Mechanizm fagocytozy: etapy i etapy. Fagocytoza w odpowiedziach immunologicznych organizmu
Odporność: mechanizmy wdrażania
Komórki i cząsteczki działają wspólnie, wspierając się nawzajem na różnych etapach rozwoju odpowiedzi immunologicznej.
Niespecyficzne mechanizmy
Na pierwszym etapie zderzenia z obcym antygenem uruchamiany jest niespecyficzny patologiczny proces ochronny - stan zapalny, któremu towarzyszy fagocytoza, uwalnianie mediatorów stanu zapalnego - histaminy, serotoniny, cytokin itp. Fagocyty (makrofagi) absorbują antygeny i kontaktują się z T- limfocyty pomocnicze, prezentujące na powierzchni determinanty antygenowe. T-pomocnicy wyzwalają rozmnażanie (wydzielanie specyficznych substancji białkowych - interleukin) klonów T-zabójców i limfocytów B specyficznych dla danego antygenu z wcześniej istniejących komórek macierzystych, które zostały przetestowane pod kątem tolerancji w okresie embrionalnym (teoria selekcji klonalnej Burneta).
Zapalenie (łac. inflammatio) to złożony, miejscowy i ogólny proces patologiczny, który zachodzi w odpowiedzi na uszkodzenie (alteratio) lub działanie bodźca chorobotwórczego i objawia się reakcjami (exudatio itp.) mającymi na celu wyeliminowanie produktów uszkodzeń, a jeśli to możliwe , następnie czynniki (drażniące), jak również prowadzące do maksymalnego wyleczenia tych warunków (proliferatio itp.) w strefie uszkodzenia.Schemat rozwoju stanu zapalnego. Pod wpływem czynnika uszkadzającego makrofagi uwalniają cytokiny prozapalne, które przyciągają inne komórki do ogniska zapalenia, w wyniku czego dochodzi do agregacji lub uwalniania przez nie substancji aktywnych, zostaje naruszona integralność tkanki .
Fagocytoza (Phago - pożerać i cytos - komórka) - proces, w którym specjalne komórki krwi i tkanek organizmu (fagocyty) wychwytują i trawią patogeny chorób zakaźnych oraz martwe komórki. Przeprowadzają ją dwa rodzaje komórek: krążące we krwi leukocyty ziarniste (granulocyty) oraz makrofagi tkankowe. Odkrycie fagocytozy należy do II Miecznikowa, który ujawnił ten proces, przeprowadzając eksperymenty z rozgwiazdami i rozwielitkami, wprowadzając ciała obce do ich ciał. Na przykład, kiedy Miecznikow umieścił zarodnik grzyba w ciele rozwielitki, zauważył, że został on zaatakowany przez specjalne ruchome komórki. Kiedy wprowadził zbyt wiele zarodników, komórki nie miały czasu na strawienie ich wszystkich i zwierzę zdechło. Miecznikow nazwał komórki, które chronią organizm przed bakteriami, wirusami, zarodnikami grzybów itp. fagocytami.U ludzi istnieją dwa rodzaje fagocytów zawodowych:neutrofile i monocyty (w tkankach - makrofagi)
Główne etapy reakcji fagocytującej są podobne dla obu typów komórek. Reakcję fagocytozy można podzielić na kilka etapów:
1. Chemotaksja. W reakcji fagocytozy większą rolę odgrywa chemotaksja dodatnia. Chemoatraktantami są produkty wydzielane przez mikroorganizmy i aktywowane komórki w ognisku zapalenia (cytokiny, leukotrien B4, histamina), a także produkty rozpadu składników dopełniacza (C3a, C5a), proteolityczne fragmenty czynników krzepnięcia krwi i fibrynolizy (trombina , fibryna), neuropeptydy, fragmenty immunoglobulin itp. Natomiast „profesjonalnymi” chemotaksynami są cytokiny z grupy chemokin.
Neutrofile migrują do ogniska zapalnego wcześniej niż inne komórki, a makrofagi przybywają znacznie później. Szybkość ruchu chemotaktycznego dla neutrofili i makrofagów jest porównywalna, różnice w czasie przybycia są prawdopodobnie związane z różnymi szybkościami ich aktywacji.
2. Adhezja fagocytów do obiektu.Wynika to z obecności na powierzchni fagocytów receptorów dla cząsteczek prezentowanych na powierzchni obiektu (własnych lub z nim związanych). Podczas fagocytozy bakterii lub starych komórek organizmu gospodarza rozpoznawane są terminalne grupy sacharydowe - glukoza, galaktoza, fukoza, mannoza itp., które są prezentowane na powierzchni fagocytowanych komórek. Rozpoznawanie dokonują receptory lektynopodobne o odpowiedniej specyficzności, przede wszystkim białko wiążące mannozę oraz selektyny obecne na powierzchni fagocytów.
W tych przypadkach, gdy przedmiotem fagocytozy nie są żywe komórki, ale kawałki węgla, azbestu, szkła, metalu itp., Fagocyty najpierw czynią obiekt absorpcji akceptowalnym dla reakcji, owijając go własnymi produktami, w tym składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej, którą wytwarzają.
Chociaż fagocyty są zdolne do wchłaniania różnego rodzaju „nieprzygotowanych” obiektów, proces fagocytarny osiąga największe nasilenie podczas opsonizacji, tj. utrwalanie na powierzchni przedmiotów opsonin, dla których fagocyty mają specyficzne receptory - dla fragmentu Fc przeciwciał, składników układu dopełniacza, fibronektyny itp.
3. Aktywacja błony.Na tym etapie obiekt jest przygotowywany do zanurzenia. Następuje aktywacja kinazy białkowej C, uwalnianie jonów wapnia z magazynów wewnątrzkomórkowych. Duże znaczenie mają przejścia zol-żel w układzie koloidów komórkowych oraz rearanżacje aktyna-miozyna.
4. Nurkuj. Obiekt się zawija
5. Tworzenie fagosomu.Zamknięcie błony, zanurzenie przedmiotu wraz z częścią błony fagocytu do wnętrza komórki.
6. Tworzenie fagolizosomu.Fuzja fagosomu z lizosomami, w wyniku której powstają optymalne warunki do bakteriolizy i rozszczepienia martwej komórki. Mechanizmy konwergencji fagosomów i lizosomów nie są jasne, prawdopodobnie istnieje aktywny ruch lizosomów do fagosomów.
7. Zabijanie i rozłupywanie.Rola ściany komórkowej strawionej komórki jest ogromna. Główne substancje biorące udział w bakteriolizie: nadtlenek wodoru, produkty metabolizmu azotu, lizozym itp. Proces niszczenia komórek bakteryjnych jest zakończony dzięki aktywności proteaz, nukleaz, lipaz i innych enzymów, których aktywność jest optymalna przy niskich wartości pH.
8. Uwalnianie produktów degradacji.
Fagocytoza może być: zakończona (udało się zabijanie i trawienie), niekompletna (dla wielu patogenów fagocytoza jest niezbędnym etapem ich cyklu życiowego, np. u prątków i gonokoków).
aktywacja dopełniacza.
