अनेक संसर्गजन्य रोगांच्या पुरेशा आणि प्रभावी उपचारांसाठी, वेळेवर अचूक निदान स्थापित करणे आवश्यक आहे. आज या समस्येचे निराकरण करण्यात, आण्विक जीवशास्त्र पद्धतींवर आधारित उच्च-तंत्र निदान पद्धतींचा समावेश आहे. याक्षणी, पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शन (PCR) हे सर्वात विश्वासार्ह प्रयोगशाळा निदान साधन म्हणून व्यावहारिक औषधांमध्ये आधीपासूनच मोठ्या प्रमाणावर वापरले जाते.

सध्या पीसीआरची लोकप्रियता काय स्पष्ट करते?

प्रथम, ही पद्धत उच्च अचूकतेसह विविध संसर्गजन्य रोगांचे रोगजनक ओळखण्यासाठी वापरली जाते.

दुसरे म्हणजे, उपचारांच्या प्रभावीतेचे निरीक्षण करणे.

विविध हस्तपुस्तिका, प्रॉस्पेक्टस, लेख, तसेच वैद्यकीय तज्ञांच्या स्पष्टीकरणांमध्ये, आम्हाला अनेकदा अनाकलनीय संज्ञा आणि शब्दांचा वापर आढळतो. विज्ञानाच्या उच्च-तंत्र उत्पादनांबद्दल सामान्य शब्दात बोलणे खरोखर कठीण आहे.

पीसीआर डायग्नोस्टिक्सचे सार आणि यांत्रिकी काय आहे?

प्रत्येक सजीवाची स्वतःची विशिष्ट जीन्स असते. जीन्स डीएनए रेणूमध्ये स्थित आहेत, जे खरं तर प्रत्येक विशिष्ट जीवाचे "कॉलिंग कार्ड" आहे. डीएनए (अनुवांशिक सामग्री) हा एक खूप लांब रेणू आहे जो न्यूक्लियोटाइड्स नावाच्या बिल्डिंग ब्लॉक्सपासून बनलेला असतो. संसर्गजन्य रोगांच्या प्रत्येक रोगजनकांसाठी, ते काटेकोरपणे विशेषतः स्थित आहेत, म्हणजे, एका विशिष्ट क्रमाने आणि संयोजनात. जेव्हा एखाद्या व्यक्तीमध्ये विशिष्ट रोगजनक आहे की नाही हे समजून घेणे आवश्यक असते तेव्हा जैविक सामग्री (रक्त, मूत्र, लाळ, स्मीअर) घेतली जाते, ज्यामध्ये डीएनए किंवा सूक्ष्मजंतूचे डीएनए तुकडे असतात. परंतु रोगजनकांच्या अनुवांशिक सामग्रीचे प्रमाण फारच कमी आहे आणि ते कोणत्या सूक्ष्मजीवाचे आहे हे सांगणे अशक्य आहे. या समस्येचे निराकरण करण्यासाठी, पीसीआर सेवा देते. पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शनचा सार असा आहे की डीएनए असलेल्या संशोधनासाठी थोड्या प्रमाणात सामग्री घेतली जाते आणि पीसीआर प्रक्रियेदरम्यान, विशिष्ट रोगजनकाशी संबंधित अनुवांशिक सामग्रीचे प्रमाण वाढते आणि अशा प्रकारे, ते ओळखले जाऊ शकते.

पीसीआर डायग्नोस्टिक्स हा बायोमटेरियलचा अनुवांशिक अभ्यास आहे.

पीसीआर पद्धतीची कल्पना अमेरिकन शास्त्रज्ञ के. मुलिन्स यांची आहे, जी त्यांनी 1983 मध्ये मांडली होती. तथापि, XX शतकाच्या 90 च्या दशकाच्या मध्यभागी याचा विस्तृत क्लिनिकल वापर प्राप्त झाला.

चला शब्दावली हाताळू, ते काय आहे - डीएनए इ. कोणत्याही सजीवाच्या (प्राणी, वनस्पती, मानव, जीवाणू, विषाणू) प्रत्येक पेशीमध्ये गुणसूत्र असतात. क्रोमोसोम हे अनुवांशिक माहितीचे संरक्षक असतात ज्यात प्रत्येक विशिष्ट सजीवाच्या जनुकांचा संपूर्ण क्रम असतो.

प्रत्येक गुणसूत्र डीएनएच्या दोन स्ट्रँडपासून बनलेले असते जे एकमेकांच्या सापेक्ष हेलिक्समध्ये वळवले जातात. डीएनए रासायनिकदृष्ट्या डीऑक्सीरिबोन्यूक्लिक अॅसिड आहे, ज्यामध्ये संरचनात्मक घटक असतात - न्यूक्लियोटाइड्स. न्यूक्लियोटाइड्सचे 5 प्रकार आहेत - थायमिन (टी), एडेनोसिन (ए), ग्वानिन (जी), सायटोसिन (सी) आणि युरासिल (यू). न्यूक्लियोटाइड्स एकामागून एक कठोर वैयक्तिक क्रमाने व्यवस्थित केले जातात, जीन्स तयार करतात. एका जनुकामध्ये 20-200 अशा न्यूक्लियोटाइड्स असू शकतात. उदाहरणार्थ, जीन एन्कोडिंग इंसुलिन उत्पादन 60 बेस जोड्या लांब आहे.

न्यूक्लियोटाइड्समध्ये पूरकतेचा गुणधर्म असतो. याचा अर्थ असा की डीएनएच्या एका स्ट्रँडमध्ये अॅडेनाइन (ए) च्या विरुद्ध दुसऱ्या स्ट्रँडमध्ये नेहमी थायमिन (टी) असते आणि त्याच्या विरुद्ध ग्वानिन (जी) - सायटोसिन (सी) असते. योजनाबद्धपणे असे दिसते:
जी - सी
टी - ए
ए - टी
पूरकतेचा हा गुणधर्म पीसीआरसाठी महत्त्वाचा आहे.

डीएनए व्यतिरिक्त, आरएनएमध्ये समान रचना आहे - रिबोन्यूक्लिक अॅसिड, जे डीएनएपेक्षा वेगळे आहे कारण ते थायमिनऐवजी यूरेसिल वापरते. आरएनए - काही विषाणूंमध्ये अनुवांशिक माहितीचे रक्षक आहे, ज्याला रेट्रोव्हायरस (उदाहरणार्थ, एचआयव्ही) म्हणतात.

डीएनए आणि आरएनए रेणू "गुणाकार" करू शकतात (ही गुणधर्म पीसीआरसाठी वापरली जाते). हे खालीलप्रमाणे होते: डीएनए किंवा आरएनएचे दोन स्ट्रँड एकमेकांपासून बाजूला जातात, प्रत्येक धाग्यावर एक विशेष एंजाइम बसतो, जो नवीन साखळीचे संश्लेषण करतो. संश्लेषण पूरकतेच्या तत्त्वानुसार पुढे जाते, म्हणजे, जर न्यूक्लियोटाइड A मूळ DNA साखळीत असेल, तर T नव्याने संश्लेषित केलेल्यामध्ये असेल, जर G - तर C, इ. या विशेष "बिल्डर" एंझाइमला संश्लेषण सुरू करण्यासाठी "बीज" - 5-15 न्यूक्लियोटाइड्सचा क्रम - आवश्यक आहे. हे "बीज" प्रत्येक जनुकासाठी (क्लॅमिडीया जनुक, मायकोप्लाझ्मा, व्हायरस) प्रायोगिकपणे.

तर, प्रत्येक पीसीआर सायकलमध्ये तीन टप्पे असतात. पहिल्या टप्प्यात, डीएनएचे तथाकथित अनवाइंडिंग होते - म्हणजे, डीएनएच्या दोन स्ट्रँड एकमेकांना जोडलेले असतात. दुसऱ्यामध्ये, "बी" डीएनए स्ट्रँडच्या एका भागाशी संलग्न आहे. आणि, शेवटी, या डीएनए स्ट्रँडचा विस्तार, जो "बिल्डर" एंझाइमद्वारे तयार केला जातो. सध्या, ही संपूर्ण गुंतागुंतीची प्रक्रिया एका चाचणी नळीमध्ये घडते आणि त्यामध्ये डीएनएच्या पुनरुत्पादनाची पुनरावृत्ती चक्रे असतात ज्या पारंपारिक पद्धतींद्वारे शोधल्या जाऊ शकतात अशा मोठ्या प्रमाणात प्रती मिळविण्यासाठी निर्धारित केल्या जातात. म्हणजेच, डीएनएच्या एका स्ट्रँडमधून आपल्याला शेकडो किंवा हजारो मिळतात.

पीसीआर अभ्यासाचे टप्पे

संशोधनासाठी जैविक साहित्याचा संग्रह

विविध जैविक सामग्री नमुना म्हणून काम करते: रक्त आणि त्याचे घटक, मूत्र, लाळ, श्लेष्मल झिल्लीचे स्राव, सेरेब्रोस्पाइनल द्रवपदार्थ, जखमेच्या पृष्ठभागातून स्त्राव, शरीराच्या पोकळीतील सामग्री. सर्व जैव नमुने डिस्पोजेबल उपकरणांसह गोळा केले जातात आणि गोळा केलेली सामग्री निर्जंतुकीकरण प्लास्टिक ट्यूबमध्ये ठेवली जाते किंवा कल्चर मीडियावर ठेवली जाते, त्यानंतर प्रयोगशाळेत वाहतूक केली जाते.

घेतलेल्या नमुन्यांमध्ये आवश्यक अभिकर्मक जोडले जातात आणि प्रोग्राम करण्यायोग्य थर्मोस्टॅटमध्ये ठेवले जातात - थर्मल सायकलर (एम्पलीफायर). सायकलरमध्ये, पीसीआर चक्र 30-50 वेळा पुनरावृत्ती होते, ज्यामध्ये तीन टप्पे असतात (विकृतीकरण, एनीलिंग आणि वाढवणे). याचा अर्थ काय? चला अधिक तपशीलवार विचार करूया.

तत्काळ पीसीआर प्रतिक्रियाचे टप्पे, अनुवांशिक सामग्रीची कॉपी करणे

आयपीसीआर स्टेज - कॉपी करण्यासाठी अनुवांशिक सामग्री तयार करणे.
95 डिग्री सेल्सिअस तापमानात उद्भवते, जेव्हा डीएनए स्ट्रँड डिस्कनेक्ट केलेले असतात आणि "बिया" त्यावर बसू शकतात.

"बियाणे" विविध संशोधन आणि उत्पादन संघटनांद्वारे औद्योगिकरित्या तयार केले जातात आणि प्रयोगशाळा तयार बिया विकत घेतात. त्याच वेळी, शोधण्यासाठी "बीज", उदाहरणार्थ, क्लॅमिडीया, फक्त क्लॅमिडीया इ. साठी कार्य करते. अशाप्रकारे, क्लॅमिडीयल संसर्गाच्या उपस्थितीसाठी बायोमटेरियलची चाचणी घेतल्यास, क्लॅमिडीयासाठी "बी" प्रतिक्रिया मिश्रणात ठेवली जाते; एपस्टाईन-बॅर विषाणूसाठी बायोमटेरियलची चाचणी करत असल्यास, एपस्टाईन-बॅर विषाणूसाठी "बीज"

IIस्टेज - संसर्गजन्य एजंट आणि "बियाणे" च्या अनुवांशिक सामग्रीचे संयोजन.
विषाणू किंवा जिवाणूचा डीएनए ठरवायचा असेल तर या डीएनएवर ‘बीज’ बसते. ही प्राइमर जोडण्याची प्रक्रिया ही पीसीआरची दुसरी पायरी आहे. हा टप्पा 75 डिग्री सेल्सिअस तापमानात होतो.

