени под ъгъл една спрямо друга). Има къси и дълги (според дължината на b-спиралите) варианти. Първата група включва повечето хематопоетинови цитокини -- IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-9, IL-13, IL-21, IL-27, IFNr и M-CSF ; към втория - IL-6, IL-10, IL-11 и GM-CSF.
• · Молекули с преобладаване на β-листови структури. Те включват цитокини от фамилията тумор некротизиращ фактор и лимфотоксини („v-трилистник“), фамилията IL-1 (v-сандвич), фамилията TGF (цитокинен възел).
• · Къса b / b-верига (b-слой със съседни b-спирали) - хемокини.
• Смесени мозаечни структури, напр. IL-12.

През последните години, във връзка с идентифицирането на голям брой нови цитокини, понякога свързани с описаните по-горе, и образуващи отделни групи с тях, класификацията, основана на принадлежността на цитокините към структурни и функционални семейства, стана широко използвана.

Друга класификация на цитокините се основава на структурните характеристики на техните рецептори. Както знаете, чрез рецепторите и действието на цитокините се осъществява. Според структурните характеристики на полипептидните вериги се разграничават няколко групи цитокинови рецептори. Дадената класификация се прилага специално за полипептидни вериги. Един рецептор може да включва вериги, принадлежащи към различни семейства. Важността на тази класификация се дължи на факта, че различните видове рецепторни полипептидни вериги се характеризират с определен сигнален апарат, състоящ се от тирозин кинази, адапторни протеини и транскрипционни фактори.

Най-многобройният тип са цитокиновите хемопоетинови рецептори. Техните извънклетъчни домени се характеризират с наличието на 4 цистеинови остатъка и наличието на последователност, съдържаща триптофанови и серинови остатъци - WSXWS. Домените на семейството на фибронектин, съдържащи 4 цистеинови остатъка, образуват гръбнака на интерфероновите рецептори. Характерна особеност на домейните, които образуват извънклетъчната част на фамилията TNFR рецептори, е тяхното високо съдържание на цистеинови остатъци ("богати на цистеин домейни"). Тези домени съдържат 6 цистеинови остатъка. Групата рецептори, чиито екстрацелуларни домени принадлежат към суперсемейството на имуноглобулините, включва две групи - рецептори за IL-1 и няколко рецептори, чиято цитоплазмена част има тирозинкиназна активност. Тирозин киназната активност е характерна за цитоплазмената част на почти всички растежни фактори (EGF, PDGF, FGF и др.). И накрая, специална група се формира от родопсиноподобни хемокинови рецептори, проникващи през мембраната 7 пъти. Въпреки това, не всички рецепторни полипептидни вериги отговарят на тази класификация. По този начин нито b-, нито b-веригите на IL-2 рецептора принадлежат към семействата, показани в Таблица 3 (b-веригата съдържа контролни домейни на комплемента). Основните групи също не включват IL-12 рецептори, общата β-верига на IL-3 рецептори, IL-5, GMCSF и някои други рецепторни полипептидни вериги.

Почти всички цитокинови рецептори (с изключение на имуноглобулиноподобните с киназна активност) се състоят от няколко полипептидни вериги. Често различните рецептори съдържат общи вериги. Най-яркият пример е r-веригата, обща за IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21 рецептори, означена като r(s). Дефектите в тази верига играят важна роля в развитието на имунодефицитна патология. Общата β-верига е част от GM-CSF, IL-3 и IL-5 рецепторите. Общите вериги имат IL-7 и TSLP (b-верига), както и IL-2 и IL-15, IL-4 и IL-13 (и двата в b-веригата).

По правило рецепторите присъстват на повърхността на клетките в покой в ​​малко количество и често в непълен състав на субединици. Обикновено в това състояние рецепторите осигуряват адекватен отговор само когато са изложени на много високи дози цитокини. Когато клетките се активират, броят на мембранните цитокинови рецептори се увеличава с порядъци; освен това тези рецептори са „недостатъчни“ с полипептидни вериги, както беше показано по-горе с примера на рецептора за IL-2. Под влияние на активирането броят на молекулите на този рецептор се увеличава значително и в техния състав се появява b-верига, чийто ген се експресира по време на активирането. Поради тези промени лимфоцитът придобива способността да пролиферира в отговор на действието на IL-2.

Механизми на действие на цитокините

Вътреклетъчна сигнална трансдукция под действието на цитокини. С-терминалната цитоплазмена част на някои цитокинови рецептори (принадлежащи към суперсемейството на имуноглобулините) включва домен с тирозин киназна активност. Всички тези кинази принадлежат към категорията на протоонкогените; когато генетичната среда се промени, те се превръщат в онкогени, осигурявайки неконтролирана клетъчна пролиферация. Тези кинази имат собствено име. Така киназата, която е част от M-CSF рецептора, се означава като c-Fms; киназа SCF --c-Kit; известна хематопоетична фактор киназа - Flt-3 (Fms-like thyrosine kinase 3). Рецепторите със собствена киназна активност задействат сигнална трансдукция директно, тъй като тяхната киназа предизвиква фосфорилиране както на самия рецептор, така и на молекули, съседни на него.

Най-типичната проява на активност е характерна за рецепторите от хематопоетичен (цитокинен) тип, съдържащи 4 6-спирални домена. Молекулите на тирозин киназите от Jak-киназната група (семейство кинази, свързани с Janus) са прикрепени към цитоплазмената част на тези рецептори. В цитоплазмената част на рецепторните вериги има специални места за свързване на тези кинази (проксимални и дистални кутии). Известни са общо 5 Janus кинази - Jak1, Jak2, Jak3, Tyk1 и Tyk2. В различни комбинации те си сътрудничат с различни цитокинови рецептори, като имат афинитет към специфични полипептидни вериги. Така Jak3 киназата взаимодейства с r(c) веригата; с дефекти в гена, кодиращ тази киназа, се развива комплекс от нарушения в имунната система, подобни на тези, наблюдавани при дефекти в гена на рецепторната полипептидна верига.

Когато цитокинът взаимодейства с рецептора, се генерира сигнал, който води до образуване на транскрипционни фактори и активиране на гени, които определят реакцията на клетката към действието на цитокина. Едновременно с това клетката поема комплекса на цитокина с рецептора и го разцепва в ендозоми. Сама по себе си интернализацията на този комплекс няма нищо общо с предаването на сигнал. Той е необходим за оползотворяването на цитокина, което предотвратява натрупването му на мястото на активиране на клетките продуценти. Афинитетът на рецептора към цитокина играе важна роля в регулацията на тези процеси. Само при достатъчно висока степен на афинитет (от порядъка на 10-10 M) се генерира сигнал и комплексът цитокин-рецептор се абсорбира.

Индукцията на сигнала започва с автокаталитично фосфорилиране на свързани с рецептора Jak кинази, задействано от конформационни промени в рецептора, които възникват в резултат на неговото взаимодействие с цитокин. Активираните Jak кинази фосфорилират STAT (преобразуватели на сигнали и активатори на транскрипция) цитоплазмени фактори, присъстващи в цитоплазмата в неактивна мономерна форма.

Фосфорилираните мономери придобиват афинитет един към друг и се димеризират. STAT димерите мигрират към ядрото и действат като транскрипционни фактори чрез свързване към промоторните области на целевите гени. Под действието на провъзпалителните цитокини се активират гените на адхезионните молекули, самите цитокини, ензимите на окислителния метаболизъм и др.. Под действието на фактори, които причиняват клетъчна пролиферация, индукцията на гени, отговорни за преминаването на клетката цикъл и т.н.

Jak/STAT-медиираният цитокинов сигнален път е основният, но не и единственият. Рецепторът е свързан не само с Jak кинази, но и с кинази от семейството Src, както и PI3K. Тяхното активиране задейства допълнителни сигнални пътища, водещи до активиране на AP-1 и други транскрипционни фактори. Активираните транскрипционни фактори участват не само в сигналната трансдукция от цитокини, но и в други сигнални пътища.

Има сигнални пътища, включени в контрола на биологичните ефекти на цитокините. Такива пътища са свързани с факторите от групата SOCS (Suppressors of cytokine signaling), която съдържа фактора SIC и 7 фактора SOCS (SOCS-1 -- SOCS-7). Активирането на тези фактори става при активиране на цитокиновите сигнални пътища, което води до образуването на отрицателна обратна връзка. SOCS факторите съдържат SH2 домейн, участващ в изпълнението на един от следните процеси:

• директно инхибиране на Jak кинази чрез свързване с тях и индуциране на тяхното дефосфорилиране;
• конкуренция със STAT фактори за свързване с цитоплазмената част на цитокиновите рецептори;
• Ускоряване на разграждането на сигналните протеини по пътя на убиквитин.

Изключването на SOCS гените води до дисбаланс на цитокините с преобладаване на синтеза на IFNg и съпътстваща лимфопения и повишена апоптоза.

Характеристики на функционирането на цитокиновата система. цитокинова мрежа.

От горното следва, че при клетъчно активиране от чужди агенти (носители на PAMP при активиране на миелоидни клетки и антигени при активиране на лимфоцити), се индуцира (или повишава до функционално значимо ниво) както синтезата на цитокини, така и експресията на техните рецептори. . Това създава условия за локално проявление на ефектите на цитокините. Наистина, ако един и същ фактор активира както клетките, произвеждащи цитокини, така и клетките-мишени, се създават оптимални условия за локално проявление на функциите на тези фактори.

Обикновено цитокините се свързват, интернализират и разцепват от клетката-мишена, с малко или никаква дифузия от секретираните продуцентски клетки. Доста често цитокините са трансмембранни молекули (например IL-1b и TNFb) или се представят на таргетните клетки в състояние, свързано с пептидогликани на извънклетъчния матрикс (IL-7 и редица други цитокини), което също допринася за локален характер на тяхното действие.

Обикновено, ако цитокините се съдържат в кръвния серум, тогава в концентрации, недостатъчни за проявата на техните биологични ефекти. След това, като използваме примера за възпаление, ще разгледаме ситуации, при които цитокините имат системен ефект. Тези случаи обаче винаги са проява на патология, понякога много сериозна. Очевидно локалният характер на действието на цитокините е от основно значение за нормалното функциониране на тялото. Това се доказва от високата скорост на тяхното отделяне през бъбреците. Обикновено кривата на екскреция на цитокини се състои от два компонента - бърз и бавен. T1 / 2 на бързия компонент за IL-1b е 1,9 минути, за IL-2 - 5 минути (T1 / 2 на бавния компонент е 30-120 минути). Свойството на късо действие отличава цитокините от хормоните - фактори на дълъг обхват (следователно твърдението "цитокините са хормони на имунната система" е фундаментално погрешно).

Цитокиновата система се характеризира с излишък. Това означава, че почти всяка функция, изпълнявана от даден цитокин, се дублира от други цитокини. Ето защо изключването на отделен цитокин, например поради мутация на неговия ген, не води до фатални последици за тялото. Наистина, мутацията на гена за определен цитокин почти никога не води до развитие на имунодефицит.

Например, IL-2 е известен като Т клетъчен растежен фактор; изкуственото отстраняване (чрез генетичен нокаут) на гена, който го кодира, не разкрива значително нарушение на Т-клетъчната пролиферация, но се записват промени, причинени от дефицит на регулаторни Т-клетки. Това се дължи на факта, че Т-клетъчната пролиферация в отсъствието на IL-2 се осигурява от IL-15, IL-7, IL-4, както и от комбинации от няколко цитокини (IL-1c, IL-6, IL- 12, TNFb). По същия начин, дефект в IL4 гена не води до значителни смущения в В-клетъчната система и смяна на изотипа на имуноглобулина, тъй като IL-13 проявява подобни ефекти. В същото време някои цитокини нямат функционални аналози. Най-известният пример за есенциален цитокин е IL-7, чието лимфопоетично действие, поне на определени етапи от Т-лимфопоезата, е уникално и следователно дефекти в гените на самия IL-7 или неговия рецептор водят до развитието на тежък комбиниран имунен дефицит (SCID).

В допълнение към излишъка, в цитокиновата система се проявява друга закономерност: цитокините са плейотропни (действат върху различни цели) и полифункционални (предизвикват различни ефекти). По този начин броят на прицелните клетки за IL-1c и TNFb е труден за преброяване. Също толкова разнообразни са ефектите, които причиняват, които участват във формирането на сложни реакции: възпаление, някои етапи на хемопоезата, невротропни и други реакции.

Друга важна характеристика, присъща на цитокиновата система, е връзката и взаимодействието на цитокините. От една страна, това взаимодействие се състои в това, че някои цитокини, действащи на фона на индуктори или независимо, предизвикват или засилват (по-рядко потискат) производството на други цитокини. Най-ярките примери за усилващо действие са активността на провъзпалителните цитокини IL-1b и TNFb, които засилват собственото си производство и образуването на други провъзпалителни цитокини (IL-6, IL-8, други хемокини). IL-12 и IL-18 са индуктори на IFNg. TGFβ и IL-10, напротив, потискат производството на различни цитокини. IL-6 проявява инхибиторна активност срещу провъзпалителни цитокини, докато IFNg и IL-4 взаимно инхибират производството един на друг и цитокини от съответните (Th1 и Th2) групи. Взаимодействието между цитокините се проявява и на функционално ниво: някои цитокини усилват или потискат действието на други цитокини. Описан е синергизъм (напр. в рамките на група провъзпалителни цитокини) и антагонизъм на цитокини (напр. между Th1 и Th2 цитокини).

Обобщавайки получените данни, можем да заключим, че нито един от цитокините не съществува и не проявява своята активност изолирано - на всички нива цитокините се влияят от други членове на този клас молекули. Резултатът от такова разнообразно взаимодействие понякога може да бъде неочакван. По този начин, когато високи дози IL-2 се използват за терапевтични цели, възникват животозастрашаващи странични ефекти, някои от които (например шок, подобен на токсичен, без бактериемия) могат да бъдат отстранени от антитела, насочени не срещу IL-2, а срещу TNFb.

Наличието на множество кръстосани взаимодействия в цитокиновата система беше причината за създаването на понятието "цитокинова мрежа", което доста ясно отразява същността на явлението.

Цитокиновата мрежа се характеризира със следните свойства:

• индуцируемост на синтеза на цитокини и експресия на техните рецептори;
• локалност на действие поради координираната експресия на цитокини и техните рецептори под въздействието на един и същ индуктор;
• излишък поради припокриващи се спектри на действие на различни цитокини;
• · взаимовръзки и взаимодействия, проявяващи се на ниво синтез и осъществяване на цитокиновите функции.

Цитокинова регулация на функциите на целевите клетки се осъществява чрез автокринни, паракринни или ендокринни механизми. Някои цитокини (IL-1, IL-6, TNFb и др.) Могат да участват в осъществяването на всички горепосочени механизми.

Отговорът на клетката към влиянието на цитокин зависи от няколко фактора:

• върху вида на клетките и тяхната първоначална функционална активност;
• от локалната концентрация на цитокина;
• от наличието на други медиаторни молекули.

По този начин продуцентските клетки, цитокините и техните специфични рецептори върху прицелните клетки образуват една единствена медиаторна мрежа. Това е набор от регулаторни пептиди, а не отделни цитокини, които определят крайния отговор на клетката. Понастоящем цитокиновата система се разглежда като универсална система за регулиране на нивото на целия организъм, която осигурява развитието на защитни реакции (например по време на инфекция).

През последните години се появи идея за цитокинова система, която комбинира:

• 1) продуцентски клетки;
• 2) разтворими цитокини и техните антагонисти;
• 3) клетки-мишени и техните рецептори.

Нарушенията на различни компоненти на цитокиновата система водят до развитие на множество патологични процеси, поради което откриването на дефекти в тази регулаторна система е важно за правилната диагноза и назначаването на адекватна терапия.

Основните компоненти на цитокиновата система.

Клетки, произвеждащи цитокини

I. Основната група клетки, произвеждащи цитокини в адаптивния имунен отговор, са лимфоцитите. Клетките в покой не секретират цитокини. При разпознаване на антигена и с участието на рецепторни взаимодействия (CD28-CD80/86 за Т-лимфоцитите и CD40-CD40L за В-лимфоцитите) настъпва клетъчно активиране, което води до транскрипция на цитокинови гени, транслация и секреция на гликозилирани пептиди в извънклетъчното пространство.

CD4 Т-хелперите са представени от субпопулации: Th0, Th1, Th2, Th17, Tfh, които се различават един от друг в спектъра на секретираните цитокини в отговор на различни антигени.

Th0 произвеждат широк спектър от цитокини при много ниски концентрации.

Посоката на Th0 диференциация определя развитието на две форми на имунен отговор с преобладаване на хуморални или клетъчни механизми.

Естеството на антигена, неговата концентрация, локализация в клетката, типът на антиген-представящите клетки и определен набор от цитокини регулират посоката на Th0 диференциация.

Дендритните клетки, след улавяне и обработка на антиген, представят антигенни пептиди на Th0 клетките и произвеждат цитокини, които регулират посоката на тяхната диференциация в ефекторни клетки. IL-12 индуцира синтеза на IFNg от Т-лимфоцитите и ]ChGK. IFNy осигурява диференциация на Th1, които започват да секретират цитокини (IL-2, IFNy, IL-3, TNFa, лимфотоксини), които регулират развитието на реакции към вътреклетъчни патогени (свръхчувствителност от забавен тип (DTH) и различни видове клетъчна цитотоксичност ).

IL-4 осигурява диференциацията на Th0 в Th2. Активираният Th2 продуцира цитокини (IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 и др.), които определят пролиферацията на В-лимфоцитите, тяхната по-нататъшна диференциация в плазмени клетки и развитието на антитела отговор, главно към извънклетъчните патогени.

IFNg регулира негативно функцията на Th2 клетките и, обратно, IL-4, IL-10, секретирани от Th2, инхибират функцията на Th1. Молекулярният механизъм на тази регулация е свързан с транскрипционни фактори. Експресията на T-bet и STAT4, определена от IFNy, насочва Т-клетъчната диференциация по Th1 пътя и потиска развитието на Th2. IL-4 индуцира експресията на GATA-3 и STAT6, което съответно осигурява превръщането на наивни Th0 в Th2 клетки.