Układ dopełniacza działa jak biochemiczna kaskada reakcji. Dopełniacz jest aktywowany przez trzy szlaki biochemiczne: szlak klasyczny, alternatywny i lektynowy. Wszystkie trzy szlaki aktywacji wytwarzają różne warianty konwertazy C3 (białka, które rozszczepia C3). Szlak klasyczny (został odkryty jako pierwszy, ale jest ewolucyjnie nowy) wymaga aktywacji przeciwciał (swoista odpowiedź immunologiczna, odporność nabyta), podczas gdy szlaki alternatywne i lektynowe mogą być aktywowane przez antygeny bez obecności przeciwciał (niespecyficzna odpowiedź immunologiczna reakcja, odporność wrodzona). Wynik aktywacji dopełniacza we wszystkich trzech przypadkach jest taki sam: konwertaza C3 hydrolizuje C3, tworząc C3a i C3b i powodując kaskadę dalszej hydrolizy elementów układu dopełniacza i zdarzeń aktywacji. W szlaku klasycznym aktywacja konwertazy C3 wymaga utworzenia kompleksu C4b2a. Kompleks ten powstaje po rozszczepieniu C2 i C4 przez kompleks C1. Z kolei kompleks C1 w celu aktywacji musi związać się z immunoglobulinami klasy M lub G. C3b wiąże się z powierzchnią patogenów, co prowadzi do większego „zainteresowania” fagocytów komórkami związanymi z C3b (opsonizacja). C5a jest ważnym chemoatraktantem, który pomaga przyciągać nowe komórki odpornościowe do obszaru aktywacji dopełniacza. Zarówno C3a, jak i C5a wykazują działanie anafilotoksyczne, powodując bezpośrednio degranulację komórek tucznych (w efekcie uwalnianie mediatorów stanu zapalnego). C5b rozpoczyna tworzenie kompleksów atakujących błonę (MAC) składających się z C5b, C6, C7, C8 i polimerowego C9. MAC jest cytolitycznym produktem końcowym aktywacji dopełniacza. MAC tworzy kanał transbłonowy, który powoduje lizę osmotyczną komórki docelowej. Makrofagi pochłaniają patogeny znakowane przez układ dopełniacza.
klasyczny sposób
Szlak klasyczny jest wyzwalany przez aktywację kompleksu C1 (zawiera on po jednej cząsteczce C1q oraz po dwie cząsteczki C1r i C1s). Kompleks C1 wiąże się poprzez C1q z immunoglobulinami klasy M i G związanymi z antygenami. Heksameryczny C1q ma kształt bukietu nieotwartych tulipanów, których „pąki” mogą wiązać się z regionem Fc przeciwciał. Pojedyncza cząsteczka IgM wystarcza do zainicjowania tego szlaku, aktywacja przez cząsteczki IgG jest mniej wydajna i wymaga większej ilości cząsteczek IgG.
C1q wiąże się bezpośrednio z powierzchnią patogenu, co prowadzi do zmian konformacyjnych w cząsteczce C1q i aktywuje dwie cząsteczki proteaz serynowych C1r. Rozszczepiają C1 (również proteazę serynową). Kompleks C1 wiąże się następnie z C4 i C2, a następnie rozszczepia je, tworząc C2a i C4b. C4b i C2a wiążą się ze sobą na powierzchni patogenu, tworząc konwertazę C3 szlaku klasycznego, C4b2a. Pojawienie się konwertazy C3 prowadzi do rozszczepienia C3 na C3a i C3b. C3b tworzy razem z C2a i C4b konwertazę C5 szlaku klasycznego.
Alternatywna ścieżka
Alternatywny szlak jest wyzwalany przez hydrolizę C3 bezpośrednio na powierzchni patogenu. W szlaku alternatywnym biorą udział czynniki B i D. Z ich pomocą powstaje enzym C3bBb. Białko P stabilizuje go i zapewnia jego długotrwałe funkcjonowanie.Ponadto PC3bBb aktywuje C3, w wyniku czego powstaje C5-konwertaza i uruchamia się tworzenie kompleksu atakującego błonę. Dalsza aktywacja końcowych składników dopełniacza zachodzi w taki sam sposób, jak w klasycznym szlaku aktywacji dopełniacza.
Szlak alternatywny różni się od klasycznego tym, że aktywacja układu dopełniacza nie wymaga tworzenia kompleksów immunologicznych, odbywa się bez udziału pierwszych składników dopełniacza - C1, C2, C4. Różni się również tym, że działa natychmiast po pojawieniu się antygenów – jego aktywatorami mogą być bakteryjne polisacharydy i lipopolisacharydy, cząstki wirusowe, komórki nowotworowe.
Lektynowy (mannozowy) szlak aktywacji układu dopełniacza
Szlak lektynowy związany z mannanem (mannan jest polimerem mannozy) jest homologiczny do klasycznego szlaku aktywacji układu dopełniacza. Szlak ten wykorzystuje lektynę wiążącą mannan (MBL), białko podobne do klasycznego szlaku aktywacji C1q, które wiąże się z resztami mannozy i innymi cukrami na błonie, aby umożliwić rozpoznanie różnych patogenów. MBL jest białkiem należącym do grupy kolektyn białek wytwarzanych przez wątrobę i może aktywować kaskadę dopełniacza poprzez wiązanie się z powierzchnią patogenu. MBL jest cząsteczką o 2-6 wierzchołkach, która tworzy kompleks z MASP-I (proteaza serynowa związana z lektyną wiążącą mannan, proteaza serynowa związana z MBL) i MASP-II. MASP-I i MASP-II są bardzo podobne do C1r i C1 klasycznej ścieżki aktywacji i mogą mieć wspólnego ewolucyjnego przodka. Kiedy wierzchołki MBL determinujące węglowodany wiążą się ze specyficznie zorientowanymi resztami mannozy na dwuwarstwie fosfolipidowej patogenu, MASP-I i MASP-II są aktywowane i rozszczepiają białko C4 na C4a i C4b, a białko C2 na C2a i C2b.C4b i C2a następnie łączą się w patogen powierzchniowy, tworząc konwertazę C3, podczas gdy C4a i C2b działają jako chemoatraktanty.Komórkowa odpowiedź immunologiczna
Wirus, który dostał się do organizmu, ulega endocytozie przez makrofagi, a następnie częściowemu zniszczeniu w retikulum endoplazmatycznym (1). W efekcie powstają obce fragmenty, które eksponowane są na powierzchni komórkowej makrofagów (2). Fragmenty te są „prezentowane” przez specjalną grupę białek błonowych (białka MHC). Kompleks fragmentu wirusa i białka głównego kompleksu zgodności tkankowej [MHC (MHC)] jest rozpoznawany i wiązany przez komórki T przy użyciu swoistych receptorów (komórki T). Spośród ogromnej liczby limfocytów T tylko nieliczne posiadają odpowiedni receptor (3).Wiązanie prowadzi do aktywacji tych limfocytów T i pojawienia się ich selektywnych kopii (4, „selekcja klonalna”). Różne hormonopodobne białka sygnalizacyjne, interleukiny [IL (IL), patrz str. 378]. Białka te są wydzielane przez te komórki układu odpornościowego, które są aktywowane po związaniu z limfocytami T. Tak więc aktywowane makrofagi z prezentowanym fragmentem wirusowym wydzielają IL-1 (5), a limfocyty T wytwarzają IL-2 (6), która stymuluje ich własne kopiowanie klonalne i replikację komórek pomocniczych T.
Sklonowane i aktywowane limfocyty T pełnią różne funkcje w zależności od ich rodzaju. Cytotoksyczne komórki T (na zielonym diagramie) są w stanie rozpoznać i związać te komórki organizmu, które są zakażone wirusami i przenoszą fragmenty wirusa na swoich receptorach MHC (7). Cytotoksyczne limfocyty T wydzielają perforynę, białko, które przenika przez błonę związanej zakażonej komórki, prowadząc do lizy komórki (8).
