Thiết bị và thuốc thử: giấy sắc ký; buồng sắc ký; máy so màu quang điện; cây kéo; tấm kính (3x32 cm) - 3 chiếc.; giá đỡ cho sắc ký đồ; Tủ sấy; micropipet; ống nghiệm có nút tiếp đất; buret 25 ml; hỗn hợp chuẩn của axit amin; hỗn hợp thử của amino axit; butanol, axit axetic, nước theo tỷ lệ 15:3:7; Dung dịch ninhydrin 1% trong axeton 95%; rượu etylic (75%), bão hòa với đồng sunfat.

Hoàn thành công việc

Lấy một tờ giấy sắc ký có kích thước 18x28 cm và dùng bút chì đơn giản vẽ một đường ngang ở khoảng cách 3 cm so với cạnh ngắn của nó. Sau đó, nó được chia thành các phân đoạn không bằng nhau theo sơ đồ đính kèm và ranh giới áp dụng hỗn hợp tiêu chuẩn và thử nghiệm được đánh dấu bằng mũi tên và các chữ khắc tương ứng được tạo bằng bút chì đơn giản.

Tờ giấy được cố định phía trên mặt bàn và trên vạch xuất phát, giới hạn bởi các mũi tên, hỗn hợp chuẩn đầu tiên được dùng micropipette chuyên dụng bôi thành một vạch mỏng cho đến khi toàn bộ dung dịch từ micropipette được chuyển sang vạch xuất phát (micropipette được đổ đầy 2-3cm). Khối lượng của dung dịch đã sử dụng được đo bằng cách cân pipet chứa đầy hỗn hợp tiêu chuẩn (trước khi sử dụng dung dịch) và đổ hết (sau khi sử dụng dung dịch). 0,02-0,03 g dung dịch tiêu chuẩn thường được áp dụng cho giấy. Sau đó, đổ hỗn hợp axit amin cần kiểm tra vào một pipet sạch (do giáo viên đưa ra để nghiên cứu), cân và bôi hỗn hợp lên vạch xuất phát có đánh dấu thích hợp.

Bản sắc ký đã chuẩn bị được đặt trong buồng sắc ký có hệ thống dung môi được rót trước để tách hỗn hợp các axit amin, ví dụ hỗn hợp butanol, axit axetic và nước theo tỷ lệ 15:3:7. Việc tách được thực hiện bằng sắc ký tăng dần cho đến khi vạch phía trước cách mép trên của giấy sắc ký 2-3 cm (vạch kết thúc). Sau đó, bản sắc ký được lấy ra khỏi buồng và đầu trên của tờ giấy được đưa ngay vào giá đỡ làm bằng ba thanh thủy tinh được buộc chặt bằng vòng cao su và đặt trong tủ hút trong 20 phút để loại bỏ dung môi khỏi giấy.

Cơm. 8. Sơ đồ sắp xếp các axit amin trên sắc ký đồ:

A - điểm bôi hỗn hợp amino axit; tôi - cystine và cysteine;

2 - lysin; 3 - histidin; 4 - arginin; 5 - axit aspartic,

loạt và glycine; 6 - axit glutamic và threonine; 7 - alanin;

8 - proline; 9 - tyrosin; 10 - valin và methionin; II - tryptophan;

12 - phenylalanin; 13 - leucine và isoleucine

Sắc ký đồ khô được nhúng vào dung dịch ninhydrin 1% trong acetone để phát hiện vị trí của các vết axit amin trên đó. Sau đó, sắc ký đồ được đặt trong tủ hút trong 10 phút để loại bỏ axeton và chuyển vào tủ sấy, nơi nó được để trong 15 phút ở 70°C. Các axit amin của hỗn hợp chuẩn và hỗn hợp thử được phát hiện dưới dạng các vết màu xanh tím sắp xếp thành chuỗi theo hướng của hệ dung môi từ vạch bắt đầu đến mép trên của sắc ký đồ.

Việc xác định các axit amin có trong hỗn hợp thử nghiệm được thực hiện bằng cách trùng hợp ngẫu nhiên trên sắc ký đồ của các vị trí chiếm giữ bởi các axit amin của hỗn hợp chuẩn và hỗn hợp thử nghiệm (Hình 8).

Để xác định hàm lượng định lượng của axit amin trong hỗn hợp thử nghiệm, sắc ký đồ được vẽ bằng bút chì đơn giản sao cho các vùng màu nằm trên cùng một mức, tương ứng với cùng một axit amin, được đặt trong các hình chữ nhật gần giống nhau (Hình 9) .

