Основы молекулярной терапии. Лекарственные средства на основе олигонуклеотидов

Лекарство для генов

Давняя мечта медиков - иметь в своем распоряжении вещества, которые действовали бы на конкретные гены, т.е. на первопричину многих болезней. Ведь на основе таких веществ можно создавать лекарственные препараты - настоящие «волшебные пули», способные поражать наследственный материал различных инфекционных агентов, не принося вреда организму человека, а также подавлять активность онкогенов, ответственных за злокачественный рост клеток. Создание подобных веществ, направленно воздействующих на генетический материал, - одна из главных задач молекулярной биологии, поскольку с их помощью можно исследовать функции генов и, в конечном счете, управлять работой последних

Но каким образом можно изменить нужную генетическую программу? Ведь все гены имеют сходные химический состав и структуру: различия между ними сводятся лишь к порядку чередования четырех мономерных блоков - нуклеотидов A, T, G, C. Для того чтобы воздействовать на определенный ген, молекула вещества должна каким-то образом распознать эту нуклеотидную последовательность - задача, на первый взгляд, неразрешимая.

Но группа сибирских химиков, приехавших в Новосибирский академгородок в первые годы его создания, считала иначе. Сотрудники Института органической химии СО АН СССР (Новосибирск) Н. И. Гринева и Д. Г. Кнорре на основе принципа молекулярного узнавания, используемого самой природой, сформулировали идею направленного воздействия на гены с помощью олигонуклеотидов - фрагментов нуклеиновых кислот, «вооруженных» специальными химическими группами. Первую работу по олигонуклеотидам сибирские химики опубликовали в 1967 г. - именно эта дата и считается сегодня официальной датой возникновения нового направления в молекулярной биологии и фармакологии.

Они были первыми

Осуществление этого необычного по смелости проекта (в то время нигде в мире даже не планировалось проведение подобных исследований) на начальной стадии велось небольшой группой молодых сотрудников, аспирантов и студентов НГУ. Начинать пришлось практически с нуля, поскольку тогда еще не умели синтезировать олигонуклеотиды в заметных количествах; не существовало технических приборов, необходимых для работы с малыми количествами нуклеиновых кислот и эффективной методики определения их последовательности. Решить эти проблемы нашим химикам удалось благодаря междисциплинарности - одному из принципов, легших в основу деятельности Сибирского отделения.

В НИОХ было организовано производство нуклеиновых кислот, разработаны методы их химической модификации; совместно с сотрудниками Института ядерной физики удалось создать приборы для анализа нуклеиновых кислот и манипуляции с их малыми количествами, а совместно с химиками МГУ - развернуть работы по созданию автоматических синтезаторов олигонуклеотидов. В результате в распоряжении ученых оказались практически все необходимые аналитические методы и приборы - биологические исследования можно было начинать.

Эксперименты, проведенные сначала на простых моделях, а затем на природных нуклеиновых кислотах, показали, что олигонуклеотиды действительно взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами - мишенями с высокой степенью избирательности. В том случае, когда к олигонуклеотидам присоединены реакционно-способные группы, происходит направленная химическая модификация мишеней - нуклеиновых кислот. К тому же, впервые было продемонстрировано, что с помощью этих реагентов можно подавить вирусные инфекции у животных, а также доказана возможность введения их в организм через кожу и слизистые оболочки и т. п.

Ранние публикации, посвященные биологическим эффектам, производимым олигонуклеотидами, вызвали огромный интерес специалистов во всем мире. В 1988 г. в Академгородке был проведен первый в мире симпозиум по ген-направленным веществам на основе фрагментов нуклеиновых кислот. В работу по созданию подобных препаратов включились ученые США, Франции, а затем и других стран; возникли десятки компаний, поставивших перед собой цель создать терапевтические препараты на основе олигонуклеотидов.

Комплементарное лекарство

Первыми из препаратов ген-направленного действия стали так называемые антисмысловые олигонуклеотиды, предназначенные для избирательной инактивации вирусных РНК и некоторых клеточных РНК. Изначально предполагалось, что к этим олигонуклеотидам будут присоединены реакционно-способные группы, которые должны химически модифицировать или разрушать целевые нуклеиновые кислоты. Однако выяснилось, что присоединение олигонуклеотидов к РНК-мишени само по себе оказывает на нее настолько большое влияние, что может провоцировать ее разрушение клеточными ферментами.