Przeciwnie, T-pomocnicy (na niebieskim diagramie) wiążą się z komórkami B, które prezentują na swojej powierzchni fragmenty wirusa związane z białkiem MHC (9). Prowadzi to do selektywnego klonowania poszczególnych limfocytów B i ich masowej proliferacji, interleukina stymuluje (10) dojrzewanie limfocytów B - transformację w komórki plazmatyczne (11) zdolne do syntezy i wydzielania przeciwciał (12)
Fagocytoza (z greckiego phago – pożeram i cytos – komórka) to proces wchłaniania i trawienia substancji antygenowych, w tym mikroorganizmów, przez komórki pochodzenia mezodermalnego, zwane fagocyty. I. I. Miecznikow podzielił fagocyty na makrofagi i mikrofagi. Obecnie makro- i mikrofagi są zjednoczone pojedynczy system makrofagów (SMF). Ten system obejmuje:
- makrofagi tkankowe - komórki nabłonkowe,
- gwiaździste retikuloendoteliocyty (komórki Kupffera),
- makrofagi pęcherzykowe i otrzewnowe zlokalizowane w pęcherzykach płucnych i jamie otrzewnej,
- białe wyrostki naskórkowe skóry (komórki Langerhansa) itp.
Mikrofagi obejmują:
- neutrofile,
- eozynofile,
- bazofile.
Funkcje makrofagów niezwykle zróżnicowane. Jako pierwsze reagują na obcą substancję, będąc wyspecjalizowanymi komórkami, które absorbują i niszczą obce substancje w organizmie (komórki obumierające, komórki nowotworowe, bakterie, wirusy i inne mikroorganizmy, antygeny, niemetabolizowane substancje nieorganiczne). Ponadto makrofagi wytwarzają wiele substancji biologicznie czynnych - enzymy (m.in. lizozym, peroksydaza, esteraza), białka dopełniacza, immunomodulatory, takie jak interleukiny. Obecność na powierzchni makrofagów receptorów dla immunoglobulin (Am) i dopełniacza oraz układu mediatorów zapewnia ich interakcję z limfocytami T i B. Jednocześnie makrofagi aktywują funkcje ochronne limfocytów T. Ze względu na obecność receptorów dla dopełniacza i Am oraz układu zgodności tkankowej Ag (HLA), makrofagi biorą udział w wiązaniu i rozpoznawaniu antygenów. Tak więc fagocyty pełnią trzy funkcje:
- ochronny, związany z oczyszczaniem organizmu z czynników zakaźnych, produktów rozpadu tkanek itp .;
- reprezentowanie, polegające na prezentacji antygenowych epitoli limfocytom na błonie fagocytów;
- wydzielniczy, związany z wydzielaniem enzymów lizosomalnych i innych substancji biologicznie czynnych – cytokin, które odgrywają ważną rolę w immunogenezie.
Następujące sekwencyjnie płyną etapy fagocytozy.
- Chemotaksja– ukierunkowany ruch fagocytów w kierunku gradientu chemicznego chemoatraktantów w środowisku. Zdolność do chemotaksji związana jest z obecnością na błonie swoistych receptorów dla chemoatraktantów (obiektów fagocytozy), którymi mogą być bakterie, produkty degradacji tkanek organizmu itp.
- Przyczepność(przywiązanie) jest również pośredniczone przez odpowiednie receptory, ale może przebiegać zgodnie z prawami nieswoistych oddziaływań fizyko-chemicznych. Cząsteczki są adsorbowane na powierzchni makrofaga.
- Endocytoza(przechwytywanie) - następuje inwazja błony komórkowej, wychwytywanie obcej cząstki i jej zanurzenie w protoplazmie. W wyniku endocytozy powstaje wakuola fagocytarna - fagosom(tj. bańka w protoplazmie wokół zaabsorbowanej cząstki).
- trawienie wewnątrzkomórkowe- rozpoczyna się od wchłonięcia fagocytowanych obiektów. Fagosom łączy się z lizosomem fagocytu, który zawiera dziesiątki enzymów i następuje tworzenie fagolizosomu (zniszczenie) przechwyconej cząstki przez enzymy. Kiedy cząsteczka należąca do samego organizmu zostanie wchłonięta (na przykład martwa komórka lub jej części, własne białka), jest rozkładana przez enzymy fagolizosomów na substancje nieantygenowe (aminokwasy, kwasy tłuszczowe, nukleotydy, monocukry). Jeśli obca cząstka zostanie wchłonięta, enzymy fagolizosomu nie są w stanie rozbić substancji na składniki nieantygenowe. W takich przypadkach fagolizosom wraz z pozostałą częścią antygenu, który zachował swoją obcość, jest przekazywany przez makrofagi do limfocytów T i B, czyli włączane jest specyficzne ogniwo odpornościowe.
funkcja wydzielnicza to wydzielanie przez fagocyty substancji biologicznie czynnych – cytokin – są to interleukina-1 i interleukina-2, które są komórkowymi mediatorami regulującymi proliferację, różnicowanie i funkcję fagocytów, limfocytów, limfoblastów i innych komórek. Makrofagi wytwarzają i wydzielają tak ważne czynniki regulacyjne, jak prostaglandyny, leukotrieny, cykliczne nukleotydy o szerokim zakresie aktywności biologicznej. Ponadto makrofagi syntetyzują i wydzielają szereg produktów o działaniu przeciwbakteryjnym, przeciwwirusowym i cytotoksycznym (rodniki tlenowe O2-H2O2, lizozym, interferon itp.).
Fagocytoza jest wzmacniana przez przeciwciała opsoninowe, ponieważ związany lub antygen jest łatwiej adsorbowany na powierzchni fagocytu, ze względu na obecność receptorów dla tych przeciwciał w tym ostatnim. To wzmocnienie fagocytozy przez przeciwciała nazywa się opsonizacja, tj. przygotowanie mikroorganizmów do wychwytywania przez fagocyty. Fagocytoza opsonizowanych antygenów nazywana jest immunologiczną.
Aby scharakteryzować aktywność fagocytozy wprowadzono indeks fagocytarny. Aby to ustalić, pod mikroskopem zlicza się liczbę bakterii wchłoniętych przez jeden fagocyt. Również cieszyć się indeks opsonofagocytarny reprezentujący stosunek parametrów fagocytarnych uzyskanych dla surowicy immunologicznej i nieimmunologicznej. Indeks fagocytarny i indeks opsonofagocytowy są wykorzystywane w immunologii klinicznej do oceny stanu odporności i statusu immunologicznego.
Fagocytoza odgrywa ważną rolę w ochronie przeciwbakteryjnej, przeciwgrzybiczej i przeciwwirusowej, utrzymując odporność organizmu na obce substancje. Fagocyty działają również aktywująco i supresyjnie na limfocyty, biorą udział w resuscytacji tolerancji immunologicznej, odporności przeciwinfekcyjnej, transplantacyjnej i przeciwnowotworowej oraz niektórych form alergii (HTZ).
Fagocytoza to szczególny proces wchłaniania przez komórkę dużych kompleksów makrocząsteczkowych lub struktur korpuskularnych. „Profesjonalne” fagocyty u ssaków to dwa typy zróżnicowanych komórek – neutrofile i makrofagi, które dojrzewają w szpiku kostnym z HSC i mają wspólną pośrednią komórkę progenitorową.Neutrofile krążą we krwi obwodowej i stanowią znaczną część leukocytów krwi - 60-70%, czyli 2,5-7,5x109 komórek na 1 litr krwi. Zwykle neutrofile nie opuszczają naczyń do tkanek obwodowych, ale jako pierwsze „pędzą” (tj. ulegają wynaczynieniu) do miejsca zapalenia z powodu szybkiej ekspresji cząsteczek adhezyjnych - VCAM-1 (ligand śródbłonka VLA-4) oraz integryna CDllb/CD18 (ligand na śródbłonku ICAM-1). Ekskluzywne markery - CD66a i CD66d (carcinoma-embrional Ag) zidentyfikowano na ich błonie zewnętrznej.