През последните години е описана отделна субпопулация от Т хелперни клетки (Th17), произвеждащи IL-17. Членовете на семейството на IL-17 могат да бъдат експресирани от активирани клетки на паметта (CD4CD45RO), y5T клетки, NKT клетки, неутрофили, моноцити под влияние на IL-23, IL-6, TGFβ, произведени от макрофаги и дендритни клетки. Основният фактор на диференциация при хората е ROR-C, при мишките е ROR-gl. Показана е кардиналната роля на IL-17 в развитието на хронично възпаление и автоимунна патология.

В допълнение, Т-лимфоцитите в тимуса могат да се диференцират в естествени регулаторни клетки (Treg), експресиращи повърхностните маркери CD4+ CD25+ и транскрипционния фактор FOXP3. Тези клетки са способни да потискат имунния отговор, медииран от Th1 и Th2 клетки чрез директен междуклетъчен контакт и синтез на TGFβ и IL-10.

Т-цитотоксични клетки (CD8+), естествени убийци - слаби производители на цитокини, като интерферони, TNF-a и лимфотоксини.

Прекомерното активиране на една от Th субпопулациите може да определи развитието на един от вариантите на имунния отговор. Хроничният дисбаланс на активирането на Th може да доведе до образуване на имунопатологични състояния, свързани с прояви на алергии, автоимунна патология, хронични възпалителни процеси и др.

II. Във вродената имунна система основните производители на цитокини са миелоидните клетки. Използвайки Toll-подобни рецептори (TLR), те разпознават сходни молекулярни структури на различни патогени, така наречените патоген-асоциирани молекулярни модели (PAMPs), напр. CpG повторения и т.н. В резултат на това взаимодействие с TLR, вътреклетъчна сигнална трансдукция се стартира каскада, водеща до експресия на гени от две основни групи цитокини: провъзпалителни и IFN тип 1. Тези цитокини са главно (IL-1, -6, -8, -12, TNFa, GM-CSF, IFN , хемокини и др.) предизвикват развитието на възпаление и участват в защитата на организма от бактериални и вирусни инфекции.

III. Клетки, които не са част от имунната система (клетки на съединителната тъкан, епител, ендотел), конститутивно секретират автокринни растежни фактори (GGF, EGF, TGFr и др.). и цитокини, подпомагащи пролиферацията на хематопоетичните клетки.

Прекомерната експресия на цитокини не е безопасна за тялото и може да доведе до развитие на прекомерна възпалителна реакция, отговор на острата фаза. Различни инхибитори участват в регулирането на производството на провъзпалителни цитокини. По този начин са описани редица вещества, които неспецифично свързват цитокина IL-1 и предотвратяват проявата на неговото биологично действие (а2-макроглобулин, С3-компонент на комплемента, уромодулин). Специфични инхибитори на IL-1 могат да бъдат разтворими рецептори-примамки, антитела и IL-1 рецепторен антагонист (IL-1RA). С развитието на възпалението се наблюдава повишаване на експресията на гена IL-1RA. Но дори и нормално, този антагонист присъства в кръвта във висока концентрация (до 1 ng / ml или повече), блокирайки действието на ендогенния IL-1.

прицелни клетки

Действието на цитокините върху таргетните клетки се медиира чрез специфични рецептори, които свързват цитокини с много висок афинитет, а отделните цитокини могат да използват общи рецепторни субединици. Всеки цитокин се свързва със своя специфичен рецептор.

Цитокиновите рецептори са трансмембранни протеини и се разделят на 5 основни типа. Най-често срещаният е така нареченият хемопоетичен тип рецептори, които имат два извънклетъчни домена, единият от които съдържа обща последователност от аминокиселинни остатъци от два триптофанови и серинови повторения, разделени от която и да е аминокиселина (WSXWS мотив). Вторият тип рецептор може да има два извънклетъчни домена с голям брой запазени цистеини. Това са рецептори от семейството на IL-10 и IFN. Третият тип е представен от цитокинови рецептори, принадлежащи към групата на TNF. Четвъртият тип цитокинов рецептор принадлежи към суперсемейството на имуноглобулиновите рецептори, които имат извънклетъчни домени, подобни по структура на тези на имуноглобулиновите молекули. Петият тип рецептори, които свързват молекули от семейството на хемокините, са представени от трансмембранни протеини, които пресичат клетъчната мембрана на 7 места. Цитокиновите рецептори могат да съществуват в разтворима форма, запазвайки способността да свързват лиганди.

Цитокините са в състояние да повлияят на пролиферацията, диференциацията, функционалната активност и апоптозата на таргетните клетки. Проявата на биологичната активност на цитокините в прицелните клетки зависи от участието на различни вътреклетъчни системи в предаването на сигнала от рецептора, което е свързано с характеристиките на прицелните клетки. Сигналът за апоптоза се осъществява, наред с други неща, с помощта на специфичен регион от фамилията TNF рецептори, така нареченият домейн на „смъртта“. Диференциалните и активиращите сигнали се предават чрез вътреклетъчни Jak-STAT протеини, сигнални преобразуватели и активатори на транскрипция. G-протеините участват в сигналната трансдукция от хемокини, което води до повишена клетъчна миграция и адхезия.

Последният компонент, цитокини и техните антагонисти, са описани по-горе.

Въведение.

1. Обща характеристика и класификация на цитокините.

1.1.Механизми на действие.

1.2 Свойства на цитокините.

1.3 Ролята на цитокините в регулацията на физиологичните функции на организма.

2. Специални изследвания на цитокини.

2.1 Значението на цитокините в патогенезата на възпалителните заболявания на дебелото черво при деца.

2.2 Ролята на азотния оксид и цитокините в развитието на синдрома на остро белодробно увреждане.

3. Методи за определяне на цитокини

3.1 Определяне на биологичната активност на цитокините

3.2 Количествено определяне на цитокини с помощта на антитела

3.3 Определяне на цитокини чрез ензимен имуноанализ.

3.3.1 Тумор некрозисфактор-алфа.

3.3.2 Интерферон гама.

3.3.3 Интерлевкин-4

3.3.4 Интерлевкин-8

3.3.5 Интерлевкин-1 рецепторен антагонист.

3.3.6 Алфа-интерферон.

3.3.7 Антитела срещу алфа-IFN.

4. Имунотропни лекарства на базата на цитокини.

Списък на използваната литература.

Заключение.

Въведение.

Измина малко време от описанието на първите цитокини. Въпреки това, тяхното изследване доведе до разпределянето на обширна част от знанието - цитокинология, която е неразделна част от различни области на знанието и на първо място имунологията, която даде мощен тласък на изучаването на тези медиатори. Цитокинологията прониква във всички клинични дисциплини, вариращи от етиологията и патогенезата на заболяванията до профилактиката и лечението на различни патологични състояния. Следователно, изследователите и клиницистите трябва да се ориентират в разнообразието от регулаторни молекули и да имат ясно разбиране за ролята на всеки от цитокините в процесите, които се изследват. Всички клетки на имунната система имат определени функции и работят в добре координирано взаимодействие, което се осигурява от специални биологично активни вещества - цитокини - регулатори на имунните реакции. Цитокините се наричат ​​специфични протеини, с помощта на които различни клетки на имунната система могат да обменят информация помежду си и да координират действията си. Наборът и количествата цитокини, действащи върху рецепторите на клетъчната повърхност - "цитокинова среда" - представляват матрица от взаимодействащи и често променящи се сигнали. Тези сигнали са сложни поради голямото разнообразие от цитокинови рецептори и защото всеки цитокин може да активира или инхибира няколко процеса, включително собствения си синтез и синтеза на други цитокини, както и образуването и появата на цитокинови рецептори на клетъчната повърхност. Целта на нашата работа е да изследва цитакините, техните функции и свойства, както и възможното им приложение в медицината. Цитокините са малки протеини (молекулно тегло от 8 до 80 kDa), които действат автокринно (т.е. върху клетката, която ги произвежда) или паракринно (върху клетки, разположени наблизо). Образуването и освобождаването на тези силно активни молекули е преходно и строго регулирано.

Литературен преглед.

Обща характеристика и класификация на цитокините.

Цитокините са група полипептидни медиатори на междуклетъчните взаимодействия, които участват главно във формирането и регулирането на защитните реакции на организма при въвеждане на патогени и нарушаване на целостта на тъканите, както и в регулирането на редица нормални физиологични функции. Цитокините могат да бъдат изолирани в нова независима регулаторна система, която съществува заедно с нервната и ендокринната система за поддържане на хомеостазата, като и трите системи са тясно взаимосвързани и взаимозависими. През последните две десетилетия гените на повечето цитокини са клонирани и са получени рекомбинантни аналози, които напълно повтарят биологичните свойства на естествените молекули. Сега са известни повече от 200 отделни вещества, принадлежащи към семейството на цитокините. Историята на изследването на цитокините започва през 40-те години на миналия век. Тогава бяха описани първите ефекти на кахектина - фактор, присъстващ в кръвния серум и способен да причини кахексия или загуба на тегло. Впоследствие този медиатор е изолиран и е доказано, че е идентичен на тумор некротизиращия фактор (TNF). По това време изследването на цитокините се основава на принципа на откриване на всеки един биологичен ефект, който служи като отправна точка за името на съответния медиатор. Така че през 50-те години те наричат ​​интерферон (IFN) поради способността му да пречи или да повишава резистентността по време на повтаряща се вирусна инфекция. Интерлевкин-1 (IL-1) също първоначално се нарича ендогенен пироген, за разлика от бактериалните липополизахариди, които се считат за екзогенни пирогени. Следващият етап в изследването на цитокините, датиращ от 60-70 години, е свързан с пречистването на природните молекули и цялостното характеризиране на тяхното биологично действие. По това време е открит Т-клетъчният растежен фактор, сега известен като IL-2, и редица други молекули, които стимулират растежа и функционалната активност на Т-, В-лимфоцитите и други видове левкоцити. През 1979 г. е предложен терминът "интерлевкини", за да ги обозначи и систематизира, т.е. медиатори, които комуникират между левкоцитите. Скоро обаче стана ясно, че биологичните ефекти на цитокините се простират далеч отвъд имунната система и следователно предложеният по-рано термин „цитокини“, който оцеля и до днес, стана по-приемлив. Революционен обрат в изследването на цитокините настъпва в началото на 80-те години след клонирането на миши и човешки интерферонови гени и производството на рекомбинантни молекули, които напълно повтарят биологичните свойства на естествените цитокини. След това стана възможно да се клонират гени и други медиатори от това семейство. Важен крайъгълен камък в историята на цитокините е клиничната употреба на рекомбинантни интерферони и особено на рекомбинантен IL-2 за лечение на рак. 90-те години на миналия век бяха белязани от откриването на структурата на субединицата на цитокиновите рецептори и формирането на концепцията за "цитокинова мрежа", а началото на 21 век беше белязано от откриването на много нови цитокини чрез генетичен анализ. Цитокините включват интерферони, колонии-стимулиращи фактори (CSF), хемокини, трансформиращи растежни фактори; фактор на туморна некроза; интерлевкини с установени исторически серийни номера и някои други ендогенни медиатори. Интерлевкините със серийни номера, започващи от 1, не принадлежат към една подгрупа цитокини, свързани с обща функция. Те от своя страна могат да бъдат разделени на провъзпалителни цитокини, фактори на растежа и диференциацията на лимфоцитите и отделни регулаторни цитокини. Името "интерлевкин" се присвоява на новооткрит медиатор, ако са изпълнени следните критерии, разработени от номенклатурния комитет на Международния съюз на имунологичните дружества: молекулярно клониране и експресия на гена на изследвания фактор, наличието на уникален нуклеотид и аминокиселинна последователност, съответстваща на него, получаване на неутрализиращи моноклонални антитела. В допълнение, новата молекула трябва да се произвежда от клетки на имунната система (лимфоцити, моноцити или други видове левкоцити), да има важна биологична функция в регулацията на имунния отговор и допълнителни функции, поради които не може да бъде дадена функционално име. И накрая, изброените свойства на новия интерлевкин трябва да бъдат публикувани в рецензирана научна публикация. Класификацията на цитокините може да се извърши според техните биохимични и биологични свойства, както и според видовете рецептори, чрез които цитокините изпълняват своите биологични функции. Класификацията на цитокините по структура (Таблица 1) взема предвид не само аминокиселинната последователност, но преди всичко третичната структура на протеина, която по-точно отразява еволюционния произход на молекулите.

Таблица 1. Класификация на цитокините по структура.

Генното клониране и анализът на структурата на цитокиновите рецептори показа, че подобно на самите цитокини, тези молекули могат да бъдат разделени на няколко типа според сходството на аминокиселинните последователности и организацията на извънклетъчните домени (Таблица 2). Едно от най-големите семейства цитокинови рецептори се нарича семейство хемопоетин рецептори или семейство цитокинови рецептори тип I. Характеристика на структурата на тази група рецептори е наличието на 4 цистеина в молекулата и аминокиселинната последователност Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS), разположена на кратко разстояние от клетъчната мембрана. Цитокиновите рецептори от клас II взаимодействат с интерфероните и IL-10. И двата първи вида рецептори имат хомология помежду си. Следните групи рецептори осигуряват взаимодействие с цитокините от фамилията тумор некротизиращ фактор и фамилията IL-1. Понастоящем е известно, че повече от 20 различни хемокинови рецептора взаимодействат с различни степени на афинитет с един или повече лиганди от семейството на хемокините. Хемокиновите рецептори принадлежат към суперсемейството на родопсиновите рецептори, имат 7 трансмембранни домена и сигнализират чрез G-протеини.

Таблица 2. Класификация на цитокиновите рецептори.

Много цитокинови рецептори се състоят от 2-3 субединици, кодирани от различни гени и експресирани независимо. В този случай образуването на рецептор с висок афинитет изисква едновременното взаимодействие на всички субединици. Пример за такава организация на цитокиновите рецептори е структурата на IL-2 рецепторния комплекс. Изненадващо беше откритието на факта, че някои субединици на IL-2 рецепторния комплекс са общи за IL-2 и някои други цитокини. По този начин β-веригата е едновременно компонент на рецептора за IL-15, а γ-веригата служи като обща субединица от рецептори за IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 и IL-21. Това означава, че всички споменати цитокини, чиито рецептори също се състоят от 2-3 отделни полипептида, използват γ-веригата като компонент на своите рецептори, освен това компонентът, отговорен за предаването на сигнала. Във всички случаи спецификата на взаимодействието за всеки цитокин се осигурява от други субединици, които се различават по структура. Сред цитокиновите рецептори има 2 по-често срещани рецепторни субединици, които провеждат сигнал след взаимодействие с различни цитокини. Това е обща βc (gp140) рецепторна субединица за IL-3, IL-5 и GM-CSF рецептори, както и gp130 рецепторна субединица, споделена от членове на семейството на IL-6. Наличието на обща сигнална субединица в цитокиновите рецептори служи като един от подходите за тяхната класификация, тъй като позволява да се намери общото както в структурата на лигандите, така и в биологичните ефекти.

Таблица 3 показва комбинирана структурна и функционална класификация, където всички цитокини са разделени на групи, като се отчита предимно тяхната биологична активност, както и горните структурни характеристики на цитокиновите молекули и техните рецептори.

Таблица 3. Структурна и функционална класификация на цитокините.

