Mechanizmy katalizy enzymatycznej zdeterminowane są rolą grup funkcyjnych centrum aktywnego enzymu w reakcji chemicznej przemiany substratu w produkt. Istnieją 2 główne mechanizmy katalizy enzymatycznej: kataliza kwasowo-zasadowa i kataliza kowalencyjna.

1. Kataliza kwasowo-zasadowa

Koncepcja katalizy kwasowo-zasadowej wyjaśnia aktywność enzymatyczną poprzez udział grup kwasowych (donorów protonów) i/lub grup zasadowych (akceptory protonów) w reakcji chemicznej. Kataliza kwasowo-zasadowa jest zjawiskiem powszechnym. Reszty aminokwasowe tworzące centrum aktywne mają grupy funkcyjne, które wykazują właściwości zarówno kwasów, jak i zasad.

Aminokwasy biorące udział w katalizie kwasowo-zasadowej obejmują przede wszystkim Cys, Tyr, Ser, Lys, Glu, Asp i His. Rodniki tych aminokwasów w formie protonowanej są kwasami (donorami protonów), w formie deprotonowanej są zasadami (akceptorami protonów). Ta właściwość grup funkcyjnych miejsca aktywnego sprawia, że ​​enzymy są wyjątkowymi katalizatorami biologicznymi, w przeciwieństwie do katalizatorów niebiologicznych, które mogą wykazywać właściwości kwasowe lub zasadowe. Kataliza kowalencyjna opiera się na ataku grup nukleofilowych (naładowanych ujemnie) lub elektrofilowych (naładowanych dodatnio) centrum aktywnego enzymu przez cząsteczki substratu z utworzeniem wiązania kowalencyjnego pomiędzy substratem a koenzymem lub grupą funkcyjną amino reszta kwasowa (zwykle jedna) centrum aktywnego enzymu.

Działanie proteaz serynowych, takich jak trypsyna, chymotrypsyna i trombina, jest przykładem mechanizmu katalizy kowalencyjnej, gdy tworzy się wiązanie kowalencyjne pomiędzy substratem a resztą aminokwasową seryny miejsca aktywnego enzymu.

25. Komplementarność odnosi się do zgodności przestrzennej i chemicznej oddziałujących cząsteczek. Ligand musi mieć zdolność do wnikania i przestrzennego pokrywania się z konformacją miejsca aktywnego. Zbieżność ta może nie jest całkowita, ale ze względu na labilność konformacyjną białka, centrum aktywne jest zdolne do niewielkich zmian i jest „dopasowane” do liganda. Ponadto pomiędzy grupami funkcyjnymi liganda i rodnikami aminokwasowymi tworzącymi centrum aktywne muszą powstać wiązania utrzymujące ligand w centrum aktywnym. Wiązania pomiędzy ligandem a centrum aktywnym białka mogą być niekowalencyjne (jonowe, wodorowe, hydrofobowe) lub kowalencyjne.

Wysoka specyficzność enzymów pozwoliła na postawienie w 1890 roku hipotezy, zgodnie z którą centrum aktywne enzymu jest komplementarne w stosunku do substratu, tj. odpowiada temu jak „klucz do zamka”. Po oddziaływaniu substratu („klucza”) z centrum aktywnym („zamkiem”) następuje przemiana chemiczna substratu w produkt. Centrum aktywne uznano za strukturę stabilną, ściśle określoną.

Substrat oddziałując z centrum aktywnym enzymu powoduje zmianę jego konformacji, prowadząc do powstania kompleksu enzym-substrat, sprzyjającego chemicznym modyfikacjom substratu. Jednocześnie cząsteczka substratu zmienia także swoją konformację, co zapewnia wyższą efektywność reakcji enzymatycznej. Ta „hipoteza indukowanej korespondencji” została następnie potwierdzona eksperymentalnie.

26. Nazywa się enzymy, które katalizują tę samą reakcję chemiczną, ale różnią się pierwotną strukturą białka izoenzymy lub izoenzymy. Katalizują ten sam typ reakcji o zasadniczo identycznym mechanizmie, ale różnią się między sobą parametrami kinetycznymi, warunkami aktywacji i cechami połączenia między apoenzymem i koenzymem. Charakter pojawiania się izoenzymów jest różnorodny, jednak najczęściej wynika to z różnic w budowie genów kodujących te izoenzymy. W związku z tym izoenzymy różnią się pierwotną strukturą cząsteczki białka, a zatem właściwościami fizykochemicznymi. Metody oznaczania izoenzymów opierają się na różnicach we właściwościach fizykochemicznych. W swojej strukturze izoenzymy są głównie białkami oligomerycznymi. Enzym dehydrogenaza mleczanowa(LDH) katalizuje odwracalną reakcję utleniania mleczanu (kwasu mlekowego) do pirogronianu (kwasu pirogronowego).

Składa się z 4 podjednostek 2 typów: M i H. Połączenie tych podjednostek leży u podstaw powstania 5 izoform dehydrogenazy mleczanowej. LDH 1 i LDH 2 są najbardziej aktywne w mięśniu sercowym i nerkach, LDH4 i LDH5 w mięśniach szkieletowych i wątrobie. Inne tkanki zawierają różne formy tego enzymu. Izoformy LDH różnią się ruchliwością elektroforetyczną, co pozwala na określenie tożsamości tkankowej izoform LDH.

Kinaza kreatynowa (CK) katalizuje powstawanie fosforanu kreatyny:

Cząsteczka KK jest dimerem składającym się z dwóch rodzajów podjednostek: M i B. Z tych podjednostek powstają 3 izoenzymy - BB, MB, MM. Izoenzym BB występuje głównie w mózgu, MM w mięśniach szkieletowych, a MB w mięśniu sercowym. Izoformy KK mają różną ruchliwość elektroforetyczną. Aktywność CK zwykle nie powinna przekraczać 90 IU/l. Oznaczenie aktywności CK w osoczu krwi ma wartość diagnostyczną w przypadku zawału mięśnia sercowego (występuje wzrost poziomu izoformy MB). Ilość izoformy MM może wzrosnąć podczas urazu i uszkodzenia mięśni szkieletowych. Izoforma BB nie może przenikać przez barierę krew-mózg, dlatego jest praktycznie niewykrywalna we krwi nawet podczas udarów i nie ma wartości diagnostycznej.

27. KATALIZA ENZYMATYWNA (biokataliza), przyspieszanie procesów biochemicznych. r-cje z udziałem makrocząsteczek białkowych tzw enzymy(enzymy). F.k - odmiana kataliza.

Równanie Michaelisa-Mentena: - podstawowe równanie kinetyki enzymów, opisuje zależność szybkości reakcji katalizowanej przez enzym od stężenia substratu i enzymu. Najprostszy schemat kinetyczny, dla którego obowiązuje równanie Michaelisa:

Równanie wygląda następująco:

,

Gdzie: - maksymalna szybkość reakcji równa ; - stała Michaelisa, równa stężeniu substratu, przy którym szybkość reakcji jest o połowę mniejsza; - stężenie substratu.

Stała Michaelisa: Zależność między stałymi szybkości

jest również stałą ( Km).