Monocyty i makrofagi. Monocyty są „formą pośrednią”, we krwi stanowią 5-10% całkowitej liczby leukocytów. Ich celem jest stać się i być osiadłymi makrofagami w tkankach.
Makrofagi wątrobowe - komórki Kupffera, mózg - mikroglej, makrofagi płucne - pęcherzykowe i śródmiąższowe, nerkowe - mezangialne.
♦ Receptory błonowe makrofagów.
O CD115 - Rc dla czynnika stymulującego tworzenie kolonii monocytów (M-CSF). Występuje również na błonie pluripotencjalnej komórki prekursorowej granulocytów i monocytów oraz unipotentnego prekursora monocytów, o Znane są cztery struktury - Rc na błonie komórkowej makrofagów, łączące to, co makrofag jest potencjalnie w stanie wchłonąć poprzez mechanizm fagocytoza
CD14 - Rc dla kompleksów bakteryjnego LPS z białkami wiążącymi lipopolisacharydy surowicy (LBP), jak również kompleksów LPS z innymi produktami drobnoustrojów (np. endotoksyny) - Rc dla wiązania fragmentów błon fosfolipidowych i innych składników własnych uszkodzonych i obumierających komórki (Rc dla „śmieci”, receptory zmiataczy). Takim jest np. CD 163 - Rc dla „starych” erytrocytów. Rc wiążąca mannozę. Obecne tylko na błonie makrofagów tkankowych.
- RC dla dopełniacza - CR3 (integryna CDllb/CD18) i CR4 (integryna CDllc/CD18). Oprócz dopełniacza wiążą również szereg produktów bakteryjnych: lipopolisacharydy, lipofosfoglikan Leishmania, hemaglutyninę z włókien Bordetella, struktury powierzchniowe komórek drożdży z rodzajów Candida i Histoplasma.
CD64 - Rc dla "ogonów" (fragmentów Fc) IgG - FcyRI (Fcy-Rc pierwszego typu), dający możliwość fagocytozy kompleksów immunologicznych przez makrofagi. Uważa się je za markery błonowe monocytów/makrofagów, ponieważ ulegają ekspresji tylko na tych komórkach. Podklasy IgG pod względem siły powiązania z FcγRI są w następującej kolejności: IgG3 > IgGl > IgG4 > IgG2. o Receptory, które oddziałują z odpornością limfocytarną. Wraz ze wspomnianym już CD64 są to: - Rc dla cytokin produkowanych przez limfocyty odpornościowe. Wiązanie z ligandami Rc dla IFNγ i czynnika martwicy nowotworów (TNF) prowadzi do aktywacji makrofagów. Wręcz przeciwnie, makrofag jest inaktywowany przez Rc dla IL-10. - CD40, B7, MHC-I/II - cząsteczki błonowe do kontaktu z komplementarnymi cząsteczkami błonowymi limfocytów tj.
do bezpośrednich interakcji międzykomórkowych. Neutrofile nie mają takich receptorów. Konsekwencje fagocytozy. Po tym, jak fagocyt owinie swoją błonę wokół wchłoniętego obiektu i zamknie go w pęcherzyku błony zwanym fagosomem, zachodzą następujące zdarzenia.
♦ Rozszczepianie fagocytowanego materiału. Proces ten przebiega według tych samych mechanizmów biochemicznych we wszystkich fagocytach, o Lizosomy to specjalne organelle wewnątrzkomórkowe zawierające zestaw enzymów hydrolitycznych (kwaśne proteazy i hydrolazy) o optymalnym pH około 4,0. W komórce lizosomy łączą się z fagolizosomami w fagolizosom, w którym zachodzą reakcje trawienia pochłoniętego materiału.02-), tlen singletowy (1O2), rodnik hydroksylowy (OH-), podchlorek (OC1-), tlenek azotu ( NIE+). Te rodniki są również zaangażowane w niszczenie fagocytowanego obiektu.
♦ Wydzielanie enzymów litycznych i rodników utleniających do przestrzeni międzykomórkowej, gdzie również działają bakteriobójczo (ale także oddziałują na własne tkanki).
Neutrofile oprócz wymienionych substancji wytwarzają i wydzielają kolagenazę, katepsynę G, żelatynazę, elastazę i fosfolipazę A2.
♦ Produkcja i wydzielanie cytokin. Aktywowane przez produkty mikrobiologiczne makrofagi i neutrofile zaczynają wytwarzać cytokiny i inne biologicznie aktywne mediatory, które tworzą przedimmunologiczny stan zapalny w miejscu wprowadzenia substancji zewnętrznych, co przygotowuje możliwość rozwoju limfocytarnej odpowiedzi immunologicznej.
O Makrofagi wytwarzają interleukiny (IL-1, IL-6, IL-8, IL-12); czynnik martwicy nowotworu a (TNFa); prostaglandyny; leukotrien B4 (LTB4); czynnik aktywujący płytki krwi (PAF).
o Neutrofile wytwarzają TNFα, IL-12, chemokinę IL-8, LTB4 i PAT.
♦ Obróbka i prezentacja Ag - tworzenie kompleksów wewnątrz komórek z produktów rozszczepienia fagocytowanego materiału z własnymi cząsteczkami MHC-II i ekspresja tego kompleksu na powierzchni komórki w „celu” prezentacji Ag do rozpoznania przez T -limfocyty. Proces ten jest przeprowadzany tylko przez makrofagi.
W literaturze opisano wiele metod ilościowego określania fagocytozy. Objętość tej książki nie pozwala nam szczegółowo opisać ich wszystkich, więc ograniczymy się do opisu tylko kilku.
Materiały i ekwipunek
Do pracy musisz mieć:
Antykoagulant cytrynianowo-dekstrozowy: 8 g kwasu cytrynowego. 22 g trójpodstawionego cytrynianu sodu (dwie wody), 24,5 g glukozy rozpuszcza się w 1 litrze wody;
Roztwór dekstrozodekstranu: 4,5 g NaCl, 25 g glukozy, 30 g dekstranu (względna masa cząsteczkowa 500 000) w 1 litrze;
Roztwór chlorku amonu: 9 części 0,83% chlorku amonu, 1 część buforu Tris-HCl pH 7,2 (20,6 g/l);
Mieszanina ficoll - vizotrast: 9 g ficoll, 20 ml vizotrast, 100 ml podwójnie destylowanej H2O, gęstość 1,077;
Substrat dla β-glukuronidazy: 31,5 mg p-nitrofenylo-β-glukuronidu i 100 µm Triton X 100 rozpuszcza się w 100 ml 0,05 M buforu octanu sodu o pH 5;
Odczynniki niedoboru mieloperoksydazy: utrwalacz (10 ml 37% formaldehydu z 90 ml etanolu absolutnego), roztwór substratu (100 ml 30% EDTA, 0,3 g chlorku benzydyny, 0,038 g ZnS0 4 x 7H 2 0, 1 ml wody destylowanej, 1,0 g CH 3C00Nax3H20, 0,7 ml 3% H202); doprowadzić pH 1,0 M NaOH do 6,0.
