mga kultura ng cell

Mga hayop

Indikasyon ng mga virus sa pamamagitan ng mga sumusunod na phenomena

pag-unlad pagkaantala,

kamatayan, pagbabago

mga shell ng embryo, RGA

CPP, pagbuo ng plake, RIF, RGads, interference

sakit, kamatayan,

mga pagbabago sa histological

sa mga tisyu, mga inklusyon

Titration ng nakahiwalay na virus; pagpili ng dosis ng pagtatrabaho.

Titer ng virus- ang maximum na pagbabanto ng materyal na naglalaman ng virus, kung saan ang inaasahang epekto ay sinusunod pa rin (CPE, RHA, pagkamatay ng hayop).

Pagkilala sa nakahiwalay na virus sa mga reaksyon ng neutralisasyon, RTGads, RSK, pagsugpo sa pagbuo ng plaka, atbp. na may diagnostic sera. Uri (uri) ng virus tinutukoy ng neutralisasyon ng tiyak na epekto ng virus ng kaukulang immune serum.

Tandaan: ang titration at pagkilala sa virus ay ginagawa gamit ang parehong phenomenon.

Paglilinang ng virus

Mga pamamaraan ng pananaliksik sa virological— mga pamamaraan para sa pag-aaral ng biology ng mga virus at ang kanilang pagkakakilanlan. Sa virology, ang mga pamamaraan ng molecular biology ay malawakang ginagamit, sa tulong kung saan posible na maitatag ang molekular na istraktura ng mga particle ng viral, kung paano sila tumagos sa cell at ang mga tampok ng pagpaparami ng mga virus, ang pangunahing istraktura ng mga viral nucleic acid. at mga protina. Ang mga pamamaraan para sa pagtukoy ng pagkakasunud-sunod ng mga bumubuo ng mga elemento ng viral nucleic acid at protina amino acids ay binuo. Nagiging posible na maiugnay ang mga pag-andar ng mga nucleic acid at ang mga protina na naka-encode ng mga ito sa pagkakasunud-sunod ng nucleotide at upang maitaguyod ang mga sanhi ng mga proseso ng intracellular na gumaganap ng isang mahalagang papel sa pathogenesis ng isang impeksyon sa viral.

Ang mga pamamaraan ng pananaliksik sa virological ay batay din sa mga proseso ng immunological (pakikipag-ugnayan ng antigen sa mga antibodies), mga biological na katangian ng virus (kakayahang mag-hemagglutinate, hemolysis, aktibidad ng enzymatic), mga tampok ng pakikipag-ugnayan ng virus sa host cell (ang likas na katangian ng cytopathic epekto, ang pagbuo ng intracellular inclusions, atbp.) .

Sa pagsusuri ng mga impeksyon sa viral, sa paglilinang, paghihiwalay at pagkakakilanlan ng mga virus, pati na rin sa paghahanda ng mga paghahanda ng bakuna, ang paraan ng tissue at cell culture ay malawakang ginagamit. Ginagamit ang pangunahin, pangalawa, matatag na tuluy-tuloy at diploid na mga kultura ng cell. Ang mga pangunahing kultura ay nakuha sa pamamagitan ng dispersing tissue na may proteolytic enzymes (trypsin, collagenase). Ang pinagmulan ng mga selula ay maaaring mga tisyu at organo (mas madalas na bato) ng mga embryo ng tao at hayop. Ang isang suspensyon ng mga cell sa isang nutrient medium ay inilalagay sa tinatawag na mattresses, bote o Petri dishes, kung saan, pagkatapos ng paglakip sa ibabaw ng sisidlan, ang mga cell ay nagsisimulang dumami. Para sa impeksyon sa virus, karaniwang ginagamit ang isang cell monolayer. Ang nutrient liquid ay pinatuyo, ang viral suspension ay ipinakilala sa ilang mga dilution, at pagkatapos makipag-ugnay sa mga cell, ang sariwang nutrient medium ay idinagdag, kadalasang walang suwero.

Ang mga cell mula sa karamihan sa mga pangunahing kultura ay maaaring i-subculture at tinutukoy bilang pangalawang kultura. Sa karagdagang pagpasa ng mga selula, isang populasyon ng mga selulang tulad ng fibroblast ay nabuo, na may kakayahang mabilis na pagpaparami, karamihan sa mga ito ay nagpapanatili ng orihinal na hanay ng mga kromosom. Ito ang mga tinatawag na diploid cells. Sa serial cultivation ng mga cell, ang matatag na tuluy-tuloy na mga kultura ng cell ay nakuha. Sa panahon ng mga sipi, lumilitaw ang mabilis na paghahati ng mga homogenous na selula na may heteroploid na hanay ng mga chromosome. Ang mga matatag na linya ng cell ay maaaring monolayer at suspensyon. Ang mga kultura ng monolayer ay lumalaki sa anyo ng isang tuluy-tuloy na layer sa ibabaw ng salamin, ang mga kultura ng suspensyon ay lumalaki sa anyo ng mga suspensyon sa iba't ibang mga sisidlan gamit ang mga agitator. Mayroong higit sa 400 mga linya ng cell na nagmula sa 40 iba't ibang uri ng hayop (kabilang ang mga primata, ibon, reptilya, amphibian, isda, insekto) at mga tao.

Ang mga piraso ng mga indibidwal na organo at tisyu (mga kultura ng organ) ay maaaring linangin sa artipisyal na nutrient media. Ang mga uri ng kulturang ito ay nagpapanatili ng istraktura ng tissue, na lalong mahalaga para sa paghihiwalay at pagpasa ng mga virus na hindi dumarami sa mga hindi nakikilalang tissue culture (halimbawa, mga coronavirus).

Sa mga nahawaang cell culture, ang mga virus ay maaaring matukoy sa pamamagitan ng pagbabago sa cell morphology, cytopathic action, na maaaring tiyak, ang hitsura ng mga inklusyon, sa pamamagitan ng pagtukoy ng mga viral antigen sa cell at sa fluid ng kultura; pagpapasiya ng mga biological na katangian ng viral progeny sa culture fluid at titration ng mga virus sa tissue culture, chick embryo o sensitibong hayop; sa pamamagitan ng pagtuklas ng mga indibidwal na viral nucleic acid sa mga cell sa pamamagitan ng molecular hybridization o mga kumpol ng nucleic acid sa pamamagitan ng cytochemical method gamit ang fluorescent microscopy.

Ang paghihiwalay ng mga virus ay isang matrabaho at mahabang proseso. Isinasagawa ito upang matukoy ang uri o variant ng virus na umiikot sa populasyon (halimbawa, upang matukoy ang serovariant ng influenza virus, ligaw o bakuna na strain ng polio virus, atbp.); sa mga kaso kung saan kinakailangan na magsagawa ng mga kagyat na hakbang sa epidemiological; kapag lumitaw ang mga bagong uri o variant ng mga virus; kung kinakailangan, kumpirmahin ang paunang pagsusuri; para sa indikasyon ng mga virus sa mga bagay sa kapaligiran. Kapag naghihiwalay ng mga virus, ang posibilidad ng kanilang pananatili sa katawan ng tao, pati na rin ang paglitaw ng isang halo-halong impeksiyon na dulot ng dalawa o higit pang mga virus, ay isinasaalang-alang. Ang isang genetically homogenous na populasyon ng isang virus na nakuha mula sa isang solong virion ay tinatawag na isang viral clone, at ang proseso ng pagkuha nito ay tinatawag na cloning.

Upang ihiwalay ang mga virus, impeksyon ng madaling kapitan ng mga hayop sa laboratoryo, ginagamit ang mga embryo ng manok, ngunit ang tissue culture ay kadalasang ginagamit. Ang pagkakaroon ng isang virus ay karaniwang tinutukoy ng tiyak na pagkabulok ng cell (cytopathic effect), ang pagbuo ng mga symplast at syncytia, ang pagtuklas ng mga intracellular inclusions, pati na rin ang isang tiyak na antigen na nakita gamit ang immunofluorescence, hemadsorption, hemagglutination (sa hemagglutinating virus), atbp. . Ang mga palatandaang ito ay makikita lamang pagkatapos ng 2-3 mga sipi ng virus.

Para sa paghihiwalay ng isang bilang ng mga virus, tulad ng mga virus ng trangkaso, ginagamit ang mga embryo ng manok, para sa paghihiwalay ng ilang mga virus ng Coxsackie at isang bilang ng mga arbovirus, ginagamit ang mga bagong panganak na daga. Ang pagkakakilanlan ng mga nakahiwalay na virus ay isinasagawa gamit ang mga serological test at iba pang mga pamamaraan.

Kapag nagtatrabaho sa mga virus, tinutukoy ang kanilang titer. Ang titration ng mga virus ay kadalasang isinasagawa sa tissue culture, na tinutukoy ang pinakamataas na pagbabanto ng fluid na naglalaman ng virus, kung saan nangyayari ang pagkabulok ng tissue, ang mga inklusyon at mga antigen na partikular sa virus ay nabuo. Ang paraan ng plaka ay maaaring gamitin upang titrate ang isang bilang ng mga virus. Ang mga plake, o mga negatibong kolonya ng mga virus, ay foci ng mga cell na nasira ng virus ng isang solong layer na tissue culture sa ilalim ng agar coating. Ang pagbilang ng kolonya ay nagbibigay-daan sa isang quantitative analysis ng nakakahawang aktibidad ng mga virus sa batayan na ang isang nakakahawang partikulo ng virus ay bumubuo ng isang plaka. Nakikilala ang mga plake sa pamamagitan ng paglamlam sa kultura ng mahahalagang tina, kadalasang neutral na pula; ang mga plake ay hindi sumisipsip sa pangulay at samakatuwid ay nakikita bilang mga light spot laban sa background ng mga stained live na cell. Ang titer ng virus ay ipinahayag bilang ang bilang ng mga yunit na bumubuo ng plaka sa 1 ml.

Ang paglilinis at konsentrasyon ng mga virus ay karaniwang isinasagawa sa pamamagitan ng differential ultracentrifugation na sinusundan ng centrifugation sa concentration o density gradients. Upang linisin ang mga virus, ginagamit ang mga immunological na pamamaraan, ion-exchange chromatography, immunosorbents, atbp.

Kasama sa pagsusuri sa laboratoryo ng mga impeksyon sa viral ang pagtuklas ng pathogen o mga bahagi nito sa klinikal na materyal; paghihiwalay ng virus mula sa materyal na ito; serodiagnosis. Ang pagpili ng pamamaraan ng diagnostic ng laboratoryo sa bawat indibidwal na kaso ay depende sa likas na katangian ng sakit, ang panahon ng sakit at ang mga kakayahan ng laboratoryo. Ang mga modernong diagnostic ng mga impeksyon sa viral ay batay sa mga express na pamamaraan na nagbibigay-daan sa iyong makakuha ng tugon ilang oras pagkatapos kumuha ng klinikal na materyal sa mga unang yugto pagkatapos ng sakit. Kabilang dito ang electron at immune electron microscopy, pati na rin ang immunofluorescence, ang paraan ng molecular hybridization , ang pagtuklas ng mga antibodies ng klase ng IgM, atbp.

Ang electron microscopy ng mga negatibong batik na mga virus ay nagbibigay-daan sa pagkita ng kaibahan ng mga virus at pagtukoy ng kanilang konsentrasyon. Ang paggamit ng electron microscopy sa diagnosis ng mga impeksyon sa viral ay limitado sa mga kaso kung saan ang konsentrasyon ng mga viral particle sa klinikal na materyal ay sapat na mataas (10 5 sa 1 ml at mas mataas). Ang kawalan ng pamamaraan ay ang kawalan ng kakayahang makilala sa pagitan ng mga virus na kabilang sa parehong pangkat ng taxonomic. Ang kawalan na ito ay inalis sa pamamagitan ng paggamit ng immune electron microscopy. Ang pamamaraan ay batay sa pagbuo ng mga immune complex kapag ang isang tiyak na suwero ay idinagdag sa mga particle ng viral, habang ang sabay-sabay na konsentrasyon ng mga particle ng viral ay nangyayari, na ginagawang posible na makilala ang mga ito. Ang pamamaraan ay ginagamit din upang makita ang mga antibodies. Para sa layunin ng mga express diagnostic, ang isang electron microscopic na pagsusuri ng mga extract ng tissue, feces, likido mula sa mga vesicle, at mga lihim mula sa nasopharynx ay isinasagawa. Ang electron microscopy ay malawakang ginagamit upang pag-aralan ang morphogenesis ng virus; ang mga kakayahan nito ay pinalawak sa paggamit ng mga may label na antibodies.

Ang paraan ng molecular hybridization, batay sa pagtuklas ng mga nucleic acid na partikular sa virus, ay ginagawang posible na makakita ng mga solong kopya ng mga gene at walang katumbas sa mga tuntunin ng sensitivity. Ang reaksyon ay batay sa hybridization ng mga pantulong na strands ng DNA o RNA (probes) at ang pagbuo ng mga double-stranded na istruktura. Ang pinakamurang probe ay cloned recombinant DNA. Ang probe ay may label na radioactive precursors (karaniwan ay radioactive phosphorus). Ang paggamit ng mga reaksyong colorimetric ay maaasahan. Mayroong ilang mga variant ng molecular hybridization: point hybridization, blot hybridization, sandwich hybridization, in situ hybridization, atbp.

Ang mga antibodies ng class lgM ay lumalabas nang mas maaga kaysa sa mga antibodies ng class G (sa ika-3-5 araw ng pagkakasakit) at nawawala pagkatapos ng ilang linggo, kaya ang kanilang pagtuklas ay nagpapahiwatig ng isang sariwang impeksiyon. Ang mga antibodies ng klase ng IgM ay natutukoy ng immunofluorescence o enzyme immunoassay gamit ang anti-m antisera (anti-IgM heavy chain sera).

Ang mga pamamaraan ng serological sa virology ay batay sa mga klasikal na reaksyon ng immunological (tingnan. Mga pamamaraan ng immunological na pananaliksik ): complement fixation reactions, hemagglutination inhibition, biological neutralization, immunodiffusion, indirect hemagglutination, radial hemolysis, immunofluorescence, enzyme immunoassay, radioimmunoassay. Ang mga micromethod para sa maraming mga reaksyon ay binuo, at ang kanilang mga diskarte ay patuloy na pinagbubuti. Ang mga pamamaraang ito ay ginagamit upang makilala ang mga virus gamit ang isang hanay ng kilalang sera at para sa serodiagnosis upang matukoy ang pagtaas ng mga antibodies sa pangalawang serum kumpara sa una (ang unang serum ay kinuha sa mga unang araw pagkatapos ng sakit, ang pangalawa - pagkatapos 2-3 linggo). Ang halaga ng diagnostic ay hindi bababa sa apat na beses na pagtaas ng mga antibodies sa pangalawang serum. Kung ang pagtuklas ng mga antibodies ng klase ng lgM ay nagpapahiwatig ng isang kamakailang impeksyon, kung gayon ang mga antibodies ng klase ng lgC ay nagpapatuloy sa loob ng ilang taon, at kung minsan ay habang-buhay.

Upang matukoy ang mga indibidwal na antigen ng mga virus at antibodies sa kanila sa mga kumplikadong paghahalo nang walang paunang paglilinis ng protina, ginagamit ang immunoblotting. Pinagsasama ng pamamaraan ang fractionation ng protina gamit ang polyacrylamide gel electrophoresis na may kasunod na immunoassay ng mga protina sa pamamagitan ng enzyme immunoassay. Ang paghihiwalay ng mga protina ay binabawasan ang mga kinakailangan para sa kemikal na kadalisayan ng antigen at ginagawang posible na makilala ang mga indibidwal na pares ng antigen-antibody. Ang gawaing ito ay may kaugnayan, halimbawa, sa serodiagnosis ng impeksyon sa HIV, kung saan ang maling-positibong enzyme immunoassay reaksyon ay dahil sa pagkakaroon ng mga antibodies sa cellular antigens, na naroroon bilang isang resulta ng hindi sapat na paglilinis ng mga viral protein. Ang pagkakakilanlan ng mga antibodies sa sera ng mga pasyente sa panloob at panlabas na mga antigen ng viral ay ginagawang posible upang matukoy ang yugto ng sakit, at sa pagsusuri ng mga populasyon, ang pagkakaiba-iba ng mga protina ng viral. Ang immunoblotting sa HIV infection ay ginagamit bilang confirmatory test para makita ang mga indibidwal na viral antigens at antibodies sa kanila. Kapag sinusuri ang mga populasyon, ang pamamaraan ay ginagamit upang matukoy ang pagkakaiba-iba ng mga viral protein. Ang malaking halaga ng pamamaraan ay nakasalalay sa posibilidad ng pag-aaral ng mga antigens na synthesize gamit ang recombinant DNA technology, na nagtatatag ng kanilang laki at ang pagkakaroon ng mga antigenic determinants.

Ang etiological diagnosis ng mga viral disease ay isinasagawa ng virological, virological, serological at molecular genetic na pamamaraan. Ang huling tatlong paraan ay maaaring gamitin bilang express diagnostic na pamamaraan.

Paraan ng virological diagnostic.

Ang pinakalayunin ng pamamaraan ay kilalanin ang mga virus sa isang species o serological na variant. Kasama sa pamamaraang virological ang ilang yugto:

1) pagpili ng materyal para sa pananaliksik;

2) pagproseso ng materyal na naglalaman ng virus;

3) kontaminasyon ng mga sensitibong sistema ng pamumuhay na may materyal;

4) indikasyon ng mga virus sa mga buhay na sistema;

5) titration ng mga nakahiwalay na mga virus;

6) pagkilala sa mga virus sa mga reaksyon ng immune.

1. Pagpili ng materyal para sa pananaliksik .

Isinasagawa ito sa mga unang yugto ng sakit, napapailalim sa mga patakaran na pumipigil sa kontaminasyon ng materyal na may dayuhang microflora at impeksyon ng mga medikal na tauhan. Upang maiwasan ang hindi aktibo na virus sa panahon ng transportasyon, ang materyal ay inilalagay sa isang viral transport medium (VTS) na binubuo ng balanseng solusyon ng asin, antibiotics, at serum albumin. Ang materyal ay dinadala sa isang espesyal na lalagyan na may thermal insulation at mga saradong plastic bag na naglalaman ng yelo. Kung kinakailangan, ang materyal ay nakaimbak sa -20˚C. Ang bawat sample ng materyal para sa pananaliksik ay dapat na may label at may label na may pangalan ng pasyente, uri ng materyal, petsa ng sampling, detalyadong klinikal na diagnosis at iba pang impormasyon.

Depende sa likas na katangian ng sakit, ang materyal para sa pag-aaral ay maaaring:

1) pamunas mula sa ilong bahagi ng lalaugan at pamunas mula sa lalaugan;

2) cerebrospinal fluid;

3) feces at rectal swabs;

6) likido mula sa serous cavities;

7) pahid mula sa conjunctiva;

8) mga nilalaman ng mga vesicle;

8) sectional na materyal.

Upang makakuha ng flushing mula sa oropharynx, 15-20 ml ng VTS ang ginagamit. Maingat na hinuhugasan ng pasyente ang lalamunan ng VTS sa loob ng 1 minuto at kinokolekta ang flush sa isang sterile vial.

Ang isang smear mula sa likod ng pharynx ay kinuha gamit ang isang sterile cotton swab, pagpindot sa ugat ng dila gamit ang isang spatula. Ang pamunas ay inilalagay sa 2-3 ml ng VTS, hugasan at pinipiga.

Ang cerebrospinal fluid ay nakukuha sa pamamagitan ng lumbar puncture. Ang 1-2 ml ng cerebrospinal fluid ay inilalagay sa isang sterile na lalagyan at inihatid sa laboratoryo.

Ang mga fecal sample ay kinukuha sa loob ng 2-3 araw sa sterile vial. Ang isang 10% na suspensyon ay inihanda mula sa nakuha na materyal gamit ang Hank's solution. Ang suspensyon ay sentripuged sa 3000 rpm, ang supernatant ay kinokolekta, ang mga antibiotics ay idinagdag dito at inilagay sa isang sterile na lalagyan.

Ang dugo na nakuha sa pamamagitan ng venipuncture sa dami ng 5-10 ml ay defibrinated sa pamamagitan ng pagdaragdag ng heparin. Ang buong dugo ay hindi nagyelo at hindi nagdaragdag ng mga antibiotic. Upang makakuha ng serum, ang mga sample ng dugo ay inilubog sa 37°C sa loob ng 60 minuto.

Ang likido mula sa mga serous na lukab ay nakuha sa pamamagitan ng pagbutas sa halagang 1-2 ml. Ang likido ay ginagamit kaagad o pinananatiling frozen.

Ang isang smear mula sa conjunctiva ay kinuha gamit ang isang sterile swab at inilagay sa VTS, pagkatapos kung saan ang materyal ay centrifuged at frozen.

Ang mga nilalaman ng mga vesicle ay hinihigop ng isang hiringgilya na may manipis na karayom ​​at inilagay sa VTS. Ang materyal ay ipinadala sa laboratoryo sa anyo ng mga pinatuyong pahid sa mga glass slide o sa mga selyadong sterile capillaries o ampoules.

Ang materyal na seksyon ay kinuha nang maaga hangga't maaari, na sinusunod ang mga patakaran ng asepsis. Ang mga hiwalay na hanay ng mga sterile na instrumento ay ginagamit para sa pagkuha ng bawat sample. Ang halaga ng mga napiling tisyu ay 1-3 g, na inilalagay sa mga sterile vial. Una, kinukuha ang mga sample ng extracavitary organs (utak, lymph node, atbp.). Ang mga tisyu ng lukab ng dibdib ay kinuha bago buksan ang lukab ng tiyan. Ang mga resultang sample ng tissue ay dinidikdik sa isang mortar na may pagdaragdag ng sterile na buhangin at sterile sodium chloride solution, pagkatapos kung saan ang materyal ay sentripuge. Ang supernatant ay kinokolekta sa mga vial, idinagdag ang mga antibiotic. Ang materyal para sa virological research ay ginagamit kaagad o nakaimbak sa -20°C.

2. Pagproseso ng materyal na naglalaman ng virus.

Isinasagawa ito upang palayain ang materyal mula sa kasamang bacterial microflora. Para dito, ginagamit ang mga pisikal at kemikal na pamamaraan.

Mga pisikal na pamamaraan:

1) pagsasala sa pamamagitan ng iba't ibang bacterial filter;

2) sentripugasyon.

Mga pamamaraan ng kemikal:

1) paggamot ng materyal na may eter sa mga kaso ng paghihiwalay ng mga virus na walang supercapsid;

2) pagdaragdag ng pinaghalong heptane at freon sa materyal;

3) ang pagpapakilala ng mga antibiotics (penicillin - 200-300 U / ml; streptomycin - 200-500 μg / ml; nystatin - 100-1000 U / ml).

3. Impeksyon ng mga sensitibong sistema ng pamumuhay na may materyal.

1) mga hayop sa laboratoryo;

2) mga embryo ng manok;

3) mga kultura ng organ;

4) tissue culture.

mga hayop sa laboratoryo. Ginagamit ang mga puting daga, guinea pig, hamster, kuneho, atbp. Ang mga puting daga ay pinaka-sensitibo sa maraming uri ng mga virus. Ang paraan ng impeksyon ng mga hayop ay tinutukoy ng tropismo ng virus sa mga tisyu. Ang impeksyon sa utak ay ginagamit sa paghihiwalay ng mga neurotropic virus (rabies virus, poliovirus, atbp.). Ang impeksyon sa intranasal ay isinasagawa kapag ang mga pathogen ng mga impeksyon sa paghinga ay nakahiwalay. Malawakang ginagamit intramuscular, intravenous, intraperitoneal, subcutaneous at iba pang mga paraan ng impeksiyon. Ang mga may sakit na hayop ay pinapatay ng eter, binuksan at ang materyal ay kinuha mula sa mga organo at tisyu.

mga embryo ng manok. Malawak na magagamit at madaling gamitin. Maglagay ng mga embryo ng manok na may edad 5 hanggang 14 na araw. Bago ang impeksyon, ang mga embryo ng manok ay ovoscoped: ang kanilang kakayahang mabuhay ay tinutukoy, ang hangganan ng air sac at ang lokasyon ng embryo (ang "madilim na mata" ng embryo) ay minarkahan sa shell. Ang pagtatrabaho sa mga embryo ng manok ay isinasagawa sa isang sterile na kahon na may mga sterile na instrumento (sipit, syringe, gunting, sibat, atbp.). Matapos makumpleto ang isang fragment ng trabaho, ang mga instrumento ay nahuhulog sa 70% ethyl alcohol at sinusunog bago ang susunod na pagmamanipula. Bago ang impeksyon, ang shell ng isang embryo ng manok ay punasan ng isang nasusunog na alcohol swab at isang alkohol na solusyon ng yodo. Ang dami ng materyal sa pagsubok na iniksyon sa embryo ay 0.1-0.2 ml. Hindi bababa sa 4 na chick embryo ang ginagamit upang ihiwalay ang mga virus mula sa isang materyal.

Ang mga pag-aaral sa virological ay mga pag-aaral na idinisenyo upang ihiwalay ang mga virus at pag-aralan ang mga katangian ng mga ito, gayundin upang itatag ang etiological na kaugnayan ng mga virus sa ilang mga sakit.

Ang materyal para sa pag-aaral ay kinuha depende sa lokasyon ng nangingibabaw na mga virus sa katawan ng pasyente at sa mga paraan ng paglabas ng mga ito sa panlabas na kapaligiran. Ang materyal ay kinokolekta sa isang sterile dish, inihatid sa laboratoryo sa lalong madaling panahon at nakaimbak hanggang sa ang pag-aaral ay nagyelo o sa yelo. Bago gamitin, ang materyal para sa paghihiwalay ng virus ay pinoproseso (at) upang sugpuin ang dayuhang microflora at napapailalim sa pag-alis ng malalaking particle.

Ang paghihiwalay ng mga virus ay isinasagawa sa pamamagitan ng impeksyon sa virus na naglalaman ng materyal ng mga hayop sa laboratoryo, mga embryo ng manok, tissue culture. Ang pagpili ng paraan ng paghihiwalay ay depende sa sinasabing causative agent ng sakit. Kaya, ang mga tissue culture (tingnan) ay ginagamit kapag nagtatrabaho sa mga virus na hindi pathogenic para sa mga hayop sa laboratoryo, o kapag sila ay nakita sa tissue culture nang mas maaga kaysa kapag ang mga hayop ay nahawahan. Ang mga embryo ng manok ay nahawaan upang ihiwalay ang mga pathogen, nakakahawang parotitis (sa amniotic at allantoic cavity), (sa yolk sac), bulutong (sa chorionallantoic membrane).

Sa mga hayop sa laboratoryo, ang mga puting daga ay kadalasang ginagamit para sa paghihiwalay ng virus, na sinusundan ng mga kuneho, daga, guinea pig, at unggoy. Para sa mga arbovirus, ang pinaka-epektibong pagpapakilala ng materyal na naglalaman ng virus sa ulo o, para sa mga pneumotropic virus - sa mauhog lamad ng respiratory tract, para sa mga virus ng bulutong - sa scarified cornea.

Ang paghihiwalay ng mga virus ay pinaka-epektibo sa talamak na panahon ng sakit. Ang isang mahalagang punto sa pagtatatag ng viral na kalikasan ng sakit ay ang mga resulta ng serological na pag-aaral ng sera na paulit-ulit na kinuha mula sa parehong pasyente sa simula ng sakit at sa panahon ng paggaling. Ang pagtuklas ng mga antibodies sa mga nakahiwalay na virus sa pangalawang serum sa isang titer na 4 o higit pang beses na mas malaki kaysa sa una ay nagpapahiwatig ng etiological na relasyon ng mga virus sa sakit na ito.

Ang isang maaga at mabilis na paraan para sa pagtuklas ng mga viral antigen ay ang paraan ng fluorescent antibodies, batay sa tiyak na pag-aayos ng mga antibodies na may label na fluorochrome sa ibabaw ng antigen. Ang antigen ay madaling ihayag sa luminescent microscopy (tingnan) salamat sa maliwanag na fluorescence ng mga antibodies na na-adsorb sa antigen. Gamit ang paraan ng fluorescent antibodies, ang mga smear na kinuha mula sa mga pasyente, mga histological na seksyon ng mga apektadong tisyu, mga paghahanda mula sa tissue culture ay sinusuri. Ilapat din sa pagtuklas ng mga elementary body (virion) (tingnan). Sa iba pang mga morphological na pamamaraan, ang mga nakakakita ng intracellular viral inclusions sa mga seksyon ng mga apektadong organo at tisyu ay ginagamit. Ang pagtuklas ng mga inklusyon ay nagpapahiwatig ng impeksiyon at sa ilang mga kaso ay nag-aambag sa pagsusuri ng isang viral disease. Iba't ibang paraan ang ginagamit upang makita ang mga viral antibodies sa dugo ng mga pasyente at upang pag-aralan ang antigenic na istraktura ng mga virus. Ang reaksyon ng neutralisasyon ay ginagamit sa halos lahat ng mga impeksyon sa viral. Ito ay batay sa kakayahan ng mga immune antibodies na i-neutralize ang mga nakakahawang katangian ng mga virus kapag ang halo ay ipinakilala sa katawan ng madaling kapitan ng mga hayop o sa tissue culture. Upang matukoy ang index ng neutralisasyon, ang isang pare-pareho na dosis ng suwero ay halo-halong may iba't ibang mga dilution ng mga virus, at upang matukoy ang antibody titer, iba't ibang mga dilution ng suwero na may pare-pareho na dosis ng mga virus. Ang kontrol ay impeksyon ng mga hayop (o tissue culture) na may pinaghalong mga virus na may normal na serum o asin. Ang reaksyon ng neutralisasyon ay nakatakda hindi lamang upang makita ang mga antibodies, kundi pati na rin upang matukoy ang uri at uri ng mga virus.

Ang complement fixation reaction [halimbawa, Borde - Zhangu reaction (tingnan)] ay ginagamit upang makita ang parehong mga viral antigen at antibodies. Sa unang kaso, ang kilalang immune serum ay nakikipag-ugnayan sa materyal kung saan ang pagkakaroon ng mga antigen ay ipinapalagay: serum ng dugo, nasopharyngeal swabs, mga extract ng tissue ng nahawaang organismo. Sa pangalawang kaso, isang kilalang antigen (diagnosticum) at serum ng pasyente o convalescent.

Ginagamit ang RSK upang masuri ang mga sakit na dulot ng influenza, bulutong, adenovirus at arbovirus.

Ang virological research ay kinabibilangan ng dalawang pangunahing yugto: paghihiwalay ng mga virus at ang kanilang pagkakakilanlan. Ang materyal para sa virological research ay maaaring dugo, iba pang biological at pathological fluid, biopsy ng mga organo at tisyu.

Ang virological blood testing ay kadalasang ginagawa upang masuri ang mga impeksyon sa arbovirus. Sa laway, maaaring matukoy ang mga virus ng rabies, beke, herpes simplex. Ang mga nasopharyngeal swab ay nagsisilbing ihiwalay ang trangkaso at iba pang ARVI pathogens, tigdas. Sa mga paghuhugas mula sa conjunctiva, ang mga adenovirus ay matatagpuan. Ang iba't ibang entero-, adsno-, pso-, nora- at rotavirus ay nakahiwalay sa mga dumi.

Ginagamit ang mga cell culture, mga embryo ng manok, at kung minsan ang mga hayop sa laboratoryo upang ihiwalay ang mga virus.

Karamihan sa mga pathogenic na virus ay tiyak sa tissue at uri, halimbawa, ang poliovirus ay nagpaparami lamang sa mga primate cell, kaya isang naaangkop na tissue culture ang ginagamit upang ihiwalay ang isang partikular na virus. Upang ihiwalay ang isang hindi kilalang pathogen, ipinapayong sabay-sabay na makahawa sa 3-4 na mga kultura ng cell, sa pag-aakalang ang isa sa mga ito ay maaaring sensitibo. Ang pagkakaroon ng virus sa mga nahawaang kultura ng cell ay tinutukoy ng pag-unlad ng tiyak na pagkabulok ng cell, i.e. cytopathogenic effect, pagtuklas ng mga intracellular inclusions, pati na rin sa batayan ng pagtuklas ng isang tiyak na antigen sa pamamagitan ng immunofluorescence, positibong hemadsorption at hemagglutination reaksyon.

Ang mga embryo ng ibon na may mahinang pagkakaiba-iba ng mga tisyu ay angkop para sa paglilinang ng maraming mga virus. Makipag-chat lamang gumamit ng mga embryo ng manok. Kapag dumarami sa mga embryo, ang mga virus ay maaaring maging sanhi ng kanilang pagkamatay (arboviruses), ang hitsura ng mga pagbabago sa chorion-allantoic membrane (pox virus) o sa katawan ng embryo, ang akumulasyon sa mga embryonic fluid ng temag glutinino sa (influenza, mumps viruses ) at ang pandagdag ng nagbubuklod na viral antigen .

Ang pagkilala sa mga virus ay isinasagawa gamit ang mga immunological na pamamaraan: hemagglutination inhibition reaction, complement fixation, neutralization, gel precipitation, immunofluorescence.

Higit pa sa paksang Virological method:

1. Pagsusuri ng pangunahing anthropometric data sa pamamagitan ng parametric na pamamaraan (sigma method)
2. Conditional Extinction Treatment at Forced Training Method
3. 2. Comparative legal na pamamaraan - pribadong siyentipikong pamamaraan ng legal na agham
4. MGA MODERNONG PARAAN NG DIAGNOSIS AT ANG PAGPILI NG PARAAN NG PAGGAgamot ng SUBMUCOUS UTERINE MYOMA
5. 5.4. Ang konsepto at istraktura ng pangkalahatang paraan ng pagsisiyasat bilang isang paraan ng praktikal na aktibidad
6. Paksa 8. MICROBIOLOGICAL METHODS PARA SA PAG-AARAL NG VARIABILITY AT MEKANISMO NG PAGLIPAT NG HEREDITARY INFORMATION. APPLICATION OF GENETIC METHODS UPANG MAKALIKHA NG MGA BAGONG DROGA
7. Paksa 15. PATHOGENICITY AT VIRULENCE NG MICROORGANISMS. VIRULENCE FACTORS. PARAAN NG IMPEKSIYON NG MGA HAYOP SA LABORATORY. ANTIGENS, PARAAN NG KANILANG PAGKUKUHA. ANTIBODIYA. IMMUNE REACTIONS AT ANG KANILANG PRAKTIKAL NA PAGGAMIT. PHAGOCYTOSIS