I II III IV

Cơm. 9. Sơ đồ sắp xếp các axit amin trên sắc ký đồ:

I - hỗn hợp số I; II - hỗn hợp số 2; 1U - hỗn hợp số 3; Ш - tiêu chuẩn

hỗn hợp axit amin

Các phần giấy được phác thảo được cắt ra và đặt trong các ống nghiệm, số lượng của chúng phải tương ứng với số lượng vết trên sắc ký đồ. 10 ml dung dịch rượu etylic 75% bão hòa với mật ong sunfat được rót vào mỗi ống nghiệm từ buret (0,2 ml dung dịch bão hòa đồng sunfat được thêm vào 500 ml rượu etylic). Ống nghiệm được đậy bằng nút và khuấy định kỳ, chuyển hoàn toàn màu đỏ gạch (muối đồng của Rueman's xanh tím) từ giấy sang dung dịch. Điều này mất 15-20 phút. Độ hấp thụ (mật độ quang) của dung dịch chuẩn và dung dịch thử được đo trên máy đo nhiệt lượng quang điện có bộ lọc ánh sáng xanh lục (540 nm). Một cuvet chứa dung dịch cồn etylic 75% với đồng sunfat được lắp vào dòng tham chiếu.

Hàm lượng định lượng của axit amin trong dung dịch thử được tính từ tỷ lệ giữa các độ tắt của mẫu thử và mẫu chuẩn.

ví dụ tính toán. Giả sử rằng hỗn hợp tiêu chuẩn chứa 1,8 mg glycine trong 1 ml, 0,02 g dung dịch tiêu chuẩn này được áp dụng cho dải bắt đầu. Do đó sắc ký đồ thu được (1,8×0,02) = 0,036 mg glyxin. Chúng ta hãy đồng ý thêm rằng độ hấp thụ của các dung dịch màu là 0,288 đối với chất chuẩn và 0,336 đối với hỗn hợp chưa biết. Khi đó hàm lượng glyxin trong hỗn hợp thử đưa lên sắc ký đồ sẽ là (36´0,336): 0,288=42 µg. Nếu chúng ta giả định thêm rằng hỗn hợp thử nghiệm được đưa vào sắc ký đồ với một lượng, ví dụ, 0,0250 g, thì hàm lượng glyxin trong 1 ml dung dịch thử nghiệm sẽ là (42: 0,0250) = 1680 μg hoặc 1,68 mg /ml.

Rút ra kết quả thí nghiệm của riêng bạn, rút ​​​​ra kết luận từ chúng.

Phòng thí nghiệm số 15

tách ionFe 3+ , đồng 2+ , Ni 2+

Có thể phát hiện axit amin bằng các phản ứng màu: xét nghiệm ninhydrin, xantoprotein, Fol, Milon, biuret, v.v.. Các phản ứng này không đặc hiệu vì dựa trên việc phát hiện các mảnh riêng lẻ trong cấu trúc của axit amin, điều này cũng có thể xảy ra trong các hợp chất khác.

phản ứng ninhydrin, một phản ứng màu được sử dụng để xác định định tính và định lượng axit amin, axit imino và amin. Khi đun nóng trong môi trường kiềm của ninhydrin (tiketohydrindenhydrat, C 9 H b O 4) với các chất có nhóm amin bậc một (-NH 2), một sản phẩm được tạo thành có màu xanh tím bền, bền với độ hấp thụ tối đa khoảng 570 bước sóng. Vì sự hấp thụ ở bước sóng này phụ thuộc tuyến tính vào số lượng nhóm amino tự do, nên phản ứng ninhydrin được dùng làm cơ sở để xác định định lượng chúng bằng phương pháp so màu hoặc quang phổ. Phản ứng này cũng được sử dụng để xác định nhóm amin thứ cấp (>NH) trong axit imino - proline và hydroxyproline; trong trường hợp này, một sản phẩm màu vàng sáng được hình thành. Độ nhạy - lên tới 0,01%. Phân tích axit amin tự động hiện đại được thực hiện bằng cách kết hợp quá trình tách axit amin bằng trao đổi ion và xác định định lượng chúng bằng phản ứng ninhydrin. Khi tách hỗn hợp các axit amin bằng sắc ký giấy, mỗi axit amin có thể được xác định với lượng ít nhất là 2-5 µg.

Lượng axit amin có thể được đánh giá bằng cường độ màu.

Phản ứng này dương tính không chỉ với axit amin tự do mà còn với peptit, protein, v.v.

phản ứng xantoprotein cho phép bạn phát hiện các axit amin thơm (phenylalanine, tyrosine, histidine, tryptophan), dựa trên phản ứng thay thế điện di trong nhân thơm (nitrat hóa).

