Същността на фагоцитозата може да се опише само с няколко думи. В този процес специални фагоцитни клетки "изчисляват", поглъщат и усвояват вредните частици, попаднали в тялото, главно инфекции. Целта на феномена е да ни предпази от потенциални патогени, токсини и т.н. И как точно се осъществява механизмът на фагоцитозата? Той преминава през няколко етапа, които ще бъдат разгледани по-подробно по-долу.

Етапи на фагоцитоза:

Хемотаксис

Зловреден обект влиза в тялото и остава незабелязан там за кратко време. Този обект, било то бактерия, чуждо тяло или нещо друго, отделя специални вещества (хемоатрактанти) и директно влиза в контакт с кръвта или тъканите. Всичко това кара тялото да осъзнае наличието на агресор в него.

Възниква каскада от биохимични реакции. В първия етап на фагоцитозата мастоцитите отделят специални съединения в кръвта, които предизвикват възпалителна реакция. Началото на възпалителния процес "събужда" макрофагите и другите фагоцитни клетки от състояние на покой. Неутрофилите, улавяйки присъствието на хемоатрактанти, бързо излизат от кръвта в тъканите и се втурват да мигрират към възпалителния фокус.

Трудно е да се опише, а още по-трудно е да си го представим, но проникването на патоген в тялото води до стартиране на истински ефект на доминото, който включва стотици (!) различни физиологични явления, протичащи в клетъчните и субклетъчните органи. нива. Състоянието на имунната система на този етап на фагоцитоза може да се сравни със състоянието на разстроен пчелен кошер, когато многобройните му обитатели се готвят да атакуват нарушителя.

Неутрофил - мигриращи фагоцити

Последователността на фагоцитозата продължава с втория етап, реакцията на адхезия. Фагоцитите, които са се приближили до правилното място, разширяват процесите си към патогена, влизат в контакт с него и го разпознават. Те не бързат да атакуват веднага и предпочитат първо да се уверят, че не грешат за „непознатия“. Разпознаването на вреден агент става с помощта на специални рецептори на повърхността на фагоцитните мембрани.

Активиране на мембраната

В третия етап на фагоцитозата в клетките-защитници протичат невидими реакции, които ги подготвят да уловят и унищожат патогена.

Потапяне

Мембраната на фагоцита е течно, пластично вещество, което може да променя формата си. Какво прави, когато клетката срещне злонамерен обект. На снимката се вижда, че фагоцитът протяга своите "пипала" към чуждата частица. След това той постепенно се разпространява около нея, пълзи по нея и напълно я пленява.

Фагоцитът разширява процесите към патогена

Образуване на фагозоми

Когато фагоцитът покрие частица от всички страни, мембраната му се затваря отвън и вътре в клетката остава затворен мехур с атакувания обект вътре. Така клетката сякаш поглъща частицата. Тази везикула се нарича фагозома.

Образуване на фаголизозома (сливане)

Докато протичаха други етапи на фагоцитоза, вътре във фагоцита се подготвяше за използване неговото оръжие - лизозомни органели, съдържащи "храносмилателните" ензими на клетката. Веднага щом бактерия или друг вреден обект бъде уловен от защитна клетка, лизозомите се приближават до него. Техните мембрани се сливат с обвивката, обгръщаща частицата, и съдържанието им се излива в тази „торба“.

Това е най-драматичният момент в целия механизъм на фагоцитозата. Уловеният обект се смила и разгражда от фагоцита.

Отстраняване на продуктите на разцепване

Всичко, което е останало от убитата бактерия или друга смляна частица, се отстранява от клетката. Бившата фаголизозома, която е торбичка с продукти на разграждане, се приближава до външната мембрана на фагоцита и се слива с него. Така остатъците от абсорбирания обект се отстраняват от клетката. Последователността на фагоцитозата завършва

Фагоцитоза (от гръцки phago - поглъщам и cytos - клетка) е процес на усвояване и смилане на антигенни вещества, включително микроорганизми, от клетки от мезодермален произход, т.нар. фагоцити. И. И. Мечников разделя фагоцитите на макрофаги и микрофаги. В момента макро- и микрофагите са обединени в единна система от макрофаги (SMF). Тази система включва:

• тъканни макрофаги - епителни клетки,
• звездовидни ретикулоендотелиоцити (клетки на Купфер),
• алвеоларни и перитонеални макрофаги, разположени в алвеолите и перитонеалната кухина,
• бели процесни епидермоцити на кожата (Лангерхансови клетки) и др.

Микрофагите включват:

• неутрофили,
• еозинофили,
• базофили.

Функции на макрофагитеизключително разнообразен. Те са първите, които реагират на чуждо вещество, като са специализирани клетки, които абсорбират и унищожават чужди вещества в тялото (умиращи клетки, ракови клетки, бактерии, вируси и други микроорганизми, антигени, неметаболизиращи се неорганични вещества). В допълнение, макрофагите произвеждат много биологично активни вещества - ензими (включително лизозим, пероксидаза, естераза), протеини на комплемента, имуномодулатори като интерлевкини. Наличието на повърхността на макрофагите на рецептори за имуноглобулини (Am) и комплемент, както и система от медиатори, осигурява тяхното взаимодействие с Т- и В-лимфоцитите. В същото време макрофагите активират защитните функции на Т-лимфоцитите. Поради наличието на рецептори за комплемент и Am, както и системата за хистосъвместимост Ag (HLA), макрофагите участват в свързването и разпознаването на антигените. Следователно фагоцитите имат три функции:

• защитно, свързано с прочистване на тялото от инфекциозни агенти, продукти от разпадане на тъканите и др .;
• представляваща, състояща се в представянето на антигенни епитоли на лимфоцитите върху фагоцитната мембрана;
• секреторни, свързани със секрецията на лизозомни ензими и други биологично активни вещества - цитокини, които играят важна роля в имуногенезата.

Има следните последователни течения етапи на фагоцитоза.