28. „hamowanie aktywności enzymatycznej" - spadek aktywności katalitycznej w obecności określonych substancji - inhibitorów. Do inhibitorów należy zaliczyć substancje powodujące spadek aktywności enzymu. Odwracalne inhibitory wiążą się z enzymem słabymi wiązaniami niekowalencyjnymi i w pewnych warunkach łatwo oddzielają się od enzymu. Istnieją odwracalne inhibitory konkurencyjne i niekonkurencyjne. W stronę hamowania konkurencyjnego obejmują odwracalne zmniejszenie szybkości reakcji enzymatycznej spowodowane przez inhibitor, który wiąże się z miejscem aktywnym enzymu i zapobiega tworzeniu się kompleksu enzym-substrat. Ten typ hamowania obserwuje się, gdy inhibitor jest strukturalnym analogiem substratu, co powoduje rywalizację pomiędzy cząsteczkami substratu i inhibitora o miejsce w centrum aktywnym enzymu. Niekonkurencyjny zwane hamowaniem reakcji enzymatycznej, podczas której inhibitor oddziałuje z enzymem w miejscu innym niż miejsce aktywne. Inhibitory niekonkurencyjne nie są strukturalnymi analogami substratu. Nieodwracalne zahamowanie obserwowane w przypadku tworzenia się kowalencyjnych trwałych wiązań pomiędzy cząsteczką inhibitora a enzymem. Najczęściej modyfikuje się centrum aktywne enzymu, przez co enzym nie może pełnić funkcji katalitycznej. Do nieodwracalnych inhibitorów zaliczają się jony metali ciężkich, takich jak rtęć (Hg 2+), srebro (Ag +) i arsen (As 3+). Substancje blokujące pewne grupy aktywnego centrum enzymów - konkretny I. Fluorofosforan diizopropylu (DFP). Octan jodu i p-chlorortęćbenzoesan łatwo reagują z grupami SH reszt cysteiny w białkach. Inhibitory te są klasyfikowane jako niespecyficzny. Na niekonkurencyjny Podczas hamowania inhibitor wiąże się tylko z kompleksem enzym-substrat, a nie z wolnym enzymem.

Rozmiar K I= [E]. [I]/, która jest stałą dysocjacji kompleksu enzym-inhibitor, nazywana jest stałą hamowania.

Czwartorzędowe zasady amoniowe hamują acetylocholinoesterazę, która katalizuje hydrolizę acetylocholiny do choliny i kwasu octowego.

Substancje tzw antymetabolity. Związki te, będąc strukturalnymi analogami naturalnych substratów, z jednej strony powodują konkurencyjne hamowanie enzymów, z drugiej zaś mogą być wykorzystywane przez te same enzymy jako pseudosubstraty. Leki sulfonamidowe (analogi kwasu paraaminobenzoesowego) stosowane w leczeniu chorób zakaźnych.

Przykładem leku, którego działanie opiera się na nieodwracalnym hamowaniu enzymów, jest lek aspiryna.

Hamowanie enzymu cyklooksygenazy, który katalizuje tworzenie prostaglandyn z kwasu arachidonowego.

29. Regulacja szybkości reakcji enzymatycznych odbywa się na 3 niezależnych poziomach:

1. zmiana liczby cząsteczek enzymu;

1. dostępność cząsteczek substratu i koenzymu;
2. zmiana aktywności katalitycznej cząsteczki enzymu.

1. Liczbę cząsteczek enzymów w komórce określa stosunek 2 procesów - syntezy i rozkładu cząsteczki białka enzymatycznego.

2. Im wyższe stężenie substratu wyjściowego, tym większa prędkość szlaku metabolicznego. Kolejnym parametrem ograniczającym przebieg szlaku metabolicznego jest obecność regenerowane koenzymy. Najważniejszą rolą w zmianie szybkości szlaków metabolicznych jest regulacja aktywności katalitycznej jednego lub większej liczby kluczowych enzymów danego szlaku metabolicznego. Jest to wysoce skuteczny i szybki sposób na regulację metabolizmu. Główne sposoby regulacji aktywności enzymów to: regulacja allosteryczna; regulacja poprzez interakcje białko-białko; regulacja przez fosforylację/defosforylację cząsteczki enzymu; regulacja przez częściową (ograniczoną) proteolizę.

Zwiększenie temperatury do pewnych granic wpływa na szybkość reakcji enzymatycznej

reakcja, podobna do wpływu temperatury na każdą reakcję chemiczną. Wraz ze wzrostem temperatury ruch cząsteczek przyspiesza, co prowadzi do wzrostu prawdopodobieństwa interakcji między reagentami. Ponadto temperatura może zwiększyć energię reagujących cząsteczek, co również przyspiesza reakcję. Jednakże szybkość reakcji chemicznej katalizowanej przez enzymy ma swoje optymalne temperatury, których przekroczeniu towarzyszy spadek aktywności enzymatycznej

Dla większości ludzkich enzymów optymalna temperatura wynosi 37-38°C.

Aktywność enzymów zależy od pH roztworu, w którym zachodzi reakcja enzymatyczna. Dla każdego enzymu istnieje wartość pH, przy której obserwuje się jego maksymalną aktywność. Odchylenie od optymalnej wartości pH prowadzi do spadku aktywności enzymatycznej.

Wpływ pH na aktywność enzymu związany jest z jonizacją grup funkcyjnych reszt aminokwasowych danego białka, które zapewniają optymalną konformację centrum aktywnego enzymu. Kiedy pH zmienia się od wartości optymalnych, zmienia się jonizacja grup funkcyjnych cząsteczki białka. Większość enzymów w organizmie człowieka ma optymalne pH zbliżone do obojętnego, pokrywające się z fizjologiczną wartością pH

30. Allosteryczny enzymy to enzymy, których aktywność jest regulowana nie tylko przez liczbę cząsteczek substratu, ale także przez inne substancje, tzw efektory. Efektorami biorącymi udział w regulacji allosterycznej są metabolity komórkowe, często pochodzące z tego samego szlaku, który regulują.

Enzymy allosteryczne odgrywają ważną rolę w metabolizmie, ponieważ niezwykle szybko reagują na najmniejsze zmiany w stanie wewnętrznym komórki. Mają ogromne znaczenie w sytuacjach: podczas procesów anabolicznych, podczas procesów katabolicznych, dla koordynacji szlaków anabolicznych i katabolicznych. ATP i ADP są efektorami allosterycznymi, które działają jak antagoniści; do koordynowania równoległych i wzajemnie powiązanych szlaków metabolicznych (na przykład synteza nukleotydów purynowych i pirymidynowych stosowanych do syntezy kwasów nukleinowych).

Efektor powodujący zmniejszenie (hamowanie) aktywności enzymu nazywa się negatywny efektor lub inhibitor. Efektor powodujący wzrost (aktywację) aktywności enzymu nazywa się pozytywny efektor lub aktywator. Różne metabolity często służą jako efektory allosteryczne.

Cechy budowy i funkcjonowania enzymów allosterycznych: zazwyczaj są to białka oligomeryczne składające się z kilku protomerów lub posiadające strukturę domenową; posiadają centrum allosteryczne, przestrzennie odległe od centrum aktywnego katalitycznego; efektory przyłączają się do enzymu niekowalencyjnie w centrach allosterycznych (regulacyjnych); centra allosteryczne, podobnie jak centra katalityczne , może wykazywać różną specyficzność w stosunku do ligandów: może być absolutna i grupowa. protomer, na którym znajduje się centrum allosteryczne, jest protomerem regulatorowym.Enzymy allosteryczne mają właściwość kooperatywności; Enzymy allosteryczne katalizują kluczowe reakcje na tym szlaku metabolicznym.

produkt końcowy może działać jako allosteryczny inhibitor enzymu, który najczęściej katalizuje początkowy etap tego szlaku metabolicznego:

W ośrodkowych szlakach metabolicznych prekursory mogą być aktywatorami kluczowych enzymów na szlaku metabolicznym.