IIIस्टेज - संसर्गजन्य एजंटच्या अनुवांशिक सामग्रीची कॉपी करणे.
ही अनुवांशिक सामग्रीच्या वास्तविक वाढीची किंवा पुनरुत्पादनाची प्रक्रिया आहे, जी 72 डिग्री सेल्सियसवर होते. एंजाइम-बिल्डर "बिया" जवळ येतो आणि डीएनएच्या नवीन स्ट्रँडचे संश्लेषण करतो. नवीन डीएनए स्ट्रँडच्या संश्लेषणाच्या समाप्तीसह, पीसीआर चक्र देखील समाप्त होते. म्हणजेच, एका पीसीआर चक्रात, अनुवांशिक सामग्रीचे प्रमाण दुप्पट होते. उदाहरणार्थ, सुरुवातीच्या नमुन्यात व्हायरसचे 100 डीएनए रेणू होते, पहिल्या पीसीआर चक्रानंतर नमुन्यात चाचणी केलेल्या विषाणूचे 200 डीएनए रेणू आधीच असतील. एक चक्र 2-3 मिनिटे चालते.

ओळखण्यासाठी पुरेशी अनुवांशिक सामग्री तयार करण्यासाठी, 30-50 पीसीआर चक्र सामान्यतः केले जातात, ज्यास 2-3 तास लागतात.

प्रसारित अनुवांशिक सामग्रीच्या ओळखीचा टप्पा

पीसीआर इथेच संपतो आणि मग ओळखीचा तितकाच महत्त्वाचा टप्पा येतो. ओळखण्यासाठी, इलेक्ट्रोफोरेसीस किंवा लेबल केलेले "बिया" वापरले जातात. इलेक्ट्रोफोरेसीस वापरताना, परिणामी डीएनए स्ट्रँड आकारानुसार विभक्त केले जातात आणि वेगवेगळ्या लांबीच्या डीएनए तुकड्यांची उपस्थिती विश्लेषणाचा सकारात्मक परिणाम दर्शवते (म्हणजे विशिष्ट विषाणू, जीवाणू इ.ची उपस्थिती). जेव्हा लेबल केलेले "बियाणे" वापरले जाते, तेव्हा प्रतिक्रियेच्या अंतिम उत्पादनामध्ये एक क्रोमोजेन (रंग) जोडला जातो, परिणामी एंजाइमॅटिक प्रतिक्रिया रंगाच्या निर्मितीसह होते. रंगाचा विकास थेट सूचित करतो की मूळ नमुन्यात व्हायरस किंवा इतर शोधण्यायोग्य एजंट उपस्थित आहे.

आज, लेबल केलेले "बियाणे", तसेच योग्य सॉफ्टवेअर वापरून, पीसीआर परिणाम त्वरित "वाचणे" शक्य आहे. हे तथाकथित रिअल-टाइम पीसीआर आहे.

पीसीआर डायग्नोस्टिक्स इतके मौल्यवान का आहे?

पीसीआर पद्धतीचा एक महत्त्वपूर्ण फायदा म्हणजे त्याची उच्च संवेदनशीलता - 95 ते 100% पर्यंत. तथापि, हे फायदे खालील अटींच्या अपरिहार्य पालनावर आधारित असले पाहिजेत:

1. योग्य नमुने, जैविक सामग्रीची वाहतूक;
2. निर्जंतुकीकरण, डिस्पोजेबल उपकरणे, विशेष प्रयोगशाळा आणि प्रशिक्षित कर्मचारी यांची उपलब्धता;
3. विश्लेषणादरम्यान पद्धती आणि निर्जंतुकीकरणाचे कठोर पालन

वेगवेगळ्या सूक्ष्मजंतूंची संवेदनशीलता वेगवेगळी असते. तर, उदाहरणार्थ, हिपॅटायटीस सी विषाणू शोधण्यासाठी पीसीआर पद्धतीची संवेदनशीलता 97-98% आहे, यूरियाप्लाझ्मा शोधण्यासाठी संवेदनशीलता 99-100% आहे.

पीसीआर विश्लेषणामध्ये अंतर्निहित क्षमता आपल्याला अतुलनीय विश्लेषणात्मक विशिष्टता प्राप्त करण्यास अनुमती देतात. याचा अर्थ नेमका कोणता सूक्ष्मजीव शोधला गेला आहे ते ओळखणे, आणि समान किंवा जवळून संबंधित नाही.
पीसीआर पद्धतीची निदान संवेदनशीलता आणि विशिष्टता बहुतेक वेळा संस्कृती पद्धतीपेक्षा जास्त असते, ज्याला संसर्गजन्य रोगांच्या शोधासाठी "गोल्ड स्टँडर्ड" म्हटले जाते. संस्कृतीच्या वाढीचा कालावधी (अनेक दिवसांपासून अनेक आठवड्यांपर्यंत) लक्षात घेता, पीसीआर पद्धतीचा फायदा स्पष्ट होतो.

संसर्गाच्या निदानामध्ये पीसीआर
पीसीआर पद्धतीचे फायदे (संवेदनशीलता आणि विशिष्टता) आधुनिक औषधांमध्ये विस्तृत अनुप्रयोग निर्धारित करतात.
पीसीआर डायग्नोस्टिक्स लागू करण्याचे मुख्य क्षेत्रः

1. विविध स्थानिकीकरणाच्या तीव्र आणि जुनाट संसर्गजन्य रोगांचे निदान
2. थेरपीच्या प्रभावीतेचे निरीक्षण करणे
3. रोगजनकांच्या प्रकाराचे स्पष्टीकरण

PCR चा उपयोग प्रसूती, स्त्रीरोग, नवजात रोग, बालरोग, मूत्रविज्ञान, वेनेरिओलॉजी, नेफ्रोलॉजी, संसर्गजन्य रोगांचे क्लिनिक, नेत्ररोग, न्यूरोलॉजी, phthisiopulmonology, इ.

पीसीआर डायग्नोस्टिक्सचा वापर इतर संशोधन पद्धती (ELISA, PIF, RIF, इ.) सह संयोगाने केला जातो. त्यांचे संयोजन आणि उपयुक्तता उपस्थित डॉक्टरांद्वारे निर्धारित केली जाते.

PCR द्वारे संसर्गजन्य एजंट आढळले

व्हायरस:

1. HIV-1 आणि HIV-2 रेट्रोव्हायरस
2. herpetiform व्हायरस
3. हर्पस सिम्प्लेक्स व्हायरस प्रकार 1 आणि 2

पॉलिमरेझ चेन रिएक्शन (PCR)- आण्विक जीवशास्त्राची प्रायोगिक पद्धत, जी सिंथेटिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर्सद्वारे प्रेरित न्यूक्लिक अॅसिडचे विशिष्ट प्रवर्धन आहे ग्लासमध्ये.

पीसीआर पद्धत विकसित करण्याची कल्पना अमेरिकन संशोधक कॅरी मुलिस यांची आहे, ज्यांनी 1983 मध्ये एक पद्धत तयार केली ज्यामुळे कृत्रिम परिस्थितीत डीएनए पॉलिमरेझ एन्झाइमचा वापर करून चक्रीय दुप्पट दरम्यान डीएनए वाढवणे शक्य झाले. ही कल्पना प्रसिद्ध झाल्यानंतर काही वर्षांनी 1993 मध्ये के. मुलिस यांना त्यासाठी नोबेल पारितोषिक मिळाले.

पद्धतीच्या वापराच्या सुरूवातीस, प्रत्येक गरम-कूलिंग चक्रानंतर, डीएनए पॉलिमरेझ प्रतिक्रिया मिश्रणात जोडणे आवश्यक होते, कारण ते उच्च तापमानात त्वरीत निष्क्रिय होते. प्रक्रिया खूप अकार्यक्षम होती, त्यासाठी बराच वेळ आणि एंजाइम आवश्यक होते. 1986 मध्ये, थर्मोफिलिक बॅक्टेरियापासून डीएनए पॉलिमरेझ वापरून त्यात लक्षणीय सुधारणा करण्यात आली. हे एंजाइम अनेक प्रतिक्रिया चक्रांना तोंड देण्यास सक्षम आहेत, जे आपल्याला पीसीआर स्वयंचलित करण्यास अनुमती देतात. सर्वात सामान्यपणे वापरल्या जाणार्‍या थर्मोस्टेबल डीएनए पॉलिमरेसेसपैकी एक जीवाणूपासून वेगळे केले गेले आहे. थर्मस एक्वाटिकसआणि नाव दिले ताक-डीएनए पॉलिमरेज.

पद्धतीचे सार.ही पद्धत Taq-DNA पॉलिमरेज एंजाइम वापरून विशिष्ट DNA क्षेत्राच्या एकाधिक निवडक कॉपीवर आधारित आहे. पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शनमुळे अनेक हजार बेस जोड्या लांबीपर्यंत अॅम्प्लिफिकेट्स मिळवणे शक्य होते. पीसीआर उत्पादनाची लांबी 20-40 हजार बेस जोड्यांपर्यंत वाढविण्यासाठी, विविध पॉलिमरेसेसचे मिश्रण वापरले जाते, परंतु तरीही ते युकेरियोटिक सेलच्या क्रोमोसोमल डीएनएच्या लांबीपेक्षा खूपच कमी आहे.

प्रतिक्रिया प्रोग्राम करण्यायोग्य थर्मोस्टॅट (एम्प्लीफायर) मध्ये चालते - एक उपकरण जे पुरेसे जलद पार पाडू शकते

चाचणी ट्यूब थंड करणे आणि गरम करणे (सामान्यत: किमान 0.1 °C च्या अचूकतेसह). अॅम्प्लीफायर्स तुम्हाला "हॉट स्टार्ट" आणि त्यानंतरच्या स्टोरेजच्या संभाव्यतेसह जटिल प्रोग्राम सेट करण्याची परवानगी देतात. रिअल-टाइम पीसीआरसाठी, फ्लोरोसेंट डिटेक्टरसह सुसज्ज उपकरणे तयार केली जातात. स्वयंचलित झाकण आणि मायक्रोप्लेट कंपार्टमेंटसह उपकरणे देखील उपलब्ध आहेत, ज्यामुळे त्यांना स्वयंचलित प्रणालींमध्ये एकत्रित केले जाऊ शकते.

सहसा, पीसीआर दरम्यान, 20-45 चक्रे केली जातात, ज्यापैकी प्रत्येकामध्ये तीन टप्पे असतात: विकृतीकरण, प्राइमर एनीलिंग, वाढवणे (चित्र 6.1 आणि 6.2). अंजीर वर. 6.1 पीसीआर चक्रादरम्यान चाचणी ट्यूबमधील तापमान बदलांची गतिशीलता दर्शविते.