Д. Г. КНОРРЕ - академик РАН, специалист в области химической кинетики, молекулярной биологии и биоорганической химии. Заведующий лабораторией химии природных полимеров (1960-1984 гг.), отделом биохимии и лабораторией химии нуклеиновых кислот (1970-1984 гг.) Института органической химии СО АН СССР, директор Института биоорганической химии СО АН СССР и СО РАН (1984-1996 гг.)

Антисмысловые подходы, основанные на использовании нуклеотидов и нуклеиновых кислот для подавления биологической активности нуклеиновых кислот, сулят интересные перспективы в тех случаях, когда нужно задавить реализацию нежелательной информации в живых организмах. В первую очередь открывается перспектива создания нового поколения противовирусных и противоопухолевых препаратов. Такие препараты имеют одно неоспоримое преимущество перед другими… Все олигонуклеотиды независимо от мишени, на которую они нацелены, могут быть созданы по единой технологии. Варьировать нужно только последовательность нуклеотидов. В частности, в вирусологии и онкологии часто приходится сталкиваться с таким явлением, как возникновение устойчивости к препаратам. Это происходит чаще всего потому, что у отдельной вирусной частицы или отдельной раковой клетки происходит мутация, приводящая к такой устойчивости. В любом другом случае нужно начинать эмпирический поиск нового лекарственного препарата. В случае антисмысловых воздействий нужно только определить, какое изменение в структуре вирусного генома или онкогена привело к появлению устойчивости. После чего сразу становится ясным, как по той же единой технологии создавать новый препарат *.

* Соросовский образовательный журнал. - 1998. - 12. - C. 25-31.

Самым мощным средством «выключения» генов оказались интерферирующие РНК - короткие двуцепочечные комплексы из РНК-олигонуклеотидов. Когда такой комплекс вводят в клетку, одна из цепочек связывается с комплементарной ей последовательностью в информационной РНК клетки. Это служит сигналом к началу работы группы ферментов, которые разрезают РНК, связанную с олигонуклеотидами. В результате программа синтеза определенного белка исчезает.

В 2006 г. за объяснение действия механизма РНК-интерференции два американских исследователя были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине. Создание регуляторов экспрессии генов на основе интерферирующих РНК открыло большие возможности для получения широкого спектра высокоэффективных нетоксичных препаратов, подавляющих экспрессию практически всех, в том числе опухолевых и вирусных, генов.

Правильные мутации

Внимание специалистов давно привлекают и методы мутагенного воздействия на ДНК с помощью олигонуклеотидов или их производных. В случае успеха может стать реальным то, что сегодня кажется фантастикой: коррекция дефектных генетических программ.

Экспериментально уже доказано, что с помощью коротких олигонуклеотидов можно вносить в генетические программы точечные мутации. Как это осуществить? Мутагенные олигонуклеотиды, содержащие «неправильные» нуклеотидные блоки, вводятся в клетку, где они соединяются с ДНК. В результате в некоторых участках нуклеотидных последовательностей появляются «неправильные», т. е. некомплементарные, пары оснований, что и воспринимается клеточной системой репарации («ремонта») ДНК как повреждение. Нуклеотиды в подобной паре заменяются репаративными ферментами таким образом, чтобы она стала «правильной», комплементарной. При этом замена может происходить как в олигонуклеотидной последовательности, так и в самой клеточной ДНК.

В последнем случае мы имеем дело с изменением генетической программы, т. е. с мутацией. И хотя эффективность подобного мутационного процесса в целом невелика, он может быть использован применительно к новым клеточным технологиям. Например, стволовые клетки больного с каким-либо наследственным нарушением можно обработать избирательным мутагеном, а затем отобрать те из них, в которых произошла нужная мутация (т. е. клетки с «исправленной» генетической программой), размножить и ввести в организм.