Sekwencję zdarzeń w katalizie enzymatycznej można opisać za pomocą poniższego diagramu. Najpierw tworzy się kompleks substrat-enzym. W tym przypadku następuje zmiana konformacji cząsteczki enzymu i cząsteczki substratu, ta ostatnia jest utrwalona w centrum aktywnym w napiętej konfiguracji. W ten sposób powstaje aktywowany kompleks, lub stan przejściowy, jest wysokoenergetyczną strukturą pośrednią, która jest mniej stabilna energetycznie niż macierzyste związki i produkty. Najważniejszy wkład w ogólny efekt katalityczny ma proces stabilizacji stanu przejściowego - oddziaływania pomiędzy resztami aminokwasowymi białka a substratem, który jest w napiętej konfiguracji. Różnica między wartościami energii swobodnej początkowych reagentów a stanem przejściowym odpowiada energii swobodnej aktywacji (ΔG #). Szybkość reakcji zależy od wartości (ΔG #): im mniejsza, tym większa szybkość reakcji i odwrotnie. Zasadniczo DG stanowi „barierę energetyczną”, którą należy pokonać, aby reakcja mogła nastąpić. Stabilizacja stanu przejściowego obniża tę „barierę” lub energię aktywacji. W kolejnym etapie zachodzi sama reakcja chemiczna, po której powstające produkty zostają uwolnione z kompleksu enzym-produkt.

Istnieje kilka przyczyn wysokiej aktywności katalitycznej enzymów, które zmniejszają barierę energetyczną reakcji.

1. Enzym może wiązać cząsteczki reagujących substratów w taki sposób, że ich grupy reaktywne będą zlokalizowane blisko siebie i od grup katalitycznych enzymu (efekt zbliżenie).

2. Wraz z utworzeniem kompleksu substrat-enzym osiąga się utrwalenie substratu i jego optymalną orientację do rozrywania i tworzenia wiązań chemicznych (efekt orientacja).

3. Związanie podłoża prowadzi do usunięcia jego powłoki hydratacyjnej (występuje na substancjach rozpuszczonych w wodzie).

4. Efekt indukowanej zgodności pomiędzy substratem a enzymem.

5. Stabilizacja stanu przejściowego.

6. Pewne grupy w cząsteczce enzymu mogą zapewnić kataliza kwasowo-zasadowa(przeniesienie protonów w podłożu) i kataliza nukleofilowa(powstanie wiązań kowalencyjnych z podłożem, co prowadzi do powstania struktur bardziej reaktywnych od podłoża).

Jednym z przykładów katalizy kwasowo-zasadowej jest hydroliza wiązań glikozydowych w cząsteczce mureiny przez lizozym. Lizozym to enzym występujący w komórkach różnych zwierząt i roślin: w płynie łzowym, ślinie, białku kurczaka, mleku. Lizozym z jaj kurzych ma masę cząsteczkową 14 600 Da, składa się z jednego łańcucha polipeptydowego (129 reszt aminokwasowych) i posiada 4 mostki dwusiarczkowe, co zapewnia wysoką stabilność enzymu. Rentgenowska analiza strukturalna cząsteczki lizozymu wykazała, że ​​składa się ona z dwóch domen tworzących „przerwę”, w której znajduje się centrum aktywne. Wzdłuż tej „przerwy” wiąże się heksosacharyd, a enzym ma swoje własne miejsce wiązania każdego z sześciu pierścieni cukrowych mureiny (A, B, C, D, E i F) (ryc. 6.4).

Cząsteczka mureiny jest utrzymywana w miejscu aktywnym lizozymu, głównie dzięki wiązaniom wodorowym i oddziaływaniom hydrofobowym. W pobliżu miejsca hydrolizy wiązania glikozydowego znajdują się 2 reszty aminokwasowe centrum aktywnego: kwas glutaminowy, zajmujący 35. pozycję w polipeptydzie i kwas asparaginowy, 52. pozycję w polipeptydzie (ryc. 6.5) .

Łańcuchy boczne tych reszt znajdują się na przeciwległych powierzchniach „szczeliny” w bliskiej odległości od atakowanego wiązania glikozydowego – w odległości około 0,3 nm. Reszta glutaminianu znajduje się w środowisku niepolarnym i nie jest zjonizowana, natomiast reszta asparaginianu znajduje się w środowisku polarnym, jej grupa karboksylowa jest deprotonowana i uczestniczy jako akceptor wodoru w złożonej sieci wiązań wodorowych.

Proces hydrolizy przeprowadza się w następujący sposób. Protonowana grupa karboksylowa reszty Glu-35 oddaje swój proton glikozydowemu atomowi tlenu, co prowadzi do zerwania wiązania pomiędzy tym atomem tlenu a atomem C 1 pierścienia cukrowego zlokalizowanego w miejscu D (etap ogólnej katalizy kwasowej ). W rezultacie powstaje produkt zawierający pierścienie cukrowe zlokalizowane w obszarach E i F, które można uwolnić z kompleksu z enzymem. Konformacja pierścienia cukrowego znajdującego się w obszarze D jest zniekształcona, przyjmując konformację półkrzesła, w którym pięć z sześciu atomów tworzących pierścień cukrowy leży praktycznie w tej samej płaszczyźnie. Struktura ta odpowiada konformacji stanu przejściowego. W tym przypadku atom C1 okazuje się być naładowany dodatnio, a produkt pośredni nazywany jest jonem węglowym (karbokationem). Energia swobodna stanu przejściowego maleje w wyniku stabilizacji jonu węglowego przez deprotonowaną grupę karboksylową reszty Asp-52 (ryc. 6.5).

W kolejnym etapie do reakcji wchodzi cząsteczka wody, która zastępuje resztę disacharydową dyfundującą z obszaru centrum aktywnego. Proton cząsteczki wody trafia do Glu-35, a jon hydroksylowy (OH -) do atomu C 1 jonu karboniowego (etap ogólnej katalizy zasadowej). W rezultacie drugi fragment rozszczepionego polisacharydu staje się produktem reakcji (konformacją krzesła) i opuszcza aktywny obszar centralny, a enzym powraca do stanu pierwotnego i jest gotowy do przeprowadzenia kolejnej reakcji rozszczepienia disacharydu (ryc. 6.5) .

Mechanizm działania enzymów można rozpatrywać z dwóch punktów widzenia: z punktu widzenia zmian energii reakcji chemicznych oraz z punktu widzenia zdarzeń w ośrodku aktywnym.

A. Zmiany energii podczas reakcji chemicznych

Wszelkie reakcje chemiczne przebiegają zgodnie z dwoma podstawowymi prawami termodynamiki: prawem zachowania energii i prawem entropii. Zgodnie z tymi prawami całkowita energia układu chemicznego i jego otoczenia pozostaje stała, podczas gdy układ chemiczny ma tendencję do zmniejszania porządku (zwiększania entropii). Aby zrozumieć energię reakcji chemicznej, nie wystarczy znać bilans energetyczny reagentów wchodzących i wychodzących z reakcji, należy wziąć pod uwagę zmiany energii podczas przebiegu danej reakcji chemicznej oraz rolę enzymów w jej przemianie. dynamikę tego procesu. Rozważ reakcję rozkładu kwasu węglowego:

H2CO3 → H20 + CO2.

Kwas węglowy jest słaby; reakcja jego rozkładu będzie przebiegać w normalnych warunkach, jeżeli cząsteczki kwasu węglowego posiadają energię przekraczającą pewien poziom, zwany energią aktywacji Ea (Rys. 2-10).

Energia aktywacji to dodatkowa ilość energii kinetycznej potrzebnej do reakcji cząsteczek substancji.

Po osiągnięciu tej bariery energetycznej w cząsteczce zachodzą zmiany, powodując redystrybucję wiązań chemicznych i tworzenie nowych związków. Mówi się, że cząsteczki posiadające Ea znajdują się w stanie przejściowym. Różnica energii między początkowym reagentem H2CO3 a końcowymi związkami H2O i CO2 nazywana jest zmianą energii swobodnej reakcji DG. Cząsteczki H2O i CO2 są substancjami bardziej stabilnymi niż H2CO3, tj. mają mniej energii i praktycznie nie reagują w normalnych warunkach. Energia uwolniona w wyniku tej reakcji jest rozpraszana w postaci ciepła do otoczenia.

Im więcej cząsteczek ma energię przekraczającą poziom Ea, tym większa jest szybkość reakcji chemicznej. Możesz zwiększyć szybkość reakcji chemicznej poprzez ogrzewanie. Zwiększa to energię reagujących cząsteczek. Jednak wysokie temperatury są destrukcyjne dla organizmów żywych, dlatego w komórkach wykorzystuje się enzymy, aby przyspieszyć reakcje chemiczne. Enzymy zapewniają wysoką szybkość reakcji w optymalnych warunkach panujących w komórce poprzez obniżenie poziomu Ea. W ten sposób enzymy zmniejszają wysokość bariery energetycznej, w efekcie zwiększa się liczba reaktywnych cząsteczek, a co za tym idzie, wzrasta szybkość reakcji.

W mechanizmie katalizy enzymatycznej decydujące znaczenie ma powstawanie niestabilnych związków pośrednich – kompleksu enzym-substrat ES, który ulega przemianie w niestabilny kompleks przejściowy EP, który niemal natychmiast rozpada się na wolny enzym i produkt reakcji.

Zatem katalizatory biologiczne (enzymy) nie zmieniają energii swobodnej.

Enzym pełniąc funkcję katalizatora reakcji chemicznej, przestrzega ogólnych praw katalizy i posiada wszystkie właściwości charakterystyczne dla katalizatorów niebiologicznych, ale ma także właściwości charakterystyczne związane z cechami strukturalnymi enzymów.

Podobieństwo między enzymami i katalizatorami niebiologicznymi polega na tym, że:

Enzymy katalizują możliwe energetycznie reakcje;

· energia układu chemicznego pozostaje stała;

·podczas katalizy kierunek reakcji nie ulega zmianie;

Enzymy nie są zużywane podczas reakcji.

Różnice między enzymami i katalizatorami niebiologicznymi polegają na tym, że:

· szybkość reakcji enzymatycznych jest większa niż reakcji katalizowanych przez katalizatory niebiałkowe;

Enzymy są wysoce specyficzne;

· reakcja enzymatyczna zachodzi w komórce, tj. w temperaturze 37°C, stałym ciśnieniu atmosferycznym i fizjologicznym pH;

Szybkość reakcji enzymatycznej można regulować.

Mechanizmy działania enzymów

Ogólnie rzecz biorąc, wszystko sprowadza się do uzupełniającego oddziaływania enzymu i substratu. W tym przypadku grupy funkcyjne substratu oddziałują z odpowiadającymi im grupami funkcyjnymi enzymu. Obecność specyficzności substratowej wyjaśniają dwie hipotezy:

1. Teoria Fishera(model „sztywnej matrycy”, „kluczyka”) – centrum aktywne enzymu ściśle odpowiada konfiguracji substratu i nie zmienia się po jego przyłączeniu. Model ten dobrze wyjaśnia specyficzność absolutną, ale nie specyficzność grupową.

2. W 1958 roku Daniel Koshland zaproponował modyfikację modelu „zamka na klucz”. Enzymy na ogół nie są sztywnymi, ale elastycznymi cząsteczkami. Miejsce aktywne enzymu może zmienić konformację po związaniu substratu. Boczne grupy aminokwasów w miejscu aktywnym przyjmują pozycję, która umożliwia enzymowi spełnianie jego funkcji katalitycznej. W niektórych przypadkach cząsteczka substratu również zmienia konformację po związaniu w miejscu aktywnym. W przeciwieństwie do modelu klucza, model indukowanego dopasowania wyjaśnia nie tylko specyficzność enzymów, ale także stabilizację stanu przejściowego. Model ten nazywany jest „rękawiczką”.

Kinetyka reakcji enzymatycznych. Zależność szybkości reakcji enzymatycznych od temperatury, pH środowiska, stężenia enzymów i substratu. Pojęcie optymalnego pH i temperatury, fizjologiczne i kliniczne znaczenie diagnostyczne. Wyznaczanie stałej Michaelisa i jej znaczenie kliniczne i diagnostyczne.

Kinetykę reakcji enzymatycznej (tj. zależność szybkości reakcji od jej warunków) określa się przede wszystkim właściwości katalizatora.

Kinetyka enzymów bada wzorce wpływu charakteru chemicznego reagujących substancji (enzymów, substratów) i warunków ich oddziaływania (stężenie, pH, temperatura, obecność aktywatorów lub inhibitorów) na szybkość reakcji enzymatycznych. Głównym celem badania kinetyki reakcji enzymatycznych jest uzyskanie informacji, które mogą pomóc w wyjaśnieniu molekularnego mechanizmu działania enzymów.

Zależność szybkości reakcji enzymatycznej od ilości enzymów:

Gdy reakcję enzymatyczną prowadzi się w warunkach nadmiaru substratu, szybkość reakcji będzie zależeć od stężenia enzymu. Graficzna zależność takiej reakcji wygląda jak linia prosta, jednak często ilości enzymu nie da się określić w wartościach bezwzględnych, dlatego w praktyce stosuje się wartości warunkowe charakteryzujące aktywność enzymu: jedna międzynarodowa jednostka aktywności ( IU) odpowiada ilości enzymu, która katalizuje konwersję 1 µmola substratu w ciągu 1 minuty w optymalnych warunkach dla reakcji enzymatycznej. Optymalne warunki są indywidualne dla każdego enzymu i zależą od temperatury otoczenia, pH roztworu, w przypadku braku aktywatorów i inhibitorów.

Ryż. Zależność akumulacji produktu (A) i utraty substratu (B) od czasu (czasu trwania) reakcji. Szybkość reakcji enzymatycznej zależy od zmiany stężenia produktu lub substratu w jednostce czasu.

Okres reakcji enzymatycznej charakteryzuje się nieliniową akumulacją produktu (lub utratą substratu) w zależności od czasu reakcji.

jednostka aktywności enzymu: 1 katal (kat), odpowiadająca ilości katalizatora, która przekształca 1 mol substratu w ciągu 1 s. Liczbę kataliz określa wzór:

Międzynarodowa jednostka aktywności enzymatycznej ME jest powiązana z katalem za pomocą następujących równości:

1 kot = 1 mol S/c = 60 mol S/min = 60x10 6 µmol/min = 6x10 7 ME,

1 ME = 1 µmol/min = 1/60 µmol/s = 1/60 µkat = 16,67 nkat.

W praktyce medycznej do oceny aktywności enzymów często wykorzystuje się międzynarodowe jednostki aktywności – ME. Aby oszacować liczbę cząsteczek enzymu wśród innych białek danej tkanki, określa się aktywność właściwą (sp. ac.) enzymu, liczbowo równą liczbie jednostek aktywności enzymu (pME) w próbce tkanki podzielonej przez masę (mg) białka w tej tkance:

Do oceny stopnia oczyszczenia enzymu wykorzystuje się aktywność specyficzną: im mniej obcych białek, tym wyższa aktywność specyficzna.

Zależność szybkości reakcji enzymatycznej od temperatury ośrodka

Zwiększenie temperatury do pewnych granic wpływa na szybkość reakcji enzymatycznej, podobnie jak wpływ temperatury na każdą reakcję chemiczną. Wraz ze wzrostem temperatury ruch cząsteczek przyspiesza, co prowadzi do wzrostu prawdopodobieństwa interakcji między reagentami. Ponadto temperatura może zwiększyć energię reagujących cząsteczek, co również przyspiesza reakcję. Szybkość reakcji chemicznej katalizowanej przez enzymy ma jednak swoje optymalne temperaturowe, którego przekroczeniu towarzyszy spadek aktywności enzymatycznej wynikający z termicznej denaturacji cząsteczki białka.

Dla większości ludzkich enzymów optymalna temperatura wynosi 37-38°C. Jednakże w przyrodzie występują również enzymy termostabilne. Na przykład polimeraza Taq wyizolowana z mikroorganizmów żyjących w gorących źródłach nie ulega inaktywacji, gdy temperatura wzrasta do 95°C. Enzym ten stosowany jest w medycynie naukowej i praktycznej do diagnostyki molekularnej chorób metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).

Ryż. Zależność szybkości reakcji enzymatycznej (V) od temperatury.

Zależność szybkości reakcji enzymatycznej od pH ośrodka

Dla każdego enzymu istnieje wartość pH, przy której obserwuje się jego maksymalną aktywność. Odchylenie od optymalnej wartości pH prowadzi do spadku aktywności enzymatycznej.

Wpływ pH na aktywność enzymu związany jest z jonizacją grup funkcyjnych reszt aminokwasowych danego białka, które zapewniają optymalną konformację centrum aktywnego enzymu. Kiedy pH zmienia się od wartości optymalnych, zmienia się jonizacja grup funkcyjnych cząsteczki białka. Na przykład, gdy środowisko jest zakwaszone, wolne grupy aminowe (NH3 +) ulegają protonowaniu, a gdy następuje alkalizacja, proton jest usuwany z grup karboksylowych (COO -). Prowadzi to do zmiany konformacji cząsteczki enzymu i konformacji centrum aktywnego; w konsekwencji następuje przerwanie przyłączania substratu, kofaktorów i koenzymów do centrum aktywnego. Dodatkowo pH środowiska może wpływać na stopień jonizacji czy organizację przestrzenną substratu, co wpływa również na powinowactwo substratu do miejsca aktywnego. Przy znacznym odchyleniu od optymalnej wartości pH może nastąpić denaturacja cząsteczki białka z całkowitą utratą aktywności enzymatycznej.

Optymalna wartość pH jest różna dla różnych enzymów. Enzymy działające w kwaśnych warunkach środowiska (na przykład pepsyna w żołądku lub enzymy lizosomalne) uzyskują konformację zapewniającą działanie enzymu przy kwaśnych wartościach pH. Jednak większość enzymów w organizmie człowieka ma optymalne pH zbliżone do obojętnego, pokrywające się z fizjologiczną wartością pH.

Zależność szybkości reakcji enzymatycznej od ilości substratu

Jeśli stężenie enzymów pozostawimy na stałym poziomie, zmieniając jedynie ilość substratu, wówczas wykres szybkości reakcji enzymatycznej opisujemy hiperbolą.

Wraz ze wzrostem ilości substratu wzrasta prędkość początkowa. Kiedy enzym zostanie całkowicie nasycony substratem, tj. przy danym stężeniu enzymu następuje maksymalne możliwe tworzenie kompleksu enzym-substrat i obserwuje się największą szybkość tworzenia produktu. Dalszy wzrost stężenia substratu nie prowadzi do wzrostu tworzenia się produktu, tj. szybkość reakcji nie wzrasta. Stan ten odpowiada maksymalnej prędkości reakcji Vmax.

Zatem stężenie enzymu jest czynnikiem ograniczającym powstawanie produktu. Obserwacja ta stała się podstawą kinetyki enzymów opracowanej przez naukowców L. Michaelisa i M. Mentena w 1913 roku.

Proces enzymatyczny można wyrazić następującym równaniem:

gdzie k 1 jest stałą szybkości tworzenia kompleksu enzym-substrat; k -1 jest stałą szybkości reakcji odwrotnej, rozkładu kompleksu enzym-substrat; k2 jest stałą szybkości tworzenia produktu reakcji.

Poniższy stosunek stałych szybkości (k -1 + k 2)/k 1 nazywany jest stałą Michaelisa i oznaczany K m.

Szybkość reakcji jest proporcjonalna do stężenia kompleksu enzym-substrat ES, a szybkość tworzenia ES zależy od stężenia substratu i stężenia wolnego enzymu. Na stężenie ES wpływa szybkość powstawania i rozpadu ES.

Największą szybkość reakcji obserwuje się, gdy wszystkie cząsteczki enzymu znajdują się w kompleksie z substratem, tj. w kompleksie enzym-substrat ES, tj. [E] = .

Zależność szybkości reakcji enzymatycznej od stężenia substratu wyraża poniższe równanie

Vmaks. [S]

K m + [S]

Równanie to nazywa się równaniem Michaelisa-Mentena.

W przypadku, gdy szybkość reakcji wynosi połowę maksymalnej, K m = [S] Zatem stała Michaelisa jest liczbowo równa stężeniu substratu, przy którym osiągana jest połowa maksymalnej szybkości.

Równanie Michaelisa-Mentena jest podstawowym równaniem kinetyki enzymów, opisującym zależność szybkości reakcji enzymatycznej od stężenia substratu.

Jeżeli stężenie substratu jest znacząco większe od K m (S >> K m), to zwiększenie stężenia substratu o K m praktycznie nie ma wpływu na sumę (K m + S) i można je uznać za równe substratowi stężenie. W rezultacie szybkość reakcji staje się równa prędkości maksymalnej: V = Vmax. W tych warunkach reakcja ma rząd zerowy, tj. nie zależy od stężenia substratu. Można stwierdzić, że Vmax jest wartością stałą dla danego stężenia enzymu, niezależną od stężenia substratu.

Jeśli stężenie substratu jest znacznie mniejsze niż K m (S<< K m), то сумма (K m + S) примерно равна К m , следовательно, V = V max [S]/K m , т.е. в данном случае скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата (реакция имеет первый порядок).

Ryż. Zależność szybkości reakcji (V) od stężenia substratu S.

Vmax i Km są charakterystykami kinetycznymi wydajności enzymu.

· Vmax charakteryzuje aktywność katalityczną enzymu i ma wymiar szybkości reakcji enzymatycznej mol/l, tj. określa maksymalną możliwość powstania produktu przy danym stężeniu enzymu i w warunkach nadmiaru substratu. Km charakteryzuje powinowactwo danego enzymu do danego substratu i jest wartością stałą niezależną od stężenia enzymu. Mniej

· Km, im większe powinowactwo enzymu do danego substratu, tym wyższa początkowa szybkość reakcji i odwrotnie, im większa Km, im niższa początkowa szybkość reakcji, tym mniejsze powinowactwo enzymu do substratu.

Aby zaszła jakakolwiek reakcja, reagujące cząsteczki muszą zetknąć się ze sobą. Jednak nie każdemu zderzeniu cząsteczek towarzyszy ich oddziaływanie, reakcja zachodzi tylko wtedy, gdy cząsteczki mają wystarczający zapas energii kinetycznej. Zbiór cząsteczek dowolnej substancji to statystyczny zbiór cząsteczek o różnych energiach kinetycznych. Energia potrzebna do osiągnięcia stanu aktywowanego (przejściowego), czyli nadwyżka energii w porównaniu do średniej energii cząsteczek w danej temperaturze, jaką muszą posiadać, aby zareagować, nazywana jest energią aktywacji (Ea). W przypadku reakcji enzymatycznych bariera energetyczna ulega zmniejszeniu w wyniku tworzenia kompleksu enzym-substrat, a im niższa jest energia aktywacji, tym szybciej przebiegają reakcje, ponieważ mogą oddziaływać cząsteczki o mniejszej energii.

w reakcjach enzymatycznych i nieenzymatycznych, aby osiągnąć stan przejściowy, cząsteczki substancji wyjściowych ulegają aktywacji, uzyskują większą rezerwę energii, dopiero potem mogą ulec przemianie w produkty reakcji, ale (Ea) w przypadku reakcji enzymatycznej reakcja jest niższa.

Zatem wysokie szybkości reakcji enzymatycznych są ostatecznie wynikiem spadku energii aktywacji katalizowanych reakcji. To właśnie dlatego, że katalizatory biologiczne zmniejszają energię aktywacji, reakcje enzymatyczne przebiegają z dużymi prędkościami i w stosunkowo niskich temperaturach.