तांदूळ. ६.१.पॉलिमरेज साखळी अभिक्रियाच्या एका चक्रादरम्यान चाचणी नळीतील तापमानातील बदलाचा आलेख

डीएनए टेम्पलेट विकृतीकरण 5-90 s साठी प्रतिक्रिया मिश्रण 94-96 ° से गरम करून चालते जेणेकरुन DNA चेन विखुरल्या जातील. हे लक्षात घेतले पाहिजे की पहिल्या चक्रापूर्वी, प्रारंभिक मॅट्रिक्स पूर्णपणे विकृत करण्यासाठी प्रतिक्रिया मिश्रण 2-5 मिनिटांसाठी गरम केले जाते, ज्यामुळे विशिष्ट प्रतिक्रिया उत्पादनांचे प्रमाण कमी करणे शक्य होते.

तांदूळ. ६.२.पॉलिमरेज साखळी अभिक्रियाच्या पहिल्या चक्राची योजना

प्राइमर अॅनिलिंग स्टेज.तापमानात हळूहळू घट झाल्यामुळे, प्राइमर्स टेम्प्लेटला पूरकपणे बांधतात. अॅनिलिंग तापमान प्राइमर्सच्या रचनेवर अवलंबून असते आणि सामान्यतः गणना केलेल्या वितळण्याच्या तापमानापेक्षा 4-5°C कमी असते. स्टेजचा कालावधी 5-60 एस आहे.

पुढील टप्प्यात - वाढवणे- मातृ मॅट्रिक्सवर डीएनएच्या कन्या स्ट्रँडचे संश्लेषण आहे. वाढवण्याचे तापमान पॉलिमरेजवर अवलंबून असते. सामान्यतः वापरले जाणारे Taq आणि Pfu DNA पॉलिमरेस 72°C वर सर्वाधिक सक्रिय असतात. वाढवण्याची वेळ, प्रामुख्याने PCR उत्पादनाच्या लांबीवर अवलंबून असते, सामान्यत: प्रति 1000 बेस जोड्यांसाठी 1 मिनिट असते.

जे तुम्हाला जैविक सामग्रीमध्ये लहान प्रमाणात, अधिक अचूकपणे, त्यातील काही तुकड्यांचा शोध घेण्यास आणि त्यांना अनेक वेळा गुणाकार करण्यास अनुमती देते. नंतर ते जेल इलेक्ट्रोफोरेसीसद्वारे दृष्यदृष्ट्या ओळखले जातात. प्रतिक्रिया 1983 मध्ये के. मुलिस यांनी विकसित केली होती आणि अलिकडच्या वर्षांत उत्कृष्ट शोधांच्या यादीत समाविष्ट केली होती.

पीसीआरची यंत्रणा काय आहे

संपूर्ण तंत्र न्यूक्लिक अॅसिडच्या स्वयं-प्रतिकृतीच्या क्षमतेवर आधारित आहे, जे या प्रकरणात प्रयोगशाळेत कृत्रिमरित्या चालते. डीएनए पुनरुत्पादन रेणूच्या कोणत्याही प्रदेशात सुरू होऊ शकत नाही, परंतु केवळ विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम असलेल्या प्रदेशांमध्ये - सुरुवातीचे तुकडे. पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शन सुरू होण्यासाठी, प्राइमर्स (किंवा डीएनए प्रोब) आवश्यक आहेत. हे दिलेल्या न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमासह डीएनए साखळीचे छोटे तुकडे आहेत. ते सुरुवातीच्या साइट्सना पूरक (म्हणजे संबंधित) आहेत

अर्थात, प्राइमर्स तयार करण्यासाठी, शास्त्रज्ञांनी तंत्रात समाविष्ट असलेल्या न्यूक्लियोटाइड क्रमाचा अभ्यास केला पाहिजे. या डीएनए प्रोब्समुळेच प्रतिक्रिया आणि त्याची सुरुवात याची विशिष्टता असते. नमुन्यात इच्छित डीएनएचा किमान एक रेणू आढळला नाही तर कार्य करणार नाही. सर्वसाधारणपणे, प्रतिक्रिया होण्यासाठी वरील प्राइमर, न्यूक्लियोटाइड्सचा संच, उष्णता-प्रतिरोधक डीएनए पॉलिमरेझ आवश्यक आहे. नंतरचे एक एंझाइम आहे जे नमुन्याच्या आधारे नवीन न्यूक्लिक अॅसिड रेणूंचे संश्लेषण उत्प्रेरित करते. हे सर्व पदार्थ, ज्यामध्ये डीएनए शोधणे आवश्यक आहे अशा जैविक सामग्रीसह, प्रतिक्रिया मिश्रण (सोल्यूशन) मध्ये एकत्र केले जाते. हे एका विशेष थर्मोस्टॅटमध्ये ठेवलेले आहे जे दिलेल्या वेळेसाठी अतिशय जलद गरम आणि थंड करते - एक चक्र. सहसा त्यापैकी 30-50 असतात.

ही प्रतिक्रिया कशी पुढे जाते?

त्याचे सार असे आहे की एका चक्रादरम्यान प्राइमर्स डीएनएच्या इच्छित विभागांशी जोडलेले असतात, त्यानंतर ते एंजाइमच्या कृती अंतर्गत दुप्पट होते. परिणामी डीएनए स्ट्रँडवर आधारित, रेणूचे नवीन आणि नवीन एकसारखे तुकडे त्यानंतरच्या चक्रांमध्ये संश्लेषित केले जातात.

पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शन क्रमाक्रमाने पुढे जाते, त्याचे खालील टप्पे वेगळे केले जातात. प्रथम प्रत्येक हीटिंग आणि कूलिंग सायकल दरम्यान उत्पादनाच्या प्रमाणात दुप्पट करून दर्शविले जाते. दुस-या टप्प्यात, प्रतिक्रिया मंदावते, कारण एंजाइम खराब होते आणि क्रियाकलाप देखील गमावते. याव्यतिरिक्त, न्यूक्लियोटाइड्स आणि प्राइमर्सचे साठे कमी झाले आहेत. शेवटच्या टप्प्यावर - एक पठार - उत्पादने यापुढे जमा होत नाहीत, कारण अभिकर्मक संपले आहेत.

ते कुठे वापरले जाते

निःसंशयपणे, पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शनला वैद्यक आणि विज्ञानामध्ये सर्वात विस्तृत अनुप्रयोग सापडतो. हे सामान्य आणि खाजगी जीवशास्त्र, पशुवैद्यकीय औषध, फार्मसी आणि अगदी पर्यावरणशास्त्र मध्ये वापरले जाते. शिवाय, नंतरच्या काळात ते अन्न उत्पादने आणि पर्यावरणीय वस्तूंच्या गुणवत्तेवर लक्ष ठेवण्यासाठी हे करतात. पितृत्वाची पुष्टी करण्यासाठी आणि एखाद्या व्यक्तीची ओळख पटविण्यासाठी फॉरेन्सिक प्रॅक्टिसमध्ये पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शन सक्रियपणे वापरली जाते. फॉरेन्सिकमध्ये, तसेच जीवाश्मविज्ञानामध्ये, हे तंत्र बहुतेकदा एकमेव मार्ग आहे, कारण सहसा संशोधनासाठी फारच कमी डीएनए उपलब्ध असतो. अर्थात, या पद्धतीला व्यावहारिक औषधांमध्ये खूप विस्तृत अनुप्रयोग आढळला आहे. अनुवांशिक, संसर्गजन्य आणि ऑन्कोलॉजिकल रोगांसारख्या भागात हे आवश्यक आहे.

साइट केवळ माहितीच्या उद्देशाने संदर्भ माहिती प्रदान करते. रोगांचे निदान आणि उपचार तज्ञांच्या देखरेखीखाली केले पाहिजेत. सर्व औषधांमध्ये contraindication आहेत. तज्ञांचा सल्ला आवश्यक आहे!

पद्धत पॉलिमरेझ साखळी प्रतिक्रियानावाच्या एका अमेरिकन शास्त्रज्ञाने जवळजवळ तीस वर्षांपूर्वी शोधले होते कॅरी मुलिस. निदान साधन म्हणून औषधामध्ये हे तंत्र मोठ्या प्रमाणावर वापरले जाते आणि त्याचे सार म्हणजे विशेष एंजाइम वापरून डीएनएचा एक भाग कॉपी करणे ( पॉलिमरेझ) कृत्रिमरित्या इन विट्रो.

औषधाच्या कोणत्या भागात ही पद्धत वापरली जाते?

डीएनए कॉपी कशासाठी आहे आणि ते औषध कसे देऊ शकते?
हे तंत्र परवानगी देते:

• जीन्स अलग करा आणि क्लोन करा.
• अनुवांशिक आणि संसर्गजन्य रोगांचे निदान करा.
• पितृत्वाचा निर्धार करा. मुलाला त्याच्या जैविक पालकांकडून काही अनुवांशिक वैशिष्ट्ये वारशाने मिळतात, परंतु त्याची स्वतःची अनुवांशिक ओळख आहे. त्याच्यामध्ये काही जनुकांची उपस्थिती जी पालकांच्या जनुकांसारखीच आहे - आम्हाला नातेसंबंधाच्या स्थापनेबद्दल बोलण्याची परवानगी देते.

फॉरेन्सिक प्रॅक्टिसमध्ये पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शन देखील वापरले जाते.

गुन्ह्याच्या ठिकाणी, फॉरेन्सिक शास्त्रज्ञ अनुवांशिक सामग्रीचे नमुने गोळा करतात. यामध्ये हे समाविष्ट आहे: केस, लाळ, रक्त. त्यानंतर, पॉलिमरेज प्रतिक्रिया तंत्रामुळे, डीएनए वाढवणे आणि संशयित व्यक्तीच्या अनुवांशिक सामग्रीसह घेतलेल्या नमुन्याची ओळख तुलना करणे शक्य आहे.

औषधांमध्ये, पॉलिमरेझ साखळी प्रतिक्रिया प्रभावीपणे वापरली जाते:

• पल्मोनोलॉजिकल प्रॅक्टिसमध्ये - न्यूमोनिया, क्षयरोगाच्या जीवाणू आणि विषाणूजन्य प्रकारांच्या फरकासाठी.
• स्त्रीरोग आणि यूरोलॉजिकल सराव मध्ये - ureaplasmosis, chlamydia, mycoplasma संक्रमण, Gardnerellosis, नागीण, गोनोरिया निश्चित करण्यासाठी.
• गॅस्ट्रोएन्टेरोलॉजिकल सराव मध्ये.
• हेमॅटोलॉजीमध्ये - ऑन्कोव्हायरस आणि सायटोमेगॅलॉइरस संसर्ग निर्धारित करण्यासाठी.
• व्हायरल हेपेटायटीस, डिप्थीरिया, साल्मोनेलोसिस सारख्या संसर्गजन्य रोगांच्या स्पष्ट निदानामध्ये.

सध्या, ही पद्धत संसर्गजन्य रोगांच्या निदानासाठी मोठ्या प्रमाणावर वापरली जाते ( हिपॅटायटीस ऑफ व्हायरल एटिओलॉजी, एचआयव्ही, लैंगिक संक्रमित रोग, क्षयरोग, टिक-बोर्न एन्सेफलायटीस).

प्रतिक्रिया दरम्यान काय होते?

प्रतिक्रिया स्वतः रासायनिकदृष्ट्या सोपी आहे. रक्ताचा एक थेंब, केस, त्वचेचा तुकडा इत्यादी प्रतिक्रियांसाठी डीएनएचा स्रोत म्हणून काम करू शकतात. सिद्धांतानुसार, प्रतिक्रियेसाठी योग्य अभिकर्मक, चाचणी ट्यूब, जैविक सामग्रीचा नमुना आणि उष्णता स्त्रोत आवश्यक आहे.

जैविक सामग्रीसह नमुन्यात रोगजनकांचे फक्त एक किंवा काही डीएनए रेणू असले तरीही पॉलिमरेझ प्रतिक्रियामुळे संसर्ग शोधणे शक्य होते.

प्रतिक्रिया दरम्यान, डीएनए पॉलिमरेझ एंझाइममुळे, दुप्पट होते ( प्रतिकृती) डीएनएचा विभाग. डीऑक्सीरिबोन्यूक्लिक अॅसिड स्वतः थोडक्यात डीएनए) हे आमच्यासाठी महत्त्वाचे आहे कारण ते कन्या पेशींमध्ये अनुवांशिक माहितीचे संचयन आणि प्रसारण सुनिश्चित करते. डीएनएमध्ये सर्पिलचे स्वरूप असते, ज्यामध्ये पुनरावृत्ती होणारे ब्लॉक्स असतात. हे ब्लॉक्स न्यूक्लियोटाइड्स बनवतात, जे डीएनएचे सर्वात लहान एकक आहेत. न्यूक्लियोटाइड्स अमीनो ऍसिडपासून तयार होतात.

डीएनएच्या भागांची प्रतिकृती बनवण्याची प्रक्रिया पुनरावृत्ती चक्रांदरम्यान होते. अशा प्रत्येक चक्रात, केवळ मूळ डीएनए तुकडा कॉपी आणि दुप्पट केला जात नाही, तर त्या तुकड्यांचा देखील जो आधीच्या प्रवर्धन चक्रात दुप्पट झाला आहे. हे सर्व भौमितिक प्रगतीच्या प्रक्रियेसारखे दिसते.

अस्तित्वात:

• नैसर्गिक प्रवर्धन ( म्हणजेच डीएनए कॉपी आणि गुणाकार करण्याची प्रक्रिया), जी आपल्या शरीरात उद्भवते आणि एक निश्चित, पूर्वनिर्धारित प्रक्रिया आहे.
• कृत्रिम प्रवर्धन, जे पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शनमुळे होते. या प्रकरणात, कॉपी करण्याची प्रक्रिया नियंत्रित केली जाते आणि न्यूक्लिक अॅसिडच्या अगदी लहान भागांची नक्कल करणे शक्य करते.

प्रत्येक कॉपीिंग सायकल पूर्ण झाल्यानंतर, न्यूक्लिक अॅसिडच्या तुकड्यांची संख्या वेगाने वाढते. म्हणूनच या प्रक्रियेलाच ‘चेन रिअॅक्शन’ म्हणतात.

तीस ते चाळीस चक्रांनंतर, तुकड्यांची संख्या अनेक अब्जांपर्यंत पोहोचते.

प्रवर्धनासाठी ग्लासमध्ये (ग्लासमध्ये) निदानासाठी घेतलेल्या बायोमेडियममध्ये विशिष्ट परदेशी डीएनए तुकडा उपस्थित असणे आवश्यक आहे ( म्हणजेच, रुग्णाचा डीएनए नाही तर रोगजनक आहे). तयार केलेल्या सोल्युशनमध्ये कोणताही विशिष्ट तुकडा नसल्यास, पॉलिमरेझच्या कृती अंतर्गत साखळी प्रतिक्रिया सुरू होणार नाही. हे पीसीआरच्या उच्च विशिष्टतेची वस्तुस्थिती स्पष्ट करते.

पीसीआर डायग्नोस्टिक्सचे टप्पे

1. डीएनए चाचणी सामग्रीपासून वेगळे केले जाते.
2. न्यूक्लियोटाइड्सच्या विशेष द्रावणात डीएनए जोडला जातो.
3. द्रावण 90 - 95 अंश सेल्सिअस तापमानाला गरम केले जाते, जेणेकरून डीएनए प्रथिने दुमडली जातात.
4. तापमान 60 अंशांपर्यंत कमी करा.
5. जसजसे तापमान वाढणे आणि पडणे या चक्रांची पुनरावृत्ती होते, तसतसे न्यूक्लिक अॅसिड विभागांची संख्या वाढते.

6. इलेक्ट्रोफोरेसीस आयोजित करून, परिणाम सारांशित केला जातो आणि दुप्पट होण्याचे परिणाम मोजले जातात.

या निदानाचे फायदे काय आहेत?

• अष्टपैलुत्व: कोणताही न्यूक्लिक अॅसिड नमुना या पद्धतीसाठी योग्य आहे.
• उच्च विशिष्टता: रोगजनकात विशिष्ट डीएनए अनुक्रम असतात. म्हणून, केलेल्या पीसीआरचे परिणाम विश्वसनीय असतील, एका रोगजनकाच्या जनुकास दुसर्या रोगजनकाच्या जनुकासह गोंधळात टाकणे अशक्य आहे.
• रोगजनकांच्या अगदी एका रेणूच्या उपस्थितीसाठी संवेदनशीलता.

• संशोधनासाठी आवश्यक असलेली थोडीशी सामग्री. रक्ताचा एक थेंब सुद्धा चालेल. बालरोग, निओनॅटोलॉजिकल, न्यूरोलॉजिकल संशोधन तसेच फॉरेन्सिक औषधांच्या सरावासाठी किमान नमुना प्रमाण वापरून निकाल मिळविण्याची क्षमता खूप महत्त्वाची आहे.
• आळशी, तीव्र संसर्ग ओळखण्याची क्षमता आणि केवळ तीव्र नाही.
• अनेक रोग निर्माण करणाऱ्या संस्कृतींना चाचणी ट्यूबमध्ये इतर पद्धतींनी संवर्धन करणे फार कठीण असते आणि पॉलिमरेझ अभिक्रियामुळे संस्कृतीचा योग्य प्रमाणात प्रसार होऊ शकतो.

या निदानाचे तोटे काय आहेत?

• जर पीसीआरसाठी अभिप्रेत असलेल्या सामग्रीमध्ये केवळ जिवंत रोगजनकाचाच नाही तर मृत व्यक्तीचा डीएनए असेल तर दोन्ही डीएनए वाढवले ​​जातील. त्यानुसार, निदानानंतरचे उपचार पूर्णपणे योग्य असू शकत नाहीत. काही काळानंतर, उपचारांच्या प्रभावीतेवर नियंत्रण ठेवणे चांगले आहे.
• सूक्ष्मजीवांच्या उपस्थितीसाठी अतिसंवेदनशीलता देखील एक गैरसोय मानली जाऊ शकते. तथापि, सामान्यत: मानवी शरीरात एक सशर्त रोगजनक मायक्रोफ्लोरा असतो, म्हणजेच हे सूक्ष्मजीव आहेत जे आतडे, पोट आणि इतर अंतर्गत अवयवांमध्ये राहतात. हे सूक्ष्मजीव एखाद्या व्यक्तीला विशिष्ट प्रतिकूल परिस्थितीतच हानी पोहोचवू शकतात - स्वच्छतेच्या आवश्यकतांचे पालन न करणे, दूषित पिण्याचे पाणी इ. पीसीआर तंत्र या सूक्ष्मजीवांचे डीएनए वाढवते, जरी ते पॅथॉलॉजीकडे नेत नाहीत.
• वेगवेगळ्या चाचणी प्रणालींचे पीसीआर परिणाम दर्शवू शकतात जे एकमेकांपेक्षा वेगळे असतील. या तंत्रात अनेक बदल आहेत: घरटे», « असममित», « उलटा», « परिमाणात्मक» पीसीआर आणि इतर.

शिक्षणासाठी फेडरल एजन्सी

राज्य शैक्षणिक संस्था

उच्च व्यावसायिक शिक्षण

"केरेलियन स्टेट पेडॅगॉजिकल अकादमी"

विषयावरील अभ्यासक्रम:

पॉलिमरेझ चेन रिएक्शन (पीसीआर) आणि त्याचा वापर

द्वारे पूर्ण: विद्यार्थी कोर्यागिना व्हॅलेरिया अलेक्झांड्रोव्हना

द्वारे तपासले: कार्पिकोवा नताल्या मिखाइलोव्हना

पेट्रोझाव्होडस्क 2013

परिचय

धडा 1 साहित्य समीक्षा

1.5.4 पठार प्रभाव

१.५.६ प्रवर्धन

निष्कर्ष

परिचय

जैविक, वैद्यकीय आणि कृषी विज्ञानांमध्ये आण्विक अनुवांशिक पद्धतींचा व्यापक परिचय करून गेल्या वीस वर्षांमध्ये चिन्हांकित केले गेले आहे.

1970 च्या दशकाच्या सुरुवातीस, असे दिसले की आण्विक जीवशास्त्र एका विशिष्ट प्रमाणात परिपूर्णतेपर्यंत पोहोचले आहे. या काळात, सूक्ष्मजीव हे आण्विक अनुवांशिक संशोधनाचे मुख्य उद्दिष्ट होते. युकेरियोट्सच्या संक्रमणाने संशोधकांना पूर्णपणे नवीन समस्या सादर केल्या ज्या त्या वेळी अस्तित्वात असलेल्या अनुवांशिक विश्लेषणाच्या पद्धती वापरून सोडवल्या जाऊ शकल्या नाहीत. आण्विक अनुवांशिकतेच्या विकासामध्ये एक नवीन प्रायोगिक साधन - निर्बंध एंडोन्यूक्लीजच्या उदयामुळे शक्य झाले. त्यानंतरच्या वर्षांत, गुणात्मक भिन्न दृष्टिकोनांवर आधारित थेट डीएनए विश्लेषण पद्धतींची संख्या वेगाने वाढू लागली.

बर्‍याच प्रकरणांमध्ये, आधुनिक तंत्रज्ञानामुळे विविध जीवांच्या अणु आणि बाह्य जीनोमच्या सूक्ष्म संरचनात्मक आणि कार्यात्मक संस्थेचा सखोल स्तरावर अभ्यास करणे शक्य झाले आहे. विविध रोगांचे निदान आणि उपचारांसाठी नवीन पद्धतींच्या विकासासाठी हे विशेष महत्त्व होते. लोकसंख्या जीवशास्त्र आणि प्रजनन मधील आण्विक अनुवांशिकतेच्या उपलब्धींचा उपयोग लोकसंख्या, जाती आणि जातींच्या अनुवांशिक परिवर्तनशीलतेची ओळख आणि विश्लेषण करण्यासाठी, आर्थिकदृष्ट्या मौल्यवान व्यक्तींना ओळखण्यासाठी आणि प्रमाणित करण्यासाठी, अनुवांशिकरित्या सुधारित जीव तयार करण्यासाठी आणि इतर समस्यांचे निराकरण करण्यासाठी वापरण्याची शक्यता कमी महत्त्वाची नव्हती.

प्रत्येक पद्धतीचे स्वतःचे फायदे आणि तोटे आहेत. उद्भवलेल्या सर्व समस्यांचे निराकरण करणारी कोणतीही सार्वत्रिक पद्धत नाही. म्हणून, चालू संशोधनासाठी विशिष्ट पद्धतीची निवड ही कोणत्याही वैज्ञानिक कार्याच्या सर्वात महत्वाच्या टप्प्यांपैकी एक आहे.

