Ang mekanismo ng phagocytosis: mga yugto at yugto. Phagocytosis sa immune response ng katawan
Immunity: mga mekanismo ng deployment
Ang mga cell at molekula ay kumikilos nang magkakasabay, na sumusuporta sa isa't isa sa iba't ibang yugto ng pag-unlad ng immune response.
Mga di-tiyak na mekanismo
Sa unang yugto ng isang banggaan sa isang dayuhang antigen, isang nonspecific pathological na proseso ng proteksiyon ay inilunsad - pamamaga, sinamahan ng phagocytosis, ang pagpapalabas ng mga nagpapaalab na mediator - histamine, serotonin, cytokines, atbp Phagocytes (macrophages) sumisipsip ng antigens at makipag-ugnay sa T- helper lymphocytes, ipinapakita ang mga ito sa ibabaw antigenic determinants. Nagsisimula ang mga T-helper sa pagpaparami (paglilihim ng mga partikular na sangkap ng protina - interleukin) ng mga clone ng T-killer at B-lymphocytes na tiyak para sa isang partikular na antigen mula sa mga preexisting stem cell na nasubok para sa tolerance sa panahon ng embryonic (teorya ng pagpili ng clonal ng Burnet).
Pamamaga (lat. inflammatio) ay isang kumplikado, lokal at pangkalahatang proseso ng pathological na nangyayari bilang tugon sa pinsala (alteratio) o ang pagkilos ng isang pathogenic stimulus at nagpapakita ng sarili sa mga reaksyon (exudatio, atbp.) na naglalayong alisin ang mga produkto ng pinsala, at kung maaari , pagkatapos ay mga ahente (mga irritant), pati na rin ang humahantong sa maximum na pagbawi para sa mga kondisyong ito (proliferatio, atbp.) sa zone ng pinsala.Scheme ng pag-unlad ng pamamaga. Sa ilalim ng impluwensya ng isang nakakapinsalang kadahilanan, ang mga pro-inflammatory cytokine ay pinakawalan ng macrophage, na nakakaakit ng iba pang mga cell sa pokus ng pamamaga, bilang isang resulta kung saan ang pagsasama-sama o ang pagpapalabas ng mga aktibong sangkap ng mga ito, ang integridad ng tissue ay nilabag. .
Phagocytosis (Phago - upang lumamon at cytos - cell) - isang proseso kung saan ang mga espesyal na selula ng dugo at mga tisyu ng katawan (phagocytes) ay kumukuha at hinuhukay ang mga pathogen ng mga nakakahawang sakit at mga patay na selula. Ito ay isinasagawa ng dalawang uri ng mga selula: butil-butil na mga leukocytes (granulocytes) na nagpapalipat-lipat sa mga macrophage ng dugo at tissue. Ang pagtuklas ng phagocytosis ay kabilang sa I. I. Mechnikov, na nagsiwalat ng prosesong ito sa pamamagitan ng paggawa ng mga eksperimento sa starfish at daphnia, na nagpapakilala ng mga banyagang katawan sa kanilang mga katawan. Halimbawa, nang maglagay si Mechnikov ng spore ng fungus sa katawan ng daphnia, napansin niya na inatake ito ng mga espesyal na mobile cell. Nang siya ay nagpakilala ng napakaraming spores, ang mga selula ay walang oras upang matunaw silang lahat, at ang hayop ay namatay. Tinatawag ng Mechnikov ang mga cell na nagpoprotekta sa katawan mula sa bacteria, virus, fungal spores, atbp. phagocytes.Sa mga tao, mayroong dalawang uri ng mga propesyonal na phagocytes:neutrophils at monocytes (sa mga tisyu - macrophage)
Ang mga pangunahing yugto ng reaksyon ng phagocytic ay magkatulad para sa parehong uri ng mga selula. Ang reaksyon ng phagocytosis ay maaaring nahahati sa maraming yugto:
1. Chemotaxis. Sa reaksyon ng phagocytosis, ang isang mas mahalagang papel ay kabilang sa positibong chemotaxis. Bilang chemoattractants, may mga produktong itinago ng mga mikroorganismo at mga aktibong selula sa pokus ng pamamaga (cytokines, leukotriene B4, histamine), pati na rin ang mga produkto ng cleavage ng mga bahagi ng pandagdag (C3a, C5a), mga proteolytic na fragment ng coagulation ng dugo at fibrinolysis factor (thrombin). , fibrin), neuropeptides, fragment immunoglobulins, atbp. Gayunpaman, ang mga "propesyonal" na chemotaxin ay mga cytokine ng chemokine group.
Mas maaga kaysa sa iba pang mga selula, ang mga neutrophil ay lumilipat sa pokus ng pamamaga, at ang mga macrophage ay dumating nang mas maaga. Ang rate ng chemotactic movement para sa neutrophils at macrophage ay maihahambing, ang mga pagkakaiba sa oras ng pagdating ay malamang na nauugnay sa iba't ibang mga rate ng kanilang pag-activate.
2. Pagdikit ng mga phagocytes sa bagay.Ito ay dahil sa pagkakaroon sa ibabaw ng mga phagocytes ng mga receptor para sa mga molekula na ipinakita sa ibabaw ng bagay (pag-aari o nauugnay dito). Sa panahon ng phagocytosis ng bakterya o mga lumang selula ng host organism, ang mga terminal na grupo ng saccharide ay kinikilala - glucose, galactose, fucose, mannose, atbp., na ipinakita sa ibabaw ng mga phagocytosed na mga cell. Ang pagkilala ay isinasagawa ng mga receptor na tulad ng lectin ng naaangkop na pagtitiyak, pangunahin sa pamamagitan ng mannose-binding protein at mga selectin na nasa ibabaw ng mga phagocytes.
Sa mga kaso kung saan ang mga bagay ng phagocytosis ay hindi mga buhay na selula, ngunit mga piraso ng karbon, asbestos, salamin, metal, atbp., ang mga phagocytes ay unang ginagawang katanggap-tanggap ang object ng pagsipsip para sa reaksyon, binabalot ito ng kanilang sariling mga produkto, kabilang ang mga bahagi ng extracellular matrix na kanilang ginagawa.
Bagaman ang mga phagocytes ay may kakayahang sumipsip ng iba't ibang uri ng "hindi handa" na mga bagay, ang proseso ng phagocytic ay umabot sa pinakamalaking intensity nito sa panahon ng opsonization, i. pag-aayos sa ibabaw ng mga bagay ng opsonins kung saan ang mga phagocytes ay may mga tiyak na receptor - para sa Fc fragment ng mga antibodies, mga bahagi ng sistema ng pandagdag, fibronectin, atbp.
3. Pag-activate ng lamad.Sa yugtong ito, ang bagay ay inihanda para sa paglulubog. Mayroong pag-activate ng protina kinase C, ang paglabas ng mga calcium ions mula sa mga intracellular depot. Ang mga paglilipat ng sol-gel sa sistema ng mga cellular colloid at actin-myosin rearrangements ay may malaking kahalagahan.
4. Sumisid. Ang bagay ay bumabalot
5. Pagbuo ng isang phagosome.Pagsara ng lamad, paglulubog ng isang bagay na may bahagi ng phagocyte membrane sa loob ng cell.
6. Pagbuo ng phagolysosome.Ang pagsasanib ng phagosome sa mga lysosome, na nagreresulta sa pagbuo ng pinakamainam na kondisyon para sa bacteriolysis at paghahati ng patay na selula. Ang mga mekanismo ng convergence ng phagosomes at lysosomes ay hindi malinaw, marahil mayroong isang aktibong paggalaw ng lysosomes sa phagosomes.
7. Pagpatay at paghahati.Ang papel ng cell wall ng digested cell ay mahusay. Ang mga pangunahing sangkap na kasangkot sa bacteriolysis: hydrogen peroxide, mga produkto ng nitrogen metabolism, lysozyme, atbp. Ang proseso ng pagkasira ng mga bacterial cell ay nakumpleto dahil sa aktibidad ng mga protease, nucleases, lipases at iba pang mga enzyme, ang aktibidad na kung saan ay pinakamainam sa mababang mga halaga ng pH.
8. Paglabas ng mga produktong degradasyon.
Ang phagocytosis ay maaaring: nakumpleto (nagtagumpay ang pagpatay at panunaw), hindi kumpleto (para sa isang bilang ng mga pathogen, ang phagocytosis ay isang kinakailangang hakbang sa kanilang ikot ng buhay, halimbawa, sa mycobacteria at gonococci).
pandagdag sa pag-activate.
Gumagana ang complement system bilang isang biochemical cascade ng mga reaksyon. Ang complement ay isinaaktibo ng tatlong biochemical pathway: ang classical, alternative, at lectin pathways. Ang lahat ng tatlong activation pathway ay gumagawa ng iba't ibang variant ng C3 convertase (isang protina na pumuputol sa C3). Ang classical pathway (una itong natuklasan, ngunit bago sa ebolusyon) ay nangangailangan ng mga antibodies na maisaaktibo (specific immune response, adaptive immunity), habang ang alternatibo at lectin pathway ay maaaring i-activate ng mga antigens nang walang presensya ng antibodies (nonspecific immune response, innate immunity ). Ang resulta ng complement activation sa lahat ng tatlong kaso ay pareho: C3 convertase hydrolyzes C3, lumilikha ng C3a at C3b at nagiging sanhi ng isang kaskad ng karagdagang hydrolysis ng mga elemento ng complement system at mga kaganapan sa pag-activate. Sa klasikal na landas, ang pag-activate ng C3 convertase ay nangangailangan ng pagbuo ng C4b2a complex. Ang complex na ito ay nabuo sa cleavage ng C2 at C4 ng C1 complex. Ang C1 complex, sa turn, ay dapat magbigkis sa class M o G immunoglobulins para sa activation. Ang C3b ay nagbubuklod sa ibabaw ng mga pathogens, na humahantong sa isang mas malaking "interes" ng mga phagocytes sa mga cell na nauugnay sa C3b (opsonization). Ang C5a ay isang mahalagang chemoattractant na tumutulong sa pag-akit ng mga bagong immune cell sa lugar ng complement activation. Parehong may anaphylotoxic na aktibidad ang C3a at C5a, na direktang nagdudulot ng degranulation ng mga mast cell (bilang resulta, pagpapalabas ng mga nagpapaalab na mediator). Sinisimulan ng C5b ang pagbuo ng mga membrane attack complex (MAC) na binubuo ng C5b, C6, C7, C8 at polymeric C9. Ang MAC ay ang cytolytic end product ng complement activation. Ang MAC ay bumubuo ng isang transmembrane channel na nagiging sanhi ng osmotic lysis ng target na cell. Nilalamon ng mga macrophage ang mga pathogen na may label ng complement system.
klasikong paraan
Ang classical pathway ay na-trigger sa pamamagitan ng pag-activate ng C1 complex (kabilang dito ang isang C1q molecule at dalawang C1r at C1s molecule bawat isa). Ang C1 complex ay nagbubuklod sa pamamagitan ng C1q sa class M at G immunoglobulins na nauugnay sa mga antigens. Ang Hexameric C1q ay hugis tulad ng isang palumpon ng hindi pa nabubuksang mga tulip, ang "mga putot" nito ay maaaring magbigkis sa rehiyon ng Fc ng mga antibodies. Ang isang solong molekula ng IgM ay sapat upang simulan ang landas na ito, ang pag-activate ng mga molekula ng IgG ay hindi gaanong mahusay at nangangailangan ng higit pang mga molekula ng IgG.
Ang C1q ay direktang nagbubuklod sa ibabaw ng pathogen, na humahantong sa mga pagbabago sa conformational sa molekula ng C1q at pinapagana ang dalawang molekula ng C1r serine protease. Pinutol nila ang mga C1 (isang serine protease din). Ang C1 complex ay nagbibigkis sa C4 at C2 at pagkatapos ay pinaghiwa-hiwalay ang mga ito upang mabuo ang C2a at C4b. Ang C4b at C2a ay nagbubuklod sa isa't isa sa ibabaw ng pathogen upang mabuo ang classical pathway na C3 convertase, C4b2a. Ang hitsura ng C3 convertase ay humahantong sa paghahati ng C3 sa C3a at C3b. Ang C3b ay bumubuo, kasama ng C2a at C4b, ang C5 convertase ng classical pathway.
Alternatibong landas
Ang isang alternatibong landas ay na-trigger ng hydrolysis ng C3 nang direkta sa ibabaw ng pathogen. Ang mga salik B at D ay kasangkot sa alternatibong landas. Sa kanilang tulong, nabuo ang enzyme C3bBb. Pinapatatag ito ng Protein P at tinitiyak ang pangmatagalang paggana nito. Dagdag pa rito, ina-activate ng PC3bBb ang C3, bilang resulta, nabuo ang C5-convertase at na-trigger ang pagbuo ng isang membrane attack complex. Ang karagdagang pag-activate ng mga sangkap na pandagdag sa terminal ay nangyayari sa parehong paraan tulad ng sa klasikal na landas ng pag-activate ng pandagdag.
Ang alternatibong landas ay naiiba sa klasikal sa sumusunod na paraan: ang pag-activate ng sistema ng pandagdag ay hindi nangangailangan ng pagbuo ng mga immune complex, nangyayari ito nang walang paglahok ng mga unang bahagi ng pandagdag - C1, C2, C4. Naiiba din ito sa na ito ay gumagana kaagad pagkatapos ng paglitaw ng mga antigens - ang mga activator nito ay maaaring bacterial polysaccharides at lipopolysaccharides, viral particle, tumor cells.
Lectin (mannose) pathway ng activation ng complement system
Ang Mannan (mannan ay isang polymer ng mannose) na nauugnay sa lectin pathway ay homologous sa classical activation pathway ng complement system. Ang pathway na ito ay gumagamit ng mannan-binding lectin (MBL), isang protina na katulad ng classical na C1q activation pathway, na nagbubuklod sa mga residue ng mannose at iba pang asukal sa lamad upang payagan ang pagkilala sa iba't ibang mga pathogen. Ang MBL ay isang protina na kabilang sa collectin group ng mga protina na ginawa ng atay at maaaring i-activate ang complement cascade sa pamamagitan ng pagbubuklod sa pathogen surface. Ang MBL ay isang 2-6 vertex molecule na bumubuo ng isang complex na may MASP-I (Mannan-binding lectin Associated Serine Protease, MBL-associated serine protease) at MASP-II. Ang MASP-I at MASP-II ay halos kapareho sa C1r at C1s ng classical activation pathway at maaaring magkaroon ng isang karaniwang evolutionary ancestor. Kapag ang carbohydrate-determining MBL vertices ay nagbubuklod sa partikular na nakatuon na mannose residues sa phospholipid bilayer ng pathogen, ang MASP-I at MASP-II ay ina-activate at hinahati ang C4 protein sa C4a at C4b, at ang C2 protein sa C2a at C2b. C4b at C2a pagkatapos ay pagsamahin ang pathogen sa ibabaw sa pamamagitan ng pagbuo ng C3 convertase, habang ang C4a at C2b ay kumikilos bilang chemoattractants.Ang tugon ng cellular immune
Ang virus na pumasok sa katawan ay endocytosed ng macrophage at pagkatapos ay bahagyang nawasak sa endoplasmic reticulum (1). Bilang isang resulta, ang mga dayuhang fragment ay nabuo, na nakalantad sa ibabaw ng cell ng macrophage (2). Ang mga fragment na ito ay "ipinakita" ng isang espesyal na grupo ng mga protina ng lamad (mga protina ng MHC). Ang complex ng viral fragment at ang pangunahing histocompatibility complex na protina [MHC (MHC)] ay kinikilala at itinatali ng mga T-cell gamit ang mga tiyak na (T-cell) na receptor. Sa napakaraming T cell, iilan lamang ang nagtataglay ng naaangkop na receptor (3). Ang pagbubuklod ay humahantong sa pag-activate ng mga T cell na ito at ang paglitaw ng kanilang mga piling kopya (4, "clonal selection"). Iba't ibang hormone-like signaling proteins, interleukins [IL (IL), tingnan ang p. 378]. Ang mga protina na ito ay itinago ng mga selula ng immune system na naisaaktibo kapag nakatali sa mga selulang T. Kaya, ang mga aktibong macrophage na may ipinakita na viral fragment ay nagtatago ng IL-1 (5), at ang mga T cells ay gumagawa ng IL-2 (6), na nagpapasigla sa kanilang sariling clonal na pagkopya at pagtitiklop ng mga T-helper cells.
Ang mga cloned at activated na T cells ay gumaganap ng iba't ibang function depende sa kanilang uri. Ang mga cytotoxic T cells (sa berdeng diagram) ay nakikilala at nabibigkis ang mga selula ng katawan na nahawaan ng mga virus at nagdadala ng mga fragment ng virus sa kanilang mga MHC receptor (7). Ang mga cytotoxic T cells ay naglalabas ng perforin, isang protina na tumatagos sa lamad ng nakagapos na nahawaang selula, na humahantong sa cell lysis (8).
Sa kabilang banda, ang mga T-helper (sa asul na diagram) ay nagbubuklod sa mga B-cell, na nasa kanilang ibabaw na mga fragment ng virus na nauugnay sa MHC protein (9). Ito ay humahantong sa pumipili na pag-clone ng mga indibidwal na selulang B at ang kanilang napakalaking paglaganap, pinasisigla ng Interleukin ang (10) pagkahinog ng mga selulang B - pagbabagong-anyo sa mga selulang plasma (11) na may kakayahang mag-synthesize at magtago ng mga antibodies (12)
Phagocytosis (mula sa Greek phago - I devour at cytos - isang cell) ay isang proseso ng pagsipsip at pagtunaw ng mga antigenic substance, kabilang ang mga microorganism, ng mga cell ng mesodermal na pinagmulan, na tinatawag na mga phagocytes. I. I. Mechnikov hinati phagocytes sa macrophage at microphage. Sa kasalukuyan, nagkakaisa ang mga macro- at microphage isang solong sistema ng macrophage (SMF). Kasama sa sistemang ito ang:
- tissue macrophage - epithelioid cells,
- stellate reticuloendotheliocytes (Kupffer cells),
- alveolar at peritoneal macrophage na matatagpuan sa alveoli at peritoneal cavity,
- white process epidermocytes ng balat (Langerhans cells), atbp.
Kasama sa mga microphage ang:
- neutrophils,
- eosinophils,
- mga basophil.
Mga function ng macrophage lubhang iba-iba. Sila ang unang tumutugon sa isang dayuhang substansiya, bilang mga dalubhasang selula na sumisipsip at sumisira ng mga dayuhang sangkap sa katawan (namamatay na mga selula, mga selula ng kanser, bakterya, mga virus at iba pang mga mikroorganismo, antigens, hindi nababagong mga inorganic na sangkap). Bilang karagdagan, ang mga macrophage ay gumagawa ng maraming biologically active substances - enzymes (kabilang ang lysozyme, peroxidase, esterase), complement proteins, immunomodulators tulad ng interleukins. Ang presensya sa ibabaw ng mga macrophage ng mga receptor para sa mga immunoglobulin (Am) at pandagdag, pati na rin ang isang sistema ng mga tagapamagitan, ay tinitiyak ang kanilang pakikipag-ugnayan sa T- at B-lymphocytes. Kasabay nito, isinaaktibo ng mga macrophage ang mga proteksiyon na function ng T-lymphocytes. Dahil sa pagkakaroon ng mga receptor para sa pandagdag at Am, pati na rin ang histocompatibility system Ag (HLA), ang mga macrophage ay kasangkot sa pagbubuklod at pagkilala ng mga antigens. Kaya, ang mga phagocytes ay may tatlong pag-andar:
- proteksiyon, nauugnay sa paglilinis ng katawan ng mga nakakahawang ahente, mga produkto ng pagkabulok ng tissue, atbp.;
- kumakatawan, na binubuo sa pagtatanghal ng mga antigenic epitols sa mga lymphocytes sa phagocyte membrane;
- secretory, na nauugnay sa pagtatago ng lysosomal enzymes at iba pang biologically active substances - cytokines, na may mahalagang papel sa immunogenesis.
May mga sumusunod na sunod-sunod na dumadaloy mga yugto ng phagocytosis.
- Chemotaxis– naka-target na paggalaw ng mga phagocytes sa direksyon ng chemical gradient ng chemoattractants sa kapaligiran. Ang kakayahang chemotaxis ay nauugnay sa pagkakaroon sa lamad ng mga tiyak na receptor para sa chemoattractants (mga bagay ng phagocytosis), na maaaring bakterya, mga produkto ng pagkasira ng mga tisyu ng katawan, atbp.
- Pagdirikit(attachment) ay pinamagitan din ng kaukulang mga receptor, ngunit maaaring magpatuloy alinsunod sa mga batas ng nonspecific physicochemical interaction. Ang mga particle ay na-adsorbed sa ibabaw ng macrophage.
- Endositosis(capture) - nangyayari ang invagination ng cell membrane, ang pagkuha ng isang dayuhang particle at ang paglulubog nito sa protoplasm. Bilang resulta ng endocytosis, nabuo ang isang phagocytic vacuole - phagosome(i.e., isang bubble sa protoplasm sa paligid ng hinihigop na particle).
- intracellular digestion- nagsisimula sa pagsipsip ng mga phagocytosed na bagay. Ang phagosome ay sumasama sa lysosome ng phagocyte, na naglalaman ng dose-dosenang mga enzyme, at ang pagbuo ng phagolysosome (pagkasira) ng nakuha na particle ng mga enzyme ay nangyayari. Kapag ang isang particle na kabilang sa mismong organismo ay nasisipsip (halimbawa, isang patay na selula o mga bahagi nito, ang sarili nitong mga protina), ito ay nahati ng phagolysosome enzymes sa mga non-antigenic substance (amino acids, fatty acids, nucleotides, monosugars). Kung ang isang dayuhang butil ay nasisipsip, kung gayon ang mga enzyme ng phagolysosome ay hindi magagawang masira ang sangkap sa mga di-antigenic na sangkap. Sa ganitong mga kaso, ang phagolysosome na may natitirang at napanatili na dayuhang bahagi ng antigen ay ipinadala ng macrophage sa T- at B-lymphocytes, ibig sabihin, ang isang tiyak na link ng kaligtasan sa sakit ay nakabukas.
pagpapaandar ng pagtatago ay ang pagtatago ng mga phagocytes ng biologically active substances - cytokines - ito ay interleukin-1 at interleukin-2, na mga cellular mediator na may regulatory effect sa paglaganap, pagkita ng kaibhan at paggana ng phagocytes, lymphocytes, lymphoblasts at iba pang mga cell. Ang mga macrophage ay gumagawa at naglalabas ng mga mahahalagang salik sa regulasyon gaya ng mga prostaglandin, leukotrienes, cyclic nucleotides na may malawak na hanay ng biological activity. Bilang karagdagan, ang mga macrophage ay nag-synthesize at nagtatago ng isang bilang ng mga produkto na may aktibidad na antibacterial, antiviral at cytotoxic (oxygen radicals O2-H2O2, lysozyme, interferon, atbp.).
Ang phagocytosis ay pinahusay ng mga opsonin antibodies, dahil ang nakagapos o antigen ay mas madaling na-adsorbed sa ibabaw ng phagocyte, dahil sa pagkakaroon ng mga receptor para sa mga antibodies na ito sa huli. Ang pagpapahusay na ito ng phagocytosis ng mga antibodies ay tinatawag opsonisasyon, ibig sabihin. paghahanda ng mga microorganism para makuha ng mga phagocytes. Ang phagocytosis ng mga opsonized antigens ay tinatawag na immune.
Upang makilala ang aktibidad ng phagocytosis na ipinakilala phagocytic index. Upang matukoy ito, ang bilang ng mga bakterya na hinihigop ng isang phagocyte ay binibilang sa ilalim ng mikroskopyo. Enjoy din opsonophagocytic index na kumakatawan sa ratio ng mga phagocytic parameter na nakuha sa immune at non-immune serum. Ang phagocytic index at ang opsonophagocytic index ay ginagamit sa clinical immunology upang masuri ang estado ng immunity at immune status.
Ang phagocytosis ay gumaganap ng isang mahalagang papel sa antibacterial, antifungal at antiviral na proteksyon, na pinapanatili ang paglaban ng katawan sa mga dayuhang sangkap. Ang mga phagocytes ay mayroon ding activating at suppressive effect sa mga lymphocytes, nakikibahagi sa resuscitation ng immunological tolerance, anti-infective, transplantation at antitumor immunity, at ilang uri ng allergy (HRT).
Ang phagocytosis ay isang espesyal na proseso ng pagsipsip ng isang cell ng malalaking macromolecular complex o corpuscular na istruktura. Ang mga "propesyonal" na phagocytes sa mga mammal ay dalawang uri ng magkakaibang mga selula - mga neutrophil at macrophage, na nag-mature sa bone marrow mula sa mga HSC at nagbabahagi ng isang karaniwang intermediate progenitor cell.Ang mga neutrophil ay nagpapalipat-lipat sa peripheral na dugo at bumubuo ng isang makabuluhang bahagi ng mga leukocytes ng dugo - 60-70%, o 2.5-7.5x109 na mga cell bawat 1 litro ng dugo. Karaniwan, ang mga neutrophil ay hindi lumalabas sa mga sisidlan patungo sa mga peripheral na tisyu, ngunit sila ang unang "nagmadali" (i.e., sumasailalim sa extravasation) sa lugar ng pamamaga dahil sa mabilis na pagpapahayag ng mga molekula ng pagdirikit - VCAM-1 (VLA-4 endothelial ligand) at integrin CDllb / CD18 (ligand sa endothelium ICAM-1). Ang mga eksklusibong marker - CD66a at CD66d (carcinoma-embryonic Ag) ay nakilala sa kanilang panlabas na lamad.
Monocytes at macrophage. Ang mga monocytes ay isang "intermediate form", sa dugo sila ay 5-10% ng kabuuang bilang ng mga leukocytes. Ang kanilang layunin ay maging at maging laging nakaupo na mga macrophage sa mga tisyu.
Mga macrophage ng atay - Kupffer cells, utak - microglia, lung macrophage - alveolar at interstitial, kidney - mesangial.
♦ Mga receptor ng macrophage membrane.
O CD115 - Rc para sa monocyte colony stimulating factor (M-CSF). Ito ay naroroon din sa lamad ng isang pluripotent precursor cell ng granulocytes at monocytes at isang unipotent precursor ng monocytes, o Apat na istruktura ang kilala - Rc sa cell membrane ng macrophage na nagbubuklod sa kung ano ang potensyal na masipsip ng macrophage sa pamamagitan ng mekanismo ng phagocytosis
CD14 - Rc para sa mga complex ng bacterial LPS na may serum lipopolysaccharide-binding proteins (LBP), pati na rin sa mga LPS complex na may iba pang microbial na produkto (halimbawa, endotoxins). - Rc para sa mga binding fragment ng phospholipid membrane at iba pang bahagi ng sariling nasira at namamatay mga cell (Rc para sa "basura", scavenger receptors). Ganito, halimbawa, ang CD 163 - Rc para sa "lumang" erythrocytes. Rc binding mannose. Naroroon lamang sa lamad ng tissue macrophage.
- RC para sa pandagdag - CR3 (CDllb/CD18 integrin) at CR4 (CDllc/CD18 integrin). Bilang karagdagan sa pandagdag, nagbubuklod din sila ng isang bilang ng mga produktong bacterial: lipopolysaccharides, Leishmania lipophosphoglycan, hemagglutinin mula sa mga filament ng Bordetella, mga istruktura sa ibabaw ng yeast cells ng genera Candida at Histoplasma.
CD64 - Rts para sa "tails" (Fc-fragments) ng IgG - FcyRI (Fcy-Rts ng unang uri), na nagbibigay ng posibilidad ng phagocytosis ng immune complexes ng mga macrophage. Ang mga ito ay itinuturing na mga marker ng lamad ng mga monocytes/macrophages, dahil ang mga ito ay ipinahayag lamang sa mga cell na ito. Ang mga subclass ng IgG sa mga tuntunin ng lakas ng pagkakaugnay sa FcyRI ay nasa sumusunod na pagkakasunud-sunod: IgG3 > IgGl > IgG4 > IgG2. o Mga receptor na nakikipag-ugnayan sa lymphocytic immunity. Kasama ng nabanggit na CD64, ang mga ito ay kinabibilangan ng: - Rc para sa mga cytokine na ginawa ng immune lymphocytes. Ang pagbubuklod sa Rc ligands para sa IFNy at para sa tumor necrosis factor (TNF) ay humahantong sa pag-activate ng macrophage. Sa kabaligtaran, ang macrophage ay hindi aktibo sa pamamagitan ng Rc para sa IL-10. - CD40, B7, MHC-I / II - mga molekula ng lamad para sa mga contact na may mga pantulong na molekula ng lamad ng mga lymphocytes, i.e.
para sa direktang intercellular na pakikipag-ugnayan. Ang mga neutrophil ay walang ganoong mga receptor. mga kahihinatnan ng phagocytosis. Matapos balutin ng phagocyte ang lamad nito sa hinihigop na bagay at ilakip ito sa isang lamad na vesicle na tinatawag na phagosome, ang mga sumusunod na kaganapan ay nangyayari.
♦ Pag-cleavage ng phagocytosed material. Ang prosesong ito ay sumusunod sa parehong biochemical na mekanismo sa lahat ng phagocytes, o Ang mga lysosome ay mga espesyal na intracellular organelle na naglalaman ng isang set ng hydrolytic enzymes (acid protease at hydrolases) na may pinakamainam na pH na humigit-kumulang 4.0. Sa cell, ang mga lysosome ay nagsasama sa mga phagosome sa isang phagolysosome, kung saan nagaganap ang mga reaksyon ng panunaw ng hinihigop na materyal. 02-), singlet oxygen (1O2), hydroxyl radical (OH-), hypochloride (OC1-), nitric oxide (NO+ ). Ang mga radikal na ito ay kasangkot din sa pagkasira ng phagocytosed object.
♦ Ang pagtatago ng lytic enzymes at oxidizing radicals sa intercellular space, kung saan mayroon din silang bactericidal effect (ngunit nakakaapekto rin sa sarili nilang mga tissue).
Ang mga neutrophil, bilang karagdagan sa mga sangkap na nabanggit na, ay gumagawa at naglalabas ng collagenase, cathepsin G, gelatinase, elastase, at phospholipase A2.
♦ Produksyon at pagtatago ng mga cytokine. Ang mga macrophage at neutrophil, na isinaaktibo ng mga produktong microbial, ay nagsisimulang gumawa ng mga cytokine at iba pang mga biologically active mediator na lumikha ng pre-immune na pamamaga sa lugar ng pagpapakilala ng mga panlabas na sangkap, na naghahanda ng posibilidad na magkaroon ng lymphocytic immune response.
O Ang mga macrophage ay gumagawa ng mga interleukin (IL-1, IL-6, IL-8, IL-12); tumor necrosis factor a (TNFa); prostaglandin; leukotriene B4 (LTB4); platelet activating factor (PAF).
o Ang mga neutrophil ay gumagawa ng TNFa, IL-12, ang chemokine IL-8, LTB4, at PAT.
♦ Pagproseso at pagtatanghal ng Ag - ang pagbuo ng mga complex sa loob ng mga cell mula sa mga produkto ng cleavage ng phagocytosed na materyal na may sarili nitong MHC-II molecule at ang pagpapahayag ng complex na ito sa ibabaw ng cell na may "layunin" ng pagpapakita ng Ag para sa pagkilala ng T - mga lymphocytes. Ang prosesong ito ay isinasagawa lamang ng mga macrophage.
Ang isang malaking bilang ng mga pamamaraan para sa pagbibilang ng phagocytosis ay inilarawan sa panitikan. Ang dami ng aklat na ito ay hindi nagpapahintulot sa amin na ilarawan nang detalyado ang lahat ng mga ito, kaya lilimitahan namin ang aming sarili sa paglalarawan ng iilan lamang.
Mga materyales at kagamitan
Upang magtrabaho, kailangan mong magkaroon ng:
Citratedextrose anticoagulant: 8 g citric acid. 22 g ng trisubstituted sodium citrate (two-water), 24.5 g ng glucose ay natunaw sa 1 litro ng tubig;
Dextrosodextran solution: 4.5 g NaCl, 25 g glucose, 30 g dextran (rel. mol. wt. 500,000) sa 1 l;
Ammonium chloride solution: 9 na bahagi 0.83% ammonium chloride, 1 bahagi Tris-HCl buffer pH 7.2 (20.6 g/l);
Isang halo ng ficoll - vizotrast: 9 g ng ficoll, 20 ml ng vizotrast, 100 ml ng bidistilled H 2 0, density 1.077;
Substrate para sa β-glucuronidase: 31.5 mg ng p-nitrophenyl-β-glucuronide at 100 μm Triton X 100 ay natunaw sa 100 ml ng 0.05 M sodium acetate buffer pH 5;
Myeloperoxidase deficiency reagents: fixative (10 ml 37% formaldehyde na may 90 ml absolute ethanol), substrate solution (100 ml 30% EDTA, 0.3 g benzidine chloride, 0.038 g ZnS0 4 x7H 2 0, 1 ml distilled water, CH 1 . 3 C00Nax3H 2 0, 0.7 ml 3% H 2 0 2); dalhin ang pH ng 1.0 M NaOH sa 6.0.
Mga komersyal na reagents:
FSB, Hank's solution at Eagle-MEM medium (State Institute for Immune Preparations and Nutrient Media, Berlin-Weissensee, GDR);
Heparin (5000 IU/mg) (Gedeon Richter, Hungary);
Serum ng bovine embryo (Flow Laboratories, USA, maaaring gamitin ang ibang kumpanya);
Visotrast (Listahan ng VEB Fahlberg, Magdeburg, GDR);
Infucoll (VEB Serumwerk Bernburg, GDR);
Dextran, ficoll (Pharmacia, Sweden);
Colloidal carbon Сl1/143a (Wagner, Pelikanwerke, Germany);
Diisodecyl phthalate, paradioxane (Coleman, Matheson at Bell, USA);
Triton X 100 (Serva, Germany, posible ang isa pang kumpanya);
Pulang langis O (Allied chemical corp., Morristown, NY, USA);
Iaranitrophenyl-β-glucuronide (Sigma, USA);
Safranin O (Fischer Scientific Lab., Chicago, USA);
Polystyrene beads, tubes (Nunc, Denmark);
Grid F 905 (VEB Orvo Wolfen, GDR).
Pagkuha ng mga phagocytes
Ang kinakailangang impormasyon tungkol sa paghihiwalay ng mga granulocytes ng tao ay maaaring makuha sa kabanata na "Paghihiwalay ng mga selula ng immune system"; para sa pagkuha ng peritoneal macrophage, tingnan ang "Pag-kultura ng macrophage at monocytes" at "Paghihiwalay ng mga macrophage mula sa isang suspensyon ng spleiocytes". Ang isyung ito ay isinasaalang-alang nang detalyado sa isang bilang ng mga gawa.
Bilang karagdagan, ang mga sumusunod na pamamaraan ay dapat ding banggitin:
8 ml ng dugo ay halo-halong may solusyon ng dextranglucose. Pagkatapos ay magdagdag ng 6% na solusyon ng dextran 75 sa 0.15 M NaCl (5 ml). Ang halo ay naiwan sa loob ng 45-50 min sa temperatura ng silid para sa sedimentation ng mga erythrocytes. Aspirate ng plasma. Ang mga natitirang erythrocyte ay lysed sa pamamagitan ng pagdaragdag ng 0.83% ammonium chloride (35 ml hanggang 15 ml ng plasma). Centrifuge sa loob ng 10 minuto sa 80g, suspindihin ang precipitate sa 0.15 M NaCl na pinalamig hanggang 0°C. Pagsamahin ang ilang mga precipitates at centrifuge sa loob ng 10 minuto sa 800 g. Ang mga cell ay pinakamahusay na nakatago sa yelo sa 0.15 M NaCl (ang medium na ito ay mas angkop kaysa sa buffered media na may bivalent cations na nagiging sanhi ng mga cell na magkadikit);
Kung ang bagay ng phagocytosis ay lebadura, ang hakbang sa paggamot ng ammonium chloride ay maaaring tanggalin, dahil ang mga pulang selula ng dugo ay hindi nakakasagabal sa proseso. Ang mga mononuclear cell ay maaaring makuha tulad ng sumusunod: ang heparinized na dugo ay halo-halong may 1/3 ng dami ng daluyan ng Eagle na naglalaman ng 15% glucose, layered sa isang layer ng isang pinaghalong ficoll - visotrast at centrifuged para sa 20 minuto sa 400 g. Ang fraction ng mga mononuclear cell ay na-aspirate gamit ang isang Pasteur pipette, hugasan ng dalawang beses gamit ang PBS, at ang isang suspensyon ay inihanda sa Eagle's medium (1x10 7 cells/ml).
Paghahanda ng butil para sa phagocytosis
Ang mga live na kultura ng Staphylococcus aureus (SG 511 o 502 A), Staphylococcus epididermidis SG 475, E. coli at iba pang enterobacteria, listeria, corynebacteria, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae ay karaniwang ginagamit. Ang mga mikroorganismo ay lumaki sa loob ng 24 na oras (kung kinakailangan, 48 oras) sa solid at likidong nutrient media. Ang nakolektang biomass ay hinuhugasan ng tatlong beses gamit ang 0.15 M NaCl. Masyadong makapal ang isang suspensyon ay sinusukat sa 640 nm, ang konsentrasyon ay tinutukoy mula sa calibration curve.
Ang konsentrasyon ng mga mikroorganismo ay natutukoy din sa pamamagitan ng mga pamamaraan ng pagsala sa siksik na nutrient media; sa ilang mga kaso, ang enumeration ng mga microorganism ay maaaring isagawa sa pagbibilang ng mga silid.
Kapag nagtatrabaho sa mga live na bacterial culture, dapat mag-ingat na laging gumamit ng mga kultura sa parehong yugto. Ang pagdaragdag ng 0.01% bovine serum albumin ay nagtataguyod ng kaligtasan ng mga microorganism. Ang inihandang suspensyon ay nananatiling matatag sa loob ng 1-2 oras.
Ang mga pinatay na microorganism culture ay karaniwang nakukuha sa pamamagitan ng pag-init ng 30 minuto sa 80°C o sa pamamagitan ng paggamot na may dumadaloy na singaw. Ang mga napatay na mikrobyo ay hinuhugasan ng tatlong beses na may 0.15 M NaCl, muling sinuspinde, at ang konsentrasyon ng suspensyon ay tinutukoy.
Paghahanda ng lebadura ng panadero: 0.5 g ng lebadura ng panadero ay sinuspinde sa 0.15 M NaCl at inilagay sa isang paliguan ng tubig na kumukulo sa loob ng 30 minuto. Salain sa pamamagitan ng cotton-gauze filter. Kapag gumagamit ng live na lebadura, ang mga sariwang selula (4-5 araw na kultura) ay hinuhugasan ng tatlong beses sa medium ng Eagle na may pagdaragdag ng 1.0% na glucose. Karaniwan ang isang cell suspension na 10 8 at 10 9 na mga cell/ml ay ginagamit. Ang mga lebadura ay ginagamit bilang mga particle ng pagsubok sa pagtuklas ng mga depekto sa bahagi ng C5.
Paggamit ng isang suspensyon ng polystyrene particle: Maghanda ng 10% aqueous suspension ng polystyrene particle na may diameter na 1.091 μm. Ito ay diluted sa isang ratio ng 1 + 1 na may isang 0.2% BSA solusyon sa 0.15 M NaCl, centrifuged. Sa isang wavelength na 253 nm, ang isang suspensyon ng polystyrene 1 μg/ml ay nagbibigay ng pagsipsip ng 1.17x10 -3 .
Paglalapat ng isang suspensyon ng lipopolysaccharide - pula ng langis O sa mineral na langis: 2 g ng pula ng langis ay triturated sa 50 ML ng diisodecyl phthalate (o langis ng vaseline) sa isang porcelain mortar. Centrifuge para sa 20 min sa 500 g. Magdagdag ng 10 μg ng supernatant fraction sa 10 ml ng dioxin, sukatin ang optical density sa wavelength na 525 nm. Ang conversion factor ay 0.92. Sa ikalawang yugto, 40 mg ng lipopolysaccharide (E. coli 0.26 B6, atbp.) ay natunaw sa 3 ml ng 0.15 M NaCl. Pagkatapos ay 1 ml ng isang solusyon ng madulas na pula O sa diisodecyl sulfate ay idinagdag sa halo na ito, at ang halo ay sinuspinde ng 90 segundo. Ang suspensyon ay ginagamit kaagad at maaaring i-freeze.
Upang i-set up ang reaksyon ng phagocytosis, ang mga pormal na erythrocytes ay maaaring gamitin bilang mga particle ng pagsubok.
Phagocytosis ng bakterya, bactericidal
Eksperimento sa pagsususpinde ng live na bacteria: Karaniwang ginagamit ang ratio na 3-10 microbes/phagocyte. Sa kabuuang dami ng 2 ml, 1x10 6 phagocytes ay halo-halong may 3x10 6 - 1x10 7 microbes. Sa pagsasagawa, ang 1 ml ng bacterial suspension ay idinagdag sa 1 ml ng phagocyte suspension, kung saan idinagdag ang 8 IU ng heparin. Ang oras ng pakikipag-ugnayan ay karaniwang 30 minuto, sa ilang mga kaso ito ay mas mahaba. Pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog, 0.5 ml ng halo ang kinuha, 1.5 ml ng isang 0.1% gelatin solution sa Hank's solution, pinalamig sa 0 ° C, ay idinagdag, at centrifuge para sa 3-4 minuto sa 300 g. Ang mga pahid ay inihanda mula sa namuo, na kung saan ay nabahiran ayon sa Pappenheim. Tingnan ang 200 mga cell (kung maaari tatlong beses). Kalkulahin ang porsyento ng phagocytosis. Ayon sa bilang ng mga bakterya na nakapaloob sa mga selula, ang index ng aktibidad ng phagocytosis ay kinakalkula: ang bilang ng mga phagocytized na bakterya ay pinarami ng porsyento ng mga phagocytic na selula; ang intensity ng phagocytosis ay ipinahayag ng mga numero mula 1 hanggang 4.
Grade 1: Phagocytosed na may I-4 bacteria
Grade 2: phagocytosed 5-7 bacteria
Grade 3: phagocytosed 8-10 bacteria
Grade 4: Mahigit sa 10 bacteria bawat cell na na-phagocytos
Kapag tinutukoy ang antas ng phagocytosis ng mga buhay na microbes, ang cell sediment at ang supernatant fraction ay hiwalay na sinusuri. Ang bilang ng mga live microbes ay natutukoy sa pamamagitan ng pagsala sa solid nutrient media na 0.1 ml ng mga pinag-aralan na fraction. Incubated para sa 24 (48) oras Kapag kinakalkula ang aktibidad ng bactericidal, ipinapalagay na ang isang nabuong kolonya ay tumutugma sa isang buhay na mikrobyo.
Para sa isang nakadirekta na pag-aaral ng aktibidad ng bactericidal, ang dugo ng mga pasyente at malusog na donor ay sinusuri kasama ang pagdaragdag ng isang antibiotic solution (5000 IU ng penicillin at streptomycin / ml) at kung wala ito, at isinasagawa din ang pagkontrol sa bakterya. Sample na komposisyon: 0.3 ml ng Hank's solution + 0.1 ml ng normal na serum na nakuha mula sa dugo na kinuha mula sa 5 donor + 0.5 ml ng leukocyte suspension (10 7 cells / ml) + 0.1 ml ng microbial suspension (10 6 microbes/ml). Ang isang solusyon ng antibiotics ay idinagdag sa 0.02 ml bawat sample. I-incubate ang mga sample sa 37°C at tukuyin ang bilang ng mga mikrobyo pagkatapos ng 20 minuto, 1.5 oras at 3 oras. Upang gawin ito, kumuha ng 0.1 ml mula sa bawat sample, palabnawin ang mga napiling aliquot na may solusyon ng Hank 10, 100 at 1000 beses at ilapat sa pinainit na agar. Minsan, lalo na kung ang mga antibiotics ay idinagdag, ang mga intermediate dilution ay inihanda para sa isang tumpak na bilang ng mga microbes (halimbawa, 0.2 ml ng sample ay halo-halong may 5 ml ng Hank's solution, centrifuge para sa 5 minuto sa 450 g, ang precipitate ay natunaw sa 1.9 ml ng PBS, inilapat sa agar). Kung nais mong paikliin ang tagal ng pag-aaral ng bacteriological, maaari mong matukoy ang mga microbes sa loob ng cell sa pamamagitan ng fluorescence gamit ang acridine yellow staining.
Phagocytosis ng lebadura ng panadero: maghanda ng suspensyon na 10 9 cells/ml sa 0.15 M NaCl. Paghaluin ang 0.1 ml ng suspensyon sa 0.1 ml ng plasma ng pasyente, i-incubate sa loob ng 30 minuto sa 37 ° C, magdagdag ng 0.2 ml (10 6) PMNL, i-incubate ng 30 minuto. Ang mga aliquot ay kinukuha sa pagitan ng 5 hanggang 30 minuto. Binibilang ang 100 PMN at tinutukoy ang bilang ng mga nakuhang yeast particle bawat cell. Ang sumusunod na pagbabago ay kilala: sa 50 μl ng guinea pig serum, magdagdag ng 50 μl ng test serum (dating diluted sa ratio na 1 + 1 sa Eagle's medium na may glucose), magdagdag ng 50-200 μl ng isang suspensyon ng leukocytes (10 7 cells / ml), ayusin ang volume sa 450 μl gamit ang medium Needle na may glucose at i-incubate ng 30 min sa 37 °C. Pagkatapos ay magdagdag ng 50 μl ng yeast suspension (10 8 cells/ml), ihalo, i-incubate ng 40 minuto sa 37 °C. Magdagdag ng 50 μl ng L-75 Se-methionine (kabuuang aktibidad 100 kBq), ihalo at i-incubate ng 1 oras sa 37 °C. Ang mga cell ay na-precipitate sa pamamagitan ng centrifugation sa loob ng 5 minuto sa 1000 g, sila ay hugasan ng dalawang beses sa PBS, ang radyaktibidad ay sinusukat sa isang gamma counter. Ang porsyento ng phagocytosed yeast ay kinakalkula ng formula:
Phagocytosis gamit ang isang solusyon ng pula ng langis sa mineral na langis: 0.2 ml ng particle suspension ay halo-halong may 0.8 ml ng cell suspension na pinainit sa 37°C. Pagkatapos ng 5 minuto ng incubation, 6 ml ng isang 0.15 M NaCl solution na pinalamig hanggang 0°C na naglalaman ng 126 μg/l ng N-ethylmaleimide (upang ihinto ang pagkuha ng mga particle) ay idinagdag. Centrifuge para sa 10 minuto sa 250 g. Ang supernatant fraction ay itinapon, ang precipitate ay muling sinuspinde sa isang solusyon ng NaCl at N-ethylmaleimide (tingnan sa itaas), ang mga cell ay hugasan ng dalawang beses. Ang mga cell ay lysed sa ultrasound, ang pula ng langis ay inilabas. Magdagdag ng 1 ml ng dioxane. Centrifuged para sa 15 minuto sa 500 g, sukatin ang optical density sa isang wavelength na 525 nm laban sa purong dioxane. Ang antas ng phagocytosis (IF) ay tinukoy bilang ang halaga ng mineral na langis (mg) na hinihigop bawat minuto ng 10 7 mga cell. Maaari mong gamitin ang sumusunod na formula upang makalkula:
Ang pag-aaral ng phagocytosis sa monolayer ng macrophage:
1. Phase: 2 ml ng cell suspension (200,000 cells/ml) ay idinagdag sa sterile polystyrene tubes. Mag-inoculate ng 5 oras sa 37°C, pagkatapos ay hugasan gamit ang medium ng Eagle. 2 ml ng culture medium na may 10% inactivated (30 min, 56 °C) serum ng bovine embryo ay idinagdag sa mga test tube, na incubated sa 37 °C.
2. Phase A: isang suspensyon ng microbes (3-10/macrophage) ay idinagdag, incubated para sa 30-60 min sa 37 °C, ang tubes ay anglaw 6 beses na may 3 ml na bahagi ng daluyan upang alisin ang non-phagocytosed microbes. Ayusin kaagad gamit ang pinaghalong 1 bahagi ng glacial acetic acid at 3 bahagi ng methanol. Mantsa ang paghahanda ayon sa Mayo - Griinwald, bilangin ang mga selula.
Phase B: pagtukoy ng intracellular na buhay na bakterya. Ang pagkakasunud-sunod ng mga operasyon ay pareho sa phase A bago ang yugto ng pag-aayos. Pagkatapos ng paghuhugas, maingat na alisin ang lahat ng mga bakas ng daluyan. Ang mga cell ay lysed, kung saan ang 2 ml ng isang 0.01% sterile solution ng bovine serum albumin (4°C) ay idinagdag, paulit-ulit na inalog. Karamihan sa mga cell ay lysed pagkatapos ng 20 minuto. Ang inilabas na bakterya ay tinutukoy sa pamamagitan ng pagsala sa siksik na nutrient media.
Phagocytosis ng erythrocytes: paghaluin ang 4x10 7 phagocytes sa 5x10 7 test erythrocytes sa 5 ml ng PBS. Ilipat ang 2 ml ng pinaghalong sa 5 mM phosphate buffer na pinalamig sa 0°C at centrifuge. Sukatin ang optical density ng supernatant fraction sa wavelength na 420 nm. Ang antas ng phagocytosis ay natutukoy sa pamamagitan ng pagbaba sa nilalaman ng hemoglobin sa cell-free phase gamit ang mga curve ng pagkakalibrate.
Pinasimpleng paraan para sa pagtukoy ng clearance
Isang halimbawa ng pagtukoy ng clearance sa mga daga: ang mga hayop ay tinuturok nang intraperitoneally sa 5x10 7 microbes bawat 100 g ng timbang (0.1 ml/ /100 g). Ang pinakamainam na dosis ay maaaring mula 10 6 hanggang 10 8 bawat 100 g ng timbang. Sa pagitan ng 1-2 oras, 3 indibidwal ang kinakatay mula sa bawat pangkat ng mga eksperimentong hayop; kabuuang tagal ng eksperimento 16 na oras. Sterilly kumuha ng 0.5 ml ng dugo mula sa puso, 1 ml ng peritoneal fluid, ilihim ang mga baga, atay, pali at bato. Ang mga silindro ay pinutol mula sa organ tissue na may Pasteur pipette. Tukuyin ang bilang ng mga microorganism sa pamamagitan ng pag-culture sa likido at solid nutrient media.
Halimbawa ng pagtukoy ng clearance sa mga daga: colloidal charcoal o may label na 51 [Cr] ram erythrocytes ay ginagamit. Ang mga daga (hindi bababa sa 5 indibidwal bawat karanasan) ay tinuturok sa ugat ng 0.01 ml ng isang suspensyon ng karbon sa rate na 16 mg bawat 100 g ng timbang. Sa loob ng 15 minuto na may pagitan ng 2 minuto, 0.025 ml ng dugo ang kinuha mula sa retroorbital space. Ang napiling 0.025 ml ng dugo ay idinagdag sa 2.0 ml ng 0.1% Na 2 C0 3 na solusyon. Pagkatapos ng hemolysis, ang konsentrasyon ng karbon ay tinutukoy ng colorimetrically sa wavelength na 675 nm gamit ang mga calibration curves.
t ay ang oras sa minuto, C ay ang carbon concentration sa sample.
Nawastong halaga ng phagocytosis:
Functional screening ng phagocytes
Degranulation determination (activity measurement (β-glucuropidase): 10 7 leukocytes ay sinuspinde sa 0.8 ml ng PBS sa plastic tubes, inalog ng 5 minuto sa 37 ° C. Magdagdag ng 0.2 ml ng sensitized LPS, fluorochromic particle (FC 80), cool na 30 minuto sa yelo, centrifuge sa loob ng 10 minuto sa 250 g Suriin ang aktibidad ng enzyme sa supernatant fraction I-incubate ang 0.9 ml ng substrate mixture sa loob ng 18 oras na may 0.1 ml ng ininvestigated fraction Magdagdag ng 2 ml ng 0.1 M NaOH, sukatin ang optical density sa alon 410 nm.
Pagkalkula:
(OD 410 x20) / (1.84 x 18) = bilang ng nmol ng substance na inilabas sa loob ng 1 oras ng 10 7 leukocytes, i.e. ang antas ng degranulation ay ipinahayag sa mga nanomol ng paranitrophenyl-β-glucuronide.
Paraan para sa pagtukoy ng mga depekto sa myeloperoxidase: ang pinakamahusay na mga resulta ay nakuha sa pamamagitan ng biochemical na pagpapasiya ng H 2 0 2, na nagpapahiwatig ng mga pagbabago sa metabolismo sa panahon ng phagocytosis. Para sa mga praktikal na layunin, napakahalaga na ang pag-activate ng hexose-monophosphate shunt, ang pagbawas ng tetrazolium nitroene, at ang pagbubuklod ng exogenous iodine sa mga protina ng PMNL ay nauugnay sa pagbuo ng H 2 0 2 . Ang isang regular na blood smear ay naayos sa loob ng 30 segundo na may pinaghalong alkohol at formalin. Hinugasan ng distilled water, at stain para sa peroxidase sa loob ng 30 segundo. Sa mga cell na naglalaman ng peroxidase, ang mga inklusyon na nabahiran ng madilim na asul ay nakita.
Pagsubok para sa pagbabawas ng tetrazolium nitro blue (TNS). Ang THC ay binabawasan ng normal na PMNL sa formazan. Ihalo sa 0.1 ml ng dugo ang 0.1 ml ng 0.1% na solusyon ng THC sa 0.15 M NaCl, i-incubate sa loob ng 20 minuto sa 37 ° C, ihalo muli nang lubusan. Ang pagsasama ng Formazan sa mga cell ay tinutukoy ng mikroskopya. Ang resulta ay ipinahayag bilang isang porsyento ng mga cell na positibo sa formazan.
Ang sumusunod na paraan ay medyo mas kumplikado: 1 patak ng dugo ng pasyente ay inilapat sa isang coverslip. I-incubate sa loob ng 20 minuto sa 37°C sa isang basang silid, pagkatapos ay maingat na hugasan ang baso gamit ang sterile na 0.15 M NaCl. Maglagay ng cover slip sa isang slide na naglalaman ng 1 drop ng THC medium (0.5 ml ng serum + 0.3 ml ng sterile 0.15 M NaCl + 0.6 ml ng THC, tingnan sa itaas). Incubate para sa 30 minuto sa isang mahalumigmig na silid sa 37°C, alisin ang coverslip at tuyo sa hangin. Ayusin gamit ang absolute methanol sa loob ng 60 segundo at hugasan ng distilled water. Mantsang para sa 5 min na may safranin (1 g safranin + 100 ml distilled water + 40 ml gliserin), hugasan. Ang mga cell na positibo sa Formazan ay malaki, parang sabog, at naglalaman ng mga asul na butil. Karaniwan, halos 30% ng mga cell na positibo sa formazan ay nakita sa paghahanda.
Ang mga pamamaraan sa itaas para sa pagtatasa ng phagocytosis ay isang buod ng napakalaking bilang ng mga publikasyon. Ang mas detalyadong impormasyon sa mga isyung ito ay matatagpuan sa mga nauugnay na gawa.
16. Phagocytic reaksyon.
Phagocytosis- ang proseso ng aktibong pagsipsip, panunaw at hindi aktibo ng mga dayuhang particle ng mga dalubhasang phagocyte cells.
Mga yugto ng phagocytosis:
Ang Chemotaxis ay ang may layuning paggalaw ng mga phagocytes kasama ang gradient ng konsentrasyon ng mga espesyal na biologically active substance - chemoattractants.
Adhesion - dumidikit sa isang mikrobyo. Ang mga Opsonin (AT, fibronectin, surfactant) ay bumabalot sa mga mikroorganismo at makabuluhang nililimitahan ang kanilang kadaliang kumilos.
Endocytosis (pagsipsip). Bilang isang resulta, ang isang phagosome ay nabuo na may isang bagay ng phagocytosis na nakapaloob sa loob. Ang mga lysosome ay dumadaloy sa phagosome at pumila sa kahabaan ng perimeter nito.
pantunaw. Pagsasama ng isang phagosome na may isang lysosome upang bumuo ng isang phagolysosome. Dagdag pa, ang mga phagocytosed microorganism ay inaatake ng oxygen-dependent (peroxide, oxygen superoxide, cytochrome b; nabuo ang mga produkto na may nakakalason na epekto, nakakapinsala sa mga microorganism at nakapaligid na istruktura) at oxygen-independent (mga butil na may lactoferrin, lysozyme, atbp.; mga produktong ito. nagdudulot ng pinsala sa cell wall at nakakagambala sa ilang metabolic process) na mga kadahilanan.
resulta ng phagocytosis.
Nakumpleto - kamatayan at pagkasira ng mga mikroorganismo
Hindi kumpleto - ang bakterya na nilagyan ng mga kapsula o siksik na hydrophobic cell wall ay lumalaban sa pagkilos ng lysosomal enzymes; hinaharangan ang pagsasanib ng mga phagosome at lysosome.
Mga uri ng phagocytic cells:
Mga macrophage at dendritic cells - mga propesyonal na phagocytes at antigen-presenting cells
Microphage - polymorphonuclear leukocytes (neutrophils) - katamtamang phagocytosis lamang
Ang mga monocyte ng dugo ay lumilipat sa mga tisyu sa ilalim ng impluwensya ng mga cytotoxin at nagiging residente.
Macrophages. Atay - Kupffer cells
Mga baga - alveolar macrophage
CNS - microglial cells
Bone marrow - mga osteoclast
Bato - mesangial cells
Phagocytose microorganisms at iproseso (digest) ang mga ito; nagpapakita ng antigen sa mga T cells.
NK - natural killers - hindi pinagkaiba ang AH, ay antibody-independent, gumagana lamang laban sa mga cell at tumutugon lamang sa mga cellular factor.
Mga tagapagpahiwatig ng phagocytosis:
Phagocytic index (phagocytic activity) - ang porsyento ng mga neutrophil na naglalaman ng mga particle ng microorganism
Phagocytic number (phagocytic index) - ang average na bilang ng mga microorganism na hinihigop ng isang phagocyte.
17. Humoral immune response.
Tatlong uri ng cell ang kasangkot sa humoral immune response: macrophage (AG-presenting cells), T-helpers, at B-lymphocytes
Mga cell na nagpapakita ng AG phagocytose ang mikroorganismo at iproseso ito, hinahati ito sa mga fragment (pagproseso ng AG). Ang mga fragment ng AG ay nakalantad sa ibabaw ng AG-presenting cell kasama ang MHC molecule. Ang AG-molecule MHC2 complex ay ipinakita sa T-helper. Ang pagkilala sa complex ng T-helper ay nagpapasigla sa pagtatago ng IL-1 ng mga macrophage.
T-katulong sa ilalim ng impluwensya ng IL-1, synthesize nito ang IL-2 at mga receptor para sa IL-2, ang huli, sa pamamagitan ng mekanismo ng autocrine, ay pinasisigla ang paglaganap ng T-helpers, pati na rin ang CTL. Kaya, pagkatapos makipag-ugnay sa isang cell na nagtatanghal ng AG, nakuha ng T-helper ang kakayahang tumugon sa pagkilos ng IL-2 sa pamamagitan ng mabilis na pagpaparami. Ang biological na kahulugan ng hindi pangkaraniwang bagay na ito ay ang akumulasyon ng mga T-helpers, na tinitiyak ang pagbuo sa mga lymphoid organ ng kinakailangang pool ng mga selula ng plasma na gumagawa ng mga antibodies sa AG na ito.
B-lymphocyte. Ang pag-activate nito ay nagsasangkot ng direktang pakikipag-ugnayan ng AG sa molekula ng Ig sa ibabaw ng B cell. Sa kasong ito, ang B-lymphocyte mismo ay nagpoproseso ng AG at nagpapakita ng fragment nito na may kaugnayan sa MHC2 molecule sa ibabaw nito. Kinikilala ng complex na ito ang T-helper na pinili gamit ang parehong antigen. Ang pagkilala ng T-helper receptor ng AG-MHC2 complex sa ibabaw ng B-lymphocyte ay humahantong sa pagtatago ng IL-2, IL-4, IL-5 at IFN-gamma ng T-helper, sa ilalim ng impluwensya kung saan dumarami ang B-cell, na bumubuo ng clone ng mga selula ng plasma. Ang mga selula ng plasma ay nag-synthesize ng mga antibodies. Ang pagtatago ng AT ay pinasigla ng IL-6 na itinago ng naka-activate na T-helper. Ang ilang mga mature na B-lymphocytes pagkatapos ng antigen-independent na pagkita ng kaibhan ay umiikot sa katawan sa anyo ng mga memory cell.
5 klase: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM; Ang mga molekula ng IgD, IgE, IgG ay kinakatawan ng mga monomer, ang IgM ng mga pentamer, ang molekula ng IgA sa serum ng dugo ay isang monomer, at sa mga excreted na likido (laway, lacrimal fluid) ito ay isang dimer
IgG: tumagos sa pamamagitan ng inunan sa katawan ng pangsanggol upang matiyak ang pagbuo ng passive immunity sa fetus, pagkatapos ng kapanganakan ng isang bata, ang nilalaman nito sa serum ng dugo ay bumaba at umabot sa isang minimum na konsentrasyon ng 3-4 na buwan, pagkatapos nito ay nagsisimula itong tumaas dahil sa akumulasyon ng sarili nitong IgG, na umaabot sa pamantayan ng 7 taon . Ang pagtuklas ng mataas na titer ng IgG hanggang Ag ng isang partikular na pathogen ay nagpapahiwatig na ang katawan ay nasa yugto ng convalescence o isang partikular na sakit ay inilipat kamakailan.
IgM: ang nilalaman nito ay makabuluhang nadagdagan sa mga bagong silang na nagkaroon ng impeksyon sa intrauterine. Ang pagkakaroon ng IgM sa Ag ng isang tiyak na pathogen ay nagpapahiwatig ng isang talamak na nakakahawang proseso.
IgA: circulates sa serum ng dugo, at din secreted sa ibabaw ng epithelium., naroroon sa laway, lacrimal fluid, gatas. Ang mga molekula ng IgA ay kasangkot sa mga reaksyon ng neutralisasyon at agglutination ng mga pathogen. Ang mga secretory immunoglobulin ng IgA class (SIgA) ay naiiba sa mga serum sa pamamagitan ng pagkakaroon ng isang secretory component na nauugnay sa 2 o 3 IgA monomer.
IgD: na matatagpuan sa ibabaw ng pagbuo ng B-lymphocytes, ang nilalaman nito ay umabot sa maximum na 10 taon, ang isang bahagyang pagtaas sa mga titer ay nabanggit sa panahon ng pagbubuntis, bronchial hika, systemic lupus erythematosus at sa mga taong may immunodeficiencies
IgE: na-synthesize ng mga selula ng plasma sa bronchial at peritoneal lymph nodes, sa mucosa ng gastrointestinal tract. Ang IgE ay tinatawag ding reagins, dahil nakikibahagi sila sa mga reaksyon ng anaphylactic, pagkakaroon ng isang binibigkas na cytophilicity.
Mula sa ika-10 linggo ng pag-unlad ng intrauterine, nagsisimula ang synthesis ng IgM, mula ika-12 - IgG, mula ika-30 - IgA, ngunit mababa ang kanilang konsentrasyon.
Ang proteksiyon na pag-andar ng mga antibodies sa panahon ng impeksyon:
Ang Ab sa pamamagitan ng mga Ag-binding center ay nakikipag-ugnayan sa iba't ibang Ag. Kaya, pinipigilan ng Abs ang impeksiyon o inaalis ang pathogen o hinaharangan ang pag-unlad ng mga reaksyon ng pathological, habang ina-activate ang lahat ng partikular na sistema ng pagtatanggol.
Opsonization (immune phagocytosis)– Ang Abs (sa pamamagitan ng Fab fragment) ay nagbubuklod sa cell wall ng katawan; Ang Fc fragment ng Ab ay nakikipag-ugnayan sa kaukulang phagocyte receptor, na namamagitan sa kasunod na epektibong pagsipsip ng nabuong complex ng phagocyte.
Antitoxic effect Ang abs ay maaaring magbigkis at sa gayon ay inactivate ang bacterial toxins.
Pag-activate ng papuri Ang Ab (IgM, IgG) pagkatapos ng pagbubuklod sa Ag (microorganism, tumor cell) ay nagpapagana sa sistema ng papuri, na humahantong sa pagkasira ng cell na ito sa pamamagitan ng pagbubutas ng cell wall nito, pagtaas ng chemotaxis, chemokinesis at immune phagocytosis
Neutralisasyon– nakikipag-ugnayan sa mga cell receptor na nagbubuklod sa bakterya o mga virus, mapipigilan ng Ab ang pagdirikit at pagtagos ng mga mikroorganismo sa mga selula ng host organism.
Nagpalipat-lipat ng mga immune complex Ang abs ay nagbubuklod sa natutunaw na Ag at bumubuo ng mga nagpapalipat-lipat na mga complex, sa tulong ng kung saan ang Ag ay pinalabas mula sa katawan, pangunahin sa ihi at apdo.
Ang cytotoxicity na umaasa sa antibody– sa pamamagitan ng pag-opsonize ng Ag, pinasisigla ng Ab ang kanilang pagkasira ng mga cytotoxic cells. Ang apparatus na nagbibigay ng target na pagkilala ay mga receptor para sa Fc fragment ng Ab. Ang mga macrophage at granulocytes ay may kakayahang sirain ang mga opsonized na target.
Mga katangian ng antibodies:
Pagtitiyak- ang kakayahan ng mga antibodies na tumugon lamang sa isang tiyak na antigen, dahil sa pagkakaroon ng mga antigenic determinants sa antigen at antigenic receptors (antideminants) sa antibody.
Valence- ang bilang ng mga antideterminants sa antibody (karaniwan ay bivalent);
affinity, affinity ay ang lakas ng koneksyon sa pagitan ng determinant at antideterminant;
Avidity ay ang lakas ng antibody-antigen bond. Dahil sa valence, ang isang antibody ay nakagapos sa ilang antigens;
Heterogenity- heterogeneity, dahil sa pagkakaroon ng tatlong uri ng antigenic determinants:
isotypic- kilalanin ang pag-aari ng isang immunoglobulin sa isang tiyak na klase (IgA, IgG, IgM, atbp.);
Allotypic- (intraspecific specificity) tumutugma sa allelic variants ng immunoglobulin (heterozygous hayop ay may iba't ibang immunoglobulins);
Idiotypical- sumasalamin sa mga indibidwal na katangian ng immunoglobulin (maaaring maging sanhi ng mga reaksiyong autoimmune).
Mga tampok ng edad:
Sa panahon ng postnatal, mayroong isang napaka makabuluhang dinamika sa nilalaman ng mga immunoglobulin ng iba't ibang klase sa dugo ng mga bata. Ito ay dahil sa katotohanan na sa mga unang buwan ng buhay, nagpapatuloy ang pagkawatak-watak at pag-alis ng mga immunoglobulin ng klase B na inilipat nang transplacental mula sa ina.
Sa unang 4-6 na buwan, ang mga maternal immunoglobulin ay ganap na nawasak at ang synthesis ng kanilang sariling mga immunoglobulin ay nagsisimula.