Mechanizmus fagocytózy: štádiá a štádiá. Fagocytóza v imunitných reakciách tela
Imunita: mechanizmy nasadenia
Bunky a molekuly pôsobia v zhode a navzájom sa podporujú v rôznych štádiách vývoja imunitnej odpovede.
Nešpecifické mechanizmy
V prvej fáze zrážky s cudzím antigénom sa spustí nešpecifický patologický ochranný proces - zápal sprevádzaný fagocytózou, uvoľnením zápalových mediátorov - histamínu, serotonínu, cytokínov atď. Fagocyty (makrofágy) absorbujú antigény a kontaktujú T- pomocné lymfocyty, ktoré ich prezentujú na povrchových antigénnych determinantoch. T-pomocníci spúšťajú reprodukciu (vylučujú špecifické proteínové látky - interleukíny) klonov T-killerov a B-lymfocytov špecifických pre daný antigén z už existujúcich kmeňových buniek, ktoré boli testované na toleranciu v embryonálnom období (Burnetova klonálna selekčná teória).
Zápal (lat. inflammatio) je komplexný, lokálny a celkový patologický proces, ktorý vzniká ako reakcia na poškodenie (alteratio) alebo pôsobenie patogénneho podnetu a prejavuje sa reakciami (exudatio a pod.) zameranými na elimináciu produktov poškodenia, a ak je to možné , potom činidlá (dráždidlá), ako aj čo vedie k maximálnej obnove pre tieto stavy (proliferatio, atď.) v zóne poškodenia.Schéma vývoja zápalu. Vplyvom poškodzujúceho faktora sa makrofágom uvoľňujú prozápalové cytokíny, ktoré priťahujú ďalšie bunky do ohniska zápalu, v dôsledku čoho je ich agregáciou alebo uvoľňovaním účinných látok narušená celistvosť tkaniva. .
Fagocytóza (Fago - požierať a cytos - bunka) - proces, pri ktorom špeciálne bunky krvi a tkanív tela (fagocyty) zachytávajú a trávia patogény infekčných chorôb a odumreté bunky. Vykonávajú ho dva typy buniek: granulované leukocyty (granulocyty) cirkulujúce v krvi a tkanivové makrofágy. Objav fagocytózy patrí I. I. Mečnikovovi, ktorý tento proces odhalil tým, že robil experimenty s hviezdicami a dafniami, pričom do ich tiel vnášal cudzie telesá. Napríklad, keď Mečnikov umiestnil spóru huby do tela dafnie, všimol si, že bola napadnutá špeciálnymi mobilnými bunkami. Keď zaviedol príliš veľa spór, bunky ich nestihli všetky stráviť a zviera zomrelo. Mechnikov nazval bunky, ktoré chránia telo pred baktériami, vírusmi, spórami húb atď., fagocytmi.U ľudí existujú dva typy profesionálnych fagocytov:neutrofily a monocyty (v tkanivách - makrofágy)
Hlavné štádiá fagocytárnej reakcie sú podobné pre oba typy buniek. Reakciu fagocytózy možno rozdeliť do niekoľkých fáz:
1. Chemotaxia. Pri fagocytóze má významnejšia úloha pozitívnu chemotaxiu. Ako chemoatraktanty sú produkty vylučované mikroorganizmami a aktivovanými bunkami v ohnisku zápalu (cytokíny, leukotrién B4, histamín), ako aj štiepne produkty zložiek komplementu (C3a, C5a), proteolytické fragmenty krvnej koagulácie a faktory fibrinolýzy (trombín , fibrín), neuropeptidy, fragmenty imunoglobulínov atď. „Profesionálne“ chemotaxíny sú však cytokíny zo skupiny chemokínov.
Skôr ako iné bunky, neutrofily migrujú do ohniska zápalu a makrofágy prichádzajú oveľa neskôr. Rýchlosť chemotaktického pohybu pre neutrofily a makrofágy je porovnateľná, rozdiely v čase príchodu sú pravdepodobne spojené s rôznou rýchlosťou ich aktivácie.
2. Adhézia fagocytov k objektu.Je to kvôli prítomnosti na povrchu fagocytov receptorov pre molekuly prezentované na povrchu objektu (vlastného alebo s ním spojeného). Pri fagocytóze baktérií alebo starých buniek hostiteľského organizmu sa rozoznávajú koncové sacharidové skupiny – glukóza, galaktóza, fukóza, manóza atď., ktoré sú prítomné na povrchu fagocytovaných buniek. Rozpoznávanie je uskutočňované lektínovými receptormi s vhodnou špecifickosťou, predovšetkým proteínom viažucim manózu a selektínmi prítomnými na povrchu fagocytov.
V prípadoch, keď objektom fagocytózy nie sú živé bunky, ale kúsky uhlia, azbestu, skla, kovu atď., fagocyty najprv urobia objekt absorpcie prijateľným pre reakciu a obalia ho svojimi vlastnými produktmi, vrátane zložiek extracelulárnu matricu, ktorú produkujú.
Fagocyty sú síce schopné absorbovať rôzne druhy „nepripravených“ predmetov, ale najväčšiu intenzitu fagocytárny proces dosahuje pri opsonizácii, t.j. fixácia na povrch predmetov opsonínov, pre ktoré majú fagocyty špecifické receptory – pre Fc fragment protilátok, zložky komplementového systému, fibronektín a pod.
3. Aktivácia membrány.V tejto fáze je objekt pripravený na ponorenie. Dochádza k aktivácii proteínkinázy C, uvoľňovaniu vápenatých iónov z vnútrobunkových zásob. Veľký význam majú sol-gélové prechody v systéme bunkových koloidov a aktín-myozínové preskupenia.
4. Ponorte sa. Objekt sa balí
5. Tvorba fagozómu.Membránový uzáver, ponorenie predmetu s časťou fagocytovej membrány do vnútra bunky.
6. Tvorba fagolyzozómu.Fúzia fagozómu s lyzozómami vedie k vytvoreniu optimálnych podmienok pre bakteriolýzu a štiepenie odumretej bunky. Mechanizmy konvergencie fagozómov a lyzozómov nie sú jasné, pravdepodobne dochádza k aktívnemu pohybu lyzozómov k fagozómom.
7. Zabíjanie a štiepenie.Úloha bunkovej steny natrávenej bunky je veľká. Hlavné látky podieľajúce sa na bakteriolýze: peroxid vodíka, produkty metabolizmu dusíka, lyzozým atď. Proces deštrukcie bakteriálnych buniek je ukončený aktivitou proteáz, nukleáz, lipáz a iných enzýmov, ktorých aktivita je optimálna pri nízkej hodnoty pH.
8. Uvoľňovanie produktov degradácie.
Fagocytóza môže byť: dokončená (usmrtenie a trávenie bolo úspešné), neúplné (pre množstvo patogénov je fagocytóza nevyhnutným krokom v ich životnom cykle, napríklad u mykobaktérií a gonokokov).
aktivácia komplementu.