1967 г. Опубликована первая работа по олигонуклеотидам - ген-направленным биологически активным веществам

Таким образом, существующие на сегодняшний день олигонуклеотиды способны регулировать «работу» генов на различных уровнях. Так, вышеупомянутые антисмысловые олигонуклеотиды и интерферирующие РНК работают на стадии синтеза белка, воздействуя на матричные РНК - информационные молекулы, в которых происходит сборка полипептидных цепочек. Антигенные олигонуклеотиды, образующие комплексы с ДНК, подавляют экспрессию генов - образование самих матричных РНК, а олигонуклеотиды-аптамеры могут, подобно антителам, образовывать связи с определенными белками, блокируя их. Кроме того, некоторые олигонуклеотиды способны стимулировать работу иммунной системы - сегодня их используют в качестве компонентов вакцин.

В настоящее время разработку и синтез олигонуклеотидов и их аналогов ведут большие исследовательский и индустриальный секторы. Так, в прошлом году только объем рынка олигонуклеотидов, предназначенных для исследовательских целей, превысил 800 млн долларов! Сейчас разработаны и синтезированы десятки новых видов химически модифицированных олигонуклеотидов, идут испытания ряда противовирусных и противовоспалительных препаратов, полученных на их основе. Исследования подобного рода в России сейчас проводятся в основном в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, где работают ученики и последователи академика Д. Г. Кнорре.

Вот так плодотворность идеи, возникшей в Сибирском отделении сорок лет назад, была доказана самой жизнью. Используя в качестве базовых структур для создания ген-направленных биологически активных веществ короткие фрагменты нуклеиновых кислот, можно быстро разработать и внедрить в производство специфические лекарственные препараты практически против любого вируса. Для этого необходимо лишь расшифровать нуклеотидную последовательность вирусных генов, что несложно сделать с помощью современных технологий. У этого универсального подхода большое будущее: результаты исследований последних лет, в частности по направленному мутагенезу, позволяют рассчитывать на появление в скором времени эффективных лекарств для борьбы с заболеваниями, до сих пор считающихся неизлечимыми.

«Антисмысловая» РНК (Antisense RNA), которую предполагается использовать в качестве лекарственного средства, представляет собой короткий (15-20-нуклеотидов) олигонуклеотид, который может связываться с комплементарным ей определенным участком мРНК и ингибировать трансляцию кодируемого ей белка, подавляя тем самым патологический процесс (рис.2).

Терапевтический эффект синтетических «антисмысловых» олигонуклео-тидов зависит от специфичности их гибридизации с доступным сайтом мРНК-мишени, устойчивости к действию клеточных нуклеаз и наличия системы доставки в клетку. 15-20-нуклеотидные последовательности гибридизуются с уникальными мРНК с достаточно высокой специфичностью. Потенциальные сайты-мишени определяют тестированием набора «антисмысловых» олигонуклеотидов с использованием культуры клеток, синтезирующих мРНК-мишень. Для этого проводят электрофоретическое разделение клеточных белков, в которые включают радиоактивную метку во время трансляции, и с помощью радиоавтографии устанавливают, в присутствии какого из «антисмысловых» олигонуклеотидов снижается синтез определенного белка. Никаких общих критериев выбора наилучших сайтов-мишеней в разных РНК-транскриптах не существует. Эффективными могут оказаться олигонуклеотиды, комплементарные 5"- или 3"-концам мРНК, границам экзонов и интронов и даже двухцепочечным областям. Антисмысловые олигонуклеотиды могут разрушаться внутриклеточными нуклеазами, поэтому важно защитить их от действия последних так, чтобы они не утратили способности к гибридизации с мишенью. Для этого можно модифицировать определенным образом пиримидиновые основания, рибозу или дезоксирибозу (рис.3). Так, у наиболее широко применяющихся сейчас «антисмысловых» олигонуклеотидов свободный атом кислорода фосфодиэфирной связи заменен на группу SH (рис. 3Б), в результате чего образуется тиофосфатная связь. Модифицированные таким образом олигонуклеотиды растворяются в воде, несут отрицательный заряд и не расщепляются под действием эндонуклеаз. При гибридизации с сайтом-мишенью они образуют дуплексы, которые активируют рибонуклеазу (РНКазу), эндогенный фермент, расщепляющий мРНК в такой гибридной молекуле. Проведены первые клинические испытания таких олигонуклеотидов - лекарственных средств «первого поколения». Мишенями являются РНК цитомегаловируса, вируса иммунодефицита человека, а также мРНК генов, ответственных за развитие рака, болезней кишечника и других заболеваний.