	Семейства цитокини	Подгрупи и лиганди	Основни биологични функции
	Интерферони тип I	IFN a,b,d,k,w,t, IL-28, IL-29 (IFN l)	Антивирусно действие, антипролиферативно, имуномодулиращо действие
	Растежни фактори на хематопоетичните клетки	Фактор на стволови клетки (кит-лиганд, стоманен фактор), Flt-3 лиганд, G-CSF, M-CSF, IL-7, IL-11 gp140 лиганди: IL-3, IL-5, GM-CSF	Стимулиране на пролиферацията и диференциацията на различни видове прогениторни клетки в костния мозък, активиране на хемопоезата Еритропоетин, Тромбопоетин
	Суперсемейство на интерлевкин-1 и FGF	Семейство FRF: Кисел FGF, основен FGF, FRF3 - FRF23 Семейство IL-1 (F1-11): IL-1α, IL-1β, IL-1 рецепторен антагонист, IL-18, IL-33 и др.	Активиране на пролиферацията на фибробласти и епителни клетки Провъзпалително действие, активиране на специфичен имунитет
	Семейство фактор на туморна некроза	TNF, лимфотоксини α и β, Fas-лиганд и др.	Провъзпалително действие, регулиране на апоптозата и междуклетъчното взаимодействие на имунокомпетентните клетки
	Семейство интерлевкин-6	gp130 лиганди: IL-6, IL-11, IL-31, онкостатин-М, кардиотропин-1, инхибиторен фактор на левкемия, цилиарен невротрофичен фактор	Провъзпалително и имунорегулиращо действие
	Хемокини	SS, SHS (IL-8), SH3S, S	Регулиране на хемотаксиса на различни видове левкоцити
	Семейство интерлевкин-10	IL-10,19,20,22,24,26	Имуносупресивно действие
	Семейство интерлевкин-12		Регулиране на диференциацията на Т-лимфоцитите на хелперите
	Цитокини на Т-хелперни клонове и регулаторни функции на лимфоцитите	Т-хелпери тип 1: IL-2, IL-15, IL-21, IFNg Т-хелпери 2 вида: IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 Лиганди на γ-веригата на IL-2 рецептора: IL-7 TSLP	Активиране на клетъчния имунитет Активиране на хуморалния имунитет, имуномодулиращ ефект Стимулиране на диференциацията, пролиферацията и функционалните свойства на различни видове лимфоцити, DC, NK клетки, макрофаги и др.
	Семейство интерлевкин 17	IL-17A, B, C, D, E, F	Активиране на синтеза на провъзпалителни цитокини
	Суперсемейство от нервен растежен фактор, тромбоцитен растежен фактор и трансформиращи растежни фактори	Семейство нервни растежни фактори: NGF, невротрофичен фактор, получен от мозъка Тромбоцитни растежни фактори (PDGF), ангиогенни растежни фактори (VEGF) TRF семейство: TRFb, активини, инхибини, нодални, костни морфогенни протеини, Мюлерово инхибиторно вещество	Регулиране на възпалението, ангиогенезата, невронната функция, ембрионалното развитие и регенерацията на тъканите
	Семейство епидермални растежни фактори	ERF, TRFα и др.
	Семейство инсулиноподобни растежни фактори	IRF-I, IRF-II	Стимулиране на пролиферацията на различни видове клетки

Първата група включва интерферони тип I и е най-проста като организация, тъй като всички молекули, включени в нея, имат подобна структура и до голяма степен същите функции, свързани с антивирусната защита. Втората група включва фактори на растеж и диференциация на хемопоетични клетки, които стимулират развитието на хемопоетични прогениторни клетки, започвайки от стволовите клетки. Тази група включва цитокини, които са тясно специфични за определени линии на диференциация на хематопоетичните клетки (еритропоетин, тромбопоетин и IL-7, който действа върху прекурсорите на Т-В-лимфоцитите), както и цитокини с по-широк спектър на биологична активност, като например като IL-3, IL-11, колонии-стимулиращи фактори. Като част от тази група цитокини са изолирани gp140 лиганди с обща рецепторна субединица, както и тромбопоетин и еритропоетин, поради сходството на структурната организация на молекулите. Цитокините от суперсемействата FGF и IL-1 имат висока степен на хомология и подобна протеинова структура, което потвърждава общия произход. Въпреки това, по отношение на проявите на биологична активност, FGF се различава в много отношения от агонистите от семейството на IL-1. Семейството от IL-1 молекули, в допълнение към функционалните имена, понастоящем е обозначено с F1-F11, където F1 съответства на IL-1α, F2 - IL-1β, F3 - IL-1 рецепторен антагонист, F4 - IL-18. Останалите членове на семейството са открити в резултат на генетичен анализ и имат доста висока хомология с IL-1 молекули, но техните биологични функции не са напълно изяснени. Следващите групи цитокини включват семействата IL-6 (лиганди на общата рецепторна субединица gp130), тумор некрозис фактор и хемокини, представени от най-голям брой отделни лиганди и изброени изцяло в съответните им глави. Семейството на факторите на туморната некроза се формира главно на базата на сходство в структурата на лигандите и техните рецептори, които се състоят от три нековалентно свързани идентични субединици, които образуват биологично активни молекули. В същото време, според техните биологични свойства, това семейство включва цитокини с доста различна активност. Например, TNF е един от най-забележителните провъзпалителни цитокини, Fas лигандът причинява апоптоза на таргетните клетки, а CD40 лигандът осигурява стимулиращ сигнал по време на междуклетъчното взаимодействие между Т и В лимфоцитите. Такива разлики в биологичната активност на структурно подобни молекули се определят основно от характеристиките на експресията и структурата на техните рецептори, например наличието или отсъствието на вътреклетъчен домен на „смърт“, който определя клетъчната апоптоза. През последните години семействата IL-10 и IL-12 също бяха попълнени с нови членове, които получиха серийни номера на интерлевкини. Това е последвано от много сложна група цитокини, които са медиатори на функционалната активност на хелперните Т-лимфоцити. Включването в тази група се основава на два основни принципа: 1) принадлежност към цитокини, синтезирани от Tx1 или Tx2, което определя развитието на предимно хуморален или клетъчен тип имунологични реакции, 2) наличието на обща рецепторна субединица - гама веригата на IL-2 рецепторния комплекс. Сред лигандите на гама веригата беше допълнително изолиран IL-4, който също има общи рецепторни субединици с IL-13, което до голяма степен определя частично припокриващата се биологична активност на тези цитокини. По подобен начин се изолира IL-7, който има обща структура на рецептори с TSLP. Предимствата на тази класификация са свързани с едновременното отчитане на биологичните и биохимичните свойства на цитокините. Целесъобразността на този подход в момента се потвърждава от откриването на нови цитокини чрез генетичен анализ на генома и търсенето на структурно подобни гени. Благодарение на този метод семейството на интерферони тип I, IL-1, IL-10, IL-12, се разшири значително, появи се ново семейство цитокинови аналози на IL-17, което вече се състои от 6 члена. Очевидно в близко бъдеще появата на нови цитокини ще се случи много по-бавно, тъй като анализът на човешкия геном е почти завършен. Промените най-вероятно са възможни поради усъвършенстването на варианти на взаимодействия лиганд-рецептор и биологични свойства, което ще позволи класификацията на цитокините да придобие окончателната си форма.

Механизми на действие.

Б. Цитокинови рецептори. Цитокините са хидрофилни сигнални вещества, чието действие се медиира от специфични рецептори от външната страна на плазмената мембрана. Свързването на цитокини с рецептора (1) води през серия от междинни етапи (2-5) до активиране на транскрипцията на определени гени (6).Самите цитокинови рецептори нямат тирозин киназна активност (с малки изключения). След свързване с цитокин (1), рецепторните молекули се свързват, за да образуват хомодимери. В допълнение, те могат да образуват хетеродимери чрез асоцииране със сигнални транспортни протеини [BPS (STP)] или да стимулират димеризацията на самите BPS (2). Клас I цитокинови рецептори могат да агрегират с три вида RBP: GP130 протеини, βc или γc. Тези допълнителни протеини не са способни да свързват самите цитокини, но те извършват сигнална трансдукция към тирозин кинази (3).

Като пример за сигнална трансдукция от цитокини, схемата показва как IL-6 рецепторът (IL-6), след свързване с лиганд (1), стимулира димеризацията на GP130 (2). Мембранният протеинов димер GP130 свързва и активира цитоплазмената тирозин киназа от семейството JAK (Янус кинази с два активни центъра) (3). Янус киназите фосфорилират цитокинови рецептори, RBP и различни цитоплазмени протеини, които извършват по-нататъшна сигнална трансдукция; те също така фосфорилират транскрипционни фактори - сигнални преобразуватели и активатори на транскрипция [PSAT (STAT, от англ. сигнални преобразуватели и активатори на транскрипция)]. Тези протеини принадлежат към семейството на BPS, които имат SH3 домейн в структурата си, който разпознава фосфотирозинови остатъци (виж стр. 372). Следователно те имат свойството да се свързват с фосфорилиран цитокинов рецептор. Ако след това молекулата PSAT се фосфорилира (4), факторът става активен и образува димер (5). След транслокация в ядрото, димерът се свързва като транскрипционен фактор към промотора (виж стр. 240) на иницииращия ген и индуцира неговата транскрипция (6).Някои цитокинови рецептори могат да загубят своя извънклетъчен лиганд-свързващ домен поради протеолиза (не показано на схемата). Домейнът навлиза в кръвния поток, където се конкурира за свързване с цитокина, което намалява концентрацията на цитокина в кръвта.Заедно цитокините образуват регулаторна мрежа (цитокинова каскада) с многофункционален ефект. Взаимното припокриване между цитокините води до факта, че в действието на много от тях се наблюдава синергизъм, а някои цитокини са антагонисти. Често в тялото можете да наблюдавате цялата каскада от цитокини със сложна обратна връзка.

свойства на цитокините.

Общи свойства на цитокините, поради които тези медиатори могат да бъдат комбинирани в независима регулаторна система.

1. Цитокините са полипептиди или протеини, често гликозилирани, повечето от тях имат ММ от 5 до 50 kDa. Биологично активните цитокинови молекули могат да се състоят от една, две, три или повече еднакви или различни субединици.

2. Цитокините нямат антигенна специфичност на биологичното действие. Те повлияват функционалната активност на клетките, участващи в реакциите на вродения и придобития имунитет. Независимо от това, като действат върху Т- и В-лимфоцитите, цитокините са в състояние да стимулират антиген-индуцирани процеси в имунната система.

3. За цитокиновите гени съществуват три варианта на експресия: а) стадийно-специфична експресия в определени етапи от ембрионалното развитие, б) конститутивна експресия за регулиране на редица нормални физиологични функции, в) индуцируем тип експресия, характерна за повечето цитокини. В действителност, повечето цитокини извън възпалителния отговор и имунния отговор не се синтезират от клетките. Експресията на цитокиновите гени започва в отговор на проникването на патогени в тялото, антигенно дразнене или увреждане на тъканите. Свързаните с патогени молекулярни структури служат като един от най-силните индуктори на синтеза на провъзпалителни цитокини. За да започне синтеза на Т-клетъчни цитокини, е необходимо активиране на клетки със специфичен антиген с участието на Т-клетъчния антигенен рецептор.

4. Цитокините се синтезират в отговор на стимулация за кратък период от време. Синтезът се прекъсва от различни авторегулаторни механизми, включително повишена нестабилност на РНК и от съществуването на отрицателна обратна връзка, медиирана от простагландини, кортикостероидни хормони и други фактори.

5. Един и същ цитокин може да се произвежда от различни хистогенетични типове клетки на тялото в различни органи.

6. Цитокините могат да бъдат свързани с мембраните на клетките, които ги синтезират, като имат пълен спектър от биологична активност под формата на мембранна форма и проявяват своя биологичен ефект при междуклетъчен контакт.

7. Биологичните ефекти на цитокините се медиират чрез специфични клетъчни рецепторни комплекси, които свързват цитокини с много висок афинитет, а отделните цитокини могат да използват общи рецепторни субединици. Цитокиновите рецептори могат да съществуват в разтворима форма, запазвайки способността да свързват лиганди.

8. Цитокините имат плейотропен биологичен ефект. Един и същи цитокин може да действа върху много типове клетки, причинявайки различни ефекти в зависимост от вида на таргетните клетки (фиг. 1). Плейотропният ефект на цитокините се осигурява от експресията на цитокинови рецептори върху клетъчни типове с различен произход и функции и чрез сигнална трансдукция с помощта на няколко различни вътреклетъчни месинджъри и транскрипционни фактори.

9. Взаимозаменяемостта на биологичното действие е характерна за цитокините. Няколко различни цитокини могат да причинят същия биологичен ефект или да имат сходна активност. Цитокините индуцират или потискат синтеза на себе си, на други цитокини и техните рецептори.

10. В отговор на сигнал за активиране, клетките едновременно синтезират няколко цитокина, участващи в образуването на цитокинова мрежа. Биологичните ефекти в тъканите и на ниво тяло зависят от наличието и концентрацията на други цитокини със синергични, адитивни или противоположни ефекти.

11. Цитокините могат да повлияят на пролиферацията, диференциацията и функционалната активност на целевите клетки.

12. Цитокините действат върху клетките по различни начини: автокринно - върху клетката, която синтезира и секретира този цитокин; паракрин - върху клетки, разположени в близост до клетката производител, например във фокуса на възпалението или в лимфоидния орган; ендокринни - дистанционно върху клетките на всякакви органи и тъкани след навлизане в кръвообращението. В последния случай действието на цитокините наподобява действието на хормоните (фиг. 2).

Ориз. 1. Един и същ цитокин може да се произвежда от различни хистогенетични типове клетки на тялото в различни органи и да действа върху много типове клетки, причинявайки различни ефекти в зависимост от вида на целевите клетки.

Ориз. 2. Три варианта на проява на биологичното действие на цитокините.

Очевидно формирането на системата за регулиране на цитокините еволюира заедно с развитието на многоклетъчните организми и се дължи на необходимостта от образуване на медиатори на междуклетъчно взаимодействие, което може да включва хормони, невропептиди, адхезионни молекули и някои други. В това отношение цитокините са най-универсалната регулаторна система, тъй като те могат да проявяват биологична активност както дистанционно след секреция от клетката продуцент (локално и системно), така и по време на междуклетъчен контакт, като са биологично активни под формата на мембранна форма. Тази система от цитокини се различава от адхезионните молекули, които изпълняват по-тесни функции само при директен клетъчен контакт. В същото време цитокиновата система се различава от хормоните, които се синтезират главно от специализирани органи и действат след навлизане в кръвоносната система.

Ролята на цитокините в регулацията на физиологичните функции на организма.

Ролята на цитокините в регулацията на физиологичните функции на организма може да бъде разделена на 4 основни компонента:

1. Регулиране на ембриогенезата, залагането и развитието на органи, вкл. органи на имунната система.

2. Регулиране на определени нормални физиологични функции.

3. Регулиране на защитните реакции на организма на локално и системно ниво.

4. Регулиране на процесите на регенерация на тъканите.

Генната експресия на отделните цитокини се случва специфично за определени етапи от ембрионалното развитие. Факторът на стволовите клетки, трансформиращите растежни фактори, цитокините от семейството на TNF и хемокините регулират диференциацията и миграцията на различни клетки и образуването на органи на имунната система. След това синтезът на някои цитокини може да не се възобнови, докато други продължават да регулират нормалните физиологични процеси или да участват в развитието на защитни реакции.

Въпреки факта, че повечето цитокини са типични индуцируеми медиатори и не се синтезират от клетки извън възпалителния отговор и имунния отговор в постнаталния период, някои цитокини не попадат в това правило. В резултат на конститутивната експресия на гените, някои от тях се синтезират постоянно и са в обръщение в достатъчно големи количества, като регулират пролиферацията и диференциацията на отделните видове клетки през целия живот. Примери за този тип физиологична регулация на функциите чрез цитокини могат да бъдат постоянно високо ниво на еритропоетин и малко CSF за осигуряване на хематопоеза. Регулирането на защитните реакции на тялото чрез цитокини се осъществява не само в рамките на имунната система, но и чрез организирането на защитни реакции на нивото на целия организъм поради регулирането на почти всички аспекти на развитието на възпалението и имунния отговор. Тази най-важна функция за цялата система от цитокини е свързана с две основни направления на биологичното действие на цитокините - защита срещу инфекциозни агенти и възстановяване на увредените тъкани. Цитокините основно регулират развитието на локални защитни реакции в тъканите, включващи различни видове кръвни клетки, ендотел, съединителна тъкан и епител. Защитата на локално ниво се развива чрез формирането на типична възпалителна реакция с нейните класически прояви: хиперемия, развитие на оток, поява на болка и дисфункция. Синтезът на цитокини започва, когато патогените проникнат в тъканите или се наруши тяхната цялост, което обикновено протича паралелно. Производството на цитокини е неразделна част от клетъчния отговор, свързан с разпознаването от клетките на миеломоноцитната серия на подобни структурни компоненти на различни патогени, наречени патоген-свързани молекулярни модели. Примери за такива структури в патогените са липополизахариди на грам-отрицателни бактерии, пептидогликани на грам-положителни микроорганизми, флагелин или ДНК, богата на CpolyG последователности, което е характерно за ДНК на всички бактериални видове. Левкоцитите експресират подходящи рецептори за разпознаване на модели, наричани също Toll-подобни рецептори (TLR), които са специфични за определени структурни модели на микроорганизми. След взаимодействието на микроорганизми или техни компоненти с TLR се стартира вътреклетъчна сигнална трансдукционна каскада, водеща до повишаване на функционалната активност на левкоцитите и експресията на цитокинови гени.

Активирането на TLR води до синтеза на две основни групи цитокини: провъзпалителни цитокини и интерферони тип I, главно IFNα/β развитието на възпалителен отговор и осигуряване на ветрилообразно разширяване на активирането на различни видове клетки, участващи в поддържане и регулиране на възпалението, включително всички видове левкоцити, дендритни клетки, Т и В-лимфоцити, NK клетки, ендотелни и епителни клетки, фибробласти и др. Това осигурява последователни етапи в развитието на възпалителния отговор, който е основният механизъм за осъществяване на вродения имунитет. В допълнение, дендритните клетки започват да синтезират цитокини от семейството на IL-12, които стимулират диференциацията на хелперните Т-лимфоцити, което служи като своеобразен мост към началото на развитието на специфични имунни реакции, свързани с разпознаването на специфични антигенни структури на микроорганизми.

Вторият също толкова важен механизъм, свързан със синтеза на IFN, осигурява осъществяването на антивирусна защита. Интерфероните тип I проявяват 4 основни биологични свойства:

1. Директно антивирусно действие чрез блокиране на транскрипцията.

2. Потискане на клетъчната пролиферация, необходимо за блокиране на разпространението на вируса.

3. Активиране на функциите на NK клетките, които имат способността да лизират инфектираните с вирус клетки на тялото.

4. Повишена експресия на клас I основни молекули на комплекса за хистосъвместимост, което е необходимо за повишаване на ефективността на представяне на вирусни антигени от инфектираните клетки на цитотоксични Т-лимфоцити. Това води до активиране на специфично разпознаване на инфектираните с вирус клетки от Т-лимфоцитите - първият етап на лизиране на инфектираните с вируси прицелни клетки.

В резултат на това, освен директното антивирусно действие, се активират механизмите както на вродения (NK клетки), така и на придобития (Т-лимфоцити) имунитет. Това е пример за това как една малка цитокинова молекула с MW 10 пъти по-малка от MW на молекулите на антитялото е способна, поради плейотропния тип биологично действие, да активира напълно различни механизми на защитни реакции, насочени към постигане на една и съща цел - премахване на вирусът, който е влязъл в тялото.

На тъканно ниво цитокините са отговорни за развитието на възпаление и след това за регенерацията на тъканите. С развитието на системна възпалителна реакция (острофазов отговор) цитокините засягат почти всички органи и системи на тялото, участващи в регулацията на хомеостазата. Действието на провъзпалителните цитокини върху ЦНС води до намаляване на апетита и промяна в целия комплекс от поведенчески реакции. Временното спиране на търсенето на храна и намаляването на сексуалната активност е полезно от гледна точка на спестяване на енергия за единствената задача за борба с нахлуващ патоген. Този сигнал се подава от цитокините, тъй като навлизането им в циркулацията със сигурност означава, че локалната защита не се е справила с патогена и е необходимо включването на системен възпалителен отговор. Една от първите прояви на системен възпалителен отговор, свързан с действието на цитокините върху терморегулаторния център на хипоталамуса, е повишаването на телесната температура. Повишаването на температурата е ефективна защитна реакция, тъй като при повишена температура способността на редица бактерии да се възпроизвеждат намалява, но напротив, пролиферацията на лимфоцитите се увеличава.