धडा 1 साहित्य समीक्षा

1.1 पॉलिमरेझ चेन रिएक्शन (PCR) च्या शोधाचा इतिहास

1983 मध्ये के.बी. Mullis et al. ने पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शन (PCR) पद्धत प्रकाशित आणि पेटंट केली, ज्याचा न्यूक्लिक अॅसिड्सच्या संशोधन आणि वापराच्या सर्व क्षेत्रांवर गहन प्रभाव पडणार होता. आण्विक जीवशास्त्र आणि अनुवांशिकतेसाठी या पद्धतीचे महत्त्व इतके महान आणि स्पष्ट झाले की सात वर्षांनंतर लेखकाला रसायनशास्त्रातील नोबेल पारितोषिक देण्यात आले.

पद्धतीच्या वापराच्या सुरूवातीस, प्रत्येक गरम-कूलिंग चक्रानंतर, डीएनए पॉलिमरेझ प्रतिक्रिया मिश्रणात जोडणे आवश्यक होते, कारण ते डीएनए हेलिक्स चेन वेगळे करण्यासाठी आवश्यक असलेल्या उच्च तापमानात निष्क्रिय होते. प्रतिक्रिया प्रक्रिया तुलनेने अकार्यक्षम होती, त्यासाठी बराच वेळ आणि एंजाइम आवश्यक होते. 1986 मध्ये, पॉलिमरेझ साखळी प्रतिक्रिया पद्धतीमध्ये लक्षणीय सुधारणा झाली. थर्मोफिलिक बॅक्टेरियापासून डीएनए पॉलिमरेस वापरण्याचा प्रस्ताव आहे. हे एन्झाइम थर्मोस्टेबल असल्याचे सिद्ध झाले आणि अनेक प्रतिक्रिया चक्रांना तोंड देण्यास सक्षम होते. त्यांच्या वापरामुळे पीसीआर सुलभ आणि स्वयंचलित करणे शक्य झाले. पहिल्या थर्मोस्टेबल डीएनए पॉलिमरेसेसपैकी एक जीवाणूपासून वेगळे केले गेले थर्मस एक्वाटिकसआणि नाव दिले ताक- पॉलिमरेझ.

ज्याचा न्यूक्लियोटाइड क्रम ज्ञात आहे अशा कोणत्याही DNA विभागाला वाढवण्याची आणि PCR नंतर एकसंध स्वरूपात आणि तयारीच्या प्रमाणात मिळवण्याची शक्यता, PCR ला लहान DNA तुकड्यांच्या आण्विक क्लोनिंगसाठी पर्यायी पद्धत बनवते. या प्रकरणात, पारंपारिक क्लोनिंगमध्ये अनुवांशिक अभियांत्रिकीमध्ये वापरल्या जाणार्‍या जटिल पद्धतशीर तंत्रांचा वापर करण्याची आवश्यकता नाही. पीसीआर पद्धतीच्या विकासामुळे आण्विक आनुवंशिकी आणि विशेषतः अनुवांशिक अभियांत्रिकीच्या पद्धतशीर शक्यतांचा मोठ्या प्रमाणावर विस्तार झाला आहे, ज्यामुळे त्याच्या अनेक क्षेत्रांची वैज्ञानिक क्षमता आमूलाग्र बदलली आहे आणि मजबूत झाली आहे.

1.2 पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शनचे प्रकार (PCR)

· नेस्टेड पीसीआर- प्रतिक्रियेच्या उप-उत्पादनांची संख्या कमी करण्यासाठी वापरली जाते. प्राइमरच्या दोन जोड्या वापरा आणि सलग दोन प्रतिक्रिया करा. प्राइमरची दुसरी जोडी पहिल्या प्रतिक्रियेच्या उत्पादनामध्ये डीएनए क्षेत्र वाढवते.

· उलटा पीसीआर- जेव्हा इच्छित क्रमातील फक्त एक लहान क्षेत्र ओळखले जाते तेव्हा वापरले जाते. जीनोममध्ये डीएनए घातल्यानंतर शेजारचे अनुक्रम निश्चित करणे आवश्यक असताना ही पद्धत विशेषतः उपयुक्त आहे. इनव्हर्टेड पीसीआरच्या अंमलबजावणीसाठी, निर्बंध एंझाइमसह डीएनए कटची मालिका चालविली जाते.<#"justify">पॉलिमरेझ चेन रिएक्शन प्राइमर

· गट-विशिष्ट पीसीआर- नातेवाईकांसाठी पीसीआर<#"center">1.3 पॉलिमरेझ साखळी प्रतिक्रिया

1980 च्या दशकाच्या मध्यात सापडलेली, पॉलिमरेझ चेन रिएक्शन (PCR) मूळ नमुन्याच्या प्रतींची संख्या काही तासांत लाखो पटीने वाढवू शकते. प्रतिक्रियेच्या प्रत्येक चक्रादरम्यान, मूळ रेणूपासून दोन प्रती तयार होतात. प्रत्येक संश्लेषित डीएनए प्रती पुढील चक्रात नवीन डीएनए प्रतींच्या संश्लेषणासाठी टेम्पलेट म्हणून काम करू शकतात. अशा प्रकारे, चक्रांची पुनरावृत्ती पुनरावृत्ती केल्याने प्रतींची संख्या वेगाने वाढते. 30 चक्र असले तरी मूळ रेणूच्या प्रतींची संख्या 1 अब्जाहून अधिक असेल हे गणनेवरून दिसून येते. जरी आपण हे लक्षात घेतले की प्रत्येक चक्रादरम्यान सर्व amplicons डुप्लिकेट केले जात नाहीत, तरीही एकूण प्रतींची संख्या ही खूप मोठी आहे.

पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शन (पीसीआर) च्या प्रत्येक चक्रात खालील चरण असतात:

· विकृतीकरण - तापमानात वाढ झाल्यामुळे दुहेरी अडकलेल्या डीएनए रेणूचे विघटन होते आणि दोन एकल-असरलेल्या रेणूंमध्ये विभागले जाते;

· एनीलिंग - तापमान कमी केल्याने प्राइमर्स डीएनए रेणूच्या पूरक क्षेत्रांशी संलग्न होऊ शकतात;

· वाढवणे - एन्झाइम डीएनए पॉलिमरेझ पूरक स्ट्रँड पूर्ण करते.

निवडलेल्या तुकड्याच्या प्रवर्धनासाठी, विशिष्ट डीएनए प्रदेशाच्या बाजूने दोन ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर्स (बिया) वापरले जातात. प्राइमर्स ओरिएंटेड 3 - एकमेकांच्या दिशेने आणि विस्तारित करणे आवश्यक असलेल्या क्रमाच्या दिशेने समाप्त होते. डीएनए पॉलिमरेझ प्राइमर्सपासून सुरू होणार्‍या परस्पर पूरक डीएनए साखळ्यांचे संश्लेषण (पूर्ण) करते. डीएनए संश्लेषणादरम्यान, प्राइमर्स भौतिकरित्या नव्याने संश्लेषित डीएनए रेणूंच्या साखळीत घातले जातात. प्राइमरपैकी एक वापरून तयार केलेल्या DNA रेणूचा प्रत्येक स्ट्रँड इतर प्राइमर वापरून पूरक DNA स्ट्रँडच्या संश्लेषणासाठी टेम्पलेट म्हणून काम करू शकतो.

1.4 पॉलिमरेज चेन रिअॅक्शन (PCR) आयोजित करणे

पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शन विशेष पातळ-भिंती असलेल्या पॉलीप्रोपायलीन टेस्ट ट्यूबमध्ये चालते, वापरलेल्या थर्मल सायकलर (अ‍ॅम्प्लीफायर) शी सुसंगत - एक उपकरण जे पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शन (पीसीआर) च्या टप्प्यांचे तापमान आणि वेळ वैशिष्ट्ये नियंत्रित करते. .

1.5 पॉलिमरेज साखळी प्रतिक्रिया पद्धतीचे तत्त्व

पॉलिमरेझ चेन रिएक्शन (पीसीआर) ही एक इन विट्रो डीएनए प्रवर्धन पद्धत आहे जी काही तासांच्या आत विशिष्ट डीएनए अनुक्रम अब्जावधी वेळा अलग आणि गुणाकार करू शकते. जीनोमच्या एका काटेकोरपणे परिभाषित प्रदेशाच्या मोठ्या संख्येने प्रती मिळविण्याची क्षमता विद्यमान डीएनए नमुन्याचा अभ्यास मोठ्या प्रमाणात सुलभ करते.

पॉलिमरेज साखळी प्रतिक्रिया पार पाडण्यासाठी, अनेक अटी पूर्ण केल्या पाहिजेत:

1.5.1 प्रतिक्रिया मिश्रणात अनेक घटकांची उपस्थिती

प्रतिक्रिया (PCR) मिश्रणाचे मुख्य घटक आहेत: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, न्यूक्लियोटाइड ट्रायफॉस्फेट्स (ATP, GTP, CTP, TTP), प्राइमर्स (ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स), विश्लेषित डीएनए तयारी, थर्मोस्टेबल डीएनए पॉलिमरेझ यांचे मिश्रण. प्रतिक्रिया मिश्रणातील प्रत्येक घटक थेट पॉलिमरेझ चेन रिएक्शन (PCR) मध्ये गुंतलेला असतो आणि अभिकर्मकांच्या एकाग्रतेचा थेट प्रवर्धनाच्या प्रक्रियेवर परिणाम होतो.

· ट्रिस-एचसीएल - प्रतिक्रिया मिश्रणाचा पीएच निर्धारित करते, बफर क्षमता तयार करते. डीएनए पॉलिमरेझची क्रिया माध्यमाच्या पीएचवर अवलंबून असते, म्हणून पीएचचे मूल्य थेट पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शनच्या कोर्सवर परिणाम करते. सहसा pH मूल्य 8 - 9.5 च्या श्रेणीत असते. उच्च पीएच हे या वस्तुस्थितीमुळे होते की तापमान वाढते तसतसे ट्रिल-एचसीएल बफरचे पीएच कमी होते.

· KCl - 50 मिमी पर्यंत पोटॅशियम क्लोराईड एकाग्रता विकृतीकरण आणि एनीलिंग प्रक्रियेवर परिणाम करते, 50 मिमी वरील एकाग्रता डीएनए पॉलिमरेझला प्रतिबंधित करते.

· MgCl 2- कारण DNA पॉलिमरेज Mg आहे 2+- अवलंबित सजीवांच्या शरीरात निर्मार्ण होणारे द्रव्य, नंतर मॅग्नेशियम आयनची एकाग्रता एंझाइमच्या क्रियाकलापांवर परिणाम करते (Mg 2+एनटीपीसह कॉम्प्लेक्स तयार करतात - हे कॉम्प्लेक्स पॉलिमरेझसाठी सब्सट्रेट आहेत). उच्च एकाग्रतेमुळे विशिष्ट नसलेल्या प्रवर्धनात वाढ होते आणि कमी प्रमाणामुळे प्रतिक्रिया थांबते, इष्टतम (विविध पॉलिमरेसेससाठी) 0.5 - 5 मिमी क्षेत्रामध्ये असते. याव्यतिरिक्त, मॅग्नेशियम क्षारांची एकाग्रता विकृतीकरण आणि एनीलिंग प्रक्रियेवर परिणाम करते - एमजीच्या एकाग्रतेत वाढ 2+DNA च्या वितळण्याच्या तापमानात वाढ होण्यास कारणीभूत ठरते (म्हणजे, ज्या तापमानात 50% दुहेरी-असरलेल्या DNA स्ट्रँड्स एकल-असरलेल्या स्ट्रँडमध्ये मोडतात).

· NTP - न्यूक्लियोटाइड ट्रायफॉस्फेट्स हे न्यूक्लिक अॅसिडचे थेट मोनोमर आहेत. साखळी संपुष्टात येण्यापासून रोखण्यासाठी, सर्व चार न्यूक्लियोटाइड ट्रायफॉस्फेट्सचे समान गुणोत्तर शिफारसीय आहे. प्रतिक्रिया मिश्रणात या घटकांची कमी एकाग्रता पूरक डीएनए स्ट्रँडच्या बांधकामातील त्रुटींची संभाव्यता वाढवते.

· प्राइमर्स - सर्वात इष्टतम म्हणजे वितळण्याच्या बिंदूमध्ये 2 - 4 पेक्षा जास्त फरक नसलेल्या प्राइमर्सचा वापर o C. कधी कधी 4 तापमानात दीर्घकालीन स्टोरेज दरम्यान o मोठ्या प्रमाणात फ्रीझिंगसह किंवा नंतर - वितळणारे प्राइमर्स दुय्यम संरचना तयार करतात - डायमर, पीसीआरची कार्यक्षमता कमी करतात. या समस्येचे निर्मूलन पाण्याच्या बाथमध्ये उष्मायनात कमी केले जाते (T=95 o क) 3 मिनिटांसाठी आणि त्यानंतर 0o पर्यंत जलद थंड होणे पासून.

· डीएनए तयारी - डीएनए तयारीचे प्रमाण आणि गुणवत्ता (मॅट्रिक्स) पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शनच्या कोर्स आणि पॅरामीटर्सवर थेट परिणाम करते. अतिरिक्त डीएनए नमुना पॉलिमरेज चेन रिअॅक्शन (पीसीआर) प्रतिबंधित करते. डीएनए तयारीमधील विविध पदार्थांच्या अशुद्धतेमुळे पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शन (पीसीआर) ची कार्यक्षमता कमी होऊ शकते: सोडियम एसीटेट, सोडियम क्लोराईड, आयसोप्रोपॅनॉल, इथेनॉल, हेपरिन, फिनॉल, युरिया, हिमोग्लोबिन इ.

· डीएनए पॉलिमरेझ - थोड्या प्रमाणात डीएनए पॉलिमरेझ वापरताना, तुकड्यांच्या आकाराच्या थेट प्रमाणात अंतिम उत्पादनाच्या संश्लेषणात घट दिसून येते. 2 - 4 पट जास्त पॉलिमरेझमुळे डिफ्यूज स्पेक्ट्रा दिसू लागतो आणि 4 - 16 पट कमी आण्विक वजन नसलेला स्पेक्ट्रा दिसू लागतो. PCR मिश्रणाच्या 25 μl च्या दृष्टीने वापरलेल्या एकाग्रतेची श्रेणी 0.5 - 1.5 एकक क्रियाकलाप आहे.

पीसीआर मिश्रणाच्या मुख्य घटकांव्यतिरिक्त, अनेक अतिरिक्त पदार्थ वापरले जातात जे पीसीआरचे गुणात्मक आणि परिमाणवाचक निर्देशक सुधारतात: एसीटामाइड (5%) - मुख्य घटकांच्या विद्रव्यतेत वाढ; betaine (सोडियम मीठ) - डीएनए पॉलिमरेझचे स्थिरीकरण, डीएनएचा वितळण्याचा बिंदू कमी करणे, हळुवार बिंदू समान करणे; बोवाइन अल्ब्युमिन (10-100 μg / ml) - डीएनए पॉलिमरेझचे स्थिरीकरण; डायमिथाइल सल्फोक्साइड (1-10%) - मुख्य घटकांची विद्रव्यता वाढवणे; फॉर्मॅमाइड (2-10%) - एनीलिंगच्या विशिष्टतेत वाढ; ग्लिसरॉल (15-20%) - एंजाइमच्या थर्मल स्थिरतेत वाढ, डीएनए नमुन्याच्या विकृतीच्या तापमानात घट; अमोनियम सल्फेट - विकृतीकरण आणि एनीलिंगचे तापमान कमी करणे.

1.5.2 चक्र आणि तापमान

पॉलिमरेझ चेन रिएक्शन (पीसीआर) प्रोग्रामचे सामान्य दृश्य खालीलप्रमाणे आहे:

स्टेज डीएनए तयारी.1 चक्राचे दीर्घकाळापर्यंत प्राथमिक विकृतीकरण

स्टेज डीएनए तयारीचे जलद विकृतीकरण. धर्मशिक्षणाचे पहिले पुस्तक annealing. वाढवणे.30 - 45 चक्र.

स्टेज दीर्घकाळापर्यंत वाढवणे. प्रतिक्रिया मिश्रण थंड करणे. 1 चक्र.

स्टेजच्या प्रत्येक घटकामध्ये - विकृतीकरण, एनीलिंग, वाढवणे - वैयक्तिक तापमान आणि वेळ वैशिष्ट्ये आहेत. प्रवर्धन उत्पादनांच्या गुणात्मक आणि परिमाणवाचक निर्देशकांनुसार, प्रत्येक घटकाचे तापमान आणि प्रवाह कालावधीचे मापदंड प्रायोगिकपणे निवडले जातात.

विकृतीकरण. पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शनच्या या घटकादरम्यान, दुहेरी-अडकलेला DNA रेणू दोन सिंगल-स्ट्रँडेडमध्ये विभागला जातो. विकृतीकरणाचे तापमान मापदंड 90 - 95 च्या श्रेणीत आहेत o सी, परंतु ग्वानिन आणि सायटोसिनची उच्च सामग्री असलेल्या डीएनए नमुन्याच्या बाबतीत, तापमान 98 पर्यंत वाढवावे. o C. विकृतीकरणाचे तापमान पूर्णपणे विकृत होण्यासाठी पुरेसे असावे - DNA स्ट्रँड्स क्लीव्ह करा आणि "अचानक थंड होणे" किंवा जलद अॅनिलिंग टाळा, तथापि, थर्मोस्टेबल डीएनए पॉलिमरेज उच्च तापमानात कमी स्थिर असते. अशाप्रकारे, प्राइमर/नमुना प्रमाण (DNA तयारी) साठी इष्टतम विकृती तापमान मापदंडांची निवड ही प्रवर्धनासाठी एक महत्त्वाची अट आहे. पहिल्या चरणात विकृतीकरण तापमान 95 च्या वर असल्यास o सी, प्राथमिक विकृतीकरणानंतर प्रतिक्रिया मिश्रणात डीएनए पॉलिमरेझ जोडण्याची शिफारस केली जाते. पॉलिमरेझ चेन रिएक्शन (पीसीआर) दरम्यान स्टेजच्या या घटकाचा कालावधी पूर्ण डीएनए विकृतीकरणासाठी पुरेसा असावा, परंतु त्याच वेळी दिलेल्या तापमानात डीएनए पॉलिमरेझच्या क्रियाकलापांवर लक्षणीय परिणाम होत नाही.

एनीलिंग. एनीलिंग तापमान (टी a ) हे पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शनचे सर्वात महत्वाचे पॅरामीटर्सपैकी एक आहे. प्रत्येक विशिष्ट प्राइमरसाठी एनीलिंग तापमान वैयक्तिकरित्या निवडले जाते. हे प्राइमरची लांबी आणि न्यूक्लियोटाइड रचना यावर अवलंबून असते. सहसा ते 2 - 4 ने कमी होते o वितळण्याच्या बिंदू मूल्यापासून (टी मी ) प्राइमर. जर सिस्टीमचे अॅनिलिंग तापमान इष्टतमपेक्षा कमी असेल, तर विशिष्ट नसलेल्या प्रवर्धित तुकड्यांची संख्या वाढते आणि याउलट, उच्च तापमान वाढीव उत्पादनांची संख्या कमी करते. या प्रकरणात, पॉलिमरेझ चेन रिएक्शन (पीसीआर) च्या प्रतिबंधापर्यंत, विशिष्ट अॅम्प्लिकॉनची एकाग्रता झपाट्याने कमी होऊ शकते. एनीलिंगची वेळ वाढवण्यामुळे विशिष्ट नसलेल्या अँप्लिकॉनच्या संख्येतही वाढ होते.

वाढवणे. सामान्यतः, प्रत्येक प्रकारच्या थर्मोस्टेबल डीएनए पॉलिमरेझचे वैयक्तिक तापमान इष्टतम क्रियाकलाप असते. एंजाइमद्वारे पूरक डीएनए स्ट्रँडच्या संश्लेषणाचा दर देखील प्रत्येक पॉलिमरेझसाठी विशिष्ट मूल्य आहे (सरासरी, ते 30-60 न्यूक्लियोटाइड्स प्रति सेकंद किंवा 1-2 हजार बेस्स प्रति मिनिट आहे), त्यामुळे वाढण्याची वेळ अवलंबून निवडली जाते. डीएनए पॉलिमरेझच्या प्रकारावर आणि विस्तारित प्रदेशाच्या लांबीवर.

1.5.3 प्राइमर निवडीची मूलभूत तत्त्वे

पीसीआर चाचणी प्रणाली तयार करताना, मुख्य कार्यांपैकी एक म्हणजे प्राइमर्सची योग्य निवड ज्याने अनेक निकष पूर्ण केले पाहिजेत:

प्राइमर्स विशिष्ट असणे आवश्यक आहे. 3 वर विशेष लक्ष दिले जाते - प्राइमर्सची टोके, कारण त्यांच्यापासूनच टाक पॉलिमरेझ पूरक डीएनए साखळी पूर्ण करण्यास सुरवात करते. जर त्यांची विशिष्टता अपुरी असेल, तर चाचणी ट्यूबमध्ये प्रतिक्रिया मिश्रणासह अवांछित प्रक्रिया घडण्याची शक्यता आहे, म्हणजे, विशिष्ट नसलेल्या डीएनएचे संश्लेषण (लहान किंवा लांब तुकडे). हे जड किंवा हलके अतिरिक्त बँडच्या स्वरूपात इलेक्ट्रोफोरेसीसवर दृश्यमान आहे. यामुळे प्रतिक्रियेच्या परिणामांचे मूल्यांकन करणे कठीण होते, कारण संश्लेषित परदेशी डीएनएसह विशिष्ट प्रवर्धन उत्पादनास गोंधळात टाकणे सोपे आहे. प्राइमर्स आणि डीएनटीपीचा काही भाग विशिष्ट नसलेल्या डीएनएच्या संश्लेषणासाठी वापरला जातो, ज्यामुळे संवेदनशीलतेचे लक्षणीय नुकसान होते.

प्राइमर्सने डायमर आणि लूप बनवू नयेत, म्हणजे. प्राइमरला स्वतःला किंवा एकमेकांना जोडून कोणतेही स्थिर दुहेरी स्ट्रँड तयार केले जाऊ नये.

1.5.4 पठार प्रभाव

हे लक्षात घेतले पाहिजे की विशिष्ट प्रवर्धन उत्पादनांच्या संचयनाची प्रक्रिया वेगाने केवळ मर्यादित काळ टिकते आणि नंतर त्याची कार्यक्षमता गंभीरपणे कमी होते. हे तथाकथित "पठार" प्रभावामुळे आहे.

मुदतीचा प्रभाव पठार प्रवर्धनाच्या शेवटच्या चक्रांमध्ये पीसीआर उत्पादनांच्या संचयनाच्या प्रक्रियेचे वर्णन करण्यासाठी वापरले जाते.

परिणाम प्राप्त होताना परिस्थिती आणि प्रवर्धन अभिक्रियाच्या चक्रांची संख्या यावर अवलंबून पठार सब्सट्रेट्सचा वापर (dNTPs आणि primers), reactants (dNTPs आणि enzyme) ची स्थिरता, pyrophosphates आणि DNA डुप्लेक्ससह इनहिबिटरची संख्या, विशिष्ट नसलेल्या उत्पादनांसह किंवा प्राइमर-डायमरसह अभिक्रियांसाठी स्पर्धा, विशिष्ट उत्पादनाची एकाग्रता , आणि प्रवर्धन उत्पादनांच्या उच्च सांद्रतेवर अपूर्ण विकृतीकरण प्रभावित होते.

लक्ष्य डीएनएची प्रारंभिक एकाग्रता जितकी कमी असेल तितकी प्रतिक्रिया होण्याचा धोका जास्त असतो पठार). विशिष्ट प्रवर्धन उत्पादनांच्या संख्येचे विश्लेषण करण्यासाठी पुरेसा होण्यापूर्वी हा बिंदू येऊ शकतो. केवळ चांगल्या-अनुकूलित चाचणी प्रणाली हे टाळू शकतात.

1.5.5 जैविक सामग्रीचा नमुना तयार करणे

डीएनए काढण्यासाठी वेगवेगळ्या तंत्रांचा वापर केला जातो, कार्यांवर अवलंबून. त्यांचे सार जैविक उत्पादनातून डीएनए काढणे (निष्कासन) आणि पीसीआरसाठी योग्य शुद्धतेसह डीएनए तयार करण्यासाठी परदेशी अशुद्धता काढून टाकणे किंवा तटस्थ करणे यात आहे.

मार्मुरने वर्णन केलेले शुद्ध डीएनए तयार करण्याची पद्धत मानक मानली जाते आणि ती आधीपासूनच शास्त्रीय बनली आहे. त्यात एन्झाइमॅटिक प्रोटीओलिसिस आणि त्यानंतर डीप्रोटीनायझेशन आणि अल्कोहोलसह डीएनए पुनरावृत्ती समाविष्ट आहे. या पद्धतीमुळे शुद्ध डीएनए तयार करणे शक्य होते. तथापि, हे खूप कष्टदायक आहे आणि त्यात फिनॉल आणि क्लोरोफॉर्म सारख्या आक्रमक आणि तिखट पदार्थांसह कार्य करणे समाविष्ट आहे.

सध्या लोकप्रिय पद्धतींपैकी एक म्हणजे बूम एट अल यांनी प्रस्तावित केलेली डीएनए काढण्याची पद्धत. ही पद्धत सेल लाइसिससाठी मजबूत कॅओट्रॉपिक एजंट, ग्वानिडाइन थायोसायनेट (GuSCN) च्या वापरावर आधारित आहे आणि त्यानंतरच्या वाहकांवर (काचेचे मणी, डायटोमेशियस पृथ्वी, काचेचे दूध इ.) डीएनए वर्गीकरण. वॉशिंगनंतर, डीएनए कॅरियरवर शोषलेल्या नमुन्यात राहते, ज्यामधून ते इलुशन बफर वापरून सहजपणे काढले जाऊ शकते. पद्धत सोयीस्कर, तांत्रिकदृष्ट्या प्रगत आणि प्रवर्धनासाठी नमुना तयार करण्यासाठी योग्य आहे. तथापि, वाहकावरील अपरिवर्तनीय सॉर्प्शनमुळे तसेच असंख्य वॉश दरम्यान डीएनए नुकसान शक्य आहे. नमुन्यातील डीएनएच्या थोड्या प्रमाणात काम करताना हे विशेषतः महत्वाचे आहे. शिवाय, गुएससीएनची ट्रेस रक्कम देखील पीसीआरला प्रतिबंधित करू शकते. म्हणून, ही पद्धत वापरताना, सॉर्बेंटची योग्य निवड आणि तांत्रिक बारकावे काळजीपूर्वक पाळणे खूप महत्वाचे आहे.

नमुना तयार करण्याच्या पद्धतींचा आणखी एक गट चिलेक्स प्रकारच्या आयन एक्सचेंजर्सच्या वापरावर आधारित आहे, जे, काचेच्या विपरीत, डीएनए नाही तर उलट, प्रतिक्रियेमध्ये व्यत्यय आणणारी अशुद्धता. नियमानुसार, या तंत्रज्ञानामध्ये दोन टप्प्यांचा समावेश आहे: आयन एक्सचेंजरवर नमुना उकळणे आणि अशुद्धतेचे शोषण. अंमलबजावणीच्या साधेपणामुळे पद्धत अत्यंत आकर्षक आहे. बर्याच बाबतीत, ते क्लिनिकल सामग्रीसह कार्य करण्यासाठी योग्य आहे. दुर्दैवाने, कधीकधी अशुद्धतेचे नमुने असतात जे आयन एक्सचेंजर्स वापरुन काढले जाऊ शकत नाहीत. याव्यतिरिक्त, काही सूक्ष्मजीव साध्या उकळण्याद्वारे नष्ट केले जाऊ शकत नाहीत. या प्रकरणांमध्ये, नमुना प्रक्रियेचे अतिरिक्त टप्पे सादर करणे आवश्यक आहे.

अशाप्रकारे, नमुना तयार करण्याच्या पद्धतीच्या निवडीमध्ये उद्दिष्ट असलेल्या विश्लेषणाच्या उद्देशांबद्दल समजून घेतले पाहिजे.

१.५.६ प्रवर्धन

प्रवर्धन प्रतिक्रिया पार पाडण्यासाठी, प्रतिक्रिया मिश्रण तयार करणे आणि त्यात विश्लेषित डीएनए नमुना जोडणे आवश्यक आहे. या प्रकरणात, प्राइमर अॅनिलिंगची काही वैशिष्ट्ये विचारात घेणे आवश्यक आहे. वस्तुस्थिती अशी आहे की, एक नियम म्हणून, विश्लेषित जैविक नमुन्यात विविध डीएनए रेणू आहेत, ज्यासाठी प्रतिक्रियेत वापरल्या जाणार्‍या प्राइमर्समध्ये आंशिक आणि काही बाबतीत महत्त्वपूर्ण, समरूपता असते. याव्यतिरिक्त, प्राइमर-डायमर तयार करण्यासाठी प्राइमर एकमेकांना जोडू शकतात. दोन्ही बाजूंच्या (नॉन-स्पेसिफिक) प्रतिक्रिया उत्पादनांच्या संश्लेषणासाठी प्राइमर्सचा महत्त्वपूर्ण वापर करतात आणि परिणामी, सिस्टमची संवेदनशीलता लक्षणीयरीत्या कमी करतात. यामुळे इलेक्ट्रोफोरेसीस दरम्यान प्रतिक्रियांचे परिणाम वाचणे कठीण किंवा अशक्य होते.

1.6 मानक पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रणाची रचना

x पीसीआर बफर (100 एमएम ट्रिस-एचसीएल सोल्यूशन, पीएच 9.0, 500 एमएम केसीएल सोल्यूशन, 25 एमएम एमजीसीएल 2 सोल्यूशन ) …….2.5 μl

पाणी (मिलीक्यू) ……………………………………………………….१८.८ μl

न्यूक्लियोटाइड ट्रायफॉस्फेट्सचे मिश्रण (dNTPs)

प्रत्येकाचे mM द्रावण……………………………………………………….0.5 μl

प्राइमर 1 (10 मिमी द्रावण) ………………………………………………….1 μl

प्राइमर 2 (10 मिमी द्रावण) ………………………………………………….1 μl

DNA पॉलिमरेझ (5 युनिट / μl) ……………………………………………… ०.२ μl

DNA नमुना (20 ng/µl) …………………………………………..1 µl

1.7 प्रतिक्रिया परिणामांचे मूल्यांकन

पीसीआरच्या परिणामांचे अचूक मूल्यांकन करण्यासाठी, ही पद्धत परिमाणात्मक नाही हे समजून घेणे आवश्यक आहे. सैद्धांतिकदृष्ट्या, एकल लक्ष्य डीएनए रेणूंचे प्रवर्धन उत्पादने 30-35 चक्रांनंतर इलेक्ट्रोफोरेसीसद्वारे शोधले जाऊ शकतात. तथापि, व्यवहारात हे केवळ अशा प्रकरणांमध्ये केले जाते जेव्हा प्रतिक्रिया आदर्शाच्या जवळच्या परिस्थितीत घडते, जी जीवनात सहसा येत नाही. डीएनए तयारीच्या शुद्धतेची डिग्री प्रवर्धनाच्या कार्यक्षमतेवर विशेषतः मोठा प्रभाव आहे; प्रतिक्रिया मिश्रणात विशिष्ट अवरोधकांची उपस्थिती, ज्यापासून काही प्रकरणांमध्ये सुटका करणे अत्यंत कठीण असू शकते. कधीकधी, त्यांच्या उपस्थितीमुळे, हजारो लक्ष्यित डीएनए रेणू देखील वाढवणे शक्य नसते. अशा प्रकारे, लक्ष्य डीएनएची प्रारंभिक रक्कम आणि प्रवर्धक उत्पादनांची अंतिम रक्कम यांच्यात सहसा थेट संबंध नसतो.

धडा 2: पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शनचे अनुप्रयोग

पीसीआरचा वापर अनेक क्षेत्रांमध्ये विश्लेषणासाठी आणि वैज्ञानिक प्रयोगांमध्ये केला जातो.

गुन्हेगारी

पीसीआरचा वापर तथाकथित "अनुवांशिक फिंगरप्रिंट्स" ची तुलना करण्यासाठी केला जातो. आम्हाला गुन्ह्याच्या ठिकाणाहून अनुवांशिक सामग्रीचा नमुना हवा आहे - रक्त, लाळ, वीर्य, ​​केस इ. त्याची तुलना संशयिताच्या अनुवांशिक सामग्रीशी केली जाते. सैद्धांतिकदृष्ट्या - एक प्रत - डीएनएची फारच लहान रक्कम पुरेसे आहे. डीएनए तुकड्यांमध्ये कापला जातो, नंतर पीसीआरद्वारे वाढविला जातो. डीएनए इलेक्ट्रोफोरेसीसद्वारे तुकडे वेगळे केले जातात. डीएनए बँडच्या स्थानाच्या परिणामी चित्राला अनुवांशिक फिंगरप्रिंट म्हणतात.

पितृत्वाची स्थापना करणे

PCR द्वारे विस्तारित डीएनए तुकड्यांच्या इलेक्ट्रोफोरेसीसचे परिणाम. वडील. मूल. आई. मुलाला दोन्ही पालकांच्या अनुवांशिक छापाची काही वैशिष्ट्ये वारशाने मिळाली, ज्याने एक नवीन, अद्वितीय ठसा दिला.

जरी "अनुवांशिक फिंगरप्रिंट्स" अद्वितीय आहेत, तरीही अशा अनेक बोटांचे ठसे बनवून कौटुंबिक संबंध स्थापित केले जाऊ शकतात. हीच पद्धत जीवांमध्ये उत्क्रांती संबंध प्रस्थापित करण्यासाठी, थोड्या बदलांसह लागू केली जाऊ शकते.

वैद्यकीय निदान

पीसीआरमुळे आनुवंशिक आणि विषाणूजन्य रोगांचे निदान लक्षणीयरीत्या वेगवान आणि सुलभ करणे शक्य होते. योग्य प्राइमर्स वापरून PCR द्वारे आवडीचे जनुक वाढवले ​​जाते आणि नंतर उत्परिवर्तन निश्चित करण्यासाठी क्रमबद्ध केले जाते. विषाणूजन्य संसर्ग संसर्गानंतर लगेचच आढळून येतो, रोगाची लक्षणे दिसण्यापूर्वी आठवडे किंवा महिने.

वैयक्तिकृत औषध

कधीकधी औषधे काही रुग्णांसाठी विषारी किंवा ऍलर्जीक असतात. याची कारणे काही प्रमाणात औषधे आणि त्यांच्या डेरिव्हेटिव्ह्जची संवेदनशीलता आणि चयापचय मधील वैयक्तिक फरक आहेत. हे फरक अनुवांशिक पातळीवर निश्चित केले जातात. उदाहरणार्थ, एका रुग्णामध्ये, एक विशिष्ट सायटोक्रोम अधिक सक्रिय असू शकतो, दुसर्यामध्ये - कमी. दिलेल्या रुग्णाला कोणत्या प्रकारचे सायटोक्रोम आहे हे निर्धारित करण्यासाठी, औषध वापरण्यापूर्वी पीसीआर विश्लेषण करणे प्रस्तावित आहे. या विश्लेषणाला प्राथमिक जीनोटाइपिंग म्हणतात.

जीन क्लोनिंग

जीन क्लोनिंग ही जनुकांना विलग करण्याची प्रक्रिया आहे आणि अनुवांशिक अभियांत्रिकी हाताळणीच्या परिणामी, दिलेल्या जनुकाचे उत्पादन मोठ्या प्रमाणात मिळवते. पीसीआरचा वापर जनुक वाढवण्यासाठी केला जातो, जो नंतर व्हेक्टरमध्ये घातला जातो, डीएनएचा एक तुकडा जो परदेशी जनुक त्याच जीवामध्ये किंवा दुसर्या जीवामध्ये वाहून नेतो जो वाढण्यास सोपा असतो. वेक्टर म्हणून, उदाहरणार्थ, प्लाझमिड्स किंवा व्हायरल डीएनए वापरले जातात. परकीय जीवामध्ये जीन्स घालणे सहसा या जनुकाचे उत्पादन - आरएनए किंवा बहुतेकदा प्रथिने मिळविण्यासाठी वापरले जाते. अशा प्रकारे, अनेक प्रथिने शेती, औषधी इत्यादींसाठी औद्योगिक प्रमाणात मिळतात.

डीएनए अनुक्रम

फ्लोरोसेंट लेबल किंवा रेडिओएक्टिव्ह आयसोटोपसह लेबल केलेल्या डिडिओक्सिन्युक्लियोटाइड्सचा वापर करून पीसीआर हा अनुक्रम पद्धतीचा एक अविभाज्य भाग आहे, कारण पॉलिमरायझेशन दरम्यान फ्लोरोसेंट किंवा रेडिओएक्टिव्ह लेबल असलेल्या न्यूक्लियोटाइड्सचे डेरिव्हेटिव्ह डीएनए साखळीमध्ये घातले जातात. हे प्रतिक्रिया थांबवते, ज्यामुळे जेलमधील संश्लेषित स्ट्रँड वेगळे केल्यानंतर विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड्सची स्थिती निश्चित केली जाऊ शकते.

म्युटाजेनेसिस

सध्या, पीसीआर ही म्युटाजेनेसिसची मुख्य पद्धत बनली आहे. पीसीआरच्या वापरामुळे म्युटाजेनेसिस प्रक्रिया सुलभ आणि वेगवान करणे तसेच ते अधिक विश्वासार्ह आणि पुनरुत्पादक बनवणे शक्य झाले.

पीसीआर पद्धतीमुळे या अभ्यासाच्या 40 वर्षांपूर्वी पॅराफिनमध्ये एम्बेड केलेल्या मानवी ग्रीवाच्या निओप्लाझमच्या बायोप्सी विभागांमध्ये मानवी पॅपिलोमाव्हायरस अनुक्रमांच्या उपस्थितीचे विश्लेषण करणे शक्य झाले. शिवाय, पीसीआरच्या मदतीने, 7 हजार वर्षे वयाच्या मानवी मेंदूच्या जीवाश्म अवशेषांमधून मायटोकॉन्ड्रियल डीएनएचे तुकडे वाढवणे आणि क्लोन करणे शक्य झाले!

वेगवेगळ्या नॉनहोमोलोगस क्रोमोसोम्सवर स्थित दोन स्थानांचे एकाच वेळी विश्लेषण करण्याची क्षमता वैयक्तिक मानवी शुक्राणूंच्या लायसेट्सवर प्रदर्शित केली गेली. हा दृष्टीकोन सूक्ष्म अनुवांशिक विश्लेषण आणि गुणसूत्र पुनर्संयोजन, डीएनए पॉलिमॉर्फिझम इ.च्या अभ्यासासाठी एक अनोखी संधी प्रदान करतो. वैयक्तिक शुक्राणूंच्या विश्लेषणाच्या पद्धतीला फॉरेन्सिक औषधात ताबडतोब व्यावहारिक उपयोग सापडला, कारण हॅप्लॉइड पेशींच्या एचएलए टाइपिंगमुळे पितृत्व निश्चित करणे किंवा ओळखणे शक्य होते. एक गुन्हेगार (एचएलए कॉम्प्लेक्स हा मानवी प्रमुख हिस्टोकॉम्पॅटिबिलिटी कॉम्प्लेक्सच्या जनुकांचा एक संच आहे; एचएलए कॉम्प्लेक्सचे लोकी उच्च पृष्ठवंशीयांमध्ये ज्ञात असलेल्या सर्वांमध्ये बहुरूपी आहेत: एका प्रजातीमध्ये, प्रत्येक स्थानावर, असामान्यपणे मोठ्या संख्येने भिन्न असतात. alleles - समान जनुकाचे पर्यायी रूप).

पीसीआर वापरुन, अभ्यास केलेल्या पेशींच्या जीनोमच्या पूर्वनिर्धारित प्रदेशात परदेशी अनुवांशिक संरचनांच्या एकत्रीकरणाची शुद्धता प्रकट करणे शक्य आहे. एकूण सेल्युलर डीएनए दोन ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर्ससह जोडलेले आहे, त्यापैकी एक इन्सर्शन पॉईंटजवळ होस्ट डीएनएच्या साइटला पूरक आहे आणि दुसरा अँटीपॅरलल डीएनए स्ट्रँडमधील एकात्मिक तुकड्याच्या अनुक्रमासाठी आहे. प्रस्तावित इन्सर्टेशन साइटवर क्रोमोसोमल डीएनएच्या अपरिवर्तित रचनेच्या बाबतीत पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शनमुळे अनिश्चित आकाराचे सिंगल-स्ट्रॅन्ड डीएनए तुकडे तयार होतात आणि नियोजित इन्सर्शनच्या बाबतीत, ज्ञात असलेल्या दुहेरी-असरलेल्या डीएनए तुकड्यांची निर्मिती होते. आकार, दोन प्राइमर्सच्या अॅनिलिंग साइट्समधील अंतराने निर्धारित केला जातो. शिवाय, पहिल्या प्रकरणात जीनोमच्या विश्लेषित प्रदेशाच्या प्रवर्धनाची डिग्री रेखीयपणे चक्रांच्या संख्येवर अवलंबून असेल, आणि दुसऱ्यामध्ये - घातांकरीत्या. पीसीआर दरम्यान पूर्वनिश्चित आकाराच्या वाढीव तुकड्याचे घातांकीय संचय डीएनए तयारीच्या इलेक्ट्रोफोरेटिक फ्रॅक्शनेशननंतर त्याचे दृश्यमानपणे निरीक्षण करणे आणि क्रोमोसोमल डीएनएच्या दिलेल्या प्रदेशात परदेशी अनुक्रम समाविष्ट करण्याबद्दल एक अस्पष्ट निष्कर्ष काढणे शक्य करते.

निष्कर्ष

विविध संसर्गजन्य रोगांचे निदान करण्यासाठी पीसीआर पद्धत सध्या सर्वात जास्त वापरली जाते. विश्लेषणासाठी घेतलेल्या नमुन्यात रोगजनकांचे फक्त काही डीएनए रेणू असले तरीही पीसीआर तुम्हाला संसर्गाचे एटिओलॉजी ओळखण्याची परवानगी देते. एचआयव्ही संसर्ग, व्हायरल हेपेटायटीस इत्यादींच्या लवकर निदानासाठी पीसीआरचा मोठ्या प्रमाणावर वापर केला जातो. आजपर्यंत, जवळजवळ कोणताही संसर्गजन्य एजंट नाही जो पीसीआर वापरून शोधला जाऊ शकत नाही.

वापरलेल्या साहित्याची यादी

1.पडुटोव्ह व्ही.ई., बारानोव ओ.यू., व्होरोपाएव ई.व्ही. आण्विक पद्धती - अनुवांशिक विश्लेषण. - मिन्स्क: युनिपोल, 2007. - 176 पी.

2.पीसीआर "रिअल टाइम" / रेब्रिकोव्ह डी.व्ही., समतोव जी.ए., ट्रोफिमोव्ह डी.यू. आणि इ.; एड b n डी.व्ही. रेब्रिकोव्ह; अग्रलेख एल.ए. Osterman आणि acad. RAS आणि RAAS E.D. Sverdlov; दुसरी आवृत्ती, रेव्ह. आणि अतिरिक्त - एम.: BINOM. ज्ञान प्रयोगशाळा, 2009. - 223 पी.

.पात्रुशेव एल.आय. कृत्रिम अनुवांशिक प्रणाली. - एम.: नौका, 2005. - 2 टन मध्ये

.B. Glick, J. Pasternak Molecular Biotechnology. तत्त्वे आणि अर्ज 589 पृष्ठे, 2002

5.Shchelkunov S.N. अनुवांशिक अभियांत्रिकी. - नोवोसिबिर्स्क: सिब. विद्यापीठ प्रकाशन गृह, 2004. - 496 पी.

संपादित A.A. व्होर्बेवा "पॉलिमरेझ साखळी प्रतिक्रिया आणि त्वचारोगशास्त्रातील निदानासाठी त्याचा उपयोग"; वैद्यकीय वृत्तसंस्था - 72 पृष्ठे

http://ru. wikipedia.org

http://scholar. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. su/ - वैद्यकीय जर्नल

शिकवणी

विषय शिकण्यासाठी मदत हवी आहे?

आमचे तज्ञ तुम्हाला स्वारस्य असलेल्या विषयांवर सल्ला देतील किंवा ट्यूशन सेवा प्रदान करतील.
अर्ज सबमिट करासल्लामसलत मिळण्याच्या शक्यतेबद्दल शोधण्यासाठी आत्ताच विषय सूचित करत आहे.