Синтезированы «антисмысловые» олигонуклеотиды с фосфорамидитной и полиамидной (пептидной) связями - пептидные нуклеиновые кислоты (Peptide nucleicacids, PNAs) (рис.3В и Г ). Такие молекулы очень устойчивы к действию нуклеаз. Химические группы, присоединенные к 2"-углеродному атому сахарного остатка и С-5-атому пиримидинов, также защищают «антисмысловые» олигонуклеотиды и облегчают их связывание с сайтом-мишенью (рис. 32Д и Е ). Все преимущества этих и других модификаций сейчас интенсивно изучаются.

Проникновение «антисмыловых» олигонуклеотидов в клетку можно значительно облегчить, поместив их в липосомы. Такая высокоэффективная система доставки позволяет использовать «антисмысловые» олигонуклеотиды в небольших концентрациях. Если же конъюгировать липосомы с антителами, специфичными к эпитопам определенных клеток тех или иных органов, то можно будет осуществлять адресную доставку «антисмысловых» олигонуклеотидов.

Проведенные доклинические испытания оказали, что «антисмысловые» олигонуклеотиды являются весьма эффективными лекартвенными средствами. Изучена возможность их применения для лечения стеноза коронарых и сонных артерий, который приводит к инфарктам и инсультам. В этих случаях часто прибегают к ангиопластике, расширению артерий с помощью баллонного катетера, но примерно у 40% больных через 6 месяцев вновь возникают стенозы, поскольку ангиопластика стимулирует пролиферацию гладкомышечных клеток и секрецию межклеточного вещества во внутренний слой артерии в месте ее расширения. В одном из экспериментов в сонные артерии крыс после ангиопластики вводили антисмысловые» олигонуклеотиды с тиофосфатными связями, комплементарные мРНК, которые кодируют важные для клеточного циклa млекопитающих белки; в результате частота повторных стенозов уменьшилась на 90%. Пролиферация гладкомышечных клеток происходит также при атеросклерозе, сахарном диабете, осложнениях после коронарного шунтирования. Вероятно, все эти состояния можно будет контролировать аналогичными способами.

«Антисмыловые» олигонуклеотиды можно применять и для лечения вирусных инфекций и малярии. Кроме того, результаты I фазы клинических испытаний лечения болезни Крона с помощью орального введения «антисмыслового» олигонуклеотида проиллюстрировали четко выраженный терапевтический эффект без заметных побочных эффектов. В этом случае мРНК-мишень кодировала межклеточный адгезии типа 1, который вырабатывается в избытке у пациентов с болезнью Крона. Предполагается исследовать эффективность этого же олигонуклеотида для терапии других воспалительных заболеваний, например ревматоидного артрита, псориаза и язвенного колита.

В принципе «антисмысловые» олигонуклеотиды могут образовывать тройную спираль с хромосомной ДНК-мишенью и блокировать транскрипцию. Однако пока специфичность «антигенных» олигонуклеотидов не соответствует стандартам, принятым для лекарственных средств.

04.07.2013 - 31.12.2013

Проведен систематический анализ современной литературы по теме исследования. Установлены последовательности наиболее перспективных, с точки зрения исполнителей проекта, производных олигонуклеотидов и их аналогов, которые должны проявлять противовирусную и антибактериальную активности.
Разработаны методики синтеза модифицированных олигонуклеотидов и их конъюгатов с использованием автоматических ДНК/РНК-синтезаторов или в режиме неавтоматизированного синтеза на твердотельном носителе. Для дизайна олигонуклеотидных производных с заданной функциональностью предложены различные подходы, в том числе, основанные на прогностическом анализе структуры и стабильности формируемых дуплексов с помощью метода молекулярной динамики. Предложен способ синтеза новых, ранее не описанных производных олигонуклеотидов, несущих модификации по атому фосфора межнуклеотидной фосфодиэфирной группировки.
Разработана методика анализа эффективности проникновения флуоресцеин-меченных соединений в бактериальные клетки. Показано, что положительно заряженные производные пептида Flu-(LR)4G-амида эффективно проникают и накапливаются в Pseudomonas aeruginosa, а эффективность проникновения в нее олигонуклеотидов без транспортного пептида низка.
Все разработанные при выполнении исследований методики, как синтетические, так и аналитические, внедрены в работу Лаборатории Биомедицинской Химии ИХБФМ СО РАН. Полученные теоретические наработки использованы в образовательных курсах.
Созданная в лаборатории синтетическая база для получения, выделения и характеризации олигонуклеотидов является уникальной для РФ и близка к уровню лучших мировых научно-исследовательских лабораторий соответствующей специализации. Привлечение специалистов биологического профиля делает лабораторию уникальной по потенциалу ее научно-исследовательской реализации в направлении разработки РНК-направленных противовирусных и антибактериальных препаратов.