В черния дроб, под въздействието на цитокини, синтезът на острофазови протеини и компоненти на системата на комплемента, които са необходими за борба с патогена, се увеличава, но в същото време синтезът на албумин намалява. Друг пример за селективното действие на цитокините е промяната в йонния състав на кръвната плазма по време на развитието на системна възпалителна реакция. В този случай има понижение на нивото на железните йони, но повишаване на нивото на цинковите йони, а добре известно е, че лишаването на бактериална клетка от железни йони означава намаляване на нейния пролиферативен потенциал (действието на лактоферина се основава по този). От друга страна, повишаването на нивото на цинк е необходимо за нормалното функциониране на имунната система, по-специално, необходимо е за образуването на биологично активен серумен тимусен фактор, един от основните хормони на тимуса, който осигурява диференциацията на лимфоцити. Ефектът на цитокините върху хемопоетичната система е свързан със значително активиране на хемопоезата. Увеличаването на броя на левкоцитите е необходимо за попълване на загубите и увеличаване на броя на клетките, главно неутрофилни гранулоцити, във фокуса на гнойно възпаление. Действието върху системата за коагулация на кръвта е насочено към подобряване на коагулацията, което е необходимо за спиране на кървенето и директно блокиране на патогена.

По този начин, с развитието на системно възпаление, цитокините проявяват огромен спектър от биологични активности и пречат на работата на почти всички системи на тялото. Въпреки това, нито една от промените, които се случват, не е случайна: всички те са или необходими за директното активиране на защитните реакции, или са полезни по отношение на превключването на енергийните потоци само за една задача - за борба с нахлуващия патоген. Под формата на регулиране на експресията на отделни гени, хормонални промени и промени в поведенческите реакции, цитокините осигуряват включването и максималната ефективност на онези системи на тялото, които са необходими в даден момент за развитието на защитни реакции. На нивото на целия организъм цитокините комуникират между имунната, нервната, ендокринната, хемопоетичната и други системи и служат за включването им в организирането и регулирането на една защитна реакция. Цитокините просто служат като организираща система, която формира и регулира целия комплекс от защитни реакции на тялото по време на въвеждането на патогени. Очевидно подобна система на регулиране е еволюирала и има безусловни ползи за най-оптималната защитна реакция на макроорганизма. Следователно, очевидно е невъзможно да се ограничи концепцията за защитни реакции само до участието на неспецифични механизми на резистентност и специфичен имунен отговор. Цялото тяло и всички системи, които на пръв поглед не са свързани с поддържането на имунитета, участват в една защитна реакция.

Специални изследвания на цитокини.

Значението на цитокините в патогенезата на възпалителните заболявания на дебелото черво при деца.

С.В. Белмер, А.С. Симбирцев, О.В. Головенко, Л.В. Бубнова, Л.М. Карпина, Н.Е. Щиголева, Т.Л. Михайлов. Руският държавен медицински университет към Държавния изследователски център по колопроктология, Москва и Държавният научноизследователски институт за високочисти биологични продукти, Санкт Петербург работят за изследване на ролята на цитокините в патогенезата на възпалителните заболявания на дебелото черво при деца. Хроничните възпалителни заболявания на стомашно-чревния тракт в момента заемат едно от водещите места в патологията на храносмилателната система при децата. От особено значение са възпалителните заболявания на дебелото черво (ВЗЧ), честотата на които непрекъснато нараства в световен мащаб. Продължителен курс с чести и в някои случаи фатални рецидиви, развитие на локални и системни усложнения - всичко това подтиква към задълбочено проучване на патогенезата на заболяването в търсене на нови подходи към лечението на IBD. През последните десетилетия честотата на неспецифичния улцерозен колит (NUC) е 510 случая годишно на 100 хиляди население, с болестта на Crohn (CD) 16 случая годишно на 100 хиляди население. Коефициентите на разпространение в Русия, в района на Москва съответстват на средните европейски данни, но са значително по-ниски, отколкото в скандинавските страни, Америка, Израел и Англия. За NUC разпространението е 19,3 на 100 хиляди, честотата е 1,2 на 100 хиляди души годишно. За CD разпространението е 3,0 на 100 хиляди, заболеваемостта е 0,2 на 100 хиляди души годишно. Фактът, че най-високата честота е отбелязана във високоразвитите страни, се дължи не само на социални и икономически фактори, но и на генетични и имунологични характеристики на пациентите, които определят предразположеността към IBD. Тези фактори са основни в имунопатогенетичната теория за произхода на ITS. Вирусните и/или бактериалните теории обясняват само острото начало на заболяването, а хронифицирането на процеса се дължи както на генетична предразположеност, така и на особености на имунния отговор, които също са генетично обусловени. Трябва да се отбележи, че IBD понастоящем се класифицира като заболяване с генетично хетерогенна комплексна предразположеност. Идентифицирани са повече от 15 предполагаеми кандидат-гени от 2 групи (имуноспецифични и имунорегулаторни), причиняващи наследствена предразположеност. Най-вероятно предразположението се определя от няколко гена, които определят естеството на имунологичните и възпалителните реакции. Въз основа на резултатите от многобройни изследвания може да се заключи, че най-вероятната локализация на гените, свързани с развитието на IBD, е хромозома 3, 7, 12 и 16. Понастоящем много внимание се обръща на изследването на характеристиките на функцията на Т и В лимфоцитите, както и на цитокините, медиатори на възпалението. Активно се изучава ролята на интерлевкините (IL), интерфероните (IFN), фактора на туморната некроза (TNF-a), макрофагите и автоантителата към протеините на лигавицата на дебелото черво и автомикрофлората. Идентифицирани са характеристиките на техните нарушения при CD и UC, но остава неясно дали тези промени възникват първично или вторично. За да се разберат много аспекти на патогенезата, изследванията, проведени в предклиничния стадий на IBD, както и при роднини от първа степен, биха били много важни. Сред медиаторите на възпалението специална роля принадлежи на цитокините, които са група полипептидни молекули с маса от 5 до 50 kDa, участващи във формирането и регулирането на защитните реакции на организма. На ниво организъм цитокините комуникират между имунната, нервната, ендокринната, хематопоетичната и други системи и служат за включването им в организирането и регулирането на защитните реакции. Класификацията на цитокините е показана в таблица 2. Повечето цитокини не се синтезират от клетки извън възпалителния отговор и имунния отговор. Експресията на цитокиновите гени започва в отговор на проникването на патогени в тялото, антигенно дразнене или увреждане на тъканите. Едни от най-мощните индуктори на синтеза на цитокини са компонентите на бактериалните клетъчни стени: LPS, пептидогликани и мурамил дипептиди. Продуценти на провъзпалителни цитокини са предимно моноцити, макрофаги, Т-клетки и др. В зависимост от ефекта върху възпалителния процес цитокините се разделят на две групи: провъзпалителни (IL-1, IL-6, IL-8). , TNF-a, IFN-g ) и противовъзпалителни (IL-4, IL-10, TGF-b). Интерлевкин-1 (IL-1) е имунорегулаторен медиатор, освобождаван по време на възпалителни реакции, тъканно увреждане и инфекции (провъзпалителен цитокин). IL-1 играе важна роля в активирането на Т-клетките по време на тяхното взаимодействие с антигена. Известни са два вида IL-1: IL-1a и IL-1b, продукти на два различни генни локуса, разположени на човешка хромозома 2. IL-1a остава вътре в клетката или може да бъде под формата на мембрана, появява се в извънклетъчното пространство в малко количество. Ролята на мембранната форма на IL-1a е предаването на активиращи сигнали от макрофага към Т-лимфоцити и други клетки по време на междуклетъчен контакт. IL-1a е основният медиатор с малък обсег. IL-1b, за разлика от IL-1a, се секретира активно от клетките, действайки както системно, така и локално. Към днешна дата е известно, че IL-1 е един от основните медиатори на възпалителни реакции, стимулира пролиферацията на Т клетките, повишава експресията на IL-2 рецептора върху Т клетките и производството на IL-2 от тях. IL-2, заедно с антигена, индуцира активирането и адхезията на неутрофилите, стимулира образуването на други цитокини (IL-2, IL-3, IL-6 и др.) от активирани Т клетки и фибробласти, стимулира пролиферацията на фибробласти и ендотелни клетки. Системно, IL-1 действа синергично с TNF-a и IL-6. С повишаване на концентрацията в кръвта, IL-1 засяга клетките на хипоталамуса и причинява повишаване на телесната температура, треска, сънливост, намален апетит, а също така стимулира чернодробните клетки да произвеждат протеини от остра фаза (CRP, амилоид А, а-2 макроглобулин и фибриноген). IL4 (хромозома 5). Инхибира активирането на макрофагите и блокира много ефекти, стимулирани от IFNg, като производството на IL1, азотен оксид и простагландини, играе важна роля в противовъзпалителните реакции, има имуносупресивен ефект. IL6 (хромозома 7), един от основните провъзпалителни цитокини, е основният индуктор на крайния етап на диференциация на В-клетки и макрофаги, мощен стимулатор на производството на острофазови протеини от чернодробните клетки. Една от основните функции на IL6 е да стимулира производството на антитела in vivo и in vitro. IL8 (хромозома 4). Отнася се до хемокинови медиатори, които причиняват насочена миграция (хемотаксис) на левкоцитите към фокуса на възпалението. Основната функция на IL10 е да инхибира производството на цитокини от помощници тип 1 (TNFb, IFNg) и активирани макрофаги (TNF-a, IL1, IL12). Сега е признато, че видовете имунен отговор са свързани с един от вариантите на активиране на лимфоцити с преобладаващо участие на клонове на Т-лимфоцити от тип 1 (TH2) или тип 2 (TH3) помощни клетки. Продуктите TH2 и TH3 влияят отрицателно върху активирането на противоположни клонове. Прекомерното активиране на един от видовете Th клонове може да насочи имунния отговор към един от вариантите на развитие. Хроничният дисбаланс в активирането на Th клоновете води до развитие на имунопатологични състояния. Промените в цитокините при IBD могат да бъдат изследвани по различни начини с определяне на тяхното ниво в кръвта или in situ. Нивата на IL1 са повишени при всички възпалителни заболявания на червата. Разликите между UC и CD са в повишената експресия на IL2. Ако UC разкрива понижено или нормално ниво на IL2, тогава CD разкрива неговото повишено ниво. Съдържанието на IL4 се повишава при UC, докато при CD остава нормално или дори намалява. Нивото на IL6, който медиира реакциите в острата фаза, също е повишено при всички форми на възпаление. Получените данни относно профила на цитокините предполагат, че двете основни форми на хронична IBD се характеризират с различно активиране и експресия на цитокини. Резултатите от проучванията показват, че цитокиновият профил, наблюдаван при пациенти с UC, е по-консистентен с TH3 профила, докато за пациентите с CD профилът TH2 трябва да се счита за по-характерен. Привлекателността на тази хипотеза за ролята на профилите TH2 и TH3 е също така, че използването на цитокини може да промени имунния отговор в една или друга посока и да доведе до ремисия с възстановяване на баланса на цитокините. Това може да се потвърди по-специално чрез използването на IL10. Допълнителни изследвания трябва да покажат дали цитокиновият отговор е вторичен феномен в отговор на дразнене или, обратно, експресията на съответните цитокини определя реактивността на организма с развитието на последващи клинични прояви. Проучването на нивото на цитокини при IBD при деца все още не е проведено. Тази работа е първата част от научно изследване, посветено на изследването на цитокиновия статус при IBD при деца. Целта на тази работа е да се изследва хуморалната активност на макрофагите с определяне на нивата (IL1a, IL8) в кръвта на деца с UC и CD, както и тяхната динамика по време на терапията. От 2000 г. до 2002 г. 34 деца с UC и 19 деца с CD на възраст от 4 до 16 години са прегледани в отделението по гастроентерология на Руската детска клинична болница. Диагнозата е потвърдена анамнестично, ендоскопски и морфологично. Изследването на нивата на провъзпалителните цитокини IL1a, IL8 е проведено чрез ензимен имуноанализ (ELISA). За определяне на концентрацията на IL1a, IL8 са използвани тест системи, произведени от Cytokin LLC (Санкт Петербург, Русия). Анализът е извършен в лабораторията по имунофармакология на Държавния научноизследователски институт по високочисти биопрепарати (ръководител на лабораторията, д-р на медицинските науки, проф. A.S. Simbirtsev). Резултатите, получени в хода на изследването, показват значително повишаване на нивата на IL1a, IL8 по време на периода на обостряне, което е по-изразено при деца с UC, отколкото при деца с CD. Извън екзацербацията нивата на провъзпалителните цитокини намаляват, но не достигат нормата. При UC нивата на IL-1a, IL-8 са повишени в периода на екзацербация при 76,2% и 90% от децата, а в периода на ремисия - съответно при 69,2% и 92,3%. При CD нивата на IL-1a, IL-8 са повишени в периода на обостряне при 73,3% и 86,6% от децата, а в периода на ремисия - съответно при 50% и 75%.

В зависимост от тежестта на заболяването децата получават терапия с аминосалицилати или глюкокортикоиди. Естеството на терапията значително повлиява динамиката на нивата на цитокини. По време на терапия с аминосалицилати нивата на провъзпалителните цитокини в групата на децата с UC и CD значително надвишават тези в контролната група. В същото време се наблюдават по-високи нива в групата на децата с UC. При UC по време на терапия с аминосалицилати, IL1a, IL8 са повишени съответно при 82,4% и 100% от децата, докато при терапия с глюкокортикоиди при 60% от децата и за двата цитокина. При CD, IL1a и IL8 са повишени по време на терапия с аминосалицилат при всички деца и по време на терапия с глюкокортикоиди съответно при 55,5% и 77,7% от децата. По този начин резултатите от това проучване показват значително участие в патогенетичния процес на макрофагалната връзка на имунната система при повечето деца с UC и CD. Данните, получени в това проучване, не се различават фундаментално от данните, получени при изследването на възрастни пациенти. Разликите в нивата на IL1a и IL8 при пациенти с UC и CD са количествени, но не и качествени, което предполага неспецифичния характер на тези промени, дължащи се на протичането на хроничен възпалителен процес. Следователно тези показатели нямат диагностична стойност. Резултатите от динамично изследване на нивата на IL1a и IL8 доказват по-високата ефективност на терапията с глюкокортикоидни лекарства в сравнение с терапията с аминосалицили. Представените данни са резултат от първия етап от изследването на цитокиновия статус на деца с IBD. Необходимо е допълнително проучване на проблема, като се вземат предвид показателите на други провъзпалителни и противовъзпалителни цитокини.

Ролята на азотния оксид и цитокините в развитието на синдрома на остро белодробно увреждане.

Този проблем се изучава от Т. А. Шуматова, В. Б. Шуматов, Е. В. Маркелова, Л.Г. Синдромът на остро белодробно увреждане (синдром на респираторен дистрес при възрастни, ARDS) е една от най-тежките форми на остра дихателна недостатъчност, която възниква при пациенти на фона на тежка травма, сепсис, перитонит, панкреатит, обилна загуба на кръв, аспирация, след обширни хирургични интервенции и в 50-60% от случаите води до смърт. Данните от проучванията на патогенезата на ARDS, разработването на критерии за ранна диагностика и прогноза на синдрома са малко, доста противоречиви, което не позволява разработването на последователна диагностична и терапевтична концепция. Установено е, че ARDS се основава на увреждане на ендотела на белодробните капиляри и алвеоларния епител, нарушение на реологичните свойства на кръвта, което води до оток на интерстициалната и алвеоларната тъкан, възпаление, ателектаза и белодробна хипертония. В литературата от последните години се появи достатъчно информация за универсалния регулатор на клетъчния и тъканния метаболизъм - азотния оксид. Интересът към азотния оксид (NO) се дължи главно на факта, че той участва в регулирането на много функции, включително съдов тонус, сърдечен контрактилитет, агрегация на тромбоцитите, невротрансмисия, АТФ и синтез на протеини и имунна защита. Освен това, в зависимост от избора на молекулярната мишена и характеристиките на взаимодействие с нея, NO също има увреждащ ефект. Смята се, че задействащият механизъм за клетъчно активиране е дисбалансираната цитокинемия. Цитокините са разтворими пептиди, които действат като медиатори на имунната система и осигуряват клетъчно сътрудничество, положителна и отрицателна имунорегулация. Опитахме се да систематизираме наличната в литературата информация за ролята на NO и цитокините в развитието на синдрома на остро белодробно увреждане. NO е водо- и мастноразтворим газ. Молекулата му е нестабилен свободен радикал, лесно дифундира в тъканта, абсорбира се и се унищожава толкова бързо, че може да засегне само клетките от непосредствената си среда. Молекулата NO има всички свойства, присъщи на класическите пратеници: бързо се произвежда, действа при много ниски концентрации и след спиране на външния сигнал бързо се превръща в други съединения, окислявайки се до стабилни неорганични азотни оксиди: нитрит и нитрат. Продължителността на живота на NO в тъканите според различни източници е от 5 до 30 секунди. Основните молекулярни мишени на NO са желязосъдържащи ензими и протеини: разтворима гуанилат циклаза, нитроксид синтаза (NOS), хемоглобин, митохондриални ензими, ензими от цикъла на Кребс, протеинов и ДНК синтез. Синтезът на NO в организма се осъществява чрез ензимни трансформации на азотсъдържащата част на аминокиселината L-аргинин под въздействието на специфичен NOS ензим и се медиира от взаимодействието на калциевите йони с калмодулин. Ензимът се инактивира при ниски концентрации и е максимално активен при 1 µM свободен калций. Идентифицирани са две изоформи на NOS: конститутивна (cNOS) и индуцирана (iNOS), които са продукти на различни гени. Зависещият от калций-калмодулин cNOS постоянно присъства в клетката и насърчава освобождаването на малко количество NO в отговор на рецепторно и физическо стимулиране. NO, образуван под въздействието на тази изоформа, действа като носител в редица физиологични реакции. Независимият от калций-калмодулин iNOS се образува в различни типове клетки в отговор на провъзпалителни цитокини, ендотоксини и оксиданти. Тази изоформа на NOS се транскрибира от специфични гени на хромозома 17 и насърчава синтеза на големи количества NO. Ензимът също се класифицира в три типа: NOS-I (невронален), NOS-II (макрофагов), NOS-III (ендотелен). Семейството на NO-синтезиращи ензими е открито в много белодробни клетки: в бронхиални епителни клетки, в алвеолоцити, в алвеоларни макрофаги, в мастоцити, в ендотелиоцити на бронхиални артерии и вени, в гладки миоцити на бронхи и кръвоносни съдове, в не- адренергични нехолинергични неврони. Конститутивната способност на бронхиалните и алвеоларните епителни клетки при хора и бозайници да секретират NO е потвърдена в множество изследвания. Установено е, че горните отдели на дихателните пътища на човека, както и долните отдели участват в образуването на NO. Изследвания, проведени при пациенти с трахеостомия, показват, че във въздуха, издишван през трахеостомата, количеството газ е много по-малко, отколкото в носната и устната кухина. Синтезът на ендогенния NO е значително засегнат при пациенти на изкуствена белодробна вентилация. Изследванията потвърждават, че освобождаването на NO възниква по време на бронходилатация и се контролира от системата на блуждаещия нерв. Получени са данни, че образуването на NO в епитела на дихателните пътища на човека се увеличава при възпалителни заболявания на дихателната система. Синтезът на газ се увеличава чрез активиране на индуцираната NOS под въздействието на цитокини, както и на ендотоксини и липополизахариди.