• Хемотаксис– целенасочено движение на фагоцитите по посока на химичния градиент на хемоатрактантите в околната среда. Способността за хемотаксис се свързва с наличието върху мембраната на специфични рецептори за хемоатрактанти (обекти на фагоцитоза), които могат да бъдат бактерии, продукти на разграждане на телесни тъкани и др.
• Адхезия(прикрепване) също се медиира от съответните рецептори, но може да протича в съответствие със законите на неспецифичното физико-химично взаимодействие. Частиците се адсорбират на повърхността на макрофага.
• Ендоцитоза(улавяне) - възниква инвагинация на клетъчната мембрана, улавяне на чужда частица и нейното потапяне в протоплазмата. В резултат на ендоцитозата се образува фагоцитна вакуола - фагозома(т.е. балон в протоплазмата около абсорбираната частица).
• вътреклетъчно храносмилане- започва с абсорбция на фагоцитирани обекти. Фагозомата се слива с лизозомата на фагоцита, която съдържа десетки ензими, и възниква образуването на фаголизозома (разрушаване) на уловената частица от ензими. Когато частица, принадлежаща на самия организъм, се абсорбира (например мъртва клетка или нейни части, собствени протеини), тя се разделя от фаголизозомни ензими на неантигенни вещества (аминокиселини, мастни киселини, нуклеотиди, монозахари). Ако се абсорбира чужда частица, тогава ензимите на фаголизозомата не са в състояние да разградят веществото до неантигенни компоненти. В такива случаи фаголизозомата с останалата част от антигена, която е запазила своята чуждост, се предава от макрофага на Т- и В-лимфоцитите, т.е. включва се специфична връзка на имунитета.

секреторна функцияе отделянето от фагоцитите на биологично активни вещества - цитокини - това са интерлевкин-1 и интерлевкин-2, които са клетъчни медиатори, оказващи регулаторен ефект върху пролиферацията, диференциацията и функцията на фагоцитите, лимфоцитите, лимфобластите и други клетки. Макрофагите произвеждат и секретират такива важни регулаторни фактори като простагландини, левкотриени, циклични нуклеотиди с широк спектър на биологична активност. В допълнение, макрофагите синтезират и секретират редица продукти с антибактериална, антивирусна и цитотоксична активност (кислородни радикали O2-H2O2, лизозим, интерферон и др.).

Фагоцитозата се засилва от опсонинови антитела, тъй като свързаният или антигенът се адсорбира по-лесно на повърхността на фагоцита, поради наличието на рецептори за тези антитела в последния. Това усилване на фагоцитозата от антитела се нарича опсонизация, т.е. подготовка на микроорганизми за улавяне от фагоцити. Фагоцитозата на опсонизирани антигени се нарича имунна.

За да се характеризира активността на въведената фагоцитоза фагоцитен индекс.За да се определи, броят на бактериите, абсорбирани от един фагоцит, се преброява под микроскоп. Също така се наслаждавайте опсонофагоцитен индекспредставляващ съотношението на фагоцитните параметри, получени с имунен и неимунен серум. Фагоцитният индекс и опсонофагоцитният индекс се използват в клиничната имунология за оценка на състоянието на имунитета и имунния статус.

Фагоцитозата играе важна роля в антибактериалната, противогъбичната и антивирусната защита, поддържайки устойчивостта на организма към чужди вещества. Фагоцитите също имат активиращ и супресивен ефект върху лимфоцитите, участват във възстановяването на имунологичния толеранс, антиинфекциозен, трансплантационен и противотуморен имунитет и някои форми на алергия (ХЗТ).

Процесът на фагоцитоза (абсорбция на твърдофазен обект) се състои от пет етапа.

• 1. Активиране (повишен енергиен метаболизъм). Факторите на активиране и хемотаксис са бактериални продукти (LPS, пептиди), компоненти на комплемента (C3 и C5), цитокини и антитела.
• 2. Хемотаксис.
• 3. Адхезия.
• 4. Усвояване.
• 5. Резултат от фагоцитоза.

Адхезията е свързана с наличието на редица рецептори на повърхността на фагоцитите (към Fc фрагменти на антитела, компоненти на комплемента, фибронектин), които осигуряват силата на рецепторно-медиираните взаимодействия на опсонините, които обгръщат микроорганизмите и ограничават тяхната мобилност (антитела, C3b, фибронектин).

Фагоцитите притежават подобни на амеба псевдоподии. При абсорбция се образува фагозома с абсорбирания обект (бактерия), лизозома, съдържаща литични ензими, се присъединява и се слива с него и се образува фаголизозома.

Има три възможни резултата от фагоцитозата:

• - пълна фагоцитоза;
• - незавършена фагоцитоза;
• - обработка на антигени.

Завършената фагоцитоза е пълното смилане на микроорганизми във фагоцитна клетка.

В процеса на фагоцитоза възниква "окислителен взрив" с образуването на реактивни кислородни видове, което осигурява бактерициден ефект.

Една от най-важните функции на макрофагите (заедно с хемотаксиса, фагоцитозата, секрецията на биологично активни вещества) е обработката (обработката) на антигена и представянето му на имунокомпетентни клетки с участието на протеини от класа на основната система за хистосъвместимост (MHC). 2.

Фагоцитозата е не само унищожаване на чуждото, но и представяне на антиген за задействане на имунни реакции и секреция на медиатори на имунни и възпалителни реакции. Макрофагалната система е централната връзка не само в естествената резистентност (видов имунитет), но също така играе важна роля в придобития имунитет, клетъчното сътрудничество в имунния отговор.

Възпалението като защитна реакция на организма към различни тъканни увреждания възниква на по-висок етап от еволюцията от фагоцитозата и е характерно за високоорганизирани организми с кръвоносна и нервна система.

Инфекциозното възпаление е придружено от различни съдови и клетъчни (включително фагоцитоза) реакции, както и стартирането на редица медиатори на възпалителни реакции (хистамин, серотонин, кинини, протеини на острата фаза на възпалението, левкотриени и простагландини, цитокини, комплемент система).

Много бактериални продукти активират клетките на макрофаго-моноцитната система и лимфоцитите, които реагират на тях чрез освобождаване на биологично активни продукти - цитокини, по-специално интерлевкини. Те могат да бъдат характеризирани като медиатори на клетъчните имунни отговори. Интерлевкин-1 (IL-1), който стимулира треската, повишава съдовата пропускливост и адхезивните свойства на ендотела и активира фагоцитите, играе основна роля във възпалителните реакции.

Треска. Повишаването на телесната температура е защитна реакция на организма, която влошава условията за размножаване на много микроорганизми, активира макрофагите, ускорява притока на кръв и засилва метаболитните процеси в организма.

Бариерна функция на лимфните възли. Според P. F. Zdrodovsky (1969) лимфните възли са вид биологичен филтър за патогени, пренасяни с лимфа. Тук проникналите в кожата или лигавиците микроорганизми, пренесени от лимфния ток, се задържат и са изложени на действието на макрофаги и активирани лимфоцити.

Системата на комплемента е комплекс от протеини и гликопротеини в кръвния серум на хора и гръбначни животни (има повече от 20 от тях). Индивидуалните компоненти медиират процесите на възпаление, опсонизация на чужди фрагменти за последваща фагоцитоза, участват заедно с макрофагите в директното унищожаване на микроорганизми и други чужди клетки (лизис на бактерии и вируси). При физиологични условия компонентите на системата на комплемента са в неактивна форма. Има три начина за активиране на системата на комплемента - класически, алтернативен и чрез С1 шънт.

Класическият път - каскада от протеазни реакции от компонент C1q до C9 - се осъществява в присъствието на антитела към съответния антиген. Компонентът C1q взаимодейства с комплекса "антиген-антитяло", след това C4, последван от C2. Образува се комплекс „антиген-антитяло-C1C4C2“, към него се свързва С3 (централният компонент на системата) и се стартира активираща верига с ефекторни функции (опсонизация и лизиране на бактерии, активиране на макрофагалната система, възпаление). .

Алтернативен път се реализира при първоначалния контакт с патогена (когато все още няма антитела). Индуцира се от LPS и други микробни антигени. C1, C4, C2 не участват, алтернативните и класически пътища се сливат на ниво C3.

интерферонова система.

Интерфероните са гликопротеини, синтезирани от различни клетки на тялото с широк спектър на биологична активност (предимно антивирусна), бърза реакция на тялото към клетките, получаващи неспецифичен сигнал за чуждост. Има цяла система от интерферони, които са разделени на алфа, бета и гама подвидове с изразена хетерогенност на свойствата. Антивирусният ефект се проявява в способността да се потиска вътреклетъчното възпроизвеждане на ДНК и РНК вируси (главно в резултат на блокиране на синтеза на вирусни макромолекули). Индукцията на синтеза на интерферон се причинява от вируси, бактерии, рикетсии, протозои, синтетични съединения.

клетки убийци.

В осигуряването на видовия имунитет съществена роля играят Т-цитотоксичните лимфоцити (Т-убийци), както и основната система за хистосъвместимост (повече подробности в следващите лекции).

Т-убийците, представяйки антигени на основната система от клас 1 на хистосъвместимост, разпознават всякакви чужди антигени (включително мутантни, например ракови клетки), атакуват ги и ги унищожават.

Клетките NK (естествени убийци) са важни за поддържането на генетичната хомеостаза и антитуморната защита, техните функции за разпознаване не зависят от представянето на клас 1 МНС (основен комплекс на хистосъвместимост) антигени.

Системите за неспецифична устойчивост и видов имунитет допринасят за поддържането на структурната и функционална цялост на тялото и са в основата на формирането на придобит (специфичен) имунитет. Скачвайки се на това по-високо ниво, системите на специфичен и придобит имунитет образуват единна и най-ефективна система за самозащита на тялото от всичко чуждо.

Имунната система.

Имунната система е съвкупност от органи, тъкани и клетки, които осигуряват клетъчното и генетично постоянство на организма. Принципите на антигенна (генетична) чистота се основават на разпознаването на „своя чужд“ и до голяма степен се определят от системата от гени и гликопротеини (техните експресионни продукти) – главния комплекс за хистосъвместимост (MHC), често наричан HLA (човешки левкоцитни антигени) система при хора. MHC протеините са ясно експресирани върху човешки левкоцити, MHC антигените се типизират с помощта на изследване на левкоцити.

органи на имунната система.

Има централни (костен мозък - хематопоетичен орган, тимус или тимус, лимфоидна тъкан на червата) и периферни (далак, лимфни възли, натрупвания на лимфоидна тъкан в собствения слой на лигавиците от чревния тип) органи на имунитета.

Прогениторните клетки на имунокомпетентните клетки се произвеждат от костния мозък. Някои потомци на стволовите клетки се превръщат в лимфоцити. Лимфоцитите се делят на два класа – Т и В. Предшествениците на Т-лимфоцитите мигрират към тимуса, където узряват в клетки, които могат да участват в имунния отговор. При хората В-лимфоцитите узряват в костния мозък. При птиците незрелите В клетки мигрират към бурсата на Фабрициус, където достигат зрялост. Зрелите В и Т лимфоцити колонизират периферните лимфни възли. По този начин централните органи на имунната система извършват образуването и узряването на имунокомпетентни клетки, периферните органи осигуряват адекватен имунен отговор на антигенна стимулация - „обработка на антиген“, неговото разпознаване и клонова пролиферация на лимфоцити - антиген-зависима диференциация.

Имунитет: механизми за разгръщане

Клетките и молекулите действат съгласувано, поддържайки се взаимно на различни етапи от развитието на имунния отговор.

Неспецифични механизми

На първия етап от сблъсък с чужд антиген се стартира неспецифичен патологичен защитен процес - възпаление, придружено от фагоцитоза, освобождаване на възпалителни медиатори - хистамин, серотонин, цитокини и др. Фагоцитите (макрофагите) абсорбират антигени и се свързват с Т- хелперни лимфоцити, представяйки ги на повърхността антигенни детерминанти. Т-хелперите предизвикват възпроизвеждане (секретиране на специфични белтъчни вещества - интерлевкини) на клонове на Т-убийци и В-лимфоцити, специфични за даден антиген от съществуващи стволови клетки, които са тествани за толерантност в ембрионалния период (теорията за клонална селекция на Бърнет).

Възпаление (lat. inflammatio) е сложен, локален и общ патологичен процес, който възниква в отговор на увреждане (alteratio) или действието на патогенен стимул и се проявява в реакции (exudatio и др.), насочени към елиминиране на продуктите на увреждане и, ако е възможно , след това агенти (дразнители), както и водещи до максимално възстановяване за тези състояния (пролиферация и др.) в зоната на увреждане.