Ví dụ, dưới tác dụng của axit nitric đậm đặc, trên tyrosine, một sản phẩm màu vàng được hình thành.

Phản ứng FohlĐây là phản ứng với cysteine ​​và cystine. Trong quá trình thủy phân bằng kiềm, “lưu huỳnh liên kết yếu” trong cysteine ​​và cystine khá dễ bị tách ra, dẫn đến sự hình thành hydro sunfua, phản ứng với kiềm sẽ tạo ra natri hoặc kali sunfua. Khi thêm chì(II) axetat, sẽ hình thành kết tủa chì(II) sunfua màu xám đen.

Mô tả kinh nghiệm. Đổ 1 ml dung dịch cystine vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml dung dịch natri hydroxit 20%. Đun hỗn hợp này đến sôi, sau đó thêm 0,5 ml dung dịch chì(II) axetat. Quan sát thấy kết tủa chì(II) sunfua màu đen xám:

Phản ứng ZimmermannĐây là một phản ứng với axit amin glycine.

Mô tả kinh nghiệm. Đối với 2 ml dung dịch glycine 0,1%, được điều chỉnh bằng cách thêm dung dịch kiềm 10% đến pH = 8, đổ 0,5 ml dung dịch o-phthalic dialdehyde. Hỗn hợp phản ứng bắt đầu từ từ chuyển sang màu xanh sáng. Sau vài phút xuất hiện kết tủa xanh.

phản ứng với tryptophan. Tryptophan, phản ứng trong môi trường axit với andehit, tạo thành sản phẩm ngưng tụ có màu. Ví dụ, với axit glyoxylic (là tạp chất của axit axetic đậm đặc), phản ứng diễn ra theo phương trình:

Phản ứng của tryptophan với formaldehyde diễn ra theo sơ đồ tương tự.

Phản ứng của Sakaguchi. Phản ứng này với axit amin arginine dựa trên sự tương tác của arginine với α-naphthol khi có mặt tác nhân oxy hóa. Cơ chế của nó vẫn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn. Rõ ràng, phản ứng được thực hiện theo phương trình sau:

Do các dẫn xuất của quinonimin (trong trường hợp này là naphthoquinon), trong đó hydro của nhóm imino –NH– được thay thế bằng một gốc alkyl hoặc aryl, luôn có màu đỏ vàng, nên rõ ràng là đỏ cam. màu của dung dịch trong phản ứng Sakaguchi là do sự xuất hiện chính xác của dẫn xuất naphthoquinoneimine. Tuy nhiên, không loại trừ khả năng hình thành một hợp chất phức tạp hơn do quá trình oxy hóa thêm các nhóm NH còn lại của dư lượng arginine và vòng benzen của α-naphthol:

Mô tả kinh nghiệm. Đổ 2 ml dung dịch arginine 0,01% vào ống nghiệm, sau đó thêm 2 ml dung dịch natri hydroxit 10% và vài giọt dung dịch rượu 0,2% của α-naphtol. Nội dung của ống được trộn đều, 0,5 ml dung dịch hypobromite được thêm vào và trộn lại. 1 ml dung dịch urê 40% được thêm ngay lập tức để ổn định màu đỏ cam đang phát triển nhanh chóng.

phản ứng biuret- dùng làm phản ứng màu cho protein. Trong môi trường kiềm với sự có mặt của muối đồng(II), chúng cho màu tím. Màu sắc là do sự tạo thành hợp chất phức đồng(II), do nhóm peptit -CO-NH-đó là đặc trưng của protein. Phản ứng này có tên từ dẫn xuất của urê - biuret, được hình thành bằng cách đun nóng urê với việc loại bỏ amoniac:

Ngoài protein và biuret, các hợp chất khác chứa nhóm này cũng cho màu tương tự: amit, imit của axit cacboxylic, cũng như các hợp chất chứa nhóm -CS-NH- hoặc \u003d CH-NH- trong phân tử. Protein, một số axit amin, peptit, biuret và pepton trung bình cũng cho phản ứng.

Màu của phức chất thu được từ phản ứng biuret với các peptit khác nhau có phần khác nhau và phụ thuộc vào độ dài của chuỗi peptit. Các peptit có chiều dài chuỗi từ bốn gốc axit amin trở lên tạo thành phức hợp màu đỏ, tripeptit - màu tím và dipeptide - màu xanh lam.

dạng ketone của một polypeptide

dạng enol của polipeptit

Khi polypeptide tương tác với Cu(OH) 2, một phức hợp được hình thành, cấu trúc của nó có thể được hiển thị như sau.

Phương pháp xác định axit amin

Axit amin là chất có hoạt tính sinh học, có vai trò quan trọng đối với hoạt động sống của cơ thể con người, được sử dụng rộng rãi làm thuốc chữa bệnh. Một số trong số chúng là không thể thiếu và đi vào cơ thể cùng với thức ăn. Hiện nay, có một số phương pháp định lượng axit amin trong dược liệu, thuốc, dịch sinh học và thực phẩm.

Từ toàn bộ các phương pháp xác định định lượng axit amin trong các đối tượng khác nhau, bốn nhóm chính có thể được phân biệt: phương pháp phân tích sắc ký, quang phổ, chuẩn độ và điện hóa.

phương pháp sắc ký

Trong những thập kỷ qua, những tiến bộ đáng kể đã được thực hiện trong lĩnh vực sắc ký khí-lỏng của axit amin. Một phương pháp sử dụng các cột vi gói được đề xuất, cho phép tách gần như hoàn toàn 17 axit α-amino quan trọng về mặt sinh học trong một thời gian tương đối ngắn.

Một phương pháp đã được phát triển để xác định các axit amin bằng cách sử dụng sắc ký khí-lỏng trong các mẫu huyết thanh, huyết tương, nước tiểu và dịch não tủy, dựa trên việc điều chế 2,3,4,5,6-pentafluorobenzoyl-isobutyl ete, sau đó là tách trên cột polydimetylsiloxan ở chế độ lập trình nhiệt độ từ 140°C đến 250°C với đầu dò ion hóa ngọn lửa. Thời gian tách sắc ký là 28 phút. Theo kết quả nghiên cứu, có thể tách 27 axit amin.

Mặc dù có nhiều phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao trong phân tích axit amin, phiên bản pha đảo ngược với phát hiện đo quang phổ là rõ ràng và dễ tiếp cận nhất. Để phân tách và phát hiện thành công, các axit amin được chuyển đổi thành các dẫn xuất kỵ nước và hấp thụ ánh sáng, nghĩa là quá trình tạo dẫn xuất trước cột được thực hiện. Orthophthalaldehyde, naphthalene-2,3-dicarboxyaldehyde, 9-fluorenylmethylchloroformate được sử dụng làm thuốc thử cho quá trình tạo dẫn xuất.

Một phương pháp xác định định lượng L-cystine, axit L-glutamic và glycine trong thuốc Eltacin, có hoạt tính chống oxy hóa kết hợp với tác dụng chống đau thắt ngực, đã được phát triển. Axit glutamic và glyxin được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo sau khi tạo dẫn xuất trước cột bằng thuốc thử orthophthalaldehyd/N-acetyl-L-cysteine. Theo các tác giả, việc tạo dẫn xuất của cysteine ​​là khó khăn do tính không ổn định của chính axit amin và các dẫn xuất thu được. Do đó, việc phân tích cystein được thực hiện bằng phương pháp chuẩn độ bromatometric. Người ta thấy rằng sự hiện diện của một lượng đáng kể cysteine ​​trong mẫu không cản trở việc xác định các sản phẩm tạo dẫn xuất của glycine và axit glutamic bằng thuốc thử orthophthalaldehyde / N-acetyl-L-cysteine. Phương pháp này được đặc trưng bởi độ lặp lại cao và độ chính xác xác định.

Khả năng sử dụng 4,7-phenanthroline-5,6-dione (fanquinone) làm nhãn thuốc thử fluorogen để hình thành trước cột các dẫn xuất của nó để tách và phân tích định lượng axit amin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao đã được đề xuất. đã học. Không có huỳnh quang riêng, phanquinone phản ứng với các nhóm amino của axit amin (ở 68°C trong 160 phút), tạo thành iminoquinol, huỳnh quang của chúng được đo ở bước sóng 460 nm. Các dẫn xuất phân lập được xác định bằng phổ Tm, IR, khối lượng và PMR. Sắc ký lỏng hiệu năng cao được thực hiện trên máy sắc ký có đầu dò huỳnh quang và cột rửa giải gradient với các hỗn hợp: dung dịch triethylamine - đệm phosphat (pH 3) - metanol. Quinidin được sử dụng làm chất nội chuẩn. Phương pháp này khá hứa hẹn trong điều kiện của các phòng thí nghiệm lớn và có thể được đề xuất để phân tích axit amin ở dạng bào chế thành phẩm.

