DNA vakcína(tiež génová vakcína, vakcína s nukleovou kyselinou)- geneticky upravený konštrukt, ktorý po zavedení do bunky zabezpečuje produkciu patogénnych proteínov alebo nádorových antigénov a vyvoláva imunitnú odpoveď. Zavedenie DNA vakcín do tela sa nazýva genetická imunizácia. Vakcinácia DNA má oproti konvenčným vakcínam niekoľko výhod. Predovšetkým sa ukázalo, že takéto vakcíny zabezpečujú nielen tvorbu protilátok (humorálna imunita), ale aj špecifickú cytotoxickú odpoveď (bunková imunita), ktorá bola predtým dosiahnuteľná len živými vakcínami. Dnes sa DNA vakcíny nepoužívajú na liečbu ľudí, ale predpokladá sa, že genetická imunizácia pomôže prekonať celý rad chorôb.

História stvorenia

Myšlienka použiť fragmenty DNA na očkovanie sa objavila v 50. a 60. rokoch minulého storočia. Po sérii experimentov sa zistilo, že genetická informácia DNA si po prenesení do inej bunky zachováva schopnosť prepisu a prekladu. V tom istom roku sa zistilo, že zavedenie genómu vírusu detskej obrny do zvierat stimuluje tvorbu protilátok. Neskôr bola preukázaná aktivácia humorálnej imunity pre molekuly DNA odvodené od neinfekčných agens. Od 90. rokov 20. storočia začali vedecké laboratóriá čoraz častejšie skúmať imunostimulačné vlastnosti DNA. V roku 1992 Tang a kolegovia ukázali, že gén ľudského rastového hormónu vložený do plazmidu je stabilne exprimovaný u myší a syntetizovaný hormón je rozpoznávaný imunitným systémom ako antigén a stimuluje produkciu protilátok. Proces zavádzania plazmidovej DNA na stimuláciu humorálnej imunity sa nazýva Tango „genetická imunizácia“. Nasledujúci rok však iná skupina vedcov uviedla, že zavedenie plazmidu kódujúceho proteíny vírusu chrípky spôsobuje humorálnu aj bunkovú odpoveď. Indukcia oboch vetiev imunity v tom istom roku bola tiež nájdená pre plazmid obsahujúci gény HIV. Od roku 1995 sa začali objavovať dôkazy, že očkovanie DNA môže aktivovať imunitný systém proti rakovine. Asi pred 20 rokmi prebehli prvé klinické skúšky DNA vakcín, ktoré mali v prvom rade preukázať bezpečnosť novej metódy. Pacientom boli injekčne podané gény pre HIV, vírus chrípky, herpes, hepatitídu B, pôvodcu malárie. Výsledky všetkých testov boli celkom povzbudivé: DNA vakcíny boli dôsledne exprimované, vyvolávali imunitnú odpoveď a nespôsobovali vážne vedľajšie účinky, čo slúžilo ako impulz pre ich ďalší výskum.

Konštrukcia DNA vakcíny

Štrukturálne je DNA vakcína nukleotidová sekvencia vložená do vektora, ktorý kóduje špecifický antigén alebo antigény. Vektor v genetickom inžinierstve je molekula nukleovej kyseliny, ktorá slúži na dodanie genetického materiálu do buniek a zabezpečuje jeho replikáciu alebo expresiu. Predtým sa na transport génov do bunky používali vektory založené na vírusoch: modifikovaný (oslabený) vírus variola, adenovírusy a retrovírusy. Vírusové vektory sú celkom účinné, ale majú významnú pravdepodobnosť vedľajších účinkov spojených s relatívne vysokou imunogenicitou samotného vektora. Preto sa dnes ako vektor najčastejšie používa bakteriálny plazmid – malá stabilná kruhová molekula DNA schopná autonómnej replikácie. Plazmid sám o sebe nespôsobuje požadovanú špecifickú imunitnú odpoveď, preto sú do neho všité gény imunogénnych proteínov. DNA vakcína musí tiež obsahovať regulačné sekvencie potrebné na génovú expresiu v eukaryotických bunkách. Hotový konštrukt DNA sa dodáva do bakteriálnej bunky, kde sa zvyšuje počet jeho kópií. Potom nasleduje izolácia a purifikácia plazmidov, ktoré nesú požadovaný inzert.

Plazmidový vektorový dizajn

Dôležitou etapou pri tvorbe DNA vakcín je návrh (konštrukcia) vektora. Povinné štruktúry plazmidového vektora sú reštrikčné miesta, selektovateľný marker a počiatok replikácie DNA vakcíny v bakteriálnej bunke. Aby prebehla syntéza antigénu, DNA vakcína musí obsahovať promótor a polyadenylačný signál. Promótor je dôležitým faktorom účinnosti vakcíny, pretože určuje silu imunitnej odpovede: čím väčšia je expresia génu kódujúceho vírusový alebo nádorový antigén, tým silnejšia je imunitná odpoveď. Najčastejšie používaným promótorom je vírus SV40 alebo cytomegalovírus (CMV). Na stabilizáciu transkriptov mRNA sa do plazmidu vloží polyadenylačný signál, najčastejšie odvodený od génu rastového hormónu hovädzieho dobytka. (BGH) alebo vírus SV40. Ako selektovateľné markery sa vyberajú gény bakteriálnej rezistencie na antibiotiká, často gén rezistencie na kanamycín. Pri navrhovaní DNA vakcín je najobľúbenejším miestom pôvodu replikácie Escherichia coli.

Génová selekcia na imunizáciu

Vektor je dôležitou zložkou DNA vakcíny, ale jeho imunogenicita je určená presne inzertom, sekvenciou DNA kódujúcou antigén. Spomedzi vírusových antigénov sú na imunizáciu najvhodnejšie fúzne proteíny, sú to relatívne konzervované proteíny, ktoré umožňujú vírusu vstúpiť do bunky. Na očkovanie proti grampozitívnym baktériám je vhodné vložiť do plazmidového vektora gény tých bakteriálnych proteínov, ktoré určujú patogenézu ochorenia. Medzi proteínmi gramnegatívnych baktérií majú vysokú imunogenicitu. Pre terapeutické protinádorové DNA vakcíny sa používajú markerové proteíny rakovinových buniek.

Spôsoby dodávania DNA vakcín do buniek

Hotová vakcína musí byť doručená do ľudského alebo zvieracieho tela, kde jej cieľom sú bunky prezentujúce antigén (APC) - makrofágy, dendritické bunky, B-lymfocyty. Tu prebehne syntéza a posttranslačná modifikácia antigénu, po ktorej sa vloží do bunkovej membrány, aby upútala pozornosť imunitného systému. Hlavným problémom je dodať dostatok plazmidu do APC. Spôsoby dodania genetického materiálu do bunky sú zvyčajne rozdelené do 2 skupín: vírusové a nevírusové. Pretože vírusové vektory majú množstvo významných nedostatkov, v tejto časti sú uvedené len nevírusové metódy na dodávanie DNA vakcín.

mikroinjekcia

Začiatkom 90. rokov boli intramuskulárne mikroinjekcie najbežnejším spôsobom zavedenia DNA do bunky kvôli jednoduchosti metódy. Na to sa DNA rozpustí vo vode alebo izotonickom roztoku, ak je to potrebné, pridá sa adjuvans (látka, ktorá zvyšuje imunitnú odpoveď). Potom sa pomocou tenkej sklenenej trubice vstrekne roztok do svalového tkaniva, kde úlohu APC plnia dendritické bunky. Keď je vakcína v jadre dendritickej bunky, začína sa exprimovať a dochádza k syntéze antigénnych proteínov. Pomocou mikroinjekcií možno DNA vpraviť subkutánne do týmusu, pečene a nádorového tkaniva, avšak práve vo svalovom tkanive je pozorovaná najdlhšia (až ročná) expresia DNA vakcíny. Kvôli vysokej koncentrácii Langerhansových buniek (subtypu dendritických buniek) je koža atraktívnym cieľom pre DNA vakcináciu. Na intradermálne (subkutánne) podanie sa používa rad mikroihiel, ktorých dĺžka je niekoľko stoviek mikrónov. Existujú rôzne možnosti intradermálnej vakcinácie. Jednoduchšie je uvoľniť zrohovatenú vrstvu kože (vonkajšia vrstva kože, zvyčajne 10-20 mikrónov) pomocou radu mikroihiel, aby sa zvýšila jej priepustnosť pre ďalšiu lokálnu injekciu roztoku DNA. Efektívnejšie je použitie mikroihiel potiahnutých suchou vakcínou, ktorá sa rozpustí pod kožou. Účinnosť tejto metódy je zvyčajne nízka, pretože DNA najskôr vstupuje do medzibunkového priestoru a až potom je zahrnutá do buniek.

elektroporácia

Elektroporácia je tradičný prístup na dodávanie DNA do bakteriálnych buniek a bunkových kultúr založený na aplikácii elektrického impulzu. Takýto impulz vytvára póry v bunkovej membráne, čo uľahčuje vstup negatívne nabitej DNA. Táto metóda bola prijatá na dodávanie DNA vakcín zvieratám a ľuďom a môže výrazne zvýšiť účinnosť konvenčnej injekcie. Zariadenie na elektroporáciu obsahuje zdroj elektrického prúdu a jednorazovú mriežku, ktorá pozostáva zo striekačky a ihlových elektród. Striekačka vstrekuje vakcínu do svalového tkaniva a elektródy vytvárajú elektrické pole, ktoré uľahčuje vstup DNA do myocytov a dendritických buniek. Dodnes boli vyvinuté zariadenia, ktoré dokážu zvýšiť účinnosť očkovania 1000-krát v porovnaní s klasickou injekciou. Elektroporácia sa môže použiť na intramuskulárne aj subkutánne podanie DNA vakcíny. Nevýhodou je mierna bolestivosť v mieste vpichu, potreba špecializovaných prístrojov. Namiesto elektrického poľa je možné použiť magnetické pole. Takéto zariadenia fungujú na rovnakom princípe, ale v tomto prípade je postup úplne bezbolestný a menej poškodzuje bunky.

Pôsobenie elektrického poľa nielen zvyšuje absorpciu DNA vakcíny bunkami, ale stimuluje aj rozvoj imunitnej odpovede. Použitie elektroporácie vedie k menšiemu poškodeniu tkaniva - vzniká lokálny zápalový proces. Keď sú bunky poškodené, uvoľňujú sa chemokíny, takže sa k nim posielajú makrofágy, lymfocyty a dendritické bunky. Zvýšenie koncentrácie imunitných buniek v mieste vpichu zvyšuje účinnosť vakcíny.

Sonoporácia

Sonoporácia je metóda prenosu cudzej DNA do buniek pomocou ultrazvuku. Ultrazvuk zvyšuje priepustnosť bunkovej membrány, v dôsledku čoho exogénna DNA ľahšie preniká do bunky. Sonoporácia bola prvýkrát použitá na prenos génov do bunky v roku 1986. Táto metóda sa používa na zavedenie molekúl DNA do buniek rohovky, mozgu, kostného tkaniva, obličiek, pankreasu, embryonálneho tkaniva, kostrových a srdcových svalov. Sonoporácia je v porovnaní s inými metódami málo prebádaná, na zlepšenie jej účinnosti je potrebné oveľa viac úsilia, najmä na úrovni celého organizmu.

Balistická transfekcia

Balistická transfekcia je založená na ostreľovaní (bombardovaní) orgánov a tkanív mikročasticami ťažkých kovov (zlato, volfrám) s priemerom 1-3 mikróny obalenými molekulami DNA. Takto zavedená DNA vakcína je exprimovaná v cieľových bunkách a ich produkty vstupujú do krvného obehu. Na zabezpečenie zrýchlenia častíc sa používa zariadenie podobné ručným zbraniam - génová pištoľ alebo génová pištoľ. Mikročastice prechádzajú cez bunkové membrány a nesú genetický konštrukt priamo do bunkového jadra. Hĺbka prieniku mikročastíc je spravidla malá - do 1 mm, takže metóda sa používa hlavne na transfekciu kože alebo priľahlého tkaniva chrupavky. Špeciálne podmienky lúskania umožňujú mikročasticiam preniknúť do hĺbky 4-5 mm a preniesť génové konštrukty do priečne pruhovaných svalových vlákien. Typicky bunky umiestnené priamo v strede výstrelu umierajú, zatiaľ čo v zóne 0,6-1 cm od stredu sú najúspešnejšie protransformované bunky. Táto technológia sa nazýva aj biobalistika alebo biolistika.