Spadek energii aktywacji podczas katalizy enzymatycznej ma związek z wieloetapowym charakterem tych reakcji. Nie zachodzą one jednoetapowo, ale etapowo, poprzez kilka reakcji pośrednich. W tym przypadku bariera aktywacji reakcji jest podzielona na kilka niższych barier dla każdej reakcji pośredniej, które są łatwiejsze do pokonania dla reagujących cząsteczek niż jedna duża bariera.

Kataliza enzymatyczna ma cechy zarówno katalizy homogenicznej, jak i heterogenicznej, zachodzącej na granicy faz. W katalitycznym działaniu enzymów można wyróżnić 3 etapy: 1) przyłączenie cząsteczki substratu (S) do enzymu (E), 2) transformacja substratu, 3) oddzielenie końcowych produktów reakcji (P) od enzym. Najprostszy schemat reakcji enzymatycznej zapisano w następujący sposób.

Mi + S ⇆ ES → Mi + P

Najszybszy jest zwykle pierwszy etap reakcji, najwolniejszy drugi. W I etapie reakcji powstaje kompleks enzym-substrat (ЈS, FSK), w wyniku którego zmienia się struktura i właściwości cząsteczki substratu oraz powstają jej formy przejściowe. Jest to główny warunek przyspieszenia procesu jego przemiany w reakcji katalizowanej.

Tworzenie się FSC stwarza warunki dla wysokiej aktywności katalitycznej. Ustalono, że podczas tworzenia FSC cząsteczki enzymu i substratu nie tylko zbliżają się do siebie, ale także są w określony sposób zorientowane względem siebie. Pomiędzy strukturą substratu a centrum aktywnym enzymu, oprócz zgodności sterycznej, istnieje również zgodność topochemiczna, która zapewnia oddziaływanie grup rozpoznawczych enzymu (strefy wiązania) i grup rozpoznawczych substratu. Wiązanie enzymu z substratem jest zwykle wielopunktowe, a im większa specyficzność enzymu, tym więcej punktów rozpoznania.

Ważnym czynnikiem wpływającym w pewnym stopniu na wzrost szybkości reakcji enzymatycznych jest wydłużenie czasu kontaktu reagujących cząsteczek o kilka rzędów wielkości w wyniku wielopunktowego wiązania substratu(ów) przez enzym. Czas trwania kontaktu cząsteczek podczas zderzenia w przypadku reakcji czysto chemicznej jest w przybliżeniu równy okresowi drgań termicznych cząsteczek (10 13 -10 12 s). W tym czasie reakcja chemiczna nie zawsze ma czas na wystąpienie.

Przy optymalnym wiązaniu substratu z enzymem tworzy się produktywny kompleks enzym-substrat, tj. kompleks, który poprzez szereg etapów pośrednich wytwarza produkt(y) reakcji. Procesy te zachodzą na II etapie reakcji enzymatycznej. Szybkiemu zajściu reakcji enzymatycznej sprzyja fakt, że podczas oddziaływania substratu z enzymem w zerwanych wiązaniach w podłożu indukuje się napięcie (odkształcenie lub destabilizacja), tzn. zerwane wiązania stają się mniej trwałe niż w darmowe podłoże.

Zwiększenie szybkości reakcji pod wpływem enzymów następuje również ze względu na większą hydrofobowość środowiska centrum aktywnego w porównaniu do otaczającego roztworu; w takim środowisku obserwuje się desolwentację naładowanego substratu, co prowadzi do destabilizacji zerwanego wiązania .

Ważną cechą reakcji enzymatycznych jest to, że przemiana substratu przebiega jako kataliza wielofunkcyjna. Polifunkcjonalność zapewnia różnorodność reszt aminokwasowych części białkowej enzymu i grup kofaktorów w centrum aktywnym; na transformujące wiązanie chemiczne substratu wpływa jednocześnie lub w wyniku serii kolejnych ataków kilku grup enzymu. W efekcie następuje polaryzacja wiązania transformującego, a następnie jego zerwanie.

Wiele grup w miejscach aktywnych enzymów działa jak uogólnione kwasy lub zasady, działając na substrat, aktywując go, zwiększając w ten sposób szybkość katalizy. Według Brønsteda uogólnione kwasy są dowolnymi donorami protonów, a zasady są akceptorami protonów. Szczególnie skuteczna jest uogólniona kataliza kwasowo-zasadowa. Daje wzrost prędkości o 10-100 razy. Boczne rodniki aminokwasów, takich jak glutamina, aspargan, histydyna, lizyna, tyrozyna itp., działają w centrum aktywnym jako uogólnione katalizatory kwasowo-zasadowe.W formie protonowanej są katalizatorami kwasowymi, w formie nieprotonowanej mają charakter zasadowy.

Grupy nukleofilowe enzymów ulegają reakcjom podstawienia nukleofilowego, co prowadzi do powstania kowalencyjnych związków pośrednich – katalizy kowalencyjnej. Grupa nukleofilowa zastępuje grupę podstawioną i powstaje kowalencyjny związek pośredni; jest niestabilny i łatwo rozpada się na produkty reakcji. Grupa imidazolowa histydyny jest silnym nukleofilem, więc chemiczna modyfikacja histydyny w miejscu aktywnym prowadzi do inaktywacji enzymów. Grupy nukleofilowe obejmują także serynę z grupy OH i cysteinę z grupy SH. Przykładami grup elektrofilowych są jony metali, na przykład Zn2+

Jedną z funkcji metali w enzymach jest działanie jako czynniki elektrofilowe. Zatem w centrum aktywnym karboksypeptydazy A, zawierającym jon Zn 2+, ten ostatni jest czynnikiem elektrofilowym, który odciąga elektrony z wiązania peptydowego substratu, ułatwiając jego hydrolizę.

3.5. Rodzaje reakcji enzymatycznych. Ze względu na liczbę uczestników reakcje enzymatyczne dzieli się na reakcje z jednym substratem i z dwoma substratami. Reakcje z dużą liczbą substratów są dość rzadkie. Najbardziej powszechnym typem reakcji enzymatycznej jest reakcja dwusubstratowa, podczas której powstają dwa produkty: A + B ⇆ C + D. Około 60% wszystkich znanych reakcji, zwłaszcza reakcji przeniesienia grupowego, należy do tego typu.

Jednosubstratowe - reakcje jednoproduktowe są rzadkie, przykładami są reakcje izomeryzacji, w szczególności glukozo-1-fosforan ⇆ glukozo-6-fosforan. Jednak wiele reakcji ma swoje właściwości zbliżone do reakcji z jednym substratem. Obserwuje się to w przypadkach, gdy zmienia się stężenie tylko jednego z dwóch substratów. Na przykład reakcje hydrolityczne można uznać za jednosubstratowe, ponieważ stężenie drugiego substratu - wody - można uznać za stałe, podczas reakcji nieznacznie maleje.

Reakcje pojedynczego substratu są zasadniczo jednocząsteczkowymi reakcjami chemicznymi (A-P). Większość z nich należy do reakcji I rzędu, gdyż szybkość reakcji jest proporcjonalna do stężenia tylko jednego reagenta.O kolejności reakcji decyduje charakter jej zależności od stężenia substratu. Szybkość reakcji jednocząsteczkowej nie może zależeć od stężenia substratu (jeśli jest ono w nadmiarze), wówczas rząd reakcji będzie zerowy (V=ko, gdzie k 0 jest stałą szybkości reakcji zerowego rzędu).

Reakcje pierwszego rzędu będą obejmować także reakcje dwucząsteczkowe (dwa substraty). Dzieje się tak, gdy stężenie jednego z substratów jest bardzo duże w porównaniu ze stężeniem drugiego, jak ma to miejsce w przypadku reakcji hydrolizy. Większość reakcji dwucząsteczkowych to reakcje drugiego rzędu, ponieważ ich szybkość jest proporcjonalna do stężenia dwóch reagentów lub, rzadziej, do kwadratu stężenia substratu.

3.6. Wiele form molekularnych enzymów i izoenzymów.

Przez wielocząsteczkowe formy enzymów (MMEF) rozumie się grupę enzymów, które pełnią identyczną funkcję katalityczną u jednego gatunku biologicznego, ale różnią się budową i szeregiem właściwości fizykochemicznych. Do rozdzielenia MMFF najczęściej stosuje się różne warianty metody elektroforezy, po czym następuje specyficzna identyfikacja stref charakteryzujących się tą samą aktywnością enzymatyczną. Na elektroforogramach strefy aktywności MMFF oznaczono cyframi arabskimi w kolejności malejącej ruchliwości anodowej.

Wszystkie MMFF są podzielone na sześć klas.

1. Genetycznie niezależne białka. Są to enzymy syntetyzowane w różnych genach. U organizmów wielokomórkowych często charakteryzują się odmienną lokalizacją wewnątrzkomórkową w tkankach: na przykład kinaza pirogronianowa, enolaza, aldolaza fruktozodifosforanowa w tkankach mięśniowych i wątrobowych, dehydrogenaza jabłczanowa oraz szereg aminotransferaz w mitochondriach i cytozolu.

2. Heteropolimery(hybrydy) dwóch lub więcej łańcuchów polipeptydowych połączonych niekowalencyjnie. Przykładami form molekularnych enzymów tej klasy są LDH, dehydrogenaza alkoholowa i kinaza kreatynowa.

3. Warianty genetyczne(allelozymy). Allelozymy występują w organizmach heterozygotycznych pod względem genów kodujących ten enzym. Klasa ta obejmuje zmutowane formy enzymów. To bardzo duża klasa molekularnych form enzymów, obejmująca np. glukozo-6-fosforan – dehydrogenazę ludzką, deaminazę adenozyny i wiele innych.

4. Białka sprzężone lub pochodne. Ta klasa MMFF obejmuje formy enzymów utworzone w wyniku kowalencyjnego dodania lub usunięcia określonych grup do (z) białka. Modyfikacjom takim towarzyszą zwykle zmiany aktywności enzymatycznej i niektórych właściwości fizykochemicznych enzymu. Modyfikacja może polegać na fosforylacji – defosforylacji (fosforylaza glikogenu, syntaza glikogenu, difosfataza fruktozowa), adenylacji – deadenylacji (syntetaza glutaminy z E coli), utlenianie grup sulfhydrylowych (oksydaza ksantynowa, dehydrogenaza lipoilowa), glikozylacja (zmienność w liczbie reszt węglowodanowych wykazano dla β-glukuronidazy z wątroby bydlęcej, oksydazy glukozowej z Penicilliumvitale, DNazy i RNazy z trzustki bydlęcej), amidowanie asparginy i reszty glutaminy (nierówny stopień amidacji stwierdzono w proteazie alkalicznej Streptomyces rectus), rozszczepienie wiązań peptydowych przez proteazy (aldolaza).

5. Oligomery pojedynczych podjednostek. Jeśli enzym ma strukturę czwartorzędową, mogą powstać różne formy molekularne w wyniku połączenia różnej liczby identycznych łańcuchów polipeptydowych w strukturę czwartorzędową. Zatem β-glukozydaza jest aktywna w postaci mono-, di-, tetra- i oktameru. Zidentyfikowano różne stopnie oligomeryczności jako przyczynę pojawienia się MMFF w przypadku dehydrogenazy glutaminianowej, cholinoesterazy i wielu innych enzymów.

6. Konformacyjnie różne formy(konformiści). Konformery to białka różniące się konformacją tą samą sekwencją aminokwasów. Różnice w strukturze przestrzennej białka, związane z liczbą naładowanych grup na powierzchni cząsteczki, prowadzą do nierównej ruchliwości elektroforetycznej. Klasa 6 będzie obejmować także wszystkie enzymy modyfikowane allosterycznie.

Zatem termin MMFF można stosować jako najbardziej ogólny dla grupy enzymów występujących u jednego gatunku biologicznego i mających tę samą specyficzność działania. Należy go stosować niezależnie od przyczyny ich pojawienia się. Termin izoenzym lub izoenzym ma zastosowanie tylko do tych MMFF, których pojawienie się jest związane z genetycznie uwarunkowanymi różnicami w strukturze pierwotnej (klasy 1-3), a nie tych, które wynikają z innych przyczyn przy tej samej strukturze pierwotnej (klasy 4-6).

Denaturacja, przyczyny i objawy, zastosowanie w medycynie.

Białka są wrażliwe na wpływy zewnętrzne. Naruszenie struktury przestrzennej białek nazywa się denaturacją. W tym przypadku białko traci wszystkie swoje właściwości biologiczne i fizykochemiczne. Denaturacji towarzyszy zerwanie wiązań stabilizujących „natywną” strukturę białka. Jak wspomniano powyżej, słabe oddziaływanie odgrywa główną rolę w stabilizacji struktury białek, dlatego denaturacja może być spowodowana różnymi czynnikami: ogrzewaniem, napromienianiem, wstrząsaniem mechanicznym, chłodzeniem, ekspozycją chemiczną. Podczas denaturacji z reguły pogarsza się również rozpuszczalność białek, ponieważ naruszenie struktury prowadzi do pojawienia się na powierzchni dużej liczby grup hydrofobowych, zwykle ukrytych w środku cząsteczki białka.

Pierwotna struktura białka nie zmienia się podczas denaturacji, co pozwoliło wykazać możliwość przywrócenia funkcji i struktury zdenaturowanemu białku, choć w większości przypadków denaturacja jest procesem nieodwracalnym. W praktyce laboratoryjnej denaturację stosuje się w celu odbiałczenia płynów biologicznych. Czynniki wywołujące denaturację nazywane są czynnikami denaturującymi. Obejmują one:

1. Ogrzewanie i napromieniowanie wysokoenergetyczne (ultrafiolet, promieniowanie rentgenowskie, neutron itp.). Polega ona na wzbudzeniu drgań atomowych, czemu towarzyszy rozrywanie wiązań.

2. Działanie kwasów i zasad; zmienić dysocjację grup, zmniejszyć liczbę wiązań jonowych.

3. Jony metali ciężkich. Tworzą złożone związki z grupami białek, czemu towarzyszy zerwanie słabych oddziaływań.

4. Reduktory - powodują zerwanie mostków dwusiarczkowych.

5. Mocznik, chlorek guanidyniowy – tworzą nowe wiązania wodorowe i rozbijają stare. Zjawisko denaturacji można również wykorzystać do jakościowej analizy obecności białek w roztworach. W tym celu należy wykorzystać próbkę wrzącej badanej cieczy po jej zakwaszeniu. Powstałe zmętnienie jest spowodowane denaturacją białka. Często stosuje się także strącanie kwasami organicznymi: sulfosalicylowym lub trichlorooctowym.

Krótka historia enzymologii.

Przyznanie Nagrody Nobla J. Sumnerowi, J. Northropowi i Stanleyowi w 1946 r. oznaczało koniec długiego okresu rozwoju enzymologii – nauki o enzymach. Początki tej nauki sięgają początków historii rozwoju ludzkości, która w swoim życiu wykorzystuje szereg technologicznych procesów enzymatycznych: wypiek chleba, winiarstwo, obróbka skór zwierzęcych itp. Potrzeba usprawnienia tych procesów stała się impulsem do ich pogłębionych badań. Do pierwszych naukowych opisów procesów enzymatycznych należy opis trawienia u zwierząt.Rene Antoine Reaumur (1683-1757) przygotowując swoje doświadczenia wychodził z założenia Faulknera, że ​​ptaki drapieżne zwracają niestrawione resztki pokarmu. Reaumur skonstruował małą drucianą kapsułkę, w której umieścił kawałek mięsa i dał myszołówowi do dziobania. Po 24 godzinach ptak wypluł tę kapsułkę. Pozostał w nim zmiękczony kawałek jedzenia, który jednak się nie zepsuł. „Proces ten może być jedynie wynikiem działania jakiegoś rozpuszczalnika” – podsumował Reaumur. Podobne eksperymenty opisał Lazzaro Spallanzani (1729-1799), profesor historii naturalnej na Uniwersytecie w Padwie. Nie uważał jednak trawienia za proces fermentacji z prostego powodu: nie tworzą się pęcherzyki gazu.