Systém komplementu funguje ako biochemická kaskáda reakcií. Komplement je aktivovaný tromi biochemickými cestami: klasickou, alternatívnou a lektínovou cestou. Všetky tri aktivačné dráhy produkujú rôzne varianty C3 konvertázy (proteín, ktorý štiepi C3). Klasická dráha (bola objavená ako prvá, ale je evolučne nová) vyžaduje aktiváciu protilátok (špecifická imunitná odpoveď, adaptívna imunita), zatiaľ čo alternatívna a lektínová dráha môže byť aktivovaná antigénmi bez prítomnosti protilátok (nešpecifická imunitná odpoveď). odpoveď, vrodená imunita). Výsledok aktivácie komplementu je vo všetkých troch prípadoch rovnaký: C3 konvertáza hydrolyzuje C3, vytvára C3a a C3b a spôsobuje kaskádu ďalšej hydrolýzy prvkov systému komplementu a aktivačných udalostí. V klasickej dráhe vyžaduje aktivácia C3 konvertázy vytvorenie komplexu C4b2a. Tento komplex vzniká po štiepení C2 a C4 komplexom C1. Komplex C1 sa zase na aktiváciu musí viazať na imunoglobulíny triedy M alebo G. C3b sa viaže na povrch patogénov, čo vedie k väčšiemu „záujmu“ fagocytov o bunky spojené s C3b (opsonizácia). C5a je dôležitý chemoatraktant, ktorý pomáha priťahovať nové imunitné bunky do oblasti aktivácie komplementu. C3a aj C5a majú anafylotoxickú aktivitu, priamo spôsobujúcu degranuláciu žírnych buniek (v dôsledku toho uvoľnenie zápalových mediátorov). C5b spúšťa tvorbu membránových atakujúcich komplexov (MAC), ktoré pozostávajú z C5b, C6, C7, C8 a polymérneho C9. MAC je cytolytický konečný produkt aktivácie komplementu. MAC tvorí transmembránový kanál, ktorý spôsobuje osmotickú lýzu cieľovej bunky. Makrofágy pohlcujú patogény označené komplementovým systémom.
klasickým spôsobom
Klasická dráha sa spúšťa aktiváciou komplexu C1 (zahŕňa jednu molekulu C1q a dve molekuly C1r a C1s). Komplex C1 sa viaže cez C1q na imunoglobulíny triedy M a G spojené s antigénmi. Hexamérny C1q má tvar kytice neotvorených tulipánov, ktorých "púčiky" sa môžu viazať na Fc oblasť protilátok. Na spustenie tejto dráhy stačí jedna molekula IgM, aktivácia molekulami IgG je menej účinná a vyžaduje si viac molekúl IgG.
C1q sa viaže priamo na povrch patogénu, čo vedie ku konformačným zmenám v molekule C1q a aktivuje dve molekuly serínových proteáz C1r. Štiepia C1 (tiež serínová proteáza). Komplex C1 sa potom viaže na C4 a C2 a potom ich štiepi za vzniku C2a a C4b. C4b a C2a sa navzájom viažu na povrchu patogénu za vzniku klasickej dráhy C3 konvertázy, C4b2a. Výskyt C3 konvertázy vedie k štiepeniu C3 na C3a a C3b. C3b tvorí spolu s C2a a C4b C5 konvertázu klasickej dráhy.
Alternatívna cesta
Alternatívna cesta sa spúšťa hydrolýzou C3 priamo na povrchu patogénu. Na alternatívnej dráhe sa podieľajú faktory B a D. S ich pomocou vzniká enzým C3bBb. Stabilizuje ho a zabezpečuje jeho dlhodobé fungovanie Proteín P. Ďalej PC3bBb aktivuje C3, čím sa vytvorí C5-konvertáza a spustí sa tvorba komplexu membránového útoku. K ďalšej aktivácii koncových komponentov komplementu dochádza rovnakým spôsobom ako pri klasickej dráhe aktivácie komplementu.
Alternatívna dráha sa od klasickej líši v tom, že aktivácia komplementového systému nevyžaduje tvorbu imunitných komplexov, prebieha bez účasti prvých komplementových komponentov - C1, C2, C4. Líši sa aj tým, že pôsobí ihneď po objavení sa antigénov – jeho aktivátormi môžu byť bakteriálne polysacharidy a lipopolysacharidy, vírusové častice, nádorové bunky.
Lektínová (manózová) dráha aktivácie komplementového systému
Lektínová dráha spojená s manánom (manán je polymér manózy) je homológna s klasickou aktivačnou dráhou komplementového systému. Táto dráha využíva lektín viažuci manán (MBL), proteín podobný klasickej aktivačnej dráhe C1q, ktorý sa viaže na manózové zvyšky a iné cukry na membráne, aby umožnil rozpoznanie rôznych patogénov. MBL je proteín patriaci do zbernej skupiny proteínov produkovaných pečeňou a môže aktivovať komplementovú kaskádu väzbou na povrch patogénu. MBL je 2-6 vertexová molekula, ktorá tvorí komplex s MASP-I (Mannan-binding lectin Associated Serine Protease, MBL-associated serine protease) a MASP-II. MASP-I a MASP-II sú veľmi podobné C1r a C1s klasickej aktivačnej dráhy a môžu mať spoločného evolučného predka. Keď sa vrcholy MBL určujúce uhľohydráty viažu na špecificky orientované manózové zvyšky na fosfolipidovej dvojvrstve patogénu, aktivujú sa MASP-I a MASP-II a štiepia proteín C4 na C4a a C4b a proteín C2 na C2a a C2b. C4b a C2a sa potom spoja v povrchový patogén tvorbou C3 konvertázy, zatiaľ čo C4a a C2b pôsobia ako chemoatraktanty.Bunková imunitná odpoveď
Vírus, ktorý sa dostal do tela, je endocytovaný makrofágmi a následne čiastočne zničený v endoplazmatickom retikule (1). V dôsledku toho vznikajú cudzie fragmenty, ktoré sú obnažené na bunkovom povrchu makrofágov (2). Tieto fragmenty sú „predložené“ špeciálnou skupinou membránových proteínov (MHC proteíny). Komplex vírusového fragmentu a proteín hlavného histokompatibilného komplexu [MHC (MHC)] rozpoznávajú a viažu T-bunky pomocou špecifických (T-bunkových) receptorov. Spomedzi obrovského počtu T buniek má len niekoľko T buniek vhodný receptor (3).Väzba vedie k aktivácii týchto T buniek a objaveniu sa ich selektívnych kópií (4, "klonálna selekcia"). Rôzne signálne proteíny podobné hormónom, interleukíny [IL (IL), pozri str. 378]. Tieto proteíny sú vylučované tými bunkami imunitného systému, ktoré sú aktivované, keď sú naviazané na T bunky. Aktivované makrofágy s prezentovaným vírusovým fragmentom teda vylučujú IL-1 (5) a T bunky produkujú IL-2 (6), ktorý stimuluje ich vlastné klonálne kopírovanie a replikáciu T-pomocných buniek.
Klonované a aktivované T bunky vykonávajú rôzne funkcie v závislosti od ich typu. Cytotoxické T bunky (v zelenom diagrame) sú schopné rozpoznať a viazať tie bunky tela, ktoré sú infikované vírusmi a nesú fragmenty vírusu na svojich MHC receptoroch (7). Cytotoxické T bunky vylučujú perforín, proteín, ktorý preniká cez membránu naviazanej infikovanej bunky, čo vedie k bunkovej lýze (8).