Развернуть

01.01.2014 - 31.12.2014

i) Оценка антибактериальной активности аналогов олигонуклеотидов/олигонуклеотидных конъюгатов по отношению к Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium; Staphylococcus aureus;
ii) Оценка антивирусной активности аналогов олигонуклеотидов/олигонуклеотидных конъюгатов по отношению к вируса гриппа WSN33/A/H1N1.
iii) Выбор последовательностей олигонуклеотидных аналогов- лидеров, проявляющих антибактериальную или противовирусную активность на требуемом уровне;
iv) Разработка протоколов синтеза олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих группы, которые увеличивают эффективность их накопления в эукариотических или бактериальных клетках
iv) Оценка эффективности проникновения и накопления разработанных соединений в бактериальных и эукариотических клетках.
v) Подготовленная лаборатория;
vi) Статьи в научной периодике, индексируемой в Web of Science.
vii) Тезисы докладов на конференциях;
viii) Свидетельства об участии в в образовательных курсах;
ix) Конференция;

Развернуть

01.01.2015 - 31.12.2015

3.1 Антибактериальная активность соединений, содержащих последовательности-лидеры по отношению к Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium; Staphylococcus aureus in vitro (в клеточной культуре);
3.2 Противовирусная активность соединений, содержащих последовательности-лидеры, по отношению к вирусу гриппа in vitro;

3.3. Технологические и терапевтические характеристики отобранных олигонуклеотидных аналогов и конъюгатов с учетом путей коммерциализации препаратов, в том числе:

3.3.1 Список стандартизованных экспериментальных методик для оценки антибактериальной и противовирусной активности препаратов олигонуклеотидных аналогов in vitro (в культуре клеток) и in vivo (на животных моделях);

3.3.3 Отобранные олигонуклеотидные аналоги и конъюгаты, которые наряду с проявлением высокой антибактериальной и противовирусной активности способны к эффективному проникновению и накоплению в клетках, в том числе:

3.3.2.1 Данные по проникновению в клетки и доставки модифицированных олигонуклеотидных аналогов и конъюгатов;
3.3.2.2 Оптимизированный полупрепаративный синтез, пре- и пост-синтетические модификации, выделение и количественный контроль олигонуклеотидных аналогов, проявляющих антибактериальную и противовирусную активность;
3.3.2.3. Оценка разработанных соединений с антибактериальной и противовирусной активностью с точки зрения коммерческого использования.

3.4 Подготовленный финальный отчет по Проекту;
3.5 Подготовленная лаборатория;

3.6 Тезисы докладов на конференциях;
3.7 Свидетельства об участии в в образовательных курсах;

3.8 3статьи в научной периодике, индексируемой в Web of Science

В большинстве методов генной терапии ех vivo и in vivo используются клонированные генетические конструкции, возмещающие функциональную форму белка, который не синтезируется в организме больного или синтезируется в дефектной форме. Однако многие заболевания человека (рак, воспаления, вирусные и паразитарные инфекции) связаны, напротив, с гиперпродукцией нормального белка. Для лечения таких состояний разработаны терапевтические

системы с использованием специфических олигонуклеотидов. Такой небольшой олигонуклеотид может гибридизоваться со специфическим геном или мРНК и снижать уровень транскрипции или трансляции, уменьшая тем самым количество синтезируемого белка, ответственного за патологию. Олигонуклеотид, который гибридизуется с самим геном и блокирует его транскрипцию, называется «антигенным», а тот, который гибридизуется с соответствующей мРНК, - «антисмысловым» (Antisense RNA). Для предотвращения активации транскрипции специфических генов можно так-же использовать двухцепочечные олигонуклеотиды, специфично присоединяющиеся к ДНК-связывающим белкам (белкам-активаторам). Наконец, для уменьшения количества определенной мРНК и синтезируемого на ней белка можно использовать рибозимы - природные РНК-последовательности, которые связываются со специфическими молекулами РНК и разрезают их.