Prvú génovú pištoľ vytvorila skupina vedcov v rokoch 1983 až 1986 s cieľom transformovať rastlinné bunky. Bola to pištoľ vyvinutá zo zariadenia na automatické pribíjanie klincov. DNA z reportérového (markerového) génu bola aplikovaná na volfrámovú guľu a vstrelená do Petriho misky. Expresia reportérového génu indikovala účinnosť imunizácie. Dnes sa na prenos DNA používajú častice zlata alebo striebra, pretože na rozdiel od volfrámových nie sú pre bunku toxické.

Pod vysokým tlakom

V roku 1999 boli vyvinuté injekčné zariadenia, ktoré sú schopné podať DNA vakcínu bez použitia ihly. Takéto zariadenia fungujú vďaka Lorentzovej sile: malý silný magnet vytvára významný tlak, poháňa piest, ktorý vytláča drogu rýchlosťou zvuku. Zmenou sily prúdu si môžete zvoliť hĺbku vpichu a dávkovať lieky. Zákrok je úplne bezbolestný a predtým sa používal na podávanie inzulínu pacientom s cukrovkou a na rozsiahle očkovanie. Významnou nevýhodou tejto metódy je, že vysoký tlak môže teoreticky zmeniť štruktúru molekúl, ktoré sa vstrekujú. Táto technológia vkladania sa však stále zdokonaľuje a dnes boli vyvinuté zariadenia, ktoré dokážu dopraviť DNA do hĺbky až 16 mm.

Ako súčasť živého bakteriálneho vektora

Živé bakteriálne vektory sú kmene salmonela, Shigella alebo listéria, ktoré nesú mutáciu v biosyntéze alebo inváznych génoch, ktoré eliminujú patogenitu a schopnosť udržať si životaschopnosť v hostiteľskom organizme alebo prostredí. Namiesto toho sú potrebné gény pre imunogénne proteíny vložené do bakteriálneho genómu. Oslabená baktéria sa podáva perorálne (ústami, prehĺtaním) alebo intranazálne (injekciou do nosového otvoru), takže tento spôsob očkovania nevyžaduje žiadne vybavenie. Okrem toho takéto podávanie stimuluje slizničnú imunitnú odpoveď, čo je dôležité, pretože väčšina patogénov vstupuje do tela cez ústa a nosové otvory. Obchádzajúc žalúdok, oslabená baktéria vstupuje do tenkého čreva. Ďalej baktéria preniká do Peerových plakov - črevných lymfatických uzlín. Keď sa baktérie dostanú do stredu Peyerových plátov, stanú sa cieľom pre makrofágy a podstúpia fagocytózu. V cytoplazme makrofágov baktéria uvoľní DNA vakcínu, po ktorej DNA vstúpi do jadra a baktériu zneškodní imunitný systém.

Balenie v lipozómoch

Lipozómy - sférické útvary (približne 100 nm v priemere), pozostávajúce z dvojitej lipidovej vrstvy. Lipozómy sú vo vnútri duté, ktoré sú zvyčajne naplnené rozpúšťadlom, ale môžu sa použiť na dodávanie rôznych látok vrátane DNA vakcín. Ich hydrofóbny obal im umožňuje splynúť s bunkovými membránami a transportovať ich obsah do bunky. Používanie lipozómov sa začalo v roku 1965 a toto sa stalo silným motorom pre rozvoj bionanotechnológie.

Sľubnou metódou na priame zavedenie konštruktu DNA do cieľových buniek je dodanie genetického konštruktu ako súčasti katiónových lipozómov vytvorených z pozitívne nabitých lipidov. Katiónové lipozómy s negatívne nabitou molekulou DNA tvoria komplex DNA-lipid – lipoplex. Výhody používania takýchto komplexov sú schopnosť niesť veľké množstvo informácií, neinfekčnosť, navyše sú jednoduché a lacné na výrobu. V roku 2003 boli vytvorené extrémne malé milimikrónové lipozómy, ktoré sú potiahnuté polyetylénglykolovým polymérom, ktoré sú schopné prenášať terapeutickú DNA cez hematoencefalickú bariéru a dodávať ju do mozgových neurónov, čo bolo predtým nemožné.

Vyrobené z polyplexu

Polyplexy, systémy pozostávajúce z kladne nabitých polymérov (polykatióny) a záporne nabitých molekúl DNA, sa používajú na zavedenie veľkých konštruktov DNA (>10 kb) do bunky. Veľkosť takýchto komplexov je menšia ako 100 nm, čo ich na jednej strane vystavuje štiepeniu makrofágmi (keďže reagujú na častice väčšie ako 200 nm), a na druhej strane sú dostatočne veľké na to, aby neboli filtrované v obličky.

Polykatióny kondenzujú molekulu DNA do komplexov, čím zabezpečujú jej stabilitu a ochranu pred pôsobením nukleáz. Ako polyméry viažuce DNA môžu slúžiť katiónové proteíny, syntetické homopolyméry aminokyselín (polylyzíny, polyarginíny), polysacharid chitosanu, polyetylénamín. Zvyčajne je polykatión v zložení polyplexu v nadbytku, v dôsledku čoho je tento komplex rozpustný a kladne nabitý. Ak je ligand pre špecifický bunkový receptor pripojený k polyplexu, potom DNA vakcína môže byť nasmerovaná na špecifický typ bunky. Proces dodania genetického materiálu v rámci polyplexu zahŕňa dva stupne: extracelulárny (cesta z miesta vpichu do cieľových buniek) a intracelulárny (interakcia s cieľovými bunkami, endocytóza, výstup z endozómov, dodanie do jadra). Prvou bariérou, ktorú musí komplex prekonať, je krv a extracelulárna matrica. Preto sa volia také fyzikálne a chemické parametre polyplexu, aby sa zvýšila jeho stabilita, zabránilo sa nežiaducim interakciám s krvnými proteínmi a imunitnej reakcii spôsobenej chemickou povahou polykatiónu. Keď je polyplex v cieľových bunkách, je absorbovaný na plazmatickej membráne, absorbovaný endocytózou, po ktorej musí opustiť endozóm a disociovať sa na katiónový polymér a molekulu DNA. Voľná ​​DNA je poslaná do jadra a polymérne katióny opúšťajú bunku a sú vylučované z tela.

Charakteristika najbežnejších spôsobov podávania DNA vakcín
Metóda	Výhody	Nedostatky
Intramuskulárne alebo subkutánne injekcie	Nevyžaduje sa žiadne špeciálne vybavenie Trvalý alebo dlhodobý prejav DNA sa prenáša do susedných tkanív	Nízka účinnosť Vyžaduje pomerne veľké množstvo DNA
elektroporácia	Vysoká účinnosť	poškodenie tkaniva
génová zbraň	Vysoká presnosť Vyžaduje malé množstvo DNA	Vyžaduje inertné mikročastice Poškodenie buniek v mieste výstrelu
Zavedenie v dôsledku vysokého tlaku	Relatívne jednoduchá metóda Nie sú potrebné mikročastice DNA môže preniknúť do hĺbky od niekoľkých mm do 1,5 cm	Ovplyvňuje štruktúru DNA Nízka účinnosť imunizácie Vyžaduje veľké množstvo DNA (až 300 mcg)
Balenie v lipozómoch	Vysoká účinnosť in vitro Jednoduchosť výroby Veľká kapacita Možno kombinovať s inými metódami Pri intravenóznom podaní má vakcína potenciál dostať sa do všetkých tkanív Intranazálne podanie zabezpečuje expresiu vakcíny v nosovej sliznici a produkciu imunoglobulínov triedy A (IgA)	Možná toxicita Nízka účinnosť in vivo

Mechanizmus vývoja imunitnej odpovede

Antigén syntetizovaný v bunke prechádza spracovaním, po ktorom je prezentovaný imunokompetentným bunkám. Spracovanie je štiepenie antigénneho proteínu na imunogénne peptidové fragmenty. Prezentácia znamená predloženie fragmentu antigénu spojeného s molekulami hlavného histokompatibilného komplexu (MHC) imunokompetentných buniek. Existujú dve najvýznamnejšie triedy týchto molekúl: MHC triedy I (MHC-I) a MHC triedy II (MHC-II). Na naviazanie na molekuly každej triedy sa antigén pripravuje v špecializovaných kompartmentoch bunky. Endogénne antigénne proteíny sú nasmerované do proteazómu na degradáciu, po ktorej sú prezentované v komplexe s MHC-I na bunkovom povrchu. Tu, keď sa stretnú, sú rozpoznané CD8+ T-bunkami (T-killers), ktoré implementujú cytotoxickú imunitnú odpoveď. Exogénne proteíny sú štiepené lysomnimálnymi proteázami, inkorporované do MHC-II a rozpoznávané CD4+ T-bunkovými (T-helper) receptormi. Posledne menované spôsobujú bunkové aj humorálne reakcie.

Prezentácia antigénu dráhou MHC-I

DNA vakcinácia zahŕňa endogénnu syntézu antigénu, takže táto cesta prevláda. Spracovanie antigénu pozdĺž dráhy MHC-I prebieha v niekoľkých krokoch. Proteín syntetizovaný v jadre je transportovaný do cytoplazmy, proteazóm je štiepený na krátke peptidy - epitopy, ktoré sú pomocou špeciálnych antigénových transportných proteínov (TAP) prenesené do endoplazmatického retikula (EPR). V EPR je každý epitop kombinovaný s molekulou MHC-I, po čom je vytvorený komplex odoslaný do Golgiho aparátu (AG) na glykozyláciu. Odtiaľ má komplex v zložení vezikuly tendenciu k plazmatickej membráne. Po fúzii vezikuly s plazmatickou membránou sa komplex objaví na povrchu bunky, kde ho rozpoznávajú T-killer receptory, ktoré majú cytotoxickú aktivitu.

Prezentácia antigénu dráhou MHC-II

Hlavným zdrojom peptidov, ktoré sa viažu na MChS-II, sú exogénne proteíny, ktoré vstúpili do bunky endocytózou. Ukázalo sa však, že niektoré intracelulárne proteíny môžu byť prítomné aj v komplexe s MChS-II. V tomto prípade sú novosyntetizované proteíny po vstupe do cytoplazmy prenesené do lyzozómov, kde sa antigén štiepi pôsobením kyslých proteáz. Potom sa lyzozóm obsahujúci epitopy spojí s vezikulou, ktorá nesie molekulu MChS-II. Vo vnútri zjednotenej vezikuly sa vytvorí komplex epitop-MChS-II, ktorý sa po fúzii vezikuly s plazmalemou dostane na povrch bunky. Tu je tento komplex rozpoznávaný T-helper receptormi, čo vedie k ich aktivácii. To vedie k stimulácii bunkovej (aktivácia T-killerov) aj humorálnej imunity (aktivácia B-lymfocytov).

Tradičná vakcinácia rozpustnými proteínovými antigénmi je zameraná na mobilizáciu T-pomocníkov. Relatívne nízka odpoveď T-helperov je jednou z nevýhod DNA vakcín. Súčasná generácia DNA vakcín tiež nie je schopná vyvolať produkciu vysokých titrov protilátok. Na zvýšenie aktivácie pomocných T-buniek musí byť antigén presmerovaný do dráhy MChS-II. Na tento účel je do DNA vakcíny zabudovaný signál lyzozomálnej lokalizácie; syntetizovaný antigén bude poslaný do lyzozómov, čo znamená, že sa vydá cestou MChS-II

Stratégie na zlepšenie účinnosti DNA vakcíny

Hlavná otázka týkajúca sa budúcnosti DNA vakcín sa týka toho, ako zvýšiť ich účinnosť. V súčasnosti prebieha veľké množstvo štúdií na optimalizáciu vyvinutých DNA vakcín. Hľadanie riešenia sa uskutočňuje dvoma smermi: zvýšením expresie vakcíny a zvýšením imunogenicity kódovaného antigénu.

Optimalizácia transkripčných prvkov

Dôležitou zložkou DNA vakcíny je promótor. Bakteriálne promótory nie sú vhodné na antigénnu expresiu v cicavčích bunkách, preto sa namiesto nich použili promótory onkogénnych vírusov. Teraz, aby sa zlepšila bezpečnosť vakcín, boli nahradené promótormi z nekarcinogénnych predmetov, ako je ľudský cytomegalovírus (CMV). Pre väčšinu DNA vakcín je tento promótor optimálnou voľbou: je vysoko exprimovaný v širokom spektre buniek. Pre génovú expresiu v špecifických tkanivách je sľubné použitie promótorov špecifických pre tento typ tkaniva. Napríklad použitie svalového promótora CPK pri podávaní vedie k desaťnásobnému zvýšeniu syntézy protilátok a indukcii odpovede T-buniek ako použitie podobnej DNA vakcíny s promótorom CMV. Promótor génu desmin kódujúci jeden z cytoskeletálnych proteínov tiež vykazoval vysokú účinnosť v myocytoch. Na zvýšenie expresie DNA vakcíny v keratinocytoch (bunkách epitelového tkaniva) sa používajú promótory génu pre metalotioneín (proteín, ktorý viaže ťažké kovy) alebo gén 3 hydroxylázy vitamínu D.

Úroveň iniciácie transkripcie má tendenciu sa zvyšovať za užívateľský účet silný promótor a zosilňovač, a ukončovacie funkcie sa môžu stať limitujúcim faktorom. Účinnosť polyadenylácie a spracovania primárneho transkriptu RNA sa mení v závislosti od sekvencie polyA signálu. To znamená, že polyadenylačná sekvencia ovplyvňuje syntézu antigénu. Napríklad široko používaný signál polyA vírusu SV40 je menej účinný ako polyadenylačný signál génu králičieho p-globínu alebo génu rastového hormónu hovädzieho dobytka.

Pre efektívnu transláciu musí mať cicavčia mRNA tzv Kozákova sekvencia. Vloženie tejto sekvencie do DNA konštruktu môže výrazne zvýšiť úroveň syntézy antigénu. Aby RNA polymeráza nepreskočila stop kodón génu a neprebehla syntéza predĺženého proteínu, ktorý potom nemôže nadobudnúť správny tvar, môže byť gén ukončený dvojitá stop linka.

Pri navrhovaní DNA vakcín sa o to tiež snažia optimalizovať svoje kodóny. Optimalizačný postup znamená nahradenie kodónov v génovej sekvencii tak, že sa nemení aminokyselinová sekvencia proteínu, ale zvyšuje sa účinnosť translácie jeho mRNA. Dôvodom je, že väčšina aminokyselín je kódovaná viac ako jednou hranicou. Každý kodón má svoju tRNA a zastúpenie rôznych tRNA v bunke nie je rovnaké a líši sa aj v závislosti od typu organizmu. Kodóny sa vyberajú takým spôsobom, aby sa prítomnosť požadovanej tRNA počas syntézy antigénu nestala obmedzujúcim faktorom.

Antigénová optimalizácia

Sila imunitnej odpovede síce koreluje s úrovňou expresie DNA vakcíny, avšak pre každý antigén existuje určité plató, po ktorom zvýšenie množstva antigénneho proteínu zvýši tvorbu protilátok. Optimalizáciou antigénu možno zároveň dosiahnuť silnejšiu imunitnú odpoveď. Napríklad tým kombinovanie antigénu s ligandom na špecifický receptor pre bunky prezentujúce antigén. Takýmto ligandom môže byť CD40 markerový proteín, extracelulárna doména tyrozínkinázy-3 v tvare Fms alebo T-killer antigén-4. V dôsledku interakcie ligand-receptor sa zvyšuje účinnosť zachytávania antigénneho proteínu APC.

Uľahčiť degradáciu antigénu v proteazóme alebo lyzozóme stimulujú aj imunitnú odpoveď. Na zvýšenie proteoliotického štiepenia antigénu sa do jeho sekvencie vloží ubikvitinačný signál. Chyba citácie: Nesprávne volanie: Vstup musí mať nepomenovaný ref tag. Použitie DNA vakcín kódujúcich namiesto celého antigénu, niekoľko epitopov rôzneho pôvodu, umožňuje výrazne rozšíriť spektrum imunitnej odpovede.

Pre protinádorové DNA vakcíny je kombinácia účinná „nádorový antigén + vírusový alebo bakteriálny antigén“. Napríklad kombinácia nádorového antigénu s epitopom tetanového toxínu výrazne zvyšuje aktiváciu zabíjačských T buniek proti rakovinovým bunkám.

Zahrnutie adjuvans

Pri použití tradičných vakcín sa k nim pridávajú adjuvans na zvýšenie imunitnej odpovede. DNA vakcína je bakteriálneho pôvodu, je teda sama o sebe imunostimulantom. Na zvýšenie imunitnej odpovede sa do DNA vakcíny vložia adjuvantné gény alebo sa použije ďalší plazmid, ktorý kóduje imunostimulačné proteíny.

Imunostimulačný účinok bakteriálnych CpG dinukleotidov

Funkcia plazmidu nie je obmedzená na dodávanie génov do buniek. Už v roku 1893 sa zistilo, že zmes bakteriálnych lyzátov znižuje progresiu rakovinových nádorov, ale až v roku 1983 sa zistilo, že imunostimulačné vlastnosti lyzátu sú spôsobené molekulami bakteriálnej DNA. V roku 1995 sa ukázalo, že imunitnú stimuláciu spôsobujú CpG motívy v bakteriálnej DNA. V baktériách, ako aj v DNA vírusoch, sú tieto motívy nemetylované. U ľudí a vyšších primátov naopak cytozín vo väčšine CpG dinukleotidov obsahuje metylovú skupinu. Preto sú CpG nemetylačné motívy vnímané ľudským telom ako molekulárne vzory spojené s patogénom (PAMP). Ramri zlúčeniny sú rozpoznávané Toll-like receptormi, ktoré sa v závislosti od typu ligandu delia na niekoľko typov. CpG nemetylačné motívy sú rozpoznávané receptorom TLR-9 umiestneným na membránach endoplazmatického retikula B lymfocytov, dendritických buniek a prirodzených zabíjačských buniek. Väzba receptora na nemetylované CpG motívy spúšťa kaskádu reakcií, ktoré indukujú syntézu prozápalových cytokínov – interferónu-1 a IL-12.

Expresia cytokínov a iných imunomodulátorov

Na DNA vakcináciu sa ako adjuvans najčastejšie používajú cytokínové gény. Cytokíny sú triedou proteínových molekúl, ktoré regulujú medzibunkové a medzisystémové interakcie v tele, najmä fungovanie imunitného systému. Všetky cytokíny, a je ich známych viac ako 30, môžu modulovať imunitnú odpoveď. Cytokíny IL2, IL-12, interferón γ, IL-15, IL-18 a IL-23 majú stimulačný účinok na T-pomocníkov prvej triedy. Cytokíny, ktoré modulujú pôsobenie T-pomocníkov druhej triedy, zahŕňajú: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 I IL-13. Typ cytokínu sa vyberie podľa toho, aký typ imunitnej odpovede sa má zvýšiť.

Pomocou chemokínov je možné dosiahnuť zvýšenie imunitnej odpovede. Chemokíny sú skupinou cytokínov, ktoré môžu spôsobiť chemotaxiu citlivých buniek, vrátane imunitných. Chemokínové receptory sa nachádzajú najmä na chemokínových bunkách prezentujúcich antigén. Väzba chemokínu na jeho receptor vedie k endocytóze komplexu antigén-chemokín vo vnútri APC. Táto stratégia sa efektívne využíva ako pri vývoji antivírusových DNA vakcín, tak aj protinádorových.

Funkciu adjuvans môže plniť aj proteín HSP70 (proteíny tepelného šoku, proteíny tepelného šoku). Imunostimulačný účinok HSP70 je založený na jeho schopnosti vstúpiť do extracelulárneho priestoru a viazať sa na APC receptory. Mechanizmus transportu HSP70 smerom von ešte nie je úplne objasnený, ale s najväčšou pravdepodobnosťou existuje niekoľko spôsobov - exocytóza, sekrécia smerom von alebo výstup cez kanál. Väzba HSP70 na jeho receptor vedie k aktivácii dendritických buniek, sprostredkúva prezentáciu antigénu a stimuluje produkciu chemokínov. Pretože antigén je fúzovaný s HSP70, vstupuje aj do extracelulárneho priestoru, takže môže byť prezentovaný cestou MES-II a aktivovať B bunky. DNA vakcíny používajú bakteriálny gén HSP70, aby sa vyhli autoimunitným reakciám.

Výhody a nevýhody DNA vakcín

Metóda DNA vakcinácie má množstvo výhod, z ktorých najdôležitejšia je spustenie humorálnej aj bunkovej imunitnej odpovede. Vakcíny na báze DNA poskytujú dlhodobú expresiu antigénu a teda stabilnú imunitnú odpoveď. Ďalšie faktory, ktoré riadia vývoj imunizácie DNA, zahŕňajú jednoduchosť a nízke náklady na výrobu vakcíny.

Výhody

Nedostatky

Antigén získava prirodzenú konformáciu Aktivácia oboch vetiev imunity: humorálnej a bunkovej Syntetizovaný antigén môže byť selektívne nasmerovaný na dráhu MES-I alebo MES-II Môže selektívne pôsobiť na rôzne populácie T-pomocníkov Poskytnite dlhodobú expresiu antigénu Jednoduchá a rýchla výroba Nízke výrobné náklady Nevyžadujú sa špeciálne skladovacie podmienky Môže sa použiť na prevenciu aj liečbu chorôb Potenciálne účinný proti širokému spektru ochorení: bakteriálne, vírusové, autoimunitné a nádorové ochorenia

Slabá imunogenicita V prípade vírusových vektorov existuje riziko integrácie cudzej DNA do bunkového genómu Možný vývoj autoimunitných reakcií Plazmidové a vírusové vektory môžu vyvolať nešpecifickú imunitnú odpoveď

Použitie DNA vakcín

Prvé klinické štúdie DNA vakcín spolu s bezpečnosťou novej metódy preukázali jej nízku účinnosť. Vedecké laboratóriá spolu s biotechnologickými spoločnosťami si uvedomili prísľub DNA imunizácie a nasmerovali svoje úsilie na optimalizáciu novej metódy a v priebehu niekoľkých rokov sa dosiahol významný pokrok. V roku 2005 získala prvá DNA vakcína schválenie FDA. Úrad pre potraviny a liečivá) na použitie u zvierat. Od roku 2013 je viac ako sto DNA vakcín v klinických skúškach a štyri DNA vakcíny sú licencované na použitie v živočíšnej výrobe.

DNA vakcíny vo veterinárnej medicíne

Všetky štyri vakcíny schválené FDA sú založené na plazmidoch. Pri troch z nich výrobca odporučil spôsob podania – intramuskulárne, pri vakcíne LifeTide® injekciu kombinovanú s elektroporáciou. Ak sú ostatné vakcíny zamerané na aktiváciu imunitného systému, potom pre vakcínu LifeTide® je imunostimulačný účinok dodatočný. Produktom vakcíny je somatoliberín, hormón, ktorý stimuluje uvoľňovanie rastového hormónu a prolaktínu hypofýzou. Pôsobenie posledných dvoch hormónov u ošípaných vedie k zvýšeniu hmotnosti zvierat a zvýšeniu počtu vrhov. Súčasne zavedenie plazmidu kódujúceho somatoliberín do zvierat stimuluje produkciu T-lymfocytov, prirodzených zabijakov, a preto zvyšuje imunitnú odolnosť organizmu.

Značka vakcíny	Rok licencie	Cieľ	Zviera	Očkovací produkt	Účel vakcíny
West Nile-Innovator® (USA)	2005	Vírus západného Nílu	Kone	Štrukturálny proteín vírusu PreM-E	Ochrana pred vírusom
Apex-IHN® (Kanada)	2005	Pôvodca infekčnej nekrózy hematopoetického tkaniva	Ryby z rodiny lososov	Vírusový glykoproteín	Zvýšenie množstva a kvality krmiva pre ryby
LifeTide® SW 5 (Austrália)	2008	Rastový hormón	Ošípané a iné hospodárske zvieratá	Prasací somatoliberín	Zvýšená podstielka u prasníc; významne znižuje zníženie perinatálnej mortality a morbidity
ONCEPT® (USA)	2010	Melanóm	Psy	Ľudská tyrozináza	Ako alternatíva radiačnej terapie a chirurgického zákroku pri liečbe melanómu

Vyhliadky na očkovanie DNA

DNA vakcíny proti rakovine

Zatiaľ čo indukcia bunkových a humorálnych imunitných odpovedí bola presvedčivo preukázaná pre cudzie antigény spojené s infekčnými chorobami, použitie DNA vakcín na liečbu rakoviny bolo zatiaľ menej úspešné. Vyvolanie účinnej protinádorovej imunity je náročná úloha. Klinické štúdie potvrdili celkovú bezpečnosť a nízku toxicitu protinádorových DNA vakcín, avšak účinnosť imunitnej odpovede, ktorú vyvolali, sa ukázala byť slabá a protinádorová aktivita je v niektorých prípadoch všeobecne pochybná.

DNA vakcíny proti vírusovým a bakteriálnym patogénom

DNA vakcína proti zubnému kazu

Príčinou zubného kazu je lokálna zmena pH v dôsledku fermentácie (glykolýzy) sacharidov uskutočňovanej baktériami. Vedci z Wuhanského virologického inštitútu (Čína) vyvinuli DNA vakcínu namierenú proti jednému z patogénov zubného kazu - Streptococcus mutans. Vakcína je založená na plazmide a kóduje dva proteíny: povrchový proteín St. mutans PAc a bičík, odvodený z baktérie Salmonella ktorý pôsobí ako adjuvans. V štádiu predklinických štúdií bola vakcína aplikovaná cez nos laboratórnym hlodavcom, následne bola u zvierat skontrolovaná hladina imunoglobulínov G v krvnom sére a sekrečných imunoglobulínov A v slinách. Po štúdiách vedci zistili, že hladina imunitných proteínov v krvi a slinách sa zvýšila, ale čo je dôležitejšie, rast kolónií bol inhibovaný. Streptococcus mutans na zubnej sklovine. To znamená, že zuby očkovaných zvierat boli lepšie chránené pred kazom.

DNA vakcíny a liečby autoimunitných ochorení

DNA vakcína proti cukrovke 1. typu

Diabetes mellitus 1. typu je charakterizovaný stratou beta buniek produkujúcich inzulín, ktoré sa nachádzajú v Langerhansových ostrovčekoch pankreasu. Hlavnou príčinou straty beta buniek je autoimunitné poškodenie zabíjačskými T bunkami. Na ochranu beta buniek pred nadmerne aktívnym imunitným systémom vyvinuli vedci z univerzít Stanford (USA) a Leiden (Holandsko) DNA vakcínu BHT-3021. Vakcína bola vytvorená na báze plazmidu a kóduje prekurzor inzulínu, proinzulín. Ide o retroaktívnu vakcínu: ak majú konvenčné vakcíny aktivovať imunitné reakcie, potom BHT-3021 naopak neutralizuje cytotoxický účinok T-killerov namierených proti Langerhansovým ostrovčekom.

V prvej fáze klinických skúšok preukázal BHT-3021 svoju účinnosť v skupine 80 ľudí. Polovica z nich dostávala intramuskulárne injekcie BHT-3021 každých sedem dní počas 12 týždňov a druhá polovica dostávala placebo. Po tomto období skupina, ktorá dostala vakcínu, vykazovala zvýšenie hladiny C-peptidov v krvi, čo poukazuje na obnovenie funkcie beta-buniek. U jedného z účastníkov neboli zaznamenané žiadne závažné vedľajšie účinky. Účinok vakcíny sa udržal 2 mesiace.

Úvod

1 Hlavné skupiny enzýmov genetického inžinierstva

1.1 Reštrikčné enzýmy

1.1.1 Mechanizmus účinku restriktáz

1.1.2 Konštrukcia máp obmedzení

1.3 Ligázy

2 Zavedenie nového génu do bunky

2.1 Regulácia génovej expresie u prokaryotov

2.2 Spôsoby priameho zavedenia génu do bunky

2.3 Zavedenie génov do buniek cicavcov

2.4 Genetická transformácia somatických buniek cicavcov

2.5 Génová terapia

2.6 Získavanie transgénnych zvierat

Záver

Bibliografia

Úvod

Genetické inžinierstvo je in vitro konštrukcia funkčne aktívnych genetických štruktúr (rekombinantná DNA), alebo inak povedané, vytváranie umelých genetických programov (Baev A. A.). Genetické inžinierstvo je podľa E. S. Piruzyana systém experimentálnych metód, ktoré umožňujú v laboratóriu (v skúmavke) konštruovať umelé genetické štruktúry vo forme takzvaných rekombinantných alebo hybridných molekúl DNA.

Hovoríme o riadenej, podľa vopred stanoveného programu, výstavbe molekulárno-genetických systémov mimo tela s ich následným zavedením do živého organizmu. V tomto prípade sa rekombinantná DNA stáva integrálnou súčasťou genetického aparátu organizmu príjemcu a prepožičiava mu nové jedinečné genetické, biochemické a následne fyziologické vlastnosti.

Cieľom aplikovaného genetického inžinierstva je navrhnúť také molekuly rekombinantnej DNA, ktoré by po zavedení do genetického aparátu poskytli telu vlastnosti užitočné pre ľudí.

Technológia rekombinantnej DNA využíva nasledujúce metódy:

Špecifické štiepenie DNA reštrikčnými nukleázami, urýchlenie izolácie a manipulácie s jednotlivými génmi;

Rýchle sekvenovanie všetkých nukleotidov purifikovaného fragmentu DNA, ktoré vám umožňuje určiť hranice génu a ním kódovanú sekvenciu aminokyselín;

Konštrukcia rekombinantnej DNA;

Hybridizácia nukleových kyselín, ktorá umožňuje detekciu špecifických sekvencií RNA alebo DNA s väčšou presnosťou a citlivosťou na základe ich schopnosti viazať komplementárne sekvencie nukleových kyselín;

DNA klonovanie: in vitro amplifikácia polymerázovou reťazovou reakciou alebo vloženie fragmentu DNA do bakteriálnej bunky, ktorá po takejto transformácii tento fragment reprodukuje v miliónoch kópií;

Zavedenie rekombinantnej DNA do buniek alebo organizmov.

História genetického inžinierstva

Genetické inžinierstvo sa objavilo vďaka práci mnohých výskumníkov v rôznych odvetviach biochémie a molekulárnej genetiky. Po mnoho rokov sa proteíny považujú za hlavnú triedu makromolekúl. Dokonca sa predpokladalo, že gény sú proteínovej povahy. Až v roku 1944 Avery, McLeod a McCarthy ukázali, že DNA je nositeľom dedičnej informácie. Odvtedy sa začalo intenzívne štúdium nukleových kyselín. O desaťročie neskôr, v roku 1953, J. Watson a F. Crick vytvorili model dvojvláknovej DNA. Tento rok sa považuje za rok zrodu molekulárnej biológie.

Na prelome 50. a 60. rokov 20. storočia boli objasnené vlastnosti genetického kódu a koncom 60. rokov bola experimentálne potvrdená jeho univerzálnosť. Došlo k intenzívnemu rozvoju molekulárnej genetiky, ktorej objektom boli E. coli, jej vírusy a plazmidy. Boli vyvinuté metódy na izoláciu vysoko purifikovaných prípravkov intaktných molekúl DNA, plazmidov a vírusov. DNA vírusov a plazmidov bola zavedená do buniek v biologicky aktívnej forme, čím sa zabezpečila jej replikácia a expresia zodpovedajúcich génov. V 70. rokoch bolo objavených množstvo enzýmov, ktoré katalyzujú reakcie transformácie DNA. Pri vývoji metód genetického inžinierstva zohrávajú osobitnú úlohu reštrikčné enzýmy a DNA ligázy.

História vývoja genetického inžinierstva sa dá rozdeliť do troch etáp. Prvá etapa je spojená s preukázaním zásadnej možnosti získania molekúl rekombinantnej DNA in vitro. Tieto práce sa týkajú produkcie hybridov medzi rôznymi plazmidmi. Bola preukázaná možnosť vytvorenia rekombinantných molekúl pomocou pôvodných molekúl DNA z rôznych druhov a kmeňov baktérií, ich životaschopnosť, stabilita a fungovanie.

Druhá etapa je spojená so začiatkom prác na získavaní rekombinantných molekúl DNA medzi chromozomálnymi génmi prokaryotov a rôznych plazmidov, čo dokazuje ich stabilitu a životaschopnosť.

Treťou etapou je začiatok prác na inklúzii eukaryotických génov, najmä živočíšnych, do molekúl vektorovej DNA (DNA slúžiaca na prenos génov a schopná integrácie do genetického aparátu bunky príjemcu).

Formálne treba za dátum zrodu genetického inžinierstva považovať rok 1972, keď P. Berg, S. Cohen, H. Boyer a spolupracovníci vytvorili prvú rekombinantnú DNA obsahujúcu fragmenty DNA vírusu SV40, bakteriofága a E. coli v Stanforde. univerzite.

1 Hlavné skupiny enzýmov genetického inžinierstva

Genetické inžinierstvo je potomkom molekulárnej genetiky, ale za svoj zrod vďačí úspechom genetickej enzymológie a chémie nukleových kyselín, keďže enzýmy sú nástrojmi molekulárnej manipulácie. Ak niekedy vieme pracovať s bunkami a bunkovými organelami pomocou mikromanipulátorov, tak pri práci s makromolekulami DNA a RNA nepomôžu žiadne, ani tie najmenšie mikrochirurgické nástroje. Čo robiť? Enzýmy fungujú ako "skalpel", "nožnice" a "nite na šitie".

Iba oni dokážu nájsť určité sekvencie nukleotidov, „vyrezať“ tam molekulu, alebo naopak „zatracovať“ dieru v reťazci DNA. Tieto enzýmy pracujú v bunke už dlhú dobu, vykonávajú prácu replikácie (zdvojenia) DNA počas bunkového delenia, opravy poškodení (obnovenie integrity molekuly), v procesoch čítania a prenosu genetickej informácie z bunky do bunky. alebo v bunke. Úlohou genetického inžiniera je vybrať enzým, ktorý by spĺňal stanovené úlohy, to znamená, že by mohol pracovať s konkrétnym úsekom nukleovej kyseliny.

Treba si uvedomiť, že enzýmy používané v genetickom inžinierstve nie sú druhovo špecifické, takže experimentátor môže spojiť fragmenty DNA akéhokoľvek pôvodu do jedného celku v ním zvolenej sekvencii. To umožňuje genetickému inžinierstvu prekonať druhové bariéry vytvorené prírodou a uskutočniť medzidruhové kríženie.

Enzýmy používané pri konštrukcii rekombinantnej DNA možno rozdeliť do niekoľkých skupín:

Enzýmy, ktoré produkujú fragmenty DNA (reštrikčné enzýmy);

Enzýmy, ktoré syntetizujú DNA na templáte DNA (polymeráza) alebo RNA (reverzná transkriptáza);

Enzýmy, ktoré spájajú fragmenty DNA (ligázy);

Enzýmy, ktoré umožňujú meniť štruktúru koncov fragmentov DNA.

1.1 Reštrikčné enzýmy

Všeobecne sa uznáva, že výrazy "reštrikčný enzým", "reštrikčná endonukleáza" a "miestne špecifická endodeoxyribonukleáza" sa považujú za synonymá.

Všetky bakteriálne reštrikčné endonukleázy rozpoznávajú špecifické, skôr krátke sekvencie DNA a viažu sa na ne. Tento proces je sprevádzaný rozrezaním molekuly DNA buď na samotnom rozpoznávacom mieste alebo na inom mieste, ktoré je určené typom enzýmu. Spolu s reštrikčnou aktivitou má bakteriálny kmeň schopnosť metylovať DNA; tento proces sa vyznačuje rovnakou špecifickosťou pre sekvencie DNA ako pre reštrikciu. Metyláza pridáva metylové skupiny k adenínovým alebo cytozínovým zvyškom na rovnakom mieste, kde sa viaže reštrikčný enzým. V dôsledku metylácie sa miesto stáva odolným voči reštrikcii. Preto metylácia chráni DNA pred prerezaním.

Existujú 3 hlavné triedy obmedzení: 1, 2 a 3.

Všetky reštrikčné enzýmy rozpoznávajú striktne definované sekvencie na dvojvláknovej DNA, ale reštrikčné enzýmy 1. triedy vykonávajú zlomy v ľubovoľných bodoch molekuly DNA a reštrikčné enzýmy 2. a 3. triedy rozpoznávajú a štiepia DNA v presne definovaných bodoch v rámci molekuly DNA. rozpoznávacie miesta alebo v pevnej vzdialenosti od nich.vzdialenosť.

Enzýmy typu 1 a 3 majú komplexnú podjednotkovú štruktúru a majú dva typy aktivít – modifikujúcu (metylačnú) a ATP-dependentnú endonukleázu.

Enzýmy druhej triedy pozostávajú z 2 samostatných proteínov: reštrikčnej endonukleázy a modifikujúcej metylázy, preto sa v genetickom inžinierstve používajú iba enzýmy triedy 2. Potrebujú horčíkové ióny ako kofaktory.

V súčasnosti bolo izolovaných viac ako 500 restriktáz triedy 2, avšak medzi enzýmami izolovanými z rôznych mikroorganizmov sú také, ktoré rozpoznávajú rovnaké sekvencie na DNA. Takéto páry alebo skupiny sa nazývajú izoschizoméry. Pravá izoschizoméria sa rozlišuje, keď enzýmy rozpoznávajú rovnakú nukleotidovú sekvenciu a zlomia DNA v rovnakých bodoch, a falošná, keď enzýmy, rozpoznávajúce rovnaké miesto na DNA, robia zlomy v rôznych bodoch toho istého miesta.

Väčšina restriktáz triedy 2 rozpoznáva sekvencie obsahujúce od 4 do 6 nukleotidových párov, takže restriktázy sú rozdelené na malé a veľké. Reštrikčné enzýmy s malým štiepením rozpoznávajú tetranukleotid a zavádzajú do molekúl oveľa viac zlomov ako reštrikčné enzýmy s veľkým štiepením, ktoré rozpoznávajú sekvenciu šiestich nukleotidových párov. Je to spôsobené tým, že pravdepodobnosť výskytu určitej sekvencie štyroch nukleotidov je oveľa vyššia ako sekvencie šiestich nukleotidov. Napríklad 40 000 bp DNA bakteriofága T7 nemá sekvenciu rozpoznávanú R1 z E. coli.

Malé štiepiace sa restriktázy zahŕňajú Hpa II a Alu (z Arthrobacter luteus), veľké štiepenie - Eco R I (z Escherichia coli) a Hind III. Ak predpokladáme, že rozpoznávacie miesta reštrikčných enzýmov sú náhodne rozdelené pozdĺž reťazca DNA, potom by sa cieľ pre enzýmy rozpoznávajúce sekvenciu (miesto) štyroch nukleotidov mal vyskytovať v priemere 1 krát každých 256 párov báz a pre enzýmy rozpoznávajúce šesť nukleotidov po 4096 párov báz. Ak je reštrikčné miesto vo vnútri génu, potom ošetrenie DNA reštrikčným enzýmom povedie k jeho inaktivácii. Pravdepodobnosť takejto udalosti je veľmi vysoká pri liečbe maloreznými restriktázami a nevýznamná pri použití veľkorezných endonukleáz. Preto sa na získanie intaktného génu uskutočňuje štiepenie striedavo niekoľkými veľkými reznými restriktázami, alebo sa používa metóda „podreštrikcia“, t.j. obmedzenie sa uskutočňuje za podmienok, keď štiepenie prebieha len na jednom mieste.

Rekombinantná DNA sa zavádza do recipientných buniek. V genetickom inžinierstve hrajú takéto recipientné bunky dve úlohy. 1. Umožňujú vyhľadávanie klonov syntetizovanej rekombinantnej DNA v génovej banke. 2 Následne môžu byť takéto recipientné bunky použité na získanie cieľových produktov.

Spôsob zavedenia rekombinantnej DNA sa berie do úvahy na základe toho, aký typ vektora bola takáto rekombinantná DNA získaná a do buniek ktorých organizmov je potrebné ju zaviesť transformáciou bunky alebo protoplastu, prípadne metódou elektroporácie. Ak sa získa rekombinantná DNA na báze fágov, môže sa zaviesť do izolovanej DNA – ide o transvekciu. Je možné zaviesť neporušené fágové častice - ide o infekciu (kozmidy, fazmidy).

DR. metódy genetickej výmeny – konjugácia, transdukcia.

V rastlinných bunkách - transformácia rastlinných protoplastov, ošetrenie rastlinných buniek alebo tkanív rekombinantnou DNA; injekcie rekombinantnej DNA do jadra sú široko používané; použitie lipozómov. Lipozómy sú sférické štruktúry, ktoré majú lipidový obal, vo vnútri ktorého je rekombinantná DNA. Na zavedenie do živočíšnych buniek - vírusové infekcie, elektroporačná metóda, mikroinjekcie do jadra. Ak ju po zavedení rekombinantnej DNA zdedia všetky bunky v tele, potom sa hovorí o získaní transgénneho organizmu.

Elektroporácia – bunky alebo protoplasty sú na krátky čas vystavené vysokonapäťovému prúdu (2000-4000 voltov). V dôsledku toho sa v bunkovej membráne vytvárajú póry cca. 30 nm, ktorý môže existovať 1-2 minúty a cez ktorý môže rekombinantná DNA vstúpiť do bunky. Póry sa potom uzavrú a DNA zostane v bunke. Toto je univerzálny spôsob.

balistická metóda- používa sa najmä v eukaryotoch. Používajú sa balistické pištole, do ktorých sa zavádzajú častice AK alebo W, na ktoré sa nastrieka rekombinantná DNA. Potom sa pomocou inertných plynov pri P takéto častice vystrelia z pištole do bunkovej kultúry. Podľa rôznych vzorov niektoré častice vstupujú do jadra a rekombinantná DNA sa tam zadržiava.

Vyhľadajte klony s rekombinantnou DNA.

Táto fáza je náročná a nepredvídateľná.

Najjednoduchšou metódou je vyhľadávanie klonov podľa fenotypu po zavedení rekombinantnej DNA(napr. pigmentácia). Môžu sa použiť komplementačné testy, ale je potrebné mať mutantné bunky, ktoré sú defektné v syntéze aktívneho produktu.

Hybridizačné metódy – je potrebná prítomnosť špecificky značených sond DNA alebo RNA. Častejšie sú označené P 32. Sondy m. krátke oligonukleotidové sekvencie, ktoré zodpovedajú najkonzervatívnejšej časti hľadaného génu. Tieto konzervované sekvencie môžu obsahovať až 100 nukleotidov pre prokaryoty a až 1000 pre eukaryoty.

Po zavedení rekombinantnej DNA sa kolónie vytvorené na médiu prenesú na špeciálny nitrocelulózový filter. Sú podrobené lýze a následnej denaturácii DNA pomocou alkálií. DNA sa silne viaže na filter. Filter sa premyje a spracuje rádioaktívne značenou sondou a určí sa klon, s ktorým táto sonda prišla do kontaktu.

Imunochemické metódy - klony po zavedení rekombinantnej DNA sú lyzované a ošetrené protilátkami proti zodpovedajúcemu produktu. Tieto protilátky sú označené.

Proces zavádzania rekombinantnej DNA do bakteriálnej bunky sa nazýva tzv transformácia. Výsledkom transformácie je získanie nových sekvencií DNA a následne nových fenotypových znakov hostiteľskou bunkou, napríklad rezistencia na niektoré antibiotiká. Hostiteľská bunka použitá v takýchto experimentoch musí mať najmä určitý fenotyp r-, t.j. nemal by obsahovať reštrikčné enzýmy; musí byť neschopný všeobecnej rekombinácie ( recA-) takže exogénna DNA nie je modifikovaná homológnou rekombináciou. Jednou z najpoužívanejších kultúr na tento účel je laboratórny kmeň baktérií. E.coli- kmeň K12.

Bunky, ktoré môžu absorbovať cudziu DNA, sa nazývajú kompetentných. kompetencie E. coli je potrebné vyvolať a niektoré iné baktérie majú túto vlastnosť spočiatku. Podiel kompetentných buniek možno zvýšiť použitím špeciálneho živného média alebo kultivačných podmienok. V prípade baktérií odolných voči chemickým induktorom spôsobilosti alebo bez prirodzenej kompetencie sa používajú iné systémy dodávania DNA.

Najčastejšie používané metódy transformácie bakteriálnych buniek v laboratórnej praxi sú:

Transformácia E.coli pôsobením chloridu vápenatého;

elektroporácia– zvýšenie priepustnosti buniek vplyvom prúdového impulzu s trvaním ~4,5 ms;

Výsledky transformácie možno kvantifikovať: určením buď frekvencia, alebo efektívnosť transformácií.

Transformačná frekvencia je podiel buniek v populácii buniek, ktoré dostali cudziu DNA; vyjadrené ako počet transformantov k celkovému počtu buniek.

Účinnosť transformácie- počet transformantov na 1 ug DNA odobratej na transformáciu.

Informácie o klonovaní rekombinantnej DNA pomocou plazmidového vektora pBR322 uvedené v tejto časti sú zhrnuté vo forme experimentálnej schémy a sú uvedené na obrázku 20.

Ryža. 20. Klonovanie DNA v plazmidovom vektore pBR322

1, 2, 3, 4 a 5 - fázy postupu klonovania (pozri text).

1. DNA pBR322 sa štiepi reštrikčnou endonukleázou Pstl v mieste ampicilínovej rezistencie.

2. Fragmenty donorovej DNA, tiež získané použitím Pstl a s lepivými koncami, ako je linearizovaný vektor pBR322, sa ligujú s vektorovou DNA pomocou DNA ligázy. Dôsledkom vytvorenia takéhoto konštruktu je deštrukcia génu, ktorý poskytuje rezistenciu na ampicilín. Takto sa vytvorí rekombinantná DNA, keď sa zavedie do buniek E.coli nebudú schopné zabezpečiť ich prežitie na médiu s ampicilínom.

3. Bunky E.coli transformovať rekombinantnou DNA.

4. Po transformačnom postupe sa bunková suspenzia umiestni na agarové platne a živné médium obsahujúce antibiotikum tetracyklín. V tomto štádiu nastáva selekcia, t.j. výber buniek, ktoré sú schopné rásť na médiu s tetracyklínom. Bunky pestované na tomto agare obsahujú rekombinantnú DNA a pBR322 DNA, ktoré neobsahujú inzert donorovej DNA; obnovili pôvodnú štruktúru vektora.

5. Jednotlivé bunkové kolónie E.coli pestované na pohári s tetracyklínom, subkultúra dvoch pohárov na pohároch, z ktorých jeden obsahuje agar s ampicilínom a druhý s tetracyklínom. Bunky obsahujúce rekombinantnú plazmidovú DNA rastú iba na tetracyklínovom agare, pretože gén, ktorý poskytuje rezistenciu na ampicilín, je deštruktúrovaný v dôsledku inzercie donorovej DNA. Kým bunky z pôvodného, ​​t.j. izolovaného pBR322 vektora DNA rastú na oboch platniach, pretože gény pre rezistenciu na obe antibiotiká sú v natívnych, t.j. v pôvodnom stave.

Z buniek vybraných klonov E.coli extrahovať plazmidovú DNA a analyzovať jej štruktúru.

Iné plazmidové vektory

Éra vektora pBR322, ktorú začali Bolivar a Rodriguez na samom začiatku 80. rokov, trvá dodnes. Avšak pri všetkej svojej spoľahlivosti a klasickej zhode so všetkými požiadavkami na vektory má tento vektor len niekoľko vhodných miest na klonovanie. Navyše selekcia transformovaných buniek v experimentoch s rekombinantnou DNA na jej základe trvá dlho. Bolo potrebné vyvinúť alternatívne, pokročilejšie, klonovacie systémy. Tak bola vytvorená skupina vektorov rodiny pUC. V názve vektorov tejto rodiny sú písmená „U“ a „C“ prvé písmená zo slov Kalifornská univerzita. Vedci z tejto univerzity vytvorili sériu vektorov, ktoré majú dôležitú vlastnosť – prítomnosť v štruktúre DNA integrovaného syntetického polylinkerčo je nukleotidová sekvencia zložená z rozpoznávacích miest pre množstvo reštrikčných endonukleáz jedinečných pre tento vektor - MCS (Multiple Cloning Sites). Názvy jednotlivých vektorov z rodiny pUC sa líšia dvojciferným číslom a primárna štruktúra rôznych vektorov sa líši v zložení miest MCS MCS - Multiple Cloning Sites v polylinkeri.

Pozrime sa podrobnejšie na vlastnosti vektorov zahrnutých v tejto skupine, pričom ako príklad použijeme vektor pUC19 (obr. 21).

Plazmid pUC19 je dlhý 2686 bp. a obsahuje: gén rezistencie na ampicilín; regulovaný segment génu β-galaktozidázy (lacZ") laktózový operón E. coli gén lacI, kódujúci represor, ktorý riadi génovú expresiu lacZ"; polylinker - krátka sekvencia s mnohými jedinečnými rozpoznávacími miestami pre endonukleázy (EcoRI, SacI, KrpI, Xmal, Smal, BamHI, Xbal, SalI, HincII, AccI, BspMI, PstI, Sphl a HindIII); začiatok replikácie plazmidu ColE1.

Ryža. 21. Plazmidový vektor pUC19

Mapa je vysvetlená v texte.

Prítomnosť génu, ktorý poskytuje rezistenciu voči ampicilínu v plazmide pUC19, umožňuje selekciu klonov E. coli obsahujúcich tento vektor alebo na ňom založenú rekombinantnú DNA na živnom médiu s týmto antibiotikom. Takéto modulárne prvky štruktúry uvažovaného vektora ako lacZ", lacI a MCS umožňujú urýchliť a zintenzívniť selekciu klonov s rekombinantnou DNA.

Ak sa bunky obsahujúce nemodifikovaný plazmid pUC19 pestujú v prítomnosti izopropyl-β-D-tiogalaktopyranozidu (IPTG), ktorý je induktorom lac- operón, potom génový produkt lacI, tzv represor nebude schopný viazať sa na promótor-operátorovú oblasť génu lacZ", a v dôsledku toho dôjde k transkripcii a translácii plazmidového fragmentu génu lacZ". Produkt tohto fragmentu sa bude viazať na proteín kódovaný chromozomálnou DNA ( α-komplementácia), a v dôsledku toho sa tvorí aktívna ß-galaktozidáza. Sekvencia s viacerými reštrikčnými miestami (polylinker) je vložená do génu lacZ" tak, že neovplyvňuje tvorbu funkčnej β-galaktozidázy a ak je v médiu prítomný jej substrát 5-bróm-4-chlór-3-indolyl-β-D-galaktopyranozid (X-Gal), potom bude hydrolyzované pôsobením tohto enzýmu za vzniku modrého produktu, ktorý farbí kolónie buniek obsahujúcich nemodifikované, t.j. bez inzercie cudzej DNA, plazmidu pUC19 (obr. 22).

Ryža. 22. Sekvencia postupov klonovania DNA vo vektore pUC19.

1, 2, 3 a 4 - fázy klonovania (pozri text)

1. Donorová DNA je ošetrená jednou z reštrikčných endonukleáz, pre ktorú existuje miesto v polylinkeri. DNA vektora pUC19 sa ošetrí rovnakým enzýmom

2. Ligácia linearizovaného vektora a inzertu s T4 DNA ligázou.

3. Po ligácii s inkubačnou zmesou sa transformujú bunky schopné α-komplementácie, ktoré dokážu syntetizovať tú časť ß-galaktozidázy (LacZα), ktorá je napojená na génový produkt lacZ" s tvorbou aktívneho enzýmu.

4. Ošetrené bunky sa naočkujú na živné médium s ampicilínom, IPTG a substrátom pre ß-galaktozidázu. Netransformované bunky nemôžu rásť v prítomnosti ampicilínu a bunky nesúce intaktný plazmid tvoria modré kolónie na médiu s ampicilínom. Hostiteľské bunky nesúce hybrid, t.j. rekombinantný, plazmid, tvoria biele kolónie na rovnakom médiu. Je to spôsobené tým, že zvyčajne, keď sa cudzia DNA vloží do polylinkera, nemôže sa vytvoriť kompletný génový produkt. lacZ" a následne sa v procese α-komplementácie nevytvorí aktívna ß-galaktozidáza, ktorá štiepi substrát X-Gal na produkt, ktorý zaisťuje modré farbenie buniek kolónií.

Vektory založené na bakteriofágu λ

Plazmidové vektory umožňujú klonovať fragmenty DNA, ktorých veľkosť nepresahuje 10 kb. Na vyriešenie problému klonovania chromozomálnej DNA aj malého organizmu, napríklad baktérie, je však potrebné vytvárať kompletné zbierky týchto fragmentov DNA, preto je často potrebné pracovať s väčšími fragmentmi. Na tento účel sa používajú vektory založené na bakteriofágu λ E. coli.

Keď fág λ prenikne do buniek E. coli. Existujú dve alternatívne cesty vývoja udalostí:

1. lytický cyklus- fág sa začne aktívne množiť a asi po 20 minútach je bunka zničená s uvoľnením až 100 nových fágových častíc.

2. Stav lyzogenézy– Fágová DNA je zahrnutá v chromozóme E. coli ako profág a replikuje sa v bunke spolu s normálnymi bakteriálnymi bunkami. Za nepriaznivých podmienok (nedostatok výživy) sa však spustí lytický cyklus (obr. 23):

1. Počas replikácie cDNA bakteriofága λ sa vytvorí lineárna molekula pozostávajúca z opakujúcich sa segmentov s dĺžkou približne 50 kb. Každý z týchto segmentov je fágová DNA s plnou dĺžkou ohraničená lepkavou cos-miesta - jednovláknové 5 "-"chvosty" 12 nukleotidov. Nazývajú sa lepivé ( cos) konce, pretože sú vzájomne komplementárne a môžu sa navzájom párovať ako lepkavé konce restrikčných fragmentov.

2. Hlava fága obsahuje jeden takýto segment, potom je už zostavený proces pripojený k hlave.

Ryža. 23. Lytická dráha vývoja bakteriofága λ

1 - balenie jedného segmentu kompletnej fágovej DNA do hlavy fágu; 2 - zostavenie plnohodnotnej fágovej častice.

Veľkosť DNA fágu λ je približne 50 kb a jej významná časť (asi 20 kb) nie je podstatná pre reprodukciu fága a je zodpovedná za jeho začlenenie do hostiteľskej DNA. V tejto súvislosti vznikla myšlienka, že by sa dala nahradiť fragmentom inej DNA rovnakej veľkosti. Výsledná rekombinantná molekula sa bude replikovať v bunke ako DNA "rekombinantného" fága, ktorý "vstúpil" do lytickej cesty vývoja. Rekombinantné molekuly sú zabalené do hláv bakteriofága λ in vitro a po pridaní procesov sa získajú infekčné fágové častice (obr. 24).

Ryža. 24. Použitie A-fágových vektorov na klonovanie DHA fragmentov v bunkách E. coli.

Príprava extraktov pre in vitro balenie DNA fága λ sa uskutočňuje pomocou dvoch kmeňov E.coli, z ktorých každý je lyzogénny proti určitému mutantnému kmeňu fága λ (obr. 25). Jeden z mutantov nie je schopný syntetizovať proteín A (jeden z polypeptidov fágovej terminázy), druhý nie je schopný syntetizovať proteín E (proteín hlavy fága). Oba tieto proteíny sú potrebné na balenie DNA fága λ. Extrakty „A“ a „E“ sa zmiešajú a pridajú sa konkatemerické (segmenty fágovej DNA s plnou dĺžkou polymerizované podľa cos-miesta) fágová DNA, ktorá sa viaže na terminázu predtým, ako je narezaná cos miest a zabalené do fágových hláv.

Ryža. 25. Balenie in vitro DNA fága λ

Pri balení molekuly DNA s dĺžkou menšou ako 38 kb. získa sa neinfekčná fágová častica a fragmenty s dĺžkou viac ako 52 ton, b.p. nezmestia sa do hlavy. Segmenty dlhé 50 kb. v lineárnej molekule DNA sú oddelené miestami cos a práve na týchto miestach sa molekula odreže, keď ďalší segment vyplní hlavu. Rezanie sa vykonáva pomocou enzýmu umiestneného pri vstupe do hlavy.

Proces zavádzania rekombinantnej fágovej DNA s vloženým fragmentom cudzej genetickej informácie do recipientných buniek je založený na prirodzenom jave – transdukcii fágovej DNA.

transdukcia(lat. transdukcia- pohyb) je proces prenosu bakteriálnej DNA z jednej bunky do druhej bakteriofágom. Transformácia bakteriálnych buniek pomocou rekombinantnej DNA na báze fágovej DNA teda nevyžaduje špeciálnu prípravu recipientných buniek ani žiadne špeciálne prístrojové vybavenie.

Na vyhľadávanie buniek obsahujúcich fágy s rekombinantnou DNA sa používajú metódy molekulárnej hybridizácie a imunologického skríningu, o ktorých bude reč v ďalšej časti.

[0001] Vynález sa týka oblasti biotechnológie, najmä spôsobu cieleného dodávania DNA do nádorových a kmeňových buniek exprimujúcich receptor CXCR4. Predložený vynález sa môže použiť na cielené dodávanie genetických konštruktov do kmeňových a malígnych nádorových buniek, aby sa opravili génové defekty a zabránilo sa chorobám. Spôsob zahŕňa prípravu nosičov genetických konštruktov zahrnutím signálnych sekvencií do kompozície nosičových molekúl, čo je DNA-viažuca sekvencia ôsmich aminokyselinových zvyškov lyzínu - KKKKKKKKK. Pripojenie signálnej sekvencie k DNA-väzbovej sekvencii sa uskutočňuje pomocou spojovacej sekcie dvoch molekúl kyseliny e-aminohexánovej. Potom sa vytvoria komplexy DNA/nosič. Potom sa uskutoční transfekcia in vitro. Navrhovaný vynález umožňuje zvýšiť účinnosť prenosu požadovaného génu do nádorových a kmeňových buniek. 2 w.p. f-ly, 4 chorí.

Vynález sa týka génovej medicíny, génovej terapie, biotechnológie a liečiv a môže sa použiť na cielené dodávanie genetických konštruktov do kmeňových a malígnych nádorových buniek s cieľom korigovať génové defekty a predchádzať chorobám. Tkanivovo špecifické dodávanie génových konštruktov je zabezpečené použitím signálnych sekvencií pre CXCR4 receptor, ktorý je exprimovaný v bunkách tohto typu.

To, čo odlišuje génovú terapiu od prístupov konvenčnej medicíny, je jej zameranie na boj proti príčine ochorenia, a nie na symptómy a následky. V súčasnosti sa vyvíjajú prístupy génovej terapie na liečbu alebo prevenciu širokého spektra ľudských chorôb. Tieto prístupy môžu byť aplikovateľné na in vivo a ex vivo terapiu. In vivo terapia je založená na priamom zavedení genetických konštruktov priamo do telesných tkanív. Podávanie sa môže uskutočniť intravenózne pomocou aerosólových dávkovačov alebo injekcií do špecifických tkanív. Ex vivo génová terapia je založená na izolácii špecifického typu buniek z tela, zavedení „terapeutického“ génového konštruktu do nich, selekcii transfekovaných buniek a následnej reimplantácii u pacienta.

Existujú tri hlavné smery v súčasne vyvinutých prístupoch k dodávaniu genetických konštruktov:

1) klonovanie ako súčasť vírusových vektorov;

2) použitie fyzikálnych metód transfekcie;

3) použitie komplexov plazmidových expresných vektorov a nevírusových nosných molekúl.

Vírusom sprostredkovaný prenos je vysoko účinný spôsob dodania DNA do cieľových buniek, pretože vstup modifikovaného vírusového vektora je podobný procesu, ktorý sa prirodzene vyskytuje, keď sa vírusový genóm prenesie do hostiteľských buniek. Najviac študované sú vektory vytvorené na báze retro-, adeno-, adeno-asociovaných vírusov. Medzi výhody vírusov patrí v prvom rade kombinácia vlastností expresného vektora a nosiča, možnosť špecifického doručenia, schopnosť transfekcie deliacich sa a nedeliacich sa buniek, možnosť zabudovania DNA do chromozómu pre zaistenie dlhodobé vyjadrenie. Vďaka týmto výhodám je tento prístup stále široko používaný v štúdiách dodávania génov, aj keď má určité nevýhody. Retro- a adeno-asociované vírusy majú obmedzenú veľkosť klonovaného fragmentu DNA a riziko inzerčnej mutagenézy, keď je vírus vložený do hostiteľského genómu. Závažnou nevýhodou adenovírusových vektorov je výrazná imunitná odpoveď pri vysokých dávkach a opakovaných injekciách adenovírusových konštruktov (Walther W., Stein U. Vírusové vektory na prenos génov: prehľad ich použitia pri liečbe ľudských chorôb // Drugs. - 2000. - v. 60. - S. 249-271, RF patent č. 2252255, C12N 15/37, C12N 15/86, C12N 15/861, C12N 15/867, zverejnené 20.05.2005).

Injekcia konštruktov nahej plazmidovej DNA bola jedným z prvých prístupov vo vývoji liečebných stratégií génovej terapie. Nízka účinnosť transfekcie pomocou „nahej“ DNA dala impulz vývoju nových metód na dodávanie genetických konštruktov. Boli študované rôzne fyzikálne metódy na dodávanie DNA do buniek tela. Najpopulárnejšie z nich sú metóda balistickej transfekcie a elektroporácie, ktoré sa široko používajú na transfekciu kožných a svalových buniek. Metóda balistickej transfekcie je založená na prieniku DNA nanesenej na mikročasticiach zlata alebo volfrámu do bunky. Transfekcia prebieha pod tlakom prúdu stlačeného plynu alebo kvapaliny. Metóda elektroporácie je založená na lokálnej zmene elektrického potenciálu bunkovej membrány v dôsledku pôsobenia elektrického prúdu. Elektrické impulzy vedú k tvorbe pórov v bunkovej membráne, čím sa stáva priepustnou pre biomolekuly. Na prekonanie nízkej účinnosti transfekcie nahej DNA in vivo sa používa aj metóda hydrodynamického šoku - intravenózna alebo intraarteriálna injekcia plazmidového vektora vo veľkom objeme roztoku. Hlavnými nevýhodami existujúcich fyzikálnych metód transfekcie je nízka účinnosť a lokalizácia účinku dodania DNA. Umožňujú plazmidu prekonať bunkovú membránu a vyhnúť sa inklúzii do endozómov, čím zabraňujú enzymatickej degradácii, ale spravidla neposkytujú dlhodobú perzistenciu zavedených genetických konštruktov (Wells D.J. Gene therapy progress and perspectives: elektroporation and other fyzikálne metódy // Gene Ther. - 2004. - v.11, č. - 2004. - v.245. - S.185-196; Herweijer H., Wolff J.A. Pokrok a vyhliadky: génový prenos a terapia nahej DNA // Génová terapia. - 2003. - v.10, č. 6. - P .453-458).

Nevírusové nosiče sú alternatívou k vírusom sprostredkovanému prenosu genetických konštruktov do buniek cicavcov. Nevírusové nosiče sa ľahko syntetizujú, jednoduchosť ich modifikácie umožňuje vykonávať zmeny v štruktúre a zložení molekúl, čím sa zlepšujú spôsoby podávania. Pri použití nevírusového média neexistujú žiadne obmedzenia týkajúce sa veľkosti dodaného expresného vektora. Okrem toho sú menej toxické, vo väčšine prípadov nespôsobujú špecifickú imunitnú odpoveď a ich použitie in vivo je bezpečnejšie ako vírusové vektory. Preto je možné zopakovať zavedenie genetického konštruktu zabaleného do nevírusových nosičov. Štúdium nevírusových nosičov sa vyvíja v smere zlepšovania transfekčných vlastností plazmidovej DNA tvorbou komplexov DNA s rôznymi syntetickými zlúčeninami (lipidy, oligo- a polypeptidy, polyméry atď.) (napríklad RF patent č. 2336090 , A61K 39/00, A61K 47/00, zverejnené 20.10.2008). Zlepšenie nevírusových nosičov do značnej miery závisí od podrobného pochopenia prekážok prenikania DNA do telesných buniek (Schmidt-Wolf G.D., Schmidt-Wolf I.G. Nevírusové a hybridné vektory v ľudskej génovej terapii: aktualizácia // Trends Mol Med. - 2003. - v.9, č.2. - S.67-72;Gardlic R, Palffy R, Hodosy J., Turňa J., Celec P. Vektory a doručovacie systémy v génovej terapii // Med Sci Monit - 2005. - v .11, č. 4. - P.110-121; Wiethoff C.M., Middaugh C.R. Bariéry prenosu nevírusového génu // J Pharm Sci. - 2003. - v.92, č. 2. - P .203-217).

Predpokladá sa, že nevírusový nosič by mal mať nasledujúce vlastnosti:

1) byť netoxický, kompaktný a chrániť plazmidovú DNA pred enzymatickou degradáciou, byť po použití vylučovaný z tela;

2) zabezpečiť penetráciu plazmidu do bunky špecifickou väzbou na plazmatickú membránu bunky:

3) majú schopnosť uvoľňovať DNA z endozomálneho kompartmentu;

zabezpečujú disociáciu DNA z komplexu pre následný transport plazmidu do jadra.

Na účely génovej terapie je najvýhodnejším spôsobom dodávania genetických konštruktov ich tkanivovo špecifický prenos do buniek a tkanív tela.

Prvou bariérou pre intracelulárnu penetráciu komplexov je plazmatická membrána. Väčšina komplexov interaguje s povrchom bunky pomocou elektrostatických síl. Možným mechanizmom väzby komplexov na bunku je ich interakcia s proteínmi bunkového povrchu, glykozaminoglykánmi. S týmto mechanizmom penetrácie komplexov však nedochádza k tkanivovo špecifickému prenosu génových konštruktov. Zároveň je problém tkanivovo špecifického dodávania genetických konštruktov relevantný pre génovú terapiu mnohých chorôb. Pre špecifickú interakciu s povrchom bunky zahŕňajú komplexy ligandy k receptorom na povrchu bunky. Doteraz bolo charakterizovaných množstvo integrínových peptidových ligandov. Patria sem najmä tripeptidový fragment RGD (integríny sú prítomné na povrchu mnohých buniek), transferín (jeho receptor má zvýšenú expresiu v proliferujúcich bunkách), asialorosomukoid (asialoglykoproteínový receptor má špecifickú expresiu v hepatocytoch pečene).

Na špecifické dodanie genetického materiálu do nervových buniek Zeng a kolegovia navrhli použiť nosič pozostávajúci zo signálnej oblasti k receptoru TrkA (80-108 aminokyselín z nervového rastového faktora) a DNA-viažucej sekvencie 10 lyzínových aminokyselinových zvyškov. . Tento nosič v prítomnosti endozomolytického činidla chlorochínu, ktorý uľahčuje uvoľňovanie komplexov z endozomálneho kompartmentu bunky, bol schopný tkanivovo špecificky dodať markerový gén len do buniek exprimujúcich TrkA receptor. Tento nosič je možné použiť na génovú terapiu pri liečbe rôznych neurologických ochorení, ako je epilepsia, Parkinsonova a Alzheimerova choroba. Nie je však vhodný na dodávanie genetického materiálu do iných typov buniek (Zeng J, Too HP, Ma Y, Luo E, Wang S Syntetický peptid obsahujúci slučku 4 nervového rastového faktora na cielené dodávanie génov // J Gene Med 2004; 6 : 1247 - 1256).

Ľudské kmeňové bunky sa považujú za sľubné látky pre bunkovú a génovú terapiu rôznych ľudských chorôb. Zároveň patria medzi najťažšie transfekovateľné typy buniek. Pri liečbe rakoviny génovou terapiou je potrebné zabezpečiť dodanie génov priamo do nádorových buniek.

CXCR4 je receptor faktora migrácie kmeňových buniek pre chemokín SDF-la. CXCR4 je exprimovaný v hematopoetických bunkách, vaskulárnom endoteli a svalových satelitných bunkách. Vysoká úroveň expresie tohto génu bola zaznamenaná vo viac ako 20 typoch rakovinových nádorov (rakovina prsníka, rakovina prostaty atď.), ako aj v migrujúcich kmeňových bunkách. Receptor CXCR4 je tiež schopný viazať sa na vírusový chemokín vMIP-II (vírus Kaposiho sarkómu). Začlenenie signálnych sekvencií na väzbu k receptoru CXCR4 do molekúl nosiča je teda sľubným spôsobom vytvorenia systémov na cielené dodávanie génov do nádorových a kmeňových buniek.

Na dodanie genetického materiálu do buniek exprimujúcich receptor CXCR4 Le Bon a kolegovia použili syntetický ligand pre tento receptor, AMD3100, ktorý bol spojený s polyetylénimínom alebo katiónovými lipidmi. Komplexy genetického materiálu s týmito zlúčeninami neviedli k významnému zvýšeniu účinnosti dodania markerového génu do CXCR4+ buniek v porovnaní so zlúčeninami bez signálov. Nosiče, ktoré použil Le Bon, neboli účinné, pretože špecifické podanie s ich pomocou je možné len vtedy, keď sa do transfekčného média pridá látka, ktorá podporuje internalizáciu receptora CXCR4 (forbolester). (Le Bon B, Van Craynest N, Daoudi JM, Di Giorgio C, Domb AJ, Vierling P. Konjugáty AMD3100 ako zložky cielených systémov nevírusového prenosu génov: Syntéza a účinnosť transfekcie buniek exprimujúcich CXCR4 in vitro. // Bioconjugate Chem 2004 15: 413-423).

Existuje teda potreba vytvoriť nosič genetických konštruktov, ktorý môže poskytnúť špecifické dodanie do CXCR4(+) buniek a neovplyvňovať blízke tkanivá. Takýto spôsob poskytuje predložený vynález.

Vynález je založený na úlohe vyvinúť spôsob špecifického dodania genetických konštruktov do buniek exprimujúcich receptor CXCR4, pri ktorom sa použitím nosičov genetických konštruktov obsahujúcich signálne sekvencie pre receptor CXCR4 zvýši účinnosť dodania dosiahne sa „úrokový“ gén. Je dôležité poznamenať, že syntéza nárokovaných nosičov môže byť uskutočnená s použitím akýchkoľvek známych spôsobov syntézy peptidov na pevnej fáze.

Riešením technického problému je skutočnosť, že pri metóde cielenej dodávky DNA do nádorových a kmeňových buniek exprimujúcich receptor CXCR4, vrátane prípravy nosičov genetických konštruktov zahrnutím do zloženia nosičových molekúl, čo je DNA-väzbová sekvencia ôsmich lyzínových aminokyselinových zvyškov - KKKKKKKK, signálne sekvencie, tvorba komplexov DNA/nosič, uskutočnenie transfekcie in vitro, signálna sekvencia je vybraná zo skupiny: fragment s 1 až 8 aminokyselinami sekvencia N-konca proteínu SDF-la - KPVSLSYR; fragment od 1 do 17 aminokyselín sekvencie N-konca proteínu SDF-la - KPVSLSYRCPCRFFESH, kde 9 a 11 aminokyselín je nahradených serínom; alebo fragment od 1 do 10 aminokyselín N-terminálnej sekvencie vírusového chemokínu vMIP-II - LGASWHRPDK; pripojenie signálnej sekvencie k DNA-väzbovej sekvencii sa uskutočňuje pomocou spojovacieho miesta dvoch molekúl kyseliny e-aminohexánovej.

V tomto prípade môže byť signálnou sekvenciou fragment z aminokyselín 1 až 8 sekvencie N-konca proteínu SDF-la-KPVSLSYR.

Alternatívne môže byť signálnou sekvenciou fragment z aminokyselín 1 až 17 N-koncovej sekvencie proteínu SDF-la - KPVSLSYRCPCRFFESH, kde aminokyseliny 9 a 11 sú nahradené serínom.

Fragment z aminokyselín 1 až 10 N-koncovej sekvencie vírusového chemokínu vMIP-II - LGASWHRPDK, syntetizovaný z D-aminokyselín, môže byť tiež použitý ako signálna oblasť.

Glycerol alebo chlorochín môžu byť použité ako zložka zabezpečujúca výstup z endozómov komplexov pozostávajúcich z nosičov a genetického materiálu.

Plazmidová DNA môže byť použitá ako genetický materiál pre nosiče.

Špecifikovaný technický výsledok v predloženom vynáleze sa dosahuje použitím molekúl oligolyzínu - KKKKKKKK (K8) konjugovaných so signálnymi sekvenciami k receptoru CXCR4 z proteínov SDF-1 alebo vMIP-II, konkrétne N-koncovou sekvenciou SDF-1. chemokín (s 1 až 8 aa) alebo N-koncová sekvencia chemokínu SDF-1 (od 1 do 17 aa, s nahradením 9 a 11 aa serínom) alebo N-koncová sekvencia vírusu vMIP-II chemokín (od 1 do 10 aa v D-konformácii). Prítomnosť oligolyzínu KKKKKKKK v zložení nosiča umožňuje konjugátom vytvárať komplexy s nukleovými kyselinami, najmä s plazmidom DNA, v dôsledku elektrostatickej interakcie.

Uvedený technický výsledok je dosiahnutý tromi variantmi navrhovaných médií.

Uvedený technický výsledok podľa prvého variantu je dosiahnutý tým, že v krátkom CDP nosiči na báze syntetických analógov chemokínu SDF-1, ktorý obsahuje katiónovú zložku, ktorou je K8 oligolyzín, používaný na kondenzáciu plazmidovej DNA, a ligandový komponent na interakciu s CXCR4 receptorom podľa vynálezu, fragment (1-8 aa) sekvencie N-konca proteínu SDF-1, ktorý má štruktúru KPVSLSYR a má aktivitu agonistov CXCR4 receptora, sa používa ako ligandová zložka a katiónová zložka konjugátu má štruktúru KKKKKKKK a je pripojená k ligandovej zložke cez spacer - dve molekuly kyseliny ε-aminohexánovej (Ahx).

Uvedený technický výsledok podľa druhého variantu je dosiahnutý tým, že v nosiči (long CDP) na báze syntetických analógov chemokínu SDF-1, ktorý obsahuje katiónovú zložku, ktorou je oligolyzín K8 použitý na kondenzáciu plazmidovej DNA, a ligandový komponent pre interakciu s CXCR4 receptorom, v súlade s nárokovaným vynálezom, fragment (1-17 aa; aa9 a aa11 nahradený serínom) sekvencie N-konca proteínu SDF-1, ktorý má štruktúra KPVSLSYRSPSRFFESH a majúci aktivitu agonistov receptora CXCR4, sa používa ako ligandová zložka a katiónová zložka konjugátu má štruktúru KKKKKKKK a je pripojená k ligandovej zložke cez spacer - dve molekuly kyseliny ε-aminohexánovej.

Uvedený technický výsledok podľa tretieho variantu je dosiahnutý tým, že v nosiči (vírusový CDP) na báze syntetických analógov proteínu vírusu Kaposiho sarkómu vMIP-II, ktorý obsahuje katiónovú zložku, ktorou je K8 oligolyzín, je použitý na kondenzáciu plazmidovej DNA a ligandovej zložky na interakciu s receptorom CXCR4, v súlade s nárokovaným vynálezom, fragment (1-10 Daa - syntetizovaný z D-aminokyselín) sekvencie N-konca vMIP- II proteín, ktorý má štruktúru LGASWHRPDK a má aktivitu antagonistov receptora CXCR4, sa používa ako ligandová zložka a katiónová zložka konjugátu má štruktúru KKKKKKKKK a je pripojená k ligandovej zložke cez spacer - dve molekuly ε - kyselina aminohexánová.

Všetky tri varianty nárokovaného nosiča možno syntetizovať pomocou známych metód syntézy peptidov, napríklad metódou Boc na pevnej fáze (Merrifield, R. B. Syntéza peptidov na pevnej fáze. I. Syntéza tetrapeptidu // Journal of the American Chemical Society. 1963. V.85 (14), s.2149-2154).

Konkrétne príklady implementácie

Vynález je ilustrovaný na obrázku 1, ktorý ukazuje zmenu intenzity fluorescencie etídiumbromidu so zvyšujúcim sa pomerom náboja nosič/DNA v krátkych komplexoch CDP/DNA, dlhých CDP/DNA a vírusových CDP/DNA. Zníženie intenzity fluorescencie indikuje zvýšenie hustoty vytvorených komplexov. Vyrovnanie fluorescenčných kriviek ukazuje, že komplexy dosiahli hustotu dostatočnú na potlačenie fluorescencie etídiumbromidu.

Obrázok 2 ukazuje závislosť luciferázovej aktivity v HeLa (CXCR4+) bunkách po transfekcii krátkymi CDP/DNA, dlhými CDP/DNA a vírusovými CDP/DNA komplexmi v prítomnosti endozomolytického činidla glycerolu. V tomto prípade sa použili komplexy vytvorené pri nasledujúcich pomeroch náboja nosič/DNA: 3/1, 6/1, 9/1, 12/1. Ako experimentálna kontrola slúžila intaktná molekula, DNA, komplexy PEI/DNA 1/8 (pozitívna kontrola experimentu - komerčný nosič rozvetvený polyetylénimín 25 kDa - PEI) a komplexy obsahujúce DNA a kontrolný peptid (CP). CP sa líši od nosičov v predloženom vynáleze tým, že mu chýba väzbový signál pre receptor CXCR4 a je štrukturálne oligolyzín KKKKKKKK. Účinnosť dodania markerového génu nosičmi krátkeho CDP, dlhého CDP a vírusového CDP bola 10–100-krát vyššia ako účinnosť kontrolného CP.

Obrázok 3 ukazuje závislosť luciferázovej aktivity v A172 (CXCR4+) bunkách po transfekcii krátkymi CDP/DNA, dlhými CDP/DNA a vírusovými CDP/DNA komplexmi v prítomnosti endozomolytického činidla glycerolu. Tu sme použili komplexy vytvorené v nasledujúcich pomeroch nosič/DNA náboj: 9/1, 12/1. Neporušená molekula DNA, komplexy PEI/DNA 1/8 a komplexy obsahujúce DNA a CP peptid slúžili ako experimentálne kontroly. Účinnosť dodania markerového génu nosičmi krátkeho CDP, dlhého CDP a vírusového CDP bola 10-krát vyššia ako účinnosť kontrolného CP.

Výsledky na obrázku 2 a obrázku 3 podporujú špecifickosť nosičov v predkladanom vynáleze pre CXCR4 receptor.

Obrázok 4 ukazuje závislosť luciferázovej aktivity v CHO (CXCR4-) bunkách po transfekcii krátkymi CDP/DNA, dlhými CDP/DNA a vírusovými CDP/DNA komplexmi v prítomnosti endozomolytického činidla glycerolu. Použili sa komplexy vytvorené pri nasledujúcich pomeroch náboja nosič/DNA: 9/1, 12/1. Neporušená molekula DNA, komplexy PEI/DNA 1/8 a komplexy obsahujúce DNA a CP peptid slúžili ako experimentálne kontroly. Účinnosť dodania markerového génu krátkymi CDP, dlhými CDP a vírusovými CDP nosičmi bola takmer rovnaká ako pri použití kontrolného CP.

Nosiče so signálom nie sú schopné zabezpečiť výrazne vyššiu úroveň dodania genetického materiálu v bunkách bez expresie receptora v porovnaní s kontrolou.

Implementácia vynálezu môže byť vysvetlená nasledovne. Cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť cielené dodanie genetických konštruktov do buniek exprimujúcich receptor CXCR4 s použitím nosičov genetického materiálu obsahujúceho signálne sekvencie pre tento receptor.

V prvom stupni sa uskutočňuje tvorba komplexov jedného z uskutočnení nosiča s genetickým konštruktom obsahujúcim "záujmový" gén. Vytvorené komplexy sa používajú na dodanie genetického materiálu do príslušných cieľových buniek. Analýza účinnosti bunkovej penetrácie sa hodnotí enzymatickými alebo imunohistochemickými metódami.

Tvorba komplexov sa uskutočňuje v izotonickom roztoku. Výhodný je bezsolný pufor HBM (Hepes-pufrovaný manitol). Veľkosť výsledných komplexov je 170–230 nm.

Ako genetické konštrukty v jednom z uskutočnení s použitím plazmidovej DNA.

Plazmidová DNA obsahuje marker (luc, lacZ) alebo terapeutický gén (v závislosti od ochorenia), pod kontrolou príslušných promótorov a zosilňovačov (CMV, SV40 atď.) a ďalšie prvky potrebné napríklad na replikáciu v hostiteľovi bunka alebo integrácia do genómu. V génovej terapii rakoviny je možné použiť gény pre HLA-B7, IL-2, IL-4, TNF, IFN, P53, tymidínkinázu a iné.

V inom uskutočnení sa oligonukleotidy pozostávajúce z malej DNA alebo RNA komplementárnej so špecifickou sekvenciou v mRNA alebo jej prekurzore používajú ako genetický konštrukt na potlačenie syntézy proteínového produktu alebo na odstránenie exónu nesúceho mutáciu z mRNA. Vytvorené komplexy sa používajú na dodanie genetického materiálu do buniek exprimujúcich receptor CXCR4. K penetrácii nosičových komplexov podľa predloženého vynálezu dochádza prevažne receptorom sprostredkovaným transportom väzbou na extracelulárne domény receptora CXCR4 a následnou internalizáciou receptora.

Dávka nosičov a genetického materiálu sa určuje individuálne a závisí od typu buniek, množstva receptora CXCR4 na ich povrchu a od zložitosti transfekcie týchto buniek.

Na zvýšenie účinnosti týchto nosičov sa transfekcia buniek výhodne uskutočňuje s použitím endozomolytického činidla. Patria sem glycerol, chlorochín a iné.Tieto látky sa pridávajú do transfekčného média bezprostredne pred pridaním komplexov do buniek. Zostávajú neviazané na komplexy, a preto neovplyvňujú ich štruktúru.

Peptidy, iné polymérne zlúčeniny, lipozómy schopné kompaktovať nukleové kyseliny môžu byť použité ako DNA-viažuca časť nosiča. Okrem toho môžu mať endozomolytické vlastnosti (nie je potrebné použiť ďalšie endozomolytické činidlo) a v prípade potreby (napríklad na dodanie terapeutických alebo markerových génov) dopraviť genetický materiál do jadra.

Pri výbere podmienok transfekcie sú navrhnuté tak, aby poskytovali najvyššiu efektivitu podávania. Výhodné je inkubovať komplexy s bunkami počas 4 hodín. Tento čas však môžete meniť od 3 do 6 hodín. Po uplynutí inkubačnej doby sa médium vymení a bunky sa nechajú 24-48 hodín (v závislosti od typu bunky a genetického materiálu) na expresiu vložených konštruktov s požadovaným génom alebo na prejavenie terapeutického účinku. oligonukleotidov.

Analýza účinnosti dodávania sa uskutočňuje enzymatickými alebo imunohistochemickými metódami v závislosti od typu zavedeného génového konštruktu.

Príklad 1 Tvorba komplexov DNA/nosič a štúdium procesu tvorby komplexov.

Plazmid pCLUC4 obsahujúci gén luciferázy svetlušiek pod kontrolou cytomegalovírusového promótora sa použil ako genetický materiál na cielené dodávanie génov do buniek. Bolo použité jedno z uskutočnení nosiča.

Roztoky 1 ug DNA v 40 ul 1X HBM pufra (5 % hmotn./obj. manitol, 5 mM Hepes, pH 7,5) a roztoky nosiča zodpovedajúce rôznym pomerom DNA/nosič náboja boli pripravené v rovnakom objeme pufra. Nosičový roztok sa postupne pridal do Eppendorfovej skúmavky s roztokom DNA a intenzívne sa miešal 20 sekúnd. Výsledná zmes sa nechala 30 minút pri teplote miestnosti, aby sa dokončila tvorba komplexov.

Výsledky komplexácie sa analyzujú metódou vytesňovania etídiumbromidom. Fluorescencia etídiumbromidu sa meria pomocou spektrálneho skenovacieho multimódového čítacieho zariadenia Varioscan Flash (Thermo, Fínsko). Vytesnenie etídiumbromidu sa pozorovalo pri 590 nm (excitácia pri 544 nm) po pridaní nosiča k DNA (20 ug/ml) predinkubovanej s interkalačným činidlom etídiumbromidom (400 ng/ml). Vytesnenie sa vypočítalo pomocou vzorca (F-Ff)/(Fb-Ff), kde Ff a Fb sú intenzity fluorescencie etídiumbromidu v neprítomnosti a prítomnosti DNA.Výsledky sú znázornené na obr.

Príklad 2 Uskutočnenie in vitro transfekcie.

Bunky HeLa, A172 a CHO sa naniesli na 48-jamkové kultivačné platne (Nunc) 24 hodín pred transfekciou v množstve 50 000 buniek na jamku s obsahom 500 ul štandardnej kultivačnej zmesi pozostávajúcej z kultivačného média DMEM (GIBCO), 10 % fetálneho hovädzieho séra (GIBCO), 2 mM glutamín, doplnený penicilínom (50 U/ml), streptomycínom (50 ug/ml) a 1 mM pyruvátom sodným. Suspenzia komplexov bola pripravená podľa spôsobu opísaného v príklade 1 v množstve 2 ug DNA na jamku kultivačnej platne. 10 minút pred pridaním suspenzie komplexov DNA/nosič sa bunky niekoľkokrát premyli DMEM a do každej jamky sa pridalo 500 ul média obsahujúceho 15 % glycerolu a 1,5 % etanolu. Transfekcia sa uskutočnila pridaním suspenzie komplexov DNA/nosič do média. Po vytvorení komplexov sa platne s bunkami umiestnili na 4 hodiny do termostatu s teplotou 37 °C a 5 % C02. Po inkubačnej dobe sa bunky premyli médiom DMEM a do každej jamky sa pridalo 500 ul štandardnej kultivačnej zmesi. Kultivačná platňa sa inkubovala v termostate pri teplote 37 °C a 5 % C02 počas 48 hodín, potom sa detegovala expresia markerového génu.

Príklad 3 Detekcia expresie luciferázového génu po transfekcii in vitro.

Médium sa odstránilo z kultivačných platní, bunky sa premyli v 1x PBS (pH 7,2). Do každej jamky sa pridalo 80 ul lyzačného pufra (25 M Gly-Gly, 15 mM MgS04, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF; pH 7,8). 50 ul lyzátu sa prenieslo na polystyrénové platne s nepriehľadnými stenami na meranie aktivity luciferázy. Meranie sa uskutočnilo pomocou spektrálnej skenovacej multimódovej čítačky Varioscan Flash (Thermo, Fínsko). Meranie sa uskutočňovalo s použitím roztoku luciferázovej bleskovej zmesi (20 mM tricín, 1,07 mM (MgC03) 4 Mg(OH) 2 x 5 H20, 2,67 mM MgS04, 01 mM EDTA, 33,3 mM DTT, 530 mM DTT, 5 H20 270 uM acetylkoenzým A, 470 uM luciferín). Každé meranie prebiehalo 10 sekúnd. Hodnoty prístroja sa získali v relatívnych svetelných jednotkách (RLU). Výsledky experimentu boli vyhodnotené v relatívnych svetelných jednotkách na 1 mg celkového proteínu z bunkových extraktov v jamke kultivačnej platne. Celkové množstvo proteínu v každej jamke sa meralo pomocou súpravy na testovanie proteínov (Bio-Rad) oproti štandardnej krivke pre hovädzí sérový albumín. Výsledky sú uvedené na obrázkoch 2, 3, 4.