Naopak, T-pomocníci (v modrom diagrame) sa viažu na B-bunky, ktoré na svojom povrchu prezentujú fragmenty vírusu asociované s MHC proteínom (9). To vedie k selektívnemu klonovaniu jednotlivých B buniek a ich masívnej proliferácii, Interleukín stimuluje (10) dozrievanie B buniek - transformáciu na plazmatické bunky (11) schopné syntetizovať a vylučovať protilátky (12)
Fagocytóza (z gréckeho phago - požieram a cytos - bunka) je proces absorpcie a trávenia antigénnych látok vrátane mikroorganizmov bunkami mezodermálneho pôvodu, tzv. fagocyty. I. I. Mečnikov rozdelil fagocyty na makrofágy a mikrofágy. V súčasnosti sú makro- a mikrofágy spojené jediný systém makrofágov (SMF). Tento systém zahŕňa:
- tkanivové makrofágy - epiteloidné bunky,
- hviezdicové retikuloendoteliocyty (Kupfferove bunky),
- alveolárne a peritoneálne makrofágy umiestnené v alveolách a peritoneálnej dutine,
- biele procesné epidermocyty kože (Langerhansove bunky) atď.
Mikrofágy zahŕňajú:
- neutrofily,
- eozinofily,
- bazofily.
Funkcie makrofágov mimoriadne pestrá. Ako prvé reagujú na cudzorodú látku, sú to špecializované bunky, ktoré pohlcujú a ničia cudzie látky v tele (odumierajúce bunky, rakovinové bunky, baktérie, vírusy a iné mikroorganizmy, antigény, nemetabolizovateľné anorganické látky). Okrem toho makrofágy produkujú mnohé biologicky aktívne látky – enzýmy (vrátane lyzozýmu, peroxidázy, esterázy), komplementové proteíny, imunomodulátory, ako sú interleukíny. Prítomnosť na povrchu makrofágov receptorov pre imunoglobulíny (Am) a komplement, ako aj systém mediátorov, zabezpečuje ich interakciu s T- a B-lymfocytmi. Makrofágy zároveň aktivujú ochranné funkcie T-lymfocytov. Vďaka prítomnosti receptorov pre komplement a Am, ako aj histokompatibilného systému Ag (HLA) sa makrofágy podieľajú na väzbe a rozpoznávaní antigénov. Fagocyty teda majú tri funkcie:
- ochranné, spojené s čistením tela od infekčných agens, produktov rozpadu tkaniva atď .;
- reprezentujúce, spočívajúce v prezentácii antigénnych epitolov lymfocytom na fagocytovej membráne;
- sekrečné, spojené so sekréciou lyzozomálnych enzýmov a iných biologicky aktívnych látok – cytokínov, ktoré hrajú dôležitú úlohu v imunogenéze.
Existujú nasledujúce postupne tečúce štádia fagocytózy.
- Chemotaxia– cielený pohyb fagocytov v smere chemického gradientu chemoatraktantov v prostredí. Schopnosť chemotaxie je spojená s prítomnosťou na membráne špecifických receptorov pre chemoatraktanty (objekty fagocytózy), ktorými môžu byť baktérie, produkty degradácie telesných tkanív atď.
- Priľnavosť(pripútanie) je tiež sprostredkované zodpovedajúcimi receptormi, ale môže prebiehať v súlade so zákonmi nešpecifickej fyzikálno-chemickej interakcie. Častice sú adsorbované na povrchu makrofágov.
- Endocytóza(záchyt) - dochádza k invaginácii bunkovej membrány, zachyteniu cudzorodej častice a jej ponoreniu do protoplazmy. V dôsledku endocytózy sa vytvára fagocytárna vakuola - fagozóm(t.j. bublina v protoplazme okolo absorbovanej častice).
- intracelulárne trávenie- začína absorpciou fagocytovaných predmetov. Fagozóm sa spája s lyzozómom fagocytu, ktorý obsahuje desiatky enzýmov a nastáva tvorba fagolyzozómu (deštrukcia) zachytenej častice enzýmami. Pri pohltení častice patriacej k samotnému organizmu (napríklad mŕtva bunka alebo jej časti, vlastné bielkoviny) dochádza k jej štiepeniu pomocou fagolyzozómových enzýmov na neantigénne látky (aminokyseliny, mastné kyseliny, nukleotidy, monocukry). Ak sa cudzia častica absorbuje, potom enzýmy fagolyzozómu nie sú schopné rozložiť látku na neantigénne zložky. V takýchto prípadoch je fagolyzozóm so zvyšnou časťou antigénu, ktorý si zachoval svoju cudzosť, prenesený makrofágom na T- a B-lymfocyty, t.j. zapne sa špecifické prepojenie imunity.
sekrečnú funkciu je sekrécia fagocytmi biologicky aktívnych látok - cytokínov - ide o interleukín-1 a interleukín-2, čo sú bunkové mediátory, ktoré majú regulačný účinok na proliferáciu, diferenciáciu a funkciu fagocytov, lymfocytov, lymfoblastov a iných buniek. Makrofágy produkujú a vylučujú také dôležité regulačné faktory, ako sú prostaglandíny, leukotriény, cyklické nukleotidy so širokým rozsahom biologickej aktivity. Okrem toho makrofágy syntetizujú a vylučujú množstvo produktov s antibakteriálnou, antivírusovou a cytotoxickou aktivitou (kyslíkové radikály O2-H2O2, lyzozým, interferón atď.).
Fagocytózu zosilňujú opsonínové protilátky, pretože naviazaný alebo antigén sa ľahšie adsorbuje na povrchu fagocytu v dôsledku prítomnosti receptorov pre tieto protilátky. Toto zosilnenie fagocytózy protilátkami sa nazýva opsonizácia, t.j. príprava mikroorganizmov na zachytenie fagocytmi. Fagocytóza opsonizovaných antigénov sa nazýva imunitná.
Charakterizovať aktivitu fagocytózy zavedenej fagocytárny index. Na jej určenie sa pod mikroskopom spočíta počet baktérií absorbovaných jedným fagocytom. Tiež si užite opsonofagocytárny index predstavujúci pomer fagocytárnych parametrov získaných s imunitným a neimunitným sérom. Fagocytárny index a opsonofagocytárny index sa používajú v klinickej imunológii na hodnotenie stavu imunity a imunitného stavu.
Fagocytóza hrá dôležitú úlohu v antibakteriálnej, protiplesňovej a antivírusovej ochrane, udržiava odolnosť organizmu voči cudzorodým látkam. Fagocyty majú tiež aktivačný a supresívny účinok na lymfocyty, podieľajú sa na oživovaní imunologickej tolerancie, protiinfekčnej, transplantačnej a protinádorovej imunity a niektorých foriem alergie (HRT).
Fagocytóza je špeciálny proces absorpcie veľkých makromolekulárnych komplexov alebo korpuskulárnych štruktúr bunkou. "Profesionálne" fagocyty u cicavcov sú dva typy diferencovaných buniek - neutrofily a makrofágy, ktoré dozrievajú v kostnej dreni z HSC a zdieľajú spoločnú intermediárnu progenitorovú bunku.Neutrofily cirkulujú v periférnej krvi a tvoria významnú časť krvných leukocytov - 60-70%, čiže 2,5-7,5x109 buniek na 1 liter krvi. Za normálnych okolností neutrofily neopúšťajú cievy do periférnych tkanív, ale sú prvé, ktoré sa „ponáhľajú“ (t. j. podstupujú extravazáciu) do miesta zápalu v dôsledku rýchlej expresie adhéznych molekúl - VCAM-1 (VLA-4 endoteliálny ligand) a integrín CDllb/CD18 (ligand na endoteli ICAM-1). Na ich vonkajšej membráne boli identifikované exkluzívne markery - CD66a a CD66d (karcinóm-embryonálny Ag).