В будущем лекарственные средства на основе нуклеиновых кислот, по-видимому, найдут широкое применение, при этом главным объектом научных исследований и клинических испытаний будут различные «антисмысловые» олигонуклеотиды.

3.1..«Антисмысловые» олигонуклеотиды как лекарственные средства

5507 0

Этого можно достичь несколькими способами: гибридизацией соответствующего олигонуклеотида со специфическим геном или мРНК, блокированием фактора транскрипции белка, уменьшением количества мРНК в результате расщепления РНК-ферментами и т.п. Рассмотрим принципы некоторых из них.

Рибоолигонуклеотид, который связывается с определенной мРНК и тем самым ингибирует трансляцию кодируемого ею белка, называется «антисмысловой» мРНК. Этот механизм используют некоторые бактерии для регулирования генов (рис. 3.20). На практике применяют искусственно сконструированные гены, у которых ДНК-вставка находится в такой ориентации, чтобы их транскрипты были антисмысловыми по отношению к мРНК-мишени (рис. 3.21).

Рис. 3.20. Регулирование гена бактериоферритина (bfr) с помощью антисмысловой РНК

Рис. 3.21. Ингибирование трансляции мРНК синтетическим антисмысловым олигонуклеотидом

Было показано, что возможно использование синтетических антисмысловых олигонуклеотидов, однако их терапевтический эффект будет сильно зависеть от их устойчивости к действию клеточных нуклеаз, системы доставки и специфичности их гибридизации. Для определения наиболее эффективных сайтов-мишеней на специфической мРНК производят тестирование набора антисмысловых олигонуклеотидов длиной 15-20 оснований с культурой клеток, синтезирующих мРНК-мишень. Состав синтезированных белков определяют электрофорезом и устанавливают, введение какого олигонуклеотида приводит к снижению синтеза белка-мишени.

Для защиты от нуклеазного расщепления синтезируются модифицированные олигонуклеотиды, при этом не утратившие способность гибридизоваться. На рис. 3.22 приведены структуры модифицированных нуклеотидов, эффективность которых интенсивно изучается. Например, показано, что олигонуклеотиды с заменой свободного кислорода фосфодиэфирной связи на серу (структура б) эффективно гибридизуются с комплементарной РНК-мишенью и полученные РНК-ДНК дуплексы активируют внутриклеточную рибонуклеазу Н.

Этот эндогенный фермент, гидролизует РНК-последовательность в таких гибридах. С такими олигонуклеотидами уже проведены многообещающие клинические испытания, в которых мишенями являлись РНК цитомегаловируса, ВИЧ, некоторых РНК, ответственных за развитие рака.

Рис. 3.22. Модификации олигонуклеотидов: а - нормальная фосфодиэфирная связь; б - тиофосфатная связь; в - фосфамидная связь; г - 2"-0-метилрибоза; д - С-5-пропинилцитозин

Для эффективной доставки антисмысловых олигонуклеотидов их часто пакуют в липосомы, в свою очередь модифицированные специфическими лигандами, обеспечивающими адресную доставку (такой прием мы уже встречали, когда рассматривали способы невирусной доставки терапевтических генов). К настоящему времени проведен ряд испытаний и показана высокая терапевтическая эффективность антисмысловых олигонуклеотидов для подавления нежелательной пролифирации гладкомышечных клеток (осложнения после ангинопластики, коронарного шунтирования, атеросклероз), для лечения вирусных инфекций и малярии.

Принцип действия и строение рибозимов - природных РНК, обладающих нуклеазной активностью, показан на рис. 3.23.
Обнаружено, что эти короткоцепочечные РНК способны эффективно подавлять экспрессию вирусных генов, онкогенов, факторов роста и других терапевтически важных генов, расщепляя их мРНК. Модифицируя субстрат-связывающую последовательность, можно получать рибозимы, специфичные к определенной мРНК. Рибозимы можно синтезировать непосредственно в клетке транскрипцией синтетического олигодезоксирибонуклеотида, кодирующего каталитический домен и фланкирующие его гибридизующиеся участки.