Odczynniki handlowe:
FSB, roztwór Hanka i pożywka Eagle-MEM (Państwowy Instytut Preparatów Odpornościowych i Pożywek, Berlin-Weissensee, NRD);
Heparyna (5000 IU/mg) (Gedeon Richter, Węgry);
Surowica z zarodków bydlęcych (Flow Laboratories, USA, można użyć innej firmy);
Visotrast (VEB Fahlberg List, Magdeburg, NRD);
Infucoll (VEB Serumwerk Bernburg, NRD);
Dekstran, ficoll (Pharmacia, Szwecja);
Węgiel koloidalny Cl1/143a (Wagner, Pelikanwerke, Niemcy);
ftalan diizodecylu, paradioksan (Coleman, Matheson and Bell, USA);
Triton X 100 (Serva, Niemcy, możliwa inna firma);
Oil red O (Allied Chemical Corp., Morristown, NY, USA);
Iaranitrofenylo-β-glukuronid (Sigma, USA);
Safranina O (Fischer Scientific Lab., Chicago, USA);
Kulki styropianowe, tuby (Nunc, Dania);
Siatka F 905 (VEB Orvo Wolfen, NRD).
Pozyskiwanie fagocytów
Niezbędne informacje na temat izolacji ludzkich granulocytów można znaleźć w rozdziale „Separacja komórek układu odpornościowego”; w celu uzyskania makrofagów otrzewnowych patrz rozdziały „Hodowla makrofagów i monocytów” oraz „Izolacja makrofagów z zawiesiny spleiocytów”. Kwestia ta jest szczegółowo rozpatrywana w wielu pracach.
Ponadto należy również wspomnieć o następujących metodach:
8 ml krwi miesza się z roztworem dekstranglukozy. Następnie dodać 6% roztwór dekstranu 75 w 0,15 M NaCl (5 ml). Mieszaninę pozostawia się na 45-50 minut w temperaturze pokojowej w celu sedymentacji erytrocytów. Zaaspirować osocze. Resztkowe erytrocyty poddaje się lizie przez dodanie 0,83% chlorku amonu (35 ml do 15 ml osocza). Wirować przez 10 minut przy 80 g, zawiesić osad w 0,15 M NaCl schłodzonym do 0°C. Połączyć kilka osadów i wirować przez 10 minut przy 800 g. Komórki najlepiej przechowywać na lodzie w 0,15 M NaCl (ta pożywka jest bardziej odpowiednia niż pożywka buforowana z dwuwartościowymi kationami, które powodują sklejanie się komórek);
Jeśli przedmiotem fagocytozy są drożdże, etap traktowania chlorkiem amonu można pominąć, ponieważ krwinki czerwone nie zakłócają tego procesu. Komórki jednojądrzaste można otrzymać w następujący sposób: heparynizowaną krew miesza się z 1/3 objętości pożywki Eagle'a zawierającej 15% glukozy, nawarstwia na warstwę mieszaniny ficoll - visotrast i wiruje przez 20 minut przy 400 g. Frakcję komórek jednojądrzastych odsysa się pipetą Pasteura, przemywa dwukrotnie PBS i przygotowuje zawiesinę w pożywce Eagle'a (1x107 komórek/ml).
Przygotowanie cząstek do fagocytozy
Częściej stosuje się żywe kultury Staphylococcus aureus (SG 511 lub 502 A), Staphylococcus epididermidis SG 475, E. coli i inne enterobakterie, listeria, corynebacteria, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae. Mikroorganizmy hoduje się przez 24 godziny (w razie potrzeby 48 godzin) na stałych i płynnych pożywkach. Zebraną biomasę przemywa się trzykrotnie 0,15 M NaCl. Zbyt gęsta zawiesina jest mierzona przy 640 nm, stężenie jest określane z krzywej kalibracyjnej.
Stężenie mikroorganizmów określa się również metodami przesiewania na gęstych pożywkach; w niektórych przypadkach zliczenie mikroorganizmów można przeprowadzić w komorach zliczeniowych.
Podczas pracy z żywymi kulturami bakteryjnymi należy uważać, aby zawsze używać kultur na tym samym etapie. Dodatek 0,01% albuminy surowicy bydlęcej sprzyja przeżywalności mikroorganizmów. Przygotowana zawiesina pozostaje stabilna przez 1-2 godziny.
Hodowle zabitych mikroorganizmów są zwykle uzyskiwane przez ogrzewanie przez 30 minut w temperaturze 80°C lub przez traktowanie przepływającą parą wodną. Zabite drobnoustroje przemywa się trzykrotnie 0,15 M NaCl, ponownie zawiesza i określa stężenie zawiesiny.
Przygotowanie drożdży piekarskich: 0,5 g drożdży piekarskich zawiesza się w 0,15 M NaCl i umieszcza we wrzącej łaźni wodnej na 30 minut. Przefiltrować przez filtr z gazy bawełnianej. W przypadku żywych drożdży, świeże komórki (hodowla 4-5 dniowa) przemywa się trzykrotnie w pożywce Eagle'a z dodatkiem 1,0% glukozy. Zwykle stosuje się zawiesinę komórek 108 i 109 komórek/ml. Drożdże są używane jako cząstki testowe do wykrywania defektów w składniku C5.
Przy użyciu zawiesiny cząstek polistyrenu: Przygotować 10% wodną zawiesinę cząstek polistyrenu o średnicy 1,091 μm. Rozcieńcza się go w stosunku 1 + 1 0,2% roztworem BSA w 0,15 M NaCl, odwirowuje. Przy długości fali 253 nm zawiesina polistyrenu 1 μg/ml daje absorpcję 1,17x10-3.
Aplikacja zawiesiny lipopolisacharydu - czerwieni olejowej O w oleju mineralnym: 2 g czerwieni olejnej rozciera się w moździerzu porcelanowym w 50 ml ftalanu diizodecylu (lub oleju wazelinowego). Wirować przez 20 min przy 500 g. Dodać 10 μg frakcji supernatantu do 10 ml dioksyny, zmierzyć gęstość optyczną przy długości fali 525 nm. Współczynnik konwersji wynosi 0,92. W drugim etapie 40 mg lipopolisacharydu (E. coli 0,26 B6 itd.) rozpuszcza się w 3 ml 0,15 M NaCl. Następnie do tej mieszaniny dodaje się 1 ml roztworu oleistej czerwieni O w siarczanie diizodecylu i mieszaninę zawiesza się na 90 sekund. Zawiesinę zużywa się natychmiast i można ją zamrozić.
Aby zainicjować reakcję fagocytozy, jako cząstki testowe można użyć sformalizowanych erytrocytów.
Fagocytoza bakterii, bakteriobójcze
Eksperyment z zawiesiną żywych bakterii: zwykle stosuje się stosunek 3-10 drobnoustrojów/fagocyt. W całkowitej objętości 2 ml miesza się 1x106 fagocytów z 3x106 - 1x107 drobnoustrojów. W praktyce 1 ml zawiesiny bakteryjnej dodaje się do 1 ml zawiesiny fagocytów, do której dodano 8 j.m. heparyny. Czas interakcji to zazwyczaj 30 minut, w niektórych przypadkach jest dłuższy. Po inkubacji pobiera się 0,5 ml mieszaniny, dodaje 1,5 ml 0,1% roztworu żelatyny w roztworze Hanka, schłodzonego do 0°C i wiruje przez 3-4 minuty przy 300 g. Z osadu sporządza się rozmazy, które barwi się metodą Pappenheima. Zobacz 200 komórek (jeśli to możliwe trzy razy). Oblicz procent fagocytozy. Na podstawie liczby bakterii zawartych w komórkach oblicza się wskaźnik aktywności fagocytozy: liczbę fagocytowanych bakterii mnoży się przez procent komórek fagocytujących; intensywność fagocytozy wyraża się liczbami od 1 do 4.