Monocyty a makrofágy. Monocyty sú "stredná forma", v krvi sú 5-10% z celkového počtu leukocytov. Ich účelom je stať sa a byť sedavými makrofágmi v tkanivách.
Makrofágy pečene – Kupfferove bunky, mozog – mikroglie, pľúcne makrofágy – alveolárne a intersticiálne, obličky – mezangiálne.
♦ Receptory makrofágovej membrány.
O CD115 - Rc pre faktor stimulujúci monocytové kolónie (M-CSF). Je prítomný aj na membráne pluripotentnej prekurzorovej bunky granulocytov a monocytov a unipotentného prekurzora monocytov, o Sú známe štyri štruktúry - Rc na bunkovej membráne makrofágov, ktoré spájajú to, čo je makrofág potenciálne schopný absorbovať mechanizmom tzv. fagocytóza
CD14 - Rc pre komplexy bakteriálneho LPS so sérovými lipopolysacharid viažucimi proteínmi (LBP), ako aj komplexy LPS s inými mikrobiálnymi produktmi (napríklad endotoxínmi) - Rc pre väzbu fragmentov fosfolipidových membrán a iných zložiek vlastných poškodených a odumierajúcich bunky (Rc pre „odpad“, receptory lapača). Takým je napríklad CD 163 – Rc pre „staré“ erytrocyty. Rc viažuca manóza. Prítomný iba na membráne tkanivových makrofágov.
- RC pre komplement - CR3 (integrín CDllb/CD18) a CR4 (integrín CDllc/CD18). Okrem komplementu na seba viažu aj množstvo bakteriálnych produktov: lipopolysacharidy, Leishmania lipofosfoglykán, hemaglutinín z filament Bordetella, povrchové štruktúry kvasinkových buniek rodov Candida a Histoplasma.
CD64 - Rc pre "chvosty" (Fc fragmenty) IgG - FcyRI (Fcy-Rc prvého typu), poskytujúce možnosť fagocytózy imunitných komplexov makrofágmi. Sú považované za membránové markery monocytov/makrofágov, pretože sú exprimované iba na týchto bunkách. Podtriedy IgG z hľadiska sily asociácie s FcyRI sú v nasledujúcom poradí: IgG3 > IgGl > IgG4 > IgG2. o Receptory, ktoré interagujú s lymfocytárnou imunitou. Spolu s už spomínaným CD64 sem patria: - Rc pre cytokíny produkované imunitnými lymfocytmi. Väzba na Rc ligandy pre IFNy a pre tumor nekrotizujúci faktor (TNF) vedie k aktivácii makrofágov. Naopak, makrofág je inaktivovaný prostredníctvom Rc pre IL-10. - CD40, B7, MHC-I / II - membránové molekuly pre kontakty s komplementárnymi membránovými molekulami lymfocytov, t.j.
pre priame medzibunkové interakcie. Neutrofily takéto receptory nemajú. následky fagocytózy. Potom, čo fagocyt obalí svoju membránu okolo absorbovaného objektu a uzavrie ho do membránového vezikula nazývaného fagozóm, nastanú nasledujúce udalosti.
♦ Štiepenie fagocytovaného materiálu. Tento proces prebieha podľa rovnakých biochemických mechanizmov vo všetkých fagocytoch, o Lyzozómy sú špeciálne intracelulárne organely obsahujúce súbor hydrolytických enzýmov (kyslé proteázy a hydrolázy) s optimálnym pH približne 4,0. V bunke sa lyzozómy spájajú s fagozómami do fagolyzozómu, kde prebiehajú reakcie trávenia absorbovaného materiálu 02-), singletový kyslík (1O2), hydroxylový radikál (OH-), chlorid (OC1-), oxid dusnatý ( NIE+). Tieto radikály sa tiež podieľajú na deštrukcii fagocytovaného objektu.
♦ Sekrécia lytických enzýmov a oxidačných radikálov do medzibunkového priestoru, kde pôsobia aj baktericídne (ale ovplyvňujú aj vlastné tkanivá).
Neutrofily okrem už spomínaných látok produkujú a vylučujú kolagenázu, katepsín G, želatinázu, elastázu a fosfolipázu A2.
♦ Produkcia a sekrécia cytokínov. Makrofágy a neutrofily, aktivované mikrobiálnymi produktmi, začnú produkovať cytokíny a iné biologicky aktívne mediátory, ktoré vytvárajú preimunitný zápal v mieste zavedenia vonkajších látok, čo pripravuje možnosť rozvoja lymfocytárnej imunitnej odpovede.
O Makrofágy produkujú interleukíny (IL-1, IL-6, IL-8, IL-12); tumor nekrotizujúci faktor a (TNFa); prostaglandíny; leukotrién B4 (LTB4); doštičkový aktivačný faktor (PAF).
o Neutrofily produkujú TNFa, IL-12, chemokín IL-8, LTB4 a PAT.
♦ Spracovanie a prezentácia Ag - tvorba komplexov vo vnútri buniek z produktov štiepenia fagocytovaného materiálu s vlastnými molekulami MHC-II a expresia tohto komplexu na povrchu bunky s „účelom“ prezentácie Ag na rozpoznanie T. - lymfocyty. Tento proces vykonávajú iba makrofágy.
V literatúre je opísaný veľký počet metód na kvantifikáciu fagocytózy. Objem tejto knihy nám neumožňuje podrobne opísať všetky, preto sa obmedzíme na opis len niektorých.
Materiály a vybavenie
Ak chcete pracovať, musíte mať:
Citrátextrózový antikoagulant: 8 g kyseliny citrónovej. 22 g trisubstituovaného citrátu sodného (dvojvoda), 24,5 g glukózy sa rozpustí v 1 litri vody;
Roztok dextrosodextránu: 4,5 g NaCl, 25 g glukózy, 30 g dextránu (rel. mol. hmotnosť 500 000) v 1 1;
Roztok chloridu amónneho: 9 dielov 0,83 % chloridu amónneho, 1 diel Tris-HCl pufra pH 7,2 (20,6 g/l);
Zmes ficoll - vizotrast: 9 g ficollu, 20 ml vizotrastu, 100 ml dvakrát destilovanej H 2 0, hustota 1,077;
Substrát pre β-glukuronidázu: 31,5 mg p-nitrofenyl-β-glukuronidu a 100 um Triton X 100 sa rozpustí v 100 ml 0,05 M pufra octanu sodného pH 5;
Reagencie z nedostatku myeloperoxidázy: fixačné činidlo (10 ml 37 % formaldehydu s 90 ml absolútneho etanolu), roztok substrátu (100 ml 30 % EDTA, 0,3 g benzidínchloridu, 0,038 g ZnS0 4 x 7H 2 0, 1 ml destilovanej vody, 1,0 g CH 3C00Nax3H20, 0,7 ml 3% H202); upravte pH 1,0 M NaOH na 6,0.
Komerčné činidlá:
FSB, Hankov roztok a Eagle-MEM médium (Štátny inštitút pre imunitné prípravky a živné médiá, Berlín-Weissensee, NDR);
heparín (5000 IU/mg) (Gedeon Richter, Maďarsko);
Sérum embryí hovädzieho dobytka (Flow Laboratories, USA, možno použiť inú spoločnosť);
Visotrast (VEB Fahlberg List, Magdeburg, NDR);
Infucoll (VEB Serumwerk Bernburg, NDR);
Dextran, ficoll (Pharmacia, Švédsko);
Koloidný uhlík Сl1/143a (Wagner, Pelikanwerke, Nemecko);
diizodecylftalát, paradioxán (Coleman, Matheson and Bell, USA);
Triton X 100 (Serva, Nemecko, je možná iná spoločnosť);
Oil red O (Allied chemical corp., Morristown, NY, USA);
Iaranitrofenyl-p-glukuronid (Sigma, USA);
Safranin O (Fischer Scientific Lab., Chicago, USA);
Polystyrénové guľôčky, rúrky (Nunc, Dánsko);
Mriežka F 905 (VEB Orvo Wolfen, NDR).
Získanie fagocytov
Potrebné informácie o izolácii ľudských granulocytov možno získať v kapitole „Separácia buniek imunitného systému“; pre získanie peritoneálnych makrofágov pozri časti "Kultivácia makrofágov a monocytov" a "Izolácia makrofágov zo suspenzie splejocytov". Touto problematikou sa podrobne zaoberá množstvo prác.
Okrem toho by sa mali uviesť aj tieto metódy:
8 ml krvi sa zmieša s roztokom dextranglukózy. Potom sa pridá 6 % roztok dextránu 75 v 0,15 M NaCl (5 ml). Zmes sa nechá 45 až 50 minút pri teplote miestnosti na sedimentáciu erytrocytov. Odsajte plazmu. Zvyškové erytrocyty sa lyzujú pridaním 0,83 % chloridu amónneho (35 ml až 15 ml plazmy). Centrifugujte 10 minút pri 80 g, zrazeninu suspendujte v 0,15 M NaCl ochladenom na 0 °C. Zmiešajte niekoľko precipitátov a centrifugujte 10 minút pri 800 g. Bunky sa najlepšie uchovávajú na ľade v 0,15 M NaCl (toto médium je vhodnejšie ako pufrované médiá s dvojmocnými katiónmi, ktoré spôsobujú zlepenie buniek);
Ak sú predmetom fagocytózy kvasinky, krok spracovania chloridom amónnym možno vynechať, pretože červené krvinky neinterferujú s procesom. Mononukleárne bunky je možné získať nasledovne: heparinizovanú krv zmiešame s 1/3 objemu Eaglovho média s obsahom 15 % glukózy, navrstvíme na vrstvu zmesi ficoll – visotrast a odstredíme 20 minút pri 400 g. Frakcia mononukleárnych buniek sa odsaje Pasteurovou pipetou, dvakrát sa premyje PBS a pripraví sa suspenzia v Eaglovom médiu (1x107 buniek/ml).
Príprava častíc na fagocytózu
Častejšie sa používajú živé kultúry Staphylococcus aureus (SG 511 alebo 502 A), Staphylococcus epididermidis SG 475, E. coli a iných enterobaktérií, listérií, korynebaktérií, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae. Mikroorganizmy sa pestujú 24 hodín (v prípade potreby 48 hodín) na pevnom a tekutom živnom médiu. Zozbieraná biomasa sa trikrát premyje 0,15 M NaCl. Príliš hustá suspenzia sa meria pri 640 nm, koncentrácia sa určuje z kalibračnej krivky.
Koncentrácia mikroorganizmov je tiež určená metódami preosievania na hustých živných médiách; v niektorých prípadoch je možné vykonať sčítanie mikroorganizmov v počítacích komorách.
Pri práci so živými bakteriálnymi kultúrami je potrebné dbať na to, aby sa kultúry používali vždy v rovnakom štádiu. Pridanie 0,01 % hovädzieho sérového albumínu podporuje prežitie mikroorganizmov. Pripravená suspenzia zostáva stabilná 1-2 hodiny.
Kultúry usmrtených mikroorganizmov sa zvyčajne získavajú zahrievaním počas 30 minút na 80 °C alebo pôsobením prúdiacej pary. Usmrtené mikróby sa trikrát premyjú 0,15 M NaCl, resuspendujú sa a stanoví sa koncentrácia suspenzie.
Príprava pekárskeho droždia: 0,5 g pekárskeho droždia sa suspenduje v 0,15 M NaCl a umiestni sa na 30 minút do vriaceho vodného kúpeľa. Prefiltrujte cez filter z bavlnenej gázy. Pri použití živých kvasiniek sa čerstvé bunky (4-5 dňová kultúra) trikrát premyjú v Eaglovom médiu s prídavkom 1,0 % glukózy. Zvyčajne sa používa bunková suspenzia 108 a 109 buniek/ml. Kvasinky sa používajú ako testovacie častice pri zisťovaní defektov v komponente C5.
Použitie suspenzie polystyrénových častíc: Pripravte 10% vodnú suspenziu polystyrénových častíc s priemerom 1,091 μm. Zriedi sa v pomere 1 + 1 0,2 % roztokom BSA v 0,15 M NaCl, odstredí sa. Pri vlnovej dĺžke 253 nm poskytuje suspenzia polystyrénu 1 μg/ml absorpciu 1,17 x 10-3.
Aplikácia suspenzie lipopolysacharidu - olejová červeň O v minerálnom oleji: 2 g olejovej červene sa rozotrie v 50 ml diizodecylftalátu (alebo vazelínového oleja) v porcelánovej mažiari. Centrifugujte 20 minút pri 500 g. Pridajte 10 μg frakcie supernatantu do 10 ml dioxínu, zmerajte optickú hustotu pri vlnovej dĺžke 525 nm. Konverzný faktor je 0,92. V druhom stupni sa 40 mg lipopolysacharidu (E. coli 0,26 B6 atď.) rozpustí v 3 ml 0,15 M NaCl. Potom sa k tejto zmesi pridá 1 ml roztoku olejovej červenej O v diizodecylsulfáte a zmes sa suspenduje počas 90 sekúnd. Suspenzia sa ihneď použije a môže sa zmraziť.
Na nastavenie reakcie fagocytózy sa ako testovacie častice môžu použiť formalizované erytrocyty.
Fagocytóza baktérií, baktericídna
Experiment so suspenziou živých baktérií: Zvyčajne sa používa pomer 3-10 mikróbov/fagocyt. V celkovom objeme 2 ml sa zmieša 1x106 fagocytov s 3x106 - 1x107 mikróbov. V praxi sa 1 ml bakteriálnej suspenzie pridá do 1 ml suspenzie fagocytov, do ktorej sa pridalo 8 IU heparínu. Interakčný čas je zvyčajne 30 minút, v niektorých prípadoch je dlhší. Po inkubácii sa odoberie 0,5 ml zmesi, pridá sa 1,5 ml 0,1% roztoku želatíny v Hankovom roztoku ochladenom na 0 °C a centrifuguje sa 3-4 minúty pri 300 g. Zo zrazeniny sa pripravia nátery, ktoré sa farbia podľa Pappenheima. Zobrazte 200 buniek (ak je to možné trikrát). Vypočítajte percento fagocytózy. Podľa počtu baktérií obsiahnutých v bunkách sa vypočíta index aktivity fagocytózy: počet fagocytovaných baktérií sa vynásobí percentom fagocytujúcich buniek; intenzita fagocytózy je vyjadrená číslami od 1 do 4.