Рис. 3.23. Расщепление мРНК под действием рибозимов. Стрелкой показан сайт расщепления

Такой олигонуклеотид встраивают в эукариотический экспрессирующий вектор и помещают в клетку. Образующаяся РНК самопроизвольно приобретает активную конформацию, так называемую форму «головки молотка». Множество рибозимов различной структуры и активности синтезировано химически. Например, в лаборатории нуклеиновых кислот Института химической биологии и экспериментальной медицины СО РАН (Новосибирск) проводятся многолетние исследования по получению синтетических рибозимов, обладающих повышенной активностью и стабильностью.

Для повышения защиты от преждевременного расщепления внутриклеточными нуклеазами получают различные производные рибозимов - с метилированными 2"-гидроксильными (см. рис. 3.22, г) группами, бинарные конструкции и т.п. Строение молекулы рибозима существенным образом влияет на его эффективность. На рис. 3.24 показана кинетика расщепления мРНК гена множественной лекарственной устойчивости mdr1 с помощью синтезированных рибозимов разной структуры.

Рис. 3.24. Расщепление 190-звенного 5"-концевого фрагмента MDR1 мРНК модифицированными бинарными (1,3) и полноразмерными (2,4) рибозимами: а - структура РНК с выделенным специфическим сайтом; б - накопление продуктов расщепления (материалы предоставлены А.Г. Веньяминовой, ИБХиФМ, Новосибирск)

Особое место в молекулярной терапии занимают так называемые методы активирования пролекарств. Например, одним из способов генной терапии рака является уничтожение опухолевых клеток с помощью активированного производного ганцикловира (GCV, производное гуанозина), продукта гена тимидинкиназы, из уже упомянутого нами вируса простого герпеса HSVtk.

Опухолевые клетки трансфецируют in vivo геном HSVtk под активным промотором и через несколько дней вводят ганцикловир, который фосфорилируется вирусной тимидинкиназой до монофосфата, а затем киназами клетки-хозяина до трифосфата. Это производное ингибирует ДНК-полимеразу и останавливает синтез ДНК, что приводит к гибели пролифилирующих клеток. Через межклеточные контакты ганцикловиртрифосфат проникает в соседние немодифицированные клетки и таким образом уничтожается дополнительно до десятка опухолевых клеток.

Ген, приводящей к гибели собственной клетки, называется геном «самоубийства» (в нашем случае это ген тимидинкиназы), а термин «пролекарство» относится к неактивной форме лекарственного вещества (в данном случае это ганцикловир). Этот подход был использован и для создания других вариантов комбинации генактиватор-пролекарство, но эффективность системы GCV-HSVtk уже доказана рядом доклинических испытаний.

Генная терапия является новой лечебной дисциплиной, становление которой происходит на наших глазах. Несмотря на некоторые успехи и многообещающие перспективны, существует ряд проблем, которые еще предстоит преодолеть.

Часть проблем лежит далеко не в плоскости медицины и молекулярной биологии. Речь идет о проблемах этических и политических. Как вы уже заметили, мы рассматривали методы генетической терапии только соматических клеток. Это означает, что произведенные коррекции ограничиваются определенным органом или тканью, «исправленные» гены не будут передаваться следующему поколению. Изменения генотипа зародышевых клеток (сперматозоидов или яйцеклеток) или оплодотворенных клеток должны передаваться из поколения в поколение.

В настоящее время генная терапия соматических клеток отнесена к стандартным методам медицинского вмешательства. В противоположность этому генная терапия зародышевых клеток является технологически гораздо более сложной, проблематичной и непредсказуемой. Поэтому эксперименты в этой области во многих странах запрещены.

В конце 80-х гг. в США были установлены правила, регулирующие испытания в области генетической терапии соматических клеток. Они гарантируют беспристрастный и репрезентативный отбор больных и их информированность (насколько опасно лечение, какова вероятность его успеха и пр.), конфиденциальность сведений о больных и произведенных исследованиях, осуществление всех манипуляций должным образом без причинения вреда, как конкретным больным, так и человеческой популяции в целом.

Поскольку лечение соматических клеток приводит к улучшению состояния и значительному продлению жизни больных с генетическими заболеваниями, но «улучшенный» ген не передается по наследству, существует мнение, что это приведет к накапливанию генетических заболеваний в человеческой популяции. Однако, по данным популяционной генетики, для существенного повышения частоты вредного гена в результате эффективного лечения требуются тысячи лет.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова