xác định rằng interferon được tổng hợp trong tế bào, đầu tiên ở dạng tiền chất chứa peptide tín hiệu ở đầu N của chuỗi polypeptide, sau đó được tách ra và kết quả là một interferon trưởng thành với hoạt tính sinh học đầy đủ được hình thành. Vi khuẩn không chứa các enzym có khả năng cắt peptit tín hiệu để tạo thành protein trưởng thành. Để vi khuẩn tổng hợp interferon trưởng thành, chỉ phần gen mã hóa nó mới được đưa vào plasmid và phần gen mã hóa peptide tín hiệu phải được loại bỏ. Thủ tục yêu cầu tuân thủ các điều kiện sau:

Gen interferon phải chứa ba vị trí phân cắt Sau 3A1, trong đó một vị trí tiếp giáp với phần truyền tín hiệu.

Sự phân cắt không hoàn toàn của gen bằng enzym này giúp phân lập được một đoạn gen chứa trình tự nucleotide mã hóa interferon trưởng thành.

cysteine ​​mã hóa bộ ba ATG bị enzyme cắt ra cùng với phần tín hiệu.

Để khôi phục trình tự polynucleotide của gen hoàn chỉnh, một đoạn DNA được tổng hợp về mặt hóa học có chứa bộ ba này, cũng như bộ ba ATG liền kề với nó, điểm bắt đầu quá trình tổng hợp protein.

Đoạn này được gắn vào phần tách biệt của gen trưởng thành, dẫn đến sự phục hồi của gen interferon trưởng thành hoàn chỉnh.

Gen tái cấu trúc được đưa vào plasmid sao cho nó tiếp giáp với vùng khởi động DNA, nơi khởi đầu quá trình tổng hợp mRNA.

Chiết xuất từ E coli, chứa một plasmid như vậy , có hoạt tính kháng virus.

Interferon được tổng hợp bằng kỹ thuật di truyền đã được phân lập, tinh chế và các đặc tính hóa lý của nó hóa ra gần với các đặc tính của interferon thu được từ máu của người hiến tặng. quản lý để có được vi khuẩn có khả năng tổng hợp lên đến 5 mg interferon trên 1 lít huyền phù vi khuẩn chứa khoảng 10 11 tế bào vi khuẩn, lớn hơn 5000 lần so với lượng interferon có thể được chiết xuất từ ​​1 lít máu của người hiến tặng.

Hiện nay, các gen interferon đã được tạo dòng vào nấm men và các tế bào nhân chuẩn cao hơn có khả năng glycosyl hóa.

Năm 1991, lần đầu tiên ở Mỹ, tế bào nấm men biến đổi gen được sử dụng để tổng hợp interferon bạch cầu người. Saccharomyces cerevisiae. Kết quả là sự biểu hiện hiệu quả của gen LeIF và việc thay thế vi khuẩn bằng tế bào nấm men giúp tăng sản xuất interferon lên 10 lần.

Ở Nga năm 1994 đã tiến hành tổng hợp gen hoàn chỉnh α- Và có kích thước khoảng 600 N. n.(điểm nucleotide) tại Viện Hóa học hữu cơ sinh học dưới sự chỉ đạo của N. M. Kolosov.

Mặc dù đã đạt được những thành công trong lĩnh vực thu nhận interferon bằng công nghệ kỹ thuật di truyền và ứng dụng của chúng để điều trị các bệnh do virus khác nhau, bao gồm cả ung thư, nhưng vẫn còn nhiều vấn đề cần giải quyết liên quan đến việc giải mã cơ chế sinh tổng hợp và tương tác của chúng với các chất khác .

Sơ đồ hoạt động sinh học của interferon được thể hiện trong Hình 8.34.

Cơm. 8.34. Cơ chế hoạt động của interferon

Cơ chế hoạt động của interferon có thể được rút gọn như sau những giai đoạn chính:

1. Bằng cách liên kết với các thụ thể của tế bào, các interferon khởi động quá trình tổng hợp các enzym 5"-oligoadenylan synthetase và protein kinase bằng cách khởi động quá trình phiên mã của các gen tương ứng;

2. Cả hai enzyme đều thể hiện hoạt động của chúng khi có DNA sợi kép, là sản phẩm sao chép của nhiều loại virus;

3. Enzim 5"-oligoadenylansynthetase xúc tác quá trình tổng hợp 2" 5"-oligoadenylat (từ ATP), kích hoạt ribonuclease của tế bào;

4. Phosphoryl hóa protein kinase và do đó kích hoạt yếu tố khởi tạo dịch mã IF 2. Kết quả của những sự kiện này là quá trình sinh tổng hợp protein và sự sinh sản của virus (sự phân hủy mRNA và rRNA) trong tế bào bị nhiễm bệnh bị ức chế, gây ra hiện tượng ly giải.

Chủ đề: Interferon. Bắt interferon.

Interferon được phát hiện vào năm 1957 tại Viện Nghiên cứu Y học Quốc gia ở London như là yếu tố kháng lại sự lây nhiễm của virus. Người ta phát hiện ra rằng các tế bào động vật tiếp xúc với vi rút tiết ra môi trường một yếu tố có khả năng truyền sức đề kháng cho các tế bào khỏe mạnh đối với nhiễm vi rút: nó dường như ngăn chặn (can thiệp) vào sự sinh sản của vi rút trong tế bào và do khả năng này, được gọi là interferon. Có ba loại interferon:

α, β, được gọi là lớp thứ nhất, γ-interferon, được gọi là lớp thứ hai.

Interferon-α, được sản xuất bởi bạch cầu, chủ yếu có tác dụng kháng vi-rút, chống tăng sinh và chống ung thư.

Interferon-β, được hình thành bởi các nguyên bào sợi, có tác dụng chủ yếu là chống ung thư và kháng vi-rút.

Interferon -γ - được tạo ra bởi các tế bào lympho T và chất giết tự nhiên (NK-cells) và được gọi là tế bào lympho và miễn dịch. Nó có tác dụng điều hòa miễn dịch chủ yếu và tác dụng kháng vi-rút yếu.

Việc sản xuất interferon loại I được gây ra bởi virus, RNA sợi đôi, oligonucleotide sợi kép tổng hợp, sản xuất interferon - γ - kháng nguyên hoặc kháng huyết thanh của virus và vi khuẩn chống lại các yếu tố quyết định bề mặt của tế bào lympho. khả năng kích hoạt sự tổng hợp của hai loại enzyme trong tế bào - oligoadenylate synthetase và protein kinase, ức chế sự sao chép protein của virus trong tế bào bị nhiễm bệnh, gây ra sự ly giải của nó. Đây là cơ chế hoạt động chống khối u chống tăng sinh tương tự của interferon.

Interferon-γ là một lymphokine điều hòa miễn dịch đa chức năng có ảnh hưởng đến sự phát triển và biệt hóa của các loại tế bào khác nhau. Nó kích hoạt các đại thực bào ở giai đoạn chuyển thông tin kháng nguyên sang tế bào lympho, tăng hoạt tính kháng khuẩn và chống ung thư của chúng, đồng thời sản xuất IL-1. IF-γ kích hoạt các sát thủ tự nhiên, các tế bào lympho gây độc tế bào, ức chế sự phát triển của khối u.

Interferon-α là protein, và β và γ - interferon - glycoprotein, chúng là những protein hình cầu điển hình. Trong α-interferon, hai liên kết disulfide đã được tìm thấy. Interferon là các protein có trọng lượng phân tử thấp gồm 146-166 gốc axit amin, đặc trưng cho loài, tức là interferon của con người có hoạt tính sinh học trong cơ thể người, chuột - chỉ có trong cơ thể chuột.

Trong số các interferon được nghiên cứu kỹ lưỡng nhất là α-interferon; số lượng gen mã hóa chúng là khoảng 20; chúng được định vị trên nhiễm sắc thể thứ 9. Đối với β-interferon, chỉ có một loại protein được phân lập tương ứng với β-interferon của con người - interferon β 1 - hầu như tất cả các hoạt động chống vi rút đều tương ứng với nó. Có thể bộ gen chứa một số gen mã hóa các β-interferon khác nhau. Các gen β-interferon được định vị trên nhiễm sắc thể thứ 9. Interferon-γ chỉ được đại diện bởi một protein riêng lẻ, được mã hóa bởi một gen nằm trên nhiễm sắc thể thứ 12.

Bắt interferon. Interferon đóng vai trò là một trong những phương pháp điều trị hiệu quả nhất đối với bệnh nhiễm vi-rút, nhưng chúng đặc trưng cho loài và chỉ có thể thu được từ tế bào người. Công nghệ phân lập và tinh chế interferon không hiệu quả, chủ yếu là do năng suất của sản phẩm cuối cùng rất thấp (chỉ có thể phân lập được 1 μg interferon từ 1 lít máu, tức là khoảng một liều tiêm).

Ở giai đoạn hiện tại, phương pháp hứa hẹn nhất là sinh tổng hợp interferon bằng vi sinh vật biến đổi gen. cDNA thu được bằng cách sao chép ngược đã được sao chép vào E. coli. Gen interferon được chèn vào DNA vectơ và các yếu tố điều hòa của vi khuẩn được gắn vào nó, lập trình phiên mã và dịch mã của nó trong tế bào vi khuẩn. Đầu tiên, các interferon trong tế bào được tổng hợp dưới dạng tiền chất chứa peptit tín hiệu ở đầu N của chuỗi polypeptide, sau đó được cắt ra, dẫn đến sự hình thành một interferon trưởng thành với đầy đủ hoạt tính sinh học. Vi khuẩn không chứa các enzym có khả năng cắt peptit tín hiệu để tạo thành protein trưởng thành. Do đó, để vi khuẩn tổng hợp interferon trưởng thành, chỉ phần gen mã hóa nó nên được đưa vào plasmid và phần gen mã hóa peptide tín hiệu phải được loại bỏ. Thủ tục này đã được thực hiện như sau. Gen interferon chứa ba vị trí phân cắt Sau 3A1, một trong số đó nằm gần phần truyền tín hiệu. Sự phân cắt không hoàn toàn của gen bằng enzym này giúp có thể phân lập một đoạn gen chứa trình tự nucleotide mã hóa interferon trưởng thành, nhưng không có cysteine ​​đầu tiên. cysteine ​​mã hóa bộ ba ATG bị enzyme cắt ra cùng với phần tín hiệu. Để khôi phục trình tự polynucleotide của gen hoàn chỉnh, một đoạn DNA nhỏ đã được tổng hợp về mặt hóa học có chứa bộ ba này, cũng như bộ ba ATG liền kề với nó, điểm bắt đầu quá trình tổng hợp protein. Đoạn này được gắn vào phần tách biệt của gen trưởng thành và kết quả là gen interferon trưởng thành hoàn chỉnh đã được phục hồi. Gen tái cấu trúc được đưa vào plasmid sao cho nó tiếp giáp với vùng khởi động DNA, nơi khởi đầu quá trình tổng hợp mRNA. Dịch chiết từ E. coli chứa plasmid này có hoạt tính kháng vi-rút. Interferon được tổng hợp bằng kỹ thuật di truyền đã được phân lập, tinh chế và các đặc tính hóa lý của nó hóa ra tương tự như các đặc tính của interferon thu được từ máu của người hiến tặng. Có thể thu được vi khuẩn có khả năng tổng hợp tới 5 mg interferon trên 1 lít huyền phù vi khuẩn chứa khoảng 1011 tế bào vi khuẩn, lớn hơn 5000 lần so với lượng interferon có thể chiết xuất từ ​​1 lít máu của người hiến tặng.

Sử dụng các công nghệ kỹ thuật di truyền trong các phòng thí nghiệm khác nhau, người ta đã thu được các chủng vi khuẩn tạo ra nhiều loại interferon khác nhau: các loại α-, β- và γ. Nhược điểm của việc sử dụng E. coli để thu được β- và γ-interferon là thiếu bộ máy glycosyl hóa cho các protein của sinh vật nhân chuẩn trong vi khuẩn, dẫn đến sự tổng hợp các phân tử không được đường hóa. Và mặc dù vai trò của quá trình glycosyl hóa là không rõ ràng và các interferon β- và γ không bị glycol hóa gần như hoàn toàn giữ được hoạt tính kháng vi-rút của chúng, nhưng đặc điểm này chỉ ra một cách tiếp cận thận trọng đối với việc sử dụng thuốc biến đổi gen trong thực hành y tế.

Hiện nay, các gen interferon đã được tạo dòng vào nấm men và các tế bào nhân chuẩn cao hơn có khả năng glycosyl hóa. Năm 1981, lần đầu tiên ở Hoa Kỳ, các tế bào biến đổi gen của nấm men Saccharomyces cerevisiae đã được sử dụng để tổng hợp interferon bạch cầu của con người. Kết quả là sự biểu hiện hiệu quả của gen LeIF và việc thay thế vi khuẩn bằng tế bào nấm men giúp tăng sản xuất interferon lên 10 lần.

Interferon được sản xuất dưới dạng thuốc ở dạng thuốc nhỏ mũi, thuốc mỡ và dung dịch tiêm. Có những interferon tự nhiên thu được từ các tế bào lympho trong máu của người hiến tặng và được tổng hợp nhân tạo bằng công nghệ kỹ thuật di truyền (tái tổ hợp). Hiện tại, các chế phẩm thương mại được sản xuất ở Nga và nước ngoài - bạch cầu người, nguyên bào lympho (Velferon) và nguyên bào sợi (Feron), cũng như các interferon thu được bằng phương pháp kỹ thuật di truyền: α-interferon tái tổ hợp (Roferon, Realderon, v.v.), β- interferon và γ-interferon (Gammaferon).

giao thoa là một trong những protein bảo vệ quan trọng của hệ thống miễn dịch. Nó được phát hiện khi nghiên cứu sự can thiệp của virus, tức là hiện tượng khi động vật hoặc tế bào nuôi cấy bị nhiễm một loại virus trở nên không nhạy cảm với việc nhiễm một loại virus khác. Hóa ra sự can thiệp là do protein thu được, có đặc tính kháng vi-rút bảo vệ. Protein này được đặt tên là interferon.

Interferon là một họ protein glycoprotein được tổng hợp bởi các tế bào của hệ thống miễn dịch và mô liên kết. Tùy thuộc vào tế bào nào tổng hợp interferon, có ba loại: α, β và γ-interferon.

giao thoa alpha do bạch cầu tạo ra và nó được gọi là bạch cầu; giao thoa bêtađược gọi là nguyên bào sợi, bởi vì nó được tổng hợp bởi nguyên bào sợi - tế bào mô liên kết, và giao thoa gamma - miễn dịch, vì nó được tạo ra bởi các tế bào lympho T đã hoạt hóa, đại thực bào, những kẻ giết người tự nhiên, tức là các tế bào miễn dịch.

Interferon được tổng hợp liên tục trong cơ thể và nồng độ của nó trong máu được giữ ở mức khoảng 2 IU / ml (1 đơn vị quốc tế - ME là lượng interferon bảo vệ tế bào nuôi cấy khỏi 1 CPD 50 của virus). Việc sản xuất interferon tăng mạnh khi bị nhiễm virus, cũng như khi tiếp xúc với các chất cảm ứng interferon, chẳng hạn như RNA, DNA, các polyme phức tạp. Những chất gây cảm ứng interferon như vậy được gọi là interferonogen.

Ngoài tác dụng kháng vi-rút, interferon còn có tác dụng bảo vệ chống khối u, vì nó làm chậm quá trình tăng sinh (sinh sản) của các tế bào khối u, cũng như hoạt động điều hòa miễn dịch, kích thích quá trình thực bào, chất diệt tự nhiên, điều hòa sự hình thành kháng thể của tế bào B, kích hoạt biểu hiện của tính tương hợp mô học chính. phức tạp.

Cơ chế hoạt động interferon rất phức tạp. Interferon không tác động trực tiếp lên virus bên ngoài tế bào mà gắn vào các thụ thể đặc biệt của tế bào và tác động đến quá trình sinh sản của virus bên trong tế bào ở giai đoạn tổng hợp protein.

Sử dụng interferon. Hoạt động của interferon càng hiệu quả, nó càng sớm bắt đầu được tổng hợp hoặc xâm nhập vào cơ thể từ bên ngoài. Do đó, nó được sử dụng cho mục đích dự phòng trong nhiều bệnh nhiễm vi-rút, chẳng hạn như cúm, cũng như cho mục đích điều trị nhiễm vi-rút mãn tính, chẳng hạn như viêm gan ngoài da (B, C, D), mụn rộp, bệnh đa xơ cứng, v.v. Interferon cho kết quả dương tính mang lại kết quả điều trị các khối u ác tính và các bệnh liên quan đến suy giảm miễn dịch.

Interferon là đặc trưng cho loài, tức là interferon của con người ít hiệu quả hơn đối với động vật và ngược lại. Tuy nhiên, tính đặc hiệu của loài này là tương đối.

Bắt interferon. Interferon thu được theo hai cách: a) bằng cách lây nhiễm vi-rút an toàn cho bạch cầu hoặc tế bào lympho của người, do đó các tế bào bị nhiễm tổng hợp interferon, sau đó được phân lập và tạo ra các chế phẩm interferon từ nó; b) bằng kỹ thuật di truyền - bằng cách nuôi cấy trong điều kiện công nghiệp các chủng vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng sản xuất interferon. Thông thường, các chủng Pseudomonas, Escherichia coli tái tổ hợp với gen interferon nhúng trong DNA của chúng được sử dụng. Interferon thu được bằng kỹ thuật di truyền được gọi là tái tổ hợp. Ở nước ta, interferon tái tổ hợp có tên chính thức là "Reaferon". Việc sản xuất loại thuốc này hiệu quả hơn và rẻ hơn nhiều so với thuốc bạch cầu.

Interferon tái tổ hợp đã được ứng dụng rộng rãi trong y học như một tác nhân phòng ngừa và điều trị nhiễm virus, khối u và suy giảm miễn dịch.

kháng nguyên. Sự định nghĩa. Khái niệm về kháng nguyên hoàn chỉnh và khiếm khuyết. yêu cầu đối với kháng nguyên. Khái niệm về tính chất kháng nguyên của vi sinh vật. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn.

kháng nguyên(từ tiếng Latin chống - chống lại, genos - chi) - các chất lạ về mặt di truyền, khi được đưa vào môi trường bên trong cơ thể, có thể gây ra phản ứng miễn dịch dưới dạng hình thành kháng thể hoặc tế bào lympho T miễn dịch và tương tác với chúng. Tính chất chính của kháng nguyên là tính sinh miễn dịch và tính đặc hiệu. Kháng nguyên là các yếu tố cấu trúc và hóa học của tế bào và các sản phẩm chuyển hóa của chúng.

Kháng nguyên là những chất có cấu trúc keo xa lạ với cơ thể, khi được giải phóng vào môi trường bên trong, có khả năng gây ra phản ứng miễn dịch đặc hiệu đáp ứng, đặc biệt biểu hiện ở sự hình thành các kháng thể đặc hiệu, sự xuất hiện của các tế bào lympho nhạy cảm. , hoặc xuất hiện trạng thái dung nạp với chất này.

Các chất là kháng nguyên phải là chất lạ đối với cơ thể, đại phân tử, ở trạng thái keo, xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêm, tức là. bỏ qua đường tiêu hóa, trong đó thường xảy ra sự phân hủy chất và mất chất lạ. Tính ngoại lai của kháng nguyên nên được hiểu là một mức độ khác biệt nhất định về mặt hóa học giữa kháng nguyên và các đại phân tử của sinh vật, vào môi trường bên trong mà nó không xâm nhập được.

Đặc tính kháng nguyên có liên quan đến trọng lượng phân tử của đại phân tử. Trọng lượng phân tử của một chất càng cao thì tính kháng nguyên của nó càng cao. Đồng thời, sẽ không chính xác khi cho rằng trọng lượng phân tử cao là đặc tính bắt buộc của kháng nguyên. Vì vậy, glucagon, vasopressin - angiotensin cũng có tính chất kháng nguyên.

Người ta thường phân biệt giữa kháng nguyên hoàn chỉnh, kháng nguyên khiếm khuyết (hapten) và bán hapten.

Các kháng nguyên đầy đủ được gọi là những chất gây ra sự hình thành kháng thể hoặc sự nhạy cảm của tế bào lympho và có thể phản ứng với chúng cả trong cơ thể và trong các phản ứng trong phòng thí nghiệm. Protein, polysacarit, axit nucleic cao phân tử và các hợp chất phức tạp của các chất này có đặc tính của các kháng nguyên chính thức.

Bản thân các kháng nguyên khiếm khuyết, hoặc haptens, không có khả năng tạo ra kháng thể hoặc sự nhạy cảm của tế bào lympho. Thuộc tính này chỉ xuất hiện khi các kháng nguyên hoàn chỉnh (“chất dẫn”) được thêm vào chúng, và trong số các kháng thể thu được hoặc các tế bào lympho nhạy cảm, một số đặc hiệu với “chất dẫn” và một số đặc hiệu với hapten.

Hapten bán là những chất tương đối đơn giản, khi xâm nhập vào môi trường bên trong của sinh vật, có thể kết hợp hóa học với protein của sinh vật này và tạo cho chúng các đặc tính của kháng nguyên. Một số loại thuốc (iốt, brom, antipyrine, v.v.) cũng có thể thuộc về những chất này.

Một phân tử kháng nguyên bao gồm hai phần không bằng nhau. Phần hoạt động (phần nhỏ) của c được gọi là yếu tố quyết định kháng nguyên (epitope) và xác định tính đặc hiệu của kháng nguyên. Các yếu tố quyết định kháng nguyên nằm ở những vị trí của phân tử kháng nguyên được kết nối nhiều nhất với môi trường vi mô. Ví dụ, trong một phân tử protein, chúng không chỉ có thể nằm ở phần cuối của chuỗi polypeptide mà còn ở các phần khác của nó. Quyết định kháng nguyên chứa ít nhất ba axit amin có cấu trúc cứng nhắc (tyrosine, tryptophan, phenylalanine). Tính đặc hiệu của kháng nguyên cũng liên quan đến thứ tự xen kẽ các axit amin của chuỗi polypeptide và sự kết hợp vị trí của chúng so với nhau. Số lượng các yếu tố quyết định kháng nguyên trong một phân tử kháng nguyên xác định hóa trị của nó. Nó càng cao, trọng lượng phân tử tương đối của phân tử kháng nguyên càng lớn.

Phần còn lại (không hoạt động) của phân tử kháng nguyên được cho là đóng vai trò của chất mang quyết định và thúc đẩy sự xâm nhập của kháng nguyên vào môi trường bên trong cơ thể, quá trình pinocytosis hoặc phagocytosis của nó, phản ứng của tế bào đối với sự xâm nhập của kháng nguyên, sự hình thành các chất trung gian của tương tác giữa các tế bào trong phản ứng miễn dịch (tế bào lympho T có thụ thể đối với chất mang , B- đối với yếu tố quyết định kháng nguyên).

Theo cấu trúc giải phẫu của tế bào vi khuẩn, có kháng nguyên H (được gắn cờ, nếu vi khuẩn có chúng), kháng nguyên K (nằm trên bề mặt thành tế bào), kháng nguyên O (liên kết với thành tế bào của vi khuẩn ), các kháng nguyên do vi khuẩn bài tiết vào môi trường của chúng (protein- exotoxin, polysaccharid vỏ nang).

Trong số rất nhiều kháng nguyên của tế bào vi sinh vật, có những kháng nguyên vốn chỉ dành cho một loại vi khuẩn nhất định (kháng nguyên loại), một loài nhất định (kháng nguyên loài), cũng như chung cho một nhóm (họ) vi sinh vật (kháng nguyên nhóm). ).

Do đó, một tế bào vi khuẩn (giống như vi sinh vật của các vương quốc vi khuẩn khác - vi rút, động vật nguyên sinh, nấm) là một phức hợp phức tạp của nhiều kháng nguyên. Khi xâm nhập vào môi trường bên trong của vi sinh vật, nhiều kháng nguyên trong số này sẽ tạo thành kháng thể đặc hiệu của riêng chúng. Một số kháng nguyên gây ra sự hình thành một lượng kháng thể (hiệu giá) hầu như không đáng chú ý, những kháng nguyên khác - sản xuất kháng thể nhanh chóng và đáng kể. Theo đó, các kháng nguyên "yếu" và "mạnh" được phân biệt.

Không phải tất cả các kháng nguyên của tế bào vi khuẩn đều tham gia như nhau vào việc tạo ra tính kháng (miễn dịch) đối với sự tái xâm nhập của các vi khuẩn gây bệnh cùng loài vào cơ thể vĩ mô. Khả năng tạo miễn dịch của một kháng nguyên được gọi là tính sinh miễn dịch, và một kháng nguyên như vậy được gọi là chất sinh miễn dịch. Người ta cũng đã xác định rằng một số kháng nguyên của một số vi sinh vật có thể gây ra sự phát triển của các loại quá mẫn cảm (dị ứng). Những kháng nguyên như vậy được gọi là chất gây dị ứng.

Theo cấu trúc của hạt virus, một số nhóm kháng nguyên được phân biệt: hạt nhân, capsid và supercapsid. Thành phần kháng nguyên của virion phụ thuộc vào cấu trúc của chính hạt virus. Tính đặc hiệu kháng nguyên của virus được tổ chức đơn giản có liên quan đến ribo- và deoxynucleoprotein. Trong các loại virus phức tạp, một phần của kháng nguyên được liên kết với nucleocapsid và phần còn lại được định vị ở lớp vỏ bên ngoài - supercapsid.

sinh miễn dịch- khả năng gây ra phản ứng miễn dịch.

độ đặc hiệu- khả năng của một kháng nguyên tham gia vào các phản ứng tương tác với các kháng thể đặc hiệu với nó hoặc các tế bào lympho được kích hoạt (mồi), dẫn đến sự trung hòa của kháng nguyên này.

Tính sinh miễn dịch được xác định:

sự xa lạ, những, cái đó. chất đó phải được hệ thống miễn dịch công nhận là "không phải bản thân". Hơn nữa, mối quan hệ di truyền giữa sinh vật và chất được sử dụng càng ít rõ rệt thì chất sinh miễn dịch đó càng tốt;

trọng lượng phân tử, đó phải là ít nhất 5-10 kD. Trọng lượng phân tử của kháng nguyên càng lớn thì đáp ứng miễn dịch càng mạnh;

Tính chất hóa học. Kháng nguyên có thể là protein, polysacarit, polypeptide, phospholipid, axit nucleic, v.v.

Tùy thuộc vào bản chất hóa học và trọng lượng phân tử, kháng nguyên có thể được hoàn thành và chưa hoàn thiện

(xảy ra).

Kháng nguyên hoàn chỉnh(chất sinh miễn dịch) gây ra phản ứng miễn dịch đặc hiệu và tương tác với các kháng thể và tế bào lympho T đã hoạt hóa. Đây là những chất cao phân tử - protein, polysacarit, glycoprotein, lipopolysacarit, lipoprotein, nucleoprotein và các dạng tiểu thể (vi sinh vật, tế bào lạ, v.v.). Kháng nguyên có thể là ngoại sinh hoặc nội sinh. AG nội sinh - các tế bào của chính cơ thể với bộ gen đã được sửa đổi và các sản phẩm do chúng tạo thành ( tự kháng nguyên).

xảy ra- đây là những hợp chất hóa học đơn giản có trọng lượng phân tử nhỏ: disacarit, lipit, peptit, axit nucleic, v.v. Chúng không sinh miễn dịch nhưng có tính đặc hiệu cao khi tương tác với các sản phẩm của phản ứng miễn dịch (kháng thể và tế bào lympho T) . Nếu hapten được kết hợp với protein, nó sẽ có được đặc tính sinh miễn dịch (nghĩa là nó trở nên hoàn chỉnh). Tính đặc hiệu của phức hợp này được xác định bởi hapten

bán hapten

tiền kháng nguyên

bán haptenđược hình thành khi các chất vô cơ (iốt, brom, nitơ, v.v.) kết hợp với protein. Những phức hợp như vậy có thể tạo ra sự hình thành các kháng thể đặc hiệu cho các hợp chất vô cơ.

tiền kháng nguyên là chất gây dị ứng-haptens hoặc chất không kháng nguyên (sulfonamid, kháng sinh, phenolphtalein, v.v.). Khi kết hợp với protein của vi sinh vật, chúng có thể gây ra tình trạng nhạy cảm và phát triển các phản ứng dị ứng.

bán haptenđược hình thành khi các chất vô cơ (iốt, brom, nitơ, v.v.) kết hợp với protein. Những phức hợp như vậy có thể tạo ra sự hình thành các kháng thể đặc hiệu cho các hợp chất vô cơ.

tiền kháng nguyên là chất gây dị ứng-haptens hoặc chất không kháng nguyên (sulfonamid, kháng sinh, phenolphtalein, v.v.). Khi kết hợp với protein của vi sinh vật, chúng có thể gây ra tình trạng nhạy cảm và phát triển các phản ứng dị ứng.

Năm 1957, các nhà khoa học phát hiện ra rằng các tế bào bị nhiễm vi-rút tạo ra một chất đặc biệt có tác dụng ức chế sự sinh sản của cả vi-rút tương đồng và dị loại, chất mà họ gọi là interferon. Nếu hệ thống miễn dịch cung cấp cân bằng nội môi protein và loại bỏ thông tin di truyền ngoại lai thông qua nó, thì hệ thống interferon sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến thông tin di truyền ngoại lai, loại bỏ nó khỏi cơ thể ở cấp độ tế bào và do đó đảm bảo cân bằng nội môi nhân. Hệ thống interferon tương tác chặt chẽ với hệ thống miễn dịch.
Interferon được mã hóa trong bộ máy di truyền của tế bào. Các gen cho interferon nguyên bào sợi của con người nằm ở nhánh thứ 2, thứ 9 và dài của nhiễm sắc thể thứ 5, gen điều hòa phiên mã nằm ở nhánh ngắn của cùng một nhiễm sắc thể. Gen xác định tính nhạy cảm với hoạt động của interferon được định vị trong nhiễm sắc thể thứ 21. Gen cho α-interferon nằm trên nhiễm sắc thể thứ 9, cho γ-interferon - trên nhiễm sắc thể thứ 11.
Hệ thống interferon không có cơ quan trung tâm, vì tất cả các tế bào của cơ thể động vật có xương sống đều có khả năng sản xuất interferon, mặc dù các tế bào bạch cầu sản xuất nó tích cực nhất.
Interferon không được tạo ra một cách tự nhiên bởi các tế bào nguyên vẹn và các chất cảm ứng cần thiết cho sự hình thành của nó, có thể là virus, độc tố vi khuẩn, chiết xuất từ ​​​​vi khuẩn nấm, phytohemagglutinin, các chất tổng hợp - polycarboxylate, polysulfate, dextrans, nhưng chất cảm ứng interferon hiệu quả nhất là sợi đôi RNA: chuỗi kép RNA virus copolyme tổng hợp chuỗi kép của ribonucleotide (poly-GC, poly-IC), v.v. Cảm ứng của interferon xảy ra do sự khử gen của nó.
Các loại interferon Ba loại interferon ở người đã được biết đến: α-interferon, hay leukocyte interferon, được tạo ra bởi các bạch cầu được xử lý bằng virus và các tác nhân khác; β-interferon, hoặc interferon nguyên bào sợi, được tạo ra bởi các nguyên bào sợi được xử lý bằng virus và các tác nhân khác. Cả hai loại interferon này đều thuộc loại 1. Interferon γ mạnh hơn, hay interferon miễn dịch, thuộc loại 2. Có một số loại phụ của α-interferon và tổng số của chúng ở người lên tới 25. Các đặc điểm so sánh của interferon ở người được đưa ra trong cái bàn. Hoạt động của interferon được đo bằng đơn vị quốc tế (ME). Một đơn vị tương ứng với lượng interferon ức chế 50% sự sinh sản của virus.
Trong quá trình tạo ra các interferon, hai hoặc nhiều loại của nó được tổng hợp. Vì vậy, trong quá trình tạo ra interferon trên nguyên bào lympho, 87% bạch cầu và 13% interferon nguyên bào sợi được hình thành, với việc tạo ra interferon trên nguyên bào sợi, các mối quan hệ nghịch đảo diễn ra. Tương tác hiệp đồng có thể tồn tại giữa ba loại interferon.

ban 2
Đặc điểm so sánh của interferon người

Tính chất của interferon. Interferon là loài cụ thể. Điều này có nghĩa là interferon của con người chỉ hoạt động trong cơ thể con người, nhưng không hoạt động trong cơ thể của các loài sinh học khác. Tất nhiên, các rào cản đối với tính đặc hiệu của loài không phải là tuyệt đối: interferon của con người thể hiện một số hoạt động trong các mô của loài vượn lớn, interferon acrine trong cơ thể của các loài có liên quan thuộc họ gà. Tuy nhiên, hoạt động của interferon trong các sinh vật không đồng nhất bị giảm mạnh.
Do đó, có thể kết luận rằng các interferon xuất hiện ở động vật có xương sống đã tiến hóa cùng với vật chủ của chúng. Interferon là một loại protein tương đối ổn định và chịu đựng tốt môi trường axit (pH2.2), được dùng để phân lập và tinh chế nó. Các đặc tính kháng nguyên của interferon không rõ rệt lắm, do đó, chỉ có thể thu được các kháng thể đối với nó sau nhiều lần chủng ngừa.
Interferon không có tính đặc hiệu chống lại vi-rút và hoạt động ức chế sự sinh sản của các loại vi-rút khác nhau, mặc dù các vi-rút khác nhau có độ nhạy không đồng đều với kinterferon. Độ nhạy cảm với nó thường trùng với hoạt động tổng hợp của kinterferon. Các chất gây cảm ứng interferon và virus thử nghiệm được sử dụng phổ biến nhất để chuẩn độ là rhabdovirus (virus viêm miệng mụn nước), paramyxovirus và togavirus. Việc sản xuất interferon cũng phụ thuộc vào bản chất của các tế bào được sử dụng. Có những tế bào bị khiếm khuyết trong một số gen interferon.
Interferon có tác dụng kháng vi-rút, chống ung thư, điều hòa miễn dịch và các hành động khác. Hoạt động chống vi-rút của chúng đã được nghiên cứu nhiều nhất và chính trên các mô hình vi-rút mà các đặc tính sinh học và các đặc tính khác của interferon đã được làm sáng tỏ.
Interferon có tác dụng chống ung thư khi dùng liều cao ngoài đường tiêu hóa, liên quan đến việc ức chế hoạt động tăng sinh tế bào. Việc bổ sung interferon vào quá trình nuôi cấy tế bào bình thường đã được thực hiện sau 2 giờ bởi sự ức chế tổng hợp DNA của chúng. Trong các khối u do virus gây ra, interferon ức chế sự sinh sản của oncovirus và đồng thời ngăn chặn hoạt động tăng sinh tế bào.
Interferon là chất điều chỉnh các cơ chế khác nhau của phản ứng miễn dịch, mang lại tác dụng kích thích hoặc ức chế các phản ứng miễn dịch.
Cơ chế hoạt động của interferon. Interferon liên kết với các thụ thể tế bào nằm trên màng sinh chất, đóng vai trò là tín hiệu cho sự loại bỏ các gen tương ứng. Kết quả là, quá trình tổng hợp PKs protein kinase đặc biệt được tạo ra, hiện diện với lượng rất nhỏ trong tất cả các tế bào động vật có vú và được kích hoạt bởi nồng độ thấp của RNA sợi đôi và trong các tế bào bị nhiễm vi-rút - bởi các phức hợp sao chép của vi-rút.
Protein kinase phosphoryl hóa tiểu đơn vị a của yếu tố dịch mã khởi đầu eIF-2, và quá trình phosphoryl hóa ngăn chặn hoạt động của yếu tố khởi đầu. Kết quả là, mARN liên kết với phức hợp khởi đầu không thể liên kết với tiểu đơn vị lớn của ribosome, và do đó quá trình dịch mã của nó bị chặn lại. Yếu tố khởi đầu eIF-2 đều cần thiết cho quá trình dịch mã của cả mRNA của tế bào và virus, nhưng quá trình dịch mã của các mRNA của virus liên quan đến cấu trúc RNA chuỗi kép của virus chủ yếu bị chặn do hoạt hóa cục bộ protein kinase.
Trong các tế bào được điều trị bằng interferon, quá trình tổng hợp enzyme synthetase được kích hoạt, xúc tác cho axit 2,5-oligoadenylic, chuyển hoạt động của các nhân tế bào thành sự phá hủy mRNA của virus. Do đó, các mRNA của virus bị phân hủy bởi các nuclease. Chặn giai đoạn bắt đầu dịch mã và phá hủy mRNA bằng interferon xác định cơ chế hoạt động phổ biến của nó trong các bệnh nhiễm trùng do virus có vật liệu di truyền khác nhau gây ra.
Việc sử dụng interferon. Interferon được sử dụng để ngăn ngừa và điều trị một số bệnh nhiễm virus. Tác dụng của chúng được xác định bởi liều lượng của thuốc, nhưng interferon liều cao có tác dụng độc hại. Interferon được sử dụng rộng rãi cho bệnh cúm và các bệnh đường hô hấp cấp tính khác. Thuốc có hiệu quả trong giai đoạn đầu của bệnh, được bôi tại chỗ, chẳng hạn như nhỏ thuốc hoặc hít vào đường hô hấp trên với nồng độ lên tới 3∙104-5∙104 đơn vị 2-3 lần một ngày. Với viêm kết mạc, interferon được sử dụng ở dạng thuốc nhỏ mắt. Interferon có tác dụng điều trị viêm gan B, mụn rộp, cũng như các khối u ác tính. Trong những bệnh này, nồng độ cao hơn được quy định. Thuốc được sử dụng ngoài đường tiêm - tiêm tĩnh mạch và tiêm bắp với liều 105 đơn vị trên 1 kg trọng lượng cơ thể. Liều cao hơn có tác dụng phụ (sốt, nhức đầu, rụng tóc, mờ mắt, v.v.). Interferon cũng có thể gây giảm bạch cầu, làm chậm quá trình trưởng thành của đại thực bào, ở trẻ em - tình trạng sốc nặng, ở bệnh nhân mắc bệnh tim mạch - nhồi máu cơ tim. Tinh chế interferon làm giảm đáng kể độc tính của nó và cho phép sử dụng nồng độ cao. Quá trình tinh chế được thực hiện bằng sắc ký ái lực sử dụng kháng thể đơn dòng với kinterferon.
Interferon biến đổi gen. Interferon bạch cầu biến đổi gen thu được trong các hệ thống sinh vật nhân sơ (E. coli). Công nghệ sinh học để thu được interferon bao gồm các bước sau:
1) điều trị khối bạch cầu bằng chất gây cảm ứng interferon;
2) phân lập hỗn hợp mRNA từ các tế bào được xử lý;
3) thu được DNA bổ sung tổng số (cDNA) bằng cách sử dụng enzyme phiên mã ngược;
4) chèn cDNA vào plasmid Escherichia coli và nhân bản nó;
5) lựa chọn dòng vô tính chứa gen interferon;
6) kết hợp một promoter mạnh vào plasmid để phiên mã gen thành công;
7) biểu hiện của gen interferon, tức là tổng hợp protein tương ứng;
8) phá hủy các tế bào nhân sơ và tinh chế interferon bằng sắc ký ái lực.
Đã thu được các chế phẩm interferon đậm đặc và tinh khiết cao đang được thử nghiệm tại phòng khám.
Interferon bạch cầu người, bản địa và tập trung, được dùng để phòng ngừa và điều trị bệnh cúm và các bệnh đường hô hấp do virus khác.
Leukocyte interferon là một loại protein đặc trưng cho loài được tổng hợp bởi bạch cầu của con người để đáp ứng với tác động của virus interferonogen. Interferon không có hoạt tính kháng vi-rút có chọn lọc và hoạt động trên hầu hết các loại vi-rút.
Để điều chế interferon, người ta sử dụng bạch cầu của máu người hiến mới thu được. Dưới ảnh hưởng của virus - interferonogen, bạch cầu trong môi trường nuôi cấy tổng hợp interferon. Sau đó, bạch cầu được loại bỏ bằng cách ly tâm, virus bị bất hoạt. Thuốc là một interferon bản địa. Để thu được interferon tự nhiên đậm đặc, nó được tinh chế thêm bằng cách tách sắc ký trên cột bằng sephadex.
Interferon được sản xuất ở dạng khô trong ống. Interferon khô tự nhiên là một loại bột xốp màu nâu xám, dễ hòa tan trong nước cất. Thuốc hòa tan có màu đỏ hồng với sự phát quang. Một màu nâu nhẹ của giải pháp được cho phép. Chế phẩm khô cô đặc là một loại bột màu trắng xám xốp, cũng dễ hòa tan trong nước cất. Dung dịch của thuốc có màu xám với sự đồng màu, giả sử có màu nâu vàng nhẹ. Các tạp chất lạ không được chứa.
Interferon bạch cầu của con người được sản xuất vô trùng về mặt virus học và vi khuẩn học. Hoạt tính kháng vi-rút của thuốc bản địa phải có ít nhất 32 đơn vị, tập trung - 100 đơn vị. Hoạt động được xác định bằng cách chuẩn độ trong nuôi cấy tế bào sơ cấp của mô cơ xương của phôi người với vi rút viêm miệng mụn nước.
Không có chống chỉ định đối với việc sử dụng thuốc. Interferon không phản ứng, không gây tác dụng phụ.
Thuốc được bảo quản ở nhiệt độ 4 °C. Hạn sử dụng 1 năm. Sau khi hết hạn, viện sản xuất loạt thuốc này có thể tiến hành kiểm soát lại. Trong khi duy trì các tính chất vật lý và hoạt động, thời hạn sử dụng của thuốc có thể được kéo dài thêm 3 tháng nữa.

vi rút gen bạch cầu interferon

Hiện tại, phương pháp thu được interferon bằng tổng hợp vi sinh được công nhận là có triển vọng hơn, giúp thu được sản phẩm mục tiêu với năng suất cao hơn nhiều từ một nguyên liệu thô tương đối rẻ tiền. Các phương pháp được sử dụng trong trường hợp này giúp tạo ra các biến thể của gen cấu trúc tối ưu cho sự biểu hiện của vi khuẩn, cũng như các yếu tố điều hòa kiểm soát sự biểu hiện của nó.

Các thiết kế khác nhau của các chủng Pichia pastoris, Pseudomonas putida và Escherichia coli được sử dụng làm vi sinh vật ban đầu.

Nhược điểm của việc sử dụng P. pastoris làm chất sản xuất interferon là điều kiện lên men cực kỳ khó khăn đối với loại men này, cần phải duy trì nghiêm ngặt nồng độ của chất cảm ứng, đặc biệt là metanol, trong quá trình sinh tổng hợp.

Nhược điểm của việc sử dụng các chủng Ps. putida là độ phức tạp của quá trình lên men ở mức độ biểu hiện thấp (10 mg interferon trên 1 lít môi trường nuôi cấy). Hiệu quả hơn là sử dụng các chủng Escherichia coli.

Một số lượng lớn plasmid và các chủng E. coli biểu hiện interferon đã được biết đến: Các chủng E. coli ATCC 31633 và 31644 với plasmid Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 hoặc Z-pBR 322(Pstl)/HclN SN 35 - AHL6 (SU 1764515), chủng E. coli pINF-AP2 (SU 1312961), chủng E. coli pINF-F-Pa (AU 1312962), chủng E. coli SG 20050 với plasmid p280/21FN, chủng E. coli SG 20050 với pINF14 plasmid (SU 1703691), chủng E. coli SG 20050 với pINF16 plasmid (RU 2054041), v.v. Nhược điểm của các công nghệ dựa trên việc sử dụng các chủng này là tính không ổn định của chúng cũng như mức độ biểu hiện interferon không đủ.

Cùng với các đặc điểm của các chủng được sử dụng, hiệu quả của quy trình phần lớn phụ thuộc vào công nghệ được sử dụng để phân lập và tinh chế interferon.

Một phương pháp đã biết để sản xuất interferon, bao gồm nuôi cấy tế bào Ps. putida, phá hủy sinh khối, xử lý polyetylen, phân đoạn amoni sunfat, sắc ký kỵ nước trên phenylsilochrom C-80, phân đoạn pH của dịch ly giải, nồng độ và quá trình lọc của nó, sắc ký trao đổi ion trên xenluloza DE-52, rửa giải gradient pH, sắc ký trao đổi ion của thu được dung dịch rửa giải trên CM cellulose -52, cô đặc bằng cách đi qua băng lọc và lọc gel trên Sephadex G-100 (SU 1640996). Nhược điểm của phương pháp này, ngoài quá trình lên men nhiều giai đoạn phức tạp, là quá trình nhiều giai đoạn để thu được sản phẩm cuối cùng.

Người ta cũng biết một phương pháp sản xuất interferon, bao gồm nuôi cấy chủng E. coli SG 20050/pIF16 trong môi trường LB trong các bình đặt trong máy lắc ổn nhiệt, ly tâm sinh khối, rửa bằng dung dịch đệm và siêu âm để phá hủy tế bào. Lysate thu được được ly tâm, rửa bằng urê 3 M trong dung dịch đệm, hòa tan trong guanidine clorua trong dung dịch đệm, siêu âm, ly tâm, sulfito hóa oxy hóa, lọc máu với urê 8 M, tái sinh và sắc ký hai giai đoạn cuối cùng trên cellulose CM-52 và Sephadex G -50 (EN 2054041) .

Nhược điểm của phương pháp này là năng suất của các công đoạn chính của quá trình phân lập và tinh sạch tương đối thấp. Đặc biệt, điều này áp dụng cho quá trình xử lý siêu âm sản phẩm, lọc máu và sulfitolysis oxy hóa, dẫn đến sản lượng interferon không ổn định, cũng như không thể sử dụng phương pháp này để sản xuất interferon công nghiệp.

Là chất tương tự gần nhất (nguyên mẫu), có thể chỉ định phương pháp thu được interferon bạch cầu của người, bao gồm nuôi cấy chủng E. coli tái tổ hợp, đông lạnh sinh khối thu được ở nhiệt độ không quá -70 ​​° C, làm tan băng, phá hủy tế bào vi sinh vật bằng lysozyme, loại bỏ DNA và RNA bằng cách đưa vào dịch ly giải DNase và tinh chế dạng interferon không hòa tan được phân lập bằng cách rửa bằng dung dịch đệm có chất tẩy rửa, hòa tan kết tủa interferon trong dung dịch guanidine hydrochloride, tái sinh và tinh chế một giai đoạn bằng ion -trao đổi sắc ký. Với tư cách là nhà sản xuất, chủng E. coli SS5 thu được bằng cách sử dụng plasmid pSS5 tái tổ hợp chứa ba chất xúc tiến: Plac, Pt7 và Ptrp, đồng thời sử dụng gen alpha-interferon với các chất thay thế nucleotide được đưa vào.

Sự biểu hiện interferon của chủng E. coli SS5 chứa plasmid này được kiểm soát bởi ba promoter: Plac, Pt7 và Ptrp. Mức độ biểu hiện của interferon là khoảng 800 mg trên 1 lít huyền phù tế bào.

Nhược điểm của phương pháp này là khả năng sản xuất thấp do sử dụng enzym phá hủy tế bào, DNA và RNA của vi sinh vật và tinh chế sắc ký một giai đoạn của interferon. Điều này gây ra sự mất ổn định của quá trình phân lập interferon, dẫn đến giảm chất lượng của nó và hạn chế khả năng sử dụng sơ đồ trên để sản xuất interferon công nghiệp.

Nhược điểm của plasmid này và chủng dựa trên nó là việc sử dụng trong plasmid của một chất kích thích thể thực khuẩn T7 mạnh không được kiểm soát trong chủng E. coli BL21 (DE3), trong đó gen T7 RNA polymerase nằm dưới chất kích thích operon lac và nó luôn luôn "chảy". Do đó, quá trình tổng hợp interferon liên tục xảy ra trong tế bào, dẫn đến sự phân ly của plasmid và làm giảm khả năng sống sót của các tế bào của chủng, và kết quả là làm giảm sản lượng interferon.

Một ví dụ về thu được interferon tái tổ hợp:

600 g sinh khối của tế bào Pseudomonas putida 84 chứa plasmid p VG-3 tái tổ hợp chứa 130 mg interferon alpha-2 sau khi nuôi cấy. Các tế bào được nạp vào máy phân hủy đạn đạo bằng máy khuấy cơ học có dung tích 5,0 l và 3,0 l dung dịch đệm ly giải chứa 1,2% natri clorua, 1,2% tris-(hydroxymethyl)-aminomethane, 10% sucrose, 0,15% axit ethylenediaminetetraacetic ( EDTA), 0,02% phenylmetylsulfonyl florua và 0,01% dithiothreitol ở pH 7,7. Sinh khối được khuấy cho đến khi thu được huyền phù đồng nhất trong 30 phút, sau đó được phân hủy ở chế độ tuần hoàn trong máy phân hủy đạn đạo theo hướng dẫn vận hành. Thời gian phân rã là 1,5 giờ Quá trình phân huỷ hoàn thành khi trong quá trình soi chế phẩm dưới kính hiển vi, thực tế không quan sát thấy toàn bộ tế bào của vi sinh vật trong một số trường quan sát của kính hiển vi. Thể tích huyền phù sinh khối ly giải là 3,5 lít.

Lysate thu được ở giai đoạn này sau đó bước vào giai đoạn kết tủa axit nucleic. Để làm điều này, 180 ml dung dịch polyetylen 5% đã được thêm vào thùng chứa lysate đồng thời khuấy với tốc độ 1-1,2 l / h. Khuấy huyền phù trong 1 giờ và ly tâm để tách kết tủa axit nucleic trong 1 giờ ở tốc độ (9500±500) vòng/phút, ở nhiệt độ (5±2)C. Sau khi ly tâm, phần nổi phía trên được tách ra, thể tích là 3,0 l.

Khi khuấy chậm bằng máy khuấy, 182 g amoni sulfat khô được đổ vào phần nổi phía trên theo từng phần nhỏ (mỗi phần tiếp theo được thêm vào sau khi phần trước được hòa tan hoàn toàn). Sau khi hoàn thành việc bổ sung amoni sulfat, tiếp tục khuấy cho đến khi muối tan hoàn toàn và huyền phù kết tủa protein được giữ ở nhiệt độ (5 ± 2) C trong 16 giờ, sau đó ly tâm trong 1 giờ ở (13500 ± 2) C 500) vòng/phút ở nhiệt độ (5 ± 2) VỚI.

Kết tủa thu được được hòa tan trong nước cất, đưa tổng thể tích thành 4 lít. Quá trình phân đoạn axit của dung dịch thu được chứa interferon alpha-2 được thực hiện để kết tủa các protein đi kèm. Để làm điều này, 5,0 ml axit axetic 50% đã được thêm vào dung dịch đến pH 4,75. Chuyển hỗn hợp thu được vào tủ lạnh và để ở nhiệt độ (5±2)С trong 3 giờ, sau đó huyền phù protein được ly tâm ở tốc độ (13500±500) vòng/phút trong 30 phút ở (5±2)С.

50,0 ml dung dịch Tris 1 M đến pH (6,9 ± 0,1) được thêm vào 4 l dịch nổi phía trên. Nồng độ protein toàn phần xác định bằng phương pháp Lowry là 9,0 mg/ml, hoạt tính sinh học của alpha-2 interferon (6,80,5) 106 IU/ml. Hoạt độ riêng 8,5105 IU/mg. Tổng hàm lượng interferon alpha-2 ở giai đoạn này là 2,91010 IU.

Sorbent Soloz KG với lượng 0,6 l ở dạng huyền phù nước được đặt trong cột sắc ký. Sau đó, sử dụng bơm nhu động, 2,0 L dung dịch natri hydroxit 0,2 M, 6,0 L nước cất và 4,5 L dung dịch đệm Tris-acetate 0,05 M lần lượt được cho qua chất hấp thụ ở pH (7,1 ± 0, 1), trong đó được theo dõi bằng máy đo pH ở đầu ra của cột.

Dung dịch protein chứa interferon alpha-2 được pha loãng với nước cất đến độ dẫn điện là (6,0+2,0) mS/cm ở nhiệt độ phòng. Thể tích dung dịch trong trường hợp này là 19,2 lít.

Dung dịch được đưa vào cột với tốc độ 1,5 l/giờ, sau đó chất hấp phụ được rửa bằng 2,0 l dung dịch đệm Tris-acetate 0,05 M ở pH 7,0. Quá trình rửa giải được thực hiện với 1,2 lít dung dịch Tris 0,05 M với độ pH (10,2 ± 0,1). Hàm lượng interferon trong các phần được thu thập bằng cách sử dụng bộ thu thập phần được xác định bằng xét nghiệm miễn dịch enzyme.

Nồng độ protein toàn phần xác định theo phương pháp Lowry là (2,2 ± 0,2) mg/ml, hoạt tính sinh học của alpha-2 interferon là (2,1 ± 0,5) 107 IU/ml, hoạt tính riêng của thuốc là (9,7 ± 0,5)106 IU/mg. Tổng hàm lượng alpha-2 interferon ở giai đoạn này là (1,5±0,5)1010 IU.

Chất hấp thụ spherocell qae với lượng 0,15 l ở dạng huyền phù nước được nạp vào cột và được rửa với tốc độ 0,15 l/h liên tục bằng 0,5 l dung dịch natri clorua 2 M, 1,5 l nước cất và 1,0 l dung dịch đệm tris- axetat 0,05 M với pH 8,0, kiểm soát pH của dung dịch đệm ở đầu ra của cột bằng máy đo pH.

Dung dịch protein 0,7 l chứa interferon alpha-2 được áp dụng cho cột chất hấp thụ Spherocell-QAE 0,15 l với tốc độ 0,2 l/h. Cột được rửa bằng dung dịch đệm Tris-acetate 0,05 M (pH 8,0) với thể tích 0,1 L, sau đó các protein tạp chất được rửa bằng 1,0 L dung dịch đệm tương tự có thêm NaCl 0,05 M. Interferon được rửa giải bằng 0,8 l dung dịch đệm natri axetat 0,1 M ở pH 5,0. Hàm lượng interferon alpha-2 trong các phân số được thu thập bằng cách sử dụng bộ thu thập được xác định bằng xét nghiệm miễn dịch enzyme. Nồng độ protein là (0,35±0,05) mg/ml, hoạt tính sinh học của alpha-2 interferon là (1,7±0,2) 107 IU/ml. Hoạt tính riêng của thuốc là 5,5107 IU/mg protein. Dịch rửa giải chứa 1,20 x 1010 IU. Hiệu suất hoạt tính sinh học ở giai đoạn này là 82,5%.

Dung dịch thu được được điều chỉnh đến pH (5,0 ± 0,1) bằng axit axetic 50% và pha loãng với dung dịch đệm natri axetat 0,05 M. Độ dẫn điện cụ thể là (0,29±0,02) mS/cm ở nhiệt độ (5±2)C. Dung dịch protein được chuẩn bị theo cách này được đưa vào cột có chất hấp thụ Spherocell LP-M với tốc độ 0,1 l/h, được rửa bằng 0,3 l dung dịch đệm ở trên, sau đó interferon được rửa giải bằng cách sử dụng nồng độ natri clorua tuyến tính gradient được tạo bằng cách sử dụng máy trộn gradient Ultrograd. Dịch rửa giải được phân đoạn bằng cách sử dụng bộ thu thập phân đoạn và đo nồng độ của tổng protein và alpha-2 interferon. Nồng độ protein trong các phân số gộp (0,45 ± 0,02) mg/ml. Thể tích của dung dịch là 0,1 l. Tổng hàm lượng alpha-2 interferon (8,6±0,2) 109 IU. Hoạt động cụ thể - e (7,5 ± 0,2) 107 IU / mg. Năng suất ở giai đoạn này là 73%.

Dung dịch 3 0,1 L thu được được cô đến (5,0 ± 0,2) ml bằng tế bào siêu lọc sử dụng màng Amicon YM-3. Do đó, mẫu đã chuẩn bị được đưa vào cột hấp thụ Sephadex G-100 được cân bằng với dung dịch muối đệm phốt phát với tốc độ 0,025 l/h. Thể tích các phân đoạn là 10,0 ml. Các phân đoạn thu được sau khi sắc ký được kiểm tra hàm lượng interferon alpha-2 bằng xét nghiệm miễn dịch enzym và bằng cách kết hợp các phân đoạn chứa đỉnh chính của interferon alpha-2. Thể tích dung dịch thu được là 30,2 ml. Nồng độ đạm tổng số, xác định bằng phương pháp Lowry, (0,90±0,02) mg/ml. Tổng hàm lượng interferon alpha-2 trong dung dịch là 5,5109 IU. Hoạt tính cụ thể của thuốc alpha-2 interferon thu được là 2,3108 IU/mg. Sản lượng alpha-2 interferon ở giai đoạn này là 90,2%. Sản phẩm thu được đã được khử trùng và đóng gói. Tổng hiệu suất của thuốc là 35,8%, bao gồm 51% ở giai đoạn tinh chế.

Để thu được một lượng lớn IFN, người ta sử dụng phương pháp nuôi cấy tế bào phôi gà hoặc tế bào bạch cầu trong máu người nuôi cấy một lớp trong sáu ngày bị nhiễm một loại vi rút nhất định. Nói cách khác, để có được IFN, một hệ thống tế bào vi-rút cụ thể được tạo ra.

Gen chịu trách nhiệm sinh tổng hợp IFN đã được phân lập từ tế bào người. IFN ngoại sinh của con người thu được bằng cách sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp. Quy trình tách cDNA của IFN như sau:

1) mRNA được phân lập từ bạch cầu của người, nó được phân đoạn theo kích thước, quá trình phiên mã ngược được thực hiện và nó được đưa vào vị trí của plasmid đã biến đổi.

2) Sản phẩm thu được chuyển thành E. coli; các bản sao kết quả được chia thành các nhóm được xác định.

3) Từng nhóm vô tính lai với IFN - mRNA.

4) Từ thể lai chứa cDNA và xRNA thu được, mARN được phân lập, quá trình dịch mã của nó được thực hiện trong hệ thống tổng hợp protein.

5) Xác định hoạt tính kháng virus interferon của từng hỗn hợp thu được từ dịch. Các nhóm đã thể hiện hoạt động interferon chứa một bản sao cDNA được lai với IFN - mRNA; xác định lại một bản sao chứa IFN có độ dài đầy đủ - cDNA của con người.

Thông tin tương tự.