Stupeň 1: Fagocytovaný baktériami I-4
Stupeň 2: fagocytované 5-7 baktérií
Stupeň 3: fagocytované 8-10 baktérií
Stupeň 4: Fagocytovalo sa viac ako 10 baktérií na bunku
Pri stanovení úrovne fagocytózy živých mikróbov sa oddelene kontroluje bunkový sediment a frakcia supernatantu. Počet živých mikróbov sa stanoví preosiatím na pevných živných pôdach 0,1 ml študovaných frakcií. Inkubované 24 (48) hodín Pri výpočte baktericídnej aktivity sa predpokladá, že jedna vytvorená kolónia zodpovedá jednému živému mikróbu.
Na cielenú štúdiu baktericídnej aktivity sa krv pacientov a zdravých darcov vyšetruje s pridaním roztoku antibiotika (5 000 IU penicilínu a streptomycínu / ml) a bez neho a vykonáva sa aj bakteriálna kontrola. Zloženie vzorky: 0,3 ml Hankovho roztoku + 0,1 ml normálneho séra získaného z krvi odobratej od 5 darcov + 0,5 ml suspenzie leukocytov (10 7 buniek / ml) + 0,1 ml mikrobiálnej suspenzie (10 6 mikróbov/ml). Pridá sa roztok antibiotík v 0,02 ml na vzorku. Vzorky inkubujte pri 37 °C a po 20 minútach, 1,5 hodine a 3 hodinách stanovte počet mikróbov. Na tento účel odoberte z každej vzorky 0,1 ml, vybrané alikvotné časti rozrieďte Hankovým roztokom 10, 100 a 1000-krát a naneste na zohriaty agar. Niekedy, najmä ak boli pridané antibiotiká, sa pripravia prechodné riedenia na presné počítanie mikróbov (napríklad 0,2 ml vzorky sa zmieša s 5 ml Hankovho roztoku, odstredí sa 5 minút pri 450 g, zrazenina sa rozpustí v 1,9 ml PBS, naneseného na agar). Ak chcete skrátiť trvanie bakteriologickej štúdie, môžete mikróby vo vnútri bunky určiť fluorescenciou pomocou farbenia akridínovou žltou.
Fagocytóza pekárskych kvasníc: pripravte suspenziu 10 9 buniek/ml v 0,15 M NaCl. Zmiešajte 0,1 ml suspenzie s 0,1 ml plazmy pacienta, inkubujte 30 minút pri 37 °C, pridajte 0,2 ml (106) PMNL, inkubujte 30 minút. Alikvóty sa odoberajú v intervaloch 5 až 30 minút. Spočíta sa 100 PMN a určí sa počet zachytených častíc kvasiniek na bunku. Známa je nasledujúca modifikácia: 50 µl testovacieho séra sa pridá k 50 µl séra z morčiat (predtým sa riedi v pomere 1 + 1 Eaglovým médiom s glukózou), 50-200 µl suspenzie leukocytov ( 107 buniek/ml), objem sa upraví na 450 ul strednou ihlou s glukózou a inkubuje sa 30 minút pri 37 °C. Potom pridajte 50 μl kvasinkovej suspenzie (10 8 buniek/ml), premiešajte a inkubujte 40 minút pri 37 °C. Pridajte 50 μl L-75 Se-metionínu (celková aktivita 100 kBq), premiešajte a inkubujte 1 hodinu pri 37 °C. Bunky sa vyzrážajú centrifugáciou počas 5 minút pri 1000 g, premyjú sa dvakrát PBS, rádioaktivita sa meria na gama čítači. Percento fagocytovaných kvasiniek sa vypočíta podľa vzorca:
Fagocytóza s použitím roztoku olejovej červene v minerálnom oleji: 0,2 ml suspenzie častíc sa zmieša s 0,8 ml bunkovej suspenzie predhriatej na 37 °C. Po 5 minútach inkubácie sa pridá 6 ml 0,15 M roztoku NaCl ochladeného na 0 °C obsahujúceho 126 ug/l N-etylmaleimidu (na zastavenie zachytávania častíc). Centrifugujte 10 minút pri 250 g. Frakcia supernatantu sa vyhodí, zrazenina sa resuspenduje v roztoku NaCl a N-etylmaleimidu (pozri vyššie), bunky sa dvakrát premyjú. Bunky sú lyzované ultrazvukom, uvoľňuje sa olejová červeň. Pridajte 1 ml dioxánu. Centrifuguje sa 15 minút pri 500 g, zmeria sa optická hustota pri vlnovej dĺžke 525 nm oproti čistému dioxánu. Stupeň fagocytózy (IF) je definovaný ako množstvo minerálneho oleja (mg) absorbovaného za minútu 107 bunkami. Na výpočet môžete použiť nasledujúci vzorec:
Štúdium fagocytózy v monovrstve makrofágov:
1. Fáza: 2 ml bunkovej suspenzie (200 000 buniek/ml) sa pridajú do sterilných polystyrénových skúmaviek. Inokulujte 5 hodín pri 37 °C, potom premyte Eaglovým médiom. Do skúmaviek sa pridajú 2 ml kultivačného média s 10 % inaktivovaným (30 minút, 56 °C) sérom embryí hovädzieho dobytka a inkubujú sa pri 37 °C.
2. Fáza A: zavedie sa suspenzia mikróbov (3-10/makrofág), inkubuje sa 30-60 minút pri 37 °C, skúmavky sa 6-krát prepláchnu 3 ml podielmi média, aby sa odstránili nefagocytované mikróby. Ihneď zafixujte zmesou 1 dielu ľadovej kyseliny octovej a 3 dielov metanolu. Farbiť prípravok podľa May - Griinwald, spočítať bunky.
Fáza B: stanovenie intracelulárnych živých baktérií. Postupnosť operácií je rovnaká ako vo fáze A pred fázou fixácie. Po umytí opatrne odstráňte všetky stopy média. Bunky sa lýzujú, pričom sa pridajú 2 ml 0,01 % sterilného roztoku albumínu hovädzieho séra (4 °C), pričom sa opakovane pretrepáva. Väčšina buniek sa lýzuje po 20 minútach. Uvoľnené baktérie sa určujú preosievaním na hustých živných médiách.
Fagocytóza erytrocytov: zmiešajte 4x107 fagocytov s 5x107 testovaných erytrocytov v 5 ml PBS. Preneste 2 ml zmesi do 5 mM fosfátového pufra ochladeného na 0 °C a odstreďte. Zmerajte optickú hustotu frakcie supernatantu pri vlnovej dĺžke 420 nm. Stupeň fagocytózy je určený znížením obsahu hemoglobínu v bezbunkovej fáze pomocou kalibračných kriviek.
Zjednodušená metóda na určenie vôle
Príklad stanovenia klírensu u potkanov: zvieratám sa intraperitoneálne injikuje 5 x 107 mikróbov na 100 g hmotnosti (0,1 ml//100 g). Optimálna dávka sa môže pohybovať od 10 6 do 10 8 na 100 g hmotnosti. V intervale 1-2 hodín sa zabíjajú 3 jedince z každej skupiny pokusných zvierat; celkové trvanie experimentu 16 hodín. Sterilne odoberte 0,5 ml krvi zo srdca, 1 ml peritoneálnej tekutiny, vylúčte pľúca, pečeň, slezinu a obličky. Z tkaniva orgánu sa Pasteurovou pipetou vyrežú valce. Stanovte počet mikroorganizmov kultiváciou na tekutých a pevných živných pôdach.
Príklad stanovenia klírensu u myší: používa sa koloidné uhlie alebo značené 51 [Cr] baraními erytrocytmi. Myšiam (najmenej 5 jedincov na skúsenosť) sa intravenózne vstrekne 0,01 ml suspenzie uhlia rýchlosťou 16 mg na 100 g hmotnosti. Do 15 minút s intervalom 2 minút sa odoberie 0,025 ml krvi z retroorbitálneho priestoru. Zvolených 0,025 ml krvi sa pridá k 2,0 ml 0,1 % roztoku Na2C03. Po hemolýze sa koncentrácia uhlia stanoví kolorimetricky pri vlnovej dĺžke 675 nm pomocou kalibračných kriviek.
t je čas v minútach, C je koncentrácia uhlíka vo vzorke.
Korigovaná hodnota fagocytózy:
Funkčný skríning fagocytov
Stanovenie degranulácie (meranie aktivity (β-glukuropidáza): 10 7 leukocytov sa suspenduje v 0,8 ml PBS v plastových skúmavkách, pretrepáva sa 5 minút pri 37 °C. Pridá sa 0,2 ml senzibilizovaného LPS, fluorochrómne častice (FC 80), ochladí sa na 30 °C minút na ľade, odstreďovať 10 minút pri 250 g Skontrolujte aktivitu enzýmu v supernatantovej frakcii Inkubujte 0,9 ml substrátovej zmesi 18 hodín s 0,1 ml skúmanej frakcie Pridajte 2 ml 0,1 M NaOH, zmerajte optickú hustotu na vlne 410 nm.
Kalkulácia:
(OD 410 x20)/(1,84x18) = počet nmol látky uvoľnenej za 1 hodinu 107 leukocytmi, t.j. stupeň degranulácie je vyjadrený v nanomóloch paranitrofenyl-β-glukuronidu.
Metóda stanovenia defektov myeloperoxidázy: najlepšie výsledky sa získajú biochemickým stanovením H 2 0 2, čo naznačuje zmeny metabolizmu počas fagocytózy. Pre praktické účely je veľmi dôležité, aby aktivácia hexóza-monofosfátového skratu, redukcia tetrazóliumnitroénu a väzba exogénneho jódu na PMNL proteíny korelovali s tvorbou H 2 0 2 . Bežný krvný náter sa fixuje na 30 sekúnd zmesou alkoholu a formalínu. Premyté destilovanou vodou a zafarbené na peroxidázu počas 30 sekúnd. V bunkách obsahujúcich peroxidázu sa detegujú inklúzie zafarbené na tmavomodro.
Test na redukciu tetrazóliovej nitromodrej (TNS). THC sa normálnym PMNL redukuje na formazan. Zmiešajte s 0,1 ml krvi 0,1 ml 0,1 % roztoku THC v 0,15 M NaCl, inkubujte 20 minút pri 37 °C, znova dôkladne premiešajte. Inkorporácia formazanu do buniek sa stanoví mikroskopicky. Výsledok je vyjadrený ako percento buniek pozitívnych na formazan.
Nasledujúca metóda je o niečo zložitejšia: 1 kvapka krvi pacienta sa aplikuje na krycie sklíčko. Inkubujte 20 minút pri 37 °C vo vlhkej komore, potom opatrne umyte sklo sterilným 0,15 M NaCl. Umiestnite krycie sklíčko na sklíčko obsahujúce 1 kvapku média THC (0,5 ml séra + 0,3 ml sterilného 0,15 M NaCl + 0,6 ml THC, pozri vyššie). Inkubujte 30 minút vo vlhkej komore pri 37 °C, odstráňte krycie sklíčko a vysušte na vzduchu. Fixujte absolútnym metanolom počas 60 sekúnd a premyte destilovanou vodou. Farbiť 5 min safranínom (1 g safranínu + 100 ml destilovanej vody + 40 ml glycerínu), umyť. Formazan-pozitívne bunky sú veľké, podobné výbuchom a obsahujú modré granuly. Zvyčajne sa v prípravku deteguje asi 30 % buniek pozitívnych na formazan.
Vyššie uvedené metódy hodnotenia fagocytózy sú súhrnom veľmi veľkého počtu publikácií. Podrobnejšie informácie o týchto otázkach nájdete v príslušných prácach.
16. Fagocytárna reakcia.
Fagocytóza- proces aktívnej absorpcie, trávenia a inaktivácie cudzích častíc špecializovanými fagocytovými bunkami.
Štádiá fagocytózy:
Chemotaxia je cieľavedomý pohyb fagocytov po koncentračnom gradiente špeciálnych biologicky aktívnych látok – chemoatraktantov.
Adhézia - priľnutie k mikróbu. Opsoníny (AT, fibronektín, surfaktant) obaľujú mikroorganizmy a výrazne obmedzujú ich pohyblivosť.
Endocytóza (absorpcia). V dôsledku toho sa vytvorí fagozóm s objektom fagocytózy uzavretým vo vnútri. Lyzozómy sa ponáhľajú k fagozómu a zoradia sa pozdĺž jeho obvodu.
Trávenie. Fúzia fagozómu s lyzozómom za vzniku fagolyzozómu. Ďalej sú fagocytované mikroorganizmy napádané kyslíkovo závislými (peroxid, kyslíkový superoxid, cytochróm b; vznikajú produkty toxického účinku, poškodzujúce mikroorganizmy a okolité štruktúry) a nezávislými na kyslíku (granule s laktoferínom, lyzozýmom a pod.; tieto produkty spôsobiť poškodenie bunkovej steny a narušiť niektoré metabolické procesy) faktory.
výsledok fagocytózy.
Dokončené - smrť a zničenie mikroorganizmov
Neúplné - baktérie vybavené kapsulami alebo hustými hydrofóbnymi bunkovými stenami sú odolné voči pôsobeniu lyzozomálnych enzýmov; blokovanie fúzie fagozómov a lyzozómov.
Typy fagocytárnych buniek:
Makrofágy a dendritické bunky - profesionálne fagocyty a bunky prezentujúce antigén
Mikrofágy - polymorfonukleárne leukocyty (neutrofily) - fagocytóza je len mierna
Krvné monocyty migrujú do tkanív pod vplyvom cytotoxínov a stávajú sa rezidentnými.
Makrofágy Pečeň - Kupfferove bunky
Pľúca – alveolárne makrofágy
CNS – mikrogliové bunky
Kostná dreň – osteoklasty
Oblička – mezangiálne bunky
Fagocytózové mikroorganizmy a ich spracovanie (trávenie); prezentovať antigén T bunkám.
NK - natural killers - nerozlišujú AH, sú nezávislé na protilátkach, pôsobia len proti bunkám a reagujú len na bunkové faktory.
Indikátory fagocytózy:
Fagocytárny index (fagocytárna aktivita) - percento neutrofilov obsahujúcich častice mikroorganizmov
Fagocytárne číslo (fagocytárny index) - priemerný počet mikroorganizmov absorbovaných jedným fagocytom.
17. Humorálna imunitná odpoveď.
Na humorálnych imunitných odpovediach sa podieľajú tri typy buniek: makrofágy (bunky prezentujúce AG), T-pomocníci a B-lymfocyty
AG-prezentujúce bunky fagocytuje mikroorganizmus a spracováva ho, pričom ho rozdeľuje na fragmenty (spracovanie AG). Fragmenty AG sú vystavené povrchu bunky prezentujúcej AG spolu s molekulou MHC. Komplex AG-molekula MHC2 je prezentovaný T-helperovi. Rozpoznanie komplexu T-pomocníkom stimuluje sekréciu IL-1 makrofágmi.
T-pomocník pod vplyvom IL-1 syntetizuje IL-2 a receptory pre IL-2, ktorý autokrinným mechanizmom stimuluje proliferáciu T-helperov, ako aj CTL. Po interakcii s bunkou prezentujúcou AG teda T-pomocník získava schopnosť reagovať na pôsobenie IL-2 rýchlou reprodukciou. Biologickým významom tohto javu je hromadenie T-pomocníkov, ktorí zabezpečujú v lymfoidných orgánoch tvorbu potrebného poolu plazmatických buniek, ktoré produkujú protilátky proti tomuto AG.
B-lymfocyt. Jeho aktivácia zahŕňa priamu interakciu AG s molekulou Ig na povrchu B bunky. V tomto prípade samotný B-lymfocyt spracováva AG a prezentuje svoj fragment v spojení s molekulou MHC2 na svojom povrchu. Tento komplex rozpoznáva T-pomocníka vybraného pomocou rovnakého antigénu. Rozpoznanie komplexu AG-MHC2 na povrchu B-lymfocytu T-helper receptorom vedie k sekrécii IL-2, IL-4, IL-5 a IFN-gama T-helperom, pod vplyvom z ktorých sa B-bunka množí, pričom vzniká klon plazmatických buniek. Plazmatické bunky syntetizujú protilátky. Sekrécia AT je stimulovaná IL-6 vylučovaným aktivovaným T-pomocníkom. Niektoré zrelé B-lymfocyty po diferenciácii nezávislej od antigénu cirkulujú v tele vo forme pamäťových buniek.
5 tried: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM; Molekuly IgD, IgE, IgG predstavujú monoméry, IgM pentaméry, molekula IgA v krvnom sére je monomér a vo vylučovaných tekutinách (sliny, slzná tekutina) je to dimér.
IgG: preniká cez placentu do tela plodu, aby sa zabezpečila tvorba pasívnej imunity u plodu, po narodení dieťaťa jeho obsah v krvnom sére klesá a minimálnu koncentráciu dosiahne do 3-4 mesiacov, potom sa začne zvyšovať v dôsledku akumulácie vlastného IgG, dosiahnutie normy o 7 rokov . Detekcia vysokých titrov IgG voči Ag špecifického patogénu naznačuje, že telo je v štádiu rekonvalescencie alebo bolo nedávno prenesené špecifické ochorenie.
IgM: jeho obsah je výrazne zvýšený u novorodencov, ktorí mali vnútromaternicovú infekciu. Prítomnosť IgM v Ag špecifického patogénu naznačuje akútny infekčný proces.
IgA: cirkuluje v krvnom sére a vylučuje sa aj na povrch epitelu., prítomný v slinách, slznej tekutine, mlieku. Molekuly IgA sa podieľajú na reakciách neutralizácie a aglutinácie patogénov. Sekrečné imunoglobulíny triedy IgA (SIgA) sa líšia od sérových v prítomnosti sekrečnej zložky spojenej s 2 alebo 3 monomérmi IgA.
IgD: nachádza sa na povrchu vyvíjajúcich sa B-lymfocytov, jeho obsah dosahuje maximum o 10 rokov, mierne zvýšenie titrov je zaznamenané počas tehotenstva, bronchiálnej astmy, systémového lupus erythematosus a u ľudí s imunodeficienciou
IgE: syntetizované plazmatickými bunkami v bronchiálnych a peritoneálnych lymfatických uzlinách, v sliznici gastrointestinálneho traktu. IgE sa tiež nazývajú reaginy, pretože sa zúčastňujú anafylaktických reakcií a majú výraznú cytofilitu.
Od 10. týždňa vnútromaternicového vývoja začína syntéza IgM, od 12. - IgG, od 30. - IgA, ale ich koncentrácia je nízka.
Ochranná funkcia protilátok počas infekcie:
Ab prostredníctvom centier viažucich Ag interagujú s rôznymi Ag. Abs teda zabraňujú infekcii alebo eliminujú patogén alebo blokujú rozvoj patologických reakcií, pričom aktivujú všetky špecifické obranné systémy.
Opsonizácia (imunitná fagocytóza)– Abs (prostredníctvom fragmentov Fab) sa viažu na bunkovú stenu tela; Fc fragment Ab interaguje so zodpovedajúcim fagocytovým receptorom, ktorý sprostredkuje následnú účinnú absorpciu vytvoreného komplexu fagocytom.
Antitoxický účinok Abs môžu viazať a tým inaktivovať bakteriálne toxíny.
Aktivácia komplimentov Ab (IgM, IgG) po naviazaní na Ag (mikroorganizmus, nádorová bunka) aktivuje komplimentový systém, čo vedie k deštrukcii tejto bunky perforáciou jej bunkovej steny, zvýšenou chemotaxiou, chemokinézou a imunitnou fagocytózou
Neutralizácia– interakciou s bunkovými receptormi, ktoré viažu baktérie alebo vírusy, môže Ab zabrániť adhézii a prenikaniu mikroorganizmov do buniek hostiteľského organizmu.
Cirkulujúce imunitné komplexy Abs viažu rozpustné Ag a tvoria cirkulujúce komplexy, pomocou ktorých sa Ag vylučuje z tela hlavne močom a žlčou.
Cytotoxicita závislá od protilátky– opsonizáciou Ag stimuluje Ab ich deštrukciu cytotoxickými bunkami. Prístroj, ktorý zabezpečuje rozpoznávanie cieľa, sú receptory pre Fc fragmenty Ab. Makrofágy a granulocyty sú schopné ničiť opsonizované ciele.
Vlastnosti protilátok:
Špecifickosť- schopnosť protilátok reagovať len so špecifickým antigénom, v dôsledku prítomnosti antigénnych determinantov na antigéne a antigénnych receptorov (antideminantov) na protilátke.
Valence- počet antideterminantov na protilátke (zvyčajne bivalentná);
spriaznenosť, spriaznenosť je sila spojenia medzi determinantom a antideterminantom;
Avidita je sila väzby protilátka-antigén. Vďaka valencii je jedna protilátka viazaná na niekoľko antigénov;
Heterogenita- heterogenita v dôsledku prítomnosti troch typov antigénnych determinantov:
izotypový- charakterizovať príslušnosť imunoglobulínu k určitej triede (IgA, IgG, IgM atď.);
Alotypický- (vnútrošpecifická špecifickosť) zodpovedajú alelickým variantom imunoglobulínu (heterozygotné zvieratá majú rôzne imunoglobulíny);
Idiotypické- odrážať individuálne charakteristiky imunoglobulínu (môže spôsobiť autoimunitné reakcie).
Vekové vlastnosti:
V postnatálnom období je v krvi detí veľmi významná dynamika obsahu imunoglobulínov rôznych tried. Je to spôsobené tým, že počas prvých mesiacov života pokračuje dezintegrácia a odstraňovanie tých imunoglobulínov triedy B, ktoré boli transplacentárne prenesené z matky.
Počas prvých 4-6 mesiacov sú materské imunoglobulíny úplne zničené a začína sa syntéza ich vlastných imunoglobulínov.