Stopień 1: Fagocytowane bakteriami I-4
Stopień 2: fagocytoza 5-7 bakterii
Stopień 3: fagocytoza 8-10 bakterii
Stopień 4: Ponad 10 bakterii na fagocytozę
Podczas określania poziomu fagocytozy żywych drobnoustrojów osobno sprawdza się osad komórkowy i frakcję supernatantu. Liczbę żywych drobnoustrojów określa się przesiewając na pożywki stałe 0,1 ml badanych frakcji. Inkubowane przez 24 (48) godzin Przy obliczaniu aktywności bakteriobójczej przyjmuje się, że jedna utworzona kolonia odpowiada jednemu żywemu drobnoustrojowi.
W celu ukierunkowanego badania działania bakteriobójczego krew pacjentów i zdrowych dawców jest badana z dodatkiem roztworu antybiotyku (5000 IU penicyliny i streptomycyny / ml) i bez niego, a także przeprowadzana jest kontrola bakteryjna. Skład próbki: 0,3 ml roztworu Hanka + 0,1 ml normalnej surowicy uzyskanej z krwi pobranej od 5 dawców + 0,5 ml zawiesiny leukocytów (10 7 komórek/ml) + 0,1 ml zawiesiny drobnoustrojów (10 6 drobnoustrojów/ml). Dodaje się roztwór antybiotyków w ilości 0,02 ml na próbkę. Inkubować próbki w temperaturze 37°C i określić liczbę drobnoustrojów po 20 minutach, 1,5 godziny i 3 godzinach. W tym celu z każdej próbki należy pobrać 0,1 ml, rozcieńczyć wybrane porcje roztworem Hanka 10, 100 i 1000 razy i nałożyć na ogrzany agar. Czasami, zwłaszcza po dodaniu antybiotyków, przygotowuje się rozcieńczenia pośrednie w celu dokładnego zliczenia drobnoustrojów (na przykład 0,2 ml próbki miesza się z 5 ml roztworu Hanka, wiruje przez 5 minut przy 450 g, osad rozpuszcza się w 1,9 ml PBS, nałożony na agar). Jeśli chcesz skrócić czas trwania badania bakteriologicznego, możesz określić drobnoustroje wewnątrz komórki za pomocą fluorescencji przy użyciu barwienia żółcią akrydynową.
Fagocytoza drożdży piekarskich: przygotować zawiesinę 109 komórek/ml w 0,15 M NaCl. Zmieszać 0,1 ml zawiesiny z 0,1 ml osocza pacjenta, inkubować przez 30 minut w temperaturze 37°C, dodać 0,2 ml (10 6) PMNL, inkubować przez 30 minut. Porcje pobiera się w odstępach od 5 do 30 minut. Zlicza się 100 PMN i określa liczbę wychwyconych cząstek drożdży na komórkę. Znana jest następująca modyfikacja: 50 µl surowicy testowej dodaje się do 50 µl surowicy świnki morskiej (wcześniej rozcieńcza się ją w stosunku 1 + 1 pożywką Eagle'a z glukozą), 50-200 µl zawiesiny leukocytów ( 107 komórek/ml), objętość doprowadza się do 450 ul za pomocą pożywki Needle z glukozą i inkubuje przez 30 min w 37°C. Następnie dodać 50 μl zawiesiny drożdży (10 8 komórek/ml), wymieszać, inkubować przez 40 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 50 μl L-75 Se-metioniny (całkowita aktywność 100 kBq), wymieszać i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Komórki wytrąca się przez wirowanie przez 5 minut przy 1000 g, przemywa się je dwukrotnie PBS, radioaktywność mierzy się na liczniku gamma. Procent fagocytowanych drożdży oblicza się według wzoru:
Fagocytoza przy użyciu roztworu czerwieni olejowej w oleju mineralnym: 0,2 ml zawiesiny cząstek miesza się z 0,8 ml zawiesiny komórek podgrzanej do 37°C. Po 5 minutach inkubacji dodaje się 6 ml 0,15 M roztworu NaCl schłodzonego do 0°C zawierającego 126 μg/l N-etylomaleimidu (aby zatrzymać wychwytywanie cząstek). Wirować przez 10 minut przy 250 g. Frakcję znad osadu odrzuca się, osad ponownie zawiesza w roztworze NaCl i N-etylomaleimidu (patrz powyżej), komórki przemywa się dwukrotnie. Komórki poddaje się lizie za pomocą ultradźwięków, uwalnia się czerwień olejowa. Dodać 1 ml dioksanu. Wirować przez 15 minut przy 500 g, zmierzyć gęstość optyczną przy długości fali 525 nm względem czystego dioksanu. Stopień fagocytozy (IF) określa się jako ilość oleju mineralnego (mg) wchłanianego na minutę przez 107 komórek. Możesz użyć następującego wzoru do obliczenia:
Badanie fagocytozy w monowarstwie makrofagów:
1. Faza: 2 ml zawiesiny komórek (200 000 komórek/ml) dodaje się do sterylnych probówek polistyrenowych. Zaszczepiać przez 5 godzin w temperaturze 37°C, następnie przemyć pożywką Eagle'a. 2 ml pożywki hodowlanej z 10% inaktywowaną (30 min, 56 °C) surowicą zarodków bydlęcych dodaje się do probówek, inkubuje w temperaturze 37 °C.
2. Faza A: wprowadza się zawiesinę drobnoustrojów (3-10/makrofagów), inkubuje przez 30-60 min w temp. 37°C, probówki przepłukuje się 6-krotnie porcjami po 3 ml pożywki w celu usunięcia niesfagocytowanych drobnoustrojów. Natychmiast utrwalić mieszaniną 1 części lodowatego kwasu octowego i 3 części metanolu. Wybarwić preparat wg May - Griinwald, policzyć komórki.
Faza B: oznaczanie żywych bakterii wewnątrzkomórkowych. Kolejność czynności jest taka sama jak w fazie A przed etapem utrwalania. Po umyciu ostrożnie usuń wszelkie ślady pożywki. Komórki poddaje się lizie, do której dodaje się 2 ml 0,01% sterylnego roztworu albuminy surowicy bydlęcej (4°C), wielokrotnie wstrząsając. Większość komórek ulega lizie po 20 minutach. Uwolnione bakterie określa się przez przesiewanie na gęstej pożywce.
Fagocytoza erytrocytów: zmieszać 4x107 fagocytów z 5x107 testowymi erytrocytami w 5 ml PBS. Przenieść 2 ml mieszaniny do 5 mM buforu fosforanowego schłodzonego do 0°C i odwirować. Zmierzyć gęstość optyczną frakcji supernatantu przy długości fali 420 nm. Stopień fagocytozy określa się na podstawie spadku zawartości hemoglobiny w fazie wolnej od komórek za pomocą krzywych kalibracyjnych.
Uproszczona metoda określania luzu
Przykład oznaczania klirensu u szczurów: zwierzętom wstrzykuje się dootrzewnowo 5x107 drobnoustrojów na 100 g wagi (0,1 ml/100 g). Optymalna dawka może wynosić od 10 6 do 10 8 na 100 g wagi. W odstępie 1-2 godzin ubija się 3 osobniki z każdej grupy zwierząt doświadczalnych; całkowity czas trwania eksperymentu 16 godzin. Sterylnie pobrać 0,5 ml krwi z serca, 1 ml płynu otrzewnowego, wydzielić płuca, wątrobę, śledzionę i nerki. Cylindry wycina się z tkanki narządu za pomocą pipety Pasteura. Określ liczbę mikroorganizmów, hodując na płynnych i stałych pożywkach.
Przykład oznaczania klirensu u myszy: stosuje się węgiel koloidalny lub baranowe erytrocyty znakowane 51 [Cr]. Myszom (co najmniej 5 osobników na doświadczenie) wstrzykuje się dożylnie 0,01 ml zawiesiny węgla w dawce 16 mg na 100 g wagi. W ciągu 15 minut w odstępie 2 minut pobiera się 0,025 ml krwi z przestrzeni zaoczodołowej. Wybrane 0,025 ml krwi dodaje się do 2,0 ml 0,1% roztworu Na2C03. Po hemolizie stężenie węgla określa się kolorymetrycznie przy długości fali 675 nm, stosując krzywe kalibracyjne.
t to czas w minutach, C to stężenie węgla w próbce.
Skorygowana wartość fagocytozy:
Funkcjonalne badanie przesiewowe fagocytów
Oznaczanie degranulacji (pomiar aktywności (β-glukuropidaza): 107 leukocytów zawiesza się w 0,8 ml PBS w plastikowych probówkach, wytrząsa przez 5 minut w temperaturze 37°C. Dodać 0,2 ml uczulonego LPS, cząstki fluorochromowe (FC 80), schłodzić 30 minuty na lodzie, wirować przez 10 minut przy 250 g Sprawdzić aktywność enzymu we frakcji supernatantu 0,9 ml mieszaniny substratów inkubować przez 18 godzin z 0,1 ml badanej frakcji Dodać 2 ml 0,1 M NaOH, zmierzyć gęstość optyczną na fali 410 nm.
Zapłata:
(OD 410 x 20)/(1,84 x 18) = liczba nmoli substancji uwolnionej w ciągu 1 godziny przez 107 leukocytów, tj. stopień degranulacji jest wyrażony w nanomolach paranitrofenylo-β-glukuronidu.
Metoda oznaczania defektów w mieloperoksydazie: najlepsze wyniki uzyskuje się przez biochemiczne oznaczenie H 2 0 2, wskazujące na zmiany w metabolizmie podczas fagocytozy. Ze względów praktycznych bardzo ważne jest, aby aktywacja przecieku heksozomonofosforanowego, redukcja nitroenu tetrazoliowego i wiązanie egzogennego jodu z białkami PMNL korelowały z tworzeniem H 2 0 2 . Zwykły rozmaz krwi utrwala się przez 30 sekund mieszaniną alkoholu i formaliny. Przemyto wodą destylowaną i barwiono na obecność peroksydazy przez 30 sekund. W komórkach zawierających peroksydazę wykrywa się inkluzje zabarwione na ciemnoniebiesko.
Test redukcji błękitu nitro tetrazoliowego (TNS). THC jest redukowane przez normalny PMNL do formazanu. Zmieszać z 0,1 ml krwi 0,1 ml 0,1% roztworu THC w 0,15 M NaCl, inkubować 20 minut w 37°C, ponownie dokładnie wymieszać. Wbudowanie formazanu do komórek określa się za pomocą mikroskopii. Wynik wyraża się jako procent komórek dodatnich pod względem formazanu.
Następująca metoda jest nieco bardziej skomplikowana: 1 kroplę krwi pacjenta nakłada się na szkiełko nakrywkowe. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37°C w wilgotnej komorze, następnie ostrożnie przemyć szkło sterylnym 0,15 M NaCl. Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku zawierającym 1 kroplę pożywki THC (0,5 ml surowicy + 0,3 ml sterylnego 0,15 M NaCl + 0,6 ml THC, patrz wyżej). Inkubować przez 30 minut w wilgotnej komorze w temperaturze 37°C, zdjąć szkiełko nakrywkowe i wysuszyć na powietrzu. Utrwalić absolutnym metanolem przez 60 sekund i przemyć wodą destylowaną. Barwić przez 5 min safraniną (1 g safraniny + 100 ml wody destylowanej + 40 ml gliceryny), przemyć. Komórki dodatnie pod względem formazanu są duże, podobne do blastów i zawierają niebieskie ziarnistości. Zwykle w preparacie wykrywa się około 30% komórek formazan-dodatnich.
Powyższe metody oceny fagocytozy są podsumowaniem bardzo dużej liczby publikacji. Bardziej szczegółowe informacje na ten temat można znaleźć w odpowiednich pracach.
16. Reakcja fagocytarna.
Fagocytoza- proces aktywnego wchłaniania, trawienia i inaktywacji obcych cząstek przez wyspecjalizowane komórki fagocytujące.
Etapy fagocytozy:
Chemotaksja to celowe przemieszczanie się fagocytów wzdłuż gradientu stężeń specjalnych substancji biologicznie czynnych - chemoatraktantów.
Adhezja – przyleganie do drobnoustroju. Opsoniny (AT, fibronektyna, surfaktant) otaczają mikroorganizmy i znacznie ograniczają ich ruchliwość.
Endocytoza (wchłanianie). W efekcie powstaje fagosom, w którym zamknięty jest obiekt fagocytozy. Lizosomy pędzą do fagosomu i ustawiają się wzdłuż jego obwodu.
Trawienie. Fuzja fagosomu z lizosomem w celu utworzenia fagolizosomu. Ponadto fagocytowane mikroorganizmy są atakowane przez czynniki zależne od tlenu (nadtlenek, nadtlenek tlenu, cytochrom b; powstają produkty o działaniu toksycznym, niszczącym mikroorganizmy i otaczające je struktury) i niezależne od tlenu (granulki z laktoferyną, lizozymem itp.; produkty te powodują uszkodzenia ściany komórkowej i zakłócają niektóre procesy metaboliczne).
wynikiem fagocytozy.
Zakończone - śmierć i zniszczenie mikroorganizmów
Niekompletne – bakterie wyposażone w otoczki lub gęste hydrofobowe ściany komórkowe są odporne na działanie enzymów lizosomalnych; blokowanie fuzji fagosomów i lizosomów.
Rodzaje komórek fagocytarnych:
Makrofagi i komórki dendrytyczne - profesjonalne fagocyty i komórki prezentujące antygen
Mikrofagi - leukocyty polimorfojądrowe (neutrofile) - tylko umiarkowana fagocytoza
Monocyty krwi migrują do tkanek pod wpływem cytotoksyn i stają się rezydentami.
Makrofagi Wątroba - komórki Kupffera
Płuca - makrofagi pęcherzykowe
OUN - komórki mikrogleju
Szpik kostny - osteoklasty
Nerka - komórki mezangialne
Fagocytoza mikroorganizmów i ich przetwarzanie (trawienie); prezentować antygen limfocytom T.
NK - naturalni zabójcy - nie różnicują AH, są niezależne od przeciwciał, działają tylko przeciwko komórkom i reagują tylko na czynniki komórkowe.
Wskaźniki fagocytozy:
Indeks fagocytarny (aktywność fagocytarna) - odsetek neutrofili zawierających cząsteczki mikroorganizmów
Liczba fagocytarna (indeks fagocytarny) - średnia liczba mikroorganizmów wchłoniętych przez jeden fagocyt.
17. Humoralna odpowiedź immunologiczna.
W humoralnej odpowiedzi immunologicznej biorą udział trzy typy komórek: makrofagi (komórki prezentujące AG), komórki pomocnicze T i limfocyty B
Komórki prezentujące AG fagocytują mikroorganizm i przetwarzają go, dzieląc na fragmenty (przetwarzanie AG). Fragmenty AG są eksponowane na powierzchnię komórki prezentującej AG wraz z cząsteczką MHC. Kompleks AG-cząsteczka MHC2 jest prezentowany pomocnikowi T. Rozpoznanie kompleksu przez T-pomocnika stymuluje wydzielanie IL-1 przez makrofagi.
T-pomocnik pod wpływem IL-1 syntetyzuje IL-2 i receptory dla IL-2, ta ostatnia poprzez mechanizm autokrynny stymuluje proliferację T-pomocników, a także CTL. Tak więc, po interakcji z komórką prezentującą AG, pomocnik T nabywa zdolność reagowania na działanie IL-2 poprzez szybką reprodukcję. Biologicznym znaczeniem tego zjawiska jest nagromadzenie pomocników T, które zapewniają tworzenie się w narządach limfatycznych niezbędnej puli komórek plazmatycznych, które wytwarzają przeciwciała przeciwko temu AG.
Limfocyt B. Jego aktywacja polega na bezpośrednim oddziaływaniu AG z cząsteczką Ig na powierzchni limfocytu B. W tym przypadku limfocyt B sam przetwarza AG i prezentuje swój fragment w połączeniu z cząsteczką MHC2 na swojej powierzchni. Kompleks ten rozpoznaje pomocnika T wybranego przy użyciu tego samego antygenu. Rozpoznanie przez receptor T-pomocniczy kompleksu AG-MHC2 na powierzchni limfocytu B prowadzi do wydzielania IL-2, IL-4, IL-5 i IFN-gamma przez T-pomocnika pod wpływem z których komórki B namnażają się, tworząc klon komórek plazmatycznych. Komórki plazmatyczne syntetyzują przeciwciała. Wydzielanie AT jest stymulowane przez IL-6 wydzielaną przez aktywowany T-pomocnik. Niektóre dojrzałe limfocyty B po zróżnicowaniu niezależnym od antygenu krążą w organizmie w postaci komórek pamięci.
5 klas: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM; Cząsteczki IgD, IgE, IgG są reprezentowane przez monomery, IgM przez pentamery, cząsteczka IgA w surowicy krwi jest monomerem, aw wydalanych płynach (ślinie, płynie łzowym) jest dimerem
IgG: przenika przez łożysko do organizmu płodu, aby zapewnić powstanie odporności biernej u płodu, po urodzeniu dziecka jego zawartość w surowicy krwi spada i osiąga minimalne stężenie o 3-4 miesiące, po czym zaczyna rosnąć ze względu na nagromadzenie własnych IgG, osiągając normę o 7 lat. Wykrycie wysokiego miana IgG na Ag określonego patogenu świadczy o tym, że organizm znajduje się w fazie rekonwalescencji lub niedawno przeniesiono określoną chorobę.
IgM: jego zawartość jest znacznie zwiększona u noworodków, które przeszły infekcję wewnątrzmaciczną. Obecność IgM w Ag określonego patogenu wskazuje na ostry proces zakaźny.
IgA: krąży w surowicy krwi, a także jest wydzielany na powierzchni nabłonka., obecny w ślinie, płynie łzowym, mleku. Cząsteczki IgA biorą udział w reakcjach neutralizacji i aglutynacji patogenów. Immunoglobuliny wydzielnicze klasy IgA (SIgA) różnią się od immunoglobulin surowiczych obecnością składnika wydzielniczego związanego z 2 lub 3 monomerami IgA.
IgD: znajduje się na powierzchni rozwijających się limfocytów B, jego zawartość osiąga maksimum do 10 lat, nieznaczny wzrost miana obserwuje się w czasie ciąży, astmy oskrzelowej, tocznia rumieniowatego układowego oraz u osób z niedoborami odporności
IgE: syntetyzowany przez komórki plazmatyczne w węzłach chłonnych oskrzeli i otrzewnej, w błonie śluzowej przewodu pokarmowego. IgE są również nazywane reaginami, ponieważ biorą udział w reakcjach anafilaktycznych, mając wyraźną cytofilowość.
Od 10. tygodnia rozwoju wewnątrzmacicznego rozpoczyna się synteza IgM, od 12. - IgG, od 30. - IgA, ale ich stężenie jest niskie.
Ochronna funkcja przeciwciał podczas infekcji:
Ab poprzez centra wiążące Ag oddziałują z różnymi Ag. W ten sposób Ab zapobiegają infekcji lub eliminują patogen lub blokują rozwój reakcji patologicznych, jednocześnie aktywując wszystkie specyficzne systemy obronne.
Opsonizacja (fagocytoza immunologiczna)– Abs (poprzez fragmenty Fab) wiążą się ze ścianą komórkową organizmu; Fragment Fc Ab oddziałuje z odpowiednim receptorem fagocytu, który pośredniczy w późniejszej efektywnej absorpcji utworzonego kompleksu przez fagocyt.
Działanie antytoksyczne Abs może wiązać, a tym samym dezaktywować toksyny bakteryjne.
Aktywacja komplementu Ab (IgM, IgG) po związaniu z Ag (mikroorganizm, komórka nowotworowa) aktywuje układ dopełniacza, co prowadzi do zniszczenia tej komórki poprzez perforację jej ściany komórkowej, nasilenie chemotaksji, chemokinezy i fagocytozy immunologicznej
Neutralizacja– oddziałując z receptorami komórkowymi wiążącymi bakterie lub wirusy, Ab może zapobiegać adhezji i przenikaniu mikroorganizmów do komórek organizmu gospodarza.
Krążące kompleksy immunologiczne Abs wiążą rozpuszczalny Ag i tworzą krążące kompleksy, za pomocą których Ag jest wydalany z organizmu, głównie z moczem i żółcią.
Cytotoksyczność zależna od przeciwciał– opsonizując Ag, Ab stymuluje ich niszczenie przez komórki cytotoksyczne. Aparatem, który zapewnia rozpoznawanie celu, są receptory dla fragmentów Fc Ab. Makrofagi i granulocyty są zdolne do niszczenia opsonizowanych celów.
Właściwości przeciwciał:
Specyficzność- zdolność przeciwciał do reagowania tylko z określonym antygenem, ze względu na obecność determinant antygenowych na antygenie i receptorów antygenowych (antydeminantów) na przeciwciele.
Wartościowość- liczba antydeterminantów na przeciwciele (zwykle dwuwartościowych);
powinowactwo, powinowactwo jest siłą związku między determinantą a antydeterminantą;
Chciwość jest siłą wiązania przeciwciało-antygen. Ze względu na wartościowość jedno przeciwciało wiąże się z kilkoma antygenami;
Niejednorodność- niejednorodność, spowodowana obecnością trzech typów determinantów antygenowych:
izotypowy- scharakteryzować przynależność immunoglobuliny do określonej klasy (IgA, IgG, IgM itp.);
Allotypowe- (specyficzność wewnątrzgatunkowa) odpowiadają wariantom allelicznym immunoglobuliny (zwierzęta heterozygotyczne mają różne immunoglobuliny);
Idiotypowe- odzwierciedlają indywidualne cechy immunoglobulin (mogą powodować reakcje autoimmunologiczne).
Cechy wieku:
W okresie poporodowym obserwuje się bardzo znaczną dynamikę zawartości immunoglobulin różnych klas we krwi dzieci. Wynika to z faktu, że w pierwszych miesiącach życia trwa dezintegracja i usuwanie tych immunoglobulin klasy B, które zostały przeniesione przez łożysko od matki.
W ciągu pierwszych 4-6 miesięcy matczyne immunoglobuliny ulegają całkowitemu zniszczeniu i rozpoczyna się synteza własnych immunoglobulin.