Понастоящем са известни повече от сто цитокини, които традиционно се разделят на няколко групи.

1. Интерлевкини (IL-1 - IL18) - секреторни регулаторни протеини, които осигуряват медиаторни взаимодействия в имунната система и връзката й с други системи на тялото.

2. Интерферони (IFN-алфа, бета, гама) - антивирусни цитокини с изразен имунорегулиращ ефект.

3. Тумор некротизиращи фактори (TNF алфа, бета) - цитокини с цитотоксично и регулаторно действие.

4. Колониостимулиращи фактори (G-CSF, M-CSF, GM-CSF) - стимулатори на растежа и диференциацията на хематопоетичните клетки, които регулират хемопоезата.

5. Хемокини (IL-8, IL-16) - хемоатрактанти за левкоцитите.

6. Растежни фактори - регулатори на растежа, диференциацията и функционалната активност на клетки от различни тъканни принадлежности (фибробластен растежен фактор, ендотелен клетъчен растежен фактор, епидермален растежен фактор) и трансформиращи растежни фактори (TGF бета).

Тези биорегулаторни молекули определят вида и продължителността на възпалителния и имунен отговор, контролират клетъчната пролиферация, хематопоезата, ангиогенезата, заздравяването на рани и много други процеси. Всички изследователи подчертават, че цитокините нямат специфичност за антигени. Експерименти с култивирани белодробни макрофаги и мастоцити показват образуването на iNOS в отговор на интерферон гама, интерлевкин-1, фактор на туморна некроза и липополизахариди. Експресия на iNOS и cNOS за провъзпалителни цитокини е открита в животински и човешки алвеолоцити. Добавянето на епидермален растежен фактор, регулатор на функцията на епителните клетки, към културата намалява активността само на индуцирания ензим. Известно е, че в зависимост от природата цитокините действат автокринно - върху самите продуциращи клетки, паракринно - върху други прицелни клетки или ендокринно - върху различни клетки извън мястото на тяхното производство. В същото време те могат да взаимодействат помежду си според агонистичния или антагонистичния принцип, променяйки функционалното състояние на целевите клетки и образувайки цитокинова мрежа. По този начин цитокините не са различни пептиди, а интегрална система, чиито основни компоненти са клетките продуценти, самият цитокинов протеин, неговият рецептор и клетката-мишена. Установено е, че с развитието на остро белодробно увреждане се повишава нивото на провъзпалителните цитокини: IL-1, 6, 8, 12, TNF алфа, IFN алфа. Техният ефект е свързан с разширяване на кръвоносните съдове, повишаване на тяхната пропускливост и натрупване на течност в белодробната тъкан. В допълнение, проучванията показват способността на IFN гама и TNF алфа да индуцират експресията на адхезионни молекули - ICAM -1 върху човешки ендотелиоцити. Адхезионните молекули, прилепващи към левкоцитите, тромбоцитите и ендотелните клетки, образуват "търкалящи се" (въртящи се) неутрофили и допринасят за агрегацията на фибриновите частици. Тези процеси допринасят за нарушаване на капилярния кръвен поток, повишават пропускливостта на капилярите и предизвикват локален оток на тъканите. Забавянето на капилярния кръвен поток се улеснява от активирането на NO, което причинява разширяване на артериолите. По-нататъшната миграция на левкоцитите към фокуса на възпалението се контролира от специални цитокини - хемокини, които се произвеждат и секретират не само от активирани макрофаги, но и от ендотелни клетки, фибробласти и гладки миоцити. Основната им функция е да доставят неутрофили във фокуса на възпалението и да активират тяхната функционална активност. Основният хемокин за неутрофилите е Il-8. Най-силните му индуктори са бактериалните липополизахариди, IL-1 и TNFalpha. R. Bahra и др. считат, че всеки етап от трансендотелната миграция на неутрофили се регулира от стимулиращи концентрации на TNF алфа. С развитието на остро белодробно увреждане, съдовите ендотелиоцити, бронхиалните епителиоцити и алвеоларните макрофаги се активират и участват във фазови взаимодействия. В резултат на това, от една страна, настъпва тяхната мобилизация и укрепване на защитните свойства, а от друга страна е възможно увреждане на самите клетки и околните тъкани. Редица проучвания показват, че продуктът от частичното намаляване на кислорода, супероксидът, който инактивира вазоактивния ефект на NO, може да се натрупа във фокуса на възпалението. NO и супероксидният анион реагират бързо, за да образуват пероксинитрит, който уврежда клетките. Тази реакция допринася за отстраняването на NO от съдовите и бронхиалните стени, както и от повърхността на алвеолоцитите. Интерес представляват проучвания, които показват, че традиционно считан за медиатор на токсичността на NO, пероксинитритът може да има физиологичен ефект и да индуцира съдова релаксация чрез NO-медиирано повишаване на cGMP в съдовия ендотел. На свой ред пероксинитритът е мощен оксидант, който може да увреди алвеоларния епител и белодробния сърфактант. Той причинява разрушаване на протеините и липидите на мембраните, уврежда ендотела, повишава агрегацията на тромбоцитите и участва в процесите на ендотоксемия. Неговото повишено образуване се наблюдава при синдрома на остро белодробно увреждане. Изследователите смятат, че NO, произведен в резултат на активирането на индуцирания ензим, е предназначен за неспецифична защита на тялото от широк спектър от патогенни агенти, инхибира агрегацията на тромбоцитите и подобрява локалното кръвообращение. Установено е, че прекомерното количество NO потиска активността на cNOS в клетките поради взаимодействие със супероксид и, вероятно, в резултат на десенсибилизация на гуанилат циклазата, което води до намаляване на cGMP в клетката и повишаване на вътреклетъчния калций . Брет и др. и Kooy et al., анализирайки значението на нитрооксидергичните механизми в патогенезата на ARDS, изразиха мнение, че iNOS, пероксинитрит и нитротирозин, основният продукт от ефекта на пероксинитрит върху протеина, могат да играят ключова роля в развитието на синдром. Cuthbertson и др. считат, че в основата на острото белодробно увреждане е ефектът на NO и пероксинитрит върху еластазата и интерлевкин-8. Кобаяши и др. също регистрира повишаване на съдържанието на iNOS, интерлевкин-1, интерлевкин-6, интерлевкин-8 в бронхоалвеоларната течност при пациенти със синдром на остро белодробно увреждане. Мелдрум и др. показват намаляване на производството на възпалителни цитокини от белодробни макрофаги при ARDS под влиянието на локалния субстрат за производство на NO - L-аргинин. Установено е, че в генезата на синдрома на острото белодробно увреждане значителна роля играе нарушената съдова пропускливост, дължаща се на действието на цитокини - TNF алфа, IL-2, GM-CSF, моноклонални антитела към CD3 лимфоцити върху белодробни съдови ендотелни клетки и имуноцити. Бързото и силно повишаване на пропускливостта на белодробните съдове води до миграция на неутрофили в белодробната тъкан и освобождаване от тях на цитотоксични медиатори, което е водещо в развитието на патологични изменения на белите дробове. По време на развитието на остро белодробно увреждане, TNF алфа повишава адхезията на неутрофилите към съдовата стена, засилва тяхната миграция в тъканите, насърчава структурни и метаболитни промени в ендотелните клетки, нарушава пропускливостта на клетъчните мембрани, активира образуването на други цитокини и ейкозаноиди , и причинява апоптоза и некроза на белодробни епителни клетки. Получени са данни, показващи, че апоптозата на макрофагите, предизвикана от въвеждането на LPS, е до голяма степен свързана с IFN гама и е намалена под влиянието на IL-4, IL-10, TGF бета. Въпреки това, Kobayashi et al. получиха данни, показващи, че IFN-гама може да участва в възстановяването на епитела на респираторната лигавица. Проучванията на Hagimoto съдържат информация, че бронхиалните и алвеоларните епителни клетки секретират IL-8, IL-12 в отговор на TNF алфа или Fas лиганд. Този процес е свързан с активирането на ядрения фактор Carr-B от лиганда Fas.

Има мнение, че IL-8 е един от най-важните цитокини в патофизиологията на остро белодробно увреждане. Милър и др. при изследване на бронхо-алвеоларна течност при пациенти с ARDS на фона на сепсис е установено значително повишаване на нивото на IL-8 в сравнение с пациенти с кардиогенен белодробен оток. Предполага се, че белите дробове са основният източник на Il-8 и този критерий може да се използва при диференциалната диагноза на синдрома. Грау и др. считат, че ендотелните клетки на белодробните капиляри служат като важен източник на цитокини - IL-6, IL-8 при развитието на остро белодробно увреждане. Гудман и др. при изследване на динамиката на нивото на цитокините в течността на бронхо-алвеоларния лаваж при пациенти с ARDS, значително увеличение на IL-1beta, IL-8, моноцитен хемотаксичен пептид-1, неутрофилен активатор на епителни клетки, възпалителен пептид на макрофагите -1 е създадена алфа. В същото време авторите смятат, че повишаването на съдържанието на IL-1 бета може да служи като маркер за неблагоприятен изход от синдрома. Bauer et al. беше показано, че контролът на съдържанието на IL-8 в бронхоалвеоларната течност при пациенти с ARDSV може да се използва за наблюдение, намаляването на нивото на IL-8 показва неблагоприятен ход на процеса. Редица проучвания също съдържат доказателства, че нивото на производство на цитокини от ендотела на белодробните съдове влияе върху развитието на остро белодробно увреждане и чийто контрол може да се прилага в клиничната практика за ранна диагностика. Възможните отрицателни последици от повишаване на нивото на провъзпалителни цитокини при пациенти с ARDS се доказват от проучванията на Martin et al., Warner et al.. Активирани от цитокини и бактериални ендотоксини, алвеоларните макрофаги повишават синтеза на NO. Нивото на производство на NO от бронхиални и алвеоларни епителни клетки, неутрофили, мастоцити, ендотелиоцити и гладки миоцити на белодробните съдове също се повишава, вероятно чрез активирането на ядрен фактор Carr-B. Авторите смятат, че азотният оксид, произведен в резултат на активиране на индуцираната NOS, е предназначен преди всичко за неспецифична защита на организма. Освободен от макрофагите, NO бързо прониква в бактерии, гъбички, където инхибира три жизненоважни групи ензими: Н-електронен транспорт, цикъл на Кребс и синтез на ДНК. NO участва в защитата на организма в последните етапи на имунния отговор и образно се смята за "наказващия меч" на имунната система. Въпреки това, натрупвайки се в клетката в неадекватно големи количества, NO също има увреждащ ефект. По този начин, по време на развитието на синдрома на остро белодробно увреждане, цитокините и NO предизвикват последователна верига от реакции, изразяващи се в нарушения на микроциркулацията, появата на тъканна хипоксия, алвеоларен и интерстициален оток и увреждане на метаболитната функция на белите дробове. Следователно може да се каже, че изследването на физиологичните и патофизиологичните механизми на действие на цитокините и NO е обещаваща област за изследване и допълнително не само ще разшири разбирането за патогенезата на ARDS, но и ще определи диагностичните и прогностичните маркери на синдрома, разработване на възможности за патогенетично обоснована терапия, насочена към намаляване на смъртността.

Методи за определяне на цитокини.

Обзорът е посветен на основните методи за изследване на цитокини, използвани в момента. Накратко се характеризират възможностите и предназначението на методите. Представени са предимствата и недостатъците на различни подходи за анализ на експресията на цитокинов ген на ниво нуклеинови киселини и на ниво производство на протеини. (Цитокини и възпаление. 2005. Т. 4, № 1. С. 22-27.)

Цитокините са регулаторни протеини, които образуват универсална мрежа от медиатори, характерни както за имунната система, така и за клетките на други органи и тъкани. Под контрола на този клас регулаторни протеини се случват всички клетъчни събития: пролиферация, диференциация, апоптоза и специализирана функционална активност на клетките. Ефектите на всеки цитокин върху клетките се характеризират с плейотропия, спектърът от ефекти на различните медиатори се припокрива и като цяло крайното функционално състояние на клетката зависи от влиянието на няколко цитокини, действащи синергично. По този начин цитокиновата система е универсална, полиморфна регулаторна мрежа от медиатори, предназначена да контролира процесите на пролиферация, диференциация, апоптоза и функционалната активност на клетъчните елементи в хематопоетичните, имунните и други хомеостатични системи на тялото. Методите за определяне на цитокини в продължение на 20 години интензивно изследване са претърпели много бърза еволюция и днес представляват цяла област на научното познание. В началото на работата изследователите в цитокинологията са изправени пред въпроса за избор на метод. И тук изследователят трябва да знае точно каква информация трябва да получи, за да постигне целта си. В момента са разработени стотици различни методи за оценка на цитокиновата система, които предоставят разнообразна информация за тази система. Цитокините могат да бъдат оценени в различни биологични среди чрез тяхната специфична биологична активност. Те могат да бъдат количествено определени с помощта на различни методи за имуноанализ, използващи поли- и моноклонални антитела. В допълнение към изучаването на секреторните форми на цитокините, може да се изследва тяхното вътреклетъчно съдържание и продукция в тъканите чрез поточна цитометрия, Western blotting и in situ имунохистохимия. Много важна информация може да бъде получена чрез изследване на експресията на цитокинова иРНК, стабилността на иРНК, наличието на цитокинови иРНК изоформи и естествени антисенс нуклеотидни последователности. Изследването на алелни варианти на цитокиновите гени може да предостави важна информация за генетично програмираното високо или ниско производство на определен медиатор. Всеки метод има своите предимства и недостатъци, собствена разделителна способност и точност на определяне. Незнанието и неразбирането на тези нюанси от страна на изследователя може да го доведе до неверни заключения.

Определяне на биологичната активност на цитокините.

Историята на откритието и първите стъпки в изследването на цитокините е тясно свързана с култивирането на имунокомпетентни клетки и клетъчни линии. Тогава бяха показани регулаторните ефекти (биологична активност) на редица разтворими протеинови фактори върху пролиферативната активност на лимфоцитите, върху синтеза на имуноглобулини и върху развитието на имунни отговори в in vitro модели. Един от първите методи за определяне на биологичната активност на медиаторите е определянето на фактора на миграция на човешките лимфоцити и фактора на неговото инхибиране. С изучаването на биологичните ефекти на цитокините се появиха и различни методи за оценка на тяхната биологична активност. Така IL-1 се определя чрез оценка на пролиферацията на миши тимоцити in vitro, IL-2 - чрез способността да стимулира пролиферативната активност на лимфобластите, IL-3 - чрез растежа на хемопоетични колонии in vitro, IL-4 - чрез комитогенният ефект, чрез повишена експресия на Ia протеини, чрез индуциране на образуването на IgG1 и IgE и др. Списъкът на тези методи може да бъде продължен, той непрекъснато се актуализира, тъй като се откриват нови биологични активности на разтворими фактори. Основният им недостатък е нестандартността на методите, невъзможността за тяхното унифициране. По-нататъшното развитие на методите за определяне на биологичната активност на цитокините доведе до създаването на голям брой клетъчни линии, чувствителни към един или друг цитокин, или мултичувствителни линии. Повечето от тези чувствителни към цитокини клетки вече могат да бъдат намерени в списъци с разпространени в търговската мрежа клетъчни линии. Например клетъчната линия D10S се използва за тестване на IL-1a и b, клетъчната линия CTLL-2 се използва за IL-2 и IL-15, клетъчната линия CTLL-2 се използва за IL-3, IL-4 , IL-5, IL-9, IL-13, GM-CSF - клетъчна линия TF-1, за IL-6 - клетъчна линия B9, за IL-7 - клетъчна линия 2E8, за TNFa и TNFb - клетъчна линия L929, за IFNg - клетъчна линия WiDr, за IL-18 - клетъчна линия линия KG-1. Въпреки това, такъв подход към изследването на имуноактивни протеини, заедно с добре известни предимства, като измерване на реалната биологична активност на зрели и активни протеини, висока възпроизводимост при стандартизирани условия, има своите недостатъци. Те включват, на първо място, чувствителността на клетъчните линии не към един цитокин, а към няколко свързани цитокини, чиито биологични ефекти се припокриват. Освен това не може да се изключи възможността за индуциране на производството на други цитокини от клетки-мишени, което може да наруши тестовия параметър (като правило това са пролиферация, цитотоксичност, хемотаксис). Все още не знаем всички цитокини и не всичките им ефекти, така че оценяваме не самия цитокин, а общата специфична биологична активност. По този начин оценката на биологичната активност като обща активност на различни медиатори (недостатъчна специфичност) е един от недостатъците на този метод. Освен това, използвайки чувствителни към цитокини линии, не е възможно да се открият неактивирани молекули и свързани протеини. Това означава, че такива методи не отразяват реалното производство на редица цитокини. Друг важен недостатък на използването на клетъчни линии е необходимостта от лаборатория за клетъчни култури. В допълнение, всички процедури за отглеждане на клетки и инкубирането им с изследваните протеини и среда изискват много време. Трябва също да се отбележи, че дългосрочната употреба на клетъчни линии изисква подновяване или повторно сертифициране, тъй като в резултат на култивирането те могат да мутират и да бъдат модифицирани, което може да доведе до промяна в тяхната чувствителност към медиатори и намаляване на точността за определяне на биологичната активност. Въпреки това, този метод е идеален за тестване на специфичната биологична активност на рекомбинантни медиатори.

Количествено определяне на цитокини с помощта на антитела.

Цитокините, произведени от имунокомпетентни и други видове клетки, се освобождават в междуклетъчното пространство за паракринни и автокринни сигнални взаимодействия. Чрез концентрацията на тези протеини в кръвния серум или в кондиционирана среда може да се прецени естеството на патологичния процес и излишъкът или дефицитът на определени клетъчни функции при пациента. Методите за определяне на цитокини с помощта на специфични антитела в момента са най-разпространените системи за откриване на тези протеини. Тези методи преминаха през цяла поредица от модификации, използвайки различни етикети (радиоизотопни, флуоресцентни, електрохемилуминесцентни, ензимни и др.). Ако радиоизотопните методи имат редица недостатъци, свързани с използването на радиоактивен етикет и ограниченото време за използване на белязани реагенти (полуживот), тогава най-широко използвани са методите за ензимен имуноанализ. Те се основават на визуализация на неразтворими продукти от ензимна реакция, които абсорбират светлина с известна дължина на вълната в количества, еквивалентни на концентрацията на аналита. Антитела, покрити върху твърда полимерна основа, се използват за свързване на измерваните вещества, а антитела, конюгирани с ензими, обикновено алкална фосфатаза или пероксидаза от хрян, се използват за визуализация. Предимствата на метода са очевидни: това е висока точност на определяне при стандартизирани условия за съхранение на реактиви и извършване на процедури, количествен анализ и възпроизводимост. Недостатъците включват ограничения диапазон на определяните концентрации, в резултат на което всички концентрации, превишаващи определен праг, се считат за равни на него. Трябва да се отбележи, че времето, необходимо за изпълнение на метода, варира в зависимост от препоръките на производителя. При всички случаи обаче говорим за няколко часа, необходими за инкубиране и промиване на реагентите. Освен това се определят латентни и свързани форми на цитокини, които в концентрацията си могат значително да надвишават свободните форми, главно отговорни за биологичната активност на медиатора. Поради това е желателно този метод да се използва заедно с методи за оценка на биологичната активност на медиатора. Друга модификация на метода за имуноанализ, намерила широко приложение, е електрохемилуминесцентният метод (ECL) за определяне на протеини с антитела, маркирани с рутений и биотин. Този метод има следните предимства в сравнение с радиоизотопните и ензимните имуноанализи: лекота на прилагане, кратко време на процедурата, липса на процедури за измиване, малък обем на пробата, голям диапазон на определени концентрации на цитокини в серума и в кондиционирана среда, висока чувствителност на метода и неговата възпроизводимост. Разглежданият метод е приемлив за използване както в научните изследвания, така и в клиниката. Следният метод за оценка на цитокини в биологична среда се основава на технологията на поточна флуорометрия. Позволява ви едновременно да оцените до сто протеина в проба. Понастоящем са създадени търговски комплекти за определяне на до 17 цитокини. Предимствата на този метод обаче определят и неговите недостатъци. Първо, това е трудоемкостта на избора на оптимални условия за определяне на няколко протеина, и второ, производството на цитокини е каскадно с пикове на производство в различно време. Следователно определянето на голям брой протеини едновременно не винаги е информативно. Общото изискване на методите за имуноанализ, използващи т.нар. "сандвич" е внимателен подбор на двойка антитела, което ви позволява да определите свободната или свързаната форма на анализирания протеин, което налага ограничения на този метод и което винаги трябва да се взема предвид при интерпретирането на получените данни . Тези методи определят общото производство на цитокини от различни клетки, докато в същото време антиген-специфичното производство на цитокини от имунокомпетентни клетки може да се прецени само условно. В момента е разработена системата ELISpot (Enzyme-Liked ImmunoSpot), която до голяма степен елиминира тези недостатъци. Методът позволява полуколичествена оценка на производството на цитокини на ниво отделни клетки. Високата разделителна способност на този метод дава възможност да се оцени антиген-стимулираното производство на цитокини, което е много важно за оценка на специфичен имунен отговор. Следващият, широко използван за научни цели метод е вътреклетъчното определяне на цитокини чрез поточна цитометрия. Предимствата му са очевидни. Можем фенотипно да характеризираме популация от цитокин-продуциращи клетки и/или да определим спектъра на цитокините, произведени от отделни клетки, и е възможно относително да характеризираме това производство. Описаният метод обаче е доста сложен и изисква скъпо оборудване. Следващата серия от методи, които се използват предимно за научни цели, са имунохистохимичните методи, използващи белязани моноклонални антитела. Предимствата са очевидни - определяне на производството на цитокини директно в тъканите (in situ), където протичат различни имунологични реакции. Разглежданите методи обаче са много трудоемки и не дават точни количествени данни.

Определяне на цитокини чрез ензимен имуноанализ.

ЗАО "Вектор-Бест" под ръководството на Т.Г. Рябичева, Н.А. Вараксин, Н.В. Тимофеева, М.Ю. Рукавишников активно работят за определяне на цитокини. Цитокините са група полипептидни медиатори, често гликозилирани, с молекулно тегло от 8 до 80 kD. Цитокините участват във формирането и регулирането на защитните реакции на организма и неговата хомеостаза. Те участват във всички части на хуморалния и клетъчния имунен отговор, включително диференциация на имунокомпетентни прогениторни клетки, представяне на антиген, клетъчно активиране и пролиферация, експресия на адхезионни молекули и отговор на острата фаза. Някои от тях са в състояние да проявяват много биологични ефекти по отношение на различни целеви клетки. Действието на цитокините върху клетките се осъществява по следните начини: автокринно - върху клетката, която синтезира и секретира този цитокин; паракрин - върху клетки, разположени в близост до клетката производител, например във фокуса на възпалението или в лимфоидния орган; ендокринно-дистанционно - върху клетките на всякакви органи и тъкани след навлизане на цитокина в кръвообращението. Производството и освобождаването на цитокини обикновено е преходно и строго регулирано. Цитокините действат върху клетката, като се свързват със специфични рецептори на цитоплазмената мембрана, като по този начин предизвикват каскада от реакции, водещи до индукция, усилване или потискане на активността на редица гени, регулирани от тях. Цитокините се характеризират със сложен мрежов характер на функциониране, при който производството на един от тях влияе върху формирането или проявата на активността на редица други. Цитокините са локални медиатори, поради което е препоръчително да се измерват нивата им в съответните тъкани след екстракция на тъканни протеини от биопсични проби на съответните органи или в естествени течности: урина, слъзна течност, течност от гингивални джобове, бронхоалвеоларен лаваж, вагинален секрет , еякулат, промивки от кухини, спинална или синовиална течност и др. Допълнителна информация за състоянието на имунната система на организма може да се получи чрез изследване на способността на кръвните клетки да произвеждат цитокини in vitro. Плазмените нива на цитокини отразяват текущото състояние на имунната система и развитието на защитни реакции in vivo. Спонтанното производство на цитокини от култура от мононуклеарни клетки на периферната кръв дава възможност да се оцени състоянието на съответните клетки. Повишеното спонтанно производство на цитокини показва, че клетките вече са активирани от антигена in vivo. Индуцираното производство на цитокини дава възможност да се оцени потенциалната способност на съответните клетки да реагират на антигенна стимулация. Намалената in vitro индукция на цитокини, например, може да бъде един от отличителните белези на състояние на имунна недостатъчност. Следователно и двата варианта за изследване на нивата на цитокини както в циркулиращата кръв, така и по време на тяхното производство от клетъчни култури са важни от гледна точка на характеризиране на имунореактивността на целия организъм и функцията на отделни звена на имунната система. Доскоро няколко групи изследователи се занимаваха с изследване на цитокини в Русия, тъй като биологичните методи на изследване са много трудоемки, а вносните имунохимични комплекти са много скъпи. С появата на налични домашни комплекти за ензимен имуноанализ, практикуващите лекари проявяват нарастващ интерес към изследването на цитокиновия профил. В момента диагностичното значение на оценката на нивото на цитокините е в установяването на самия факт на повишаване или намаляване на тяхната концентрация при даден пациент с конкретно заболяване. Освен това, за да се оцени тежестта и да се предскаже хода на заболяването, е препоръчително да се определи концентрацията както на противовъзпалителни, така и на провъзпалителни цитокини в динамиката на патологията. Например, съдържанието на цитокини в периферната кръв се определя от времето на обостряне, отразява динамиката на патологичния процес при пептична язва и други заболявания на стомашно-чревния тракт. В най-ранните периоди на обостряне преобладава повишаването на съдържанието на интерлевкин-1бета (IL-1бета), интерлевкин-8 (IL-8), след това концентрацията на интерлевкин-6 (IL-6), гама-интерферон (гама -IFN), а факторът на туморната некроза повишава -алфа (алфа-TNF). Концентрацията на интерлевкин-12 (IL-12), гама-IFN, алфа-TNF достига своя максимум в разгара на заболяването, докато съдържанието на маркерите на острата фаза през този период се доближава до нормалните стойности. В пика на екзацербацията нивото на алфа-TNF значително надвишава съдържанието на интерлевкин-4 (IL-4) както в кръвния серум, така и директно в засегнатата тъкан на периулцерната зона, след което започва постепенно да намалява. С отшумяването на явленията в острата фаза се засилват репарационните процеси, нараства концентрацията на IL-4. Чрез промяна на цитокиновия профил може да се прецени ефективността и целесъобразността на химиотерапията. При провеждане на терапия с цитокини, например по време на терапия с алфа-интерферон (алфа-IFN), е необходимо да се контролира както нивото на съдържанието му в циркулиращата кръв, така и производството на антитела срещу алфа-IFN. Известно е, че с развитието на голям брой от тези антитела, терапията с интерферон не само престава да бъде ефективна, но може да доведе и до автоимунни заболявания. Напоследък са разработени и въведени в практиката нови лекарства, които по един или друг начин променят цитокиновия статус на тялото. Например, за лечение на ревматоиден артрит се предлага лекарство на базата на антитела срещу алфа-TNF, предназначено да премахне алфа-TNF, който участва в разрушаването на съединителната тъкан. Въпреки това, както според нашите данни, така и според литературата, не всички пациенти с хроничен ревматоиден артрит имат повишено ниво на алфа-TNF, следователно за тази група пациенти намаляването на нивото на алфа-TNF може допълнително да влоши дисбаланса на имунната система. Следователно правилната цитокинова терапия включва контрол на цитокиновия статус на тялото по време на лечението. Защитната роля на провъзпалителните цитокини се проявява локално, във фокуса на възпалението, но тяхното системно производство не води до развитие на антиинфекциозен имунитет и не предотвратява развитието на бактериален токсичен шок, който е причина за ранна смъртност при хирургични пациенти с гнойно-септични усложнения. В основата на патогенезата на хирургичните инфекции е стартирането на цитокиновата каскада, която включва, от една страна, провъзпалителни, а от друга страна, противовъзпалителни цитокини. Балансът между тези две противоположни групи до голяма степен определя естеството на хода и изхода на гнойно-септичните заболявания. Въпреки това, определянето на концентрацията в кръвта на един цитокин от тези групи (например алфа-TNF или IL-4) няма да отразява адекватно състоянието на целия цитокинов баланс. Следователно е необходима еднократна оценка на нивото на няколко медиатора (поне 2-3 от противоположните подгрупи). CJSC "Vector-Best" е разработила и пуснала в търговската мрежа набори от реагенти за количествено определяне на: фактор на туморна некроза-алфа (чувствителност - 2 pg/ml, 0–250 pg/ml); интерферон гама (чувствителност - 5 pg / ml, 0–2000 pg / ml); интерлевкин-4 (чувствителност - 2 pg / ml, 0-400 pg / ml); интерлевкин-8 (чувствителност - 2 pg / ml, 0–250 pg / ml); интерлевкин-1 рецепторен антагонист (IL-1RA) (чувствителност - 20 pg / ml, 0-2500 pg / ml); алфа интерферон (чувствителност - 10 pg / ml, 0–1000 pg / ml); автоимунни антитела към алфа-интерферон (чувствителност - 2 ng / ml, 0-500 ng / ml). Всички комплекти са предназначени да определят концентрацията на тези цитокини в човешки биологични течности, в супернатанти на култури при изследване на способността на човешки клетъчни култури да произвеждат цитокини in vitro. Принципът на анализа е "сандвич" версия на твърдофазен триетапен (време за инкубация - 4 часа) или двуетапен (време за инкубация - 3,5 часа) ензимен имуноанализ върху плочи. Анализът изисква 100 µl телесна течност или супернатант от култура на ямка. Отчитане на резултатите - спектрофотометрично при дължина на вълната 450 nm. Във всички групи хромогенът е тетраметилбензидин. Срокът на годност на нашите комплекти е увеличен на 18 месеца от датата на издаване и 1 месец след началото на употреба. Анализът на литературните данни показа, че съдържанието на цитокини в кръвната плазма на здрави хора зависи както от комплектите, използвани за тяхното определяне, така и от региона, в който живеят тези хора. Ето защо, за да се определят стойностите на нормалните концентрации на цитокини при жителите на нашия регион, беше направен анализ на случайни плазмени проби (от 80 до 400 проби) на практически здрави кръводарители, представители на различни социални групи на възраст 18 години. до 60 години без клинични прояви на груба соматична патология и липса на HBsAg, антитела срещу HIV, вируси на хепатит В и С.

Фактор на туморна некроза-алфа.

TNF-алфа е плейотропен провъзпалителен цитокин, състоящ се от две удължени b-вериги с молекулно тегло 17 kDa и изпълняващ регулаторни и ефекторни функции в имунния отговор и възпалението. Основните производители на алфа-TNF са моноцитите и макрофагите. Този цитокин също се секретира от лимфоцити и кръвни гранулоцити, естествени убийци, Т-лимфоцитни клетъчни линии. Основните индуктори на алфа-TNF са вируси, микроорганизми и техните метаболитни продукти, включително бактериален липополизахарид. В допълнение, някои цитокини, като IL-1, IL-2, гранулоцитно-макрофагов колониестимулиращ фактор, алфа- и бета-IFN, също могат да играят ролята на индуктори. Основните направления на биологичната активност на алфа-TNF: проявява селективна цитотоксичност срещу определени туморни клетки; активира гранулоцити, макрофаги, ендотелни клетки, хепатоцити (производство на протеини в острата фаза), остеокласти и хондроцити (резорбция на костна и хрущялна тъкан), синтез на други провъзпалителни цитокини; стимулира пролиферацията и диференциацията на: неутрофили, фибробласти, ендотелни клетки (ангиогенеза), хематопоетични клетки, Т- и В-лимфоцити; засилва потока на неутрофили от костния мозък в кръвта; има антитуморна и антивирусна активност in vivo и in vitro; участва не само в защитните реакции, но и в процесите на разрушаване и възстановяване, съпътстващи възпалението; служи като един от медиаторите на разрушаването на тъканите, често срещано при дълготрайно, хронично възпаление.

Ориз. 1. Разпределение на нивото на алфа-TNF

в плазмата на здрави донори.

Повишено ниво на алфа-TNF се наблюдава в кръвния серум по време на посттравматично състояние, с белодробни дисфункции, нарушения на нормалния ход на бременността, онкологични заболявания и бронхиална астма. Нивото на алфа-TNF 5-10 пъти по-високо от нормалното се наблюдава по време на обостряне на хроничната форма на вирусен хепатит С. По време на периода на обостряне на заболявания на стомашно-чревния тракт концентрацията на алфа-TNF в серума надвишава нормата с средно 10 пъти, а при някои пациенти - 75–80 пъти. Високи концентрации на алфа-TNF се откриват в цереброспиналната течност на пациенти с множествена склероза и цереброспинален менингит, а при пациенти с ревматоиден артрит - в синовиалната течност. Това предполага участието на алфа-TNF в патогенезата на редица автоимунни заболявания. Честотата на откриване на алфа-TNF в кръвния серум, дори при тежко възпаление, не надвишава 50%, при индуцирано и спонтанно производство - до 100%. Диапазонът на концентрациите на алфа-TNF е 0–6 pg/ml, средната стойност е 1,5 pg/ml (фиг. 1).

Гама интерферон.

Ориз. 2. Разпределение на нивото на гама-INF

в плазмата на здрави донори.

Интерлевкин-4

IL-4 е гликопротеин с молекулно тегло 18–20 kD, естествен инхибитор на възпалението. Заедно с гама-IFN, IL-4 е ключов цитокин, продуциран от Т клетки (главно TH-2 лимфоцити). Поддържа баланс TH-1/TH-2. Основните направления на биологичната активност на IL-4: засилва еозинофилията, натрупването на мастоцити, секрецията на IgG4, хуморалния имунен отговор, медииран от TH-2 клетки; има локална антитуморна активност, стимулирайки популацията на цитотоксични Т-лимфоцити и туморна инфилтрация от еозинофили; инхибира освобождаването на възпалителни цитокини (алфа-TNF, IL-1, IL-8) и простагландини от активирани моноцити, производството на цитокини от TH-1 лимфоцити (IL-2, гама-IFN и др.).

Ориз. 3. Разпределение на нивото на IL-4 в плазмата

здрави донори.

Повишени нива на IL-4 както в серума, така и в стимулираните лимфоцити могат да се наблюдават при алергични заболявания (особено по време на обостряне), като бронхиална астма, алергичен ринит, сенна хрема, атопичен дерматит и заболявания на стомашно-чревния тракт. Нивото на IL-4 също е значително повишено при пациенти с хроничен хепатит С (CHC). По време на периоди на обостряне на CHC количеството му се увеличава почти 3 пъти в сравнение с нормата, а по време на ремисия на CHC нивото на IL-4 намалява, особено на фона на продължаващото лечение с рекомбинантен IL-2. Диапазонът на концентрациите на IL-4 е 0–162 pg/ml, средната стойност е 6,9 pg/ml, нормалният диапазон е 0–20 pg/ml (фиг. 3).

Интерлевкин-8

IL-8 се отнася до хемокини, представлява протеин с молекулно тегло 8 kD. IL-8 се произвежда от мононуклеарни фагоцити, полиморфонуклеарни левкоцити, ендотелни клетки и други видове клетки в отговор на различни стимули, включително бактерии и вируси и техните метаболитни продукти, включително провъзпалителни цитокини (напр. IL-1, TNF- алфа). Основната роля на интерлевкин-8 е да засили хемотаксиса на левкоцитите. Той играе важна роля както при остро, така и при хронично възпаление. Повишено ниво на IL-8 се наблюдава при пациенти с бактериални инфекции, хронични белодробни заболявания и заболявания на стомашно-чревния тракт. Плазмените нива на IL-8 са повишени при пациенти със сепсис и високите му концентрации корелират с повишена смъртност. Резултатите от измерването на съдържанието на IL-8 могат да се използват за проследяване на хода на лечението и прогнозиране на изхода от заболяването. По този начин е установено повишено съдържание на IL-8 в слъзната течност при всички пациенти с благоприятен ход на язви на роговицата. При всички пациенти със сложен ход на язва на роговицата концентрацията на IL-8 е 8 пъти по-висока, отколкото при пациенти с благоприятен ход на заболяването. По този начин съдържанието на провъзпалителни цитокини (особено IL-8) в слъзната течност при язва на роговицата може да се използва като прогностичен критерий за хода на това заболяване.

Ориз. 4. Разпределение на нивото на IL-8 в

плазма на здрави донори (Новосибирск).

Според наши и литературни данни IL-8 в кръвния серум на здрави хора е изключително рядък; спонтанна продукция на IL-8 от кръвни мононуклеарни клетки се наблюдава при 62%, а индуцирана - при 100% от здравите донори. Диапазонът на концентрация на IL-8 е 0–34 pg/ml, средната стойност е 2 pg/ml, нормалният диапазон е 0–10 pg/ml (фиг. 4).

Ориз. 5. Разпределение на нивото на IL-8 в плазмата

здрави донори (Рубцовск).

Интерлевкин-1 рецепторен антагонист.

IL-1RA принадлежи към цитокините и е олигопептид с молекулно тегло 18–22 kD. IL-1RA е ендогенен инхибитор на IL-1, произведен от макрофаги, моноцити, неутрофили, фибробласти и епителни клетки. IL-1RA инхибира биологичната активност на интерлевкините IL-1алфа и IL-1бета, конкурирайки се с тях за свързване с клетъчния рецептор.

Ориз. 6. Разпределение на нивото на IL-1RA

в плазмата на здрави донори

Производството на IL-1RA се стимулира от много цитокини, вирусни продукти и протеини от острата фаза. IL-1RA може да се експресира активно във възпалителни огнища при много хронични заболявания: ревматоиден и ювенилен хроничен артрит, системен лупус еритематозус, исхемични мозъчни лезии, възпалителни заболявания на червата, бронхиална астма, пиелонефрит, псориазис и др. При сепсис се отбелязва най-високото увеличение на IL-1RA - до 55 ng / ml в някои случаи и е установено, че повишените концентрации на IL-1RA корелират с благоприятна прогноза. Високо ниво на IL-1RA се наблюдава при жени, страдащи от висока степен на затлъстяване, като това ниво намалява значително в рамките на 6 месеца след липосукция. Диапазонът на концентрация на IL-1RA е 0–3070 pg/ml, средната стойност е 316 pg/ml. Нормалният диапазон е 50–1000 pg/mL (фиг. 6).

Алфа интерферон.

Алфа-IFN е мономерен негликозилиран протеин с молекулно тегло 18 kDa, който се синтезира главно от левкоцити (В-лимфоцити, моноцити). Този цитокин също може да бъде произведен от практически всеки тип клетка в отговор на подходяща стимулация; вътреклетъчните вирусни инфекции могат да бъдат мощни стимулатори на синтеза на алфа-IFN. Алфа-IFN индукторите включват: вируси и техните продукти, сред които водещо място заема двойноверижната РНК, произведена по време на вирусна репликация, както и бактерии, микоплазми и протозои, цитокини и растежни фактори (като IL-1, IL- 2, алфа-TNF, колонии-стимулиращи фактори и др.). Първоначалната защитна реакция на неспецифичния антибактериален имунен отговор на организма включва индукция на алфа- и бета-IFN. В този случай той се произвежда от антиген-представящи клетки (макрофаги), които са уловили бактериите. Интерфероните (включително алфа-IFN) играят важна роля в неспецифичната част на антивирусния имунен отговор. Те повишават антивирусната резистентност чрез индуциране на синтеза на ензими в клетките, които инхибират образуването на нуклеинови киселини и протеини на вируси. В допълнение, те имат имуномодулиращ ефект, повишават експресията на антигени на основния комплекс за хистосъвместимост в клетките. Установена е промяна в съдържанието на алфа-IFN при хепатит и цироза на черния дроб с вирусна етиология. По време на обостряне на вирусни инфекции концентрацията на този цитокин се повишава значително при повечето пациенти, а по време на периода на възстановяване спада до нормално ниво. Доказана е връзката между серумното ниво на алфа-IFN и тежестта и продължителността на грипната инфекция.

Ориз. 7. Разпределение на нивото на алфа-INF

в плазмата на здрави донори.

Увеличаване на концентрацията на алфа-IFN се отбелязва в серума на повечето пациенти, страдащи от автоимунни заболявания като полиартрит, ревматоиден артрит, спондилоза, псориатичен артрит, ревматична полимиалгия и склеродермия, системен лупус еритематозус и системен васкулит. Високо ниво на този интерферон се наблюдава и при някои пациенти по време на обостряне на пептична язва и холелитиаза. Диапазонът на концентрациите на алфа-IFN е 0–93 pg/ml, средната стойност е 20 pg/ml. Нормалните стойности са до 45 pg/ml (фиг. 7).

Антитела срещу алфа-IFN.

Антитела срещу алфа-IFN могат да бъдат открити в серума на пациенти със соматичен лупус еритематозус. Спонтанна индукция на антитела към алфа-IFN се наблюдава и в серума на пациенти с различни форми на рак. В някои случаи са открити антитела срещу алфа-IFN в серума на пациенти с ХИВ, както и в цереброспиналната течност и серума на пациенти с менингит по време на острата фаза, в серума на пациенти с хроничен полиартрит.

Ориз. 8. Разпределение на нивото на антителата към алфа-IFN

в плазмата на здрави донори.

Алфа-IFN е едно от ефективните антивирусни и противотуморни терапевтични лекарства, но продължителното му приложение може да доведе до производството на специфични антитела срещу алфа-IFN. Това намалява ефективността на лечението и в някои случаи причинява различни странични ефекти: от грипоподобни до развитие на автоимунни заболявания. Поради това по време на INF-терапията е важно да се контролира нивото на антитела срещу алфа-IFN в тялото на пациента. Образуването им зависи от вида на използваното в терапията лекарство, продължителността на лечението и вида на заболяването. Обхватът на концентрациите на антитела срещу алфа-IFN е 0–126 ng/ml, средната стойност е 6,2 ng/ml. Нормалните граници са до 15 ng/mL (фиг. 8). Оценката на нивото на цитокините с помощта на комплекти реагенти, произведени в търговската мрежа от CJSC "Vector-Best", позволява нов подход към изследването на състоянието на имунната система на организма в клиничната практика.

Имунотропни лекарства на базата на цитокини.

Интересна работа. С. Симбирцева, Държавен научноизследователски институт за високочисти биопрепарати на Министерството на здравеопазването на Русия, Санкт Петербург).нарушаване на целостта на тъканите. Този нов клас регулаторни молекули е създаден от природата в хода на милиони години еволюция и има неограничен потенциал за използване като лекарства. В рамките на имунната система цитокините медиират връзката между неспецифичните защитни реакции и специфичния имунитет, като действат и в двете посоки. На ниво организъм цитокините комуникират между имунната, нервната, ендокринната, хематопоетичната и други системи и служат за включването им в организирането и регулирането на защитните реакции. Интензивното изследване на цитокините винаги е било водено от обещаващата перспектива за тяхното клинично използване при лечението на широко разпространени заболявания, включително рак, инфекциозни и имунодефицитни заболявания. В Русия са регистрирани няколко цитокинови препарата, включително интерферони, колониестимулиращи фактори, интерлевкини и техните антагонисти, фактор на туморна некроза. Всички цитокинови препарати могат да бъдат разделени на естествени и рекомбинантни. Естествени са препарати с различна степен на пречистване, получени от културална среда на стимулирани еукариотни клетки, предимно човешки клетки. Основните недостатъци са ниската степен на пречистване, невъзможността за стандартизация поради големия брой компоненти и използването на кръвни съставки в производството. Очевидно бъдещето на цитокиновата терапия е свързано с генетично модифицирани лекарства, получени с помощта на най-новите постижения в биотехнологиите. През последните две десетилетия гените на повечето цитокини са клонирани и са получени рекомбинантни аналози, които напълно повтарят биологичните свойства на естествените молекули. В клиничната практика има три основни области на използване на цитокините:

1) цитокинова терапия за активиране на защитните реакции на организма, имуномодулация или за компенсиране на липсата на ендогенни цитокини,

2) антицитокинова имуносупресивна терапия, насочена към блокиране на биологичното действие на цитокините и техните рецептори,

3) цитокинова генна терапия за повишаване на антитуморния имунитет или коригиране на генетични дефекти в цитокиновата система.

Редица цитокини могат да се използват в клиниката за системна и локална употреба. Системното приложение се оправдава в случаите, когато е необходимо да се осигури действието на цитокини в няколко органа за по-ефективно активиране на имунитета или да се активират целеви клетки, разположени в различни части на тялото. В други случаи локалното приложение има редица предимства, тъй като позволява достигане на висока локална концентрация на активния компонент, насочване към целевия орган и избягване на нежелани системни прояви. Понастоящем цитокините се считат за едно от най-обещаващите лекарства за използване в клиничната практика.

Заключение.

По този начин в момента няма съмнение, че цитокините са най-важните фактори на имунопатогенезата. Изследването на нивото на цитокините позволява получаване на информация за функционалната активност на различни видове имунокомпетентни клетки, съотношението на процесите на активиране на Т-хелперни типове I и II, което е много важно при диференциалната диагноза на редица инфекциозни и имунопатологични процеси. Цитокините са специфични протеини, с които клетките на имунната система могат да обменят информация помежду си и да си взаимодействат. Днес са открити повече от сто различни цитокини, които условно се разделят на провъзпалителни (провокиращи възпаление) и противовъзпалителни (предотвратяващи възпалението). И така, различните биологични функции на цитокините са разделени на три групи: те контролират развитието и хомеостазата на имунната система, контролират растежа и диференциацията на кръвните клетки (система на хематопоезата) и участват в неспецифични защитни реакции на тялото. , повлияване на възпалението, съсирването на кръвта, кръвното налягане.

Списък на използваната литература.

С.В. Белмер, А.С. Симбирцев, О.В. Головенко, Л.В. Бубнова, Л.М. Карпина, Н.Е. Щиголева, Т.Л. Михайлов. /Руски държавен медицински университет, Държавен изследователски център по колопроктология, Москва и Държавен научноизследователски институт за високочисти биологични продукти, Санкт Петербург.

С.В. Сенников, А.Н. Силков // сп. "Цитокини и възпаление", 2005, № 1 Т. 4, № 1. С. 22-27.

Т.Г. Рябичева, Н.А. Вараксин, Н.В. Тимофеева, М.Ю. Рукавишников, материали от ZAO Vector-Best.

А. С. Симбирцев, Държавен научноизследователски институт за високочисти биопрепарати към Министерството на здравеопазването на Русия, Санкт Петербург.

Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S. Държавен научноизследователски институт за високочисти биопрепарати, Санкт Петербург.

Т. А. Шуматова, В. Б. Шуматов, Е. В. Маркелова, Л. Г. Сухотеплая. Катедра по анестезиология и интензивно лечение, Владивостокски държавен медицински университет.

В работата са използвани материали от сайта http://humbio.ru/humbio/spid/000402c2.htm

някои патогени на инфекциозни заболявания. И така, норсулфазол...

1. Молекулярни и клетъчни механизми на антивирусния имунитет, модели на развитие и имунопатология

   Резюме >> Медицина, здраве

   ... "сайт" се отнася до конкретен сайт определениполипептид (антиген), с който ... ранните му стадии. цитокинии хемокини. други цитокини, в допълнение към интерфероните, ... произведени от тях за единица време цитокиниопределя интензивността на разпространението и...

2. Изследване на причините за фиброза на костния мозък при миелопролиферативни заболявания чрез анализиране на ефекта на тромбоцитните фактори върху мезенхимните стволови клетки

   Домашна >> Медицина, здраве

   Различна концентрация; - количествени определениепротеин в експериментални системи, ... водят до продължително действие цитокин, което засилва процеса на фиброза ... тромбоцитите. Също така, по-високо съдържание цитокиннамерени в урината...

3. Патогенезата на туберкулозата при хората

   Резюме >> Медицина, здраве

   Но е възможно и хранително. определенииграе роля в аерогенната инфекция ... играе, секретиран от макрофаги и моноцити цитокин– тумор некрозис фактор (TNFα). ... йони, всяка клетка има определенитранспортна система...

МЕТОДИ ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЦИТОКИНИ

С.В. Сенников, А.Н. Силков

Обзорът е посветен на основните методи за изследване на цитокини, използвани в момента. Накратко се характеризират възможностите и предназначението на методите. Представени са предимствата и недостатъците на различни подходи за анализ на експресията на цитокинов ген на ниво нуклеинови киселини и на ниво производство на протеини. (Цитокини и възпаление. 2005. Т. 4, № 1. С. 22-27.)

Ключови думи:преглед, цитокини, методи за определяне.

Въведение

Цитокините са регулаторни протеини, които образуват универсална мрежа от медиатори, характерни както за имунната система, така и за клетките на други органи и тъкани. Под контрола на този клас регулаторни протеини се случват всички клетъчни събития: пролиферация, диференциация, апоптоза и специализирана функционална активност на клетките. Ефектите на всеки цитокин върху клетките се характеризират с плейотропия, спектърът от ефекти на различните медиатори се припокрива и като цяло крайното функционално състояние на клетката зависи от влиянието на няколко цитокини, действащи синергично. По този начин цитокиновата система е универсална, полиморфна регулаторна мрежа от медиатори, предназначена да контролира процесите на пролиферация, диференциация, апоптоза и функционалната активност на клетъчните елементи в хематопоетичните, имунните и други хомеостатични системи на тялото.

Измина малко време от описанието на първите цитокини. Въпреки това, тяхното изследване доведе до разпределянето на обширна част от знанието - цитокинология, която е неразделна част от различни области на знанието и на първо място имунологията, която даде мощен тласък на изучаването на тези медиатори. Цитокинологията прониква във всички клинични дисциплини, вариращи от етиологията и патогенезата на заболяванията до профилактиката и лечението на различни патологични състояния. Следователно, изследователите и клиницистите трябва да се ориентират в разнообразието от регулаторни молекули и да имат ясно разбиране за ролята на всеки от цитокините в процесите, които се изследват.

Методите за определяне на цитокини в продължение на 20 години интензивно изследване са претърпели много бърза еволюция и днес представляват цяла област на научното познание. В началото на работата изследователите в цитокинологията са изправени пред въпроса за избор на метод. И тук изследователят трябва да знае точно каква информация трябва да получи, за да постигне целта си. В момента са разработени стотици различни методи за оценка на цитокиновата система, които предоставят разнообразна информация за тази система. Цитокините могат да бъдат оценени в различни биологични среди чрез тяхната специфична биологична активност. Те могат да бъдат количествено определени с помощта на различни методи за имуноанализ, използващи поли- и моноклонални антитела. В допълнение към изучаването на секреторните форми на цитокините, може да се изследва тяхното вътреклетъчно съдържание и продукция в тъканите чрез поточна цитометрия, Western blotting и in situ имунохистохимия. Много важна информация може да бъде получена чрез изследване на експресията на цитокинова иРНК, стабилността на иРНК, наличието на цитокинови иРНК изоформи и естествени антисенс нуклеотидни последователности. Изследването на алелни варианти на цитокиновите гени може да предостави важна информация за генетично програмираното високо или ниско производство на определен медиатор. Всеки метод има своите предимства и недостатъци, собствена разделителна способност и точност на определяне. Незнанието и неразбирането на тези нюанси от страна на изследователя може да го доведе до неверни заключения.

Определяне на биологичната активност на цитокините

Историята на откритието и първите стъпки в изследването на цитокините е тясно свързана с култивирането на имунокомпетентни клетки и клетъчни линии. Тогава бяха показани регулаторните ефекти (биологична активност) на редица разтворими протеинови фактори върху пролиферативната активност на лимфоцитите, върху синтеза на имуноглобулини и върху развитието на имунни отговори в in vitro модели. Един от първите методи за определяне на биологичната активност на медиаторите е определянето на фактора на миграция на човешки лимфоцити и неговия фактор на инхибиране. С изучаването на биологичните ефекти на цитокините се появиха и различни методи за оценка на тяхната биологична активност. Така IL-1 се определя чрез оценка на пролиферацията на миши тимоцити in vitro, IL-2 - чрез способността да стимулира пролиферативната активност на лимфобластите, IL-3 - чрез растежа на хемопоетични колонии in vitro, IL-4 - чрез комитогенният ефект, чрез повишена експресия на Ia протеини, чрез индуциране на образуването на IgG1 и IgE и др. . Списъкът на тези методи може да бъде продължен, той непрекъснато се актуализира, тъй като се откриват нови биологични активности на разтворими фактори. Основният им недостатък е нестандартността на методите, невъзможността за тяхното унифициране. По-нататъшното развитие на методите за определяне на биологичната активност на цитокините доведе до създаването на голям брой клетъчни линии, чувствителни към един или друг цитокин, или мултичувствителни линии. Повечето от тези чувствителни към цитокини клетки вече могат да бъдат намерени в списъци с разпространени в търговската мрежа клетъчни линии. Например, за тестване на IL-1a и b се използва клетъчната линия D10S, за IL-2 и IL-15 се използва клетъчната линия CTLL-2, за IL-3, IL-4, IL-5, IL -9, IL-13, GM-CSF - клетъчна линия TF-1, за IL-6 - клетъчна линия B9, за IL-7 - клетъчна линия 2E8, за TNFa и TNFb - клетъчна линия L929, за IFNg - клетъчна линия WiDr , за IL-18 - клетъчна линия линия KG-1.

Въпреки това, такъв подход към изследването на имуноактивни протеини, заедно с добре известни предимства, като измерване на реалната биологична активност на зрели и активни протеини, висока възпроизводимост при стандартизирани условия, има своите недостатъци. Те включват, на първо място, чувствителността на клетъчните линии не към един цитокин, а към няколко свързани цитокини, чиито биологични ефекти се припокриват. Освен това не може да се изключи възможността за индуциране на производството на други цитокини от клетки-мишени, което може да наруши тестовия параметър (като правило това са пролиферация, цитотоксичност, хемотаксис). Все още не знаем всички цитокини и не всичките им ефекти, така че оценяваме не самия цитокин, а общата специфична биологична активност. По този начин оценката на биологичната активност като обща активност на различни медиатори (недостатъчна специфичност) е един от недостатъците на този метод. Освен това, използвайки чувствителни към цитокини линии, не е възможно да се открият неактивирани молекули и свързани протеини. Това означава, че такива методи не отразяват реалното производство на редица цитокини. Друг важен недостатък на използването на клетъчни линии е необходимостта от лаборатория за клетъчни култури. В допълнение, всички процедури за отглеждане на клетки и инкубирането им с изследваните протеини и среда изискват много време. Трябва също да се отбележи, че дългосрочната употреба на клетъчни линии изисква подновяване или повторно сертифициране, тъй като в резултат на култивирането те могат да мутират и да бъдат модифицирани, което може да доведе до промяна в тяхната чувствителност към медиатори и намаляване на точността за определяне на биологичната активност. Въпреки това, този метод е идеален за тестване на специфичната биологична активност на рекомбинантни медиатори.

Количествено определяне на цитокини с помощта на антитела

Цитокините, произведени от имунокомпетентни и други видове клетки, се освобождават в междуклетъчното пространство за паракринни и автокринни сигнални взаимодействия. Чрез концентрацията на тези протеини в кръвния серум или в кондиционирана среда може да се прецени естеството на патологичния процес и излишъкът или дефицитът на определени клетъчни функции при пациента.

Методите за определяне на цитокини с помощта на специфични антитела в момента са най-разпространените системи за откриване на тези протеини. Тези методи преминаха през цяла поредица от модификации, използвайки различни етикети (радиоизотопни, флуоресцентни, електрохемилуминесцентни, ензимни и др.). Ако радиоизотопните методи имат редица недостатъци, свързани с използването на радиоактивен етикет и ограниченото време за използване на белязани реагенти (полуживот), тогава най-широко използвани са методите за ензимен имуноанализ. Те се основават на визуализация на неразтворими продукти от ензимна реакция, които абсорбират светлина с известна дължина на вълната в количества, еквивалентни на концентрацията на аналита. Антитела, покрити върху твърда полимерна основа, се използват за свързване на веществата, които трябва да бъдат измерени, и за изобразяване, антитела, конюгирани с ензими, обикновено алкална фосфатаза или пероксидаза от хрян.

Предимствата на метода са очевидни: това е висока точност на определяне при стандартизирани условия за съхранение на реактиви и извършване на процедури, количествен анализ и възпроизводимост. Недостатъците включват ограничения диапазон на определяните концентрации, в резултат на което всички концентрации, превишаващи определен праг, се считат за равни на него. Трябва да се отбележи, че времето, необходимо за изпълнение на метода, варира в зависимост от препоръките на производителя. При всички случаи обаче говорим за няколко часа, необходими за инкубиране и промиване на реагентите. Освен това се определят латентни и свързани форми на цитокини, които в концентрацията си могат значително да надвишават свободните форми, главно отговорни за биологичната активност на медиатора. Поради това е желателно този метод да се използва заедно с методи за оценка на биологичната активност на медиатора.

Друга модификация на метода за имуноанализ, намерила широко приложение, е електрохемилуминесцентният метод (ECL) за определяне на протеини с антитела, маркирани с рутений и биотин. Този метод има следните предимства в сравнение с радиоизотопните и ензимните имуноанализи: лекота на прилагане, кратко време на процедурата, липса на процедури за измиване, малък обем на пробата, голям диапазон на определени концентрации на цитокини в серума и в кондиционирана среда, висока чувствителност на метода и неговата възпроизводимост. Разглежданият метод е приемлив за използване както в научните изследвания, така и в клиниката.

Следният метод за оценка на цитокини в биологична среда се основава на технологията на поточна флуорометрия. Позволява ви едновременно да оцените до сто протеина в проба. Понастоящем са създадени търговски комплекти за определяне на до 17 цитокини. Предимствата на този метод обаче определят и неговите недостатъци. Първо, това е трудоемкостта на избора на оптимални условия за определяне на няколко протеина, и второ, производството на цитокини е каскадно с пикове на производство в различно време. Следователно определянето на голям брой протеини едновременно не винаги е информативно.

Общото изискване на методите за имуноанализ, използващи т.нар. "сандвич" е внимателен подбор на двойка антитела, което ви позволява да определите свободната или свързаната форма на анализирания протеин, което налага ограничения на този метод и което винаги трябва да се взема предвид при интерпретирането на получените данни . Тези методи определят общото производство на цитокини от различни клетки, докато в същото време антиген-специфичното производство на цитокини от имунокомпетентни клетки може да се прецени само условно.

В момента е разработена системата ELISpot (Enzyme-Liked ImmunoSpot), която до голяма степен елиминира тези недостатъци. Методът позволява полуколичествена оценка на производството на цитокини на ниво отделни клетки. Високата разделителна способност на този метод дава възможност да се оцени антиген-стимулираното производство на цитокини, което е много важно за оценка на специфичен имунен отговор.

Следващият, широко използван за научни цели метод е вътреклетъчното определяне на цитокини чрез поточна цитометрия. Предимствата му са очевидни. Можем фенотипно да характеризираме популация от цитокин-продуциращи клетки и/или да определим спектъра на цитокините, произведени от отделни клетки, и е възможно относително да характеризираме това производство. Описаният метод обаче е доста сложен и изисква скъпо оборудване.

Следващата серия от методи, които се използват предимно за научни цели, са имунохистохимичните методи, използващи белязани моноклонални антитела. Предимствата са очевидни - определяне на производството на цитокини директно в тъканите (in situ), където протичат различни имунологични реакции. Разглежданите методи обаче са много трудоемки и не дават точни количествени данни.

И имунорегулация, които се секретират от неендокринни клетки (главно имунни) и имат локален ефект върху съседни таргетни клетки.

Цитокините регулират междуклетъчните и междусистемните взаимодействия, определят оцеляването на клетките, стимулирането или потискането на техния растеж, диференциация, функционална активност и апоптоза, а също така осигуряват координацията на действието на имунната, ендокринната и нервната системи на клетъчно ниво при нормални условия и в отговор на патологични влияния.

Важна характеристика на цитокините, която ги отличава от другите биолиганди, е, че те не се произвеждат "в резерв", не се отлагат, не циркулират дълго време през кръвоносната система, а се произвеждат "при поискване", живеят кратко време и имат локален ефект върху най-близките клетки.-мишени.

Цитокините, заедно с клетките, които ги произвеждат, се образуват "микроендокринна система" , който осигурява взаимодействието на клетките на имунната, хематопоетичната, нервната и ендокринната системи. Образно може да се каже, че с помощта на цитокините клетките на имунната система комуникират помежду си и с останалите клетки на тялото, като предават команди от клетките, произвеждащи цитокини, за промяна на състоянието на таргетните клетки. И от тази гледна точка цитокините могат да бъдат наречени за имунната система "цитотрансмитери", "цитотрансмитери" или "цитомодулатори"по аналогия с невротрансмитерите, невротрансмитерите и невромодулаторите на нервната система.

Терминът "цитокини" е предложен от S. Cohen през 1974 г.

цитокини заедно с растежни фактори Препоръчай на хистохормони (тъканни хормони) .

Функции на цитокините

1. Провъзпалителни, т.е. допринасящи за възпалителния процес.

2. Противовъзпалително, т.е. инхибиране на възпалителния процес.

3. Растеж.

4. Диференциация.

5. Регулаторен.

6. Активиране.

Видове цитокини

1. Интерлевкини (IL) и тумор некрозисфактор (TNF)
2. Интерферони.
3. Малки цитокини.
4. Колониостимулиращи фактори (CSF).

Функционална класификация на цитокините

1. Провъзпалителни, осигуряващи мобилизиране на възпалителния отговор (интерлевкини 1,2,6,8, TNFα, интерферон γ).
2. Противовъзпалително, ограничаващо развитието на възпаление (интерлевкини 4,10, TGFβ).
3. Регулатори на клетъчния и хуморален имунитет (естествен или специфичен), които имат собствени ефекторни функции (антивирусни, цитотоксични).

Механизмът на действие на цитокините

Цитокините се секретират от активирана цитокин-продуцираща клетка и взаимодействат с рецепторите на прицелните клетки в съседство с нея. Така се предава сигнал от една клетка към друга под формата на пептидно контролно вещество (цитокин), което предизвиква по-нататъшни биохимични реакции в нея. Лесно е да се види, че цитокините по своя механизъм на действие са много подобни на невромодулатори, но само те се отделят не от нервните клетки, а имунитет и някои други.

Цитокините са активни при много ниски концентрации, тяхното образуване и секреция е преходно и силно регулирано.
Повече от 30 цитокина са били известни през 1995 г. и повече от 200 през 2010 г.

Цитокините нямат строга специализация: един и същ процес може да бъде стимулиран в клетката-мишена от различни цитокини. В много случаи се наблюдава синергизъм в действията на цитокините, т.е. взаимно подсилване. Цитокините нямат антигенна специфичност. Следователно специфичната диагноза на инфекциозни, автоимунни и алергични заболявания чрез определяне на нивото на цитокини не е възможна. Но в медицината определянето на тяхната концентрация в кръвта дава информация за функционалната активност на различни видове имунокомпетентни клетки; за тежестта на възпалителния процес, прехода му към системно ниво и прогнозата на заболяването.
Цитокините действат върху клетките, като се свързват с техните повърхностни рецептори. Свързването на цитокина с рецептора води през серия от междинни стъпки до активирането на съответните гени. Чувствителността на таргетните клетки към действието на цитокините варира в зависимост от броя на цитокиновите рецептори на тяхната повърхност. Времето за синтез на цитокини, като правило, е кратко: ограничаващият фактор е нестабилността на молекулите на иРНК. Някои цитокини (напр. растежни фактори) се произвеждат спонтанно, но повечето цитокини се секретират индуцирани.

Синтезът на цитокини се индуцира най-често от микробни компоненти и продукти (например бактериален ендотоксин). В допълнение, един цитокин може да служи като индуктор за синтеза на други цитокини. Например, интерлевкин-1 индуцира производството на интерлевкини-6, -8, -12, което осигурява каскадния характер на цитокиновия контрол. Биологичните ефекти на цитокините се характеризират с полифункционалност или плейотропия. Това означава, че един и същ цитокин проявява многопосочна биологична активност и в същото време различни цитокини могат да изпълняват една и съща функция. Това осигурява граница на безопасност и надеждност на системата за хеморегулация на цитокини. Със съвместен ефект върху клетките цитокините могат да действат като синергисти, и като антагонисти.

Цитокините са регулаторни пептиди, произвеждани от клетките на тялото. Такава широка дефиниция е неизбежна поради хетерогенността на цитокините, но изисква допълнително изясняване. Първо, цитокините включват прости полипептиди, по-сложни молекули с вътрешни дисулфидни връзки и протеини, състоящи се от две или повече идентични или различни субединици с молекулно тегло от 5 до 50 kDa. Второ, цитокините са ендогенни медиатори, които могат да се синтезират от почти всички ядрени клетки на тялото, а гените на някои цитокини се експресират във всички клетки на тялото без изключение.
Цитокиновата система в момента включва около 200 отделни полипептидни вещества. Всички те имат редица общи биохимични и функционални характеристики, сред които следните се считат за най-важни: плейотропия и взаимозаменяемост на биологичното действие, липса на антигенна специфичност, предаване на сигнал чрез взаимодействие със специфични клетъчни рецептори и образуването на цитокин мрежа. В тази връзка цитокините могат да бъдат изолирани в нова независима система за регулиране на функциите на тялото, съществуваща заедно с нервната и хормоналната регулация.
Очевидно формирането на системата за регулиране на цитокините еволюира заедно с развитието на многоклетъчните организми и се дължи на необходимостта от образуване на медиатори на междуклетъчно взаимодействие, което може да включва хормони, невропептиди и адхезионни молекули. В това отношение цитокините са най-универсалната регулаторна система, тъй като те могат да проявяват биологична активност както дистанционно след секреция от клетката продуцент (локално и системно), така и по време на междуклетъчен контакт, като са биологично активни под формата на мембранна форма. Тази система от цитокини се различава от адхезионните молекули, които изпълняват по-тесни функции само при директен клетъчен контакт. В същото време цитокиновата система се различава от хормоните, които се синтезират главно от специализирани органи и действат след навлизане в кръвоносната система.
Цитокините имат плейотропни биологични ефекти върху различни видове клетки, като основно участват във формирането и регулирането на защитните реакции на организма. Защитата на локално ниво се развива чрез формирането на типична възпалителна реакция след взаимодействието на патогени с рецептори за разпознаване на модели (мембранни Toll рецептори) с последващ синтез на така наречените провъзпалителни цитокини. Синтезирани във фокуса на възпалението, цитокините засягат почти всички клетки, участващи в развитието на възпалението, включително гранулоцити, макрофаги, фибробласти, ендотелни и епителни клетки, а след това върху Т- и В-лимфоцити.

В рамките на имунната система цитокините медиират връзката между неспецифичните защитни реакции и специфичния имунитет, като действат и в двете посоки. Пример за цитокинова регулация на специфичния имунитет е диференциацията и поддържането на баланс между Т-лимфоцитите, помощници от 1-ви и 2-ри тип. В случай на неуспех на локалните защитни реакции цитокините навлизат в кръвообращението и тяхното действие се проявява на системно ниво, което води до развитие на острофазов отговор на ниво организъм. В същото време цитокините засягат почти всички органи и системи, участващи в регулацията на хомеостазата. Действието на цитокините върху централната нервна система води до промяна в целия комплекс от поведенчески реакции, синтеза на повечето хормони, белтъчините в острата фаза в черния дроб, експресията на гени за фактори на растеж и диференциация, промяна в йонния състав на плазмата. . Въпреки това, нито една от промените, които се случват, не е случайна: всички те са или необходими за директното активиране на защитните реакции, или са полезни по отношение на превключването на енергийните потоци само за една задача - борбата срещу нахлуващия патоген. На нивото на тялото цитокините комуникират между имунната, нервната, ендокринната, хемопоетичната и други системи и служат за включването им в организирането и регулирането на една защитна реакция. Цитокините просто служат като организираща система, която формира и регулира целия комплекс от патофизиологични промени по време на въвеждането на патогени.
През последните години стана ясно, че регулаторната роля на цитокините в организма не се ограничава до имунния отговор и може да бъде разделена на четири основни компонента:
Регулиране на ембриогенезата, полагането и развитието на редица органи, включително органи на имунната система.
Регулиране на определени нормални физиологични функции, като нормална хемопоеза.
Регулиране на защитните реакции на организма на локално и системно ниво.
Регулиране на процесите на регенерация за възстановяване на увредените тъкани.
Цитокините включват интерферони, колонии-стимулиращи фактори (CSF), хемокини, трансформиращи растежни фактори; фактор на туморна некроза; интерлевкини с установени исторически серийни номера и някои други. Интерлевкините със серийни номера, започващи от 1, не принадлежат към една подгрупа цитокини, свързани с обща функция. Те от своя страна могат да бъдат разделени на провъзпалителни цитокини, фактори на растежа и диференциацията на лимфоцитите и отделни регулаторни цитокини. Името "интерлевкин" се присвоява на новооткрит медиатор, ако са изпълнени следните критерии, разработени от номенклатурния комитет на Международния съюз на имунологичните дружества: молекулярно клониране и експресия на гена на изследвания фактор, наличието на уникален нуклеотид и съответстваща му аминокиселинна последователност, като се получават неутрализиращи моноклонални антитела. В допълнение, новата молекула трябва да се произвежда от клетки на имунната система (лимфоцити, моноцити или други видове левкоцити), да има важна биологична функция в регулацията на имунния отговор и допълнителни функции, поради които не може да бъде дадена функционално име. И накрая, изброените свойства на новия интерлевкин трябва да бъдат публикувани в рецензирана научна публикация.
Класификацията на цитокините може да се извърши според техните биохимични и биологични свойства, както и според видовете рецептори, чрез които цитокините изпълняват своите биологични функции. Класификацията на цитокините по структура (Таблица 1) взема предвид не само аминокиселинната последователност, но преди всичко третичната структура на протеина, която по-точно отразява еволюционния произход на молекулите.