Một kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao với cảm biến sinh học đo điện thế để xác định định lượng lysine đã được phát triển. Bộ cảm biến sinh học được chế tạo bằng cách gắn một màng chứa lysine oxidase vào một điện cực NH4+ chọn lọc ion. Các ion amoni được tạo ra trong quá trình phân hủy lysine bằng enzym được phát hiện bằng phép đo điện thế. Phương pháp biểu thị mật độ sắc ký để phân tích tryptophan trong chất lỏng nuôi cấy đã được phát triển. Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản Sorbfil. Sắc ký được thực hiện trong hệ thống propanol-2 - dung dịch amoni hydroxit 25% (7:3) trong 25 phút. Sắc ký đồ được làm khô ở nhiệt độ phòng và giữ ở 120°C trong 15 phút. Để phát hiện các đốm trên sắc ký đồ, một thuốc thử cụ thể đã được sử dụng - 4-dimethylaminobenzaldehyd, chọn lọc trên vòng indole của tryptophan, ở dạng dung dịch etanol 0,5% có bổ sung axit sunfuric đậm đặc 5%. Sau khi triển khai sắc ký đồ bằng cách ngâm trong cuvet Teflon với dung dịch 4-dimethylaminobenzaldehyde mới chuẩn bị, chúng được giữ trong 5-7 phút ở nhiệt độ 110°C. Các điểm tryptophan được quét ở bước sóng 625nm bằng máy đo mật độ video máy tính. Phương pháp được phát triển, mặc dù có độ chính xác cao về xác định và năng suất, là đặc hiệu đối với tryptophan.

Để phân tích các axit α-amino trong chất lỏng sinh học, thuốc và thực phẩm, phương pháp điện di mao quản được sử dụng rộng rãi, dựa trên sự phân tách các thành phần của hỗn hợp phức tạp trong mao quản thạch anh dưới tác động của điện trường ứng dụng. Vì các axit amin có bản chất ion điện li, nên chúng có thể được tách ra bằng cách sử dụng dung dịch đệm điện phân có độ pH thích hợp, phổ biến nhất là sử dụng dung dịch đệm trung tính và bazơ.

Để tăng tính đặc hiệu và độ nhạy của phương pháp điện di mao quản để phân tích từng axit α-amino riêng lẻ, quá trình tạo dẫn xuất sơ bộ của chúng được sử dụng, sau đó là tách trong mao quản thạch anh và xác định quang phổ của các sản phẩm phản ứng. Do đó, 9-fluorenylmethyl formate, 9-(2-carbazole)-ethyl chloroformate và thuốc nhuộm xyanine được sử dụng làm chất tạo dẫn xuất. Triển vọng của phương pháp là do các ưu điểm của nó như phân tích nhanh, dễ chuẩn bị mẫu, tiêu thụ ít thuốc thử và dễ sử dụng.

Và protein

Được biết, tất cả 20 loại α-amino axit chính tắc đều có cấu trúc giống nhau, với 3 biến thể của nhóm chức (Hình 3.3). Thật không may, phản ứng với các nhóm amino và cacboxy không cụ thể lắm, bởi vì lần lượt là đặc trưng của tất cả các amin, một số amit và axit cacboxylic. Điều tương tự cũng áp dụng cho hầu hết các gốc của chúng = R, 10 trong số đó là không phân cực, nghĩa là chúng được đại diện bởi các nhóm hydrocacbon = aliphatic, hầu hết chúng đều trơ về mặt hóa học. Tính đặc hiệu của hầu hết các axit amin phân cực R cũng tương đối thấp, trong đó rượu (Ser, Tre, Tyr) amit (Acn, Gln) và nhóm cacboxyl (Asp, Glam) xảy ra. Nhóm amino (Liz), imidazole His và nhóm guanidino Arg hoạt động mạnh hơn, trong khi hoạt tính của nhóm thio Cys là cao nhất. Do đó, phản ứng ninhydrin phổ biến, đặc trưng cho sự có mặt đồng thời của cả hai nhóm amino và carboxy ở nguyên tử α-C, đã nhận được ý nghĩa thực tế lớn nhất trong phân tích định tính và định lượng các axit α-amino, kể cả trong máy phân tích axit amin.

Cơm. 3.3. Công thức chung về cấu tạo của các α-amino axit và sản phẩm trùng hợp của chúng. Giải thích trong văn bản.

Sự trùng hợp của các α-amino axit thành cấu trúc của peptit và protein (Hình 3.3) bảo tồn tất cả các loại R của chúng, nhưng:

1. Phản ứng ninhydrin trở nên âm tính, bởi vì ngoại trừ đầu tận cùng N- và C, các nhóm α-amino và α-carboxy được sử dụng để hình thành liên kết peptit. Phản ứng ninhydrin dương tính với protein thay vào đó chỉ ra sự hiện diện của tạp chất axit amin trong chế phẩm hoặc món ăn.

2. Đối với tất cả các peptit và protein, phản ứng biuret đối với nhóm peptit không có ở các axit amin đơn phân là đặc hiệu.

3. Trong số các phản ứng cụ thể hơn đối với axit amin R, phản ứng sau đây rất hữu ích: phản ứng xantoprotein với axit nitric đậm đặc, tạo R Phe, Tyr, Tri thơm; phản ứng với isatin đối với vòng năm cạnh Pro, cũng như các phản ứng đối với imidazole R His, nhóm thio Cys và nhóm guanidino Arg. Điều quan trọng cần lưu ý là một số R này được ẩn bên trong các hạt protein và do đó, các phản ứng định tính đối với chúng bị suy yếu. Do đó, trước khi chúng được thực hiện, protein thường bị biến tính theo cách này hay cách khác.

4. Khác với dung dịch thật của axit amin, dung dịch keo của protein có đặc điểm là phản ứng trầm tích liên quan đến sự phá hủy lớp vỏ hydrat hóa của chúng và kết quả là làm giảm khả năng hòa tan của chúng dưới tác dụng của các chất loại bỏ nước: muối trung tính = muối hóa, metanol = MeOH, etanol = EtOH, axeton, urê và các chất khác.

Thực hiện các phản ứng định tính, bạn nên:

1. Cẩn thận tuân thủ các quy tắc an toàn cháy nổ và làm việc với axit và kiềm đậm đặc = EJ.

2. Đánh dấu 2 hàng ống nghiệm bằng bút thủy tinh hoặc bút dạ và nhỏ không quá 0,5 ml (2-5 giọt) dung dịch axit amin 1% vào một trong số chúng và khoảng cùng một thể tích dung dịch protein 1% trong kia.

3. Trong một cặp ống nghiệm có dung dịch axit amin và protein, thêm song song 3-5 giọt thuốc thử tương ứng và thực hiện phần còn lại của các quy trình được chỉ định cho phản ứng tương ứng.

4. Nếu cần đun nóng các ống nghiệm, hãy mở nắp chén và đốt lửa bằng que diêm để làm khô nhiên liệu. Sau đó, kẹp ống nghiệm vào giá đỡ, thiết kế nguyên thủy của nó rất không đáng tin cậy. Do đó, tốt hơn là bạn nên quấn một cặp ống nghiệm bằng một mảnh giấy được gấp thành dải và dùng ngón tay cái giữ chúng, hơ đều nửa dưới của ống nghiệm qua ngọn lửa, tránh hướng cổ về phía hàng xóm và sự sôi nhanh của dung dịch. Sau khi hoàn thành thao tác, kịp thời dập tắt ngọn lửa bằng nắp nồi nấu kim loại.

5. Kết quả của các thí nghiệm, theo mẫu, vẽ trên sự trải rộng của một cuốn sổ ghi chép trong phòng thí nghiệm dưới dạng bảng:

6. Sau khi xem xét kết quả và hoàn thành quy trình, cùng với giá đựng ống nghiệm, hãy xuất trình cho giáo viên để bảo vệ.

1. Phản ứng Ninhydrin. Dựa trên quá trình khử amin và khử carboxyl của các α-amino axit bằng dung dịch ancol ninhydrin:

Amoniac thu được, phản ứng với hai phân tử ninhydrin, tạo thành một dẫn xuất có màu với cực đại hấp thụ ở 540 nm (đối với Pro - 440 nm).

Quá trình làm việc: Thêm 3-5 giọt dung dịch rượu ninhydrin 0,5% vào các mẫu cần nghiên cứu. Đun nóng nhẹ các ống nghiệm có hỗn hợp trên ngọn lửa và sau 2-3 phút xuất hiện màu.

2. Phản ứng xantoprotein. Như trên đã nói, nó dựa trên sự tạo thành dẫn xuất nitro của các amino axit có vòng thơm R: Phen, Tyr, Tri.

Quá trình làm việc: Bật luồng gió của tủ hút, nhỏ cẩn thận vài giọt axit nitric đặc (HNO 3) vào cặp ống nghiệm có đựng dung dịch thử. Đun nóng nhẹ các ống nghiệm trên ngọn lửa, tránh hướng cổ ống sang các ống nghiệm bên cạnh và ghi lại sự phát triển màu sắc.

3. Phản ứng nitroprusside. Nó dựa trên quá trình thủy phân kiềm của axit amin cysteine ​​chứa lưu huỳnh, với sự giải phóng natri sunfua (Na 2 S), tạo ra phức hợp màu đỏ với dung dịch natri nitroprusside mới được chuẩn bị.

Quá trình làm việc: Thêm một lượng natri hydroxit 20% vào cả hai ống nghiệm với 5-10 giọt dung dịch thử và đun sôi trong ít nhất 3-5 phút. Thêm 3-5 giọt dung dịch natri nitroprusside vào ống nghiệm và ghi lại sự phát triển của màu sắc.

4. Phản ứng Biuret. Nó dựa trên sự tạo thành trong môi trường kiềm phức chất có màu của liên kết peptit với ion Cu 2+. Phục vụ như một thử nghiệm phổ quát để phát hiện các peptide và protein trong dung dịch. Vì với sự gia tăng số lượng liên kết peptide, cường độ màu của dung dịch tăng tuyến tính, nên nó được sử dụng rộng rãi để xác định nồng độ protein bằng phương pháp trắc quang.

Quá trình làm việc. Cho cùng một lượng dung dịch natri hydroxyd 10% vào các ống nghiệm có 5-10 giọt dung dịch thử. Trộn đều và thêm 2 giọt dung dịch đồng sunfat 1% (CuSO 4). Trộn các mẫu và sau vài phút ghi lại sự phát triển màu sắc.

5. Kiểm tra bằng cách đun sôi. Dựa vào sự biến tính nhiệt của protein.

Quá trình làm việc. Axit hóa cả hai ống nghiệm bằng dung dịch thử với không quá một giọt dung dịch axit axetic (AcOH) 1% và đun đến sôi. Sau khi đun sôi dung dịch trong 2-3 phút, ghi kết quả và giải thích cơ chế của hiện tượng.

6. Kết tủa với muối của kim loại nặng(Tôi) . Tính chất biến tính của chúng dựa trên khả năng phản ứng của các cation Me nặng với các nhóm chức R của phân tử protein: thio-, amino-, cacboxy-, aromat. Ngoài ra, các anion mạnh của chúng gây ra việc nạp lại các nhóm tạo ion trong các phân tử protein, do đó phá hủy các liên kết ion trong chúng.

Quá trình làm việc. Thêm vài giọt dung dịch đồng sunfat (CuSO 4) 5% vào cả hai ống nghiệm có dung dịch thử. Ghi lại và giải thích kết quả.

7. Kết tủa bằng axit hữu cơ. Nó dựa trên sự biến tính axit của protein và sự hình thành các dẫn xuất cộng hóa trị của các nhóm thio-, amino- và thơm của axit amin R với clo hữu cơ.

Quá trình làm việc. Nhỏ vài giọt dung dịch axit tricloaxetic (TCA) 10% vào ống nghiệm có dung dịch thử và ghi kết quả sau vài phút

Bài viết này sẽ xem xét các phương pháp xác định axit amin, không chỉ được sử dụng trong phân tích sản phẩm mà còn trong phân tích hóa sinh và dược phẩm.

Tổng lượng axit amin có thể được thực hiện bằng phương pháp đo quang dựa trên việc xác định amoniac thu được từ axit amin theo phương pháp Kjeldahl.

Phản ứng với 1-naphtol. Để xác định arginine, histidine, tyrosine, một phản ứng với 1-naphthol đã được đề xuất. Với sự có mặt của natri hypoclorit (NaOCl), dung dịch chuyển sang màu đỏ. Dung dịch mẫu trong etanol 50% chứa axit amin được làm lạnh bằng nước đá và dung dịch NaOCl 10% và dung dịch naphtol được thêm vào. Sản phẩm phản ứng có màu đỏ (l max = 550 nm). Hàm lượng axit amin được xác định bởi cường độ màu của dung dịch thu được.

phản ứng biuret. Một trong những phản ứng quan trọng nhất được sử dụng để xác định axit amin là phản ứng biuret. Phản ứng được thực hiện bằng cách cho dung dịch muối đồng (II) loãng vào dung dịch kiềm của biuret. Trong trường hợp này, dung dịch chuyển sang màu tím đậm do sự hình thành của một hợp chất phức tạp.

Các hợp chất chứa ít nhất 2 nhóm amit hoặc một nhóm aminohydroxyetylen, cũng như amit và imit của axit amin tham gia vào phản ứng biuret. Protein và dung dịch đậm đặc của axit amin và amit cho phản ứng này. Các dung dịch loãng của axit amin không tạo ra phản ứng biuret và do đó phản ứng này có thể được sử dụng để thiết lập kết thúc quá trình thủy phân protein. Phản ứng cũng được sử dụng để xác định định tính và định lượng protein. Các phương pháp được sử dụng trong phòng thí nghiệm chẩn đoán lâm sàng để xác định protein trong máu và các chất lỏng sinh học khác dựa trên phản ứng biuret.

phản ứng ninhydrin. Phản ứng quan trọng thứ hai được sử dụng để xác định axit amin là phản ứng ninhydrin - phản ứng tạo màu cho a-amino axit, được thực hiện bằng cách đun nóng axit amin sau trong dung dịch kiềm của ninhydrin dư.

Ninhydrin thực hiện quá trình decarboxyl hóa oxy hóa các axit a-amino với sự hình thành amoniac, carbon dioxide và một aldehyd chứa ít hơn một nguyên tử carbon so với axit amin ban đầu. Ninhydrin khử sau đó phản ứng với amoniac được giải phóng và phân tử ninhydrin thứ hai, tạo thành sản phẩm ngưng tụ có màu với amoniac.

Hợp chất thu được (sắc tố) có màu xanh tím (l max = 570 nm). Sự hình thành của hợp chất có màu này được sử dụng trong một thử nghiệm định lượng đối với axit a-amino, có thể phát hiện ra axit amin, thậm chí lượng của chúng không vượt quá 1 μg.

Proline và hydroxyproline, không có nhóm a-amino, phản ứng với ninhydrin tạo thành dẫn xuất màu vàng (l max = 440 nm). Phản ứng không đặc hiệu vì phẩm màu với ninhydrin còn cho amoniac và hợp chất chứa nhóm amin (amin, protein, peptit). Tuy nhiên, không có CO 2 được giải phóng với các hợp chất này. Sự giải phóng khí cacbonic chỉ đặc trưng cho a-axit amin. Phản ứng được sử dụng để xác định định lượng bằng phương pháp so màu các a-amino axit, kể cả trong máy phân tích axit amin tự động (đo thể tích CO 2).

Phản ứng ninhydrin dùng để xác định glycine, isoleucine, leucine; màu ít đậm hơn được tạo ra bởi serine, phenylalanine, cysteine, tyrosine, tryptophan, v.v.

Sản phẩm thu được có đặc điểm là màu khá đậm (e = 1,8–3,3 10 4), nhưng sản phẩm có màu không ổn định. Cường độ màu giảm nhanh chóng. CdCl 2 được thêm vào để ổn định. Nó tạo thành các phức hợp ổn định với các hợp chất thu được. Cadmium clorua cũng tăng tốc độ phản ứng.

Axit amin và một số hợp chất khác chứa nhóm amin ngưng tụ trong môi trường kiềm với 1,2-naphthoquinon - 4-sulfoxylat tạo thành các dẫn xuất màu đỏ, vàng, da cam của monoimin 1,2-naphthoquinon.

Phản ứng được dùng để xác định a-amino axit (valine, isoleucine, leucine,…).

Phản ứng với 4-dimetylaminobenzaldehyd có thể được sử dụng để xác định tryptophan. Sản phẩm phản ứng có màu tím và cường độ của màu xác định hàm lượng tryptophan trong dung dịch được phân tích.

Tuy nhiên, cần lưu ý rằng phản ứng này hiếm khi được sử dụng trong phân tích thực phẩm.

Để xác định định lượng các axit amin chứa lưu huỳnh, phương pháp đo bromat được sử dụng, dựa trên phản ứng sau:

Một dung dịch cystein trong dung dịch NaOH 1% được đổ vào bình có nút mài, 0,1 N. dung dịch kali bromat, làm khô kali bromua và axit hóa bằng HCl 10%.

BrO 3 - + 5Br - + 6H + → 3Br 2 + 3H 2 O

Brôm tạo thành là kết quả của phản ứng, lượng brom tương đương với lượng kali bromat, phản ứng với axit amin. Sau 10 phút, kali iodua được thêm vào, chất này phản ứng với brom chưa phản ứng và iốt giải phóng được chuẩn độ bằng 0,1 N. dung dịch natri thiosunfat với tinh bột làm chất chỉ thị.

2I - + Br 2 → Br - + I 2

Lượng thiosunfat dùng để chuẩn độ tương đương với lượng brom không phản ứng với amino axit. Bằng sự khác biệt giữa lượng kali bromat và thiosunfat được thêm vào, lượng brom đã phản ứng với axit amin được tìm thấy và do đó lượng axit amin.

Methionine được xác định tương tự. Methionine bị oxy hóa thành sulfone:

Phản ứng này, trong những điều kiện nhất định, cho phép bạn xác định rất chính xác hàm lượng methionine.