Схема на развитие на възпаление. Под въздействието на увреждащ фактор, провъзпалителните цитокини се освобождават от макрофага, който привлича други клетки към фокуса на възпалението, в резултат на което агрегацията или освобождаването на активни вещества от тях, целостта на тъканта се нарушава .

Фагоцитоза (Phago - да поглъщам и cytos - клетка) - процес, при който специални клетки на кръвта и тъканите на тялото (фагоцити) улавят и усвояват патогени на инфекциозни заболявания и мъртви клетки. Осъществява се от два вида клетки: гранулирани левкоцити (гранулоцити), циркулиращи в кръвта, и тъканни макрофаги. Откриването на фагоцитозата принадлежи на И. И. Мечников, който разкрива този процес, като прави експерименти с морски звезди и дафния, въвеждайки чужди тела в телата им. Например, когато Мечников постави спора на гъба в тялото на дафния, той забеляза, че тя е атакувана от специални подвижни клетки. Когато въвежда твърде много спори, клетките нямат време да ги усвоят и животното умира. Мечников нарича клетките, които защитават тялото от бактерии, вируси, гъбични спори и др. Фагоцити.

При хората има два вида професионални фагоцити:неутрофили и моноцити (в тъканите - макрофаги)

Основните етапи на фагоцитната реакция са сходни и за двата вида клетки. Реакцията на фагоцитоза може да бъде разделена на няколко етапа:

1. Хемотаксис. В реакцията на фагоцитоза по-важна роля принадлежи на положителния хемотаксис. Като хемоатрактанти има продукти, секретирани от микроорганизми и активирани клетки във фокуса на възпалението (цитокини, левкотриен В4, хистамин), както и продукти на разцепване на компоненти на комплемента (С3а, С5а), протеолитични фрагменти на коагулация на кръвта и фактори на фибринолиза (тромбин , фибрин), невропептиди, фрагменти имуноглобулини и др. Въпреки това, "професионалните" хемотаксини са цитокини от групата на хемокините.

По-рано от другите клетки неутрофилите мигрират към фокуса на възпалението, а макрофагите пристигат много по-късно. Скоростта на хемотактичното движение за неутрофили и макрофаги е сравнима, разликите във времето на пристигане вероятно са свързани с различни скорости на тяхното активиране.

2. Адхезия на фагоцити към обекта.Това се дължи на наличието на повърхността на фагоцитите на рецептори за молекули, представени на повърхността на обекта (собствен или свързан с него). По време на фагоцитоза на бактерии или стари клетки на организма гостоприемник се разпознават крайни захаридни групи - глюкоза, галактоза, фукоза, маноза и др., които се намират на повърхността на фагоцитираните клетки. Разпознаването се извършва от лектиноподобни рецептори с подходяща специфичност, предимно от маноза-свързващ протеин и селектини, присъстващи на повърхността на фагоцитите.

В случаите, когато обектите на фагоцитоза не са живи клетки, а парчета въглища, азбест, стъкло, метал и др., Фагоцитите първо правят обекта на абсорбция приемлив за реакцията, обвивайки го със собствени продукти, включително компонентите на извънклетъчната матрица, която произвеждат.

Въпреки че фагоцитите са способни да абсорбират различни видове "неподготвени" обекти, фагоцитният процес достига най-голяма интензивност по време на опсонизацията, т.е. фиксиране върху повърхността на обекти на опсонини, за които фагоцитите имат специфични рецептори - за Fc фрагмента на антитела, компоненти на системата на комплемента, фибронектин и др.

3. Активиране на мембраната.На този етап обектът е подготвен за потапяне. Има активиране на протеин киназа С, освобождаване на калциеви йони от вътреклетъчните депа. Сол-гел преходите в системата на клетъчните колоиди и актин-миозиновите пренареждания са от голямо значение.

4. Гмуркане. Обектът се опакова

5. Образуване на фагозома.Затваряне на мембраната, потапяне на предмет с част от мембраната на фагоцита вътре в клетката.

6. Образуване на фаголизозома.Сливането на фагозома с лизозоми, което води до образуването на оптимални условия за бактериолиза и разделяне на мъртвата клетка. Механизмите на конвергенция на фагозомите и лизозомите не са ясни, вероятно има активно движение на лизозомите към фагозомите.

7. Убиване и разделяне.Голяма е ролята на клетъчната стена на смляната клетка. Основните вещества, участващи в бактериолизата: водороден прекис, продукти на азотния метаболизъм, лизозим и др. Процесът на унищожаване на бактериалните клетки е завършен поради активността на протеази, нуклеази, липази и други ензими, чиято активност е оптимална при ниски pH стойности.

8. Изпускане на продукти от разграждане.

Фагоцитозата може да бъде: завършена (умъртвяването и смилането са били успешни), непълна (за редица патогени фагоцитозата е необходима стъпка в техния жизнен цикъл, например при микобактерии и гонококи).

активиране на комплемента.

Системата на комплемента работи като биохимична каскада от реакции. Комплементът се активира от три биохимични пътя: класически, алтернативен и лектин. И трите пътя на активиране произвеждат различни варианти на C3 конвертаза (протеин, който разцепва C3). Класическият път (той е първият открит, но е еволюционно нов) изисква антитела да бъдат активирани (специфичен имунен отговор, адаптивен имунитет), докато алтернативният и лектиновият път могат да бъдат активирани от антигени без наличието на антитела (неспецифичен имунен реакция, вроден имунитет). Резултатът от активирането на комплемента и в трите случая е един и същ: C3 конвертазата хидролизира C3, създавайки C3a и C3b и предизвиквайки каскада от по-нататъшна хидролиза на елементи на системата на комплемента и събития на активиране. При класическия път активирането на C3 конвертазата изисква образуването на C4b2a комплекса. Този комплекс се образува при разцепването на С2 и С4 от С1 комплекса. Комплексът C1 от своя страна трябва да се свърже с имуноглобулини от клас M или G за активиране.C3b се свързва с повърхността на патогените, което води до по-голям „интерес“ на фагоцитите към C3b-свързаните клетки (опсонизация). C5a е важен хемоатрактант, който помага за привличането на нови имунни клетки в зоната на активиране на комплемента. Както C3a, така и C5a имат анафилотоксична активност, като директно причиняват дегранулация на мастоцитите (като резултат освобождаване на възпалителни медиатори). C5b започва образуването на мембранно атакуващи комплекси (MACs), състоящи се от C5b, C6, C7, C8 и полимерен C9. MAC е цитолитичният краен продукт на активирането на комплемента. MAC образува трансмембранен канал, който причинява осмотичен лизис на целевата клетка. Макрофагите поглъщат патогени, белязани от системата на комплемента.

класически начин

Класическият път се задейства от активирането на комплекса C1 (включва една молекула C1q и две молекули C1r и C1s всяка). Комплексът C1 се свързва чрез C1q с имуноглобулини от клас M и G, свързани с антигени. Хексамерният C1q е оформен като букет от неотворени лалета, чиито "пъпки" могат да се свързват с Fc областта на антителата. Една единствена IgM молекула е достатъчна, за да инициира този път, активирането от IgG молекули е по-малко ефективно и изисква повече IgG молекули.

C1q се свързва директно с повърхността на патогена, което води до конформационни промени в молекулата C1q и активира две молекули на C1r серин протеази. Те разцепват C1s (също серинова протеаза). След това комплексът C1 се свързва с C4 и C2 и след това ги разцепва, за да образува C2a и C4b. C4b и C2a се свързват един с друг на повърхността на патогена, за да образуват класическия път C3 конвертаза, C4b2a. Появата на C3 конвертаза води до разделянето на C3 на C3a и C3b. C3b образува, заедно с C2a и C4b, C5 конвертазата на класическия път.

Алтернативен път

Алтернативен път се задейства чрез хидролиза на С3 директно върху повърхността на патогена. В алтернативния път участват факторите B и D. С тяхна помощ се образува ензимът C3bBb. Протеин P го стабилизира и осигурява дълготрайното му функциониране.Освен това PC3bBb активира C3, в резултат на което се образува C5-конвертаза и се задейства образуването на мембранно атакуващ комплекс. По-нататъшното активиране на крайните компоненти на комплемента става по същия начин, както при класическия път на активиране на комплемента.

Алтернативният път се различава от класическия по следния начин: активирането на системата на комплемента не изисква образуването на имунни комплекси, протича без участието на първите компоненти на комплемента - С1, С2, С4. Различава се и по това, че действа веднага след появата на антигени – негови активатори могат да бъдат бактериални полизахариди и липополизахариди, вирусни частици, туморни клетки.

Лектинов (манозен) път на активиране на системата на комплемента

Свързаният с манан (мананът е полимер на маноза) път на лектин е хомоложен на класическия път на активиране на системата на комплемента. Този път използва манан-свързващия лектин (MBL), протеин, подобен на класическия път на активиране на C1q, който се свързва с манозни остатъци и други захари върху мембраната, за да позволи разпознаването на различни патогени. MBL е протеин, принадлежащ към групата колекционирани протеини, произведени от черния дроб и може да активира каскадата на комплемента чрез свързване към повърхността на патогена. MBL е 2-6 връхна молекула, която образува комплекс с MASP-I (манан-свързваща лектин-асоциирана серинова протеаза, MBL-асоциирана серинова протеаза) и MASP-II. MASP-I и MASP-II са много подобни на C1r и C1s от класическия път на активиране и може да имат общ еволюционен предшественик. Когато въглехидратоопределящите MBL върхове се свържат със специфично ориентирани манозни остатъци върху фосфолипидния двоен слой на патогена, MASP-I и MASP-II се активират и разцепват C4 протеин в C4a и C4b, и C2 протеин в C2a и C2b. C4b и C2a след това се комбинират при повърхностния патоген чрез образуване на C3 конвертаза, докато C4a и C2b действат като хемоатрактанти.

Клетъчен имунен отговор

Вирусът, който е влязъл в тялото, се ендоцитира от макрофагите и след това частично се унищожава в ендоплазмения ретикулум (1). В резултат на това се образуват чужди фрагменти, които се експонират върху клетъчната повърхност на макрофагите (2). Тези фрагменти са "представени" от специална група мембранни протеини (MHC протеини). Комплексът от вирусния фрагмент и главния протеин на комплекса за хистосъвместимост [MHC (MHC)] се разпознава и свързва от Т-клетките, използвайки специфични (Т-клетъчни) рецептори. Сред огромния брой Т-клетки само няколко притежават съответния рецептор (3).Свързването води до активирането на тези Т-клетки и появата на техните селективни копия (4, "клонова селекция"). Различни хормоноподобни сигнални протеини, интерлевкини [IL (IL), вижте стр. 378]. Тези протеини се секретират от онези клетки на имунната система, които се активират, когато се свържат с Т клетките. Така активираните макрофаги с представен вирусен фрагмент секретират IL-1 (5), а Т клетките произвеждат IL-2 (6), който стимулира тяхното собствено клонално копиране и репликация на Т-хелперни клетки.

Клонираните и активираните Т клетки изпълняват различни функции в зависимост от техния тип. Цитотоксичните Т-клетки (в зелената диаграма) са в състояние да разпознаят и свържат тези клетки на тялото, които са заразени с вируси и носят вирусни фрагменти върху техните МНС рецептори (7). Цитотоксичните Т клетки отделят перфорин, протеин, който прониква в мембраната на свързаната инфектирана клетка, което води до клетъчен лизис (8).

Напротив, Т-хелперите (в синята диаграма) се свързват с В-клетките, които представят на повърхността си фрагменти от вируса, свързан с протеина МНС (9). Това води до селективно клониране на отделни В клетки и тяхната масивна пролиферация, Интерлевкинът стимулира (10) узряването на В клетките - трансформация в плазмени клетки (11), способни да синтезират и секретират антитела (12)

В литературата са описани голям брой методи за количествено определяне на фагоцитозата. Обемът на тази книга не ни позволява да опишем подробно всички, затова ще се ограничим да опишем само няколко.