Później proces fermentacji badał bardziej szczegółowo jeden z twórców współczesnej chemii, Antoine Laurent Lavoisier (1743-1794). Badając fermentację alkoholową zachodzącą podczas produkcji wina, odkrył, że glukoza przekształca się w alkohol i dwutlenek węgla,

Na początku XIX wieku. Panował ogólny pogląd, że fermentacja to zmiana chemiczna wywołana przez pewne wyspecjalizowane formy materiału organicznego, a mianowicie „enzymy”. W 1814 roku rosyjski naukowiec (z urodzenia Niemiec), akademik petersburskiej Akademii Nauk Konstantin Gottlieb Sigismund Kirchhoff (1764-1833) wykazał, że powstawanie cukru ze skrobi w porośniętych ziarnach zbóż jest wynikiem procesu chemicznego, a nie pojawienie się kiełków. W 1810 roku Yu Gay-Lussac wyizolował główne produkty końcowe działania drożdży – alkohol i dwutlenek węgla. J. Berzelius, jeden z twórców teorii katalizy chemicznej i autor samego terminu „kataliza” w 1835 roku, potwierdza te dane zauważając, że diastaza (ekstrakt ze słodu) katalizuje hydrolizę skrobi skuteczniej niż mineralny kwas siarkowy . Ważną rolę w rozwoju enzymologii odegrał spór Yu Liebiga ze słynnym mikrobiologiem L. Pasteurem, który uważał, że procesy fermentacji mogą zachodzić tylko w całej żywej komórce. J. Liebig natomiast uważał, że procesy biologiczne wynikają z działania substancji chemicznych, które później nazwano enzymami. Termin enzym (gr. en – in, zyme – drożdże) został zaproponowany w 1878 roku przez Friedricha Wilhelma Kühne, aby podkreślić, że proces ten zachodzi w drożdżach, a nie w samych drożdżach, które katalizują proces fermentacji. Jednakże w 1897 r. E. Buchner uzyskał bezkomórkowy ekstrakt drożdżowy zdolny do produkcji etanolu, co potwierdziło opinię Liebiga.

Próby wyjaśnienia jednej z ważnych właściwości enzymów, czyli specyficzności, doprowadziły w 1894 roku niemieckiego chemika i biochemika E. Fischera do zaproponowania modelu oddziaływania enzymu z substratem, zwanego „kluczem” – geometryczną komplementarnością kształtów substratu (klucz) i enzymu (zamek). W 1926 r. J. Sumner po prawie 9 latach badań udowodnił białkową naturę enzymu ureazy. W tych samych latach J. Northrop i M. Kunitz wskazali na bezpośrednią korelację pomiędzy aktywnością krystalicznej pepsyny, trypsyny a zawartością białka w badanych próbkach, dostarczając tym samym istotnych dowodów na białkowy charakter enzymów, choć ostateczny dowody uzyskano po określeniu struktury pierwszorzędowej i sztucznej syntezie szeregu enzymów. Podstawowe pojęcia o enzymach uzyskano już w drugiej połowie XX wieku. W 1963 roku zbadano sekwencję aminokwasów RNazy z trzustki. W 1965 roku wykazano przestrzenną strukturę lizozymu. W ciągu kolejnych lat oczyszczono tysiące enzymów i uzyskano wiele nowych danych na temat mechanizmów działania enzymów, ich struktury przestrzennej i regulacji reakcji katalizowanych przez enzymy. Aktywność katalityczną odkryto w RNA (rybozymach). Otrzymano przeciwciała o aktywności enzymatycznej – abzymy. W tym rozdziale pokrótce przedstawiono współczesne koncepcje dotyczące struktury, mechanizmu działania i medycznych aspektów enzymologii.

Cechy katalizy enzymatycznej.

1. Białkowa natura katalizatora

2. Wyjątkowo wysoka wydajność. Skuteczność katalizy biologicznej przewyższa skuteczność katalizy nieorganicznej o 10 9 - 10 12

3. Wyjątkowo wysoka specyficzność:

a) absolutny, gdy enzym działa tylko ze swoim substratem (fumaraza z izomerami trans kwasu fumarowego, a nie z izomerami cis);

b) grupowe – specyficzne dla wąskiej grupy powiązanych substratów (enzymy żołądkowo-jelitowe).

4. Działa w łagodnych warunkach (t=37, pH 7,0, określona osmolarność i skład soli).

5. Regulacja wielopoziomowa: regulacja aktywności na poziomie warunków środowiskowych, na poziomie metabolonu, na poziomie genetycznym, tkankowym, komórkowym, za pomocą hormonów i mediatorów, a także za pomocą substratów i produktów reakcję, którą katalizują.

6. Kooperatywność: enzymy potrafią organizować asocjacje – produkt pierwszego enzymu jest substratem drugiego; produkt drugiego jest substratem trzeciego itd.

Ponadto enzymy mają zdolność adaptacji, tj. mogą zmieniać swoją aktywność i tworzyć nowe asocjacje.

7. Zdolny do katalizowania reakcji do przodu i do tyłu. Kierunek reakcji wielu enzymów wyznacza stosunek działających mas.

8. Kataliza jest ściśle zaplanowana, to znaczy zachodzi etapami.

Specyfika działania enzymów.

Wysoka specyficzność enzymów wynika z komplementarności konformacyjnej i elektrostatycznej pomiędzy cząsteczkami substratu i enzymu oraz unikalnej struktury centrum aktywnego enzymu, która zapewnia „rozpoznanie”, wysokie powinowactwo i selektywność występowania jednego konkretnego reakcja.

W zależności od mechanizmu działania wyróżnia się enzymy o specyficzności względnej lub grupowej oraz o specyficzności absolutnej.

Dla działania niektórych enzymów hydrolitycznych największe znaczenie ma rodzaj wiązania chemicznego w cząsteczce substratu. Na przykład pepsyna rozkłada białka pochodzenia zwierzęcego i roślinnego, choć mogą one różnić się budową chemiczną, składem i właściwościami fizjologicznymi. Jednakże pepsyna nie rozkłada węglowodanów i tłuszczów. Wyjaśnia to fakt, że miejscem działania pepsyny jest wiązanie peptydowe. W przypadku działania lipazy takim miejscem jest wiązanie estrowe tłuszczów.

Oznacza to, że enzymy te mają względną specyficzność.

Bezwzględną swoistością działania nazywa się zdolność enzymu do katalizowania przemiany tylko pojedynczego substratu, a wszelkie zmiany w strukturze substratu czynią go niedostępnym dla działania enzymu. Na przykład: arginaza, która rozkłada argininę; ureaza, która katalizuje rozkład mocznika.

Istnieją dowody na istnienie specyficzności stereochemicznej wynikającej z istnienia optycznie izomerycznych form L i D lub izomerów geometrycznych (cis- i trans-)

Zatem znane są oksydazy L i D a/k.

Jeśli jakikolwiek związek występuje w postaci izomerów cis i trans, to dla każdej z tych form istnieje własny enzym. Na przykład fumaraza katalizuje konwersję tylko kwasu fumarowego (trans), ale nie działa na izomer cis, kwas maleinowy.