Depende sa pamamaraan ng paghahanda, ang mga kultura ng cell ay inuri sa:

- isang patong– ang mga cell ay nakakabit at dumami sa ibabaw ng chemically neutral na salamin o plastik.

- pagsususpinde- ang mga cell ay dumarami sa buong dami ng nutrient medium kapag ito ay hinalo.

- organ- buong piraso ng mga organo at tisyu na nagpapanatili ng orihinal na istraktura sa labas ng katawan (limitadong paggamit).

Ang pinakalaganap ay solong layer na mga kultura ng cell, alin maaaring hatiin depende sa bilang ng mga mabubuhay na henerasyon sa

1) pangunahin (pangunahing trypsinized),

2) semi-transplantable (diploid)

3) maaaring ilipat.

Pinanggalingan inuri sila sa embryonic, neoplastic at mula sa mga adult na organismo.

Sa pamamagitan ng morphogenesis- sa fibroblastic, epithelial, atbp.

Pangunahin Ang mga cell culture ay mga selula ng anumang tissue ng tao o hayop na may kakayahang tumubo bilang isang monolayer sa ibabaw ng plastik o salamin na pinahiran ng espesyal na nutrient medium. Limitado ang haba ng buhay ng naturang mga pananim. Sa bawat kaso, ang mga ito ay nakuha mula sa tissue pagkatapos ng mekanikal na paggiling, paggamot na may proteolytic enzymes at standardisasyon ng bilang ng mga cell. Ang mga pangunahing kultura na nagmula sa mga bato ng unggoy, mga embryonic na bato ng tao, amnion ng tao, mga embryo ng manok ay malawakang ginagamit para sa paghihiwalay at akumulasyon ng virus, gayundin para sa paggawa ng mga bakunang viral.

semi-transplantable(o diploid ) mga kultura ng cell - mga cell ng parehong uri, na may kakayahang makatiis ng hanggang 50-100 na mga sipi sa vitro, habang pinapanatili ang kanilang orihinal na diploid na hanay ng mga chromosome. Ang mga diploid strain ng human embryonic fibroblast ay ginagamit kapwa para sa pagsusuri ng mga impeksyon sa viral at sa paggawa ng mga bakunang viral. Ang pinakakaraniwang ginagamit na kultura ay mga human embryonic fibroblast (WI-38, MRC-5, IMR-9), baka, baboy, tupa, atbp.

inilipat Ang mga linya ng cell ay nailalarawan sa pamamagitan ng potensyal na imortalidad at heteroploid karyotype. Ang mga pangunahing kultura ng cell ay maaaring maging mapagkukunan ng tuluy-tuloy na mga linya(halimbawa, SOC - ang puso ng cinamobus monkey, PES - ang bato ng embryo ng baboy, VNK-21 - mula sa mga bato ng day-old Syrian hamster; PMS - mula sa kidney ng guinea pig, Vero - isang kidney ng isang berdeng unggoy, atbp.) Ang mga indibidwal na selula na kung saan ay nagpapakita ng isang ugali sa walang katapusang pagpaparami sa vitro. Ang hanay ng mga pagbabago na humahantong sa paglitaw ng mga naturang tampok mula sa mga cell ay tinatawag na pagbabagong-anyo, at ang mga selula ng mga transplanted tissue culture ay tinatawag na transformed. Ang isa pang pinagmumulan ng mga naililipat na linya ng cell ay malignant neoplasms. Sa kasong ito, ang pagbabagong-anyo ng cell ay nangyayari sa vivo. Ang mga sumusunod na linya ng mga transplanted cell ay kadalasang ginagamit sa virological practice: HeLa - nakuha mula sa cervical carcinoma; Ner-2 - mula sa carcinoma ng larynx; Detroit-6 - mula sa metastasis ng kanser sa baga hanggang sa utak ng buto; RH - mula sa bato ng tao, KB - oral cavity carcinoma, RD - rhabdomyosarcoma ng tao.

Mga kultura ng organ- ay mga seksyon ng mga organo ng hayop na inihanda sa ilalim ng mga sterile na kondisyon, na para sa isang tiyak na panahon (araw, linggo) ay nagpapanatili ng kanilang mahahalagang aktibidad sa mga espesyal na kondisyon ng paglilinang

Mga kultura ng cell - ang mga ito ay genetically homogenous na populasyon ng mga cell na lumalaki sa pare-pareho ang mga kondisyon sa kapaligiran. Ang mga ito ay maaaring mga strain ng normal na tao, hayop, halaman o malignant na mga selula ng tumor.

Mga kondisyon sa paglilinang

Ang mga cell ay karaniwang inilalagay sa mga garapon ng salamin, kaya ang pangalan ng in vitro study (mula sa Latin na In - in, vitro - glass), bagaman ang mga kultura ay mas madalas na lumaki sa mga plastic na sisidlan. Ang mga cell na nakahiwalay mula sa mga tisyu ay incubated sa temperatura na 38 ° C 39 ° C (para sa mga selula ng hayop at tao) at sa 22 ° C 28 ° C (para sa mga selula ng halaman) sa isang nutrient medium ng naaangkop na komposisyon. Ang mga cell pagkatapos ay lumalaki bilang isang suspensyon o monolayer. Ang kultura ng suspensyon ay ang paglilinang ng mga indibidwal na selula o maliliit na grupo ng mga ito na nakasuspinde sa isang likidong nutrient medium gamit ang mga kagamitan na nagbibigay sa kanila ng aeration at paghahalo. Ang isang katangian ng mga kultura ng suspensyon ay ang kanilang morphological at biochemical heterogeneity. Ang populasyon ng cell ay naglalaman ng mga cell na naiiba sa laki at hugis.

Aplikasyon

Application sa cytology

Sa cytology, ang pamamaraang ito ay maginhawa dahil ang mga cell sa kultura ay madaling ma-access para sa iba't ibang biochemical manipulations. Kapag nagtatrabaho sa kanila, ang mga radioactive substance, lason, hormones, atbp. ay maaaring ipakilala sa tamang konsentrasyon para sa kinakailangang oras. Ang dami ng mga sangkap na ito ay maaaring mas mababa kaysa sa mga eksperimento sa hayop. Walang panganib na ang sangkap ay ma-metabolize ng atay, ilalabas ng mga bato o ideposito sa mga kalamnan. Nagbibigay ito ng mga tunay na halaga ng rate ng pagkilos ng sangkap sa cell o ang asimilasyon nito sa pamamagitan ng cell.

Upang pag-aralan ang mga buhay na selula ng halaman, ginagamit ang isang kultura ng mga nakahiwalay na protoplast. Ang mga nakahiwalay na protoplast ay maaaring tukuyin bilang "hubad" na mga selula ng halaman dahil ang cell wall ay tinanggal sa mekanikal o enzymatically. Ang sistema ng mga nakahiwalay na protoplast ay ginagawang posible upang isagawa ang pagpili sa antas ng cellular, upang gumana sa isang maliit na dami na may malaking bilang ng mga indibidwal na mga cell, upang makakuha ng mga bagong anyo ng mga halaman sa pamamagitan ng direktang paglipat ng gene, upang makakuha ng somatic hybrids sa pagitan ng systematically remote species . Dahil ang pagbabagong-buhay ng lamad ng cell ay agad na nagsisimula sa mga nakahiwalay na protoplast, ang mga ito ay isang maginhawang bagay para sa pag-aaral ng pagbuo ng cellulose microfibrils.

Application sa virology

Sa virology, ang mga cell culture ay ginagamit nang napakalawak, dahil ang mga ito ay medyo madaling gamitin sa laboratoryo, hindi katulad ng iba pang mga pamamaraan - lumalaki ang mga virus sa mga embryo ng manok o sa mga nabubuhay na hayop. Bilang karagdagan, ang cytopathic na epekto ng mga virus ay maaaring pag-aralan nang mabuti sa isang cell culture monolayer, sa pamamagitan ng pagbuo ng intracellular inclusions, plaques, sa hemadsorption at hemagglutination reactions, at sa pamamagitan ng color breakdown. Kapag nagtatrabaho sa mga kultura ng cell, ang mga makabuluhang resulta ay maaaring makuha kapag nagtatrabaho sa isang maliit na bilang ng mga kultura. Ang mga eksperimento na nangangailangan ng daan-daan o libu-libong hayop sa laboratoryo upang kumpirmahin ito o ang katotohanang iyon ay maaaring isagawa nang may pantay na katiyakan sa istatistika sa parehong bilang ng mga kultura ng cell. Kaya, ang laboratoryo ay hindi kailangang magtago ng vivarium at walang mga etikal na aspeto ng paghawak ng mga may sakit na hayop.

Ang pagbabagong-anyo ng mga selula sa pamamagitan ng mga virus ay pinag-aaralan din, ang mekanismo nito ay katulad ng sa mga malignant na tumor.

Application sa pharmacology

Ang mga cell culture ay malawakang ginagamit upang subukan ang mga epekto ng mga sangkap na maaaring magamit bilang mga gamot. Sa kabila ng katotohanan na ang mga resulta na nakuha sa mga kultura ng cell ay hindi maaaring i-extrapolated sa buong organismo, walang alinlangan na kung ang isang partikular na sangkap ay nakakagambala sa aktibidad ng mga cell mula sa iba't ibang mga linya ng kultura, kung gayon ang isang negatibong epekto ay dapat ding asahan kapag ang sangkap na ito ay ipinakilala sa katawan.

Application sa biotechnology

Ang mga partikular na kultura ng cell ay isang mahalagang pinagmumulan ng mga hormone at iba pang biologically active substance. Ngayon ay ginagamit na ang mga ito para sa paggawa ng antiviral protein interferon.

Application sa genetika

Sa genetics, ang kakayahan ng mga cell na lumaki sa kultura ay ginagamit sa mga sumusunod na paraan:

• Pag-clone
• Imbakan ng cell
• Pagkuha ng mutant cells at pagtatrabaho sa kanila

Mga uri ng kultura ng cell

1. Pangunahing trypsinization - nakuha mula sa durog na mga tisyu ng tao at hayop sa pamamagitan ng paggamot sa kanila ng trypsin o iba pang mga enzyme. Makatiis lamang ng 5-10 dibisyon (mga sipi).

2. transplantable - mga cell na nakakuha ng kakayahan sa walang limitasyong pagpaparami, dahil ang mga ito ay derivatives ng mga tumor ng tao at hayop.

3. Drinking resplit (diploid) - kayang tumagal ng hanggang 100 passages, habang pinapanatili ang orihinal na diploid set ng chromosome.