Материали и оборудване

За да работите, трябва да имате:

Цитратдекстрозен антикоагулант: 8 g лимонена киселина. 22 g тризаместен натриев цитрат (двуводен), 24,5 g глюкоза се разтварят в 1 литър вода;

Разтвор на декстрозодекстран: 4,5 g NaCl, 25 g глюкоза, 30 g декстран (отн. мол. тегло 500 000) в 1 l;

Разтвор на амониев хлорид: 9 части 0,83% амониев хлорид, 1 част Tris-HCl буфер pH 7,2 (20,6 g/l);

Смес от фикол - визотраст: 9 g фикол, 20 ml визотраст, 100 ml бидестилирана Н 2 0, плътност 1,077;

Субстрат за β-глюкуронидаза: 31,5 mg р-нитрофенил-β-глюкуронид и 100 μm Triton X 100 се разтварят в 100 ml 0,05 М натриев ацетатен буфер рН 5;

Реагенти за дефицит на миелопероксидаза: фиксатор (10 ml 37% формалдехид с 90 ml абсолютен етанол), субстратен разтвор (100 ml 30% EDTA, 0,3 g бензидин хлорид, 0,038 g ZnS0 4 x7H 2 0, 1 ml дестилирана вода, 1,0 g CH 3C00Nax3H20, 0.7 ml 3% H202); доведете рН на 1.0 М NaOH до 6.0.

Търговски реактиви:

FSB, разтвор на Ханк и среда Eagle-MEM (Държавен институт за имунни препарати и хранителни среди, Берлин-Вайсензее, ГДР);

Хепарин (5000 IU/mg) (Gedeon Richter, Унгария);

Серум от говежди ембриони (Flow Laboratories, САЩ, може да се използва друга фирма);

Visotrast (VEB Fahlberg List, Магдебург, ГДР);

Infucoll (VEB Serumwerk Bernburg, ГДР);

Декстран, фикол (Pharmacia, Швеция);

Колоиден въглерод Сl1/143a (Wagner, Pelikanwerke, Германия);

Диизодецил фталат, парадиоксан (Coleman, Matheson и Bell, САЩ);

Triton X 100 (Serva, Германия, възможна е друга компания);

Oil red O (Allied chemical corp., Morristown, NY, USA);

Яранитрофенил-β-глюкуронид (Sigma, САЩ);

Safranin O (Fischer Scientific Lab., Чикаго, САЩ);

Полистиренови перли, тръби (Nunc, Дания);

Решетка F 905 (VEB Orvo Wolfen, ГДР).

Получаване на фагоцити

Необходимата информация за изолирането на човешки гранулоцити може да бъде получена в глава "Разделяне на клетки на имунната система"; за получаване на перитонеални макрофаги, вижте разделите "Култивиране на макрофаги и моноцити" и "Изолиране на макрофаги от суспензия на сплейоцити". Този въпрос е разгледан подробно в редица трудове.

Освен това трябва да се споменат следните методи:

8 ml кръв се смесват с разтвор на декстранглюкоза. След това добавете 6% разтвор на декстран 75 в 0,15 М NaCl (5 ml). Сместа се оставя за 45-50 минути при стайна температура за утаяване на еритроцитите. Аспирирайте плазма. Остатъчните еритроцити се лизират чрез добавяне на 0,83% амониев хлорид (35 ml към 15 ml плазма). Центрофугирайте за 10 минути при 80 g, суспендирайте утайката в 0,15 М NaCl, охладен до 0°C. Комбинирайте няколко утайки и центрофугирайте за 10 минути при 800 g. Клетките се държат най-добре върху лед в 0,15 М NaCl (тази среда е по-подходяща от буферирана среда с двувалентни катиони, които карат клетките да се слепват);

Ако обектът на фагоцитоза са дрожди, етапът на третиране с амониев хлорид може да бъде пропуснат, тъй като червените кръвни клетки не пречат на процеса. Мононуклеарните клетки могат да бъдат получени по следния начин: хепаринизираната кръв се смесва с 1/3 от обема на средата на Eagle, съдържаща 15% глюкоза, наслоява се върху слой от смес от фикол - визотраст и се центрофугира 20 минути при 400 g. Фракцията от мононуклеарни клетки се аспирира с пипета на Pasteur, промива се два пъти с PBS и се приготвя суспензия в среда на Eagle (1x107 клетки/ml).

Подготовка на частици за фагоцитоза

По-често се използват живи култури от Staphylococcus aureus (SG 511 или 502 A), Staphylococcus epididermidis SG 475, E. coli и други ентеробактерии, листерии, коринебактерии, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae. Микроорганизмите се отглеждат 24 часа (при необходимост 48 часа) върху твърди и течни хранителни среди. Събраната биомаса се промива три пъти с 0.15М NaCl. Твърде гъстата суспензия се измерва при 640 nm, концентрацията се определя от калибровъчната крива.

Концентрацията на микроорганизмите се определя и от методите на пресяване върху плътни хранителни среди; в някои случаи преброяването на микроорганизмите може да се извърши в камери за преброяване.

Когато работите с живи бактериални култури, трябва да се внимава винаги да се използват култури на един и същи етап. Добавянето на 0,01% говежди серумен албумин насърчава оцеляването на микроорганизмите. Приготвената суспензия остава стабилна за 1-2 часа.

Културите на убити микроорганизми обикновено се получават чрез нагряване в продължение на 30 минути при 80°C или чрез третиране с течаща пара. Убитите микроби се промиват три пъти с 0,15 М NaCl, ресуспендират се и се определя концентрацията на суспензията.

Приготвяне на хлебна мая: 0,5 g хлебна мая се суспендира в 0,15 M NaCl и се поставя на кипяща водна баня за 30 минути. Филтрира се през филтър от памучна марля. Когато се използват живи дрожди, пресни клетки (4-5 дневна култура) се промиват три пъти в среда на Eagle с добавяне на 1,0% глюкоза. Обикновено се използва клетъчна суспензия от 10 8 и 10 9 клетки/ml. Дрождите се използват като тестови частици при откриването на дефекти в компонент C5.

Използване на суспензия от полистиренови частици: Пригответе 10% водна суспензия от полистиренови частици с диаметър 1,091 μm. Разрежда се в съотношение 1 + 1 с 0,2% разтвор на BSA в 0,15 М NaCl, центрофугира се. При дължина на вълната 253 nm, суспензия от полистирол 1 μg/ml дава абсорбция от 1,17x10 -3.

Приложение на суспензия от липополизахарид - маслено червено О в минерално масло: 2 g маслено червено се стриват в 50 ml диизодецил фталат (или вазелиново масло) в порцеланово хаванче. Центрофугирайте за 20 минути при 500 g. Добавете 10 μg от супернатантната фракция към 10 ml диоксин, измерете оптичната плътност при дължина на вълната 525 nm. Коефициентът на преобразуване е 0,92. На втория етап 40 mg липополизахарид (Е. coli 0.26 B6 и др.) се разтварят в 3 ml 0.15 М NaCl. След това към тази смес се добавя 1 ml разтвор на маслообразно червено О в диизодецилсулфат и сместа се суспендира за 90 секунди. Суспензията се използва веднага и може да се замразява.

За да се настрои реакцията на фагоцитоза, формализираните еритроцити могат да се използват като тестови частици.

Фагоцитоза на бактерии, бактерицидно

Експеримент със суспензия на живи бактерии: Обикновено се използва съотношение 3-10 микроби/фагоцит. В общ обем от 2 ml се смесват 1x106 фагоцити с 3x106 - 1x106 микроби. На практика 1 ml бактериална суспензия се добавя към 1 ml суспензия от фагоцити, към която са добавени 8 IU хепарин. Времето за взаимодействие обикновено е 30 минути, в някои случаи е по-дълго. След инкубацията се вземат 0,5 ml от сместа, добавят се 1,5 ml 0,1% разтвор на желатин в разтвор на Hank, охладен до 0°C, и се центрофугира 3-4 минути при 300 g. От утайката се приготвят петна, които се оцветяват по Pappenheim. Вижте 200 клетки (ако е възможно три пъти). Изчислете процента на фагоцитоза. Според броя на бактериите, съдържащи се в клетките, се изчислява индексът на фагоцитната активност: броят на фагоцитираните бактерии се умножава по процента на фагоцитните клетки; интензивността на фагоцитозата се изразява с числа от 1 до 4.

Степен 1: Фагоцитиран с I-4 бактерии
Степен 2: фагоцитирани 5-7 бактерии
Степен 3: фагоцитирани 8-10 бактерии
Степен 4: Повече от 10 фагоцитирани бактерии на клетка

При определяне на нивото на фагоцитоза на живи микроби, клетъчната утайка и фракцията на супернатантата се проверяват отделно. Броят на живите микроби се определя чрез пресяване върху твърда хранителна среда на 0,1 ml от изследваните фракции. Инкубира се 24 (48) часа При изчисляване на бактерицидната активност се приема, че една образувана колония съответства на един жив микроб.

За насочено изследване на бактерицидната активност се изследва кръвта на пациенти и здрави донори с добавяне на антибиотичен разтвор (5000 IU пеницилин и стрептомицин / ml) и без него, като се извършва и бактериален контрол. Състав на пробата: 0,3 ml разтвор на Hank + 0,1 ml нормален серум, получен от кръв, взета от 5 донора + 0,5 ml левкоцитна суспензия (10 7 клетки / ml) + 0,1 ml микробна суспензия (10 6 микроби / ml). Добавя се разтвор на антибиотици по 0,02 ml на проба. Инкубирайте пробите при 37°C и определете броя на микробите след 20 минути, 1,5 часа и 3 часа. За да направите това, вземете 0,1 ml от всяка проба, разредете избраните аликвоти с разтвор на Hank 10, 100 и 1000 пъти и нанесете върху загрят агар. Понякога, особено ако са добавени антибиотици, се приготвят междинни разреждания за точно преброяване на микробите (например 0,2 ml от пробата се смесват с 5 ml разтвор на Hank, центрофугират се 5 минути при 450 g, утайката се разтваря в 1,9 ml PBS, приложен към агар). Ако искате да съкратите продължителността на бактериологичното изследване, можете да определите микробите вътре в клетката чрез флуоресценция, като използвате акридиново жълто оцветяване.

Фагоцитоза на хлебни дрожди: приготвя се суспензия от 10 9 клетки/ml в 0,15 М NaCl. Смесете 0,1 ml от суспензията с 0,1 ml плазма на пациента, инкубирайте 30 минути при 37 ° C, добавете 0,2 ml (10 6) PMNL, инкубирайте 30 минути. Аликвотни части се вземат на интервали от 5 до 30 минути. Преброяват се 100 PMN и се определя броят на уловените частици дрожди на клетка. Известна е следната модификация: 50 µl от тестовия серум се добавят към 50 µl серум от морско свинче (предварително се разрежда в съотношение 1 + 1 със среда на Eagle с глюкоза), 50-200 µl суспензия от левкоцити ( 107 клетки/ml) се добавят, обемът се регулира до 450 µl със среда Игла с глюкоза и се инкубира за 30 min при 37 °C. След това добавете 50 μl суспензия от дрожди (10 8 клетки/ml), разбъркайте, инкубирайте за 40 минути при 37 °C. Добавете 50 μl L-75 Se-метионин (обща активност 100 kBq), разбъркайте и инкубирайте за 1 час при 37 °C. Клетките се утаяват чрез центрофугиране за 5 минути при 1000 g, промиват се два пъти с PBS, радиоактивността се измерва на гама брояч. Процентът на фагоцитираните дрожди се изчислява по формулата:

Фагоцитоза с използване на разтвор на маслено червено в минерално масло: 0,2 ml суспензия от частици се смесват с 0,8 ml клетъчна суспензия, предварително загрята до 37°C. След 5 минути инкубация се добавят 6 ml 0,15 М разтвор на NaCl, охладен до 0°C, съдържащ 126 μg/l N-етилмалеимид (за спиране на улавянето на частици). Центрофугирайте за 10 минути при 250 g. Супернатантната фракция се изхвърля, утайката се ресуспендира в разтвор на NaCl и N-етилмалеимид (виж по-горе), клетките се промиват два пъти. Клетките се лизират с ултразвук, отделя се маслено червено. Добавете 1 ml диоксан. Центрофугира се за 15 минути при 500 g, измерва се оптичната плътност при дължина на вълната 525 nm спрямо чист диоксан. Степента на фагоцитоза (IF) се определя като количеството минерално масло (mg), абсорбирано на минута от 10 7 клетки. Можете да използвате следната формула за изчисляване:

Изследване на фагоцитозата в монослоя на макрофагите:

1. Фаза: 2 ml клетъчна суспензия (200 000 клетки/ml) се добавят към стерилни полистиренови епруветки. Инокулирайте за 5 часа при 37°C, след това промийте със среда на Eagle. 2 ml културална среда с 10% инактивиран (30 минути, 56 °C) серум от говежди ембриони се добавя към тестови епруветки, инкубирани при 37 °C.

2. Фаза А: въвежда се суспензия от микроби (3-10/макрофаг), инкубира се 30-60 минути при 37 °C, епруветките се изплакват 6 пъти с порции от 3 ml от средата за отстраняване на нефагоцитираните микроби. Фиксирайте незабавно със смес от 1 част ледена оцетна киселина и 3 части метанол. Оцветете препарата по May - Grinwald, пребройте клетките.

Фаза B: определяне на вътреклетъчни живи бактерии. Последователността на операциите е същата като във фаза А преди етапа на фиксиране. След измиване внимателно отстранете всички следи от средата. Клетките се лизират, за което се добавят 2 ml 0,01% стерилен разтвор на говежди серумен албумин (4°C), като се разклаща многократно. Повечето от клетките се лизират след 20 минути. Освободените бактерии се определят чрез пресяване върху плътни хранителни среди.

Фагоцитоза на еритроцити: смесете 4x107 фагоцити с 5x107 тестови еритроцити в 5 ml PBS. Прехвърлете 2 ml от сместа в 5 mM фосфатен буфер, охладен до 0°C и центрофугирайте. Измерете оптичната плътност на супернатантната фракция при дължина на вълната 420 nm. Степента на фагоцитоза се определя от намаляването на съдържанието на хемоглобин в безклетъчната фаза, като се използват калибровъчни криви.

Опростен метод за определяне на клирънс

Пример за определяне на клирънса при плъхове: животни се инжектират интраперитонеално при 5x107 микроби на 100 g тегло (0,1 ml/100 g). Оптималната доза може да варира от 10 6 до 10 8 на 100 g тегло. С интервал от 1-2 часа се колят по 3 индивида от всяка група опитни животни; обща продължителност на експеримента 16 часа. Вземете стерилно 0,5 ml кръв от сърцето, 1 ml перитонеална течност, секретирайте белите дробове, черния дроб, далака и бъбреците. Цилиндрите се изрязват от тъканта на органа с пипета на Пастьор. Определяне на броя на микроорганизмите чрез култивиране върху течни и твърди хранителни среди.

Пример за определяне на клирънс при мишки: използват се колоиден въглен или маркирани с 51 [Cr] еритроцити на овен. Мишките (най-малко 5 индивида на опит) се инжектират интравенозно с 0,01 ml суспензия от въглища в размер на 16 mg на 100 g тегло. В рамките на 15 минути с интервал от 2 минути се вземат 0,025 ml кръв от ретроорбиталното пространство. Избраните 0,025 ml кръв се добавят към 2,0 ml 0,1% разтвор на Na 2 C0 3. След хемолиза концентрацията на въглища се определя колориметрично при дължина на вълната 675 nm, като се използват калибровъчни криви.

t е времето в минути, C е концентрацията на въглерод в пробата.

Коригирана стойност на фагоцитозата:

Функционален скрининг на фагоцити

Определяне на дегранулация (измерване на активността (β-глюкуропидаза): 107 левкоцити се суспендират в 0,8 ml PBS в пластмасови епруветки, разклащат се в продължение на 5 минути при 37 °C. Добавят се 0,2 ml сенсибилизиран LPS, флуорохромни частици (FC 80), охлаждат се 30°С минути върху лед, центрофугирайте за 10 минути при 250 g Проверете активността на ензима във фракцията на супернатанта Инкубирайте 0,9 ml от субстратната смес за 18 часа с 0,1 ml от изследваната фракция Добавете 2 ml 0,1 М NaOH, измерете оптичната плътност на вълна 410 nm.

Плащане:

(OD 410 x20)/(1,84x18) = брой nmol вещество, освободено за 1 час от 107 левкоцити, т.е. степента на дегранулация се изразява в наномоли паранитрофенил-β-глюкуронид.

Метод за определяне на дефекти в миелопероксидазата: най-добри резултати се получават чрез биохимично определяне на H 2 0 2, което показва промени в метаболизма по време на фагоцитоза. За практически цели е много важно активирането на хексозо-монофосфатния шънт, редукцията на тетразолиев нитроен и свързването на екзогенен йод към PMNL протеини да корелира с образуването на H 2 0 2 . Обикновена кръвна натривка се фиксира за 30 секунди със смес от алкохол и формалин. Промива се с дестилирана вода и се оцветява за пероксидаза за 30 секунди. В клетките, съдържащи пероксидаза, се откриват включвания, оцветени в тъмно синьо.

Тест за редукция на тетразолиево нитро синьо (TNS). THC се редуцира от нормален PMNL до формазан. Смесете с 0,1 ml кръв 0,1 ml 0,1% разтвор на THC в 0,15 M NaCl, инкубирайте 20 минути при 37 ° C, разбъркайте отново добре. Инкорпорирането на формазан в клетките се определя чрез микроскопия. Резултатът се изразява като процент на формазан-положителни клетки.

Следният метод е малко по-сложен: 1 капка от кръвта на пациента се нанася върху покривно стъкло. Инкубирайте за 20 минути при 37°C във влажна камера, след това внимателно измийте стъклото със стерилен 0,15 М NaCl. Поставете покривно стъкло върху предметно стъкло, съдържащо 1 капка THC среда (0,5 ml серум + 0,3 ml стерилен 0,15 М NaCl + 0,6 ml THC, вижте по-горе). Инкубирайте за 30 минути във влажна камера при 37°C, отстранете покривното стъкло и изсушете на въздух. Фиксирайте с абсолютен метанол за 60 секунди и измийте с дестилирана вода. Оцветете за 5 минути със сафранин (1 g сафранин + 100 ml дестилирана вода + 40 ml глицерин), измийте. Формазан-позитивните клетки са големи, подобни на бласт и съдържат сини гранули. Обикновено в препарата се откриват около 30% от формазан-позитивните клетки.

Горните методи за оценка на фагоцитозата са обобщение на много голям брой публикации. По-подробна информация по тези въпроси можете да намерите в съответните трудове.