Karamihan sa mga karaniwang linya ng cell

linya ng cell	Pagpapaliwanag ng pagdadaglat	organismo	Tela	Morpolohiya	Mga tala at link
293-T		tao	bato (embryonic)		Nagmula sa HEK-293 ECACC
3T3 na mga cell	"3-araw na paglipat, inoculum 3 x 105 na mga cell"	daga	mga embryonic fibroblast		Kilala rin bilang NIH 3T3 ECACC
721		tao	melanoma
9L		daga	glioblastoma
A2780		tao	obaryo	kanser sa ovarian	ECACC
A2780ADR		tao	obaryo	A2780 derivative na may paglaban sa adriamycin	ECACC
A2780cis		tao	obaryo	cisplatin-resistant derivative ng A2780	ECACC
A172		tao	glioblastoma	malignant na glioma	ECACC
A431		tao	epithelium ng balat	squamous cell carcinoma	ECACCell Line Data Base
A-549		tao	kanser sa baga	epithelium	DSMZECACC
B35		daga	neuroblastoma		ATCC
BCP-1		tao	peripheral leukocytes	HIV + lymphoma	ATCC
BEAS-2B	bronchial epithelium + adenovirus 12-SV40 virus hybrid (Ad12SV40)	tao	baga	epithelium	ATCC
bEnd.3	endothelial ng utak	daga	cortex	endothelium	ATCC
BHK-21	"Baby Hamster Kidney"	hamster	usbong	mga fibroblast	ECACCOlympus
BR 293		tao	dibdib	ulang
BxPC3	Biopsy xenograph ng pancreatic carcinoma line 3	tao	pancreatic adenocarcinoma	epithelium	ATCC
C3H-10T1/2		daga	embryonic mesenchymal cells		ECACC
C6/36		lamok	himaymay ng uod		ECACC
CHO	Chinese hamster ovary	Cricetulus griseus	obaryo	epithelium	ECACCICLC
COR-L23		tao	baga		ECACC
COR-L23/CPR		tao	baga		ECACC
COR-L23/5010		tao	baga		ECACC
COR-L23 / R23		tao	baga	epithelium	ECACC
COS-7	Cercopithecus aethiops, may depektong pinagmulan na SV-40	Unggoy Cercopithecus aethiops	usbong	mga fibroblast	ECACCATCC
CML T1	Talamak na Myelod Leukemia T-lymphocyte 1	tao	talamak na myeloid leukemia	T cell leukemia	Dugo
CMT	canine mammary tumor	aso	dibdib	epithelium
D17		aso	osteosarcoma		ECACC
DH82		aso	histiocytosis	monocytes / macrophage	ECACC
DU145		tao	carcinoma	prostate
DuCaP	Dura mater Cancer ng Prostate	tao		epithelium	11317521
EL4		daga		T cell leukemia	ECACC
EMT6/AR1		daga	dibdib	epithelium	ECACC
EMT6/AR10.0		daga	dibdib	epithelium	ECACC
FM3		tao	metastases sa isang lymph node	melanoma
H1299		tao	baga	ulang
H69		tao	baga		ECACC
HB54		hybridoma	hybridoma	nagtatago ng L243 mAb (laban sa HLA-DR)	Immunology ng Tao
HB55		hybridoma	hybridoma	nagtatago ng MA2.1 mAb (laban sa HLA-A2 at HLA-B17)	Journal ng Immunology
HCA2		tao	mga fibroblast		Journal ng General Virology
HEK-293	embryonic na bato ng tao	tao	bato (embryonic)	epithelium	ATCC
HeLa	Kulang si Henrietta	tao	cervical cancer	epithelium	DSMZECACC
Hepa1c1c7	clone 7 ng clone 1 hepatoma line 1	daga	hepatoma	epithelium	ECACC
HL-60	leukemia ng tao	tao	myeloblasts	mga selula ng dugo	ECACCDSMZ
HMEC	mammary epithelial cell ng tao	tao		epithelium	ECACC
HT-29		tao	colonic epithelium	adenocarcinoma	ECACC Cell Line Data Base
Jurkat		tao	T cell leukemia	mga puting selula ng dugo	ECACC
JY		tao	mga lymphoblast	B cells, EBV immortalization
K562		tao	mga lymphoblast		ECACC
Ku812		tao	mga lymphoblast	erythroleukemia	ECACC
KCL22		tao	mga lymphoblast	talamak na myeloid leukemia
KYO1	Kyoto 1	tao	mga lymphoblast	talamak na myeloid leukemia	DSMZ
LNCap	Lymph node Kanser ng Prostate	tao	prostate adenocarcinoma	epithelium	ECACCATCC
Ma-Mel 1, 2, 3….48		tao		mga linya ng melanoma cell
MC-38		daga		adenocarcinoma
MCF-7	Michigan Cancer Foundation-7	tao	dibdib	invasive ductal carcinoma ng dibdib	ER+, PR+
MCF-10A	Michigan Cancer Foundation	tao	dibdib	epithelium	ATCC
MDA-MB-231		tao	dibdib	ulang	ECACC
MDA-MB-468	MD Anderson-Metastatic na Dibdib	tao	dibdib	ulang	ECACC
MDA-MB-435	MD Anderson-Metastatic na Dibdib	tao	dibdib	melanoma o carcinoma (walang pinagkasunduan)	Cambridge Patolohiya ECACC
MDCK II	Madin Darby canine kidney	aso	usbong	epithelium	ECACC ATCC
MOR/0.2R		tao	baga		ECACC
NCI-H69/CPR		tao	baga		ECACC
NCI-H69 / LX10		tao	baga		ECACC
NCI-H69 / LX20		tao	baga		ECACC
NCI-H69/LX4		tao	baga		ECACC
NIH-3T3	National Institutes of Health, 3-araw na paglipat, inoculum 3 x 10 May mga cell	daga	embryo	mga fibroblast	ECACCATCC
NALM-1			peripheral na dugo	talamak na myeloid leukemia	Cancer Genetics at Cytogenetics
NW-145				melanoma	ESTDAB
OPCN/OPCT	Onyvax Prostate Cancer….			mga linya ng selula ng kanser sa prostate	Asterand
kapantay		tao	T cell leukemia		DSMZ
PNT-1A / PNT 2				mga linya ng selula ng kanser sa prostate	ECACC
RenCa	Carcinoma sa bato	daga		carcinoma sa bato
RIN-5F		daga	lapay
RMA/RMAS		daga		T cell cancer
Saos-2		tao		osteosarcoma	ECACC
Sf-9	Spodoptera frugiperda	paruparo Spodoptera frugiperda	obaryo		DSMZECACC
SkBr3		tao		kanser sa suso
T2		tao		Hybridoma ng B cells at T-cell leukemia	DSMZ
T-47D		tao	dibdib	duct carcinoma
T84		tao	colon carcinoma/mga metastases sa baga	epithelium	ECACCATCC
THP1		tao	monocytes	talamak na myeloid leukemia	ECACC
U373		tao	glioblastoma-astrocytoma	epithelium
U87		tao	glioblastoma-astrocytoma	epithelium	Abcam
U937		tao	leukemic monocytic lymphoma		ECACC
VCaP	Kanser sa Prostate ng Vertebra	tao	metastatic na kanser sa prostate	epithelium	ECACC ATCC
Vero	"Vera Reno" / "Vero" ("katotohanan")	african green monkey	epithelium ng bato		ECACC
WM39		tao	balat	pangunahing melanoma
WT-49		tao	mga lymphoblast
X63		daga	melanoma
YAC-1		daga	lymphoma		Cell Line Data Base ECACC
YAR		tao	B-lymphocytes	binago ang EBV	Immunology ng Tao

Ipadala ang iyong mabuting gawa sa base ng kaalaman ay simple. Gamitin ang form sa ibaba

Ang mga mag-aaral, nagtapos na mga mag-aaral, mga batang siyentipiko na gumagamit ng base ng kaalaman sa kanilang pag-aaral at trabaho ay lubos na magpapasalamat sa iyo.

Nai-post sa http://www.allbest.ru/

kultura ng cell virus

Panimula

1. Mga uri ng mga kultura ng cell

2. Nutrient media

4.1 Pagtuklas ng virus

Bibliograpiya

Panimula

Para sa dami ng akumulasyon ng mga virus, ang mga kultura ng cell ay ang pinaka-maginhawang sistema. Ang mga unang pagtatangka na linangin ang mga selula ng hayop sa labas ng katawan ay nagmula sa katapusan ng huling siglo. Ang mga pira-pirasong obserbasyon na ito ay nagpahiwatig ng posibilidad na mapanatili ang posibilidad na mabuhay ng mga tisyu at mga selula sa ilalim ng mga artipisyal na kondisyon at minarkahan ang simula ng malalim na siyentipikong pananaliksik sa mga kultura ng tisyu.

Ang isang mahusay na merito sa pagbuo ng mga pamamaraan para sa paglilinang ng mga tisyu ay pag-aari ni Carrel. Siya ang unang nagpatunay sa posibilidad ng pagpaparami ng mga selula ng hayop sa mga artipisyal na kondisyon at sa gayon ay ipinakita ang kanilang "imortalidad" at pagkakapareho sa mga unicellular na walang buhay na organismo. Ang makabuluhang pag-unlad sa direksyon na ito ay nakamit ng isang pangkat ng mga mananaliksik na pinamumunuan ni Earl. Sila ang unang nakakuha ng paglaki ng malaking bilang ng mga cell sa salamin at sa likidong hinalo na suspensyon. Ang pagdating ng mga antibiotic at pagsulong sa artificial culture media ay naghatid sa isang bagong panahon sa pagbuo ng mga diskarte sa tissue culture.

Matagal nang ginagamit ang mga tissue culture upang malutas ang iba't ibang problema sa biology at medisina. Gayunpaman, ang mga tagumpay lamang sa larangan ng virology na nakamit sa tulong ng mga tissue culture ay isang malakas na pampasigla para sa kanilang pag-unlad hanggang sa kasalukuyang antas.

Ang paglilinang ng mga virus ay nakakatulong upang malutas ang isang bilang ng mga teoretikal na problema na nauugnay sa pag-aaral ng mga tampok ng pakikipag-ugnayan ng "virus-cell". Bilang karagdagan, ang solusyon ng isang bilang ng mga inilapat na problema na may kaugnayan sa pagsusuri at paggawa ng mga gamot para sa pag-iwas sa mga impeksyon sa viral ay imposible nang walang akumulasyon ng mga hilaw na materyales na naglalaman ng virus.

1. Mga uri ng mga kultura ng cell

Ang paglipat ng mga selula ng isang buong organismo sa mga kondisyon ng buhay sa vitro ay huminto sa kanilang pag-iral bilang isa sa maraming mga elemento ng istruktura ng tissue o organ kung saan sila dati ay kasama. Kasabay nito, ang mga cell ay nawalan ng kontrol sa mga neurohumoral na kadahilanan at nakakakuha ng isang bilang ng mga tampok na nakasalalay pareho sa mismong katotohanan ng pagtanggi ng cell mula sa mga tisyu na ito at sa mga tiyak na kondisyon ng kanilang pag-iral sa vitro.

Ang mga cell o tisyu na naninirahan sa labas ng katawan ay nailalarawan sa pamamagitan ng isang buong kumplikado ng metabolic, morphological at genetic na mga tampok na lubhang naiiba sa mga katangian ng mga selula ng mga organo at tisyu sa vivo.

Ang ilang mga uri ng nabubuhay at lumalaking tissue at cell culture ay nakikilala depende sa paraan ng pangunahing pagpapaliwanag ng tissue at ang pamamaraan ng paglilinang nito. Pinakalawak na ginagamit ang mga single-layer at suspension culture ng lumalaking cell. Binubuo nila ang batayan ng modernong laboratoryo at pang-industriyang virological practice.

Mayroong dalawang pangunahing uri ng single-layer cell culture: pangunahin at inilipat.

Ang terminong "pangunahing" ay tumutukoy sa isang kultura ng cell na nakuha nang direkta mula sa mga tisyu ng tao o hayop sa panahon ng embryonic o postnatal. Limitado ang haba ng buhay ng naturang mga pananim. Pagkatapos ng isang tiyak na oras, ang mga phenomena ng hindi tiyak na pagkabulok ay lilitaw sa kanila, na ipinahayag sa granulation at vacuolization ng cytoplasm, pag-ikot ng mga cell, pagkawala ng komunikasyon sa pagitan ng mga cell at solidong substrate kung saan sila lumaki. Ang pana-panahong pagbabago ng medium, mga pagbabago sa komposisyon ng huli, at iba pang mga pamamaraan ay maaari lamang bahagyang tumaas ang buhay ng pangunahing kultura ng cell, ngunit hindi mapipigilan ang panghuling pagkawasak at kamatayan nito. Sa lahat ng posibilidad, ang prosesong ito ay nauugnay sa natural na pagkalipol ng metabolic na aktibidad ng mga cell na wala sa kontrol ng mga neurohumoral factor na kumikilos sa buong organismo.

Tanging ang mga indibidwal na cell o grupo ng mga cell sa populasyon laban sa background ng pagkabulok ng karamihan ng layer ng cell ang maaaring mapanatili ang kakayahang lumaki at magparami. Ang mga cell na ito, na natagpuan ang potency ng walang katapusang pagpaparami sa vitro, ay nagbubunga ng mga transplanted cell culture pagkatapos ng paulit-ulit na inoculations.

May mga linya at strain ng mga inilipat na selula. Ang unang termino ay tumutukoy sa mga transplantable cell na nailalarawan sa pamamagitan ng potensyal na imortalidad at, bilang isang panuntunan, isang heteroploid karyotype; ang pangalawang termino ay tumutukoy sa mga semi-transplantable na mga cell na may isang diploid na hanay ng mga chromosome at isang limitadong habang-buhay sa vitro. Ang hitsura ng parehong mga iyon at iba pang mga cell ay nauugnay sa proseso ng pagpili sa populasyon ng cell ng mga pangunahing kultura, na kung saan ay ang pinagmulan ng lahat ng mga linya at mga strain ng mga transplanted na mga cell.

Ang pangunahing bentahe ng mga naililipat na linya ng cell, kung ihahambing sa anumang pangunahing kultura, ay ang potensyal para sa walang limitasyong pagpaparami sa labas ng katawan at ang relatibong awtonomiya na naglalapit sa kanila sa bacteria at unicellular protozoa.

Ang kakayahan ng mga transplanted cell na magparami nang walang katapusang in vitro ay nagmamarka ng isang qualitative leap, bilang isang resulta kung saan ang mga cell ay nakakuha ng kakayahang mag-autonomous na pag-iral, katulad ng mga microorganism na lumaki sa artipisyal na nutrient media. Ang kabuuan ng mga pagbabago na humahantong sa paglitaw ng mga naturang tampok sa mga cell ay tinatawag na pagbabagong-anyo, at ang mga selula ng mga transplanted tissue culture ay tinatawag na transformed.

Ang mga pagpapabuti sa mga diskarte sa kultura ng cell ay lubos na nagpalawak ng mga posibilidad ng pagkuha ng mga naililipat na linya ng cell mula sa iba't ibang uri ng mga tisyu ng hayop at tao. Kasabay nito, walang limitasyon sa edad ang natagpuan, sa itaas kung saan ang mga tisyu ay mawawalan ng kakayahang umangkop sa walang limitasyong paglaki sa vitro, i.e. sa pagbabagong-anyo.

Ang isa pang pinagmumulan ng mga transplanted cell line ay mga malignant neoplasms. Sa kasong ito, ang pagbabagong-anyo ng cell ay nangyayari sa vivo bilang isang resulta ng pag-unlad ng isang proseso ng pathological, ang etiology na kung saan ay nananatiling higit na hindi maliwanag.

Hindi lahat ng malignant neoplasms ay may kakayahang magbunga ng mga transplantable cell culture. Kaya, halimbawa, ang mga hindi matagumpay na pagtatangka ay ginawa upang makakuha ng mga naililipat na selula mula sa mga kanser na tumor ng tiyan ng tao at mga glandula ng mammary. Mahirap umangkop sa buhay in vitro cells ng squamous cell carcinoma ng balat at mucous membrane. Sa kabilang banda, ang mga linya ay medyo madaling nakuha mula sa mga tisyu ng sarcomas at malignant na mga tumor ng nervous system.

2. Nutrient media

Sa anumang kultura ng cell, mayroong mga yugto ng cell at likido. Tinitiyak ng likidong bahagi ang mahahalagang aktibidad ng mga selula ng kultura at isang nutrient medium ng iba't ibang komposisyon at mga katangian.

Ang lahat ng media ayon sa kanilang layunin ay nahahati sa paglago at suporta. Ang growth media ay dapat maglaman ng mas maraming sustansya upang matiyak ang aktibong pagpaparami ng cell upang bumuo ng isang monolayer sa ibabaw ng salamin o isang sapat na mataas na konsentrasyon ng mga elemento ng cell sa suspensyon (kapag kumukuha ng mga kultura ng suspensyon). Sa katunayan, ang pagsuporta sa media ay dapat lamang matiyak ang kaligtasan ng mga cell sa isang nabuo nang monolayer sa panahon ng pagpaparami ng mga ahente ng viral sa mga cell.

Multicomponent ang media ng paglago at suporta. Maaari nilang isama ang parehong mga natural na produkto (amniotic fluid, animal sera), at mga substrate na nakuha bilang resulta ng bahagyang pagproseso ng mga natural na produkto (embryonic extracts, lactalbumin hydrolyzate, hemohydrolyzate, aminopeptide, atbp.), pati na rin ang mga synthetic chemically pure substances (amino acid, bitamina, asin).

Bilang isang halimbawa ng isang nutrient medium na ganap na binubuo ng mga natural na bahagi, ang Buckley's medium, na iminungkahi para sa lumalaking cell culture mula sa renal epithelium ng mga unggoy, ay maaaring banggitin. Kasama sa medium na ito ang bovine amniotic fluid (85%), horse serum (10%), at bovine fetal extract (5%).

Ang lahat ng mga likas na produkto ay mababa ang pamantayan, ang kanilang paggamit ay nauugnay sa isang malaking panganib ng microbial at viral contamination ng mga cell culture. Sa pagsasaalang-alang na ito, unti-unti silang pinapalitan ng mga synthetic standard mixtures. Ang sintetikong daluyan 199 at daluyan ng Needle ay mahanap ang pinakamahusay na aplikasyon. Ang media na naglalaman ng mahigpit na tinukoy na halaga ng mga asin, amino acid at bitamina ay malawakang ginagamit.

Anuman ang nilalayong paggamit, ang lahat ng tissue culture media ay idinisenyo na may ilang uri ng balanseng solusyon sa asin na may sapat na kapasidad sa pag-buffer. Kadalasan ang mga ito ay mga solusyon nina Hanks at Earl. Ang mga solusyon na ito ay isang mahalagang bahagi ng anumang nutrient medium. Ang isang mahalagang bahagi ng karamihan sa media ng paglago ay serum ng hayop (calf, bovine, horse), nang walang pagkakaroon ng 5--10% kung saan ang cell reproduction at monolayer formation ay hindi nangyayari.

Ang pagsasama ng serum sa parehong oras ay pumipigil sa paglikha ng paglago ng media ng tumpak na komposisyon ng kemikal, na napakahalaga para sa pagbuo ng pangunahing pananaliksik sa cell physiology, dahil kasama ang serum (o mga derivatives nito) ang isang buong kumplikado ng hindi makontrol na mga kadahilanan ay ipinakilala , na nag-iiba depende sa serye ng serum.

Noong 1950s, ang serum-free media ng eksaktong komposisyon ng kemikal ay iminungkahi nina Ewans at Waymouth. Gayunpaman, ang mga media na ito ay hindi nagbigay ng mga tagapagpahiwatig ng aktibidad ng cell proliferative, na tumutukoy sa media na may pagdaragdag ng sera. Kaugnay nito, interesado ang gawain ng Birch at Pirt. Ipinakita nila na ang pagsasama ng mga sulfate salt ng Fe, Zn, Cu, at MnC1 2 ay mapagpasyahan para matiyak ang masinsinang paglaki ng cell sa serum-free media.

Ang mga antibiotic ay idinagdag sa media ng paglago, pati na rin sa buffer solution para sa paghuhugas ng mga tisyu. Ang mga ito ay ipinakilala sa daluyan kaagad bago gamitin sa rate na 1 ml ng stock solution ng antibiotics bawat 500 ml ng medium.

Nasa ibaba ang komposisyon at paraan ng paghahanda ng isa sa karaniwang kulturang media.

Karayom ​​ng Miyerkules

l-arginine - 17.4

l-cystine - 4.8

l-histidine - 3.1

l-isoleucine - 26.2

l-leucia - 13.1

l-lysine - 14.6

l-methionine - 7.5

l-phenylalanine - 8.3

l-threonine - 11.9

l-tryptophan - 2.0

l-tyrosine - 18.1

l-valine - 11.7

biotin - 0.24

choline - 0.12

choline chloride - 0.14

bitamina B 12 (pteroylglutamic acid) - 0.44

nicotinamide - 0.12

pantothenic acid - 0.22

calcium pantothenate - 0.48

pyridoxal (pyridoxine hydrochloride) - 0.20

thiamine hydrochloride - 0.34

riboflavin - 0.04

sodium chloride - 5850.0

potasa klorido - 373.0

monosubstituted sodium phosphate (NaH 2 PO 4. H 2 O) - 138.0

calcium chloride - 111.0

sodium bikarbonate (NaHCO 3) - 1680.0

magnesium chloride (MgCl 2. 6H 2 O) - 102.0

glucose - 900.0

l-glutamine - 146.2--292.3

penicillin - 50.0

streptomycin - 50.0

phenol red - 5.0

tubig hanggang 1000.0

Nagluluto.

Solusyon 1. Sa 500 ML ng tubig na pinainit sa humigit-kumulang 80 °, ang mga halaga sa itaas ng mga amino acid ay natunaw sa pagpapakilos, pagkatapos ay idinagdag ang l-glutamine at phenol red.

Solusyon 2. Sa 100.0 ml ng tubig, i-dissolve ang mga di-organikong asing-gamot, maliban sa sodium bikarbonate (NaHCO 3 ), ihalo sa naunang solusyon ng mga di-organikong asing-gamot, at magdagdag ng biotin at bitamina B 12 .

Solusyon 3. Ang lahat ng bitamina ay natutunaw sa 200.0 ml ng tubig, maliban sa biotin at ptero-ylglutamic acid, at antibiotics - penicillin at streptomycin. Ang lahat ng mga solusyon ay isterilisado sa pamamagitan ng pagsasala sa pamamagitan ng isang glass suction filter (porous glass plate, laki ng butas na 0.7--1.5) o sa pamamagitan ng Seitz asbestos cellulose plate pagkatapos ng paunang paghuhugas ng tubig, at pagkatapos ay gamit ang inihandang solusyon.

Paghaluin ang 500 ml ng solusyon 1 + 200 ml ng solusyon 2 + 200 ml ng solusyon 3 at maghalo sa 1000.0 ml na may sterile na tubig. Maaari kang magdagdag ng 1 mg ng inositol bawat 1 litro.

3. Pagkuha ng mga kultura ng cell

3.1 Paghahanda ng mga pangunahing kultura ng cell

Pangunahin - ay tinatawag na isang kultura na nakuha mula sa tissue at lumago sa vitro bago ang simula ng subculturing, iyon ay, bago ang unang crop. Ang pangunahing kultura ay wala sa marami sa mga cell na naroroon sa orihinal na tisyu, dahil hindi lahat ng mga cell ay nakakapit sa substrate at nakaligtas sa vitro. Sa proseso ng paglilinang ng cell, ang kultura ay medyo naubos ng hindi naghahati o mabagal na naghahati ng mga selula.

Sa unang yugto ng pagkuha ng isang pangunahing kultura, ang isang sterile na pag-alis ng isang fragment ng tissue, isang organ ng hayop at ang mekanikal o enzymatic disaggregation nito ay isinasagawa. Ang tissue ay durog sa mga piraso na may dami ng hanggang 1-3 mm, ang mga piraso ng tissue ay hugasan mula sa mga erythrocytes na may Hank's solution na may antibiotics. Trypsin (0.25% krudo o 0.01-0.05% purified) o collagenase (200-2000 units/ml, krudo) at iba pang proteolytic enzymes ay ginagamit para sa tissue disaggregation. Ang pamamaraang ito ng pagkuha ng kultura ay nagbibigay ng mataas na ani ng mga selula.

Ang mga pangunahing kultura ay maaari ding makuha mula sa mga piraso ng tissue, 1 mm ang dami, na sumunod sa ibabaw ng substrate dahil sa kanilang sariling adhesiveness o pagkakaroon ng mga notches sa ulam, o gamit ang isang plasma clot. Sa mga kasong ito, ang mga cell ay lalago mula sa mga fragment. Ang mga cell na lumilipat mula sa mga explant ay maaaring gamitin para sa pagpasa. Ang mga fragment ng tissue (explant) ay inililipat sa mga bagong plate, ang mga migrating na cell ay maaaring alisin sa pamamagitan ng subculture, isang pinaghalong versene at trypsin, at ang natitirang mga explant ay bubuo ng mga bagong outgrowth.

Ang mga pangunahing kultura tulad ng chick embryo fibroblast culture, calf kidney cell culture, at leukocytes ay kilala.

3.2 Pagkuha ng monolayer na tuloy-tuloy na mga kultura ng cell

Tulad ng nabanggit sa itaas, ang isa sa mga pamamaraan para sa pagkuha ng mga transplantable cell line ay ang pagpili ng mga cell na may mas mataas na aktibidad ng paglago at pagpaparami mula sa populasyon ng mga pangunahing kultura. Ang pagpili ay maaaring isagawa sa pamamagitan ng regular na pagbabago ng kapaligiran, paghuhugas ng monolayer ng pangunahing trypsinized cell culture. Para dito, ang mga kutson na may mahusay na nabuo na monolayer ng cell ay pinili (ang mga kutson mismo ay dapat magkaroon ng isang patag na ilalim at hindi dapat magkaroon ng mga gasgas at mapurol na mga spot sa mga dingding). Ang daluyan ng paglago na inihanda para sa isang sistematikong pagbabago ay ibinubuhos sa maliliit na sisidlan (upang ibukod ang kontaminasyon ng bacterial) at nakaimbak sa t - 4 °.

Regular na binabago ang medium, kahit isang beses sa isang linggo. Sa unang 3 linggo, ang 20-30% ng dami ng daluyan ng paglago ay pinalitan, sa susunod na 3-4 na linggo - 50-60%, mamaya isang kumpletong pagbabago ng daluyan ay isinasagawa. Ang sariwang kapaligiran kaagad bago ang trabaho ay pinainit sa t - 37 °.

Habang nagbabago ang media, binabago ng mga cell ang kanilang morpolohiya. Ang ilan sa mga cell ay bilugan at nahuhulog sa salamin. Karamihan sa mga cell ay lumiliit patungo sa gitna, at ang monolayer ay nakakakuha ng isang stellate na hitsura. Ang mga cell mismo ay bahagyang pinahaba. Pagkatapos ng 7-10 na pagbabago ng kapaligiran sa mga kutson, bilang panuntunan, ang mga bagong elemento ng cellular ay nagsisimulang lumitaw, at sa iba't ibang kultura mayroon silang iba't ibang morpolohiya.

Sa kultura ng mga cell ng kidney ng chick embryo, lumilitaw ang mga bilugan na elemento ng cellular sa gitna ng monolayer o sa pagitan ng mga kinontratang lugar nito, kung saan unti-unting nabuo ang mga kumpol sa anyo ng maliliit na kolonya. Sa kultura ng mga selula ng bato ng unggoy, lumilitaw ang mga solong pormasyon na kahawig ng mga butil. Ang mga cell ay mahigpit na katabi sa bawat isa, na bumubuo ng maliliit na transparent na kolonya. Ang bilang ng mga naturang selula ay dahan-dahang tumataas, ang laki ng mga kolonya ay halos hindi rin tumataas. Lumilitaw ang mga kolonya hindi lamang sa ilalim ng kutson, kundi pati na rin sa mga gilid na ibabaw, sa hangganan ng nutrient medium. Samakatuwid, ang isang paunang kinakailangan para sa pagbabago ng nutrient medium ay upang mapanatili ang pare-parehong dami nito. Sa kultura ng mga embryonic na mga cell ng bato ng tao laban sa background ng mass degeneration ng monolayer constricted sa strands, malalaking polygonal cell na may mahabang proseso ay ipinahayag.

Ang mga hindi tipikal na elemento ng cellular na lumitaw sa panahon ng proseso ng pagpili ay dapat na ihiwalay mula sa natitirang bahagi ng monolayer at ilipat sa magkahiwalay na mga test tube o mattress. Para dito, maaaring gamitin ang versenization method o mechanical cleavage ng mga atypical na cell gamit ang bacteriological loop o spatula. Ang huling pamamaraan ay kinakailangan lalo na kapag nagtatrabaho sa isang kultura ng cell ng mga bato ng unggoy, kung saan ang mga kolonya ng mga hindi tipikal na selula ay mahigpit na nakakabit sa salamin at hindi humihiwalay mula dito.

Kapag binabago ang nutrient medium sa kaganapan ng paglitaw ng mga hindi tipikal na mga cell, inirerekumenda na maingat na alisin ang karamihan sa daluyan ng paglago, at sa isang mas maliit na bahagi, masiglang banlawan ang monolayer at ibuhos ang daluyan na ito sa mga test tube. Sa kasong ito, ang mga atypical na cell ay maaaring lumitaw sa medium na may kakayahang bumuo ng mga kolonya na angkop para sa karagdagang mga subculture.

Matapos ilipat ang kultura ng mga hindi tipikal na mga cell sa isang bagong ulam, ipinapayong ipagpatuloy ang pagsubaybay sa pangunahing kultura, dahil ang proseso ng pag-aanak ng isang bagong linya ng cell ay napaka-kumplikado, at hindi palaging ang mga napiling mga hindi tipikal na elemento ay nagbibigay ng isang mabubuhay na linya ng mga transplanted na selula. . Kinakailangan na ang lahat ng trabaho sa pagkuha ng mga bagong linya ng cell, na tumatagal ng maraming buwan, ay isagawa gamit ang parehong nutrient media, animal sera at serye ng mga antibiotics.

Ang mga pangunahing kultura tulad ng golden hamster kidney cell culture (BHK), Siberian mountain ibex kidney cell culture (PSGC), green monkey kidney cell culture (CV) ay kilala.

3.3 Roller cell kultura

Hanggang kamakailan lamang, ang mga tissue culture ay ginamit sa virology pangunahin sa anyo ng single-layer stationary culture. Sa maraming kaso, ang pamamaraang ito ng cell culture ay kailangang-kailangan. Ipinakikita ng maraming taon ng karanasan na kapag gumagamit ng mga single-layer na nakatigil na kultura, maraming mga paghihirap ang nahaharap, na nauugnay sa malaking paggasta ng oras ng pagtatrabaho at mga materyales. Mula sa puntong ito, ang mga kultura ng roller ay mas kumikita, na matipid, na nailalarawan sa isang pinakamainam na ratio ng kapaki-pakinabang na lugar ng paglilinang sa dami ng nutrient medium at nagbubukas ng mga kanais-nais na pagkakataon para sa akumulasyon ng cell mass.

Ang terminong "roller culture" ay tumutukoy sa isang pamamaraan ng kultura kung saan ang isang cell monolayer ay matatagpuan sa buong cylindrical na ibabaw ng pahalang na umiikot na mga sisidlan at pana-panahong hinuhugasan ng isang nutrient medium. Para sa ilang mga kadahilanan, ang isang tiyak na bilang ng mga cell ay maaaring sa ilang mga kaso ay matimbang sa medium ng kultura. Sa embodiment na ito, ang cell culture ay tinatawag na roller-suspension. Ang "bunga" ng kultura ng cell ay magiging mas malaki, mas malaki ang lugar kung saan ang mga cell ay inaani. Gumamit ang mga mananaliksik ng iba't ibang paraan upang madagdagan ang ibabaw na lugar kung saan ang mga cell ay maaaring magkabit at dumami. Upang gawin ito, ginamit ang iba't ibang mga base na may malaking tiyak na ibabaw: matigas, espongy, gawa sa lana, collagen, sa mga spiral ng salamin, atbp. Ang mga pamamaraang ito ay hindi malawakang ginagamit, dahil mas mahirap ang mga manipulasyon sa mga cell, ngunit dapat itong gawin. mapapansing inilarawan ni L. S. Ratner at V. A. Krikun na paraan ng multi-tiered cultivation. Ang mga cell ay nilinang sa 1.5, 10 at 15 litro na bote na ganap na puno ng mga hugis-itlog na glass tube na kahanay sa longitudinal axis ng mga sisidlan. Sa kasong ito, ang kapaki-pakinabang na lugar ay nadagdagan kumpara sa mga nakatigil na single-layer na kultura sa mga sisidlan ng parehong dami ng 20 beses. Ang paglilinang ay naganap sa 2 yugto. Sa unang yugto, ang mga bote ay pinaikot sa isang pahalang na axis upang pantay na ipamahagi ang mga cell. Kasunod nito, kapag ang mga cell ay nakakabit sa salamin, ang paglilinang ay nagpatuloy sa isang nakatigil na posisyon. Ang inilarawan na sistema ng kultura ay matagumpay na ginamit para sa paglilinang ng FMDV.

Ang pag-ikot ng mga sisidlan kung saan dumami ang mga selula ay naging mas epektibo. Sa una, ang mga cell ay lumaki sa mga test tube, ngunit sa pag-unlad ng mga teknikal na kagamitan, ang dami ng mga vessel ng kultura ay tumaas, at ang mga mananaliksik ay lumipat mula sa lumalaking mga cell sa umiikot na mga test tube patungo sa mga umiikot na bote. Ang mga kultura ng roller ay nagsimulang gamitin kapwa para sa akumulasyon ng mga selula at para sa pagpapalaganap ng mga virus.

Para sa paglilinang ng roller, ginagamit ang espesyal na rack-and-tier apparatus para sa mga umiikot na bote o drum. Kadalasan, 0.5--3-litro na bote ang ginagamit para sa paglilinang. Sa ilalim ng mga kondisyon ng produksyon, ang kanilang dami ay maaaring umabot sa 20 litro o higit pa. Ang mga roller culture apparatus ay simple, maaasahan at madaling mapanatili. Ang pinakamahalaga ay ang bilis ng pag-ikot ng mga bote. Ito ay hindi dapat masyadong mataas, upang hindi maiwasan ang cell attachment, ngunit hindi rin masyadong mababa, dahil ang matagal na pagkakalantad ng mga cell sa gas phase ay nagpapalala sa kanilang mga kondisyon sa nutrisyon. Sa mga gawa ng iba't ibang mga may-akda, ang bilis ng pag-ikot ng mga bote ay nag-iiba mula 8–12 rpm hanggang 1 rpm. Ang pinaka-angkop para sa iba't ibang mga kultura ng cell ay ang bilis ng pag-ikot ng mga vial sa hanay na 0.5--1 rpm. Inirerekomenda sa loob ng unang 30 minuto. pagkatapos seeding ang mga cell, tiyakin ang isang mataas na bilis ng pag-ikot ng mga vial (0.5-1.0 rpm) para sa pare-parehong pamamahagi ng mga materyales, pagkatapos ay ilipat ang mga ito sa isang mababang bilis ng pag-ikot (20-30 rpm).

Ang konsentrasyon ng binhi sa 1 ml ng medium ay 60-80 thousand para sa SPEV, VNK-21, HeLa, L cells, 100-200 thousand para sa diploid cells, at 200-300 thousand para sa primary cultures. Ang volume ng growth medium ay dapat maging 1/10, 1/20 ng volume ng isang roller bottle. Ang paraan ng paglilinang ng roller ay nagpapahintulot sa iyo na makakuha ng mas malaking bilang ng mga cell. Kaya, mula sa isang vial na may kapasidad na 3 l, posible na makakuha ng isang crop ng HeLa cells ng 8 beses, VNK-21 - ng 9 na beses, AO - 11 beses na mas malaki kaysa sa isang monolayer na nakatigil na kultura ng isang vial na may isang kapasidad ng 1 l. Ang multiplicity ng media savings kapag gumagamit ng 3-litro vial ay 2.8 para sa HeLa cells; VNK-21 - 5.0, AO - 4.0. Ang kakayahang lumaki at magparami sa ilalim ng mga kondisyon ng roller ay taglay ng mga subculture, transplanted na kultura, at mas madalas na pangunahin, pati na rin ang mga diploid cell strain. Para sa mas mahusay na pagpaparami ng mga cell sa mga aparatong roller, kinakailangan upang iakma ang mga ito sa mga bagong kondisyon ng paglilinang. Ang paraan ng roller culture ay nagbibigay-daan sa pagkuha ng malaking bilang ng mga cell. Ang bentahe ng mga roller culture kumpara sa mga tradisyonal na nakatigil na kultura ay, sa partikular, mas matipid na paggamit ng nutrient media at isang mas mataas na ani ng viral antigen (sa pamamagitan ng 1-2 lg).

3.4 Suspension cell culture

Noong 1953, unang ipinakita ni Owens at mga katrabaho ang kakayahan ng mga cell na dumami sa isang likidong daluyan sa isang malayang nasuspinde na estado. Simula noon, ang paraan ng kultura ng suspensyon ay nakakuha ng atensyon ng mga mananaliksik dahil sa mataas na kahusayan nito sa akumulasyon ng malalaking halaga ng mga cell. Ito ay lumabas na ang mga cell ng mga transplanted na linya, hindi katulad ng iba pang mga uri ng mga kultura ng cell, ay maaaring linangin nang mahabang panahon sa isang nasuspinde na estado. Ang mga cell sa ilalim ng mga kundisyong ito ay dumarami nang hindi nakakabit sa mga dingding ng daluyan ng kultura, na nasa estado ng pagsususpinde, dahil sa patuloy na paghahalo ng daluyan. Sa ilalim ng pinakamainam na lumalagong rehimen, ang mga cell sa mga suspensyon ay mabilis na dumami at may mas mataas na "ani" kaysa sa mga nakatigil na kultura. Ang pangunahin at tuloy-tuloy na mga linya ng cell ay may iba't ibang kakayahan na lumago sa pagsususpinde. Kaya, ang heteroploid at aneuploid na mga permanenteng linya, sa kaibahan sa mga pseudodiploid na linya, ay mas mabilis na umaangkop sa paglaki sa suspensyon.

Ang mga kultura ng pagsususpinde ay inihanda mula sa mga kulturang monolayer. Ang mga cell ay nababalatan sa salamin na may mga solusyon sa versene at trypsin. Ang cell pellet pagkatapos ng centrifugation (1000 rpm) ay muling sinuspinde sa sariwang nutrient medium. Ang handa na suspensyon ay inilalagay sa mga sisidlan ng kultura (reactors, fermenters) at lumaki na may patuloy na pagpapakilos. Sa mga siyentipikong pag-aaral, ang konsentrasyon ng mga cell sa paunang suspensyon ay mula 0.3 hanggang 10x10 bawat 1 ml. Ang pinakamainam na konsentrasyon ng mga cell sa paunang suspensyon ay dapat na 2-5x10 bawat 1 ml. Ayon kay Earle at sa kanyang mga katuwang, ang konsentrasyon ng mga cell sa suspendido na kultura ay dapat na ganoon na ang logarithmic growth phase ay nangyayari nang hindi lalampas sa 16-24 na oras pagkatapos ng paghahanda ng kultura. Ang mga suspension cell culture ay dumaan sa mga katangiang yugto: isang lag phase, isang logarithmic growth phase, isang stationary phase, at isang logarithmic death phase. Sa unang yugto, bilang panuntunan, ang bilang ng mga cell ay bumababa, sa pangalawang yugto, ang populasyon ng cell ay tumataas (logarithmic growth stage), sa ikatlong yugto, walang pagtaas sa bilang ng mga cell ang naobserbahan (stationary phase). Kung ang paglilinang ay nagpapatuloy pa, pagkatapos ay ang isang panahon ng pagbaba sa bilang ng mga cell ay matatagpuan - ang yugto ng logarithmic na kamatayan (ang yugto ng pagkawasak). Ang rate ng pagpaparami ng cell sa logarithmic growth phase ay ipinahayag ng oras ng henerasyon. Ang generation time ay tumutukoy sa panahon na kinakailangan upang doblehin ang populasyon ng mga cell sa kultura. Para sa paglilinang ng suspensyon ng cell, isang mahalagang kondisyon ay ang paghahalo ng likido, na dapat na tuluy-tuloy at sapat na matindi upang mapanatili ang mga selula sa suspensyon, maiwasan ang mga ito mula sa pag-aayos at paglakip sa mga dingding ng sisidlan, at sa parehong oras ay hindi maging sanhi ng mekanikal. pinsala.

Ang paghahalo ng mga kultura ng suspensyon ay isinasagawa gamit ang mga bladed magnetic stirrer, pati na rin ang mga circular rocking chair. Sa kasalukuyan, ang pag-ikot ng mga vial at bote sa paligid ng longitudinal axis (15-40 rpm) ay malawakang ginagamit. Sa mga magnetic stirrer, ang bilis ng pag-ikot ay 100--200 rpm. Ang bilis ng paghahalo ay depende sa dami ng kultura; Ang maliit na volume ng kultura ay nangangailangan ng mababang bilis, habang dapat itong tumaas sa malalaking volume. Ginagawa ang siliconeization upang maiwasan ang pag-aayos ng cell sa panloob na ibabaw ng sisidlan. Ang silicone coating, dahil sa hydrophobicity nito, ay pumipigil sa mga cell mula sa paglakip sa pader ng sisidlan.

Ang mga panloob na dingding ng sisidlan ng kultura ay basa-basa ng isang 5% o 10% na solusyon ng silicone, at pagkatapos ng pagsingaw ng solvent (benzene, acetone), ang mga sisidlan ay pinananatili sa 85 ° C at 200 ° (sa loob ng 30 at 60 minuto, ayon sa pagkakabanggit. ). Pagkatapos ng paglamig, ang mga sisidlan ay punuin ng mainit na tubig na na-bidistill at iniwan sa loob ng 2 oras, pagkatapos ay hinuhugasan sila ng 3 beses na may tubig na na-bidistill at pinatuyo sa 100°C. Ang mga sisidlan ay isterilisado sa oven sa 170°C sa loob ng 2 oras.

Ang maximum na paglaki ng cell sa suspensyon ay sinusunod sa pH 7.0-7.2. Ang nutrient media na ginamit upang palaguin ang mga cell sa pagsususpinde ay hindi naiiba sa media na ginagamit upang palaguin ang mga linya ng cell sa monolayer culture. Kadalasan, kapag nililinang ang mga cell sa mga suspensyon, ang medium ng Eagle ay kinukuha na may dobleng konsentrasyon ng mga amino acid at bitamina.

Ang mga kultura ng suspensyon ay kumonsumo ng 2-7 beses na mas maraming glucose kaysa sa mga monolayer. Sa proseso ng pagkonsumo ng glucose, ang mga cell ay naglalabas ng lactic acid, nakakalason sa kanila, sa kapaligiran. Ang pagkonsumo ng glucose ng mga selula at ang paggawa ng lactic acid ay tumatakbo nang magkatulad at direktang umaasa sa density ng populasyon ng cell. Ito ay naging kapaki-pakinabang upang magdagdag ng insulin sa nutrient medium sa halagang 40 hanggang 200 IU bawat 1 litro. Ang pagdaragdag ng insulin sa nutrient medium ay nagbabago sa ratio sa pagitan ng dami ng glucose na hinihigop at ang dami ng lactic acid na inilabas. Para sa L cells, ang koepisyent na ito ay maaaring bawasan mula 74-81 hanggang 37-38%.

Ang iba't ibang mga amino acid ay natupok mula sa nutrient medium sa pamamagitan ng paglaki ng mga cell sa iba't ibang mga rate. Nabanggit na ang regular na pagdaragdag ng arginine (20-40 mg/l) at ang pagtaas ng halaga ng glutamine sa 450 mg/l ay pinapaboran ang paglago ng mga nasuspinde na kultura.

Ang pagdaragdag ng inositol (0.4 mg/l) ay nagpapabilis sa paglaki ng mga kultura ng amniotic cell ng tao. Ito ay kanais-nais na magdagdag ng catalase (1 mg/l) at thyroxine (12 mg/l) sa daluyan.

Malaking interes ang mga gawang nakatuon sa pagkuha ng mga nasuspinde na mga kultura ng cell sa isang sintetikong medium na hindi naglalaman ng serum ng dugo. Ang mga pagtatangka ay ginagawa upang taasan ang lagkit ng nutrient medium sa gastos ng mga sangkap na walang protina. Para sa layuning ito, ginagamit ang methylcellulose at hyaluronic acid.

Ang Methylcellulose sa isang konsentrasyon ng 0.1-0.2% ay may pinakamataas na proteksiyon na epekto sa mga cell na nasuspinde sa medium. Ang proteksiyon na epekto ng methylcellulose ay ang mga molekula ay bumubuo ng isang proteksiyon na layer sa paligid ng cell, na pumipigil sa pagkasira ng cell kapag ang medium ay hinalo. Ang isang napakahalagang tagapagpahiwatig ng estado ng kultura ng suspensyon ay ang bahagyang presyon ng oxygen sa likidong bahagi. Ang konsentrasyon ng oxygen sa bahagi ng gas ay nakasalalay sa density ng populasyon ng cell at madalas ay mas mababa sa atmospera. Ang kakulangan ng oxygen ay humahantong sa paglitaw ng granulation ng cytoplasm, ang mga cell ay nawawala ang kanilang regular na bilog na hugis. Sa isang bahagyang labis na oxygen, ang mga selula ay may mahusay na tinukoy, regular, bilugan na hugis, at nagiging napakalaki sa ilalim ng nakakapinsalang epekto ng labis na oxygen. Ang pinakamainam na konsentrasyon ng oxygen para sa iba't ibang mga kultura ng cell ay mula 9 hanggang 17% o 293 mm Hg. haligi. Sa mga konsentrasyon ng oxygen na higit sa 20%, ang paglaki ng cell ay pinipigilan. Kaya, sa isang konsentrasyon ng oxygen na 24%, ang pagpaparami ng mga rabbit embryonic kidney cells (ERK line) ay nabawasan ng kalahati, at sa 30% ay nabawasan ito sa zero. Ang pagtaas sa konsentrasyon ng oxygen ay may nakakalason na epekto sa cellular metabolism.

Kaya, ang pagpaparami ng mga cell sa suspensyon ay nakasalalay sa konsentrasyon ng mga cell sa paunang suspensyon, aeration at pH ng medium, ang komposisyon ng nutrient medium, ang paraan ng paghahalo, ang dami ng suspensyon, at iba pang mga kadahilanan.

Ang homogeneity ng suspension, ang posibilidad ng pangmatagalang pagpapanatili ng mga cell sa logarithmic phase ng paglago, ang mga prospect para sa matematikal na pagmomodelo ng mga proseso ng paglago ng cell depende sa impluwensya ng mga kadahilanan sa kapaligiran, ang kaginhawahan ng maraming pag-aaral ng physiological state ng cell kultura sa suspensyon, ang mataas na kahusayan ng paraan - ito ay hindi isang kumpletong listahan ng mga bentahe ng suspension kultura.

Ang mga kultura ng pagsususpinde ay malawakang ginagamit sa mga virological na pag-aaral at para sa akumulasyon ng malalaking halaga ng materyal na naglalaman ng virus, sa paggawa ng mga bakuna at mga diagnostic na paghahanda.

3.5 Paglilinang ng mga selula sa mga microcarrier

Noong 1967, iminungkahi ni Van Werel ang isang paraan ng kultura na pinagsasama ang mga elemento ng monolayer at suspension cell growth, na tinawag niyang "microcarrier" na paraan. Ang kakanyahan nito ay nakasalalay sa katotohanan na ang mga cell ay nakakabit at dumami sa ibabaw ng mga polymer balls-particles ng "microcarriers" (MN), na nakapaloob sa suspensyon gamit ang isang mixing device, tulad ng isang stirrer. Sa isang MN particle na may diameter na 160–230 mm, 350–630 (o isang average ng 460) na mga cell ang maaaring magkasya. Sa isang ml ng daluyan, ilang libong microcarrier na particle ang maaaring masuspinde, na ang kabuuang lawak ng mga ito ay mula sa ilang hanggang 50 cm 2 /ml.

Ang mga cell na inoculated sa cultivator ay nakakabit sa ibabaw ng mga particle ng MN at dumarami upang bumuo ng tuluy-tuloy na monolayer sa bawat indibidwal na particle.

Ang pangunahing bentahe ng pamamaraang ito ay:

1) paglikha ng mga pare-parehong kondisyon sa buong dami ng sisidlan, na ginagawang posible na epektibong kontrolin ang mga kinakailangang parameter (pH, p0 2, atbp.); 2) pagkuha ng isang mataas na density ng populasyon ng cell hanggang sa 5-6 milyong mga cell bawat 1 ml; 3) paglilinang ng ilang daang bilyong cell nang sabay-sabay; 4) ang pagpapakilala ng patuloy na kontrol sa dinamika ng paglaki ng cell; 5) isang pagbawas sa paglaki ng kontaminasyon dahil sa isang pagbawas sa mga operasyon na nauugnay sa depressurization ng daluyan ng kultura; 6) makabuluhang pagtitipid sa nutrient media; 7) ang kakayahang panatilihing direkta ang mga lumaki na selula sa mga particle sa mababang temperatura; 8) ang kakayahang artipisyal na lumikha ng iba't ibang konsentrasyon ng mga MN na may mga selulang tumubo sa kanila; 9) ang posibilidad na maipasa ang kultura nang walang paggamit ng trypsin sa pamamagitan ng pagdaragdag ng mga sariwang bahagi ng microcarrier.

Ang mga microcarrier ay dapat mayroong:

Isang maliit na positibong singil sa hanay na 1.5-1.8 MEKV / g. Dahil sa katotohanan na ang karamihan sa mga selula ng hayop ay may mahinang negatibong singil, mas madali silang makakabit sa naturang MN:

Densidad 1.05--1.15 g/cm; ang ipinahiwatig na density ay pinakamainam para sa pagpapanatili ng MN sa suspensyon;

Ang diameter ng butil ay mula 100 hanggang 250 microns, na nagbibigay ng mga lugar para sa paglago ng ilang daang mga cell;

Makinis na ibabaw;

Aninaw;

Kakulangan ng toxicity ng mga bahagi para sa mga cell;

Bahagyang pagsipsip ng mga medium na bahagi;

Versatility, na nagbibigay ng posibilidad na gamitin ang mga ito para sa pangunahin, diploid at heteroploid na mga selula. Walang maliit na kahalagahan ang mga katangian ng MH, na nagpapahintulot sa kanila na magamit nang paulit-ulit.

Ang isang pag-aaral ng maraming butil na paghahanda ng iba't ibang kemikal na kalikasan, kabilang ang mga ginawa mula sa cross-linked (PS) dextran, PS-agarose, PS-polyvinylpyrrolidone, polyacrylnitrite, porous silica gel, polystyrene, capron, nylon, at aluminosilicate, ay isinagawa sa upang gamitin ang mga ito bilang mga microcarrier.

Angkop ay ilan lamang sa mga ito, pangunahing batay sa PS-dextran.

Maraming mga dayuhang kumpanya ang nakabuo ng handa-gamiting komersyal na paghahanda ng mga microcarrier: Cytodex-1, 2, 3 (France, Sweden), Superbit (USA, England), Biosilon (Denmark). Ang halaga ng mga gamot na ito ay medyo mataas, kaya kinakailangan na magsagawa ng pananaliksik sa pagbuo at paggawa ng mga domestic MN.

Ang kultura ng cell sa mga microcarrier ay isinasagawa sa maginoo na mga fermenter ng kultura ng suspensyon. Ang fermenter ay hindi dapat magkaroon ng anumang mga protrusions, pockets, upang maiwasan ang akumulasyon ng mga microcarrier sa mga stagnant zone. Samakatuwid, makatwirang gumamit ng mga fermenter na may bilog na ilalim at makinis na mga dingding. Ang panloob na ibabaw ng fermenter ay dapat na siliconized upang maiwasan ang mga microcarrier na dumikit sa salamin o hindi kinakalawang na asero ng fermenter.

Maaaring gamitin ang karaniwang kagamitan upang kontrolin ang mga kondisyon ng pananim tulad ng pH at O ​​2 . Ang bilis ng paghahalo ng suspensyon sa carrier ay dapat na 40-60 rpm. Iba't ibang uri ng mga cell ang ginagamit para sa paglilinang sa MH.

Ang konsentrasyon ng cytodex ay maaaring mag-iba mula 0.5 hanggang 5 mg/ml. Gayunpaman, sa paggawa ng mga prophylactic na bakuna, karaniwang ginagamit ang panghuling konsentrasyon ng cytodex na hindi hihigit sa 1 mg/ml. Ang pagtaas ng konsentrasyon sa 3 mg/ml at sa itaas ay lumilikha ng karagdagang mga paghihirap na nauugnay sa pangangailangan para sa perfusion ng nutrient medium at ang bahagyang pagpapalit nito, na nagpapalubha sa proseso ng teknolohiya.

Ang konsentrasyon ng inoculum ng mga cell, pati na rin ang mga kondisyon ng paglilinang sa MN sa mga unang oras, ay higit na tinutukoy ang pinakamainam na mga parameter para sa paglaganap at maximum na akumulasyon ng mga cell. Ipinakita na ang inoculation ng 10 cell/ml ng tuloy-tuloy na linya ng monkey kidney (Vero) at diploid cells ng human embryonic fibroblasts (MRC-5) sa medium volume ay nabawasan sa 1/3 at sa pana-panahong naka-on ang stirrer (30). rpm) sa loob ng isang minuto pagkatapos ng bawat oras sa loob ng 4 na oras, na sinusundan ng pagdaragdag ng nutrient medium sa huling volume, ay humahantong sa pagtaas ng cell proliferation at ang kanilang bilang kumpara sa control (buong volume ng nutrient medium sa oras ng cell planting at tuluy-tuloy na operasyon ng stirrer mula sa simula ng paglilinang).

Ang nutrient medium ay mahalaga para sa pag-culture ng mga cell sa MN. Ang tamang pagpili ng nutrient medium ay makakatulong din na ma-optimize ang proseso ng paglaganap ng cell at ang kalidad nito. Kinakailangang pumili ng nutrient media para sa pag-culture ng mga cell sa iba't ibang uri ng MNs. Ipinakita na ang transplanted cell line ng monkey kidneys (Vero) sa cytodex ay nagbibigay ng pinakamataas na ani kapag gumagamit ng Eagle DME medium (planting cell concentration 10 5 ml) ngunit kumpara sa BME at 199 medium. Kung ang bilang ng mga cell sa panahon ng pagtatanim ay nabawasan hanggang 10 4 , pagkatapos ay ang pinakamahusay na media 199 ay nagbibigay ng mga resulta. Lahat ng media na nasubok ay naglalaman ng 10% na serum ng pangsanggol.

3.6 Lumalagong mga virus sa mga kultura ng cell

Sa kasalukuyan, ang mga pangunahing kultura, mga strain ng cell, at itinatag na mga linya ng cell ay ginagamit upang ihiwalay at palaganapin ang mga virus ng hayop. Sa pangkalahatan, ang pamamaraan ay pareho para sa lahat ng mga virus.

Ang medium ay tinanggal mula sa cell monolayer at ang monolayer ay hinuhugasan ng balanseng buffered saline solution (SBSR) o phosphate buffered saline (PBS) upang alisin ang mga inhibitor (antibodies) na maaaring nasa medium. Ang mga particle ng virus ay sinuspinde sa isang maliit na halaga ng SBSR o PBS at na-adsorbed ng mga cell sa loob ng 30-60 minuto. Ang mga solusyon sa asin ay pinapalitan ng sariwang daluyan.

Ang impeksiyon ng mga nilinang na selula na may mga virus ay nagdudulot ng mga katangiang pagbabago sa morphological sa mga selula. Ang mga huling degenerative na proseso ng cellular (cytopathogenic effect, CPE) ay nakita lamang pagkatapos ng ilang linggo ng paglaki sa pagkakaroon ng mga virus, ngunit sa ilang mga kaso, ang CPE ay natukoy pagkatapos ng 12 oras. Ang mga detalye ng mga pagbabago sa morphological ay naiiba sa kaso ng iba't ibang mga virus.

Kung, sa halip na isang produktibong impeksyon, ang virus ay nagdudulot ng pagbabagong-anyo ng cellular, kung gayon ito ay sinamahan din ng mga pagbabago sa katangian sa morpolohiya at mga katangian ng paglaki ng cell.

4. Mga pag-iingat kapag humahawak ng mga cell na nahawaan ng virus

Ang mga virus ay may cytopathogenic effect at nagsisilbing etiological agent sa maraming sakit ng tao at hayop. Bilang karagdagan, maraming mga virus (hal., mga ocornavirus, herpesvirus type II, adenovirus, polyoma virus, at SV40) ang lumilitaw na mga ahente na nagdudulot ng tumor sa mga hayop. Dahil sa kakayahan ng mga virus na dumaan sa mga bacterial filter, maaaring mahirap alisin ang mga virus mula sa mga hindi nahawaang cell culture sa pagkakaroon ng mga pagsususpinde ng virus, kung saan posible ang paghahatid ng virus sa pamamagitan ng hangin sa silid ng kultura.

Ang mga sumusunod na pag-iingat ay may pangkalahatang katangian at nalalapat lamang kapag ang mga virus ay walang anumang partikular na panganib. Kapag gumagamit ng lubhang mapanganib na mga virus na nagdudulot ng panganib sa kalusugan sa mga tauhan ng laboratoryo o mga tao at hayop sa nakapaligid na mundo, ang mga karagdagang pag-iingat ay dapat gawin. Kabilang sa mga partikular na virus ang mga virus ng sakit na Newcastle, mga virus ng sakit sa paa at bibig, mga virus ng vesicular stomatitis, mga virus ng pox, mga virus ng rabies, mga virus ng herpes type B, at iba pa. Bilang karagdagan, hindi makatitiyak na kahit ang mga virus tulad ng SV40 ay hindi nagdudulot ng panganib sa mga tao.

Ang isang espesyal na silid o grupo ng mga silid ay dapat gamitin upang makahawa sa mga cell at mapalago ang mga cell na nahawaan ng virus.

Walang mga live na virus ang dapat alisin sa mga silid na ito maliban kung nakalagay ang mga ito sa mga lalagyan ng mahigpit na selyado. Dapat gawin ang pag-iingat upang matiyak na ang mga panlabas na ibabaw ng mga lalagyan na ito ay hindi kontaminado ng mga partikulo ng virus.

Kapag nagtatrabaho sa mga virus, dapat gumamit ng mga espesyal na proteksiyon na damit (lab coats). Pagkatapos ng trabaho, ang mga damit na ito ay dapat ilagay sa isang espesyal na tangke para sa autoclaving.

Ang lahat ng media at glassware na na-contact sa mga virus ay dapat tratuhin ng chloros; pagkatapos lamang na maaari silang mailabas sa silid na idinisenyo upang gumana sa mga virus.

Ang lahat ng mga plastik na kagamitan ay dapat ilagay sa isang espesyal na tangke ng autoclaving.

Ang mga kagamitan para sa pag-iimbak at paghawak ng viral material ay dapat na matatagpuan sa loob ng pasilidad ng paghawak ng virus.

Ang laboratoryo ay dapat na nilagyan ng dalawang-cycle na autoclave upang maprotektahan ang mga kawani ng laboratoryo mula sa mga mapanganib na materyales.

4.1 Pagtuklas ng virus

Ang mga virus ay maaaring matukoy at mabibilang gamit ang maraming iba't ibang mga pagsubok, tulad ng:

1) Sinusukat ang aktibidad ng viral sa pamamagitan ng pagtukoy sa dami ng materyal na naglalaman ng virus na kinakailangan upang makakuha ng partikular na tugon sa host. Ang tugon na dulot ng virus ay maaaring maging all-or-nothing (ibig sabihin, ang pagkakaroon o kawalan ng impeksyon), o maaari itong mabilang, tulad ng tagal ng panahon bago lumitaw ang isang impeksyon o ang bilang ng mga sugat sa isang madaling kapitan ng cell. layer. Ang quantitative determination ng viral activity ay tinatawag na titration.

Ang pinakamaliit na dami ng virus na maaaring magdulot ng naaangkop na reaksyon ay tinatawag na nakakahawang unit, at ang titer ng paunang viral suspension ay ipinahayag bilang ang bilang ng mga nakakahawang unit sa bawat unit volume. Halimbawa, kung ang pinakamababang halaga ng pagsususpinde ng influenza virus na nagiging sanhi ng pulmonya sa isang mouse kapag na-injected sa intranasally na may suspensyon ng infected na tissue ng baga sa dilution na 1:10 6 ay 0.1 ml, nangangahulugan ito na ang titer ng influenza virus sa Ang paunang pagsususpinde ng tissue sa baga ay 10 7 nakakahawang unit kada 1ml--1/(10~1-10-6)=10 7 .

Bilang isang patakaran, ang isang ipinag-uutos na bahagi ng paraan ng titration ng virus ay isang pagsubok na nagbibigay-daan sa iyo upang suriin ang resulta ng inoculation bilang positibo o negatibo. Halimbawa, kapag nagti-titrate ng mga virus ng hayop, ang naturang pagsusuri ay maaaring ang pagkakaroon o kawalan ng nakikitang mga sugat sa cell culture, isang nagpapasiklab na reaksyon sa lugar ng inoculation ng virus sa balat o kornea, paralisis na nagreresulta mula sa pagpasok ng virus sa ang utak ng hayop, atbp. Minsan ang pagpaparami ng virus ay maaaring makita kahit na walang nakikitang reaksyon mula sa host organism: halimbawa, ang impeksiyon ng mga embryo ng manok na may myxovirus ay maaaring makita sa pamamagitan ng paglitaw ng hemagglutinin sa allantoic fluid.

Ang pinakamahusay na mga resulta ay nakuha sa pamamagitan ng mga pamamaraan ng titration, na batay sa pagbibilang ng bilang ng mga discrete lesyon sa isang tiyak na lugar ng isang layer ng mga cell na nahawaan ng isang kilalang dami ng materyal na naglalaman ng virus. Sa mga kaso kung saan ang bilang ng mga cell na madaling kapitan ng virus at naa-access ay maaaring ituring na halos walang katapusan na malaki, tulad ng, halimbawa, kapag ang isang monolayer na kultura ng bakterya sa nutrient agar ay nahawahan ng isang phage o kapag ang isang tuluy-tuloy na monolayer na kultura ng mga selula ng hayop ay nahawaan ng isang virus, ang mga sugat na dulot ng virus, o mga plake na nabuo phage, sa ganitong kahulugan, ay katulad ng mga kolonya ng bakterya sa isang siksik na nutrient medium. Kung paanong ang bilang ng mga kolonya ay proporsyonal sa bilang ng mga bacterial cell na nakapaloob sa titratable na paghahanda, kaya ang bilang ng mga plake ay direktang proporsyonal sa dami ng virus na idinagdag sa monolayer culture, ang pagbuo ng mga viral particle ng mga nahawaang selula, na maaaring makilala, halimbawa, sa pamamagitan ng likas na katangian ng mga nucleic acid at particle symmetry.

2) Ang paggawa ng mga nucleic acid ng mga nahawaang selula, na maaaring may katangiang density sa pamamagitan ng density gradient centrifugation o isang katangiang laki sa pamamagitan ng agarose gel electrophoresis o sucrose concentration gradient centrifugation.

3) Pagbuo ng mga nahawaang selula o mga nabagong selula ng mga katangiang antigen, na maaaring makita sa pamamagitan ng paglamlam ng mga fluorescent specific antibodies o magdulot ng mga pagbabago sa cell membrane na humahantong sa heme adsorption. Sa direktang pamamaraan, ang mga antibodies na nabuo laban sa mga viral antigen ay pinagsama sa isang fluorochrome at ginagamit upang mantsang ang mga nahawaang selula. Ang isang positibong reaksyon (dilaw-berde sa isang fluorescent na mikroskopyo) ay nagpapahiwatig ng pagkakaroon ng mga viral antigen sa mga selula. Ang pamamaraang ito ay maaaring gamitin upang makita ang cellular transformation kapag ang mga antibodies ay nabuo laban sa, halimbawa, maagang antigens ng SV40 virus, o upang makita ang pagbuo ng mga mature na virus kapag ang mga antibodies ay nabuo laban sa mga capsid protein. Sa hindi direktang paraan, ang mga antibodies ay hindi pinagsama sa isang fluorochrome. Sa halip, pagkatapos ng pakikipag-ugnayan ng mga antibodies sa mga antigen sa mga nakapirming paghahanda ng cell, ang mga anti-gamma globulin antibodies na pinagsama sa fluorochrome ay idinagdag sa kanila. Ang pamamaraang ito ay mas sensitibo at iniiwasan ang conjugation ng bawat indibidwal na antibody na may fluorescent dye. Kaya, ang parehong fluorescent antibodies sa rabbit antibodies (nakuha sa tupa laban sa rabbit gamma globulins) ay maaaring gamitin upang mantsang ang anumang antibodies na ginawa sa mga rabbits at nakikipag-ugnayan sa mga viral antigen sa productively infected o transformed cells. Ang isang mas hindi direkta, ngunit mas sensitibong paraan na hindi nangangailangan ng paggamit ng fluorescent microscope ay ang peroxidase-antiperoxidase method. Ayon sa pamamaraang ito, ang mga antibodies ng kuneho ay nakikipag-ugnayan sa mga fixed cell antigens at pagkatapos ay pinahiran ng mga antibodies ng kambing sa mga immunoglobulin ng kuneho na pinagsama-sama ng mga complex ng malunggay peroxidase at antiperoxidase ng kuneho. Pagkatapos nito, ang mga paghahanda ay ginagamot sa diamino-benzidine at hydrogen peroxide; Ang kulay ng kayumanggi ay nagpapahiwatig ng pagkakaroon ng mga antigens.

4) Ang pagkakaroon ng mga antigen sa mga particle ng viral ay maaaring humantong sa mga reaksyon ng hemagglutination, na nagbibigay-daan para sa quantitative assessment. Maraming mga virus ang may mga antigen na maaaring ma-adsorbed sa mga pulang selula ng dugo at maging sanhi ng pagdikit nito. Kapag ang isang malaking bilang ng mga viral particle at erythrocytes ay nakikipag-ugnayan, ang isang network ng mga cell ay nabuo, at ang suspensyon ay nagsasama-sama, i.e. erythrocytes namuo. Mayroong ilang partikular na tiyak na ang ilang mga virus ay nagdudulot ng pagsasama-sama ng mga erythrocytes ng ilang mga hayop, ngunit kung ang isang aktibong kumbinasyon ay natagpuan, ang hemagglutination ay nagiging isang mabilis na pagsubok upang matukoy ang titer ng virus. Ang dugo ay iginuhit sa isang heparinized syringe at ang mga erythrocytes ay hugasan ng tatlong beses na may reprecipitation sa 0.85% NaCl sa 200 g para sa 10 min. Ang huling erythrocyte sediment ay sinuspinde sa isang 200-tiklop na dami ng 0.85% NaCl solution. Ang pinaka-maginhawang paraan upang subukan para sa hemagglutination ay sa microtiter plates. Sa isang serye ng mga balon ng microtiter plate, magdagdag ng 25 µl ng 0.85% NaCl o PBS; Ang 25 μl ng virus suspension ay idinagdag sa unang balon at ang halo ay hinalo (1:2 dilution). Ang 25 µl ay inililipat mula sa unang balon hanggang sa pangalawa (dilution 1:4) at iba pa, hanggang sa ang huling dilution ay 1:2048. Pagkatapos nito, 25 µl ng erythrocyte suspension ay idinagdag sa bawat balon, ang halo ay hinalo at iniwan sa 4°C, temperatura ng silid o 37°C hanggang sa mangyari ang hemagglutination (1-2 oras). Sa mga balon kung saan naganap ang agglutination, ang erythrocyte sediment ay may hindi regular na hugis, at sa mga balon kung saan hindi naganap ang hemagglutination, ang cell sediment ay bumubuo ng isang compact na tuldok sa ilalim ng balon. Ang pagbabanto sa huling balon kung saan naganap ang haemagglutination ay itinuturing na titer at ang pagbabanto na ito ay itinalaga ng isang halaga ng 1 haemagglutination unit (HAU). Ang nakaraang pagbabanto ay naglalaman ng 2 HAU ayon sa pagkakabanggit, at iba pa.

5) Ang pagbuo ng mga nahawaang selula ng mga katangiang enzyme, o mga enzyme na madaling makilala sa pamamagitan ng kanilang mga katangian mula sa kaukulang mga enzyme ng host cell.

4.2 Paglilinang ng mga picornavirus gamit ang halimbawa ng pagkuha ng poliovirus type 3 sa HeLa cell culture

Bilang isang partikular na pamamaraan para sa pag-culture ng mga virus, maaaring banggitin ang isang paraan para sa pagpapalaki ng poliovirus sa tuluy-tuloy na mga selula.

Ang lahat ng mga pamamaraan ay isinasagawa sa ilalim ng mga sterile na kondisyon.

Ang ilang mga subline ng HeLa cells (hal. HeLa S3) ay maaaring lumaki sa mababang calcium ion media (hal. CaS2MEM). Para sa epektibong impeksyon, mahalaga na ang mga selula ay lumago nang maayos sa isang homogenous na suspensyon. Ang mga cell ay na-pellet sa pamamagitan ng mababang bilis ng sentripugasyon (15 min sa 900 g) at muling sinuspinde sa CaS2MEM sa isang konsentrasyon ng ~2. 10 7 cell/ml (~1/20 ng orihinal na volume).

Ang virus ay idinagdag sa suspensyon ng cell sa isang konsentrasyon na 10-50 PFU bawat cell; incubate ito sa magnetic stirrer sa loob ng 1 oras sa 35°C.

Ang suspensyon ay diluted na may parehong medium sa isang konsentrasyon ng 2. 10 6 cells/ml at magdagdag ng 100 μCi ng [ 3 H]-uridine.

Ang cell suspension ay incubated para sa 8 h, pagkatapos kung saan ang mga cell ay pelleted sa pamamagitan ng low speed centrifugation (15 min sa 900 g) at hugasan ng isang beses gamit ang phosphate buffer solution (PBS) na walang magnesium at calcium ions.

Ang mga cell ay muling sinuspinde sa PBS (5-10 7 cells/ml) at sumasailalim sa tatlong freeze-thaw cycle.

Ang mga labi ng cell ay tinanggal sa pamamagitan ng centrifugation.

Ang supernatant ay itinatago para sa karagdagang paglilinis.

Bibliograpiya

1. Adams R. Mga pamamaraan ng kultura ng cell para sa mga biochemist. - M.: Mir, 1983, 263 p.

2. Virology. Paraan. / Ed. B. Meikhi. - M.: Mir, 1988, 344 p.

3. Golubev D.B., Sominina A.A., Medvedeva M.N. Mga patnubay para sa paggamit ng mga kultura ng cell sa virology. - L .: Medisina, 1976, 224 p.

4. Dyakonov L.P., Glukhov V.F., Pozdnyakov A.A., Denisenko G.F., Kalmykova T.P. Paglilinang ng mga selula at tisyu ng mga hayop. - Stavropol: Stavrop. Pravda, 1988, bahagi 2, 91 p.

5. Animal cell sa kultura sa ilalim. ed. L.P. Dyakonova, V.I. Sitkova. - M.: 2000.

6. Kultura ng mga selula ng hayop. Paraan. / Ed. R. Freshni. - M.: Mir, 1989, 333 p.

7. Gabay sa veterinary virology. / Ed. V.N. Shurin. - M.: Kolos, 1965, 687 p.

8. Sergeev V.A. Pagpaparami at paglilinang ng mga virus ng hayop. - M.: Kolos, 1976, 303 p.

9. Fenner F., McOslen B., Mims S., Sambrook J., White D. Biology ng mga virus ng hayop. - M.: Mir, 1977, tomo 1, 447 p.

Naka-host sa Allbest.ru

...

Mga Katulad na Dokumento

Ang mga pangunahing paraan ng impeksyon ng mga embryo ng manok na may virus. Mga yugto ng pagkuha ng mga subculture: pag-alis ng layer ng cell, paghihiwalay at pagtatanim ng mga cell, ang paraan ng impeksyon ng mga kultura ng cell na may virus, pagtatala ng mga resulta. Mga semi-permanenteng kultura ng mga selula ng tao at hayop.

pagtatanghal, idinagdag noong 01/29/2015


Nutrient media sa microbiology, ang kanilang pag-uuri at mga varieties, mga lugar at mga tampok ng paggamit. Paglilinang ng aerobic at anaerobic microorganisms. Mga pamamaraan para sa quantitative accounting ng mga microorganism, mga pangunahing patakaran at kundisyon para sa pag-iimbak ng kanilang mga kultura.

abstract, idinagdag 03/25/2013


Flavans sa mas mataas na mga halaman: istraktura, pangunahing kinatawan, lokalisasyon, pagganap na papel. Morphophysiological at biochemical na katangian ng mga kultura ng cell at callus ng mga halaman ng tsaa. Pagpapasiya ng nilalaman ng mga flavan at proanthocyanidins.

thesis, idinagdag noong 02/02/2018


Mga uri ng carrier para sa immobilization ng mga cell at enzymes. Hindi kumikilos na mga kultura at ang posibilidad ng kanilang aplikasyon sa iba't ibang industriya. Mga uri ng reactor na gumagamit ng mga immobilized na kultura. Mga kalamangan at kawalan ng paggamit ng mga immobilized na kultura.

term paper, idinagdag noong 01/15/2012


Ang pag-aaral ng proseso ng paglikha ng mga artipisyal na asosasyon ng cell sa tulong kung saan posible na isakatuparan ang mahahalagang aktibidad ng mga organismo na nag-aayos ng nitrogen sa mga selula at tisyu ng mga nilinang halaman. Mga samahan ng uri ng endo- at exosymbiotic. Ang layunin ng paglikha ng mga populasyon.

pagtatanghal, idinagdag noong 03/18/2015


Ang halaga ng kahalumigmigan ng kapaligiran sa paglilinang ng mga enzyme sa maluwag na media. Impluwensiya ng antas ng aeration ng mga kultura ng microscopic fungi. Ang impluwensya ng komposisyon ng daluyan at ang tagal ng paglilinang sa biosynthesis ng lipase. Mga pamamaraan para sa pagproseso at pagpapalaki ng mga pananim.

pagtatanghal, idinagdag noong 03/19/2015


pagtatanghal, idinagdag noong 02/23/2014


Mga pamamaraan para sa paghihiwalay ng mga purong kultura ng microalgae at mga pamamaraan para sa kanilang pagkakakilanlan. Paghihiwalay ng isang purong kultura ng Euglena glacilis; pagsasaalang-alang ng mga pamamaraan para sa pagtukoy ng cell viability. Upang pag-aralan ang mga epekto ng uncouplers ng respiration at ATP synthesis sa cell motility.

thesis, idinagdag noong 05/24/2012


Mga partikular na salik ng antiviral immunity at ang synthesis ng antibodies sa isang partikular na antigen. Mga cell ng memorya at ang pagpapalabas ng immune response sa anyo ng antibody biosynthesis. Pagkalat ng nakakahawang brongkitis ng mga ibon at pangolin. Paglilinang ng mga virus sa mga selula.

pagsubok, idinagdag noong 11/17/2010


Paglalapat ng mga teknolohiya ng cell sa pagpaparami ng halaman. Paggamit ng mga in vitro na pamamaraan sa malayong hybridization. Gumagana sa paglilinang ng callus upang makakuha ng bagong materyal sa pag-aanak. Hybridization ng somatic cells at ang mga pangunahing resulta nito.

1966).

Ang mga diskarte sa kultura ng cell ay nabuo nang malaki noong 1940s at 1950s na may kaugnayan sa pananaliksik sa larangan ng virology. Ang paglilinang ng mga virus sa mga kultura ng cell ay naging posible upang makakuha ng purong viral na materyal para sa paggawa ng mga bakuna. Ang bakuna sa polio ay isa sa mga unang gamot na ginawa nang marami gamit ang teknolohiya ng cell culture. Noong 1954, natanggap nina Enders, Weller at Robbins ang Nobel Prize "para sa kanilang pagtuklas sa kakayahan ng polio virus na lumaki sa mga kultura ng iba't ibang mga tisyu." Noong 1952, binuo ang kilalang human cancer cell line na HeLa.

Mga pangunahing prinsipyo ng paglilinang[ | ]

Paghihiwalay ng cell[ | ]

Para sa paglilinang sa labas ng katawan, ang mga buhay na selula ay maaaring makuha sa maraming paraan. Ang mga selula ay maaaring ihiwalay sa dugo, ngunit ang mga leukocyte lamang ang maaaring tumubo sa kultura. Ang mga mononuclear cell ay maaaring ihiwalay mula sa malambot na mga tisyu gamit ang mga enzyme tulad ng collagenase, trypsin, at pronase na nagpapababa sa extracellular matrix. Bilang karagdagan, ang mga piraso ng tisyu at materyales ay maaaring ilagay sa nutrient medium.

Ang mga kultura ng mga selula na direktang kinuha mula sa bagay (ex vivo) ay tinatawag na pangunahin. Karamihan sa mga pangunahing selula, maliban sa mga selula ng tumor, ay may limitadong habang-buhay. Pagkatapos ng isang tiyak na bilang ng mga dibisyon ng cell, ang mga naturang selula ay tumatanda at humihinto sa paghahati, bagama't maaari pa rin silang manatiling mabubuhay.

May mga immortalized ("immortal") na mga linya ng cell na maaaring dumami nang walang katiyakan. Sa karamihan ng mga selula ng tumor, ang kakayahang ito ay resulta ng isang random na mutation, ngunit sa ilang mga linya ng cell ng laboratoryo ito ay nakuha nang artipisyal, sa pamamagitan ng pag-activate ng telomerase gene.

Kultura ng cell[ | ]

Ang mga cell ay lumaki sa espesyal na nutrient media sa isang pare-parehong temperatura. Para sa mga kultura ng cell ng halaman, ginagamit ang kontroladong pag-iilaw, at para sa mga selulang mammalian, karaniwang kailangan din ang isang espesyal na kapaligiran ng gas, na pinananatili sa isang incubator ng kultura ng cell. Bilang isang patakaran, ang konsentrasyon ng carbon dioxide at singaw ng tubig sa hangin ay kinokontrol, ngunit kung minsan din ang oxygen. Ang nutrient media para sa iba't ibang mga kultura ng cell ay naiiba sa komposisyon, konsentrasyon ng glucose, komposisyon ng mga kadahilanan ng paglago, atbp. Ang mga salik ng paglaki na ginagamit sa mammalian cell culture media ay kadalasang idinaragdag kasama ng blood serum. Ang isa sa mga kadahilanan ng panganib sa kasong ito ay ang posibilidad ng impeksyon ng kultura ng cell na may mga prion o mga virus. Sa paglilinang, isa sa mga mahalagang layunin ay maiwasan o mabawasan ang paggamit ng mga kontaminadong sangkap. Gayunpaman, sa pagsasagawa, hindi ito palaging nakakamit. Ang pinakamahusay, ngunit din ang pinakamahal na paraan ay upang madagdagan ng purified growth factor sa halip na suwero.

Cross-contamination ng mga linya ng cell[ | ]

Kapag nagtatrabaho sa mga kultura ng cell, maaaring harapin ng mga siyentipiko ang problema ng cross-contamination.

Mga tampok ng lumalagong mga cell[ | ]

Kapag lumalaki ang mga cell, dahil sa patuloy na paghahati, ang kanilang labis na kasaganaan sa kultura ay maaaring mangyari, at, bilang isang resulta, ang mga sumusunod na problema ay lumitaw:

Upang mapanatili ang normal na paggana ng mga kultura ng cell, pati na rin upang maiwasan ang mga negatibong phenomena, ang nutrient medium ay pana-panahong pinapalitan, ang mga cell ay irradiated at inililipat. Upang maiwasan ang kontaminasyon ng mga kultura na may bakterya, lebadura, o iba pang mga linya ng cell, ang lahat ng mga manipulasyon ay karaniwang isinasagawa sa ilalim ng mga kondisyong aseptiko sa isang sterile na kahon. Ang mga antibiotics (penicillin, streptomycin) at antifungal (amphotericin B) ay maaaring idagdag sa medium ng kultura upang sugpuin ang microflora.

Ang paglilinang ng mga selula ng tao ay medyo salungat sa mga alituntunin ng bioethics, dahil ang mga cell na lumago sa paghihiwalay ay maaaring mabuhay sa magulang na organismo at pagkatapos ay magamit upang magsagawa ng mga eksperimento o upang bumuo ng mga bagong paggamot at kumita mula dito. Ang unang desisyon ng korte sa lugar na ito ay dumating sa Korte Suprema ng California sa John Moore v. University of California, kung saan ang mga pasyente ay walang karapatan sa pagmamay-ari sa mga cell line na nagmula sa mga organ na inalis nang may pahintulot nila.

hybridoma [ | ]

Paggamit ng mga kultura ng cell[ | ]

Ang kultura ng mass cell ay ang batayan para sa pang-industriya na produksyon ng mga bakunang viral at iba't ibang mga produkto ng biotechnology.

Mga produktong biotechnology[ | ]

Ang isang pang-industriya na pamamaraan mula sa mga kultura ng cell ay gumagawa ng mga produkto tulad ng mga enzyme, synthetic hormones, monoclonal antibodies, interleukins, lymphokines, antitumor na gamot. Bagama't maraming simpleng protina ang medyo madaling makuha gamit ang mga bacterial culture, ang mas kumplikadong mga protina tulad ng glycoproteins ay kasalukuyang makukuha lamang mula sa mga selula ng hayop. Isa sa mga mahahalagang protinang ito ay ang hormone erythropoietin. Ang halaga ng lumalaking mammalian cell culture ay medyo mataas, kaya ang pananaliksik ay kasalukuyang ginagawa sa posibilidad ng paggawa ng mga kumplikadong protina sa insekto o mas mataas na mga kultura ng cell ng halaman.

mga tissue culture[ | ]

Ang cell culture ay isang mahalagang bahagi ng teknolohiya ng tissue culture at tissue engineering, dahil tinutukoy nito ang batayan para sa paglaki ng mga cell at pagpapanatili ng mga ito sa isang mabubuhay na estado ex vivo.

Mga bakuna [ | ]

Gamit ang mga pamamaraan ng cell culture, ang mga bakuna laban sa poliomyelitis, tigdas, beke, rubella, bulutong-tubig ay kasalukuyang ginagawa. Dahil sa banta ng isang H5N1 influenza pandemic, kasalukuyang pinopondohan ng gobyerno ng Estados Unidos ang pananaliksik sa isang bakuna sa avian influenza gamit ang mga cell culture.

Mga non-mammalian cell culture[ | ]

Mga kultura ng cell ng halaman[ | ]

Ang mga kultura ng cell ng halaman ay karaniwang lumalago bilang isang suspensyon sa isang likidong nutrient medium o bilang isang callus culture sa isang solidong nutrient base. Ang paglilinang ng mga walang pagkakaiba na mga selula at kalyo ay nangangailangan ng pagpapanatili ng isang tiyak na balanse ng mga hormone sa paglago ng halaman na mga auxin at cytokinin.

Bakterya, mga kultura ng lebadura[ | ]

Pangunahing artikulo:

Para sa paglilinang ng isang maliit na bilang ng mga bacterial at yeast cells, ang mga cell ay nilagyan ng solid nutrient medium batay sa gelatin o agar-agar. Para sa mass production, ang paglilinang sa likidong nutrient media (broths) ay ginagamit.

mga kultura ng virus[ | ]

I. Mga kultura ng cell

Ang pinakakaraniwan ay ang mga single-layer cell culture, na maaaring nahahati sa 1) pangunahin (pangunahing trypsinized), 2) semi-transplantable (diploid) at 3) transplantable.

Pinanggalingan ang mga ito ay inuri sa embryonic, neoplastic at mula sa mga adult na organismo; sa pamamagitan ng morphogenesis- sa fibroblastic, epithelial, atbp.

Pangunahin Ang mga cell culture ay mga selula ng anumang tissue ng tao o hayop na may kakayahang tumubo bilang isang monolayer sa ibabaw ng plastik o salamin na pinahiran ng espesyal na nutrient medium. Limitado ang haba ng buhay ng naturang mga pananim. Sa bawat kaso, ang mga ito ay nakuha mula sa tissue pagkatapos ng mekanikal na paggiling, paggamot na may proteolytic enzymes at standardisasyon ng bilang ng mga cell. Ang mga pangunahing kultura na nagmula sa mga bato ng unggoy, mga embryonic na bato ng tao, amnion ng tao, mga embryo ng sisiw ay malawakang ginagamit para sa paghihiwalay at akumulasyon ng virus, gayundin para sa paggawa ng mga bakunang viral.

semi-transplantable(o diploid ) mga kultura ng cell - mga cell ng parehong uri, na may kakayahang makatiis ng hanggang 50-100 na mga sipi sa vitro, habang pinapanatili ang kanilang orihinal na diploid na hanay ng mga chromosome. Ang mga diploid strain ng human embryonic fibroblast ay ginagamit kapwa para sa pagsusuri ng mga impeksyon sa viral at sa paggawa ng mga bakunang viral.

inilipat Ang mga linya ng cell ay nailalarawan sa pamamagitan ng potensyal na imortalidad at heteroploid karyotype.

Ang pinagmumulan ng mga inilipat na linya ay mga pangunahing kultura ng cell (halimbawa, SOC, PES, VNK-21 - mula sa mga bato ng day-old Syrian hamsters; PMS - mula sa bato ng guinea pig, atbp.), mga indibidwal na selula na nagpapakita ng isang ugali sa walang katapusang pagpaparami sa vitro. Ang kabuuan ng mga pagbabago na humahantong sa paglitaw ng mga naturang tampok mula sa mga cell ay tinatawag na pagbabagong-anyo, at ang mga selula ng mga transplanted tissue culture ay tinatawag na transformed.

Ang isa pang pinagmumulan ng mga transplantable cell line ay mga malignant neoplasms. Sa kasong ito, ang pagbabagong-anyo ng cell ay nangyayari sa vivo. Ang mga sumusunod na linya ng mga transplanted cell ay kadalasang ginagamit sa virological practice: HeLa - nakuha mula sa cervical carcinoma; Ner-2 - mula sa carcinoma ng larynx; Detroit-6 - mula sa metastasis ng kanser sa baga hanggang sa utak ng buto; RH - mula sa bato ng tao.

Para sa paglilinang ng cell, kinakailangan ang nutrient media, na, ayon sa kanilang layunin, ay nahahati sa paglago at pagsuporta sa mga. Ang komposisyon ng growth media ay dapat maglaman ng mas maraming nutrients upang matiyak ang aktibong pagpaparami ng mga cell upang bumuo ng isang monolayer. Ang pagsuporta sa media ay dapat lamang na tiyakin ang kaligtasan ng mga cell sa isang nabuo nang monolayer sa panahon ng pagpaparami ng mga virus sa cell.

Ang karaniwang sintetikong media, tulad ng Synthetic 199 media at Needle media, ay malawakang ginagamit. Anuman ang layunin, ang lahat ng nutrient media para sa mga cell culture ay idinisenyo batay sa isang balanseng solusyon sa asin. Kadalasan ito ang solusyon ni Hank. Ang isang mahalagang bahagi ng karamihan sa media ng paglago ay ang serum ng dugo ng mga hayop (guya, toro, kabayo), nang walang pagkakaroon ng 5-10% kung saan ang pagpaparami ng cell at ang pagbuo ng isang monolayer ay hindi nangyayari. Ang serum ay hindi kasama sa maintenance media.

I. Mga kultura ng cell - konsepto at uri. Pag-uuri at mga tampok ng kategoryang "I. Mga kultura ng cell" 2017, 2018.

- III. Mga komunikasyon sa radio relay

II. Mga wireless na komunikasyon I. Mga wired na komunikasyon Ø Komunikasyon sa telepono ng lungsod Ø Direktang komunikasyon sa telepono (selector) Ø Komunikasyon sa radyotelepono ("Altai") Ø Inductive na komunikasyon (EKV na komunikasyon "Diston", "Nalmes") Ø... .

- Pagkonsumo ng mga materyales sa bawat 1 km ng kalsada na may type IV asphalt concrete pavement

Talahanayan 15 Talahanayan 14 Talahanayan 13 Talahanayan 12 Talahanayan 11 Mga Kalsada Trapiko sa tambalang interes sa iba't ibang taon ng operasyon Mga halaga ng mga koepisyent m, K0, K0m na ​​may pagtaas ng intensity Talahanayan... .

- III. Oras 90 minuto.

Aralin Blg. 5 Sistema ng preno Paksa Blg. 8 Mga mekanismo ng kontrol Ayon sa pag-aayos ng mga kagamitan sa sasakyan Pagsasagawa ng isang grupong Plano ng aralin - abstract Guro ng POPON cycle, Tenyente Colonel Fedotov S.A. "____"... .

- Pagpapasiya ng Zmin at Xmin mula sa kondisyon na walang undercutting

Fig.5.9. Tungkol sa pagputol ng mga ngipin ng mga gulong. Isaalang-alang natin kung paano nauugnay ang rack shear factor x sa bilang ng mga ngipin na maaaring putulin ng rack sa gulong. Hayaang mai-install ang riles sa posisyon 1 (Larawan 5.9.). Sa kasong ito, ang tuwid na ulo ng rack ay tatawid sa linya ng pakikipag-ugnayan N-N sa t. At ....

- Verbos que terminan en -it, -et

Los verbos irregulares Go - ir Eat - comer Sleep - dormir Want - querer I Go Eat Sleep Gusto mo Kumain Ka Matulog Do He, She Go Eat Sleep Gusto Tayo Eat Sleep Gusto mo Kumain Sleep Do They Go...